PL175177B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawierająca rekombinantowy czynnik krzepnięcia VIII I54) oraz sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej rekombinantowy czynnik krzepnięcia VIll - Google Patents

Abstract

1.Kompozycja farmaceutycznazawierająca rekombinantowyczynnikkrzepnięcia VIIIistabilizator (57) stabilizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wydłużony okres czasu a sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rekonstytuowany jako wodny roztwór przed użyciem, znamienna tym, że zawiera rekombinowany czynnik krzepnięcia VIII o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chlorek sodu lub potasu w ilości większej niż 0,1 M, sól wapniową taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy w ilości większej niż 0,5 mM, niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mono- lub disacharydy lub alkohole cukrowe. 13. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej rekombinantowy czynnik krzepnięcia VIIIistabilizator stabilizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wydłużony okres czasu, przy czym sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rekonstytuowanyjako wodny roztwór przed użyciem, która zawiera rekombinowany czynnik krzepnięcia VIII o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chloreksodu lub potasuwilościwiększej niż 0,1M,sólwapniową takąjakchlorekwapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości większej niż 0,5 mM, niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mono- lub disacharydy lub alkohole cukrowe, znamienny tym, że miesza się czynnik VIII z niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w roztworze wodnym, chlorkiem sodu lub potasu, sól wapniową i korzystnie z sacharozą.

Description

Wynalazek niniejszy dotyczy nzwei kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik krzepnięcia VIII i nibjznony środek powierzchniowo czynny, taki jak kopolimery blokowe, na przykład pzlioksambry lub produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych i sorbitanu z tlenkiem etylenu (20), takie jak, na przykład, Polysorbate 20 lub Polysorbate 80. Kompozycja zawiera także chlorek sodowy, chlorek wapniowy, L-histydynę i/lub cukry i/lub alkohole cukrowe.

Hemofilia jest to choroba dziedziczna, znana od setek lat, jednakże dopiero w ciągu ostatnich trzydziestu lat stało się możliwe rozróżnienie rozmaitych jej postaci, a mianowicie hemofilii A, hemofilii B i hemofilii C. Najczęściej spotykaną postacią hemofilii jest hemofilia A. Dotyka ona wyłącznie osobników płci męskiej, a częstość jej występowania wynosi 1 lub 2 przypadki na 10000 żywych urodzeń. Chorobę tę powoduje silnie zaniżony poziom, lub brak, biologicznie aktywnego czynnika krzepnięcia VIII (czynnik antyhemofilony), będącego białkiem normalnie występującym w osoczu krwi. Objawem klinicznym hemofilii A jest skłonność do silnego krwawienia i zanim wprowadzono leczenie z zastosowaniem koncentratów czynnika VIII, średni wiek pacjentów cierpiących na hemofilię wynosił mniej niż 20 lat. Od około trzydziestu lat dostępne są koncentraty czynnika VIII ztrzzmynanb z osocza. Polepszyło to znacznie sytuację, jeśli chodzi o leczenie pacjentów dotkniętych hemofilią i uzyskali oni możliwość życia w normalny sposób.

Lecznicze koncentraty czynnika VIII wytwarza się, jak dotychczas, za pomocą frakcjonowania osocza. Tym niemniej, jednak, obecnie dostępne są już metody wytwarzania czynnika VIII w hodowli komórkowej z zastosowaniem metody rekombinantowego DNA, jak o tym donieśli, na przykład, J. Gitschier i in. [Nature, 312, 330 - 337 (1984)] oraz EP 160457.

Koncentraty czynnika VIII pochodzące z osocza krwi ludzkiej zawierają szereg fragmentowych, w pełni aktywnych, postaci czynnika VIII [Andersson i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, tom 83, 2979 - 1983, maj 1986)]. Najmniejsza tego rodzaju postać aktywna charakteryzuje się masą cząsteczkową wynoszącą 170 kDa i składa się z dwóch łańcuchów,

175 177 jednego o masie cząsteczkowej 90 kDa i drugiego o masie cząsteczkowej 80 kDa, utrzymywanych razem przez mostek będący jonem metalu. Można się tu odnieść do EP 197901. Firma Kabi Pharmacia opracowała produkt stanowiący rekombinantowy czynnik VIII, który odpowiada postaci 170 kDa czynnika VIII pochodzącego z osocza, występującej w stosowanych w lecznictwie koncentratach czynnika VIII. Skrócona cząsteczka rekombinantowego czynnika VIII została nazwana r-VIII SQ i wytwarza się ją z udziałem komórek chomika chińskiego (CHO) metodą hodowli komórkowej w podłożu nie zawierającym surowicy w końcowym pasażu.

Aktywność właściwa r-VIII SQ może być wyższa niż 12000 IU/mg białka, korzystnie ponad 14000 IU/mg. Zmierzono aktywność wynoszącą około 15000 IU/mg. Wcześniej stwierdzono dla r-VIII SQ według wynalazku około 10(^00 IU VIII:C/mg białka.

Wskazane jest zastosowanie rekombinantowego czynnika VIIISQ do leczenia klasycznej hemofilii. Dawkowanie jest w tym przypadku podobne do dawkowania koncentratów czynnika VIII z osocza. Dzięki wysokiemu stężeniu, jakie stało się obecnie osiągalne, objętości niezbędne do wykonania wstrzyknięcia są bardzo niewielkie.

Strukturę i biochemię wytworzonych produktów, będących preparatami rekombinantowego czynnika VIII, opisał w sposób ogólny Kaufman [Tibtech, tom 9 (1991); Hematology, 63, 155 - 165 (1991)]. Struktura i biochemia r-VIII SQ są opisane w WO 91/09122.

Stabilność białek stanowi, ogólnie, problem w przemyśle farmaceutycznym. Często rozwiązuje się go przez wysuszenie białka w rozmaitych procesach suszenia, takich jak, na przykład, liofilizacja. Po wysuszeniu, białko rozdysponowuje się i przechowuje w stanie suchym.

Zarówno roztwór przed suszeniem lub liofilizacją, jak i materiał wysuszony oraz produkt, któremu przywrócono postać pierwotną, powinny być trwałe. Oznacza to, że w trakcie suszenia, przechowywania lub manipulowania nie powinno tracić się aktywności preparatu w nadmiernym zakresie.

Czynnik VIII, który otrzymuje się za pomocą rozfrakcjonowania osocza, normalnie sprzedawany jest w postaci zliofilizowanego proszku, który należy rekonstytuować przy użyciu wody.

Preparat o małej zawartości białka na ogół traci swą aktywność podczas oczyszczania, obróbki w warunkach jałowych, pakowania i stosowania. Problem ten zazwyczaj rozwiązuje się przez dodanie do preparatu albuminy ludzkiej, która znacznie zmniejsza stratę aktywności czynnego białka. Albumina ludzka działa jako ogólny stabilizator w trakcie oczyszczania, obróbki jałowej i liofilizacji [patrz: przegląd dokonany przez Wanga i in. w: J. of Parenteral Sci. and Tech., tom 42, nr 2 S, suplement (1988)]. Albumina ludzka nadaje się także dobrze do formowania masy w przypadku preparatu przeznaczonego do liofilizacji. Zastosowanie albuminy do stabilizowania czynnika VIII jest znane i obecnie wykorzystuje się ją we wszystkich preparatach czynnika VIII o wysokim stopniu czystości znajdujących się na rynku.

Jednakże, nie jest pożądane dodawanie albuminy ludzkiej do stosowanego w lecznictwie białka wytworzonego z zastosowaniem technologii rekombinantowego DNA. Poza tym, użycie albuminy ludzkiej jako zarobki w preparacie często ogranicza zastosowanie wielu spośród najskuteczniejszych i czułych analitycznych metod identyfikacji białka.

Istnieje zapotrzebowanie na preparaty czynnika VIII, a zwłaszcza rekombinantowego czynnika VIII, nie zawierające albuminy i odznaczające się trwałością podczas suszenia lub liofilizacji, w roztworze i w postaci roztworu po przywróceniu pierwotnej postaci.

Zaproponowano szereg różnych rozwiązań, jeśli chodzi o stabilizowanie rozmaitych białek.

W EP 35204 (Cutter) ujawniono sposób nadawania termostabilności kompozycji białkowej w obecności poliolu.

W EP 381 345 (Corint) ujawniono wodny płyn zawierający peptyd desmopresynę, obecnością karboksymetylocelulozy.

175 177

W WO 89/09614 (Genentech) ujawniono stabilizowany preparat ludzkiego hormonu wzrostu zawierający glicynę, mannitol i bufor, a w korzystnym wariancie sposobu realizacji wynalazku, z dodatkiem niejonowego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak Polysorbate 80. Niejonowy środek powierzchniowo czynny dodawany jest w celu zmniejszenia tworzenia agregatów i denaturacji. Preparat taki oznacza się zwiększoną trwałością, tak w postaci liofilizatu jak i po przywróceniu pierwotnej postaci.

W EP 268 110 (Cetus) ujawniono roztwór zawierający specyficzne białko, interleukinę 2, rozpuszczone w obojętnym środowisku stanowiącym nośnik. Zawiera ono niejonowy polimeryczny detergent jako środek solubilizujący/stabilizujący. Korzystnymi detergentami są związki typu oktylofenoksypolietoksyetanolu, związki typu monosterynianu glikolu polietylenowego i produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych i sorbitanu z polietylenem.

W US 4783441 (Hoechst) ujawniono roztwór wodny zawierający białko, takie jak insulina oraz substancję powierzchniowo czynną.

W US 4165370 (Coval) ujawniono roztwór gamma-globuliny i sposób jego wytwarzania. Wspomniane roztwory zawierają glikol polietylenowy (PEG). Do roztworu dodać można niejonowy środek powierzchniowo czynny.

W EP 77870 (Green Cross) ujawniono dodanie aminokwasów, monosacharydów, oligosacharydów albo alkoholi cukrowych lub wywodzącego się od węglowodorów kwasu karboksylowego w celu polepszenia stabilności roztworu zawierającego czynnik VIII, a w EP 117064 (Green Cross) ujawnione dodanie alkoholu cukrowego lub disacharydów do wodnego roztworu czynnika VIII w celu zwiększenia stabilności podczas obróbki cieplnej.

W WO 91/10439 (Octopharma) zastrzeżono stabilny, dający się wstrzykiwać roztwór czynnika VIII lub czynnika IX, który zawiera disacharyd, korzystnie sacharozę oraz jeden, lub więcej niż jeden aminokwas.

W Ep 315968 i EP 314095 (Rorer) zastrzeżono stabilne preparaty czynnika VIII o różnej mocy jonowej.

Z punktu widzenia właściwości fizyko-chemicznych białka różnią się między sobą. Jeśli chodzi o wytwarzanie preparatu farmaceutycznego, który powinien nadawać się do przyjęcia pod względem właściwości fizyko-chemicznych i który powinien być stabilny w ciągu długiego czasu, należy brać pod uwagę nie tylko właściwości fizjologiczne białka, ale także i inne aspekty, takie jak możliwość wytwarzania w skali przemysłowej, łatwość podawania pacjentowi i bezpieczeństwo chorego. Wyników analizy tych aspektów nie można przewidzieć przy testowaniu rozmaitych preparatów i często zachodzi potrzeba indywidualnego rozwiązania tych problemów dla każdego białka.

Krążący w osoczu czynnik VIII stabilizowany jest przez wiązanie się ze swym nośnikiem białkowym, a mianowicie czynnikiem von Willebranda (vWF). W osoczu, a także w typowych koncentratach czynnika VIII o średniej czystości, stosunek wagowy vWF do czynnika VIII wynosi co najmniej 50:1. W koncentratach czynnika VIII o wysokim stopniu czystości, a aktywności właściwej wynoszącej ponad 2000 IU/mg białka, stosunek vWF do czynnika VIII wynosi około 1:1 (wag/wag), i w istocie cały czynnik VIII jest związany z vWF. Pomimo osiągnięcia takiego poziomu ustabilizowania preparatu, potrzebne jest dalsze zabezpieczenie za pomocą dodania albuminy w celu uzyskania nadającej się do przyjęcia trwałości w trakcie liofilizacji i przechowywania.

Wszystkie znajdujące się na rynku preparaty o najwyższej czystości stabilizowane są albuminą (albuminą surowicy ludzkiej). Obecnie występuje zapotrzebowanie na dający się wstrzykiwać preparat czynnika VIII nie zawierający albuminy, z minimalną zawartością dodatków. Obecnie opracowano nową kompozycję, która umożliwia rozwiązanie powyższych problemów dotyczących czynnika VIII. Nieoczekiwanie stwierdzono, że czynnik VIII, który jest białkiem o wysokiej wrażliwości, można stabilizować z pominięciem użycia albuminy, jeżeli doda się niejonowego środka powierzchniowo czynnego.

Zgodnie z tym, wynalazek niniejszy dotyczy kompozycji, zawierający czynnik krzepnięcia VIII i niejonowy środek powierzchniowo czynny jako stabilizator. Uzyskany czynnik VIII jest preparatem o wysokim stopniu czystości, co oznacza, że jego aktywność właściwa wynosi ponad 2000 IU/mg, korzystnie ponad 5000 IU/mg białka, przy czym kompozycja ta stabilizowana jest z pominięciem dodania albuminy.

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca rekombinantowy czynnik krzepnięcia VIII i ssabillzator stabiiizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wydłużony okres czasu a sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rekonstytuowany jako wodny roztwór przed użyciem, zawiera rekombinowany czynnik krzepnięcia VIII o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chlorek sodu lub potasu w ilości większej niż 0,1 M, sól wapniową taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości większej niż 0,5 mM, niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mono- lub d^chai^y lub alkohole cukrowe.

W przypadku użycia rekrmbinrwanegr czynnika VIII, może on występować w postaci o pełnej długości, albo w postaci pochodnej delecyjnej, takiej jak pochodna SQ. Ilość czynnika VIII wynosi korzystnie 50-10.000 IU/ml.

Korzystnie, niejonowy środek powierzchniowo czynny dobiera się spośród kopolimerów blokowych, takich jak poloksamer lub polirasyetylenowany (20) ester kwasu tłuszczowego, taki jak Polysorbate 20 lub Polysorbate 80. Jako Polysorbate 80 używa się Tween 80®. Niejonowy środek powierzchniowo czynny obecny jest w ilości przewyższającej krytyczne stężenie mizeilaacjl (CMC). Patrz: Wan i Lee, Jom-nal of Pharm. Sci, 63,136 (1974).

Tak więc, poiloktyetnlenrwany (20) ester kwasu tłuszczowego korzystnie występuje w ilości wynoszącej co najmniej 0,01 mg/ml. I tak, na przykład, ilość ta może mieścić się w zakresie od 0,02 do 1 mg/ml.

Kompozycja może także zawierać chlorek sodowy lub potasowy w ilości większej niż 0,1 M.

Kompozycja zawiera sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, w ilości większej niż 0,5 mM oraz aminokwas, taki jak L-histydyna, w ilości większej niż 1 mM.

Można też dodać monotacharndy lub ditacharydn, takie jak sacharoza, lub alkohole cukrowe, na przykład w ilości wynoszącej od 1 do 300 mg/ml.

Korzystnie, kompozycja zawiera L-histydynę i sacharozę. Stosunek wagowy chlorku sodowego do L-hlttndnnn w omawianej kompozycji korzystnie jest wyższy niż 1:1.

Kompozycja może zawierać: i) 10 -100000 IU/mg rekombinantowego czynnika VIII, ii) co najmniej 0,01 mg/ml polirksyetylenowanegr (20) estru kwasu tłuszczowego, iii) chlorek sodowy, w ilości większej niż 0,1 M, iv) sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, w ilości większej niż 0,5 mM oraz v) aminokwas, taki jak L-histydyna, w ilości większej niż 1 mM.

Do omawianej kompozycji można dodać monosacharydy lub disacharndn albo alkohole cukrowe, korzystnie sacharozę.

Kompozycja może mieć postać preparatu suchego, korzystnie liofilizowanego. Może też, przed wysuszeniem lub po nim, występować jako roztwór wodny. Produktowi suchemu przywraca się postać pierwotną przy użyciu wody jałowej do wstrzykiwań lub roztworu buforowego.

Zastrzegana kompozycja może także stanowić stabilny roztwór wodny gotowy do użycia.

Wynalazek dotyczy także kompozycji, w przypadku których aktywność właściwa r-VIII SQ jest wyższa niż 12000 IU/mg białka, korzystnie jest wyższa niż 14000 IU/mg.

Zastrzeganą kompozycję można wytworzyć za pomocą zmieszania czynnika VIII z niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w roztworze wodnym, razem z aminokwasem, takim jak L-histydyna, solą sodową, sacharozą i solą wapniową, albo za pomocą wyeluowania czynnika VIII po ostatnim etapie oczyszczania buforem zawierającym niejonowy środek powierzchniowo czynny w roztworze wodnym, razem z aminokwasem, takim jak L-histydyna, solą sodową, sacharozą i solą wapniową.

177

Do zbuforowania układu używa się aminokwasu, który także zabezpiecza utrzymanie białka w fazie amorficznej. Stosowanym buforem może być L-histydyna, lizyna i/lub arginina. Przede wszystkim wybiera się L-histydynę, z uwagi na jej dobrą pojemność buforową, około pH 7.

W celu zapewnienia ochrony białka można dodać sacharozę lub alkohol cukrowy.

Do preparatu według wynalazku wprowadza się wapń (lub jony metalu dwuwartościowego) w postaci chlorku wapniowego (CaCl₂), jednakże można w tym przypadku użyć innych soli, takich jak glukonian wapniowy, giubionian wapniowy lub gluceptan wapniowy. Jest on potrzebny dla utrzymania ciężkiego i lekkiego łańcucha czynnika VIII w stanie zasocjowanym.

Dane przedstawione w przykładach wskazują na to, że r-VIII SQ jest stabilny w ciągu co najmniej 12 miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze 5 ± 3°C.

Następujące przykłady objaśniają wynalazek i przedstawiają dane odnoszące się do trwałości rozmaitych preparatów, przy czym wszystkie te preparaty objęte są zakresem ochrony patentowej, który to zakres nie jest ograniczony do tylko tych przykładów.

Wynalazek objaśniają następujące figury.

Figura 1: chromatografia żelowa HpLC, przykład 10 A, przechowywanie w ciągu 5 miesięcy w temperaturze 25°C.

Figura 2: chromatografia żelowa HPLC, przykład 10 B, przechowywanie w ciągu miesięcy w temperaturze 30°C.

Część doświadczalna.

Materiały, i metody.

Wytwarzanie czynnika VIII SQ (r-VIII SQ) przeprowadzone w zasadzie tak, jak to opisano w opisie patentowym WO 91/09122, przykład 1-3. Linię komórek CHO z delecją DHFR (DG44N.Y.) poddano elektroporacji z udziałem wektora ekspresyjnego zawierającego gen r-VIII SQ oraz wektora ekspresyjnego zawierającego gen reduktazy dihydrofolianowej. Po dokonaniu selekcji na podłożach selekcyjnych, kolonie przeżywające amplifikowano przez wzrost ze stopniowo zwiększającą się ilością metotreksatu. Supernatanty utworzonych tak kolonii przeszukano pod względem aktywności VIII:C. Wybrano klon produkcyjny i przystosowano go następnie do hodowli w nieobecności surowicy w podłożu o znanym składzie. W końcu opracowano sposób prowadzenia fermentacji w dużej skali. Po upływie określonego czasu supernatant zbiera się, po czym poddaje oczyszczaniu zgodnie z opisanym poniżej sposobem postępowania.

pH sklarowanego, kondycjonowanego podłoża doprowadzono do właściwego poziomu i podłoże wprowadzono na kolumnę S - Sepharose FF. Po przemyciu, wyeluowano czynnik VIII przy użyciu buforu solnego zawierającego 5 mM CaCl₂.

Immunoadsorpcję przeprowadzono na żywicy działającej na zasadzie immunopowinowactwa, przy czym ligandem było przeciwciało monoklonalne (8A4) skierowane przeciw ciężkiemu łańcuchowi czynnika VIII. Przed wprowadzeniem na kolumnę, na eluat S podziałano 0,3% TNBP i 1% Octoxynol 9.

Kolumnę zrównoważono, przemyto i wyeluowano czynnik VIII buforem zawierającym 0,05 M CaCl2 i 50% glikolu etylenowego.

Eluat mAb wprowadzono na kolumnę Q-Sepharose FF, zrównoważoną buforem stosowanym do elucji w etapie immunopowinowactwa. Po przemyciu, czynnik VIII wyeluowano przy użyciu 0,05 M L-histydyny, 4 mM CaCl2, 0,6 M NaCl (ph 6,8).

Eluat Q naniesiono na kolumnę do chromatografii żelowej (Superdex 200 p. g.). Zrównoważenia kolumny i elucji dokonano przy użyciu układu zawierającego chlorek sodowy, L-histydynę, chlorek wapniowy i Polysorbate 80.

Zebrano pik białkowy i roztwór sformułowano, po czym przeprowadzono liofilizację.

Aktywność VIII:C i stężenie składników nieaktywnych doprowadzono do właściwego poziomu za pomocą rozcieńczenia odpowiednim buforem. Następnie roztwór wyjałowiono przez przesączenie (0,22 /im), rozdozowano i zliofilizowano. Próbki pobrane z każdej

1^75177 kompozycji zamrożono i przechowywano w temperaturze -70°C. Próbki te rozmrażano i stosowano jako odnośniki przy oznaczaniu VIII :C.

Aktywność VIII:C jako czynnika powodującego krzepnięcie oceniono w teście z substratem chromogennym (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Moelndal, Szwecja). Aktywny czynnik X (Xa) tworzy się na szlaku wewnątrznaczyniowym, przy czym czynnik VIII.C działa jako kofaktor. Następnie oznacza się czynnik Xa przy użyciu substratu chromagennego S-2222 w obecności inhibitora trombiny I-2581 w celu zapobieżenia hydrolizie substratu przez trombinę. Reakcję zatrzymuje się za pomocą dodania kwasu, po czym oznacza się VIII:C [którego ilość jest proporcjonalna do uwolnionej pNA (p-nitroaniliny)] metodą fotometryczną przy 450 nm wobec samego odczynnika jako ślepej próby. Ilość czynnika VIII:C wyraża się w jednostkach międzynarodowych (IU) zgodnie z definicją w aktualnym International Concentrate Standard (IS) ustanowionym przez WHO.

Odzysk VIII:C oblicza się jako procent: VIII:C w restytuowanym roztworze podzielony przez VIII :C w . zamrożonym i rozmrożonym roztworze kierowanym do liofilizacji, z uwzględnieniem rozcieńczenia.

Rozpuszczalne agregaty oznaczano przy zastosowaniu chromatografii żelowej. Użyto wstępnie załadowanej kolumny Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia) z detektorem fluorescencji (długość fali wzbudzenia 280 nm, długość fali emisji 340 nm). Analizie poddano preparat, któremu przywrócono pierwotną postać. Oceny wyników uzyskanych metodą chromatografii żelowej dokonano na podstawie wzrokowego badania chromatogramów, albo przez scałkowanie powierzchni pików, jeżeli stwierdzono obecność agregatów.

Odzysk po liofilizacji wyraża się z % wydajności zamrożonego odnośnika.

Przykład 1. Porównanie między albuminą a niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym.

Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

ml roztworu zliofilizowano, a następnie przywrócono do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań.

Kompozycje miały skład następujący:

	IA	IB	IC	ID
L-Histydyna, mM	50	50	50	50
Chlorek sodowy, M	0,6	0,6	0,6	0,6
Chlorek wapniowy, mM	4	4	4	4
Polysorbate 80, %	-	-	0,02	-
PEG 4000, %	0,1	0,1	-	-
Albumina, %	-	1	-	1
VIII:C:
wprowadzono IU/ml	250	250	250	250
odzyskano po przywróceniu pierwotnej postaci IU/ml	83	197	232	222

Przykład ten pokazuje, że nie było żadnej różnicy w odzysku czynnika VIII:C przy stosowaniu czy to niejonowego środka powierzchniowo czynnego czy albuminy.

Przykład 2. Porównanie między różnymi ilościami niejonowego środka powierzchniowo czynnego.

Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

ml roztworu zliofilizowano, a następnie przjevrócono od postaci piarwpinej prze użyciu 2 ml jałowej wody do wstrzykiwań.

175 177

Kompozycje miały skład następujący:

	2 A	2 B	2 C
L-Histydyna/L-glutamina ilości równomolowe, mg/ml	10	10	10
Chlorek sodowy, %	2	2	2
Chlorek wapniowy, mg/ml	0,1	0,1	0,1
Polysorbate 80, %	-	0,001	0,01
VIII:C:
wprowadzono IU/ml	300	300	300
odzyskano po przywróceniu pierwotnej postaci, IU/ml:
początkowo	69	133	228
po upływie 3,5 godz.*	43	144	222
po upływie 7 godz.*	49	133	204

* Przechowywano jako zrekonstytuowany roztwór w temperaturze otoczenia.

W oczywisty sposób wykonano fakt zaskakująco korzystnego wpływu stabilizującego wywieranego przez niejonowy środek powierzchniowo czynny na czynnik VIII.

Przykład 3. Zmiana stężenia niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

ml roztworzi zliofilizowano, a następnie pnzywracono do pienvotnej posjaci użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań.

	3 A	3 B	3 C	3 D	3 E
L-Histydyna, mM	50	50	50	50	50
Chlorek sodowy, M	0,34	0,34	0,34	0,34	0,34
Chlorek wapniowy, mM	4	4	4	4	4
Polysorbate 80, %	0,01	0,02	0,03	0,04	0,05
Odzyskano po przywróceniu pierwotnej postaci, %	91	90	93	99	100

Wyniki uzyskane w tym przykładzie wskazują na to, że odzysk czynnika VIII (VIII:C), po przywróceniu pierwotnej postaci, był bardzo wysoki i bardzo dobry dla wszystkich zastosowanych stężeń Polysorbate 80.

Przykład 4. Zmiana stężenia chlorku sodowego.

Rekombipantpny czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

ml roztworu zliofilizowano i przechowywano w różnych temperaturach w czasie do 6 miesięcy, po czym przywrócono do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml wody jałowej do wstrzykiwań.

	4 A	4 B
L-Histydyna, mM	50	50
Chlorek sodowy, M	0,3	0,6
Chlorek wapniowy, mM	4	4
PEG-4000% (glikol polietylenowy)	0,1	0,1
Polysorbate 80, %	0,025	0,025

175 177

Odzysk, %: początkowo po przechowywaniu w temperaturze 8°C:

w ciągu 3 miesięcy	88	87
w ciągu 4 miesięcy	87	83
w ciągu 6 miesięcy	87	83
po przechowywaniu w temperaturze 25°C:
w ciągu 1 miesiąca	92	93
w ciągu 3 miesięcy	87	79
w ciągu 4 miesięcy	84	81
w ciągu 6 miesięcy	85	85
po przechowywaniu w temperaturze 37°C:
w ciągu 1 miesiąca	88	90
w ciągu 3 miesięcy	80	80
w ciągu 4 miesięcy	80	77
w ciągu 6 miesięcy	81	80
po przechowywaniu w temperaturze 50°C:
w ciągu 1 miesiąca	84	89
w ciągu 3 miesięcy	77	77
w ciągu 4 miesięcy	73	70

Dla 0,3 M lub 0,6 M chlorku sodowego uzyskano bardzo dobrą stabilność czynnika VIII. Oba preparaty okazały się trwałe w ciągu 6 miesięcy przechowywania w temperaturze 37°C.

Przykład 5. Zmiana stężenia L-histydyny.

Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opi-

sanym w części doświadczalnej. 2,2 ml roztworu wiofilżzowano, po czym przecpowywano w różnych temperatprach w czasie do 3 miesięcy, a następnie pcrywrhpona do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań. 5 A 5B
L-Histydyna, mM	46	59
Chlorek sodowy, M	0,31	0,31
Chlorek wapniowy, mM	3,7	3,7
PEG-4000% (glikol polietylenowy)	0,091	0,011
Polysorbate 80, %	0,364	0,364
Odzysk, %: po przechowywaniu w temperaturze 8°C
początkowo	78	884
w ciągu 3 miesięcy po przechowywaniu w temperaturze 25°C:	70	76
w ciągu 1 miesiąca w ciągu 3 miesięcy	69	74
po przechowywaniu w temperaturze 37°C:
w ciągu 1 miesiąca	76	85
w ciągu 3 miesięcy po przechowywaniu w temperaturze 50°C:	61	48
w ciągu 1 miesiąca	60	73
w ciągu 3 miesięcy	41	48

175 177

Przykład ten pokazuje, że użyte różne ilości L-histydyny nie wpływają na trwałość preparatu.

Przykład 6. Rekombioantzny czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem pzstępznaoia opisanym w części doświadczalnej.

	6 A	6 B
L-Histydyna, mM	65	65
Chlorek sodowy, M	0,3	0,3
Chlorek wapniowy, mM	4	4
PEG-4000%	0	0,1
Tween 80, %	0,025	0,025

Roztwory te zamrożznz/rozmrożzoz 1,5 i 10 razy i otrzymano następujące wielkości odzysku:

	IU/ml	IU/ml
Na zimno	298	291
1 zamrożenie	293	293
5	295	287
10	290	288

Badania te wykazały, że VIII:C był stabilny po powtarzanym zamrażaniu/rozmrażaniu oraz, że w przypadku omawianego preparatu użycie PEG-4000 (co do którego uważa się, że działa jako środek kriozchroony) nie jest konieczne.

Przykład 7. Zmiana pH.

Rbkombmantony czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części dośniadrzalobj.

2,2 ml roztw υzff mżrfiizsowano, a nostępni^ proibvcócono do pierwoibej oostaci pray użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań.

	7 A	7 B	7 C	7D
L-Histydyna, mM	65	65	65	65
Chlorek sodowy, M	0,3	0,3	0,3	0,3
Chlorek wapniowy, mM	4	4	4	4
Polysorbate 80, %	0,025	0,025	0,025	0,025
PH	6,0	6,5	7,0	7,5
Odzysk, %: początkowo	74	70	78	79
3 godziny *	73	80	78	77

* Przechowywano jako zrekonstytuowany roztwór w temperaturze otoczenia.

Przykład ten pokazuje, że pH w zakresie, w przybliżeniu, od 6,0 do 7,5 nie wywiera znaczącego wpływu.

Przykład 8. Dodanie sacharozy.

RbOzmbmantony czynnik VIII wytworzzoo zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

2,2 ml rozyvozu m^ofiizsi^i^ai^t^, a azstępnie praibΛcócono co ρΐβ^^^' zostaci p^c użyciu 5 ml jałzwbj wody do wstrzykiwań.

175 177

	8 A	8 B
L-Histydyna, mM	58	20,5
Chlorek sodowy, M	0,3	0,3
Chlorek wapniowy, mM	3,7	3,7
Sacharoza, mM	0	13,3
Polysorbate 80, %	0,025	0,025

Sacharozę dodano do roztworu B po etapie końcowego oczyszczania, przed liofilizacją. Odzysk po liofilizacji wynosił 76% dla A i 87% dla B. Taką samą aktywność stwierdzono po upływie 4 godzin od przywrócenia pierwotnej postaci przy przechowywaniu w temperaturze pokojowej.

Wyniki tego badania wskazują na to, że dodanie sacharozy jest korzystne z punktu widzenia odzysku VIII:C po liofilizacji.

Przykład 9. Zmiana rodzaju soli wapniowej.

Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

ml roztworu zliofilizowano, a następnie przywrócono do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań.

	9 A	9B	9 C	9D
L-Histydyna, mM	23	23	23	23
Chlorek sodowy, M	0,34	0,34	0,34	0,34
Chlorek wapniowy, mM	4	4	0,15	0,15
Polysorbate, %	0,025	0,025	0,025	0,025
Sacharoza, mM	-	10	-	10
Glukonian wapniowy, mM	0	0	6	6
Odzysk, %·.
początkowo	63	74	74	78
4 godziny *	60	73	73	77

* Przechowywano jako zrekonstytuowany roztwór w temperaturze otoczenia.

Przykład ten pokazuje, że CaCl2 można zastąpić glukonianem wapniowym. Przykład 10. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

2,2 ml roztworu zliofilizowano, a następnie przywrócono do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań. Ilość VIII:C w preparacie zrekonstytuowanym, w jednej fiolce, wynosiła około 1000IU.

	10 A	10 B
L-Histydyna, mM	14,7	58
Chlorek sodowy, M	0,31	0,31
Chlorek wapniowy, mM	3,7	3,7
Sacharoza, mM	19,9	-
Polysorbate 80, %	0,025	0,025
Odzysk, IU/ml, po przywróceniu pierwotnej postaci:
początkowo	213	198
4 godziny, 25°C	213	198
24 godziny, 25°C	201	182

175 177

Odzysk, %:

początkowo	92	91
5 miesięcy, 25°C	88	-
5 miesięcy, 30°C	76	85
12 miesięcy, 7°C	89	97

Odzysk był dobry wtedy, gdy część L-histydyny zastąpiono sacharozą.

Preparaty te badano z wykorzystaniem metody chromatografii żelowej, po upływie 5 miesięcy przechowywania w temperaturze, odpowiednio, 25°C i 30°C. Otrzymane wyniki przedstawiono na figurach 1 i 2. Jedynymi pikami, które można tam zahaczyć są to: pik w minucie 42, wskazujący czynnik VIII:C i pik w minucie 70, którym jest histydyna. Obecność agregatów stwierdza się przed 40 minutą. Na figurze 1 można zaba^czyć, że w przypadku 10 A nie stwierdza się występowania żadnej dającej się oznaczyć ilości agregatów po upływie 5 miesięcy przechowywania w temperaturze 25°C. Figura 2 pokazuje, dla 10 B, niewielką ilość agregatów, mniejszą niż 2%, po upływie 5 miesięcy przechowywania w temperaturze 30°C.

Przykład 11. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono) zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

2,2 ml roztworu zllrfllizrwano, a następnie praywrócśśno do pierwotnej postaci przy użyciu 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań. Ilość VIII:C w preparacie zrekrnttytuowanym, w jednej fiolce, wynosiła około 500IU.

	11A	11B
L-Histydyna, mM	144,	58
Chlorek sodowy, M	0,31	0,31
Chlorek wapniowy, mM		3,3
Sacharoza, mM	11,9	-
Polysorbate 80, %	0,025	0,025
Odzysk, IU/ml, po przywróceniu pierwotnej postaci:
początkowo	98	115
4 godziny, 25°C	9(5	110
24 godziny, 25°C Odzysk,	93	110
początkowo	91	93
po przechowywaniu w temperaturze 25°C:
w ciągu 5 miesięcy	89	87
po przechowywaniu w temperaturze 30°C:
w ciągu 5 miesięcy	7(5	79
po przechowywaniu w temperaturze 7°C:
w ciągu 12 miesięcy		89

Oba preparaty wykazywały dobrą stabilność.

Preparaty te poddano badaniu metodą chromatografii żelowej i otrzymane wyniki okazały się podobne do wyników przedstawionych na figurach 1 i 2.

175 177

Nie stwierdzono tworzenia się agregatów przy przechowywaniu omawianych preparatów w ciągu 5 miesięcy w temperaturze, odpowiednio, 25°C i 30°C.

Przykład 12. Rekom^^i^my czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

ml roztwora d^trfilż^i^^iliK^, wo ozym ozozcCóueoppno w różwyrh tempemliKach w czasie do 3 miesięcy, a następnie przowrhcpnp do pierwotnej postaci pozy użyciu 4 ml jałowej wody do wstrzykiwań. Ilość VIII:C w preparacie zrekonstruowanym, w jednej fiolce, wynosiła około 500 IU.

	12 A	12 B
Mannitol, mg/ml	20	20
L-Histydyna, mg/ml	2,67	2,67
Chlorek sodowy, mg/ml	18	18
Chlorek wapniowy, mM	3,7	3,7
Polysorbate 80, mg/ml	0,23	0,23
Odzysk, %·. początkowo	91	93
po przechowywaniu w temperaturze 7°C:
w ciągu 5 miesięcy	90	85

Uzyskano nadającą się do przyjęcia trwałość preparatu, stwierdzoną po przechowywaniu go w ciągu 5 miesięcy w temperaturze 7°C.

Stosowane w opisie nazwy handlowe oznaczają:

Po^sam^ - polimer ppksyeiolnnpwp-pksypóppylenpwo,

Polysorbate 20 - mpnplauóynian pρlipksyetyleno(20)-srrbitanu,

Polysorbate 80 - mpnppleinian pplipksyntylenp(20)-sprbitanu,

TNBP - iri-N-buiylpfpsfpran,

Octpχonpl 9 - oktylo fenoksy pplintpksyetanpl.

Claims (14)

1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca rekombinantowy czynnik krzepnięcia VIII i stabilizator stabilizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wydłużony okres czasu a sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rekonstytuowanyjako wodny roztwór przed użyciem, znamienna tym, że zawiera rekombinowany czynnik krzepnięcia VIII o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chlorek sodu lub potasu w ilości większej niż 0,1 M, sól wapniową taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy w ilości większej niż 0,5 mM, niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mono- lub disacharydy lub alkohole cukrowe.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera czynnik VIII o aktywności właściwej wyższej niż 5000 IU/mg białka.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako czynnik VIII zawiera rekombinantowy czynnik VIII o pełnej długości lub jego pochodną delecyjną.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ilość czynnika VIII wynosi korzystnie 50 do 10000 IU/ml.

5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny obecny jest w ilości przewyższającej krytyczne stężenie micelizacji.

6. Kompozycj a według zastrz. 1, znamienna tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny zawiera kopolimer blokowy, korzystnie polimer oksyetyleno-oksypropylenowy (poloksamer).

7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako niejonowy środek powierzchniowo czynny zawiera polietoksylowany (20) ester kwasu tłuszczowego, korzystnie monolaurynian polioksyetyleno (20) sorbitanu (Polysorbate 20) lub monoleinian polioksyetyleno (20) sorbitanu (Polysorbate 80).

8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako disacharyd zawiera sacharozę.

9. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek wagowy chlorku sodowego do L-histydyny jest wyższy niż .1:1.

10. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera: i) 10-100000 IU/ml rekombinantowego czynnika VIII, ii) co najmniej 0,01 mg/ml polietoksylowanego (20) estru kwasu tłuszczowego, iii) chlorek sodowy w ilości większej niż 0,1 M, iv) sól wapniową, taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości większej niż 0,5 mM, oraz v) L-histydynę, w ilości większej niż 1 mM.

11. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ma postać preparatu suchego.

12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że ma postać preparatu liofilizowanego.

13. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej rekombinantowy czynnik krzepnięcia VIII i stabilizator stabilizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wydłużony okres czasu, przy czym sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rekonstytuowany jako wodny roztwór przed użyciem, która zawiera rekombinowany czynnik krzepnięcia VIII

175 177 o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chlorek sodu lub potasu w ilości większej niż 0,1 M, sól wapniową taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości większej niż 0,5 mM, niejonowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mono- lub disacharydy lub alkohole cukrowe, znamienny tym, że miesza się czynnik VIII z niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w roztworze wodnym, chlorkiem sodu lub potasu, sól wapniową i korzystnie z sacharozą.

14. Sposób odtwarzania kompozycji farm aceutacznej zawierającej ręko mbinantowy czynnik krzepnięcia VIII i stabilizator stabilizujący aktywność czynnika VIII podczas magazynowania przez wzdłużznz okres czasu, przy czym sama kompozycja jest albo a) początkowo lub na końcu w postaci wodnego roztworu gotowego do użycia albo b) początkowo w postaci wodnego roztworu, który następnie jest suszony i na końcu rb0znstztuznaoz jako wodny roztwór przed użyciem, która zawiera re0ombinowaoy czynnik krzepnięcia VIII o aktywności właściwej powyżej 2000 IU/mg białka w ilości 10-100.000 IU/ml, chlorek sodu lub potasu w ilości większej niż 0,1 M, sól wapniową taką jak chlorek wapniowy lub glukonian wapniowy, korzystnie w ilości większej niż 0,5 mM, niejzoowy środek powierzchniowo czynny w ilości co najmniej 0,01 mg/ml, L-histydynę buforującą system i chroniącą białko w fazie amorficznej i ewentualnie mzoz- lub disacharydy lub alkohole cukrowe, znamienny tym, że eluuje się czynnik VIII po ostatnim etapie oczyszczania buforem zawierającym oieioozny środek powierzchniowo czynny w roztworze wodnym, z L-histydyną, chlorkiem sodowym lub potasowym, solą wapniową i korzystnie z sacharozą.