PL202265B1 - Sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny, wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu o wzorze ogólnym 7, w którym X jest resztą stanowiącą H lub NH2 lub CH2-CH2-NH2 lub CH2-CH2-OH lub C(CH2OH)2CH3 a Y jest resztą podaną we wzorze 3 lub wzorze 4 lub wzorze 5 lub wzorze 6, znamienny tym, że związek o wzorze ogólnym 10 osadza się na żywicy Merrifielda, poddaje się acylowaniu za pomocą związku o wzorze 11 lub wzorze 12 lub wzorze 13 lub wzorze 14, zdejmuje się z żywicy w reakcji aminolizy za pomocą związku NH2H; gdzie X ma podane wyżej znaczenia, usuwa się grupy ochronne w reakcji redukcji sodem w ciekłym amoniaku, a następnie utlenianiu produktu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu.

Somatostatyna (SS-14) powstaje z prohormonu na drodze proteolizy i ma wzór strukturalny przedstawiony we wzorze 1. Znana jest jako czynnik hamujący uwalnianie somatotropiny (SRIF) lub hormon hamujący uwalnianie hormonu wzrostu (GHR-IH). Jej aktywność jest wielokierunkowa, uzależniona od obszaru, w którym jest wydzielana. I tak oprócz podwzgórza somatostatynę wytwarza na przykład gruczoł tarczowy, łożysko, trzustka, ośrodkowy układ nerwowy, błona śluzowa różnych odcinków przewodu pokarmowego, komórki D żołądka. Powstaje ona też w błonie śluzowej trzonu i części przedodźwiernikowej żołądka, dwunastnicy i dalszych odcinkach jelita cienkiego. Wykryto ją również w rdzeniowych zwojach nerwowych, krezkowych zwojach nerwowych, rdzeniu nerwowym całego ciała, a także w neuronach Auerbacha. Jest określana jako peptyd mózgowo-jelitowo-trawienny, zaś sposób działania może być endokrynalny, neurokrynalny oraz egzo i parakrynalny. Różnorodność działań somatostatyny w połączeniu z jej anatomicznym rozmieszczeniem ma wpływ na wiele istotnych funkcji życiowych, co znalazło lecznicze zastosowanie u chorych z obfitym krwawieniem z górnego odcinka przewodu pokarmowego, ograniczając przepływ krwi w obszarze trzewnym.

Ograniczenia terapeutycznej efektywności somatostatyny SS-14 wynikają z krótkiego okresu półtrwania (około 4 minut) oraz szerokiego spektrum działania.

W badaniach zależności między strukturą a czynnością biologiczną stwierdzono, ż e istotnym dla wiązalności z receptorem jest fragment 7 - 10 natywnej somatostatyny o sekwencji przedstawionej we wzorze 2.

W stanie techniki znane jest z polskiego opisu patentowego nr 169867 rozwiązanie sposobu otrzymywania nowych analogów somatostatyny, wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu.

Niedogodnością znanego rozwiązania jest istnienie w strukturze chemicznej analogów deaminokwasów będących „obcym” dla organizmu ludzkiego.

Istotą rozwiązania według wynalazku jest sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny o wzorze ogólnym 7, w którym X jest resztą stanowiącą H lub NH2 lub CH2-CH2-NH2 lub CH2-CH2-OH lub C(CH2OH)2CH3, a Y jest resztą podaną we wzorze 3 lub wzorze 4 lub wzorze 5 lub wzorze 6, według wynalazku polega na tym, że związek o wzorze ogólnym 10, osadzony na żywicy Merrifielda poddaje się acylowaniu za pomocą związku o wzorze 11 lub wzorze 12 lub wzorze 13 lub wzorze 14, zdejmuje się z żywicy w reakcji aminolizy za pomocą związku NH2X, gdzie X ma podane wyżej znaczenie, usuwa się grupy ochronne w reakcji redukcji sodem w ciekłym amoniaku, a następnie utlenianiu produktu. Ponadto istotnym jest, że stosuje się korzystnie związek o wzorze 10 otrzymany w wyniku osadzenia Boc-Cys(Bzl) na żywicy Merrifielda i poddania tak otrzymanego substratu kolejnym acylowaniom związkami o wzorach Boc-Thr(Bzl). Boc-Lys(Tos), Boc-Trp-(Boc-His-Tos) i Boc-Phe, poprzedzanym usuwaniem grupy Boc z każ dego kolejnego substratu acylowego.

W sposobie wedł ug wynalazku został y wyeliminowane wszystkie deaminokwasy, które są nienaturalne dla organizmu ludzkiego. Dokonana zamiana tryptofanu na histydynę, eliminuje powstawanie w trakcie procesu utleniania wytwarzanych przez tryptofan fioletowych zabarwień.

Sposób według wynalazku prowadzi do uzyskania produktów według wzoru ogólnego 7, wykazujących wielokrotnie silniejsze właściwości hamujące wydzielanie hormonu wzrostu i wielokrotnie wyższą odporność na degradacje enzymatyczną, aniżeli natywna somatostatyna.

P r z y k ł a d. Związek o wzorze 10 powstaje w wyniku osadzenia Boc-Cys(Bzl) na ż ywicy Merrifielda i poddania tak otrzymanego substratu kolejnym acylowaniom związkami o wzorach Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys(Tos), Boc-Trp-(Boc-His-Tos) i Boc-Phe poprzedzanym usuwaniem grupy Boc z każ dego kolejnego substratu acylowanego. Chroniony peptyd liniowy o strukturze przedstawionej we wzorze 8 otrzymuje się metodą syntezy na nośniku stałym. Przyłączenie reszty C-końcowej N-t-butyloksykarbonylo-S-benzylocysteiny do nośnika realizuje się w reakcji soli cezowej chronionego aminokwasu z chlorometylowaną żywicą poliestrową o stopniu osadzenia chloru 0,67 mmola/g żywicy.

Grupy α-aminowe przyłączanych aminokwasów osłania się ugrupowaniem t-butylooooksykarbonyylowym (Boc), a aminokwasu N-końcowego ugrupowaniem benzyloksykarbonylowym (Z).

Grupy funkcyjne łańcuchów bocznych treoniny i cysteiny oraz grupę tiolową kwasu β-mercaptopropiowego i jego pochodnych zabezpiecza się przez zastosowanie osłony benzylowej (Bzl).

Boczną grupę aminową lizyny chroni się przez użycie reszty p-touenosulfonylowej (Tos).

PL 202 265 B1

Syntezę na stałym nośniku przeprowadza się w następujący sposób.

Odpowiednią ilość polimeru zawierającego 0,5 mmola osadzonego aminokwasu, czyli Boc-Cys(Bzl) w ilości 1,05 g przy stopniu osadzenia 0,48 mmola/g, zalewa się 15 cm³ chlorku metylenu i pozostawia się układ na 12 godzin celem spęcznienia polimeru. Po up ływie tego czasu żywicę z osadzonym na niej aminokwasem poddaje się pięciu cyklom zło ż onym z odblokowania, neutralizacji i sprzęgania. Każdy cykl składa się z nastę pujących etapów. W etapie pierwszym przeprowadza się usunięcie grupy Boc poprzez użycie 40% roztworu kwasu trifluorooctowego w chlorku metylenu z dodatkiem 1% anizolu. W operacji pierwszej używa się tu 10 cm³ roztworu przez 5 minut, a w operacji drugiej 10 cm³ roztworu przez 25 minut. W etapie drugim przeprowadza się przemywanie w pię ciu kolejnych operacjach, które podano niż ej:

3x chlorkiem metylenu w ilości 10 cm³ przez czas 3 minut:

3x mieszaniną chlorek metylenu: metanol (1:1) w ilości 10 cm³ przez czas 3 minut;

3x metanolem w ilości 10 cm³ (1:1) w ilości 10 cm³ przez czas 3 minut:

3x mieszaniną chlorek metylenu: metanol (1:1) w ilości 10 cm³ przez czas 3 minut;

3x chlorkiem metylenu w ilości 10 cm³ przez czas 3 minut.

Po wykonaniu wszystkich opisanych wyżej operacji przemywania, realizuje się etap trzeci, polegający na zobojętnianiu trifluorooctanu peptydylożywicy 10% roztworem trietyloaminy w chlorku metylenu. W operacji pierwszej przeprowadza się zobojętnianie przy użyciu 10 cm³ roztworu przez 5 minut, a w drugiej operacji przy uż yciu tej samej iloś ci roztworu przez czas 10 minut. Po wykonaniu zoboję tniania przeprowadza się ponownie przemywanie w pięciu kolejnych operacjach opisanych wyżej dla etapu drugiego. W następującym teraz etapie czwartym przeprowadza się acylowanie. Do schłodzonego roztworu 1,5 mmola Boc-Thr(Bzl) i 1,5 mmola N-hydroksybenzotriazolu w najmniejszej objętości mieszaniny chlorek metylenu: dimetyloformamid (1:1) dodaje się 1,5 mmola dicykloheksyklokarbodiimidu w chlorku metylenu, przy czym ten etap wykonuje się odrębnie, poza właściwym naczyniem reakcyjnym. Po upływie co najmniej 15 minut odsącza się wytrącony dicykloheksylomocznik, a otrzymany w ten sposób przesącz wprowadza się do naczynia reakcyjnego i wytrząsa w wytrząsarce laboratoryjnej przez okres 2 do 3 godzin.

W nastę pnym etapie pią tym, przeprowadza się ponowne przemywanie realizując w tym celu wszystkie zabiegi technologiczne, jak opisano dla etapu drugiego. W szóstym etapie cyklu technologicznego otrzymywania nowych analogów somatostatyny, prowadzi się kontrolę stopnia acylowania. Stopień ten kontroluje się przy pomocy ninhydrynowego testu Kaisera i testu chloranilowego. W przypadku pozytywnego wyniku testu, acylowanie powtarza się, natomiast uzyskanie negatywnego wyniku testu acylowania pozwala na przejście do następnego etapu, którym jest zdejmowanie grupy Boc z chronionego peptydu. Po przyłączeniu ostatniego N-końcowego aminokwasu i zdjęciu grupy t-butyloksykarbonylowej osadzony peptyd acyluje się kwasem e-mercapto-e,e-cyklopentametyleno-S-benzylopropionowym analogicznie jak w czasie acylowania aminokwasem i stosuje się ten sam ciąg przemywań i ten sam sposób kontroli przebiegu reakcji acylowania. Po przyłączeniu kwasu β-mercapto-e,e-cyklopentametyleno-S-benzylopropionowego żywicę z osadzonym na niej peptydem dokładnie przemywa się w dziewięciu kolejnych operacjach: trzykrotnie chlorkiem metylenu użytego za każdym razem w ilości 10 cm³, trzykrotnie etanolem użytym za każdym razem w ilości 10 cm³ oraz ponownie trzykrotnie chlorkiem metylenu w tej samej ilości.

Otrzymany substrat suszy się w eksykatorze próżniowym nad pięciotlenkiem fosforu i wodorotlenkiem potasowym, a następnie waży. Tak otrzymany chroniony peptyd zdejmuje się z żywicy Merrifielda poprzez aminolizę etanoloaminą w następujący sposób. Do mieszaniny 0,5 mmola peptydu na żywicy i 14 cm³ metanolu dodaje się 0,05 mola etanoloaminy i całość ogrzewa się przez 5 godzin w temperaturze wrzenia metanolu. Następnie odsącza się żywicę, a do metanolowego roztworu peptydu dodaje się 200 cm³ wody. Wytrąca się biały osad, który odsącza się, przemywa wodą i krystalizuje z mieszaniny metanol: eter etylowy. Zdjęty z żywicy chroniony peptyd najpierw poddaje się deprotekcji poprzez redukcję sodem w ciekłym amoniaku, a następnie cyklizacji poprzez utworzenie mostka disulfidowego na drodze utleniania grup tiolowych przy pomocy 0,01 molowego wodnego roztworu żelazocyjanku potasowego lub 0,1 molowego roztworu jodu w metanolu. Surowy cykliczny peptyd odsala się metodą chromatografii kolumnowej z wypełnieniem Sephadex G-15 eluując 50% wodnym roztworem kwasu octowego. W drugim etapie odsolony peptyd poddaje się oczyszczaniu na kolumnie jonowymiennej, stosując jako wypełnienie Sephaarose. W ostatnim etapie peptyd poddaje się oczyszczaniu na kolumnie wypełnionej Sephadexem LH-20. Peptyd eluuje się 10% wodnym roztworem kwasu octowego, a połączone frakcje zawierające czysty produkt poddaje się liofilizacji. Uzyskuje się

PL 202 265 B1 w ten sposób czysty peptyd przedstawiony wzorem 7, w którym X oznacza grupę D-etanoloamina a Y oznacza grupę o wzorze 3.

Związek ten charakteryzuje skręcalność [a]²⁰D = -30,32 c = 0,5; 10% kwas octowy, jon molekularny 880, czas retencji w wysokosprawnej chromatografii cieczowej równy RT = 7,091 (peptyd eluowano izokratycznie w układzie rozpuszczalników 48% B i 52% A, gdzie A:0,1% kwas trifluorooctowy w wodzie, a B:80% acetonitryl w A, szybkość przepływu 1 cm na minutę, detekcja przy długości fali 226 nm). Skład aminokwasowy peptydu potwierdzono wykonując hydrolizę peptydu sześcionormalnym roztworem kwasu solnego w temperaturze 110°C, a następnie przeprowadzając analizę ilościową składu aminokwasowego przy pomocy automatycznego analizatora aminokwasów.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

AJa-Gly-Cys-Lys-Asu-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

WZÓR 1

8 9 10

Phe-Trp-(His)-Lys-Thr o<

CH_Z-COWZÓR2

WZÓR 3

H ch₂-coHCk /CH-CO-

WZÓR 4

WZÓR 5 h₃c ,α^-co-

Y-Phe-(His)-Trp-Lys-Thr-Cys-NH-X

WZÓR 6

WZÓR 7

CH2CO-Phe-(His)-Trp-Lys(Tos)Thr(Bzl)-Cys(Bzl)-NH-CH^-CH^OH

S-Bzl

WZÓR 8

PL 202 265 B1

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania nowych analogów somatostatyny, wykazujących właściwości hamowania uwalniania hormonu wzrostu o wzorze ogólnym 7, w którym X jest resztą stanowiącą H lub NH2 lub CH2-CH2-NH2 lub CH2-CH2-OH lub C(CH2OH)2CH3 a Y jest resztą podaną we wzorze 3 lub wzorze 4 lub wzorze 5 lub wzorze 6, znamienny tym, że związek o wzorze ogólnym 10 osadza się na żywicy Merrifielda, poddaje się acylowaniu za pomocą związku o wzorze 11 lub wzorze 12 lub wzorze 13 lub wzorze 14, zdejmuje się z żywicy w reakcji aminolizy za pomocą związku NH2H; gdzie X ma podane wyżej znaczenia, usuwa się grupy ochronne w reakcji redukcji sodem w ciekłym amoniaku, a następnie utlenianiu produktu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze 10 otrzymany w wyniku osadzenia Boc-Cys(Bzl) na ż ywicy Merrifielda i poddania tak otrzymanego substratu kolejnym acylowaniem związkami o wzorach Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys(Tos), Boc-Trp-(Boc-His-Tos) i Boc-Phe.