PL175177B1

PL175177B1 - A pharmaceutical composition containing recombinant coagulation factor VIII I54) and a method of producing a pharmaceutical composition containing recombinant coagulation factor VIII

Info

Publication number: PL175177B1
Application number: PL93304018A
Authority: PL
Inventors: Thomas Oesterberg; Angelica Fatouros
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Ab
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 1998-11-30
Also published as: EE03171B1; ZA937266B; SE9202878D0

Abstract

1.Kompozycja farmaceutycznazawierająca rekombinantowyczynnikkrzepnięcia VIIIistabilizator (57) stabilizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wydłużony okres czasu a sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rekonstytuowany jako wodny roztwór przed użyciem, znamienna tym, że zawiera rekombinowany czynnik krzepnięcia VIII o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chlorek sodu lub potasu w ilości większej niż 0,1 M, sól wapniową taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy w ilości większej niż 0,5 mM, niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mono- lub disacharydy lub alkohole cukrowe. 13. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej rekombinantowy czynnik krzepnięcia VIIIistabilizator stabilizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wydłużony okres czasu, przy czym sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rekonstytuowanyjako wodny roztwór przed użyciem, która zawiera rekombinowany czynnik krzepnięcia VIII o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chloreksodu lub potasuwilościwiększej niż 0,1M,sólwapniową takąjakchlorekwapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości większej niż 0,5 mM, niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mono- lub disacharydy lub alkohole cukrowe, znamienny tym, że miesza się czynnik VIII z niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w roztworze wodnym, chlorkiem sodu lub potasu, sól wapniową i korzystnie z sacharozą.1. A pharmaceutical composition comprising recombinant coagulation factor VIII and a stabilizer (57) stabilizing the activity of factor VIII during storage for a prolonged period of time, the composition itself being either a) initially or finally in the form of an aqueous solution ready for use or b) initially in the form of an aqueous solution which is then dried and finally reconstituted as an aqueous solution before use, characterized in that it comprises recombinant coagulation factor VIII with a specific activity of more than 2000 IU/mg protein in an amount of 10-100,000 IU/ml, sodium or potassium chloride in an amount of more than 0.1 M, a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate in an amount of more than 0.5 mM, a non-ionic surfactant in an amount of at least 0.01 mg/ml, L-histidine buffering the system and protecting the protein in the amorphous phase, and optionally mono- or disaccharides or sugar alcohols. 13. A method for preparing a pharmaceutical composition comprising recombinant coagulation factor VIII and a stabilizer stabilizing the activity of factor VIII during storage for an extended period of time, wherein the composition itself is either a) initially or finally in the form of an aqueous solution ready for use or b) initially in the form of an aqueous solution which is then dried and finally reconstituted as an aqueous solution before use, which comprises recombinant coagulation factor VIII with a specific activity of more than 2000 IU/mg of protein in an amount of 10-100,000 IU/ml, sodium or potassium chloride in an amount of more than 0.1 M, a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably in an amount of more than 0.5 mM, a non-ionic surfactant in an amount of at least 0.01 mg/ml, L-histidine buffering the system and protecting the protein in the amorphous phase, and optionally mono- or disaccharides or sugar alcohols, characterized in that factor VIII is mixed with a non-ionic surfactant in aqueous solution, sodium or potassium chloride, a calcium salt and preferably with sucrose.

Description

Wynalazek niniejszy dotyczy nzwei kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik krzepnięcia VIII i nibjznony środek powierzchniowo czynny, taki jak kopolimery blokowe, na przykład pzlioksambry lub produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych i sorbitanu z tlenkiem etylenu (20), takie jak, na przykład, Polysorbate 20 lub Polysorbate 80. Kompozycja zawiera także chlorek sodowy, chlorek wapniowy, L-histydynę i/lub cukry i/lub alkohole cukrowe.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising coagulation factor VIII and a non-ionic surfactant such as block copolymers, for example polyoxambry, or condensation products of fatty acid esters of sorbitan with ethylene oxide (20), such as, for example, polysorbate 20 or polysorbate 80. The composition also comprises sodium chloride, calcium chloride, L-histidine and/or sugars and/or sugar alcohols.

Hemofilia jest to choroba dziedziczna, znana od setek lat, jednakże dopiero w ciągu ostatnich trzydziestu lat stało się możliwe rozróżnienie rozmaitych jej postaci, a mianowicie hemofilii A, hemofilii B i hemofilii C. Najczęściej spotykaną postacią hemofilii jest hemofilia A. Dotyka ona wyłącznie osobników płci męskiej, a częstość jej występowania wynosi 1 lub 2 przypadki na 10000 żywych urodzeń. Chorobę tę powoduje silnie zaniżony poziom, lub brak, biologicznie aktywnego czynnika krzepnięcia VIII (czynnik antyhemofilony), będącego białkiem normalnie występującym w osoczu krwi. Objawem klinicznym hemofilii A jest skłonność do silnego krwawienia i zanim wprowadzono leczenie z zastosowaniem koncentratów czynnika VIII, średni wiek pacjentów cierpiących na hemofilię wynosił mniej niż 20 lat. Od około trzydziestu lat dostępne są koncentraty czynnika VIII ztrzzmynanb z osocza. Polepszyło to znacznie sytuację, jeśli chodzi o leczenie pacjentów dotkniętych hemofilią i uzyskali oni możliwość życia w normalny sposób.Hemophilia is a hereditary disease known for centuries, but only in the last thirty years has it become possible to distinguish its various forms: hemophilia A, hemophilia B, and hemophilia C. The most common form of hemophilia is hemophilia A. It affects only males and has an incidence of 1 or 2 cases per 10,000 live births. This disease is caused by a severely reduced level or absence of biologically active coagulation factor VIII (antihemophilin factor), a protein normally found in blood plasma. The clinical manifestation of hemophilia A is a tendency to heavy bleeding, and before the introduction of treatment with factor VIII concentrates, the average age of hemophilia patients was less than 20 years. Factor VIII concentrates extracted from plasma have been available for approximately thirty years. This has significantly improved the treatment situation for patients with haemophilia and they have been able to live a normal life.

Lecznicze koncentraty czynnika VIII wytwarza się, jak dotychczas, za pomocą frakcjonowania osocza. Tym niemniej, jednak, obecnie dostępne są już metody wytwarzania czynnika VIII w hodowli komórkowej z zastosowaniem metody rekombinantowego DNA, jak o tym donieśli, na przykład, J. Gitschier i in. [Nature, 312, 330 - 337 (1984)] oraz EP 160457.Therapeutic factor VIII concentrates have, until now, been produced by plasma fractionation. However, methods for producing factor VIII in cell culture using recombinant DNA methods are now available, as reported, for example, by J. Gitschier et al. [Nature, 312, 330-337 (1984)] and EP 160457.

Koncentraty czynnika VIII pochodzące z osocza krwi ludzkiej zawierają szereg fragmentowych, w pełni aktywnych, postaci czynnika VIII [Andersson i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, tom 83, 2979 - 1983, maj 1986)]. Najmniejsza tego rodzaju postać aktywna charakteryzuje się masą cząsteczkową wynoszącą 170 kDa i składa się z dwóch łańcuchów,Factor VIII concentrates derived from human blood plasma contain a number of fragmentary, fully active forms of factor VIII [Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, 2979 - 1983, May 1986)]. The smallest such active form has a molecular weight of 170 kDa and consists of two chains,

175 177 jednego o masie cząsteczkowej 90 kDa i drugiego o masie cząsteczkowej 80 kDa, utrzymywanych razem przez mostek będący jonem metalu. Można się tu odnieść do EP 197901. Firma Kabi Pharmacia opracowała produkt stanowiący rekombinantowy czynnik VIII, który odpowiada postaci 170 kDa czynnika VIII pochodzącego z osocza, występującej w stosowanych w lecznictwie koncentratach czynnika VIII. Skrócona cząsteczka rekombinantowego czynnika VIII została nazwana r-VIII SQ i wytwarza się ją z udziałem komórek chomika chińskiego (CHO) metodą hodowli komórkowej w podłożu nie zawierającym surowicy w końcowym pasażu.175 177 one with a molecular weight of 90 kDa and the other with a molecular weight of 80 kDa, held together by a metal ion bridge. Reference may be made to EP 197901. Kabi Pharmacia has developed a recombinant factor VIII product that corresponds to the 170 kDa plasma-derived form of factor VIII found in therapeutic factor VIII concentrates. The truncated recombinant factor VIII molecule has been designated r-VIII SQ and is produced using Chinese hamster (CHO) cells by cell culture in serum-free medium at the final passage.

Aktywność właściwa r-VIII SQ może być wyższa niż 12000 IU/mg białka, korzystnie ponad 14000 IU/mg. Zmierzono aktywność wynoszącą około 15000 IU/mg. Wcześniej stwierdzono dla r-VIII SQ według wynalazku około 10(^00 IU VIII:C/mg białka.The specific activity of r-VIII SQ may be higher than 12,000 IU/mg protein, preferably higher than 14,000 IU/mg. An activity of about 15,000 IU/mg has been measured. Previously, about 10(^00 IU VIII:C/mg protein has been found for r-VIII SQ according to the invention.

Wskazane jest zastosowanie rekombinantowego czynnika VIIISQ do leczenia klasycznej hemofilii. Dawkowanie jest w tym przypadku podobne do dawkowania koncentratów czynnika VIII z osocza. Dzięki wysokiemu stężeniu, jakie stało się obecnie osiągalne, objętości niezbędne do wykonania wstrzyknięcia są bardzo niewielkie.Recombinant factor VIIISQ is indicated for the treatment of classic hemophilia. Dosing is similar to that of plasma-derived factor VIII concentrates. Thanks to the high concentrations now available, the injection volumes required are very small.

Strukturę i biochemię wytworzonych produktów, będących preparatami rekombinantowego czynnika VIII, opisał w sposób ogólny Kaufman [Tibtech, tom 9 (1991); Hematology, 63, 155 - 165 (1991)]. Struktura i biochemia r-VIII SQ są opisane w WO 91/09122.The structure and biochemistry of the products produced, which are recombinant factor VIII preparations, have been described in general terms by Kaufman [Tibtech, vol. 9 (1991); Hematology, 63, 155-165 (1991)]. The structure and biochemistry of r-VIII SQ are described in WO 91/09122.

Stabilność białek stanowi, ogólnie, problem w przemyśle farmaceutycznym. Często rozwiązuje się go przez wysuszenie białka w rozmaitych procesach suszenia, takich jak, na przykład, liofilizacja. Po wysuszeniu, białko rozdysponowuje się i przechowuje w stanie suchym.Protein stability is a general concern in the pharmaceutical industry. It is often addressed by drying the protein through various drying processes, such as freeze-drying. After drying, the protein is distributed and stored in a dry state.

Zarówno roztwór przed suszeniem lub liofilizacją, jak i materiał wysuszony oraz produkt, któremu przywrócono postać pierwotną, powinny być trwałe. Oznacza to, że w trakcie suszenia, przechowywania lub manipulowania nie powinno tracić się aktywności preparatu w nadmiernym zakresie.Both the solution before drying or lyophilization, the dried material, and the reconstituted product should be stable. This means that the activity of the preparation should not be excessively lost during drying, storage, or handling.

Czynnik VIII, który otrzymuje się za pomocą rozfrakcjonowania osocza, normalnie sprzedawany jest w postaci zliofilizowanego proszku, który należy rekonstytuować przy użyciu wody.Factor VIII, which is obtained by fractionating plasma, is normally sold as a lyophilized powder that must be reconstituted with water.

Preparat o małej zawartości białka na ogół traci swą aktywność podczas oczyszczania, obróbki w warunkach jałowych, pakowania i stosowania. Problem ten zazwyczaj rozwiązuje się przez dodanie do preparatu albuminy ludzkiej, która znacznie zmniejsza stratę aktywności czynnego białka. Albumina ludzka działa jako ogólny stabilizator w trakcie oczyszczania, obróbki jałowej i liofilizacji [patrz: przegląd dokonany przez Wanga i in. w: J. of Parenteral Sci. and Tech., tom 42, nr 2 S, suplement (1988)]. Albumina ludzka nadaje się także dobrze do formowania masy w przypadku preparatu przeznaczonego do liofilizacji. Zastosowanie albuminy do stabilizowania czynnika VIII jest znane i obecnie wykorzystuje się ją we wszystkich preparatach czynnika VIII o wysokim stopniu czystości znajdujących się na rynku.A low-protein preparation generally loses activity during purification, sterile processing, packaging, and use. This problem is usually solved by adding human albumin to the preparation, which significantly reduces the loss of active protein activity. Human albumin acts as a general stabilizer during purification, sterile processing, and lyophilization [see the review by Wang et al. in J. of Parenteral Sci. and Tech., vol. 42, no. 2 S, supplement (1988)]. Human albumin also performs well as a bulking agent for a preparation intended for lyophilization. The use of albumin to stabilize factor VIII is well known and is currently used in all high-purity factor VIII preparations on the market.

Jednakże, nie jest pożądane dodawanie albuminy ludzkiej do stosowanego w lecznictwie białka wytworzonego z zastosowaniem technologii rekombinantowego DNA. Poza tym, użycie albuminy ludzkiej jako zarobki w preparacie często ogranicza zastosowanie wielu spośród najskuteczniejszych i czułych analitycznych metod identyfikacji białka.However, it is undesirable to add human albumin to therapeutically used proteins produced using recombinant DNA technology. Furthermore, the use of human albumin as an excipient in formulations often limits the use of many of the most effective and sensitive analytical methods for protein identification.

Istnieje zapotrzebowanie na preparaty czynnika VIII, a zwłaszcza rekombinantowego czynnika VIII, nie zawierające albuminy i odznaczające się trwałością podczas suszenia lub liofilizacji, w roztworze i w postaci roztworu po przywróceniu pierwotnej postaci.There is a need for factor VIII preparations, particularly recombinant factor VIII, that are albumin-free and stable during drying or lyophilization, in solution, and in solution after reconstitution.

Zaproponowano szereg różnych rozwiązań, jeśli chodzi o stabilizowanie rozmaitych białek.A number of different solutions have been proposed for stabilizing various proteins.

W EP 35204 (Cutter) ujawniono sposób nadawania termostabilności kompozycji białkowej w obecności poliolu.EP 35204 (Cutter) discloses a method for imparting thermostability to a protein composition in the presence of a polyol.

W EP 381 345 (Corint) ujawniono wodny płyn zawierający peptyd desmopresynę, obecnością karboksymetylocelulozy.EP 381 345 (Corint) discloses an aqueous liquid containing the peptide desmopressin, in the presence of carboxymethylcellulose.

175 177175 177

W WO 89/09614 (Genentech) ujawniono stabilizowany preparat ludzkiego hormonu wzrostu zawierający glicynę, mannitol i bufor, a w korzystnym wariancie sposobu realizacji wynalazku, z dodatkiem niejonowego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak Polysorbate 80. Niejonowy środek powierzchniowo czynny dodawany jest w celu zmniejszenia tworzenia agregatów i denaturacji. Preparat taki oznacza się zwiększoną trwałością, tak w postaci liofilizatu jak i po przywróceniu pierwotnej postaci.WO 89/09614 (Genentech) discloses a stabilized human growth hormone formulation comprising glycine, mannitol, and a buffer, and in a preferred embodiment, a nonionic surfactant such as Polysorbate 80. The nonionic surfactant is added to reduce aggregate formation and denaturation. This formulation is characterized by increased stability, both in the lyophilized form and after reconstitution.

W EP 268 110 (Cetus) ujawniono roztwór zawierający specyficzne białko, interleukinę 2, rozpuszczone w obojętnym środowisku stanowiącym nośnik. Zawiera ono niejonowy polimeryczny detergent jako środek solubilizujący/stabilizujący. Korzystnymi detergentami są związki typu oktylofenoksypolietoksyetanolu, związki typu monosterynianu glikolu polietylenowego i produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych i sorbitanu z polietylenem.EP 268 110 (Cetus) discloses a solution containing a specific protein, interleukin 2, dissolved in an inert carrier medium. It contains a nonionic polymeric detergent as a solubilizing/stabilizing agent. Preferred detergents are octylphenoxypolyethoxyethanol-type compounds, polyethylene glycol monostearate-type compounds, and condensation products of sorbitan fatty acid esters with polyethylene.

W US 4783441 (Hoechst) ujawniono roztwór wodny zawierający białko, takie jak insulina oraz substancję powierzchniowo czynną.US 4783441 (Hoechst) discloses an aqueous solution containing a protein, such as insulin, and a surfactant.

W US 4165370 (Coval) ujawniono roztwór gamma-globuliny i sposób jego wytwarzania. Wspomniane roztwory zawierają glikol polietylenowy (PEG). Do roztworu dodać można niejonowy środek powierzchniowo czynny.US 4,165,370 (Coval) discloses a gamma globulin solution and a method for preparing the same. Said solutions contain polyethylene glycol (PEG). A nonionic surfactant may be added to the solution.

W EP 77870 (Green Cross) ujawniono dodanie aminokwasów, monosacharydów, oligosacharydów albo alkoholi cukrowych lub wywodzącego się od węglowodorów kwasu karboksylowego w celu polepszenia stabilności roztworu zawierającego czynnik VIII, a w EP 117064 (Green Cross) ujawnione dodanie alkoholu cukrowego lub disacharydów do wodnego roztworu czynnika VIII w celu zwiększenia stabilności podczas obróbki cieplnej.EP 77870 (Green Cross) discloses the addition of amino acids, monosaccharides, oligosaccharides or sugar alcohols or a hydrocarbon-derived carboxylic acid to improve the stability of a solution containing factor VIII, and EP 117064 (Green Cross) discloses the addition of sugar alcohol or disaccharides to an aqueous solution of factor VIII to improve the stability during heat treatment.

W WO 91/10439 (Octopharma) zastrzeżono stabilny, dający się wstrzykiwać roztwór czynnika VIII lub czynnika IX, który zawiera disacharyd, korzystnie sacharozę oraz jeden, lub więcej niż jeden aminokwas.WO 91/10439 (Octopharma) claims a stable, injectable solution of factor VIII or factor IX which comprises a disaccharide, preferably sucrose, and one or more amino acids.

W Ep 315968 i EP 314095 (Rorer) zastrzeżono stabilne preparaty czynnika VIII o różnej mocy jonowej.Ep 315968 and EP 314095 (Rorer) claim stable preparations of factor VIII with different ionic strengths.

Z punktu widzenia właściwości fizyko-chemicznych białka różnią się między sobą. Jeśli chodzi o wytwarzanie preparatu farmaceutycznego, który powinien nadawać się do przyjęcia pod względem właściwości fizyko-chemicznych i który powinien być stabilny w ciągu długiego czasu, należy brać pod uwagę nie tylko właściwości fizjologiczne białka, ale także i inne aspekty, takie jak możliwość wytwarzania w skali przemysłowej, łatwość podawania pacjentowi i bezpieczeństwo chorego. Wyników analizy tych aspektów nie można przewidzieć przy testowaniu rozmaitych preparatów i często zachodzi potrzeba indywidualnego rozwiązania tych problemów dla każdego białka.Proteins differ from one another in terms of their physicochemical properties. When it comes to manufacturing a pharmaceutical preparation that should be acceptable in terms of physicochemical properties and long-term stability, it is necessary to consider not only the protein's physiological properties but also other aspects, such as feasibility of industrial production, ease of administration to the patient, and patient safety. The results of analyzing these aspects cannot be predicted when testing different preparations, and it is often necessary to address these issues individually for each protein.

Krążący w osoczu czynnik VIII stabilizowany jest przez wiązanie się ze swym nośnikiem białkowym, a mianowicie czynnikiem von Willebranda (vWF). W osoczu, a także w typowych koncentratach czynnika VIII o średniej czystości, stosunek wagowy vWF do czynnika VIII wynosi co najmniej 50:1. W koncentratach czynnika VIII o wysokim stopniu czystości, a aktywności właściwej wynoszącej ponad 2000 IU/mg białka, stosunek vWF do czynnika VIII wynosi około 1:1 (wag/wag), i w istocie cały czynnik VIII jest związany z vWF. Pomimo osiągnięcia takiego poziomu ustabilizowania preparatu, potrzebne jest dalsze zabezpieczenie za pomocą dodania albuminy w celu uzyskania nadającej się do przyjęcia trwałości w trakcie liofilizacji i przechowywania.Circulating factor VIII in plasma is stabilized by binding to its protein carrier, von Willebrand factor (vWF). In plasma, as well as in typical medium-purity factor VIII concentrates, the weight ratio of vWF to factor VIII is at least 50:1. In highly pure factor VIII concentrates with a specific activity of more than 2000 IU/mg protein, the ratio of vWF to factor VIII is approximately 1:1 (w/w), and essentially all of the factor VIII is bound to vWF. Although this level of stabilization is achieved, further protection by the addition of albumin is required to achieve acceptable stability during lyophilization and storage.

Wszystkie znajdujące się na rynku preparaty o najwyższej czystości stabilizowane są albuminą (albuminą surowicy ludzkiej). Obecnie występuje zapotrzebowanie na dający się wstrzykiwać preparat czynnika VIII nie zawierający albuminy, z minimalną zawartością dodatków. Obecnie opracowano nową kompozycję, która umożliwia rozwiązanie powyższych problemów dotyczących czynnika VIII. Nieoczekiwanie stwierdzono, że czynnik VIII, który jest białkiem o wysokiej wrażliwości, można stabilizować z pominięciem użycia albuminy, jeżeli doda się niejonowego środka powierzchniowo czynnego.All high-purity preparations available on the market are stabilized with albumin (human serum albumin). Currently, there is a need for an injectable, albumin-free preparation of factor VIII with minimal additives. A new formulation has been developed that addresses these challenges with factor VIII. Surprisingly, factor VIII, a highly sensitive protein, can be stabilized without albumin by adding a nonionic surfactant.

Zgodnie z tym, wynalazek niniejszy dotyczy kompozycji, zawierający czynnik krzepnięcia VIII i niejonowy środek powierzchniowo czynny jako stabilizator. Uzyskany czynnik VIII jest preparatem o wysokim stopniu czystości, co oznacza, że jego aktywność właściwa wynosi ponad 2000 IU/mg, korzystnie ponad 5000 IU/mg białka, przy czym kompozycja ta stabilizowana jest z pominięciem dodania albuminy.Accordingly, the present invention relates to a composition comprising coagulation factor VIII and a non-ionic surfactant as a stabilizer. The obtained factor VIII is a preparation of high purity, which means that its specific activity is greater than 2000 IU/mg, preferably greater than 5000 IU/mg of protein, wherein the composition is stabilized without the addition of albumin.

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca rekombinantowy czynnik krzepnięcia VIII i ssabillzator stabiiizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wydłużony okres czasu a sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rekonstytuowany jako wodny roztwór przed użyciem, zawiera rekombinowany czynnik krzepnięcia VIII o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chlorek sodu lub potasu w ilości większej niż 0,1 M, sól wapniową taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości większej niż 0,5 mM, niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mono- lub d^chai^y lub alkohole cukrowe.A pharmaceutical composition comprising recombinant coagulation factor VIII and a scavenger stabilizing the activity of factor VIII during storage for a prolonged period of time, and the composition itself being either a) initially or ultimately in the form of an aqueous solution ready for use or b) initially in the form of an aqueous solution which is then dried and finally reconstituted as an aqueous solution before use, comprises recombinant coagulation factor VIII with a specific activity of more than 2000 IU/mg protein in an amount of 10-100,000 IU/ml, sodium or potassium chloride in an amount of more than 0.1 M, a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably in an amount of more than 0.5 mM, a non-ionic surfactant in an amount of at least 0.01 mg/ml, L-histidine buffering the system and protecting the protein in the amorphous phase, and optionally mono- or di- or sugar alcohols.

W przypadku użycia rekrmbinrwanegr czynnika VIII, może on występować w postaci o pełnej długości, albo w postaci pochodnej delecyjnej, takiej jak pochodna SQ. Ilość czynnika VIII wynosi korzystnie 50-10.000 IU/ml.When factor VIII reconstitution is used, it may be in the full-length form or in the form of a deletion derivative, such as an SQ derivative. The amount of factor VIII is preferably 50-10,000 IU/ml.

Korzystnie, niejonowy środek powierzchniowo czynny dobiera się spośród kopolimerów blokowych, takich jak poloksamer lub polirasyetylenowany (20) ester kwasu tłuszczowego, taki jak Polysorbate 20 lub Polysorbate 80. Jako Polysorbate 80 używa się Tween 80®. Niejonowy środek powierzchniowo czynny obecny jest w ilości przewyższającej krytyczne stężenie mizeilaacjl (CMC). Patrz: Wan i Lee, Jom-nal of Pharm. Sci, 63,136 (1974).Preferably, the nonionic surfactant is selected from block copolymers such as poloxamer or poly(propylene glycol)(20) fatty acid esters such as Polysorbate 20 or Polysorbate 80. Tween 80® is used as the Polysorbate 80. The nonionic surfactant is present in an amount exceeding the critical molecular weight concentration (CMC). See Wan and Lee, Journal of Pharm. Sci, 63, 136 (1974).

Tak więc, poiloktyetnlenrwany (20) ester kwasu tłuszczowego korzystnie występuje w ilości wynoszącej co najmniej 0,01 mg/ml. I tak, na przykład, ilość ta może mieścić się w zakresie od 0,02 do 1 mg/ml.Thus, the polyoctylethylene (20) fatty acid ester is preferably present in an amount of at least 0.01 mg/ml. For example, the amount may be in the range of 0.02 to 1 mg/ml.

Kompozycja może także zawierać chlorek sodowy lub potasowy w ilości większej niż 0,1 M.The composition may also contain sodium or potassium chloride in an amount greater than 0.1 M.

Kompozycja zawiera sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, w ilości większej niż 0,5 mM oraz aminokwas, taki jak L-histydyna, w ilości większej niż 1 mM.The composition comprises a calcium salt, such as calcium chloride or calcium gluconate, in an amount greater than 0.5 mM and an amino acid, such as L-histidine, in an amount greater than 1 mM.

Można też dodać monotacharndy lub ditacharydn, takie jak sacharoza, lub alkohole cukrowe, na przykład w ilości wynoszącej od 1 do 300 mg/ml.Monotaccharides or ditaccharides, such as sucrose, or sugar alcohols may also be added, for example in amounts ranging from 1 to 300 mg/ml.

Korzystnie, kompozycja zawiera L-histydynę i sacharozę. Stosunek wagowy chlorku sodowego do L-hlttndnnn w omawianej kompozycji korzystnie jest wyższy niż 1:1.Preferably, the composition comprises L-histidine and sucrose. The weight ratio of sodium chloride to L-hlttndnnn in said composition is preferably greater than 1:1.

Kompozycja może zawierać: i) 10 -100000 IU/mg rekombinantowego czynnika VIII, ii) co najmniej 0,01 mg/ml polirksyetylenowanegr (20) estru kwasu tłuszczowego, iii) chlorek sodowy, w ilości większej niż 0,1 M, iv) sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, w ilości większej niż 0,5 mM oraz v) aminokwas, taki jak L-histydyna, w ilości większej niż 1 mM.The composition may comprise: i) 10 - 100,000 IU/mg of recombinant factor VIII, ii) at least 0.01 mg/ml of a polyoxyethylene (20) fatty acid ester, iii) sodium chloride in an amount greater than 0.1 M, iv) a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate in an amount greater than 0.5 mM, and v) an amino acid such as L-histidine in an amount greater than 1 mM.

Do omawianej kompozycji można dodać monosacharydy lub disacharndn albo alkohole cukrowe, korzystnie sacharozę.Monosaccharides or disaccharides or sugar alcohols, preferably sucrose, may be added to the composition in question.

Kompozycja może mieć postać preparatu suchego, korzystnie liofilizowanego. Może też, przed wysuszeniem lub po nim, występować jako roztwór wodny. Produktowi suchemu przywraca się postać pierwotną przy użyciu wody jałowej do wstrzykiwań lub roztworu buforowego.The composition may be presented as a dry preparation, preferably lyophilized. It may also be presented as an aqueous solution, either before or after drying. The dry product is reconstituted using sterile water for injection or a buffer solution.

Zastrzegana kompozycja może także stanowić stabilny roztwór wodny gotowy do użycia.The claimed composition may also be a stable, ready-to-use aqueous solution.

Wynalazek dotyczy także kompozycji, w przypadku których aktywność właściwa r-VIII SQ jest wyższa niż 12000 IU/mg białka, korzystnie jest wyższa niż 14000 IU/mg.The invention also relates to compositions wherein the specific activity of r-VIII SQ is higher than 12,000 IU/mg protein, preferably higher than 14,000 IU/mg.

Zastrzeganą kompozycję można wytworzyć za pomocą zmieszania czynnika VIII z niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w roztworze wodnym, razem z aminokwasem, takim jak L-histydyna, solą sodową, sacharozą i solą wapniową, albo za pomocą wyeluowania czynnika VIII po ostatnim etapie oczyszczania buforem zawierającym niejonowy środek powierzchniowo czynny w roztworze wodnym, razem z aminokwasem, takim jak L-histydyna, solą sodową, sacharozą i solą wapniową.The claimed composition can be prepared by mixing factor VIII with a non-ionic surfactant in an aqueous solution, together with an amino acid such as L-histidine, a sodium salt, sucrose and a calcium salt, or by eluting factor VIII after the last purification step with a buffer containing a non-ionic surfactant in an aqueous solution, together with an amino acid such as L-histidine, a sodium salt, sucrose and a calcium salt.

177177

Do zbuforowania układu używa się aminokwasu, który także zabezpiecza utrzymanie białka w fazie amorficznej. Stosowanym buforem może być L-histydyna, lizyna i/lub arginina. Przede wszystkim wybiera się L-histydynę, z uwagi na jej dobrą pojemność buforową, około pH 7.An amino acid is used to buffer the system, which also maintains the protein in the amorphous phase. L-histidine, lysine, and/or arginine can be used as buffers. L-histidine is primarily chosen due to its good buffering capacity, approximately pH 7.

W celu zapewnienia ochrony białka można dodać sacharozę lub alkohol cukrowy.Sucrose or sugar alcohol may be added to protect the protein.

Do preparatu według wynalazku wprowadza się wapń (lub jony metalu dwuwartościowego) w postaci chlorku wapniowego (CaCl₂), jednakże można w tym przypadku użyć innych soli, takich jak glukonian wapniowy, giubionian wapniowy lub gluceptan wapniowy. Jest on potrzebny dla utrzymania ciężkiego i lekkiego łańcucha czynnika VIII w stanie zasocjowanym.Calcium (or divalent metal ions) is incorporated into the formulation according to the invention in the form of calcium chloride ( _CaCl2 ), however, other salts such as calcium gluconate, calcium glubionate, or calcium gluceptate can also be used. This salt is needed to maintain the heavy and light chains of factor VIII in the associated state.

Dane przedstawione w przykładach wskazują na to, że r-VIII SQ jest stabilny w ciągu co najmniej 12 miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze 5 ± 3°C.The data presented in the examples indicate that r-VIII SQ is stable for at least 12 months when stored at 5 ± 3°C.

Następujące przykłady objaśniają wynalazek i przedstawiają dane odnoszące się do trwałości rozmaitych preparatów, przy czym wszystkie te preparaty objęte są zakresem ochrony patentowej, który to zakres nie jest ograniczony do tylko tych przykładów.The following examples illustrate the invention and provide data relating to the stability of various formulations, all of which are within the scope of the patent, which scope is not limited to these examples.

Wynalazek objaśniają następujące figury.The invention is explained in the following figures.

Figura 1: chromatografia żelowa HpLC, przykład 10 A, przechowywanie w ciągu 5 miesięcy w temperaturze 25°C.Figure 1: HpLC gel permeation chromatography, example 10A, storage for 5 months at 25°C.

Figura 2: chromatografia żelowa HPLC, przykład 10 B, przechowywanie w ciągu miesięcy w temperaturze 30°C.Figure 2: HPLC gel permeation chromatography, example 10 B, storage for months at 30°C.

Część doświadczalna.Experimental part.

Materiały, i metody.Materials and methods.

Wytwarzanie czynnika VIII SQ (r-VIII SQ) przeprowadzone w zasadzie tak, jak to opisano w opisie patentowym WO 91/09122, przykład 1-3. Linię komórek CHO z delecją DHFR (DG44N.Y.) poddano elektroporacji z udziałem wektora ekspresyjnego zawierającego gen r-VIII SQ oraz wektora ekspresyjnego zawierającego gen reduktazy dihydrofolianowej. Po dokonaniu selekcji na podłożach selekcyjnych, kolonie przeżywające amplifikowano przez wzrost ze stopniowo zwiększającą się ilością metotreksatu. Supernatanty utworzonych tak kolonii przeszukano pod względem aktywności VIII:C. Wybrano klon produkcyjny i przystosowano go następnie do hodowli w nieobecności surowicy w podłożu o znanym składzie. W końcu opracowano sposób prowadzenia fermentacji w dużej skali. Po upływie określonego czasu supernatant zbiera się, po czym poddaje oczyszczaniu zgodnie z opisanym poniżej sposobem postępowania.Production of Factor VIII SQ (r-VIII SQ) was performed essentially as described in WO 91/09122, Examples 1-3. A DHFR-deleted CHO cell line (DG44N.Y.) was electroporated with an expression vector containing the r-VIII SQ gene and an expression vector containing the dihydrofolate reductase gene. After selection on selective media, surviving colonies were amplified by growth with gradually increasing amounts of methotrexate. Supernatants from the resulting colonies were screened for VIII:C activity. A production clone was selected and adapted for serum-free culture in a medium of known composition. Finally, a method for large-scale fermentation was developed. After a specified period, the supernatant was collected and purified according to the procedure described below.

pH sklarowanego, kondycjonowanego podłoża doprowadzono do właściwego poziomu i podłoże wprowadzono na kolumnę S - Sepharose FF. Po przemyciu, wyeluowano czynnik VIII przy użyciu buforu solnego zawierającego 5 mM CaCl₂.The pH of the clarified, conditioned medium was adjusted to the appropriate level and the medium was loaded onto an S-Sepharose FF column. After washing, factor VIII was eluted using a salt buffer containing 5 mM CaCl ₂ .

Immunoadsorpcję przeprowadzono na żywicy działającej na zasadzie immunopowinowactwa, przy czym ligandem było przeciwciało monoklonalne (8A4) skierowane przeciw ciężkiemu łańcuchowi czynnika VIII. Przed wprowadzeniem na kolumnę, na eluat S podziałano 0,3% TNBP i 1% Octoxynol 9.Immunoadsorption was performed on an immunoaffinity resin using a monoclonal antibody (8A4) directed against the heavy chain of factor VIII. Before loading the column, the S eluate was treated with 0.3% TNBP and 1% Octoxynol 9.

Kolumnę zrównoważono, przemyto i wyeluowano czynnik VIII buforem zawierającym 0,05 M CaCl2 i 50% glikolu etylenowego.The column was equilibrated, washed, and factor VIII was eluted with a buffer containing 0.05 M CaCl2 and 50% ethylene glycol.

Eluat mAb wprowadzono na kolumnę Q-Sepharose FF, zrównoważoną buforem stosowanym do elucji w etapie immunopowinowactwa. Po przemyciu, czynnik VIII wyeluowano przy użyciu 0,05 M L-histydyny, 4 mM CaCl2, 0,6 M NaCl (ph 6,8).The mAb eluate was loaded onto a Q-Sepharose FF column equilibrated with the elution buffer used in the immunoaffinity step. After washing, factor VIII was eluted using 0.05 M L-histidine, 4 mM CaCl2, 0.6 M NaCl (pH 6.8).

Eluat Q naniesiono na kolumnę do chromatografii żelowej (Superdex 200 p. g.). Zrównoważenia kolumny i elucji dokonano przy użyciu układu zawierającego chlorek sodowy, L-histydynę, chlorek wapniowy i Polysorbate 80.The Q eluate was applied to a gel permeation chromatography column (Superdex 200 p.g.). The column was equilibrated and eluted using a system containing sodium chloride, L-histidine, calcium chloride, and Polysorbate 80.

Zebrano pik białkowy i roztwór sformułowano, po czym przeprowadzono liofilizację.The protein peak was collected and the solution was formulated and then lyophilized.

Aktywność VIII:C i stężenie składników nieaktywnych doprowadzono do właściwego poziomu za pomocą rozcieńczenia odpowiednim buforem. Następnie roztwór wyjałowiono przez przesączenie (0,22 /im), rozdozowano i zliofilizowano. Próbki pobrane z każdejVIII:C activity and inactive component concentrations were adjusted to appropriate levels by dilution with an appropriate buffer. The solution was then sterile filtered (0.22 µm), dispensed, and lyophilized. Samples taken from each

1^75177 kompozycji zamrożono i przechowywano w temperaturze -70°C. Próbki te rozmrażano i stosowano jako odnośniki przy oznaczaniu VIII :C.1^75177 of the compositions were frozen and stored at -70°C. These samples were thawed and used as references for the VIII :C determination.

Aktywność VIII:C jako czynnika powodującego krzepnięcie oceniono w teście z substratem chromogennym (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Moelndal, Szwecja). Aktywny czynnik X (Xa) tworzy się na szlaku wewnątrznaczyniowym, przy czym czynnik VIII.C działa jako kofaktor. Następnie oznacza się czynnik Xa przy użyciu substratu chromagennego S-2222 w obecności inhibitora trombiny I-2581 w celu zapobieżenia hydrolizie substratu przez trombinę. Reakcję zatrzymuje się za pomocą dodania kwasu, po czym oznacza się VIII:C [którego ilość jest proporcjonalna do uwolnionej pNA (p-nitroaniliny)] metodą fotometryczną przy 450 nm wobec samego odczynnika jako ślepej próby. Ilość czynnika VIII:C wyraża się w jednostkach międzynarodowych (IU) zgodnie z definicją w aktualnym International Concentrate Standard (IS) ustanowionym przez WHO.Factor VIII:C activity as a coagulation factor was assessed using a chromogenic substrate assay (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Moelndal, Sweden). Activated factor X (Xa) is formed in the intravascular pathway, with factor VIII.C acting as a cofactor. Factor Xa is then assayed using the chromogenic substrate S-2222 in the presence of the thrombin inhibitor I-2581 to prevent hydrolysis of the substrate by thrombin. The reaction is stopped by the addition of acid, and VIII:C (the amount of which is proportional to the released pNA (p-nitroaniline)) is then determined photometrically at 450 nm against the reagent blank. The amount of factor VIII:C is expressed in international units (IU) as defined by the current International Concentrate Standard (IS) established by the WHO.

Odzysk VIII:C oblicza się jako procent: VIII:C w restytuowanym roztworze podzielony przez VIII :C w . zamrożonym i rozmrożonym roztworze kierowanym do liofilizacji, z uwzględnieniem rozcieńczenia.The VIII:C recovery is calculated as the percentage of VIII:C in the reconstituted solution divided by the VIII:C in the frozen and thawed solution sent for lyophilization, taking into account dilution.

Rozpuszczalne agregaty oznaczano przy zastosowaniu chromatografii żelowej. Użyto wstępnie załadowanej kolumny Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia) z detektorem fluorescencji (długość fali wzbudzenia 280 nm, długość fali emisji 340 nm). Analizie poddano preparat, któremu przywrócono pierwotną postać. Oceny wyników uzyskanych metodą chromatografii żelowej dokonano na podstawie wzrokowego badania chromatogramów, albo przez scałkowanie powierzchni pików, jeżeli stwierdzono obecność agregatów.Soluble aggregates were determined using gel filtration chromatography. A preloaded Superdex 200 HR 10/30 column (Pharmacia) with a fluorescence detector (excitation wavelength 280 nm, emission wavelength 340 nm) was used. The reconstituted preparation was analyzed. The gel filtration results were assessed by visual inspection of the chromatograms or by integration of peak areas if aggregates were detected.

Odzysk po liofilizacji wyraża się z % wydajności zamrożonego odnośnika.Recovery after lyophilization is expressed as % yield of the frozen reference.

Przykład 1. Porównanie między albuminą a niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym.Example 1. Comparison between albumin and non-ionic surfactant.

Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.Recombinant factor VIII was produced according to the procedure described in the experimental section.

ml roztworu zliofilizowano, a następnie przywrócono do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań.ml of solution was lyophilized and then reconstituted with 5 ml of sterile water for injection.

Kompozycje miały skład następujący:The compositions were as follows:

IA IA IB IB IC IC ID ID L-Histydyna, mML-Histidine, mM 50 50 50 50 50 50 50 50 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,6 0.6 0,6 0.6 0,6 0.6 0,6 0.6 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 4 4 4 4 4 4 4 4 Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % - - - - 0,02 0.02 - - PEG 4000, % PEG 4000, % 0,1 0.1 0,1 0.1 - - - - Albumina, %Albumin, % - - 1 1 - - 1 1 VIII:C: VIII:C: wprowadzono IU/ml IU/ml introduced 250 250 250 250 250 250 250 250 odzyskano po przywróceniu pierwotnej postaci IU/ml recovered after restoring the original IU/ml form 83 83 197 197 232 232 222 222

Przykład ten pokazuje, że nie było żadnej różnicy w odzysku czynnika VIII:C przy stosowaniu czy to niejonowego środka powierzchniowo czynnego czy albuminy.This example shows that there was no difference in factor VIII:C recovery when using either non-ionic surfactant or albumin.

Przykład 2. Porównanie między różnymi ilościami niejonowego środka powierzchniowo czynnego.Example 2. Comparison between different amounts of non-ionic surfactant.

ml roztworu zliofilizowano, a następnie przjevrócono od postaci piarwpinej prze użyciu 2 ml jałowej wody do wstrzykiwań.ml of solution was lyophilized and then reconstituted with 2 ml of sterile water for injection.

175 177175 177

Kompozycje miały skład następujący:The compositions were as follows:

2 A 2 A 2 B 2 B 2 C 2 C L-Histydyna/L-glutamina ilości równomolowe, mg/mlL-Histidine/L-Glutamine equimolar amounts, mg/ml 10 10 10 10 10 10 Chlorek sodowy, %Sodium chloride, % 2 2 2 2 2 2 Chlorek wapniowy, mg/mlCalcium chloride, mg/ml 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % - - 0,001 0.001 0,01 0.01 VIII:C: VIII:C: wprowadzono IU/ml IU/ml introduced 300 300 300 300 300 300 odzyskano po przywróceniu pierwotnej postaci, IU/ml: recovered after restoration to original form, IU/ml: początkowo initially 69 69 133 133 228 228 po upływie 3,5 godz.* after 3.5 hours* 43 43 144 144 222 222 po upływie 7 godz.* after 7 hours* 49 49 133 133 204 204

* Przechowywano jako zrekonstytuowany roztwór w temperaturze otoczenia.* Stored as a reconstituted solution at ambient temperature.

W oczywisty sposób wykonano fakt zaskakująco korzystnego wpływu stabilizującego wywieranego przez niejonowy środek powierzchniowo czynny na czynnik VIII.The surprisingly beneficial stabilizing effect of the non-ionic surfactant on factor VIII was clearly demonstrated.

Przykład 3. Zmiana stężenia niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.Example 3. Changing the concentration of nonionic surfactant. Recombinant factor VIII was produced according to the procedure described in the experimental section.

ml roztworzi zliofilizowano, a następnie pnzywracono do pienvotnej posjaci użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań.ml of the solution was lyophilized and then reconstituted with 5 ml of sterile water for injection.

3 A 3 A 3 B 3 B 3 C 3 C 3 D 3D 3 E 3 E L-Histydyna, mML-Histidine, mM 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,34 0.34 0,34 0.34 0,34 0.34 0,34 0.34 0,34 0.34 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % 0,01 0.01 0,02 0.02 0,03 0.03 0,04 0.04 0,05 0.05 Odzyskano po przywróceniu pierwotnej postaci, %Recovered after restoring to its original form, % 91 91 90 90 93 93 99 99 100 100

Wyniki uzyskane w tym przykładzie wskazują na to, że odzysk czynnika VIII (VIII:C), po przywróceniu pierwotnej postaci, był bardzo wysoki i bardzo dobry dla wszystkich zastosowanych stężeń Polysorbate 80.The results obtained in this example indicate that the recovery of factor VIII (VIII:C), after reconstitution, was very high and very good for all concentrations of Polysorbate 80 used.

Przykład 4. Zmiana stężenia chlorku sodowego.Example 4. Change in sodium chloride concentration.

Rekombipantpny czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.Recombinant factor VIII was prepared according to the procedure described in the experimental section.

ml roztworu zliofilizowano i przechowywano w różnych temperaturach w czasie do 6 miesięcy, po czym przywrócono do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml wody jałowej do wstrzykiwań.ml of solution was lyophilized and stored at various temperatures for up to 6 months and then reconstituted with 5 ml of sterile water for injection.

4 A 4 A 4 B 4 B L-Histydyna, mML-Histidine, mM 50 50 50 50 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,3 0.3 0,6 0.6 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 4 4 4 4 PEG-4000% (glikol polietylenowy) PEG-4000% (polyethylene glycol) 0,1 0.1 0,1 0.1 Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % 0,025 0.025 0,025 0.025

175 177175 177

Odzysk, %: początkowo po przechowywaniu w temperaturze 8°C:Recovery, %: initially after storage at 8°C:

w ciągu 3 miesięcywithin 3 months 88 88 87 87 w ciągu 4 miesięcywithin 4 months 87 87 83 83 w ciągu 6 miesięcywithin 6 months 87 87 83 83 po przechowywaniu w temperaturze 25°C: after storage at 25°C: w ciągu 1 miesiącawithin 1 month 92 92 93 93 w ciągu 3 miesięcywithin 3 months 87 87 79 79 w ciągu 4 miesięcywithin 4 months 84 84 81 81 w ciągu 6 miesięcywithin 6 months 85 85 85 85 po przechowywaniu w temperaturze 37°C: after storage at 37°C: w ciągu 1 miesiącawithin 1 month 88 88 90 90 w ciągu 3 miesięcywithin 3 months 80 80 80 80 w ciągu 4 miesięcywithin 4 months 80 80 77 77 w ciągu 6 miesięcywithin 6 months 81 81 80 80 po przechowywaniu w temperaturze 50°C: after storage at 50°C: w ciągu 1 miesiącawithin 1 month 84 84 89 89 w ciągu 3 miesięcywithin 3 months 77 77 77 77 w ciągu 4 miesięcywithin 4 months 73 73 70 70

Dla 0,3 M lub 0,6 M chlorku sodowego uzyskano bardzo dobrą stabilność czynnika VIII. Oba preparaty okazały się trwałe w ciągu 6 miesięcy przechowywania w temperaturze 37°C.Very good factor VIII stability was achieved with 0.3 M or 0.6 M sodium chloride. Both preparations were stable for up to 6 months when stored at 37°C.

Przykład 5. Zmiana stężenia L-histydyny.Example 5. Change in L-histidine concentration.

Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opi-Recombinant factor VIII was produced according to the procedure described

sanym w części doświadczalnej. 2,2 ml roztworu wiofilżzowano, po czym przecpowywano w różnych temperatprach w czasie do 3 miesięcy, a następnie pcrywrhpona do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań. 5 A 5B used in the experimental section. 2.2 ml of the solution was violophilized, then stored at various temperatures for up to 3 months, and then reconstituted to its original form using 5 ml of sterile water for injection. 5 A 5B L-Histydyna, mML-Histidine, mM 46 46 59 59 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,31 0.31 0,31 0.31 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 3,7 3.7 3,7 3.7 PEG-4000% (glikol polietylenowy) PEG-4000% (polyethylene glycol) 0,091 0.091 0,011 0.011 Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % 0,364 0.364 0,364 0.364 Odzysk, %: po przechowywaniu w temperaturze 8°CRecovery, %: after storage at 8°C początkowo initially 78 78 884 884 w ciągu 3 miesięcy po przechowywaniu w temperaturze 25°C: within 3 months after storage at 25°C: 70 70 76 76 w ciągu 1 miesiąca w ciągu 3 miesięcywithin 1 month within 3 months 69 69 74 74 po przechowywaniu w temperaturze 37°C: after storage at 37°C: w ciągu 1 miesiącawithin 1 month 76 76 85 85 w ciągu 3 miesięcy po przechowywaniu w temperaturze 50°C: within 3 months after storage at 50°C: 61 61 48 48 w ciągu 1 miesiącawithin 1 month 60 60 73 73 w ciągu 3 miesięcywithin 3 months 41 41 48 48

175 177175 177

Przykład ten pokazuje, że użyte różne ilości L-histydyny nie wpływają na trwałość preparatu.This example shows that the different amounts of L-histidine used do not affect the stability of the preparation.

Przykład 6. Rekombioantzny czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem pzstępznaoia opisanym w części doświadczalnej.Example 6. Recombinant factor VIII was produced according to the method described in the experimental part.

6 A 6 A 6 B 6 B L-Histydyna, mML-Histidine, mM 65 65 65 65 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,3 0.3 0,3 0.3 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 4 4 4 4 PEG-4000% PEG-4000% 0 0 0,1 0.1 Tween 80, % Tween 80, % 0,025 0.025 0,025 0.025

Roztwory te zamrożznz/rozmrożzoz 1,5 i 10 razy i otrzymano następujące wielkości odzysku:These solutions were frozen/thawed 1.5 and 10 times and the following recovery values were obtained:

IU/ml IU/ml IU/ml IU/ml Na zimnoCold 298 298 291 291 1 zamrożenie 1 freeze 293 293 293 293 5 5 295 295 287 287 10 10 290 290 288 288

Badania te wykazały, że VIII:C był stabilny po powtarzanym zamrażaniu/rozmrażaniu oraz, że w przypadku omawianego preparatu użycie PEG-4000 (co do którego uważa się, że działa jako środek kriozchroony) nie jest konieczne.These studies showed that VIII:C was stable after repeated freeze/thaws and that the use of PEG-4000 (which is believed to act as a cryoprotectant) was not necessary for this formulation.

Przykład 7. Zmiana pH.Example 7. Change in pH.

Rbkombmantony czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części dośniadrzalobj.Rbkombmantons factor VIII were prepared according to the procedure described in the intranasal section.

2,2 ml roztw υzff mżrfiizsowano, a nostępni^ proibvcócono do pierwoibej oostaci pray użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań.2.2 ml of the solution was mixed and then reconstituted to the original consistency using 5 ml of sterile water for injection.

7 A 7 A 7 B 7 B 7 C 7 C 7D 7D L-Histydyna, mML-Histidine, mM 65 65 65 65 65 65 65 65 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 4 4 4 4 4 4 4 4 Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % 0,025 0.025 0,025 0.025 0,025 0.025 0,025 0.025 PH PH 6,0 6.0 6,5 6.5 7,0 7.0 7,5 7.5 Odzysk, %: początkowoRecovery, %: initially 74 74 70 70 78 78 79 79 3 godziny *3 hours * 73 73 80 80 78 78 77 77

Przykład ten pokazuje, że pH w zakresie, w przybliżeniu, od 6,0 do 7,5 nie wywiera znaczącego wpływu.This example shows that a pH in the range of approximately 6.0 to 7.5 has no significant effect.

Przykład 8. Dodanie sacharozy.Example 8. Adding sucrose.

RbOzmbmantony czynnik VIII wytworzzoo zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.RbOzmbmantonyl factor VIII was produced according to the procedure described in the experimental part.

2,2 ml rozyvozu m^ofiizsi^i^ai^t^, a azstępnie praibΛcócono co ρΐβ^^^' zostaci p^c użyciu 5 ml jałzwbj wody do wstrzykiwań.2.2 ml of the solution for injection was added to the solution and then diluted with 5 ml of sterile water for injection.

175 177175 177

8 A 8 A 8 B 8 B L-Histydyna, mML-Histidine, mM 58 58 20,5 20.5 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,3 0.3 0,3 0.3 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 3,7 3.7 3,7 3.7 Sacharoza, mMSucrose, mM 0 0 13,3 13.3 Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % 0,025 0.025 0,025 0.025

Sacharozę dodano do roztworu B po etapie końcowego oczyszczania, przed liofilizacją. Odzysk po liofilizacji wynosił 76% dla A i 87% dla B. Taką samą aktywność stwierdzono po upływie 4 godzin od przywrócenia pierwotnej postaci przy przechowywaniu w temperaturze pokojowej.Sucrose was added to solution B after the final purification step, before lyophilization. Recovery after lyophilization was 76% for A and 87% for B. The same activity was observed 4 hours after reconstitution when stored at room temperature.

Wyniki tego badania wskazują na to, że dodanie sacharozy jest korzystne z punktu widzenia odzysku VIII:C po liofilizacji.The results of this study indicate that the addition of sucrose is beneficial for the recovery of VIII:C after lyophilization.

Przykład 9. Zmiana rodzaju soli wapniowej.Example 9. Changing the type of calcium salt.

9 A 9 A 9B 9B 9 C 9 C 9D 9D L-Histydyna, mML-Histidine, mM 23 23 23 23 23 23 23 23 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,34 0.34 0,34 0.34 0,34 0.34 0,34 0.34 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 4 4 4 4 0,15 0.15 0,15 0.15 Polysorbate, %Polysorbate, % 0,025 0.025 0,025 0.025 0,025 0.025 0,025 0.025 Sacharoza, mMSucrose, mM - - 10 10 - - 10 10 Glukonian wapniowy, mMCalcium gluconate, mM 0 0 0 0 6 6 6 6 Odzysk, %·. Recovery, %·. początkowo initially 63 63 74 74 74 74 78 78 4 godziny *4 hours * 60 60 73 73 73 73 77 77

Przykład ten pokazuje, że CaCl2 można zastąpić glukonianem wapniowym. Przykład 10. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.This example shows that CaCl2 can be replaced by calcium gluconate. Example 10. Recombinant factor VIII was produced according to the procedure described in the experimental section.

2,2 ml roztworu zliofilizowano, a następnie przywrócono do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań. Ilość VIII:C w preparacie zrekonstytuowanym, w jednej fiolce, wynosiła około 1000IU.2.2 ml of solution was lyophilized and then reconstituted with 5 ml of sterile water for injection. The amount of VIII:C in the reconstituted preparation, per vial, was approximately 1000 IU.

10 A 10 A 10 B 10 B L-Histydyna, mML-Histidine, mM 14,7 14.7 58 58 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,31 0.31 0,31 0.31 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 3,7 3.7 3,7 3.7 Sacharoza, mMSucrose, mM 19,9 19.9 - - Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % 0,025 0.025 0,025 0.025 Odzysk, IU/ml, po przywróceniu pierwotnej postaci:Recovery, IU/ml, after restoration to original form: początkowo initially 213 213 198 198 4 godziny, 25°C4 hours, 25°C 213 213 198 198 24 godziny, 25°C24 hours, 25°C 201 201 182 182

175 177175 177

Odzysk, %:Recovery, %:

początkowo initially 92 92 91 91 5 miesięcy, 25°C5 months, 25°C 88 88 - - 5 miesięcy, 30°C5 months, 30°C 76 76 85 85 12 miesięcy, 7°C12 months, 7°C 89 89 97 97

Odzysk był dobry wtedy, gdy część L-histydyny zastąpiono sacharozą.Recovery was good when some of the L-histidine was replaced by sucrose.

Preparaty te badano z wykorzystaniem metody chromatografii żelowej, po upływie 5 miesięcy przechowywania w temperaturze, odpowiednio, 25°C i 30°C. Otrzymane wyniki przedstawiono na figurach 1 i 2. Jedynymi pikami, które można tam zahaczyć są to: pik w minucie 42, wskazujący czynnik VIII:C i pik w minucie 70, którym jest histydyna. Obecność agregatów stwierdza się przed 40 minutą. Na figurze 1 można zaba^czyć, że w przypadku 10 A nie stwierdza się występowania żadnej dającej się oznaczyć ilości agregatów po upływie 5 miesięcy przechowywania w temperaturze 25°C. Figura 2 pokazuje, dla 10 B, niewielką ilość agregatów, mniejszą niż 2%, po upływie 5 miesięcy przechowywania w temperaturze 30°C.These preparations were examined by gel permeation chromatography after 5 months of storage at 25°C and 30°C, respectively. The results are presented in Figures 1 and 2. The only detectable peaks are the peak at 42 minutes, indicating factor VIII:C, and the peak at 70 minutes, which is histidine. The presence of aggregates is observed before 40 minutes. Figure 1 shows that for 10 A, no detectable amount of aggregates is observed after 5 months of storage at 25°C. Figure 2 shows, for 10 B, a small amount of aggregates, less than 2%, after 5 months of storage at 30°C.

Przykład 11. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono) zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.Example 11. Recombinant factor VIII was produced according to the procedure described in the experimental part.

2,2 ml roztworu zllrfllizrwano, a następnie praywrócśśno do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań. Ilość VIII:C w preparacie zrekrnttytuowanym, w jednej fiolce, wynosiła około 500IU.2.2 ml of the solution was reconstituted and then reconstituted with 5 ml of sterile water for injection. The amount of VIII:C in the reconstituted preparation, per vial, was approximately 500 IU.

11A 11A 11B 11B L-Histydyna, mML-Histidine, mM 144, 144, 58 58 Chlorek sodowy, MSodium chloride, M 0,31 0.31 0,31 0.31 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 3,3 3.3 Sacharoza, mMSucrose, mM 11,9 11.9 - - Polysorbate 80, %Polysorbate 80, % 0,025 0.025 0,025 0.025 Odzysk, IU/ml, po przywróceniu pierwotnej postaci:Recovery, IU/ml, after restoration to original form: początkowo initially 98 98 115 115 4 godziny, 25°C4 hours, 25°C 9(5 9(5 110 110 24 godziny, 25°C Odzysk,24 hours, 25°C Recovery 93 93 110 110 początkowo initially 91 91 93 93 po przechowywaniu w temperaturze 25°C: after storage at 25°C: w ciągu 5 miesięcywithin 5 months 89 89 87 87 po przechowywaniu w temperaturze 30°C: after storage at 30°C: w ciągu 5 miesięcywithin 5 months 7(5 7(5 79 79 po przechowywaniu w temperaturze 7°C: after storage at 7°C: w ciągu 12 miesięcywithin 12 months 89 89

Oba preparaty wykazywały dobrą stabilność.Both preparations showed good stability.

Preparaty te poddano badaniu metodą chromatografii żelowej i otrzymane wyniki okazały się podobne do wyników przedstawionych na figurach 1 i 2.These preparations were tested by gel permeation chromatography and the results obtained were similar to those shown in Figures 1 and 2.

175 177175 177

Nie stwierdzono tworzenia się agregatów przy przechowywaniu omawianych preparatów w ciągu 5 miesięcy w temperaturze, odpowiednio, 25°C i 30°C.No formation of aggregates was observed when the preparations in question were stored for 5 months at 25°C and 30°C, respectively.

Przykład 12. Rekom^^i^my czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.Example 12. Recommend factor VIII was prepared according to the procedure described in the experimental part.

ml roztwora d^trfilż^i^^iliK^, wo ozym ozozcCóueoppno w różwyrh tempemliKach w czasie do 3 miesięcy, a następnie przowrhcpnp do pierwotnej postaci pozy użyciu 4 ml jałowej wody do wstrzykiwań. Ilość VIII:C w preparacie zrekonstruowanym, w jednej fiolce, wynosiła około 500 IU.ml of the diluted solution, then stored in various vials for up to 3 months, and then reconstituted to its original form using 4 ml of sterile water for injection. The amount of VIII:C in the reconstituted preparation, in one vial, was approximately 500 IU.

12 A 12 A 12 B 12 B Mannitol, mg/mlMannitol, mg/ml 20 20 20 20 L-Histydyna, mg/ml L-Histidine, mg/ml 2,67 2.67 2,67 2.67 Chlorek sodowy, mg/mlSodium chloride, mg/ml 18 18 18 18 Chlorek wapniowy, mMCalcium chloride, mM 3,7 3.7 3,7 3.7 Polysorbate 80, mg/mlPolysorbate 80, mg/ml 0,23 0.23 0,23 0.23 Odzysk, %·. początkowo Recovery, %· initially 91 91 93 93 po przechowywaniu w temperaturze 7°C: after storage at 7°C: w ciągu 5 miesięcywithin 5 months 90 90 85 85

Uzyskano nadającą się do przyjęcia trwałość preparatu, stwierdzoną po przechowywaniu go w ciągu 5 miesięcy w temperaturze 7°C.Acceptable stability of the preparation was achieved after storage for 5 months at 7°C.

Stosowane w opisie nazwy handlowe oznaczają:The trade names used in the description mean:

Po^sam^ - polimer ppksyeiolnnpwp-pksypóppylenpwo,Po^sam^ - polymer ppksyeiolnnpwp-pksypóppylenpwo,

Polysorbate 20 - mpnplauóynian pρlipksyetyleno(20)-srrbitanu,Polysorbate 20 - pρlipoxyethylene(20)-srbitane monolate,

Polysorbate 80 - mpnppleinian pplipksyntylenp(20)-sprbitanu,Polysorbate 80 - pplipxinylenp(20)-sprbitane mpnppleate,

TNBP - iri-N-buiylpfpsfpran,TNBP - iri-N-buiylpfpsfpran,

Octpχonpl 9 - oktylo fenoksy pplintpksyetanpl.Octpχonpl 9 - octyl phenoxy pplintpksyetanpl.

Claims

1. A pharmaceutical composition containing recombinant coagulation factor VIII and a stabilizer to stabilize factor VIII activity during storage over an extended period of time and the composition itself is either a) initially or finally in the form of a ready-to-use aqueous solution, or b) initially as an aqueous solution, which is then is dried and finally reconstituted as an aqueous solution before use, characterized in that it contains recombinant coagulation factor VIII with a specific activity above 2000 IU / mg of protein in an amount of 10-100,000 IU / ml, sodium or potassium chloride in an amount greater than 0.1 M , a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate in an amount greater than 0.5 mM, a non-ionic surfactant in an amount of at least 0.01 mg / ml, L-histidine buffering the system and protecting the protein in the amorphous phase, and optionally mono- or or disaccharides or sugar alcohols.

2. A composition according to claim 1 8. The product of claim 1, wherein the factor VIII has a specific activity greater than 5000 IU / mg protein.

3. A composition according to p. The method of claim 1, wherein the factor VIII is full-length recombinant factor VIII or a deletion derivative thereof.

4. A composition according to p. The method of claim 1, characterized in that the amount of factor VIII is preferably 50 to 10,000 IU / ml.

5. A composition according to p. The method of claim 1, wherein the nonionic surfactant is present in an amount in excess of the critical micellization concentration.

6. A composition according to claim 1 The method of claim 1, wherein the nonionic surfactant is a block copolymer, preferably an oxyethylene-oxypropylene polymer (poloxamer).

7. The composition according to p. The method of claim 1, wherein the nonionic surfactant is a polyethoxylated (20) fatty acid ester, preferably polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (Polysorbate 20) or polyoxyethylene (20) sorbitan monoleate (Polysorbate 80).

8. A composition as claimed in p. The composition of claim 1, wherein the disaccharide is sucrose.

9. A composition according to p. The method of claim 1, wherein the weight ratio of sodium chloride to L-histidine is greater than .1: 1.

10. A composition according to claim 1 A compound according to claim 1, characterized in that it contains: i) 10-100,000 IU / ml of recombinant factor VIII, ii) at least 0.01 mg / ml of polyethoxylated (20) fatty acid ester, iii) sodium chloride in an amount greater than 0.1 M , iv) a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably in an amount greater than 0.5 mM, and v) L-histidine, in an amount greater than 1 mM.

11. The composition according to p. A formulation as claimed in claim 1 in the form of a dry formulation.

12. A composition as claimed in p. A formulation as claimed in claim 11 in the form of a lyophilized preparation.

13. A method for the preparation of a pharmaceutical composition containing recombinant coagulation factor VIII and a stabilizer to stabilize factor VIII activity during storage over an extended period of time, the composition itself being either a) initially or finally in the form of an aqueous ready-to-use solution or b) initially in the form of an aqueous solution a solution which is then dried and finally reconstituted as an aqueous solution before use, which contains recombinant coagulation factor VIII

175 177 with a specific activity above 2000 IU / mg of protein in an amount of 10-100.000 IU / ml, sodium or potassium chloride in an amount greater than 0.1 M, a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably in an amount greater than 0, 5 mM, non-ionic surfactant in an amount of at least 0.01 mg / ml, L-histidine buffering the system and protecting the protein in the amorphous phase and optionally mono- or disaccharides or sugar alcohols, characterized by mixing factor VIII with the non-ionic agent a surfactant in an aqueous solution, sodium or potassium chloride, a calcium salt and preferably with sucrose.

14. A method for reconstituting a pharmaceutical composition containing manual mbinant coagulation factor VIII and a stabilizer to stabilize factor VIII activity during long-term storage, the composition itself being either a) initially or finally in the form of an aqueous ready-to-use solution or b) initially in in the form of an aqueous solution, which is then dried and finally prepared as an aqueous solution before use, which contains recombinant coagulation factor VIII with a specific activity of more than 2,000 IU / mg of protein in an amount of 10-100,000 IU / ml, sodium or potassium chloride in an amount greater than 0.1 M, a calcium salt such as calcium chloride or calcium gluconate, preferably greater than 0.5 mM, a non-ionic surfactant of at least 0.01 mg / ml, L-histidine buffering the system and protecting the protein in the phase amorphous and possibly mzoz- or disaccharides or sugar alcohols, characterized in that factor VIII is eluted after the last step purification with a buffer containing an alcoholic surfactant in an aqueous solution, with L-histidine, sodium or potassium chloride, a calcium salt and preferably sucrose.