PL170059B1

PL170059B1 - Sposób wytwarzania nowej szczepionki przeciw Herpes simplex PL PL PL

Info

Publication number: PL170059B1
Application number: PL92300617A
Authority: PL
Inventors: Myriam Francotte; Jean-Paul Prieels; Moncef Slaoui; Nathalie M J Garcon-Johnson
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog
Priority date: 1991-03-21
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 1996-10-31
Also published as: PT100262A; KR100224329B1; ZA922011B; IL101290A0; GR3017884T3; CZ280505B6; IE69560B1; SA92120459B1; AU1365792A; CA2106492C; FI934134L; MY110086A; MX9201245A; HUT67052A; BR9205745A; EP0576478B2; NZ242057A; WO1992016231A1; DE69205566T2; IL101290A

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowej szczepionki przeciw Herpes simplex, znamienny tym, ze w pierwszym etapie glikoproteine D HSV lub jej immunologiczny fragment adsorbuje sie na wodorotlenku glinu, po czym w drugim etapie dodaje 3-deacylowany monofosforylowy lipid A. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest sposób wytwarzania nowej szczepionki przeciw Herpes simplex. Nowe szczepionki wytwarzane sposobem według wynalazku nadająsię do leczenia zakażeń wirusem opryszczki zwykłej (Herpes simplex), zwłaszcza wirusem Herpes simplex 2 (HSV-2).

HSV-2 jest pierwotnym czynnikiem etiolologicznym opryszczki narządów płciowych i wraz z HSV-1 (czynnik przyczynowy opryszczki wargowej) oba charakteryzują się zdolnością wywoływania zarówno ostrych schorzeń, jak zakażenia latentnego, przede wszystkim w komórkach zwojów nerwowych.

Ocenia się, że opryszczka narządów płciowych występuje u około 5 milionów osób w samych USA i każdego roku notuje się 500 000 przypadków klinicznych (zakażenie pierwotne i nawrotowe). Zakażenie pierwotne występuje typowo po osiągnięciu dojrzałości płciowej i charakteryzuje się miejscowym występowaniem bolesnych zmian skórnych, które utrzymują się przez okres 2 do 3 tygodni. W ciągu sześciu miesięcy następujących po pierwotnym zakażeniu, u 50% pacjentów wystąpi nawrót choroby. Około 25% pacjentów może przechodzić 10-15 epizodów nawrotowych choroby każdego roku. U pacjentów z osłabioną odpornością częste występowanie nawrotów jest statystycznie wyższe niż w normalnej populacji chorych.

Zarówno HSV-1 jak i HSV-2 mająkilka składników glikoproteinowych zlokalizowanych na powierzchni wirusa. Są one znane jako gA, gB, gC, gD, gE itd.

Glikoproteina D jest zlokalizowana na błonie wirusowej i znaleziono ją również w cytoplazmie zakażonych komórek (Eisenberg R.J. i in., J. of Virol. 1980, 35,428-435). Zawiera ona 393 aminokwasy, w tym peptyd sygnalizacyjny i ma ciężar cząsteczkowy w przybliżeniu 60 kD. Ze wszystkich glikoprotein otoczki wirusa, ta jest przypuszczalnie najlepiej scharakteryzowana (Cohen i in., J. Virology, 60,157-166). Wiadomo, że in vivo odgrywa ona centralną rolę w przyczepianiu się wirusa do błon komórkowych. Ponadto stwierdzono, że glikoproteina D jest zdolna do indukcji przeciwciał neutralizujących in vivo (Eing i in., J. Med. Virology 127, 59-65). Jednakże latentny wirus HSV-2 może się reaktywować i wywoływać nawrót choroby, mimo obecności wysokich mian przeciwciał neutralizujących w surowicach pacjentów.

Zdolność indukcji tylko przeciwciała neutralizującego nie wystarcza do właściwego zwalczania choroby. Aby zapobiec nawrotowi choroby, trzeba żeby każda szczepionka stymulowała nie tylko przeciwciało neutralizujące, ale także odporność komórkową za pośrednictwem limfocytów T. Obecny wynalazek spełnia te zadania.

170 059

Sposobem według wynalazku wytwarza się szczepionkę zawierającą glikoproteinę D HSV, albo jej immunologiczny fragment, w połączeniu z 3-o-deacylowanym monofosforylowanym lipidem A (3D-MPL), deacylowaną pochodną monofosforylowanego lipidu A oraz wodorotlenkiem glinu, który stanowi nośnik. Sposób wytwarzania szczepionki przeciw Herpes simplex według wynalazku obejmuje dwa etapy: w pierwszym etapie glikoproteinę D HSV lub jej immunologiczny fragment adsorbuje się na wodorotlenku glinu, po czym w drugim etapie dodaje się 3-deacylowany monofosforylowany lipid A.

3D-MPL stosuje się w ilości w zakresie od 10 pg do 100 pg, korzystnie 25-50 pg na dawkę, a antygen typowo w zakresie 2 do 50 pg na dawkę.

3D-MPL można otrzymać według metod opisanych w brytyjskim opisie patentowym nr 2 220 211 (RIBI).

Jako glikoproteinę korzystnie stosuje się glikoproteinę D z HSV-2 lub jej immunologiczny fragment. Korzystnie glikoproteina D z HSV-2 jest skróconym białkiem o 308 aminokwasach, które zawiera aminokwasy od 1 do 306 glikoproteiny występującej w naturze i dodatkowo asparaginę i glutaminę na C-końcu, z którego został odcięty region kotwiczenia na błonie. Ta postać białka obejmuje peptyd sygnałowy, z którego po odszczepieniu powstaje dojrzałe białko o 283 aminokwasach. Wytwarzanie takiego białka w komórkach jajnika chomika chińskiego metodami inżynerii genetycznej zostało opisane w europejskim opisie patentowym Genentech EP-B-139 417.

Dojrzałe obcięte białko pozbawione C-końca i sekwencji sygnałowej przy N-końcu korzystnie stosuje się jako składnik szczepionki wytwarzanej sposobem według wynalazku. Takie białko wytworzone metodami rekombinacji DNA oznaczone jest symbolem rgD2t.

Antygen HSV można chemicznie lub w inny sposób związać z rozdrobnionym nośnikiem. Szczególnie korzystne jest chemiczne połączenie z antygenem powierzchniowym Hepatitis B poprzez grupy sulfhydrylowe znajdujące się na powierzchni antygenu powierzchniowego Hepatitis B. Patrz będące w załatwianiu brytyjskie zgłoszenie patentowe Nr 9027623.9.

Preparaty wytworzone sposobem według wynalazku bardzo skutecznie indukują ochronną odporność, nawet przy pomocy bardzo małych dawek antygenu (na przykład 5 pg rgD 2t).

Zapewniają one doskonałą ochronę przeciw zakażeniu pierwotnemu i z powodzeniem stymulują swoistą odpowiedź immunologiczną zarówno humoralną (przeciwciała neutralizujące), jak również komorkowąprzez komórki efektorowe (DTH).

Ilość białka w każdej dawce szczepionki dobiera się jako tę ilość, która indukuje ochronną odpowiedź immonologiczną bez znaczniejszych, niepożądanych efektów ubocznych typowych szczepionek. Ilość ta będzie zmieniać się w zależności od tego, jaki swoisty immunogen jest stosowany. Na ogół przewiduje się, że każda dawka będzie zawierała 1 - 1000 pg białka, korzystnie 2-100 pg, najkorzystniej 4-40 pg. Dawkę optymalną określonej szczepionki można ustalić przy pomocy standardowych badań, obejmujących obserwację mian przeciwciał i innych odpowiedzi osobników szczepionych. Po pierwszym szczepieniu osobnicy ci mogą otrzymać dawkę przypominającą w ciągu około 4 tygodni.

Poza szczepieniem osób wrażliwych na zakażenia HSV, preparaty farmaceutyczne wytworzone sposobem według wynalazku mogą być używane do immunoterapii chorych z zakażeniami HSV.

Porównanie skuteczności adiuwantów szczepionki zawierającej podjednostki, glikoproteiny D wirusa Herpes simplex wytworzone na drodze rekombinacji.

W tym badaniu oceniano na modelu świnki morskiej zdolność kilku adiuwantów do wzmozenia ochronnej odporności wywołanej przez glikoproteinę D z wirusa Herpes simplex (HSV) typu 2 (rgD2t) otrzymaną na drodze rekombinacji DNA. Badanymi adiuwantami były wodorotlenek glinu, wodorotlenek glinu w połączeniu z 3-deacylo-monofosforylolipidem A oraz 3-deacylo-monofosforylolipid A podawany w emulsji typu olej w wodzie.

1. Opis oitygenu.

HSV rgD 2t jest otrzymaną przy pomocy inżynierii genetycznej, obciętą glikoproteiną, wytworzoną w transfekowanych komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) (europejski opis patentowy Nr 0 139 417).

170 059

2. Preparaty antygen-adiuwant i schematy uodpornienia.

Przeprowadzono na modelu świnki morskiej dwa oddzielne doświadczenia dla oceny odporności ochronnej indukowanej przez kilka preparatów rgD 2t. W doświadczeniu pierwszym grupy świnek morskich immunizowano trzykrotnie niską dawką antygenu (5 pg rgD2t) w preparatach z adiuwantami przygotowanych jak opisano niżej. Dwa tygodnie po ostatniej immunizacji zwierzęta zakażono dopochwowo HSV typu 2 i badano je codziennie celem obserwacji rozwoju pierwotnej i nawrotowej choroby HSV2. W doświadczeniu drugim te preparaty oceniano dalej na większych grupach zwierząt. Badano także czynniki wpływające na skuteczność tych preparatów, takie jak dawka antygenu i skład adiuwantu.

2.1. Preparat antygen-adiuwant.

W doświadczeniu pierwszym świnki morskie uodporniono preparatami z następującymi adiuwantami. Każdą dawkę (5 pg) podawano w objętości 0,25 ml.

2.1.1. rgD 2t/wodorotlenek glinu.

Wodorotlenek glinu otrzymano z firmy Superfos (Alhydrogel (Boehimte) Superfos, Dania).

pg oczyszczonej rgD2t adsorbowano przez noc w 4°C na wodorotlenku glinu w ilości odpowiadającej 0,25 mg równoważników Al³⁺ w 0,25 ml 150 mM NaCl buforowanego 10 mM fosforanu, pH 6,8.

2.1.2. rgD2t/wodorotlenek glinu + 3D-MPL.

3D-MPL otrzymano z Ribi Immunochem Research, Inc. Po adsorpcji przez noc 5 pg rgD 2t na wodorotlenku glinu, j ak opisano w punkcie 2.1.1., preparat z adiuwantem wirowano i usunięto ciecz znad osadu. Następnie do rgD2t związanej z wodorotlenkiem glinu dodano równą objętość buforu do adsorpcji zawierającego 100 pg 3D-MPL.

W przypadku obu preparatów rgD2t/wodorotlenek glinu stwierdzono, że ponad 98% rgD2t związało się z adiuwantem - wodorotlenkiem glinu.

2.1.3. rgD2t/3D-MPL w emulsji oleju w wodzie (R).

Emulsję oleju w wodzie przygotowano dodając 12% (wag./obj.) lecytyny do oleju Squalene i 0,08% Tween 80. 3D-MPL dodano w stężeniu 100 razy wyższym niż żądane stężenie końcowe. 1%> tego preparatu w objętości 0,25 ml zmieszano następnie z 5 pg rgD2t w fazie wodnej i otrzymano 1% emulsję typu oleju w wodzie zawierającą 100 pg 3D-MPL.

Podobne preparaty z adiuwantami, przygotowane jak wyżej, ale zawierające różne ilości rgD2t i/lub immonostymulatora, zostały użyte w drugim doświadczeniu. Podawano je w całkowitej objętości 0,5 ml. Preparaty te są opisane poniżej.

rgD2/wodorotlenek glinu: 5 lub 20 pg rgD2t; 0,5 mg równoważników Al⁺³ na dawkę 0,5 ml. rgD2/wodorotlenek glinu + 3D-MPL; 5 lub 20 pg rgD 2t; 0,5 mg równoważników Al³⁺; 50 pg 3D-MPL na dawkę 0,5 ml.

rglfUD-MPL w emulsji o/w (R): 5 lub 20 pg rgD2t przygotowano w 1% emulsji o/w jak opisano wyżej (2.1.3). Dawka 0,5 ml zawierała 5 lub 20 pg rgE>2t, 50 pg 3D-MPL w 1% emulsji o/w.

rgD22/3D-MPL w emulsji o/w (S): Nośnik przygotowano następująco: do buforowanego fosforanu roztworu soli (PBS), zawierającego 0,4% (obj./obj.) Tween 80, dodano 5% (obj./obj.) Pluronic L121 i 10% oleju Squalane i mieszaninę tę przepuszczono 10 razy przez mikrofluidyzator (Model M/110, Microfluidics Corp.), tak że wytworzona emulsja zawierała tylko cząstki submikronowe. Następnie do emulsji dodano 50 pg 3D-MPL. Jedną objętość tej emulsji, zawierającej 3D-MPL, zmieszano z równą objętością dwukrotnie zatężonego antygenu i krótko kołysano ruchem obrotowym aby zapewnić całkowite wymieszanie składników. Końcowy preparat zawierał 0,2% Tween 80, 2,5% Pluronic L121, 5% oleju Squalane, 50 pg 3D-MPL i pg lub 20 pg rgD 2t w dawce 0,5 ml.

2.2. Schemat uodpornienia.

Grupy samic świnek morskich Hartley (200 - 250 g) immunizowano trzykrotnie, w dniach 0, 28 i 95, 5 pg rgD 2t w postaci czterech różnych preparatów adiuwantowych.

Uodpornienie wykonano przy pomocy iniekcji podskórnych w objętości 0,25 ml. Zwierzęta kontrolne otrzymały według tego samego schematu iniekcje samego adiuwantu albo nie były traktowane.

170 059

Poszczególne grupy uodporniono następująco:

Grupa 1 (n=4) : 5 pg rgD^^3D-MPL (100 pg) w emulsji o/w (R),

Grupa 2 (n=l): 5 pg rgD2t/wodorotlenek glinu + 3D-MPL (100 pg),

Grupa 3 (n=4) : 5 pg rgD2t/wodorotlenek glinu,

Grupa 4 (n=^=5): sam wodorotlenek glinu,

Grupa 5 (n=5) : sam 3D-MPL (100 pg)

Grupa 6 (n==^) : nietraktowana.

Co dwa tygodnie zwierzętom pobierano krew do oznaczenia przeciwciał metodą ELISA i testem neutralizacji jak opisano niżej.

Poszczególne preparaty badano również na zdolność do indukowania odporności za pośrednictwem limfocytów T, mierzoną indukcją nadwrażliwości typu opóźnionego. Sposoby odczytywania zastosowane do oceny humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej, indukowanej przez różne preparaty rgD 2t, są opisane niżej.

W celu porównania ochronnej odporności wywołanej preparatami rgD2t, dwa tygodnie po ostatniej immunizacji wszystkie świnki morskie zakażono dopochwowo 10 ⁵ jednostek tworzących łysinki (pfu) HSV2, szczep MS. Zwierzęta badano codziennie na obecność klinicznych objawów zakazenia oraz obj awów nawrotowej choroby opryszczkowej. Próbki wymazów z pochwy pobierano 5 dnia po challeng’u wirusowym i badano miano zakaźnego wirusa.

Szczegółowy opis dopochwowego modelu dla świnki morskiej jest podany niżej.

W doświadczeniu drugim immunogenność niżej podanych preparatów rgD2t oceniano na większych grupach zwierząt. Porównano dwie dawki antygenu (5 i 20 pg) i badano różne adiuwanty. Zastosowano dawkę 50 pg 3D-MPL i porównano jej efekt z dawką 100 pg użytą poprzednio.

Grupy samic świnek morskich Hartley immunizowano trzykrotnie w dniach 1,28 i 84, jak następuje:

Grupa I (n=8) : 20 pg rgDyt/3D-MPL (50 pg) emulsja o/w (R),

Grupa II (n=8) : 5 pg rgD2t/3D-MPL (50 pg) emulsja o/w (R),

Grupa III (n=10) : 20 pg rgD2t/3D-MPL (50 pg) emulsja o/w (S),

Grupa IV (n=10): 5 pg rgD2t/3D-MPL (50 fig) emulsja o/w (S),

Grupa V (n=10) : 20 pg rgD2t/wodorotlenek glinu + 3D-MPL (50 pg),

Grupa VI (n=10): 5 pg rgD2t/wodorotlenek glinu + 3D-MPL (50 pg),

Grupa VII (n=4): tylko wodorotlenek glinu + 3D-MPL (50 pg),

Grupa VIII (n=4): tylko 3D-MPL (50 pg) emulsja o/w (R),

Grupa IX (n=8) : nietraktowane.

Wstrzykiwano dawki 0,5 ml. Grupy kontrolne otrzymały według tego samego schematu tylko adiuwant (grupy VII i VIII) albo były nietraktowane (grupa IX). Ostatnia grupa (grupa X) została uodporniona preparatem gD2t/wodorotlenek glinu + 3D-MPL, zawierającym 100 pg 3D-MPL w dawce 0,25 ml, zgodnie ze schematem z pierwszego doświadczenia profilaktycznego:

Grupa X (n=l00: 5 pg rgD2t/wodorotlenek glinu + 3D-MPL (100 mg).

Co dwa tygodnie zwierzętom pobierano krew do indywidualnego oznaczenia przeciwciał metodą ELISA i testem neutralizacji, jak opisano niżej. Wypłuczyny z pochwy pobierano po drugiej immunizacji i badano je na obecność przeciwciał układowych swoistych dla gD2t (przeciwciała anty gD2t klasy IgG). Świnki morskie zakazono dopochwowo 105 jednostek pFu wirusa HSV2 (szczep MS) w 2 tygodnie po ostatniej immunizacji. Po challenge’u zwierzęta badano codziennie na obecność klinicznych objawów ostrego zakażenia (4 do 12 dni po challenge’u) oraz objawów nawrotowej choroby opryszczkowej (13 do 39 dni po challenge’u).

3. SSOssbb odczytjyvania.

Wyznaczono kilka parametrów dla oceny swoistej odpowiedzi przeciwciał i odpowiedzi komórkowej indukowanej szczepieniem preparatami rgD 2t. Wartość ochronną tych preparatów oceniano na modelu dopochwowym świnki morskiej.

3.1. ELISA.

Test ELISA zastosowano do wykrywania i ilościowego oznaczania swoistych przeciwciał anty gD w surowicach i wypłuczynach z pochwy, stosując rgD 2t jako antygen oołaszcząjązy.

170 059

3.1.1. Wykrywanie przeciwciał IgG swoistych dla rgD 2t w surowicach.

Roztwory antygenu i przeciwciała używano w objętości 50 μΐ na dołek. Antygen rozcieńczono PBS do końcowego stężenia 1 μg/ml i adsorbowano przez noc w 4°C w dołkach 96-miejscowej płytki mikrotitracyjnej (Maxisorp Immuno-plate, Nunc, Dania). Następnie dołki płukano 5 razy PBS z 0,1% Tween (bufor do płukania) i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C w PBS zawierającym 1%o albuminę surowicy bydlęcej, 4% surowicę noworodków cielęcych i 0,1% Tween (bufor saturacyjny). Trzykrotne rozcieńczenia surowic (poczynając od rozcieńczenia 1/100) w buforze saturacyjnym dodano do dołków pokrytych rgD 2t i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Płytki płukano jak wyżej i do każdego dołka dodano skoniugowane z biotynabaranie przeciwciała anty IgG świnki morskiej (swoiste dla IgG1 i IgG2, Serotec, Sopar Biochem, Belgia) rozcieńczone 1/3000 w buforze saturacyjnym i indukowano przez 1 godz. 30 min. w 37°C. Po przemyciu, do każdego dołka dodano kompleksu streptawidyna-biotynylowana peroksydaza (Amersham, Anglia), rozcieńczonego 1/1000 w buforze saturacyjnym, i inkubowano przez 30 min. w 37°C. Płytki płukano jak wyżej i inkubowano z roztworem o-fenylenodiaminy (Sigma) 0,04% i H2O 0,03% w buforze cytrynianowym 0,1 M, pH 4,5. Reakcję barwną przerywano po 15 minutach, dodając 2 M H2SO4 i odczytywano absorbancję przy 492 nm.

Miano ELISA określano jako odwrotność rozcieńczenia surowicy, w którym absorbancja (gęstość optyczna mierzona przy 492 nm) wynosiła 50% maksymalnej wartości (miano środkowe).

Miana ELISA obliczano przy pomocy 4-parametrowej analizy regresji liniowej z użyciem programu komputerowego.

3.1.2. Wykrywanie przeciwciał IgG swoistych dla rgD2t w wypłuczynach z pochwy.

Wypłuczyny z pochwy najpierw kalibrowano na całkowitą zawartość surowicy za pomocą testu ELISA w następujący sposób. Płytki Maxisorp Immuno pokryto przez noc w 4°C roztworem 1 μg/ml (50 μ na dołek) oczyszczonego przeciwciała kozy anty IgG świnki morskiej (Sigma, Belgia), rozcieńczonego PBS. Płytki płukano i inkubowano z buforem saturacyjnym jak wyżej. Szereg dwukrotnych rozcieńczeń wypłuczyn z pochwy w buforze saturacyjnym (poczynając od rozcieńczenia 1/100) dodawano do płytek. Do każdej płytki dołączono krzywą standardową z oczyszczonej IgG świnki morskiej (Sigma, Belgia), w dwukrotnych rozcieńczeniach poczynając od stężenia 100 ng/ml.

Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej płytki płukano jak wyżej i do każdego dołka dodano skoniugowane z biotyną przeciwciała barana swoiste dla IgG1 i IgG2 świnki morskiej (Serotec, Separ Biochem Belgia), rozcieńczone 1/1000 w buforze saturacyjnym, i inkubowano przez 1 godzinę 30 minut w 37°C. Dalsze etapy (dodanie kompleksu streptawidynabiotynylowana peroksydaza i wywołanie barwy) wykonano jak opisano wyżej (3.1.1).

Całkowite stężenia IgG w wypłuczynach z pochwy wyznaczono z krzywej standardowej IgG, przy pomocy 4-parametrowej analizy regresji liniowej używając programu komputerowego.

Po kalibracji całkowitej zawartości IgG, wypłuczyny z pochwy badano na obecność przeciwciał IgG swoistych dla rgD 2t, przy użyciu tego samego testu ELISA jak opisany dla ilościowego oznaczania przeciwciał anty gD w surowicach. Wyniki wyrażono jako gęstość optyczną mierzoną przy 492 nm na 0,5 μg/ml całkowitej IgG.

3.2. Test neutralizacjj.

Test neutralizacji na płytkach 96-miejsjowych przeprowadzono następująco:

Szereg dwukrotnych rozcieńczeń badanych próbek przygotowano bezpośrednio na płytkach 96 W (25 μl surowicy/dołek każdego rozcisńjasnic, podwójne próby). Do każdego dołka dodano 50 μ! mieszaniny zawierającej 4000 jednostek pfu wirusa HG52 i dopełniacz (końcowe stężenie w dołku 1/100). Płytki iekubowaeo przez 1 godz. w 37°C. 100 μl zawiesiny komórek BHK 21 (4-10⁵komórek/ml) dodano następnie do każdego dołka (4-10⁴ komórek/dołek). Płytki wirowano przez 5 minut przy 1000 obr./min. i inkubowano przez 5 dni w 37°C, w obecności 7% CO2.

170 059

Po tym okresie płyn hodowlany delikatnie usunięto i do każdego dołka dodano 100 μΐ roztworu fioletu krystalicznego (10% metanolu, 90% H2O,0,3% fioletu krystalicznego), po czym inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie płytki płukano obficie wodą wodociągową. Obecność łysinek można było z łatwością obserwować pod mikroskopem.

Miano neutralizacyjne określano jako najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym nie obserwowano łysinek wirusowych (100% ochrony przed przed efektem cytopatycznym). Należy zauważyć, że w tym czasie w dołkach kontrolnych obserwowano całkowity efekt cytopatyczny (100% liza jednowarstwowej hodowli komórek).

3.3. Nadwrażliwość typu opóźnionego.

Poszczególne preparaty rgD 2t badano również na ich zdolność do wywoływania swoistej odpowiedzi immunologicznej limfocytów T, mierzonej indukcją nadwrażliwości typu opóźnionego.

W tym badaniu zastosowano preparaty adiuwantowe przygotowane do doświadczenia pierwszego. Preparaty te zawierały 5 μg rgD2t w dawce 0,25 ml. Schemat uodpornienia był następujący: pierwsza immunizacja: 0,25 ml szczepionki domięśniowo; dawka przypominająca: 0,25 ml szczepionki domięśniowo 21 dni później; test skórny: 5 μg rgD2t śródskórnie (w roztworze soli fizjologicznej) 8 dni później. Jako kontrolę, u wszystkich świnek morskich wykonano test skórny roztworem fizjologicznym soli.

Dodatkowo u kontrolnych świnek morskich (nie uodpornionych) wykonano test skórny z rgD 2t. Zaczerwienienie i stwardnienie w miejscu śródskórnego wstrzyknięcia oceniano 24 i 48 godzin później.

3.4. Model dopochwowy świnki morskiej.

Model zakażenia narządów płciowych HSV u świnki morskiej został opisany przez L.R. Stanberry i in. (J. Infectious Diseases 1982, 146, 397-403; Intervirology 1985, 226-231).

W skrócie, dwa tygodnie po ostatniej immunizacji świnki morskie zakażono dopochwowo 10⁵jednostek pfu HSV2, szczep MS. Kliniczny przebieg zakażenia pierwotnego badano codziennie, obserwując występowanie i nasilenie zmian na skórze zewnętrznej okolicy płciowej przez okres 12 dni po challenge’u.

Wymazy z pochwy pobierano 5 dni po challenge’u wirusowym i badano na obecność zakaźnego wirusa HSV2 metodą łysinek, jak opisano niżej. Następnie w dniach od 13 do 60 zwierzęta badano codziennie na obecność opryszczkowych zmian nawrotowych. Zmiany opryszczkowe skóry zewnętrznej okolicy płciowej oceniano ilościowo przy pomocy punktowej skali zmian od 0 do 4 (0 = brak zmian lub zaczerwienienia; 0,5 = zaczerwienienie; 1 = pęcherzyk;

1.5 = > 4 małe pęcherzyki; 2 = większe pęcherzyki; 2,5 = kilka dużych pęcherzyków w wyniku zlewania się pęcherzyków takichj ak w punkcie 2; 3 = wielkość i liczba pęcherzyków zwiększone;

3.5 = zmiany pokrywające całą powierzchnię skóry okolicy płciowej; 4 = zmiany wrzodziejące zmacerowane).

Stopień ochrony przez poszczególne rgD2t szczepionki oceniano według kryteriów podanych niżej.

Ochrona przed chorobą pierwotną (dni 0-12).

Zwierzę uznawano za nieochronione jeśli zanotowano następujące zmiany:

- więcej niż jedno miejsce zaczerwienienia w dowolnym czasie,

- jedno miejsce zaczerwienienia utrzymujące się przez co najmniej 3 kolejne dni (skala zmian 0,5),

-jeden lub więcej pęcherzyków (skala zmian > 1).

Ochrona przed chorobą nawrotową (dni 13-60).

Zwierzę określano jako dodatnie pod względem choroby nawrotowej albo jeśli wartość 0,5 skali zmian notowano przez co najmniej 2 kolejne dni, albo jeśli wartość <1 stwierdzono dowolnego dnia. Przed epizodem choroby nawrotowej i po nim obserwowano dzień bez jakichkolwiek zmian lub zaczerwienienia.

Nasilenie zmian u danego zwierzęcia oblicza się jako sumę punktów skali zmierzonych podczas zakażenia pierwotnego (dni 1-12). Częstość występowania zmian wyraża się jako liczbę

170 059 zwierząt, które wykazywały zmianę < 1 skali w okresie obserwacji [dni 1-12 (chorobapierwotna) albo dni 13-60 (choroby nawrotowe)].

3.5. Miareczkowanie wirusa w wymazach z pochwy.

Wymazy z pochwy pobierano 5 dnia po challenge’u wirusowym. Jamę pochwy wycierano wacikiem z alginianem wapnia na końcu, uprzednio zwilżonym podłożem podstawowym Eagle’a uzupełnionym 2% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM glutaminy, 100 J/ml penicyliny, 100 pg/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny, 100 pg/ml gentamycyny i 1pg/ml amfoterycyny B (podłoże do wymazów).

Koniec każdego wacika odłamywano i umieszczono w jałowej próbce 5ml(12x75 mm), zawierającej 1 ml podłoża do wymazów. Probówki wstrząsano celem uwolnienia wirusa i zamrażano do chwili użycia. W celu mianowania, 6-miejscowe płytki do hodowli, zawierające 5-10⁵ komórek/dołek, inkubowano przez noc w 37°C. Probówki odmrażano i przygotowywano szereg rozcieńczeń próbek w podłożu do wymazów. Po usunięciu podłoża hodowlanego z 6 dołków, 200 pl każdego rozcieńczenia próbki (podwójne próby) nakładano na jednowarstwową hodowlę komórek i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Do każdego dołka dodawano 4 ml podłoża hodowlanego, zawierającego 1,5% karboksymetylocelulozy i płytki następnie inkubowano przez 2 dni w 37°C. Po tym okresie inkubacji podłoże delikatnie usuwano i do każdego dołka dodawano na 15 minut 1 ml roztworu fioletu krystalicznego (10% metanolu, 90% H2O, 0,3% fioletu krystalicznego). Następnie płytki dokładnie płukano i liczono łysinki. Miano HSV wyrażano w jednostkach pfu/ml.

4. Wyniki.

W pierwszej serii doświadczeń grupy świnek morskich immunizowano niską dawką antygenu (5 pg rgD2t), zawarty w 4 różnych preparatach. Tę suboptymalną dawkę antygenu zastosowano aby wybrać najskuteczniejszą kombinację rgD 2t/adiuwant, która, podana świnkom morskim przed zakażeniem dopochwowym HSV2, mogłaby zapewnić ochronę przed pierwotną i nawrotową chorobą HSV (próby zapobiegawcze).

4.1. Indukcja odporności humoralnej.

Jak widać w tabeli 1, grupy szczepione preparatami rgD 2t zawierającymi 3D-MPL jako immunostymulant wykazywały w surowicach wyższe miana ELISA i neutralizacji niż grupa uodporniona szczepionką rgD 2t/wodorotlenek glinu. Dobre średnie miana neutralizacji obserwowano po 3 immunizacjach rgD2t 3D-MPL o/w (R) lub rgD 2t/wodorotlenek glinu 3D-MPL.

4.2. Indukcja odpowiedzi komórek efektorowych T (DTH).

Wyniki testu skórnego (tabela 2) wykazały, że rgD2t w preparacie 3D-MPL emulsja o/w wywołała najsilniejszą odpowiedź DTH. Swoistą odpowiedź DTH indukował także rgD2t'wodorotlenek glinu/3D-MPL. Podobne doświadczenia przeprowadzone na myszach również wykazały, że kombinacja rgD2t/wodorotlenek glinu/3D-MPL bardzo silnie indukowała in vivo odpowiedź komórek efektorowych T, w przeciwieństwie do preparatu rgD2t/wodorotlenek glinu.

4.3. Wpływ szczepienia na chorobę pierwotnąHSV.

Dwa tygodnie po trzeciej immunizacji świnki morskie zakażono dopochwowo HSV2. Wpływ szczepienia na kliniczny i wirusologiczny przebieg pierwotnego zakażenia HSV2 jest przedstawiony w tabeli 1 i podsumowany w tabeli 3. W porównaniu z grupami kontrolnymi, które (grupy 4 do 6) po zakażeniu przebyły ostrą chorobę pierwotną, 100% zwierząt szczepionych preparatem rgD2t/3D-MPL o/w nie wykazało objawów zakażenia opryszczkowego, jak to wynikało z obserwacji występowania i natężenia zmian skórnych. Ponadto u tych zwierząt nie wystąpiła replikacja wirusa w pochwie, co wykazano mianowaniem wirusa w pochwie 5 dnia po challenge’u. Bardzo podobne wyniki stwierdzono w grupie szczepionej rgD2t/wodorotlenek glinu/3D-MPL. W tej grupie w żadnym przypadku nie rozwinęły się pęcherzyki opryszczkowe w okresie obserwacji (< 1 skali zmian). Ponadto w wymazach z pochwy można było wykryć tylko bardzo niską replikację wirusa. Natomiast zwierzęta szczepione rgD 2t adsorbowaną na wodorotlenku glinu wykazały słabą ochronę (75% występowania zmian skórnych).

170 059

4.4. Wpływ szczepienia na chorobę nawrotową HSV.

Wyniki ilustrujące fig. 1 i są podsumowane w tabeli 4. Szczepienie rgD 2t w preparatach zawierających 3D-MPL (grupy 1 i 2) w znacznym stopniu wpłynęły na rozwój nawrotowych chorób opryszczkowych. Te dwie grupy wykazały znacznie mniej epizodów nawrotowych i liczbę dni nawrotów niż grupy kontrolne albo szczepione rgD2t/wodorotlenek glinu.

W celu dalszej oceny czynników wpływających na skuteczność profilaktyczną szczepionek rgD 2t zawierających 3D-MPL, przeprowadzono drugą serię doświadczeń na większej liczbie świnek morskich.

Porównano dwie dawki antygenu (5 pg i 20 pg) i zbadano różny skład adiuwantu. Podawano trzy dawki uodpamiaj ące w dniach 0,28 i 84. Co dwa tygodnie zwierzętom pobierano krew do indywidualnego oznaczania przeciwciał metodąELISA i testem neutralizacji. Po drugiej immunizacji pobierano wypłuczyny z pochwy, które badano na obecność układowych przeciwciał swoistych dla rgD 2t.

Indukcja odporności humoralnej

Wyniki (tabela 5) wskazywały, że wszystkie preparaty rgD2t zawierające 3D-MPL były zdolne stymulować wysokie miana ELISA i neutralizacji w surowicach świnek morskich.

Średnie miana ELISA i neutralizacji, indukowane po trzech immunizacjach, były bardzo podobne w surowicach grup szczepionych preparatami rgD 2t zawierającymi zarówno 5 pg, jak 20 pg gD 2t. Nie było istotnej różnicy w odpowiedzi humoralnej mierzonej w grupach immunizowanych szczepionką rgD2t/wodorotlenek glinu, zawierającą zarówno 50 pg 3D-MPL (grupa VI), jak 100 pg 3D-MPL (grupa X).

Jest interesujące, ze przeciwciała układowe anty-rgD 2t (klasy IgG) można było wykryć w wypłuczynach z pochwy we wszystkich grupach szczepionych. Ta odpowiedź przeciwciał anty-rgD2t, zlokalizowanych w śluzie, może odgrywać ważną rolę ochronną zmniejszając obciążenie zakaźnym wirusem dróg rodnych podczas pierwotnego zakażenia.

Wpływ szczepienia na chorobę pierwotną HSV.

Dwa tygodnie po trzeciej immunizacji świnki morskie zakażono dopochwowo HSV2. Wpływ szczepienia na kliniczny i wirusologiczny przebieg pierwotnego zakażenia HSV2 jest podsumowany w tabeli 6. W porównaniu z kontrolami, zwierzęta szczepione preparatem 5 pg rgD2t/wodorotlenek glinu/3D-MPL, zawierającym zarówno 50 pg jak 100 pg 3D-MPL (grupy VI i X) wykazały istotną(p < 0,05) redukcję nasilenia zmian skórnych oraz redukcję częstości występowania zmian skórnych.

Bardzo podobne wyniki stwierdzono w grupie szczepionej 5 pg rgD2t w 3D-MPL emulsji o/w (grupa III). W tych trzech grupach szczepionych można było wykryć tylko bardzo niską replikację wirusa w wymazach z pochwy pobranych 5 dni po challenge’u.

Wpływ szczepienia na chorobę nawrotnaHSV

Wyniki sąpodane w tabeli 6. W porównaniu z grupami kontrolnymi, w tych trzech grupach szczepionych częstość występowania zmian skórnych oraz liczba dni nawrotu były istotnie (p <0,05) niższe. W grupach tych również wystąpiło mniej epizodów nawrotowych niż w grupach kontrolnych.

5. Wnioski

Wyniki otrzymane na świnkach morskich wyraźnie wskazują, że szczepienie preparatem rgD2t zawierającym 3D-MPL, podanym w emulsji oleju w wodzie albo w kombinacji z wodorotlenkiem glinu, daje bardzo skutecznąochronę przeciw pierwotnej i nawrotowej chorobie HSV2 przy podawaniu świnkom morskim przed zakażeniem HSV2. Te preparaty rgD 2t 3D-MPL poprawiają zdolne poprawić swoistą odpowiedź immunologiczną humoralną (przeciwciała neutralizujące) i komórkową za pośrednictwem komórek efektorowych (DTH). Wyniki te otrzymano przy użyciu niskiej dawki rgD2t (5 pg).

6. Immunogenność preparatów rgD2t u naczelnych.

6.1 Porównawcza immunogenność preparatów rgD 2t/wodorotlenek glinu i rgD 2t/wodorotlenek glInu/3D-MPL.

170 059

Immunogenność szczepionek rgD2t/wodbrotlenek glinu i rgD2t/wodorotlenek glinu/3D-MPL oceniano na małpach Cercbpithecus aethiops (afrykańska małpa zielona (AGM)). Uodporniono je trzykrotnie, w miesiącach 0,1 i 3. Mierzono swoistą odpowiedź immunologi(^:anihumoralną(ELISA i neutralizacja) i komórkową za pośrednictwem komórek efektorowych (DTH).

6.1.1. Przebieg doświadczenia.

Każdy z preparatów zawierał 20 mg rgD2t i 0,5 mg równoważników Ał³⁺ na dawkę. Zastosowano dawkę 50 pg 3D-MPL. Grupy małp Cercopithecus aethiops (AGM) immunizowano 3 razy w dniach 0,28 i 84, domięśniowo w dawkach po 0,5 ml (20 rgD 2t). Co ± 2 tygodnie zwierzętom pobierano krew do oznaczania przeciwciał metodą ELISA i testem neutralizacji. Oba preparaty zbadano również na ich zdolność do indukcji odporności komórkowej T, mierzoną indukcją nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH). 13 dni po drugiej immunizacji małpom wstrzykiwano śródskórnie na brzuchu różne dawki rgD2t (20, 5 i 1 pg) w roztworze fizjologicznym soli. Testy skórne wykonano również tym samym roztworem fizjologicznym soli jako kontrolę. Zaczerwienienie i stwardnienie w miejscu śródskórnego wstrzyknięcia badano 24 i 48 godzin później).

6.1.2. Wyniki.

a) Indukcja odporności humoralnej.

Przed szczepieniem żadna z surowic małp nie wykazywała aktywności przeciwciała anty-HSV2 (dane nie przytoczone). Jak widać z tabeli 7, obie szczepionki indukowały dobre miana ELISA i neutralizacji po drugiej immunizacji. Ta odpowiedź nie podniosła się po trzeciej immunizacji u małp szczepionych rgD 2t/wbCorotlenek glinu. Natomiast małpy, które otrzymały trzecią dawkę rgD2t/wodorotlenek glinu/3D-MPL odpowiedziały zwiększeniem przeciwciał ELISA i neutraliyacyjnyzh (średnie miano ELISA: 10056, średnie miano neutralizacji: 950).

b) Indukcja odpowiedzi komórek efektorowych T (DTH).

Wyniki testu skórnego (tabela 8) wykazały, rgD2t w połączeniu z wodorotlenkiem glinu i 3D-MPL bardzo silnie indukowała in vi\O odpowiedź komórek efektorowych T, w przeciwieństwie do preparatu rgD2t/wodorotlenek glinu. Silną odpowiedź DTH obserwowano u wszystkich zwierząt szczepionych rgD 2t/wodorotlenek glinu/3D-MPL, u których testy skórne wykonano z 20 pg rgD 2t. Swoistą odpowiedź DTH można było zmierzyć także z mniejszymi stężeniami gD2t (5 oraz 1 pg) u większości małp (3/4 dla dawki 5 pg i 2/4 dla dawki 1 pg). Te dawki rgD2t wywoływały słabsze odczyny skórne niż stężenie 20 pg rgD 2t.

6.2. ImmunobennnSć pi-rppaatów rgD2Łtwo0dsrSlennk glinn/3D-NML u mml-p rhesus.

Immunogenność szczepionek rgD 2t/wodorotlsnsk glinu./3D-MLL, zawierających różne dawki rgD2t (100, 10 lub 5 pg), porównywano u małp rhesus.

6.2.1. Przebieg doświadczenia.

Każdy preparat zawierał 0,5 pg równoważników Al³⁺ i 50 pg 3D-MPL na dawkę. Trzy grupy małp rhesus (4 małpy w grupie) immunizowano trzykrotnie w dniach 0, 28 i 77, jak następuje:

Grupa 1: 100 pg rgD 2t/wodorotlenek glinu + 3D-MPL (50 pg),

Grupa 2: 20 pg rgD2t/wodorotlsnek glinu + 3D-MPL (50 pg),

Grupa 3: 5 pg rgD 2t/wodorotlenek glinu + 3D-MPL (50 pg).

Uodporniano domięśniowo w dawce 1 ml. Co ± 2 tygodnie zwierzętom pobierano krew do oznaczania przeciwciał metodą ELISA i testem neutralizacji.

6.2.2.Indukzja odporności humoralnej.

Przed uodpornieniem żadna z surowic małp nie wykazywała aktywności przeciwciał anty HSV2. Dobre miana ELISA i neutralizacji obserwowano u trzech szczepionych grup, które otrzymały 100, 20 i 5 pg rgD 2t w wodorotlenku glinu + 3D-MPL (dane nie przytoczone).

6.3. Wnioski.

Wyniki otrzymane na małpach Cercopithecus asteiops wyraźnie wskazują. że szczepionka rgD2t, zawierającą połączenie wodorotlenku glinu z 3D-MPL, znacznie poprawia swoiste odpowiedzi immunolbgizyns, humoralną (przeciwciała neutralizujące) i komórkową (DTH). W

170 059 porównaniu z tą szczepionką, preparat rgD 2t/wodorotlenek glinu słabiej indukował przeciwciała neutralizujące i nie był zdolny do indukcji odpowiedzi DTH in vivo.

Wyniki otrzymane na małpach rhesus również wykazuj że preparat rgD2t/wodorotlsesk glinu + 3D-MPL jest bardzo skuteczny w indukcji swoistej odpowiedzi hu-moralnej, nawet przy małych dawkach antygenu (5 lub 20 μ§ rgD2t).

7. Wyniki ogólne.

⁰ WynWi nirzymane na ew^kacA morskich wyrżnie wse^ują, że preparatp adiuwantawe zawierające 3D-MPL albo w emulsji olejowo-wodnej, albo w połączeniu z wodorotlenkiem glinu sąwysoys skuteczne w indukowaniu ochronnej odpowiedzi immżnologiyzesj przez szczepionkę z glikoaroteiną HSV otrzymaną na drodze rekombinacji DNA na modelu świnki morskiej, obejmującym dopochwowe zakażenie zwierząt, nawet przy bardzo małych dawkach antygenu (5 μg rgD2). Dane dotyczące ochrony również wykazują, że te preparaty rgD2t 3D-MPL są skuteczniejsze w zapewnieniu ochrony. Takie preparaty 3D-MPL podwyższają swoiste odpowiedzi immunologiczne, humoralną (przeciwciała neutralizujące) i komórkową (DTH).

Ponadto stwierdzono, że preparat rgD2t/wodorotlensk glinu^D-MPL także poprawia immunogeeeość na poziomie przeciwciał i indukuje odpowiedź komórek efektorowych T u naczelnych, co sugeruje, że ten efekt adiuwantowy nie ogranicza się do małych zwierząt.

170 059

Tabela 1

Odpowiedź przeciwciał anty-HSV w surowicach świnek morskich immunizowanych preparatami rgD2t, przed i po challenge© wirusowym

σ>	Miano neutra- lizacj i	220o ± 765	180o o 765	133o ± 461	14o ± 85	o cn τ—\| Ή LD > CM τ—1	11o o 141
Po challenge —	Miano Elisa	6872o ± 24648	2722o o 13093	2862o ± 24024	73o o 878	25o ± 244	22o ± 194
PrzeO challenge— ⁽²⁾	Miano neutra- lizacj i	1600	200o ± 800	60o ± 400	<50	<50	<50
Miano Elisa	8121 ± 20822	3987o ± 30165	2034o ± 23704	<100	<100	<100
fO Λί C O •H Λ Φ Ν O Ν ω	Adiuwant	3D-MPo o/w(R)	wodorotlenek glino 3D-MPL	wodorotlenek glinu	wodorotlenek glinu	3D-MPL	1
Antygen				1	1	nietraktowane
Grupa		,—1	CM	cn		LT)	i£>

υ ίΰ

Ν •Η c

g •Η

Τ~Ί

Φ •Η υ

φ

Ν

Μ

LD σι

CO

CM

Λ υ

φ

-Η β

Τ5

Φ •Η β

-Ρ

Ο μ

Λί

Ν

Ρ

-Ρ

Ο β

Φ £

Ο

Ν •Η β

β

Ή

Φ

4-1 α>

Ν

Μ

Φ

-Η

Ν

Οχ] ί>

ω

W ο

Μβ a

£ e

φ θ' β

φ φ

£ ο

Ό β

φ η

β φ

θ'

β.

ίΤ) α

θ' β

α) (Ο

Ό φ

.β υ

•σ φ

Ν β

a 'β φ

Ή

Ν τ>

φ •β β

φ ιβ >1 χ:

u

Ό

Ο β υ 'Ν

Ό Ο a a β

Ίχ]

Ό α

φ •Η β

Ό

Ο θ' >1 +J φ

-Η β

Ό

Ο

Φ -Η β Ό Ο θ' θ' >1 >, 4J 4->

Οχ] 04

Φ θ' β

φ

Φ β

Λ

Ο β

Φ •Η β

φ β

Ν υ

4-J

Φ β

4->

>1 β

Φ

-β β

Ό

Φ β

ΊΏ

Ο

Φ φ

υ •β s

ο β

β

Φ β

Φ

Ό

Ο a

•Η υ

'Φ ο

4-) β

φ &

170 059

T a b e 1 a 2

Wyniki testu skórnego (DTH) u świnek morskich szczepionych preparatami rgD2t

Odczyt po 48 godz.	H	10 (N) 3 12 (N)	tf co o	o o o	o o
ω	O Lf) tH rH rH	O CM CM t—i ł—i t-η	o o o	o o
Odczyt po 24 godz.	H	15 10 17 (N)		o o o	o o
ω	O Lf) O CM <-l CM	S £	o o o	o o
Świnko morska	=łł=	a cn ω	rH CM Γ0	r-\| CM CO	T-l CM
Preparat	oS o A ββ S 1 Q n A <SJ Q Cn β	rgD2t wodorotleneO glinu 3D-MPL	wodorotlenkO gliuu 3D-MPL	eiitrak0owaei

rH O) CM CM

-H	3 -H
O	β Ό
A
O	5
03
•H	-H
β	i—1
Ό	0 W

£ θ' β

4-1 (0 >4 rfl a

ω β

a

Cn g

Lf)

O

S

O •H β

'10 d>

-H g

O

Ό

O (O s

o

N

-H β

-H

CD •H

A

CO β

O g

-H

A β

-H 'W β N U -H Cn O i—I o

•o

N

-H

M (1)

N β

O

S

A

N

O β

A

CJ a

Cn β

Cn g

LO

O β

ro £

•H

A

N

A to

S (1)

-H β

β

Ό

A

CO

Ό

Ό β

ίο (0 β

•β

Ν

Ό

Ο

Cn co

-β

A (Ν

Ο a

ο β

(Ο

Α

Ν υ

τ) ο

>1 β

β

Α

C0

CD

Η

E = zaczerwienienie w miejcuu wstrzyknięcaa śródskónnggo (w milimetrach) I = stwardeienio w miejsuo wstrzykniecie śródskónngge (w milimetrach)

N = martwice w miejcuei wykonanie testu skórnego

170 059

Tabela 3

Wpływ uodpornienia preparatami rgD2t (1) na kliniczny i yirusologiznyy przebieg pierwotnego zakażema HSV2 u świnek morskich

Miana wirusa w pochwia (4)		o	6,2a ± 12,4	357a ± 6010	52ia ± 6295	329a ± 4475	2214 ± 4519
Nasilenie zmian skórnych (3)		o,a ± 0,3	a n 0,4	4,4 ± 2,7	6, a ± 2,6	5, 1 ±3,6	7,a ± 4,7
Występowanie zmian skórnych (2)		0/4	o	3/4	5/5	4/5	CO
Szczepionka	Adiuwant	3D-MPn o/w (R)	wodorotlenen glinu 3D-MPL	wodorotlenen glinu	wodorotlenen glinu	3D-MPL	1
c Φ Cn >1 -P			©Cfór	1	1	nietraktowane
Grupa	T—(	CN	CO		LO	(O

lO cn

-H

CN x:

υ

Π3 •H φ

•H

CJ

-P o

P >1

N p

-P o

c

Π3 s

o

N •H £

Q>

N

P

0) •H

N

Cn

P f0 £

Ό

Φ ?

O

Ό μ

<o

Ό β

<0

4-1 to

-ΓΊ

Φ

O

-P

Λί

CJ α

-H i—I (0 X to

Cn β

rH

Ό

Φ

S β

Φ

I—1 υ

Ό o

-Η ftJ β

N

U >.

4-J

Φ e

4-1 >1 β

ra β

Ό

Φ β

Ό5

CM .—I I

β φ

θ' β

φ (0 υ

υ >1 β

(0 β

Ο a

υ ο a υ

to

Μ (0 >

ω

X ο

c fO •Η g

Φ

Ν

W •Ν >ι

-ΓΊ

Φ

C

170 059

Tabelo 4

Wpływ uodpornienia preparatami rgD2t (1) na nawrotową chorobę HSV narząóów płciowyhh u świnek morskich

Liczbs Oni nawrots (4)		0,i ± 1,5	1,i w 3,5	8,i ± 5	7, i ± 6,5	6,i i 4,4	9, 9 i 6
Epizods choroby nawrotowei (3)		1 ± 2	1 ± 0,8	LD P +1 cn •sjt	3,i ± 3,3	2, i ± 1,1	3,i ± 2,2
Występowanie zmias skórnych (2)		x—1	2/4	3/3	4/5	5/5	8/9
Szczepionka	Aditwant	3D-MPS o/w (R)	wodorotlenei glint 3D-MPL	wodorotlenki glint	wodorotlenki glint	3D-MPL
Antygen			©aha	1	1	nietraktowane
Grtpa	<—1	CN	cn		LD	kD

LT) σ»

P

CN o

p ϋ

to

P c

TJ

Φ •H

CJ

P

O μ

Ν μ

P ο

cj to

S o

N

CJ to

P d>

N μ

φ

P

S

N cn

Li)

II

P

Cl

Q

Cn fi (0

S ra

Ό

CN >

OT

W fi

Ή a

<1>

•fi

W o

fi xs <D

-m ιΛ

O

Φ

P

C 'N

O

CU

CJ

TJ o

Cn >1

P o

o a>

P to fO s

o

N μ

Φ

P

Λ!

to μ

(0 £

O

P o

Ci s

to c

TJ o

N

I (1)

P ϋ

G>

CU (0 c:

(0

Z o

CU d>

P co β

Φ

P fi

Ό fi

Ό

0)

Φ •H

C

Φ t—I >1

TJ

O

-H t0

CJ

N υ

P φ

g

P

Ci to (0

P c:

TJ φ

P 'CO o

(0 •m <D

O

-P fi fi a

•H

P fO

Λί

CO

Cn

P

TJ

Φ

Ξ

Al £>i c

fO

P g

N

O rtf ’ΓΊ α

Ν fO

Λ!

P (tf

N μ

φ

P s

N o

kO

I

ΓΩ

P β

TJ

CU

Φ

P (0

Tp

ϋ

Φ

S μ

φ

CO p

o φ

P co

Φ μ

o £

C

Φ

P g

N

Φ

P 'CJ

Φ

P

N

TJ

P to

E£ o

CU

Φ*

P

CO £

a £

o p

O μ

S cj

Φ

P

N

TJ o

N

P

CU

Φ o

CU

TJ

Φ

N μ

Cu cn

O t—I (0

-ΓΊ	Φ
Φ	CJ
£	0
O	•N
P	to
	μ
CJ
2
CU P	P Λί
P	P
CTJ	CJ
Λί	>1
CO	ES
Cn
CJ
P	-ΓΊ
TJ	Φ
Φ	S
s	O
LQ	P Λί
	CJ
o	2
	CU
Φ	-fi
P	1—1
CJ	fi
Φ	24
P	to
CJ Φ	Cn
P	fi
2	a
μ	Ό
φ	<1>
M	s
o (0	x—1
N	ΛΙ
P
g flj
P	T
c:	o
TJ	24
to	N
g	fi
o	<D
£	23
TJ	U
-ΓΊ	d> a
Φ	-—
P CJ	fi
g	24
’ΓΊ
to	N
CJ	fi

o kO i

cn ρ

CJ

TJ

-H

-ΓΊ

U rO

S μ

φ co

P o

co φ

μ o

φ o

P μ

to

TJ

CJ to

P co (4) całkowita liczba dni, w których u zwierząt obserwowano epizody nawrotowe opryszczki ± odchyleni standardowe (okres obserwacji Oni 13-39)

170 059

Tabela 5

Porównanie wpływu różnych preparatów adiuwantowych na immunogenność rgD2t u świnek morskich

:eciwciał mnizacj ach 1 challen- :chh (4) Miano neutr.	07 07 ?—i Ή o o n	ch r- co CM Ή CM cn	cn CO co CM HI O co o	CM O -f) CM Ή o kD Lf)	kD > CM CM Ή O CO CM CO	o τ—i Lf) t-H -HI o kD CM	O Z) V	o -f) V	O -f) V	00 rkD t—1 HI o kD Lf) CM
Odpowiedh prz ph trzech imn - miano przeć ge'h (3) W surowic Miano Elisa \|	T—1 r«—ł O t—1 Ή co -O Ch 0) i“1	o CM ι—1 O 'C¹ Ή CO co kD r—ł Lf)	36647O2412O \|	τ—i CM CM CM -HI CM co o -f)	kD co Γ- Η Lf) «—i O kD ι—I	20488±9562	o o T-1 V	o o «-i V	o o T—1 V	16588±6945
iwo immuni- W wypłuczynach z pochwo (5)	kD > n o Ή o co > o	> > t—1 O H o o o <—1	I 0, 700±0,2O2 I	o o CM O Ή o > Lf) o	-Γ) > i—i O Ή o CM kD O	0,200+0,755	o CM O o V	o CM O O V	o CM O o V	0, 671±1,877
zeciwciłO po e cach (2) Miano neutr.	kD 07 cn Ή o Lf) CO	kD CM Ή CM t—1	1 138O±75C I	τ—1 Lf) Ή o co	07 07 -H O	420±301	o Lf) V	o Lf) V	o Lf) V	163±151
Odpowiedć pr: zacjach W surowi Miano ELISA	=> CO o 07 -HI CM kD Ή co	-f) 07 rn r—ł HI Lf) <—I o Lf) CO	1 1672O±1264C 1	Lf) 00 co 07 -HI CM 07 07 H	kD > > Ή CM Lf) τ—I	1O174±4219	o o H V	o o T-i V	o o t—1 V	4672±3953
Szczepionko (1) Adiuwant	cź £ o CP Zł. o LT) P CU § rn	\| 3 DMPh (5O pg) o/w (R) \|	ω S o CP zł. o Lf) § rn	OT 2 O Cn a o OT £ m	wodorotlenkh glinu 3DMPO (5W gg)	wodorotlenkh glinu 3DMPO (5O μg)	wodorotlenkh glinu 3DMPO (5O Hg)	3DMLO (5O μg) o/w (R) \|	nietraktowane	wodorotlenkh glinu 3DMPL (10O μιςτ)
Dawka	Ch i s	CP zł. Lf)	Cn a o CM	CP -f)	CP zł. o CM	tP zt Lf)	1	1	1	CP zł. Lf)
Grupa	1—I	H H	HI Hi HI	> H	>	ΙΛ	VII	HI HI HI >	X H	X

•H ’χ:

o-H nw u -h a 3 o rM c

Λ! a co e o > t-i E+J Ϊ3 -H CO O o-η a (ΰ c +j Ό cd ω α> ω u o N -r-t-H -H H 2 5 CD O O -H 2 Η H 3 3 CS] OT OT cp co -H; -m U

(Ο Ό B O

CM OT OT

170 059 >

I

H

H >

α

P

W

O (Ź %

O X O oP

LD

44 co ©Ρ σ'

ΓLD ω

Γ** ρ w _α

Tabela 6

Wpływ uodpornienia preparatami rgD) na przebigg kliniczny i yirusoiogiznyy zakażema HSV2 u śwńnek morskich

SZCZEPIONKA

-1-1Q

Cn

P

Cn i

Q

Cn

P β

•P rH θ'

4*!

<D β

0) <P

P

O

P

O

Ό

O

S θ' zł.

X (0

CU

P

Cu § ω o

CJ β

•P rp θ'

Cn

U Λ β o o <—ł iD

P

O P

Cn O =L Ό O 5

LO »-q nj CU CU § ? Q Ju m O %, S Q

Cn O h P

Pl ’(0 Cn CU CU zl. S 2

Q P m ro 0 oP

O +1 σι o

o rp

O oP

O r* o

r* o

oP »—i <—ł

CM <—ł

Λ ϋ

>1 0) β ·Ρ Ρ £ Ό 4C 44 U W Ο CU β <ΰ 5 -Ρ β Π) ν to 3

α) ρ •Η ·Ρ β 5 ' 0) i—I Π3 ♦Η β W Π3 σΡ

Ο ω

οΡ

Ο

CM οΡ

CM

CM σ' \

CM

ΓCM

LD

CM

LD σ'

CM

Λ ϋ

>1 ο

-Ρ ο

Ρ (ΰ β

Ρ β

Ό (ϋ

Ρ

Ν ϋ

•Ρ

Ρ

Ο >.

Ο

4-)

Ρ

Π3 β

S

Ό

Ο

Ν •Ρ

CU (I) (0 ρ

Ν υ

§ -Η

4J Ł U (0 ·Ρ S 2 w

<d >ι (ϋ asp ω

® Λ _ 44 5

-!? -8 υ •ρ

170 059

Tab e a a 7

Wynikli DTH u zietonych mapo afrykańskich szcz^e^pik^nych gD2t-wodoIΌlienek glinu albo gD2t-wodoIΌlienek glinu-3D MPL

OdczyO p° 48 godzinach ί	20 pg	lilii	I I I Bałato
_) a © a lo	lilii	IP Η Η 1
_> a fi ^Χa a	Q Q Q Q Q	1 W W 1
cn 0Q a	lilii	1 1 1 1
OdczyO p° 24 godzinach \|	, Cn -> X M “*· 3n ° CN	lilii	sf ? CD ¹ e Λ g ¹ g _Mca O B 6 W ^M
_i a a lo	lilii	CO nl 6 1 Bi ^ωιπ £n g ¹ C—1 T—ł
_j a © a	Q Q Q Q o 22222	E 1-2 mm E 1-2 mm
PBS	lilii	1 1 1 1
	Małpa Nr	CO ΟΊ CO tO Lf) LT) LO LO LO co co co co cn O O O O O	co a lo ld θ’ fi C-~ tp ησισηη O O O O fi) fi) fi> fi)
	SzcyeO-ibnka	gD2t wodorotlenek glinu	gD2t wodorotlenek glinu 3D MPL

G

N υ

-P a

O

I-1 o

-m tSJ

-P <P <D

N

P

O

-P

N

O fil

-P £

CsJ

Q .p

Q fi a •P fi -P Ρ 24 fi 5 a to ω Ό ρ a ω

G

Cn-N ao ρ

ο ^24 υ

° 3 ? Ν ο ρ •Ρ G '10 > ω- *

Φ

-Η

G

Ρ

Ό -24 co Κ) (Ν Ό _,Ό •ρ ρ 'Μ

Ο θ’

G

Ό fi

Β· ο

Ό

-Ρ ο

υ

24-ρ • φ -ι—ι 24-Η υ υ G 24 fi-ρ φ G -Ρ -Ρ -Γ-ι G Ν Φ-Ρ G

Ρ ·ι—ι &Ό 24 οο w μ< Ό Ό 24 -ρ Ρ W 'Μ Ό -φ Ό (Ν fi Ρ υ 'Μ Ο Μ a-m fi ω υ Ο-Ρ κι G S -η fi ω

4_) φ >ι-Ρ Ν G ω

G

Ρ

Ό

Ο G ο φ ω fi

Ό-Η -Ρ Ο G G _οφ φ 24 >ι-Ρ -Ρ >ι G £ G Ź Ρ Ρ Ό Ό Φ Ρ Ο 24 Ν rd -Ρ ω υ 5 G fi .ρ Ν w II

-Ρ ω

Φ

170 059

O β β 4-1

H H ł—l •H β

Ti rt)

-H β

(1) β

O o o o -β 04

LT) o o o o CO 04 +I

ΙΌ

Ο)

ΙΌ θ' +1

O 'a· a κ

O β

rt)

-H w

H

XI w

Ο ΟβΟΊ 04	00 (2
ιΌ τβ Ο 04 Ο	σι £
Ο β C4 00 00	ί £
04 04 τβ CO 04	CM$j

00

TJ<

Ο 00 ΙΌ

Γ~~ θ' σ γ— 'θ'

CO CO co

ΙΌ

Ο

Ο σ

οο •α·

-H

Porównawcza immunogenność preparatów gD2t-wodorotlenek glinu i gD2t-wodorotlenek glinu-3D MPL u zielonych małp afrykańskich; odpowiedzi serologiczne lO •H β

T β

β

T

0	β
β	4-1
β	β
β	03
53	β

o o o o

OJ τβ w

I-i

XI w

o β

rt)

-β s

ιΌ

ο Ο Ο ο ο ο ο ο

C4 CO C0 τβ

m co o o o co rWCWLf) H jc τβ 00 00 Γ ΙΌ I-I ββββΝ OJ ο β η ο co ~ σ co uo co ,β Lł τφ οο σι co co

Ω [ C4 00 ^ +[ ο

τβ β

β τ

ω β

Ό

4-J

Λί

04 CO LO CO 00 L r- oo τβ C cn τβ El

LO 04 00 04 co CM JO co oo cm lo oo 2j?|

LO σ

ο

-β

ΙΌ

Ο co Γ— ·β τβ 04 LO Γ

Ο ο

ΙΌ σ

CM β· β

β +1

Ο	β
β	4-1
β	β
-β	ω
52	β

O

ο ο

Ο

CO τβ ο ο ο ο 00 04

Ο ο

Γη co co +1 o < β co rt) H 2 W co τβ co -a* oo co r- ή β >β O) τβ τ—I ΙΌ β

ο

Ο

Ο)

CO ο

Ο) +1 ο 04 τ—I θ' θ' η

β β

Ο ΙΌ σ τβ σ υ^-) θ' CO

ΙΌ τβ ο

σ β

C0

C0 οο +1 β

s

00	σ	00		kO
LO	ιΌ	CO	kO	kO
00	00	ιΌ	η	ΓΟ
Ο	Ο	Ο	ο	ο
Τ	Τ	Τ		>Ό

Β £

β Ω • ω β

'03 +1

C0 σ ιΌ ιΌ β β Γ τβ οο οο οο ιό

Ο Ο Ο Ο ΡΡΟΟ £

Λ Ο • ω β

'03 +1 β

Λ) β

o •Η a

ω

C4 u

N

CO

Λί ω β ω ι—ι +4 Ο β ο τ ο

(Μ -β

Ω Ω cn σ'

Λί σ

β ο

I-1

Ω ι—I σ' σ

4-1

Ν

Ω σ>

σ i

ο β

β ω

-β β

t4 •β λ:

β ο

ή

Ω

Ο

Ν υ

Ν β

S β

τ β

τ •Ν β

υ •β ο £ β >1 β β 03 C4 υ

β >1 -β 4-1 β β 03 β, Ν Ο υ 4-> 'β > ω υ -β

Ο 4-1 β λ;

ω ο Μβ σ ω φ τ β 03 •Ν Ν > β 5 Ω 03 ·ι—ι £ β > Ο β β » Ο ΤΌ β Ο'Ώβ β ο υ 'β β ο 4->

Ο Ο óc° β β Ο β 5 ο -β Τ τ—ι

e	ο
II	II
<	β
ω	4—1
Ω	β
Ω	03
ω	β
ο	Ο
β	β
β	β
-β	•β
52	2

170 059

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowej szczepionki przeciw Herpes simplex, znamienny tym, ze w pierwszym etapie glikoproteinę D HSV lub jej immunologiczny fragment adsorbuje się na wodorotlenku glinu, po czym w drugim etapie dodaje 3-deacylowany monofosforylowy lipid A.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuj e się glikoproteinę D, która pochodzi z HSV-2 lub jej immunologiczny fragment.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się glikoproteinę D, która stanowi skrócone białko.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się glikoproteinę D z HSV-2, która jest pozbawiona C-końcowego regionu kotwiczącego.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się glikoproteinę D z HSV-2 wytworzoną metodą rekombinacji DNA, która jest pozbawiona sekwencji C-końcowej i Nkońcowej sekwencji sygnałowej.