PL175024B1

PL175024B1 - Nowy analog acylofulwenowy i substancja przeciwrakowo czynna

Info

Publication number: PL175024B1
Application number: PL94310159A
Authority: PL
Inventors: Michael J. Kelner; Trevor C. Mcmorris; Raymond Taetle
Original assignee: Univ California
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-02
Publication date: 1998-10-30
Also published as: JPH08506812A; NZ262282A; US5439936A; DK0683762T3; HUT72450A; NO318648B1; CA2155329A1; KR100311327B1; HU9502358D0; AU6170094A; EP0683762A1; CN1119854A; ATE174894T1; CZ288596B6; RU2145849C1; BR9405689A; MD1418G2; EP0683762B1; WO1994018151A1; MD1418F2

Abstract

1 1 Nowy analog acylofulwenowy o wzorze ogól- nym 1, w którym R oznacza grupe CH 2OH, grupe o wzorze 16, grupe o wzorze 17, J, Br lub grupe CH2OC(O)R1 , w której R1 oznacza alkil, aryl, NH2, NH(alkil) lub N(alkil)2. 4. Substancja przeciwrakowo czynna, do inhi- bit owania rozwoju guza u pacjenta, bez toksycznosci recesyjnej, znamienna tym, ze stanowi analog acy- lofulwenowy o wzorze ogólnym 1, w którym R ozna- cza grupe CH2OH, grupe o wzorze 16, grupe o wzorze 17, J, Br lub grupe CH2OC(O)R1 , w której R 1 oznacza alkil, aryl, NH2, NH(alkil) lub N(alkil)2 z ewentual- nym dodatkiem farmaceutycznie dopuszczalnego no- snika. 5. Substancja przeciwrakowo czynna zdolna do wiazania antygenu guza, znamienna tym, ze zawiera reagent przylaczony do analogu acylofulwenowego o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupe CH2OH, grupe o wzorze 16, grupe o wzorze 17, J, Br lub grupe CH2 OC(O)R1 , w której R1 oznacza alkil, aryl, NH2, NH(alkil) lub N(alkil)2 Wzór 1 W zór 16 W zór 17 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy analog acylofulwenowy i substancja przeciwrakowo czynna, do inhibitowania rozwoju guza i zdolna do wiązania antygenu guza.

Nowy analog acylofulwenowy przedstawiony jest wzorem ogólnym 1, w którym R ma znaczenie podane poniżej. Analog ten ma działanie przeciwrakowe, zwłaszcza inhibitujące rozwój guza.

W niniejszym opisie przez inhibitowanie” należy rozumieć bądź zmniejszenie szybkości rozwoju komórki guza mogącego nastąpić bez traktowania, bądź spowodowanie zmniejszenia masy komórek guza. Inhibitowanie obejmuje również całkowite cofnięcie się guza, a zatem działanie albo cytostatyczne, albo cytotoksyczne dla komórek guza.

Wiele środków chemioterapeutycznych ma potencjalnie lecznicze działanie w niektórych hematologicznych chorobach nowotworowych o charakterze złośliwym i zaawansowanych stałych guzach szybko rozrastających się. Leczenie chemioterapeutyczne korzysta z odkryć nowych, stosunkowo niekrzyżowo opornych środków i skuteczniejszego stosowania istniejących środków. Interwencje, które zwiększają skuteczność tradycyjnych środków obejmują reżimy wielokrotnego podawania leku, zmniejszenie do minimum toksyczności leków i zwiększone stosowanie środków pomocniczych, chirurgicznych i terapii radiacyjnej.

Mimo ostatnich osiągnięć, pacjenci z różnymi typami chorób nowotworowych znajdująsię w zasięgu zwiększonego ryzyka nawrotu choroby i śmierci. Po nawrocie choroby, u niektórych pacjentów może nastąpić remisja przy pierwotnym trybie leczenia. Jednakże, często wymagane są wyższe dawki pierwotnego środka chemioterapeutycznego lub stosowanie dodatkowych środków, co wskazuje na co najmniej częściowe rozwinięcie się oporności na leki. Ostatnie badania wskazują, że oporność na lek może jednocześnie rozwinąć się na kilka środków, łącznie z tymi, których pacjent nie przyjmował. Rozwój guzów opornych na wiele leków (mdr) może być funkcjąmasy guza i stanowić główną przyczynę nieskuteczności leczenia Dla ominięcia tej opo175 024 mości na leki stosowano wysokodawkową chemioterapię z lub bez napromieniania oraz transplantację allogeniczną lub autologiczną szpiku kostnego.

W wysokodawkowej chemioterapii można stosować bądź lek pierwotny bądź lek zmieniony przez włączenie dodatkowych środków. Przydatność tego podejścia można zademonstrować dla guzów układu krwiotwórczego i guzów stałych. W celu dalszego zwiększenia potencjału leczniczego bieżących trybów leczenia i ułatwienia leczniczych interwencji u poprzednio leczonych pacjentów wymagane jest opracowanie nowych leków niekrzyżowo opornych z fenotypami mdr.

Ostatnio przebadano in vitro aktywność przeciw guzową nowej klasy produktów naturalnych nazywanych illudynami [M. Kelner i wsp., w Cancer Res. 47:3186 (1987)]. Wiadomo, że istnieją dwa typy illudyn, illudyna S i illudyna M. Illudyny mają budowę chemiczną całkowicie różną od innych środków chemioterapeutycznych. Znane, oczyszczone związki illudynowe zostały poddane ocenie w National Cancer Institute Division of Cancer Treatment (NCI DCT) w programie skriningu in vivo, ale, zgodnie z badaniami NCI, w innych systemach badań nad guzami wykazały niski indeks terapeutyczny. Ekstremalnie wysoka toksyczność illudyn przeszkodziła jakiemukolwiek stosowaniu ich w terapii ludzkiego guza.

Tak więc, w dalszym ciągu istnieje zapotrzebowanie na środki chemioterapeutyczne, które są toksyczne dla guzów, a zwłaszcza guzów mdr i mają odpowiedni indeks terapeutyczny skuteczny w traktowaniu in vivo.

W pracach nad wynalazkiem badano illudyny pod kątem znalezienia analogów, które miałyby odpowiedni indeks terapeutyczny i charakteryzowały się zdolnością inhibitowania rozwoju guzów przy zmniejszonej toksyczności.

Przebadano sposób inhibitowania rozwoju komórek guza u pacjenta, obejmujący kontaktowanie guza z terapeutyczną ilością analogów illudyny S lub illudyny M o budowie przedstawionej wzorami 2 lub 3, w którym analog zdolny jest do inhibitowania rozwoju komórek guza bez nadmiernej toksyczności wobec pacjenta i w którym

R, oznacza alkil lub wodór;

R₂ oznacza alkil; a

R3 oznacza alkohol lub ester.

Analogiem może być każdy związek mający przedstawioną strukturę. Przykładami skutecznych analogów mogą być związki o wzorze 4. Dalszymi przykładami analogów są związki o wzorach 5 i 6. Ujawniono również związek o budowie przedstawionej wzorem 7, w którym R = metyl, R,, R₂ i R₃ = metyl lub alkil oraz związek o budowie przedstawionej wzorem 8, w którym R = H lub metyl, R,, R₂ i R₃ = metyl lub alkil.

Jak podano powyżej, illudyny S i illudyny M mają niski indeks terapeutyczny z uwagi na wysoką toksyczność, a zatem nie mogą być stosowane w leczeniu ludzi.

Zgłaszający nieoczekiwanie odkryli, że można sporządzić analogi illudyny S i M, które są mniej toksyczne od illudyn S i M, a są bardziej skuteczne jako środki chemioterapeutyczne in vivo. Jak podano powyżej, illudyny S i M mająniski indeks terapeutyczny z uwagi na bardzo wysoką toksyczność, a zatem nie mogą być stosowane leczniczo u ludzi. Stwierdzono, że różne modyfikacje illudyn S i M inhibitują nukleofile od reakcji ze związkiem. Powoduje to mniejszą łatwość otwarcia pierścienia cyklopropanowego i redukuje toksyczność związku in vivo, dając wysoki indeks terapeutyczny. Zgłaszający dokonali następnego odkrycia, że analog acylofulwenowy, 6-hydroksymetyloacylofulwen, jest znacznie skuteczniejszy niż uprzednio znane analogi illudyny S i M i nietoksyczny.

Analog acylofulwenowy według wynalazku przedstawiony j est wzorem ogólnym 1, w którym R oznacza grupę CH₂Oh, grupę o wzorze 16, grupę o wzorze 17, J, Br lub grupę CH₂OC(O)R,, w której R_l oznacza alkil, aryl, NH2, NH(alkil) lub N(alkil)2.

Korzystnie, R oznacza grupę hydroksymetylową, 4-hydroksybenzylową, 4-metoksybenzylową, jodo, bromo lub acetoksymetylową, zwłaszcza grupę hydroksymetylową, 4-hydroksybenzylową, 4-metoksybenzylową, jodo lub bromo.

175 024

Według wynalazku analog o wzorze ogólnym 1, w którym R ma powyższe znaczenie, może być stosowany jako substancja przeciwrakowo czynna, do inhibiowania rozwoju guza u pacjenta, bez toksyczności recesyjnej. Substancja ta zwykle stosowana jest z dodatkiem farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika.

W innym wykonaniu substancja tajest zdolna do wiązania antygenu guza i według wynalazku zawiera reagent przyłączony do analogu acylofulwenowego o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę CH₂OH, grupę o wzorze 16, grupę o wzorze 17, J, Br lub grupę CH2OC(O)R,, w której R, oznacza alkil, aryl, Nh₂, NH(alkil) lub N(alkil)₂, przy czym jako reagent zawiera przeciwciało.

Analogi mogą być przyłączone do reagenta tworząc kompleks, który wiąże związany z guzem antygen. Metody tworzenia kompleksów są dobrze znane i mogą obejmować czynnik łączący, który służy do przyłączania reagenta do analogu. Takie przyłączanie może obejmować każde wiązanie chemiczne, na przykład wiązanie kowalencyjne.

Reagentem może być każdy reagent, który specyficznie wiąże guz-związany antygen na komórce guza lub w obszarze komórki guza. Zwykle taki reagent jest przeciwciałem albo poliklonalnym albo monoklonalnym. Kompleksy te mogąnastępnie być stosowane w terapii. Kompleksy według wynalazku mogąbyć realizowane w praktyce na dowolnych komórkach rakowych, ale są szczególnie skuteczne wobec takich komórek guza jak komórki szpikowe, komórki naskórkowe, białaczka z komórkami T, oraz rak płuc, jajników i piersi.

Guz może być kontaktowany z analogiem za pomocą dowolnego skutecznego środka, z których wiele jest dobrze znanych. Droga podawania pacjentowi może obejmować podawanie dożylne, doustne, śródotrzewnowe oraz przez inhalację ustną lub nosową. Korzystna droga podawania zależy od pacjenta i typu napotkanego guza.

Pacjentem może być każde zwierzę mające guza. Analogi sąskuteczne wobec guzów ludzkich in vivo jak również wobec ludzkich linii komórkowych guza in vitro.

Terapeutycznie skuteczna ilość analogu jest różna w zależności od stanu pacjenta. Jednakże stwierdzono, że można stosować stosunkowo wysokie dawki analogów z uwagi na obniżoną toksyczność w porównaniu z illudyną S lub M. Taka terapeutyczna ilość może wynosić co najmniej 0,03 mg wyżej wymienionego analogu acylofulwenowego. Wiadomo, że ilość będzie różna w zależności od drogi podawania. Na ogół terapeutyczna ilość pomiędzy 30 a 112.000 pg na kg wagi ciała jest szczególnie skuteczna przy podawaniu doustnym, podczas gdy 300 do 112.000 pg na kg wagi ciała jest skuteczna przy podawaniu śródotrzewnowym. Ponadto ilość może się zmieniać jeśli analog złączony jest z toksyną.

Nośnikiem lub substancją pomocniczą może być dowolna znana substancja lub kompozycja opisana w “Remington's Pharmaceutical Sciences”, wyd. Arthur Osol, wydanie 16, Mack Publishing Company, Pensylwania, Stany Zjednoczone, 1980 str. 1438-1630.

Porównanie analogu acylofulwenowego i illudyn przedstawiono w nawiązaniu do poniższych przykładów i załączonych rysunków, na których: fig. 1 przedstawia wrażliwość raka piersi i komórek białaczki szpikowej w stosunku do innych guzów wobec illudyny S; fig. 2 - aktywne miejsca illudyny S, fig. 3 - widmo NMR wykazujące obecność krótko trwałego produktu pośredniego w kwasie. Sygnał A pochodzi od wodoru z podwójnego wiązania w 5 członowym pierścieniu (illudyna M). Sygnał B pochodzi od atomu wodoru na produkcie pośrednim o krótkiej żywotności, który jest rezultatem otwarcia pierścienia cyklopropanu (ale zanim zareaguje podwójne wiązanie). Sygnały oznaczone przy C pochodzą z produktu, który otrzymano po reakcji podwójnego wiązania. Z czasem piki sygnałów illudyny S zanikną i piki pozycji C staną się sygnałami dominującymi. Sygnał B zniknie równocześnie z sygnałem A potwierdzając, że jest to produkt pośredni o krótkiej żywotności powstający z illudyny M; fig. 4 - działanie illudyny S na rozwój guza Molt-4 u bez grasiczej myszy (Ba1b/c); fig. 5 - działanie dehydroilludyny M na rozwój guza; fig. 6 - reakcję na dehydroilludynę M heteroprzeszczepu HL-60/MRI; fig. 7 - wychwyt illudyny S przy zastosowaniu stosunkowo wrażliwych komórek HL-60 i opornych komórek B; fig. 8 - pokazuje, że szybka wewnątrzkomórkowa akumulacja illudyny S przez komórki HL-60 została nasycona przy wysokich stężeniach; fig. 9 - analizę początkowego wychwytu illudyny S

175 024 przez komórki HL60 przy różnych stężeniach zgodnych ze stałymi nasycenia Michaelisa-Mentona, fig. 10 - wpływ 6-hydroksymetyloacylofulvenu i innych tradycyjnych środków przeciwrakowych na ludzki gruczolakorak płuc MV522; fig. 11 - wpływ różnych dawek 6-hydroksymetyloacylofUlvenu na ludzki gruczolakorak płuc MV522.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek oraz przeprowadzone badania na podstawie których stwierdzono, że analog acylofulwenowy według wynalazku jest toksyczny dla komórek rakowych, ale jest nietoksyczny dla ludzi i może być stosowany jako środek przeciwrakowy.

Przykład I

Synteza dehydroilludyny M

Mieszaninę illudyny M (200 mg) i dwuchromianu pirydyniowego (1 g) w suchym dichlorometanie (60 ml) mieszano w temperaturze pokojowej w kolbie wyposażonej w gumową przegrodę tak, żeby utrzymać atmosferę argonu. Po 20 godzinach, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem etylowym (20 ml) i przesączono przez krótką kolumnę z żelem krzemionkowym. Kolumnę następnie eluowano dalszym eterem etylowym i połączone przesącze zatężono otrzymując pozostałość, którą chromatografowano na żelu krzemionkowym i eluowano heksanem - octanem etylu (10:1). Pożądany związek otrzymano z chromatografii w początkowych frakcjach. Wydajność wynosiła 140 mg białych kryształów o temperaturze topnienia 64-65°C. Zarejestrowano dane widma NMR dla tego związku.

Przykład II

Synteza fulwenu

Illudynę S (50mg) rozpuszczono w wodzie (2 ml) i do tego roztworu dodano 3 n kwas solny (2 ml). Otrzymany roztwór wkrótce zmętniał (w ciągu 30 minut) i utworzył się żółty osad. Mieszaninę umieszczono na noc w lodówce, po czym wyekstrahowano chloroformem (10 ml). Żółty roztwór chloroformowy osuszono (MgSO.,) i rozpuszczalnik usunięto pod obniżonym ciśnieniem otrzymując żółto-pomarańczową żywicę. Materiał ten chromatografowano na żelu krzemionkowym eluując heksanami : octanem etylu (6:1) i otrzymano fulwen (20 mg) i bis-fulwen (10 mg). Zarejestrowano dane widma NMR dla tych związków.

Alternatywnie całą syntezę fulwenu można przeprowadzić sposobem przedstawionym na schemacie 1, na którym THP oznacza tetrahydroksypiranyl.

Reakcja znanego 1,1-diacetylocylkopropanu z pokazanym dianionem pochodnej cyklopentadienu daje diol, który traktowany łagodnym kwasem daje dioloketon. Selektywne wyeliminowanie grupy hydroksylowej daje pożądany fulwen.

Przykład III

Synteza i struktura związków 2,5,6,7-tetranetylo-1-indenonu i dehydropterozyny

Najpierw zsyntetyzowano 2,5,6,7-tetrametylo-1,3-indanion przez przygotowanie roztworu 1,2,3-trimetylobenzenu i chlorku metylomalonylu w dwusiarczku węgla i wkroplono w przeciągu ponad 2 godzin trójchlorek glinu. Mieszaninę utrzymywano we wrzeniu w warunkach powrotu skroplin przez 2 godziny, dodano pognieciony lód i wyekstrahowano trzykrotnie chloroformem. Połączone ekstrakty przemyto solanką, osuszono i rozpuszczalnik usunięto pozostawiając pozostałość, którą oczyszczono chromatograficznie 1% octanem etylu w benzenie. Usunięcie rozpuszczalnika i oczyszczenie przez sublimację dało pożądany produkt.

2,5,6,7-tetrametylo-1-indenon sporządzono przez redukcję 2,5,6,7-tetrametylo-1,3-indanionu pyłem cynkowym w temperaturze 50°C. Produkt oczyszczono chromatograficznie przez chromatografię 1% octanem etylu w benzenie otrzymując dwa izomery. Główny izomer zadano 10% wodorotlenkiem potasu, następnie oczyszczono przez sublimację. Związek miał strukturę przedstawioną wzorem 9.

Synteza dehydropterozyny 0: 3-acetoksy-6-(beta-metoksy)-etylo-2,5,7-trimetylo-1-indanon rozpuszczono w tetrahydrofuranie i 10% wodorotlenku potasu i utrzymywano we wrzeniu w warunkach powrotu skroplin przez dwie godziny. Następnie roztwór wyekstrahowano trzykrotnie eterem i połączone ekstrakty chromatografowano 2% octanem etylu w benzenie otrzymując związek dehydropterozynowy 0. Związek ma budowę przedstawioną wzorem 10, w którym

175 024

R - H Dehydropterozyna B

R = CH₃ Depterozyna 0

Oba związki były toksyczne dla komórek in vitro i miały własności przeciwgrzybicze.

Przykład IV

Synteza analogów acylofulwenowych

Wiele analogów acylofulwenowych posiadających kluczowe cechy strukturalne dla działania przeciwguzowego można otrzymać wychodząc z illudyny S lub drogą całkowitej syntezy z prostych prekursorów. Illudyna S wytwarzana jest podczas fermentacji Omphalotus illudens. Podczas rozpuszczania tego związku w wodzie i dodania rozcieńczonego H2SO4 zostaje on przekształcony do acylofulwenu (R, = H, IR_? = H, R₃-CH₃) z 55% wydajnością. Z acylofulwenu można otrzymać dużą liczbę analogów przez modyfikację podstawnika R2, np. R2 = hydroksymetyl, bromo, jodo, chloro, fluoro, nitro, p-hydroksybenzyl, p-metoksybenzyl. R2 może również oznaczać grupę wielopierścieniową lub heterocykliczną. Takie przekształcenie zilustrowano na schemacie 2.

Grupa R, może oznaczać acyl lub alkil. Analogi o różnych grupach R3 (a także grupach R2) można sporządzić drogą całkowitej syntezy przedstawionej na schemacie 3.

Kondensacja aldolowa 1,1 -diacetylocyklopropanu z dianionem pochodzącym z odpowiednio podstawionego cyklopetadienu daje produkt pośredni, który z łatwością przekształcany jest do acylofulwenu. Możliwa jest szeroka różnorodność związków, ponieważ R2 i R3 mogą oznaczać grupę alkilową, arylową lub podstawioną grupę alkilową lub arylową.

Synteza acylofulwenu. 2 g (9,2 mmola) illudyny S rozpuszczono w 700 ml wody a następnie dodano 4 m H2SO4 (236 ml). Roztwór mieszano przez noc i wyekstrahowano octanem etylu. Fazę organiczną przemyto nasyconym NaHCO3, wodąi solanką, osuszono nad MgSO41 no. Po chromatografii na żelu krzemionkowym z heksanem i octanem etylu otrzymano 0,82 g acylofulwenu (50%). Ή NMR δ 0,73 - 1,50 (m, 4H), 1,38 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 3,93 (s, 1H), 6,43 (s 1H), 7,16 (s, 1H): MS m/Z 216 (M+), 202 (M+-CH2), 188 (M⁺-CH₂CH2), 173 (M+-2CH2-CH2), 170 (M+-2CH2-HO2). UV 325 nm (8,3 x 103), 235 nm (16,6 x 103). Związek ten ma strukturę przedstawioną wzorem 5.

Synteza 6-hydroksymetylofulwenu. Acylofulwen (550 mg, 2,5 mmola) rozpuszczono w 40 ml THF i dodano 30% roztwór formaldehyd - woda (40 ml). Dodano 26,4 ml 4 n roztworu H₂SO4 dla doprowadzenia końcowego stężenia H2SO4 do 1 n. Roztwór mieszano przez noc i wyekstrahowano octanem etylu. Fazę organiczną przemyto nasyconym roztworem NaHCO₃, wodą i solanką i wysuszono nad MgSC^. Chromatografia na żelu krzemionkowym z heksanem i octanem etylu dała 400 mg hydroksymetylofulwenu (64%). ’H NMR δ 0,72 - 1,48 (m, 4H), 1,38 (s, 3H), 2,15 (s. 3H), 2,19 (s, 3H), 3,90 (s, 1H), 4,66 (d, J = 2,1 Hz, 2H), 7,10 (s, 1H). MS m/Z 246 (M+), 228 (M+ -H₂O), 218 (M+ -CH₂CH2), 186 (M+ - CH3-CH2-CH2-OH), 185 (M+-H2O-CH2-CH2-CH3). UV 233 nm (1,0 x 104), 325 nm (7,7 χ 103). Związek ma strukturę przedstawioną wzorem 11.

Jodofulwen. Do roztworu acylofulwenu (60 mg, 0,28 mmola) w 15 ml CHjCy dodano trifluorooctan srebra (63 mg, 0,29 mmola). Wkroplono roztwórjodu (70,5 mg, 0,28 mmola) w 8 ml CH2CL w temperaturze 0°C. Mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez 3 godziny, po czym przesączono przez celit i eluowano eterem. Zatężenie przesączu dało jodofulwen w postaci czerwonej żywicy (73 mg, 77%). 'HNMR δ 0,76 - 1,54 (m, 4H), 1,38 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 3,87 (s, 1H), 7,16 (s, 1H). MS m/Z 342 (M+, 314 (M⁺-CH->CH2), 299 (M⁺-CH2CH2-CH3), 296 (M⁺-CH2CH₂-H₂O), 215 (M+-J), 187 (M+J-C^CH), 127 (J+). Związek ma strukturę przedstawioną wzorem 12.

Bromofulwen. Acylofulwen (60 mg, 0,28 mmola) rozpuszczono w 9 ml acetonitrylu w temperaturze 0°C. Dodano N-bromosukcynimid (50 mg, 0,28 mmoli) i mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez 3,5 godziny. Do zgaszenia reakcji użyto wody i wyekstrahowano produkt eterem. Warstwę eterową przemyto wodą i solanką i osuszono nad MgSO4. Po chromatografii otrzymano bromofulwen w postaci pomarańczowych kryształów (77 mg, 94%; rekrystalizowano z etero octanu - heksanu, t.t. 92-94°C). 'HNMR δ0,75 -1,55 (m,4H), 1,40(s,3H),2,12(s,3H),

175 024

Ί

2,33 (s, 3H), 3,89 (s, 1H), 7,15 (s, 1H). MS m/Z 295 (M+), 293 (M+-2), 267, 265 (M⁺-CH2CH2), 252, 250 (M⁺-CH2CH₂-CH3), 249, 247 (M⁺-CH₂CH₂-H₂O), 215 (fulwen-1). Związek ma strukturę przedstawioną wzorem 13.

p-Hydroksybenzylofulwen. Do roztworu hydroksymetylofulwenu 70 mg, 0,28 mmoli) w suchym Cl fCk (25 ml) dodano fenol (40 mg, 0,4 mmola). Mieszaninę ochłodzono do temperatury -78°C i wkroplono eterat trójfluorku boru (0,3 ml, 2,7 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w tej temperaturze przez 1 godzinę i dodano wody dla zgaszenia reakcji. Warstwę organiczną przemyto wodą, NaHCO₂ i solanką i osuszono nad MgSO₄. Chromatografia na żelu krzemionkowym heksanem - octanem etylu dała 90 mg (98%) czerwonych kryształów (t.t. 143-144°C) Ή NMR δ0,59 - 1,43 (m, 4H), 1,36 (s, 3H), 1,76 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 3,95 (s. 1H), 3,97 (d, J - 7,2 Hz, 2H), 4,83 (s, 1H), 6,74 (d, J - 8,4 Hz, 2H), 6,91 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,22 (s, 1H). MS m/Z 322 (M+), 294 (M+-2 CH2), 279 (M+-2 CH2-CH3), 251 (M+-2 CH2-CH3-CO), 215, 107. UV 228nm(1,2x 10⁴), w przegięciem przy 243 i 262), 325 (7,1 x 103). Związek ma strukturę przedstawioną wzorem 14.

p-Metoksybenzylofulven. Do roztworu hydroksymetylofulwenu 10 mg, 0,04 mmoli) w suchym CH2G2 (5 ml) dodano anizol (0,04 ml, 0,37 mmoli). Mieszaninę ochłodzono do temperatury -78°C i wkroplono eterat trójfluorku boru (0,04 ml, 0,36 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w tej temperaturze przez 1 godzinę i dodano wody dla zgaszenia reakcji. Warstwę organicznąprzemyto wodą, NaHCO3 i solanką i osuszono nad MgSO4. Zatężenie roztworu dało pozostałość, którą osuszono in vacuo, otrzymując produkt z wydajnością ilościową (14 mg). 'HNMR δ0,59- 1,40 (m, 4H), 1,36 (s,3H), 1,76 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 3,78 (s, 3H), 3,95 (s, 1H), 3,99 (d, J = 16,12 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,22 (s, 1H). MS m/Z 336 (M+), 308 (M+-CH2CH2), 215, 121 ((C^-Ph-OC^f). UV 410 nm (2,7 x 103), 325 nm (7,0 x 10³), 267 nm (1,0 x 104), 245 _nm (przegięcie), 226 nm (1,9 x 104), 203 nm (1,4 x 104). Związek ma strukturę przedstawioną wzorem 15.

Przykład V

Badania in vitro

W celu oceny działania cytotoksycznego do hodowli komórkowych dodano różne stężenia illudyny na okres 48 godzin, następnie oznaczano rozwój komórki/żywotność za pomocą wykluczenia błękitem trypanowym. Alternatywnie do badania przez 48 godzinną ekspozycję, komórki umieszczono w ciekłej hodowli na płytce o 96 wgłębieniach, wystawiając je na różne stężenia illudyn w ciągu 2 godzin, pulsowano z [³H]-tymidyną przez jedną do dwóch godzin i zebrano na szklane filtry. Bibuły filtracyjne wprowadzono do fiolek zawierających płyn scyntylacyjny i pozostałościową radioaktywność oznaczono w liczniku beta (scyntylacyjnym).

Podczas skriningu wrażliwości innych stałych linii komórkowych guza na illudynę S, zauważono, że linia komórek piersi, MCF-7, jest wyraźnie wrażliwa (fig. 1). Inna linia komórkowa piersi utrzymywana w naszym laboratorium, MDA-231, również okazała się wyraźnie wrażliwa na illudynę S (fig. 1).

Badania z dehydroilludyną M wykazały, że ten analog również wykazuje selektywną toksyczność w stosunku do szpikowych komórek białaczki i linii raka piersi MCF-7 i MDA-231 (tabela 1).

175 024

Tabela 1

Histiospecyficzna cytotoksyczność llludyny S i dehydroilludyny M
wykazana przez inhibicję	tymidyny po 2 godzinnym	wystawieniu na
działanie tokshyn (N - 3)
Związek	Illudyna S	IC₅₀ (nM/L)
		Dehydroilludyna M
HL6 0, szpikowy	7 ± 1	246 ± 19
8392, komórka B	236 ± 31	> 33000
8402, komórka T	669 + 196	> 38000
242, czerniak	607 + 70	> 38000
547, jajnikowy	607 ± 110	> 38000
SL2, mysi (grasiczy)	142 ± 15	5235 + 277
MCF-7, piersi	58 + 5	653 ± 65
MDA-231, piersi	2,0 + 0,2	112 + 17

Ponieważ poprzednie badania wykazały, że warianty CEM mdr nie były oporne wobec llludyny S, przebadano kilka innych typów komórek mdr na wrażliwość na illudynę S i dehydroilludynę M. Te zstępne linie komórkowe mdr wykazały 200 do 800 krotny wzrost oporności na wiele tradycyjnych środków chemioterapeutycznych, ale wykazały minimalną oporność lub brak oporności wobec llludyny S lub dehydroilludyny M (tabela 2). Tak więc, komórki mdr związane z białkiem gpl70 lub bez białka gpl70 były stale wrażliwe na toksyczność illudyny. Badanie te wskazują, że nowa budowa illudyny nadaje stosunkowo niekrzyżową odporność w wiełolekowo opornych liniach komórkowych układu krwiotwórczego. Pochodna illudyny, dehydroilludyna M, jest nieco mniej toksyczna od macierzystego związku illudynowego, ale wyniki (tabela 2) wskazują, że nie ma żadnej oporności krzyżowej wobec tego związku w różnych liniach komórkowych mdr.

Badano wpływ illudyny S i dehydroilludyny M na L1210, mysi szpik kostny CFU-gm i 0498 (linia komórkowa AML). Illudyna S była najsilniejszym środkiem kiedykolwiek badanym w tej próbie i wykazała największy zróżnicowany efekt kiedykolwiek zauważony między L1210 a AM1 linii białaczki i CFU-gm cytowanych stref (tabela 3). Pochodna dehydroilludyny M, mimo, że mniej toksyczna była znacznie bardziej selektywna wobec linii AML. Inhibitowała tworzenie kolonii AML w stężeniach, w których nie miało to wpływu na komórki CFU-gm (tabela 4).

175 024

Tabela 2

Wrażliwość różnych linii mdr na illudynę S
Dostępna linia komórkowa MDR	Illudyna S	Dehydroilludyna M
Warianty CEM	Macierzysty	8,3 ± 2,6	NT
	VW-1	16,2 ±6,4	NT
	AraC	14	NT
	VLB100 (gp170+)	3,7 ± 0,7	NT
	Dox (gp170+)	14
MDA-231(pierś)	Macierzysty	0,85 ± 0,23	54 ±7
	3-1(gp170+)	0,89 ± 0,38	58 ± 11
MCF7-wt(pierś)	Macierzysty	0,88 ± 0,11	92 ± 15
	ADR (GSH-	3, 7 ± 0,4	68 ± 15
	transferaza)
HL-60	Macierzysty	3,1 ± 1,1	163 ± 11
	ADR (<gp15 0 + )	1,9 ± 0,8	191 ± 44
Wariant KB	Macierzysty	0,58 ± 0,12	125 ± 14
	C-1 (gp170+)	0,69 ± 0,15	80 ± 18
	VBL (ęgp170 + )	0,69 ± 0,11	78 ± 19
L1210	Macierzysty	0,42 ± 0,08	62 ±8
	DDPt(cis-plat)	0,46 ± 0,12	119 ± 39
	BCNU	0,58 ± 0,08	100 ± 31
	PAM(melfalan)	0,62 ± 0,15	73 ± 31
	CPA(cyklofos)	0,46 ± 0,12	38 ± 15

Tabela 3

Inhibitowanie rozwoju przez Illudynę S
Stężenie illudyny S	Strefa inhibitowania
(pg/krążek)
	L1210	Go	Colon 38
2,50	500	240	30
1,25	400	70	0
0,63	320	30	0

175 024

Tabela 4

Wpływ illudyn na tworzenie kolonii
Związek	Rozcieńczenie	Wielkość	strefy

		L1210	CFU-GM	C1498 ((AMD
Illudyna S	1/1000	850	400	> 1000
	1/4000	600	200	800
	1/16000	550	0	550
	1/64000	300	0	250
Dehydroilludyna M	1/25	400	200	> 1000
	1/125	200	100	750
	1/125(powtórzenie)	300	50	700
	1/625	100	0	400

Przykład VI

Badanie struktura - funkcja

Badania struktura - funkcja przeprowadzono poprzez zsyntezowanie pochodnych illudyn i przebadanie ich toksyczności in vitro dla komórek białaczki HL-60 (tabela 5). Badanie to zidentyfikowało trzy krytyczne miejsca dla toksyczności illudyny. Obejmują one pierścień cyklopropanowy (miejsce A), miejsce nienasyconego wiązania alfa/beta (miejsce B) i grupę ketonową (miejsce C) (fig. 2). Zmiana któregokolwiek z tych miejsc dawała w rezultacie obniżenie toksyczności, aż do 4 log. W przeciwieństwie do tego, nie pierścieniowa pierwszorzędowa grupa hydroksylowa (fig. 2, miejsce D) nie przyczyniała się do toksyczności. Róże duże grupy chemiczne mogły być przyłączone do tego miejsca bez zmiany toksyczności. Wiele pochodnych ze znacznym obniżeniem toksyczności (w porównaniu z illudyną S lub illudynąM) ma jeszcze silniejsze działanie niż tradycyjne środki chemioterapeutyczne, takie jak BCNU lub cis- platinum (tabela 5).

Tabela 5

IC₅₀ dla różnych pochodnych illudyny w stosunku do innych środków w komórkach HL-60
Związki	nm^l.i
Illudyna S lub M	10
Dihydroilludyna S lub M	100000
Acylofulven	500
Dehydroilludyna M (diketon)	246
Izoilludyna M	3800
Ptakwilozyd	7700
Pterozyna C	12500
2,5,6,7-tetrametyloindenon	475
Tozylan illudyny	38
Inhibitor polimerazy DNA Afidokolina	2100
Środek alkilujący· BCNU	23300
Środek sieciujący: cis-platinum	550 ± 14
Środek alkilujący: MNNG	15000
Inhibitor syntezy białka, rycyna	0,2

175 024

Przykład VII

Chemiczne badania struktura - funkcja

Illudyna M z łatwością przekształcana jest do trwałych związków aromatycznych (podczas traktowania rozcieńczonym HCl), które w badaniach hodowli komórkowych były ponad 1 000 krotnie mniej toksyczne. Tworzenie wiązania chlor-węgiel, otwarcie pierścienia cyklopropanowego i ekstruzja trzeciorzędowej grupy hydroksylowej (w postaci wody) są równoczesne. Utworzony produkt pośredni można wykryć za pomocą spektroskopii NMR mieszaniny reakcyjnej (figura 3). Jednakże produkt pośredni jest wysoce reaktywny i szybko przekształcany do fenolu przez zaatakowanie drugiego nukleofilu tj. wody. Tak więc, w warunkach kwaśnych, illudyna M jest wyraźnie dwufunkcyjna.

Powyższe badania wskazują, że toksyczność illudyn wiąże się z łatwościąz jaką może być usunięty trzeciorzędowy hydroksyl i otwarty pierścień cyklopropanowy. Stwierdzono, że toksyczność illudyn zależy od połączonego działania grupy cyklopropanowej (miejsce A, fig. 2), dwóch podwójnych wiązań (sprzężony dien) (miejsce B) i ketonu (miejsce C). Założono, że utlenianie drugorzędowej grupy hydroksylowej w pierścieniu pięcioczłonowym do ketonu powinno zmienić siłę działania lub selektywność cząsteczki przez przyczynianie się do dalszej delokalizacji elektronu w cząsteczce. Nowa grupa ketonowa działa jak “odciąg elektronów”, tak, że elektrony z wiązania cyklopropanowego C-C przemieszają się raczej w kierunku ketonu niż do atomu węgla niosącego trzeciorzędowy hydroksyl. Oznacza to, że zapoczątkowana karbonacja, tworzona w miarę rozrywania wiązania węgiel - tlen (tlen z trzeciorzędowej grupy hydroksylowej), nie jest tak trwała jak w przypadku illudyny M. Zatem, rozerwanie wiązania węgiel - tlen jest mniej korzystne i reaktywność jest obniżona. Ta pochodna ketonowa, nazywana dehydroilludynąM, została zsyntezowana i była mniej toksyczna wobec komórek HL-60 in vitro niż illudyna S lub M (tabela 4). Jak omówiono powyżej, toksyczność dehydroilludyny M okazała się stosunkowo selektywna dla komórek szpikowych i raka piersi in vitro (fig. 1 i tabela 1).

Zgodne, z powyższymi założeniami hipotetycznymi, są wyniki kinetyki reakcji illudyny M i dehydroilludyny M z rozcieńczonym HCl. W rozcieńczonym HCl, illudyna M podlega pseudo reakcji pierwszego rzędu (k = 4,7 x 10’³min¹, tl/2 =148 minut). Dehydroilludyna M również wykazuje kinetykę pierwszego rzędu, ale reakcja była znacznie wolniejsza (k = 2 x W^min! tl/2 = 2765 minut). W reakcji z dehydroillud;yiąM nie można było wykryć żadnego pośredniego za pomocą spektroskopii NMR. Przypuszczalnie tworzy się zbyt wolno i ma zbyt krótką żywotność by mógł być wykryty. Niższa reaktywność wykazywana przez dehydroilludynę M sugeruje, że jest ona bardziej selektywna w swoich reakcjach z nukleofilami a zatem ma mniejszą toksyczność w porównaniu z illudyną M.

Badano również reakcję illudyn z naturalnie występującym nukleofilem, glutationem. W szerokim zakresie od pH 3 do pH 9, glutation spontanicznie reaguje z illudyną M, illudyną S lub dehydroilludynąM, tworząc produkty analogiczne do produktów reakcji illudyny M z HCl. Szybkość reakcji jest optymalna przy pH 6,1 do pH 7,0, wskazując, że reakcja może pojawić się wewnątrzkomórkowo.

Przebadano następnie toksyczność illudyn wobec linii komórkowej raka piersi MCF7-wt i jej mdr odpornej linii zstępnej MCF/Adr. Negatywna gpl 70 zstępna linia komórkowajest oporna na leki na skutek 50 krotnego zmniejszenia transferazy glutationowej, której wynikiem jest 200 800 krotny spadek wrażliwości wobec tradycyjnych środków chemioterapeutycznych. Ta linia wykazuje również 4, 1 krotne obniżenie zawartości glutationu. Ta zstępna linia wykazała 4,2 krotne obniżenie wrażliwości na illudynę S (macierzysta IC₅₀ 0,88 nmoli/l, linia zstępna 3,70 nmoli/l) w stosunku 200 - 800 krotnego przy innych środkach. Badania kinetyczne zdolności illudyn do inhibitowania transferazy glutationowej wskazały, że nie było bezpośredniego inhibitowania aktywności enzymu. Odkrycie to pokazuje, że podczas gdy toksyczność illudyny jest odwrotnie skorelowana z wewnątrzkomórkową zawartością glutationu nie jest ona skorelowana z aktywnością transferazy glutationowej.

175 024

Przykład VIII

Badania na zwierzętach

Postępując według J.E. Leonarda i wsp., Cancer Res. 47:2899-1 (1987) i Dillmana, R.O. i wsp., Cancer Res. 45:5632-36 (1985), heteroprzeszczepy Molt-4 (ludzka białaczka z komórkami T) wprowadzono do czterotygodniowej bez grasiczej myszy Balb/cnu/nu. Po 3 tygodniowych dawkach napromieniania całego ciała (600 cGy), myszom wstrzyknięto podskórnie w bok komórki Molt-4 wraz z napromienionymi (600 cGY) komórkami karmiciela HT-1080. Dwa zwierzęta otrzymały tylko napromienione komórki karmiciela HT-1080 dla upewnienia się, że te komórki nie wywołują guzów.

Zwierzęta monitorowano na rozwój guza Molt-41 gdy guzy były namacalne (w przybliżeniu 4x4 mm dnia 5-7) zwierzęta na chybił trafił przydzielono po 5 do grupy, jak opisano uprzednio. Myszy kontrolne otrzymały śródotrzewnowo solankę a traktowane myszy otrzymały albo 300 pg/kg illudyny S, 30 lub 300 (g/kg dehydroilludyny M, i.p. dwa razy w tygodniu. U myszy, której podano illudynę S rozwój guza został opóźniony (fig. 4).

W przeciwieństwie do tego u gołych myszy, które otrzymały dehydroilludynę M w małej dawce 30 pg/kg (następnie stwierdzono, że związek jest nietoksyczny dla myszy przy 60 000 pg/kg i.p. dwa razy w tygodniu) trzy spośród pięciu guzów uległo całkowitemu cofnięciu, ale dwa guzy nie zareagowały (figura 5). Dwa najwyraźniej oporne guzy pobrano i przebadano m vitro na oporność na illudynę S i dehydroilludynę M. Nie było oznak oporności w żadnym związku. Dwa z tych, które całkowicie zareagowały śledzono przez ponad dwanaście tygodni bez oznak cofania się.

Doświadczenie to powtórzono stosując inne źródło bez grasiczych, gołych myszy. W badaniach tych wpływ illudyn na rozwój guza był bardzo mały. Przyczyna tak różnej reakcji na heteroprzeszczep prawdopodobnie związana była z niskimi dawkami dehydroilludyny M, zmianami metabolizmu glutationu lub dystrybucją leku wewnątrz zwierząt.

Skuteczność dehydroilludyny M poddano następnie skriningowi w jednorodnym modelu stosując komórki mysie SL-2. Komórki SL-2 białaczka/chłoniak wstrzyknięto podskórnie i uzyskano przerzuty do węzłów chłonnych, śledziony i płuc i określano skuteczność leku w tym modelu przez przedłużenie okresu życia (ILS). Komórki SL-2 podawane były w ilości 2,5 miliona komórek na zwierzę i traktowanie opóźniono na 7 dni dopóki guzy nie stały się wyczuwalne. Jest to stosunkowo przekonywujący test przeciw utrwalonym guzom i kontrastuje z ogólnymi osłonami lekowymi w modelu SL-2, w którym normalnie stosuje się jedynie 0,5 miliona komórek i rozpoczyna traktowanie lekiem w 3 dniu. Dehydroilludyna M miała małe działanie w dawce 30 mg/kg i.p. dwa razy w tygodniu, ILS 5%, a w dawce 60 mg/kg i.p. dwa razy w tygodniu ILS 18%. Przy podawaniu i.v. w dawce 0,03 mg/kg dwa razy w tygodniu ILS wzrosło do 38%. Nasuwa to przypuszczenie, że lekulega metabolizmowi w wątrobie i jest przypuszczalnie bardziej skuteczny przy podawaniu i.v.

W trakcie tych doświadczeń in vivo, stało się jasne z doświadczeń in vitro, że histiospecyficzność illudyn zależy od obecności aktywnych pomp zależnych od energii. Badano komórki SL-2 i Molt-4 i określono, że nie ma mechanizmu wychwytywania. Zmieniono zatem kierunek badań na modele heteroprzeszczepów, z zastosowaniem linii szpikowej.

Ludzkie komórki HL-60 zdolne do rozwijania się jako heteroprzeszczepy w gołych myszach, bez napromieniania zwierząt, otrzymano od Dr. Theodore Brightmana (NCI). Było potwierdzone, że komórki te, oznaczone jako komórki HL-60 MRI, mają zależną od energii pompę wychwytu. Dehydroilludyna M wzbudzała dawkę związanąz inhibitowaniem guza przy harmonogramie podawania dwa razy w tygodniu (fig. 6). Dawka MTD i.p. dla dehydroilludyny M doszła w tych badaniach do 2 dawkowań na tydzień w harmonogramie dawki i.p. Podobne cofnięcie guza obserwowano przy i.v. dehydroilludynie M.

We współpracy ponownie przebadano efekty in vivo dehydroilludyny M. Początkowo związek badano przeciw komórkom L1210. Dawka 2,5 mg/kg i.p. podawana dziennie przez5 dni dała ILS jedynie 9%. Dehydroilludynę M podano następnie w postaci 24 godzinnej infuzji (5 mg/kg); ILS wyniosło 11%. Po zdaniu sobie sprawy z występowania wychwytu zależnego od energii w ludzkich komórkach mielocytowych, poddano dehydroilludynę M przeglądowi na

175 024 skuteczność in vivo przeciw jednorodnemu modelowi AML myszy stosując komórki C1498 i pojedynczą dużą dawkę illudyny S, 2,5 mg/kg i.p., dało ILS 35%. Druga próba przy użyciu tego samego dawkowania, podawana i.p. raz dziennie przez 5 dni dała 44% ILS. Gdy zwierzęta mogą tolerować 60 mg/kg i.p. lub 1 mg/kg i.v. (żyła ogonowa) w harmonogramie 2 razy tygodniowo przez 4 tygodnie bez wykazania utraty wagi lub zmniejszenia pobierania żywności/wody, możliwe jest dalsze optymalizowanie zarówno dawkowania jak i harmonogramu traktowania.

Przykład IX

Próba mysiego HL-60/MRI z acylofulwenem i dehy<^^^roill^u^d^^rniM

Trzydziestu myszom podskórnie wstrzyknięto, nad barkiem, 500 000 komórek HP60/MRI (komórki guza ludzkiej białaczki szpikowej). Traktowanie rozpoczęto dopiero po 11 dniach. To opóźnienie w rozpoczęciu traktowania jest przekonywującym testem w celu oznaczenia czy związek jest skuteczny. Przez opóźnione traktowanie, komórki stają się trwale ustalone.

Myszy podzielono na 6 grup po 5 myszy każda. Jedna grupa była grupą kontrolną i otrzymywała placebo, roztwór stosowany do rozcieńczania środka. Inne grupy otrzymały następujące związki i dawkowanie: związek dehydroilludynę M w dawce 1,0 mg/kg, dehydroilludynę M w dawce 3,0 mg/kg, acylofulwen w dawce 0,3 mg/kg, acylofulwen w dawce 1,0 mg/kg, acylofulwen w dawce 3,0 mg/kg. Wszystkie zwierzęta otrzymały placebo lub leki przez iniekcję dożylną w żyłę ogonową. Placebo lub leki podawano według harmonogramu dwa razy tygodniowo.

Wyniki przedstawiono w towarzyszącej tabeli 6. Oba związki, dehydroilludyna M i acylofulwen były skuteczne w inhibitowaniu rozwoju guza i wykazały zależność inhibitowania od dawkowania (im więcej podano leku tym mniejszy był rozwój guza). Zwierzęta otrzymujące najwyższe dawki któregokolwiek z leków nie wykazały żadnych oznak działania szkodliwego, takiego jak zmniejszenie pobierania pożywienia lub wody ani statystycznie znaczącego ubytku wagi ciała. Te wyniki pokazują, że mogą być podawane wyższe dawki któregokolwiek leku. Również, że lek mógłby być podawany w bardziej skutecznym harmonogramie dawkowania, takim jak podawanie raz dziennie.

Tabela 6

Podsumowanie wyników, eksperyment z HL60, dożylnie - # 1
CAŁKOWITA WAGA GUZA (mg)
	dzień 11	dzień 18	dzień 25	dzień 32	dzień 40
PRÓBA KONTROLNA
Bez leku	99 + 36	845+282	3299+1080	10162+4123	16747+5061
Dehydroilludyna M
1 mg/kg IV	114+55	883+311	2274+992	6025+1772	11507+3707
3 mg/kg IV	101+40	911+309	2127+1092	2854+1260	4784+2303
Acylofulwen
0,3mg.kg IV	73+38	540+167	+1152+520	3204+1147	9501+4605
1 mg/kg	58+32	582±297	964+685	2321+1434	6275+2865
3 mg/kg	38 + 30	369+250	336+215	437+238	1201+501

175 024

Przykład X

Ogólne postępowania skriningowe in vitro i badania wychwytu komórki

Trzymając się sugestii, że uprzednie przykłady i skoncentrowanie się na mechanizmach działania illudyny i specyficzności komórki, inne linie komórkowe białaczki szpikowej można poddać przeglądowi na szybki wychwyt llludyny (KG1, KG1a, HEL, K562, OCI-MI, AML-193).

Postępowania przy skriningu in vitro związków illudynowych szczegółowo przedstawiono w poprzednich przykładach. Cytotoksyczność nowych analogów dla linii komórkowych początkowo oceniono na zakres ponad 5 log stosując wzrost lub pół-stałąkolonię tworzącąpróbki i inhbitowanie włączenia tymidyny. Stosowano inhibitowanie włączenia tymidyny, ponieważ wcześniejsze badania wskazały, że włączanie tymidyny jest preferencyjnie inhibitowane przez illudyny i koreluje ściśle ze śmiercią komórki. Analogi poddano skriningowi przeciw normalnym przodkom szpiku kostnego i różnym liniom komórkowym związanym z różnymi białaczkami, komórki B i T) i stałymi guzami (czerniak, jajnikowy).

Badania in vitro dehydroilludyny M na różnych liniach komórkowych, łącznie z liniami mdr, mogą być również przeprowadzone na liniach komórkowych z brakiem naprawy DNA i normalnych przodkach szpiku kostnego. Można sporządzić wiele innych analogów. Ponieważ te analogi będą miały zmiany w znanych miejscach aktywnych, oczekuje się, że dadząpodobną inhibicję guza. Badania skriningowe dla tych analogów mogą obejmować różne komórki mdr (dla zapewnienia, że nie wystąpi oporność krzyżowa) i linie komórkowe braku naprawy DNA.

Testowanie in vitro może również badać wrażliwość innych linii komórkowych piersi w celu oznaczenia, czy są one również preferencyjnie wrażliwe wobec illudyny S, dehydroilludyny M i innych analogów fulwenowych.

Przykład XI

Ocena wychwytu illudyny w. komórkach guza

Mimo, że komórki ludzkiego guza szpikowego są wrażliwe na illudyny, ich normalne prekursory, jednostki tworzące granulocyt/makrofag, są stosunkowo oporne na illudyny 15-2,0 log, wykazując, że układ transportowy nie jest obecny od niektórych normalnych komórek szpiku i zapewnia terapeutyczny margines bezpieczeństwa.

Przeprowadzono test na specyficzny wychwyt illudyny S stosując stosunkowo wrażliwe komórki HL-60 oraz oporne komórki B. W temperaturze 37°C, komórki HL-60 białaczki szpikowej wykazały szybki wychwyt illudyny S, podczas gdy stosunkowo niewrażliwe komórki B 8392 wykazały stosunkowo małe włączanie leku (fig. 7). Wewnątrzkomórkowa akumulacja illudyn w linii komórkowej B była powolna i liniowa przez 7 godzin (r - 0,984), w którym to czasie wewnątrzkomórkowe stężenie zbliżyło się do stężenia mieszaniny inkubacyjnej. Natomiast komórki HL-60, szybko kumulowały toksyny i wewnątrzkomórkowa akumulacja doszła do poziomej części wykresu w ciągu 1 godziny. Komórki HL-60 wystawione na działanie 10 nmoh illudyny S koncentrowały toksyny 19 krotnie, podczas gdy komórki B aktywnie nie koncentrowały toksyn. Szybka wewnątrzkomórkowa akumulacja illudyny S przez komórki HL-60 została nasycona przy wysokich stężeniach (fig. 8). W przeciwieństwie, kumulacja illudyny S w komórkach B 8392 pozostała zależna od stężenia. Analiza początkowego wychwytu illudyny S przez komórki HL-60 przy różnych stężeniach wyjawiła, że dopływ illudyny Sjest zgodny z kinetyką nasycenia Michaelisa-Mentona (fig. 9). Vmaks dla komórek HL-60 wynosiło 27 pikomoli/minutę/mg białka a Km wynosiło 4,2 pmoli. To wskazuje, że komórki HL-60 mają bardzo wysoką zdolność transportu illudyn, ponieważ Vmax dla illudyn jest 5 krotnością Vmaks dla folianu, witaminy potrzebnej komórkom.

Zimny (4°C) 1 % azydek i metaboliczne czynniki blokujące 2-dezoksyglukoza i antymycyna A, wszystkie blokują wychwyt illudyny S do komórek HL-60, ale mają małe działanie na niewrażliwe komórki B 8392 (tabela 7). Badania te wskazują, że illudyna Sjest transportowana i koncentrowana w komórkach HL-60 przez układ transportowy zależny od energii, podczas gdy transport do niewrażliwych komórek następuje jedynie przez dyfuzję (transport pasywny lub nie wymagający energii). Komórki guza piersi MCF7 również wykazały inhibicję wychwytu na zimno. Znalezienie zależnego

175 024 od energii mechanizmu transportu wyjaśnia dlaczego komórki szpikowe i guza piersi są tak wrażliwe na illudyny z krótkimi czasami wystawienia na działanie, ale komórki B nie są.

Tabela 7

Wychwytywanie [³H] illudyny S przez HL60 szpiku w stosunku do komórek B 8392
Maksymalny wychwyt na godzinę (pikomole)³
Warunki	HL6 0	8392	MCF7
37°C	75 ± 16^b	5,5 ± 1.4	29 ±4
4°C	4,3 ± 0,9	3,4 ± 1,0	4,0 ± 2,1
1% azydek	8,7 ± 1,4	4,3 ± 1,3	NT^b
2-dezoksyglukoza i
antymycyna A	16,7 ±3,5	3,6 ± 1,4	NT

Komórki wystawiono na działanie 100 ng/ml [3H]-znakowanej illudyny S na jednągodzinę i zebrano tak, jak opisano. Wyniki wyrażono jako średnie ± SE i reprezentowały 3 próby.

^a na 10 milionów komórek ^bNT = nie badano Przykład XII

Badanie hodowli komórkowej in vitro z analogami acylofulwenu

Badania in vitro przy użyciu próbek hodowli komórkowej wykazały, że analogi 6-hydroksymetyloacylofulwenu, bromoacylofulwenu i jodoacylofulvenu były wyraźnie toksyczne dla docelowych komórek guza HL-60 i MV522 zarówno przy okresach 21 48 godzinnego wystawienia na działanie (tabela 8 i tabela 9). Stosunek' toksyczności względnej (2 do 48 godzinnej toksyczności) sugeruje, że analogi te byłyby bardziej skuteczne in vivo niż którykolwiek albo macierzysty związek illudyna S albo analogi opisane w pierwotnym zgłoszeniu patentowym.

Tabela 8

2 godzinna cytotoksyczność nowych analogów (według oznaczenia inhibicji
wprowadzonej tymidyny w porównaniu z pierwotnymi analogami i	illudyną S
	2 godzinne wartości	IC50
		(nanomole/litr)
	Komórki	Komórki 8392	MV522
	HL60
Illudyna S	10 ±1	236 ± 22	19 ±6
Dehydroilludyna M	377 ± 81	61335 ±9810	1826 ± 378
Acylofulwen	998 ± 244	66435 ±11006	727 ± 180
6-hydroksymetyloacylofulwen	150 ± 11	7359 ± 2096	114 ± 28
octanowy analog 6-HMAF	3333 ± 192	47455 ± 2951	1066 ± 87
bromoacylofulwen	803 ± 88	17175 ± 890	4180 ± 424
j odoacylofulwen	2602 ± 345	10331 ± 497	956 ± 152
p-hydroksybenzylofulwen	264 ± 38	95236 ±11984	1180 ± 180
p-metoksybenzylofulwen	1964 ± 84	35714 ± 7292	2045 ± 208

175 024

Tabela 9

48 godzinna cytotoksyczność nowych analogów w porównaniu z pierwotnymi
analogami i macierzystym związkiem illudyną
	48 godzinne wartości	IC₅0
		(nanomole/litr)
	Komórki	Komórki 8392	MV522
	HL6 0
Illudyna S	3 ±1	8 ±2	4 ±1
Dehydroilludyna M	296 ± 66	269 ± 100	313 ± 23
Acylofulwen	364 ± 74	833 ± 152	349 ±-23
6-hydroksymetyloacylofulwen	4 ±1	76 ±4	73 ±8
octanowy analog 6-HMAF	806 ± 30	4434 ± 163	486 ± 42
bromoacylofulwen	412 ± 21	1186 ± 138	356 ± 61
j odoacylofulwen	290 ± 12	1696 ± 183	556 ± 47
p-hydroksybenzylofulwen	382 ± 39	11078 ± 388	615 ± 56
p-metoksybenzylofulwen	1051 ± 104	7143 ± 244	1548 ± 214

Przykład XIII

Badania in vivo

Bazując na tych badaniach przeglądowych in vitro, do badań in vivo wybrano jeden z analogów, 6-hydroksymetyloacylo-fulven, w celu oznaczenia czy ten analog ma rzeczywiście silniejsze działanie niż acylofulwen. Jako heteroprzeszczep znowu stosowano ludzki gruczolakorak płuc MV522, ponieważ jest to model niereagujący na tradycyjne środki przeciwrakowe i zabija przez przerzuty (bez inwazji lokalnego guza). Jako farmaceutyczną próbę kontrolną stosowano tradycyjne środki przeciwrakowe cis-platinum, taksol, mitomycyna C, adriamycyna, jak również illudynę S. Włączono grupę kontrolną, która otrzymywała jedynie rozpuszczalnik stosowany do rozpuszczania leków, mieszaninę 40% sulfotlenek dimetylu/ normalna solanka (40% DMSO/NS). Analog, 6-hydroksymetyloacylofulwen, rzeczywiście wywoływał cofanie się guza u zwierząt. Rzeczywiste cofanie guzów przez środki przeciwrakowe na tym modelu nie było nigdy dotąd zauważone. Nie stwierdzono inhibicji rozwoju guza przy tradycyjnych środkach przeciwrakowych lub illudynie S (fig. 10). Zwierzęta otrzymały jedynie 9 dawek analogu

6-hydroksymetyloacylofulwenu. Nie było oznak toksycznych efektów ubocznych u tych zwierząt, takich jak obniżenie aktywności, nabywanie wagi, przyjmowanie pożywienia i przyjmowanie wody. Nie było znacznego zwiększenia długości życia traktowanych zwierząt przy cis-platinum, taksolu, mitomycynie C i adriamycynie w porównaniu z próbą kontrolną (DMSO/NS) traktowanych zwierząt. Illudyna S faktycznie powodowała przedwczesną śmierć (toksyczność leku) (tabela 10). Zwierzęta traktowane 6-hydroksymetyloacylo-fulwenem żyły znacznie dłużej niż zwierzęta z grupy kontrolnej (traktowane DMSO/NS) i traktowane cis-platinum, taksolem, mitomycynąC i adriamycyną (p < 0,001 dla wszystkich grup) (tabela 10).

175 024

Tabela 10

Skuteczność analogu S-hydroksymetyloacylafulwenowego w stosunku do innych środków w ludzkim gruczolaku płuc MV22 przerzutowym modelu guza płuc - eksperyment pierwszy
Lek	Długość życia
próby kontrolne DMSO/NS IP 3x/tydzień	100 ± 7%
cis-platinum 3,2 mg/kg IP 1x/tydzień	102 ± 8%
taksol 4,0 mg/kg IP 5x/tydzień	100 ± 10%
mitomycyna C 2,4 mg/kg IP 1x/tydzień	111 ± 2%
Adriamycyna 2,6 mg/kg IP 1x/tydzień	98 ± 12%
Illudyna S 2,5 mg/kg IP 3x/tydzień	< 26% [5/5 śmierć tylko przy 3 dawkach]
6-hydroksymetyloacylofulwen 10 mg/kg IP 3x/tydzień	233 ± 18%

Eksperyment powtórzono z różnym dawkowaniem analogu 6-hydroksymetyloacylofulwenu w celu oznaczenia czy wystąpił wzór dawka - reakcja. Taksol i niskie dawki illudyny S ponownie włączono jako farmaceutyczne próby kontrolne (tabela 11). Ponownie włączono grupę kontrolną otrzymującąjedynie rozpuszczalnik farmaceutyczny (40% DMSO/NS). Znowu zauważono cofanie się guza przy 10 mg/kg i inhibicję rozwoju guza zauważono przy traktowaniu 1 i 5 mg/kg. Taksol i illudyna S znowu zawiodły i nie inhibitowały rozwoju guza (fig. 11). W tym drugim eksperymencie znowu nie było znacznego zwiększenia długości życia przy taksolu lub illudynie S w porównaniu z próbą kontrolną (zwierzęta traktowane 40% DMSO/NS). Zwierzęta traktowane 10 mg/kg 6-hydroksymetyloacylofulwenu i 5 mg/kg 6-hydroksymetyloacylo fulwenu żyły znacznie dłużej niż zwierzęta z grupy kontrolnej (traktowane DMSO/nS), i traktowane taksolem lub illudyną S. Wartość prawdopodobieństwa (lub znaczenia) dla zwierząt traktowanych 10 mg/kg 6-hydroksymetyloacylofulwenu w stosunku do próby kontrolnej, zwierząt traktowanych taksolem i zwierząt traktowanych illudyną S była mniejsza niż 0,001 w każdym przypadku (p < 0,001). Wartość prawdopodobieństwa dla zwierząt traktowanych 5 mg/kg

6-hydroksymetylo-acylofulwenu w stosunku do próby kontrolnej, zwierząt traktowanych taksolem i zwierząt traktowanych illudyną S była również mniejsza niż 0,001 w każdym przypadku (p <0,001). Zwierzęta traktowane 1 mg/kg 6-hydroksymetyloacylofulwenu również żyły znacznie dłużej niż grupa kontrolna (p <0,01).

175 024

Tabela 11

Skuteczność analogu 6-hydroksymetyloacylofulwenowego w stosunku do innych środków w ludzkim gruczolaku płuc MV22 przerzutowym modelu guza płuc - eksperyment drugi
Lek	Długość życia
próby kontrolne DMSO/NS IP 3x/tydzień	100 ± 15% (100% z definicji i)
taksol 4,0 mg/kg IP 5x/tydzień	120 ± 10% (nie znacząca)
Illudyna S 0,25 mg/kg IP 3x/tydzień	104 ± 20%
6-hydroksymetyloacylofulwen 10 mg/kg IP 3x/tydzień	232 ± 20%
6-hydroksymetyloacylofulwen 5 mg/kg IP 3x/tydzień	154 ± 13%
6-hydroksymetyloacylofulwen 1 mg/kg IP 3x/tydzień	135 ± 10%

Eksperyment powtórzono po raz trzeci (tabela 12). Ilość taksolu podawanego i.p. zwiększono w celu wykazania maksymalnego dawkowania i dodano podskórne dawkowanie z uwagi na doniesienia, że ta droga może być bardziej skuteczna. Ponownie włączono adriamycynę i mitomycynę C. Do eksperymentu tego włączono dwie nowe pochodne acylofiilwenu (jodoacylofulwen i p-hydroksybenzylofiiłwen). Analog diketonowy włączono dla wykazania zaznaczonej poprawy z ó-hydroksymetyloacylofulwenu. 6-hydiOksyrnetyloacylofulwen znacznie zwiększył długość życia w stosunku do grupy kontrolnej i wszystkich zwierząt traktowanych innym lekiem. Wartość prawdopodobieństwa dla 6-hydroksymetyłoacylofulwenu w stosunku do grupy kontrolnej, grupy traktowanej mitomycyną C, grupy traktowanej adriamycyną i obu grup traktowanych taksolem była niższa niż 0,0005 (p <0,0005). Jest to ogromnie znaczący efekt. Bazując na długości życia 2 danych zwierząt, ważne jest to, że jest możliwość wyleczenia ich. Chociaż diketon również znacznie zwiększył długość życia w stosunku do prób kontrolnych (p <0,002) i innych leków, którymi traktowano zwierzęta, nie był on tak skuteczny jak 6-hydroksymetyloacylofulwen. Należy zauważyć, że długość życia zwierząt traktowanych wysokimi dawkami taksolu (6 mg/kg i.p.) nie tylko obniżyła się w stosunku do dawki poniżej 4 mg/kg zwierząt traktowanych taksolem w poprzednich eksperymentach, ale była obecnie mniejsza niż długość życia zwierząt nie traktowanych lub z próby kontrolnej. To wskazuje, że osiągnięto maksymalną dawkę dla taksolu i toksyczność leku obecnie zabijała zwierzęta. Inne nowe analogi są również skuteczne w tym modelu.

175 024

Tabela 12

Skuteczność analogu 6-hydroksymetyloacylofulwenowego w stosunku do innych środków w ludzkim gruczolaku płuc MV22 przerzutowym modelu guza płuc - eksperyment trzeci
Lek	Długość życia
próby kontrolne DMSO/NS IP 3x/tydzień	100 ± 29%
taksol 6,0 mg/kg IP 5x/tydzień	93 ± 22%
taksol 20,0 mg/kg IP 5x/tydzień	113 ± 22%
mitomycyna C 2,4 mg/kg IP 1x/tydzień	149 ± 12%
adriamycyna 2,6 mg/kg IP 1x/tydzień	105 ± 25%
diketon 30 mg/kg IP 3x/tydzień t (pieniony w zgłoszeniu oryginalnym)	163 ± 6 %
jodoacylofulwen 20 mg/kg IP 3x/tydzień	120 ± 34%
p-hydroksybenzylofulwen 15 mg/kg IP 3x/tydzień	125 ± 16%
p-hydroksybenzylofulwen 20 mg/kg IP 3x/tydzień	126 ± 22%
6-hydroksymetyloacylofulwen 10 mg/kg IP 3x/tydzień	> 204% (2 zwierzęta przeżyły, ? wyleczone)--

Fig. 3

N

175 024

CZAS (TYGODNIE) <

N

O

CD δ

§ <

Q η

PRÓBA KONTROLNA (N = 3)

NIE REAGUJĄCY (N = 2)

TRAKTOWANIE DWA RAZY TYGODNIOWO

3'-KET0N-IU-UDYNA ug/kg

ROZWÓJ GUZA

COFANIE GUZA

REAGUJĄCY (N = 3)

TRAKTOWANIE DWA RAZY TYGODNIOWO

3'-KETON-ILLUDYNA ug/kg

3

CZAS (TYGODNIE)

175 024

Fig. 6

—próba kontrolna —+~3 mg/kg -*-io mg/kg

-e-30 mg/kg -*-60 mg/kg

CZAS (GODZINY)

175 024

/ ILLUDYNA S (nM)

175 024

100-1

ΙΟ η ί

Ο <

<

ο ο

ο

0_ <

Ν

Ξ>

Ο <

ω <

Ol-ίο

PRÓBA KONTROLNA TAKSOL 5X/TYDZIEŃ 4 MG/KG ADRIAMYCYNA 1X/TYDZIEN 2,6 MG/KG CISPLATINUM 1X/TYDZIEŃ 3,2 MG/KG MITOMYCYNA C 1X/TYDZIEŃ 2,4 MG/KG

60H FULWEN 3X/TYDZIEŃ 10 MG/KG

1-1-1-1-1-'-1

20 30 40

DNI PO INJEKCJ1 GUZA

175 024

DNI PO INJEKCJI GUZA

175 024

Wzór 7

Wzór 8

175 024

Ο

Wzór 9

Wzór 13 Wzór 14

175 024

SCHEMAT 1

SCHEMAT 2

O

175 024

ILLUDYNA S (ng/ml)

DZIAŁANIE DWUGODZINNE N = 4

MIEJSCE A

MIEJSCE D

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowy analog acylofulwenowy o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę CH2OH, grupę o wzorze 16, grupę o wzorze 17, J, Br lub grupę CH2OC(O)R,, w które] R, oznacza alkil, aryl, NH2, NH(alkil) lub N(alkil)2- ’
2. Analog według zastrz. 1, w którym R oznacza grupę hydroksymetylową, 4-hydroksybenzylową, 4-metoksybenzylową, jodo, bromo lub acetoksymetylową.
3. Analog według zastrz. 1, w którym R oznacza grupę hydroksymetylową, 4-hydroksybenzylową, 4-metoksybenzylową, jodo lub bromo.
4. Substancja przeciwrakowo czynna, do inhibiowania rozwoju guza u pacjenta, bez toksyczności recesyjnej, znamienna tym, że stanowi analog acylofulwenowy o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę CH2OH, grupę o wzorze 16, grupę o wzorze 17, J, Br lub grupę CH^^C(O)R[, w której R] oznacza alkil, aryl, NH2, NH(alkil) lub N(alkil)2 z ewentualnym dodatkiem farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika.
5. Substancja przeciwrakowo czynna zdolna do wiązania antygenu guza, znamienna tym, że zawiera reagent przyłączony do analogu acylofulwenowego o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupę CH2OH, grupę o wzorze 16, grupę o wzorze 17, J, Br lub grupę CH^^C(O)R1, w której R oznacza alkil, aryl, NH2, NH(alkil) lub N(alkil)2.
6. Substancja według zastrz. 5, znamienna tym, że jako reagent zawiera przeciwciało.