PL175443B1 - Zestaw spoiwa fibrynowego - Google Patents

Abstract

1. Zestaw spoiwa fibrynowego, znamienny tym, ze sklada sie z wodnej kompozycji zawierajacej m onomer fibryny o stezeniu równym 10 - 200 mg/ml, której pH równa sie 1 - 5 i kompozycji wybranej z grupy obejmujacej wode destylowana i bufor alkaliczny wybrany z grupy obejmujacej uklad 0,5 - 0,75 M weglan/wodoroweglan sodu o pH 10 - 10,5, 0,5 - 0,75 M wodoroweglan sodu/NaOH o pH 10,0, 1,5 M glicyna/NaOH o pH 10,0, 0,5 - 1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5,1M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5, 0,5 M tricyna o pH 8,5,1M kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS) o pH 8 ,0 ,1 M kwas trishydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0 i 0,5 M kwas cyklohe- ksyloaminoetanosulfonowy (CHES). PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zestaw spoiwa fibrynowego. Spoiwo fibrynowe znajduje zastosowanie w medycynie do tamowania upływu krwi.

Jeden z mechanizmów homeostazy u ssaków, to jest zapobieganie ubytkom krwi, polega na tworzeniu skrzepu krwi. Tworzenie skrzepu u ludzi, to jest koagulacja krwi, przebiega na drodze złożonej kaskady reakcji, której etapem końcowym jest konwersja fibrynogenu - monomeru - przez trombinę, jony wapnia i aktywowany czynnik XIII do usieciowanego ostatecznie polimeru fibryny II, który jest skrzepem fibryny.

Tworzenie usieciowanego polimeru fibryny II przebiega na drodze konwersji fibrynogenu przez trombinę do monomeru fibryny I, która spontanicznie polimeryzuje z utworzeniem polimeru fibryny I, niekiedy określanego jako rozpuszczalna fibryna I, ponieważ przez działanie odpowiednimi środkami chemicznymi polimer fibryny I może być ponownie przekształcony w monomer fibryny I. Polimer fibryny I jest następnie przekształcany przez trombinę do polimeru fibryny II, który jest czasami określany jako rozpuszczalna fibryna II, ponieważ przez działanie odpowiednimi środkami chemicznymi polimer fibryny II można ponownie przeprowadzić w monomer fibryny I. Polimer fibryny II pod wpływem czynnika XIIIa, znanego jako aktywowany czynnik XIII, jest następnie sieciowany z utworzeniem usieciowanej fibryny II, która jest skrzepem fibryny. Czynnik XIII jest aktywowany przez trombinę w obecności jonów wapnia. Usieciowana fibryna II jest niekiedy określana jako nierozpuszczalna fibryna II, ponieważ nie może być przekształcona w monomer fibryny II.

Należy zauważyć, że trombina tworzy się z protrombiny. Protrombina jest przekształcana w trombinę działaniem czynnika Xa w obecności wapnia i innych substancji pomocniczych.

Fibrynogen stanowi około 2 do 4 gramów/litr z białek osocza krwi. Fibrynogen jest monomerem, który składa się z trzech par łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami disiarczkowymi, oznaczonych (Aa)2, (Ββ)2, γ2, A i B oznaczają dwa małe

175 443 peptydy terminalne, znane jako odpowiednio fibrynopeptyd A i fibrynopeptyd B. W wyniku odszczepienia fibrynopeptydu A od fibrynogenu podczas transformacji fibrynogenu pod wpływem trombiny powstaje związek fibryna I, zaś w wyniku późniejszego odszczepienia fibrynopeptydu B związek fibryna II. Takie odszczepienie fibrynopeptydów A i B powoduje bardzo niewielkie zmniejszenie ciężaru cząsteczkowego fibrynogenu o około 6000 do 340000 daltonów, ale odsłania miejsca polimeryzacji. Przegląd mechanizmów koagulacji krwi oraz struktura fibrynogenu przedstawione są przez C. M. Jackson, Ann. Rev. Biochem., 49:765-811 (1980) i B. Furie i B.C. Furie, Cell, 53: 505-518 (1988).

Spoiwo fibrynowe jest lepiszczem biologicznym, którego działanie imituje końcowe etapy koagulacji, przez co uzyskuje się skrzep fibrynowy. Typowe spoiwa fibrynowe składają się z zatężonego fibrynogenu ludzkiego, aprotyniny bydlęcej i czynnika XIII jako pierwszego składnika oraz trombiny bydlęcej i chlorku wapnia jako drugiego składnika. Nanoszenie odbywa się zwykle za pomocą dwucylindrowej strzykawki, która pozwala na jednoczesne nanoszenie obu składników na miejsce, w którym chce się utworzyć skrzep fibrynowy. Aprotynina jest inhibitorem fibrynolitycznym, dodawanym w celu nadania trwałości spoiwom fibrynowym.

Składnik fibrynogenowy spoiwa fibrynowego otrzymuje się ze zbieranego ludzkiego osocza krwi. Fibrynogen może być zatężony z osocza ludzkiego za pomocą krioprecypitacji oraz precypitacji przy użyciu różnych reagentów, na przykład glikolu polietylenowego, eteru, etanolu, siarczanu amonu lub glicyny. Doskonały przegląd spoiw fibrynowych przedstawili M. Brennan, Blood Reviews, 5:240-244 (1991); J.W. Gibble i P.M. Ness, Transfusion, 30: 741-747 (1990); H. Matras, J. Oral Maxillofac Surg., 43:605-611 (1985) oraz R. Lerner i N. Binur, J. of Surgical Research, 48:165-181 (1990).

Ostatnio obserwuje się również zainteresowanie otrzymywaniem spoiw fibrynowych przy użyciu fibryny autologicznej. Autologiczne spoiwo fibrynowe jest to takie spoiwo fibrynowe, którego składnik fibrynogenowy jest wyekstrahowany z własnej krwi pacjenta. Stosowanie autologicznego spoiwa fibrynowego jest korzystne, ponieważ eliminuje ono ryzyko przeniesienia chorób przenoszonych przez krew, na przykład zapalenia wątroby typu B, typu A i typu nie-A nie-B oraz zespołu nabytego niedoboru odpornościowego (AIDS), które w przeciwnym razie mogłyby być obecne w komponencie fibrynogenowym, wyodrębnionym ze zbieranego osocza ludzkiego. Patrz L.E. Silberstein et al., Transfusion, 28:319321 (1988); K. Laitakari i J. Luotonen, Laryngoscope, 99:974-976 (1989) i A Dresdale et al., The Annals of Thoracic Surgery, 40:385-387 (1985).

Spoiwo fibrynowe może przenosić infekcje nie tylko za pośrednictwem fibrynogenu, ale również za pośrednictwem aprotyniny bydlęcej i trombiny bydlęcej. Wiadomo jest, że trombina bydlęca przenosi czynnik zakaźny bydlęcego gąbczastego zapalenia mózgu (BSE) i inne wirusy patogenne dla ssaków. Ponadto trombina bydlęca jest silnym antygenem, który może powodować reakcje immunologiczne u ludzi. Zatem zastosowanie trombiny bydlęcej może spowodować działania uboczne u biorcy. Patrz D.M. Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (Supplement A):141-146 (1991), S.B. Prusiner et al., Cornell Vet. 81 Nr 2: 85-96 (1991) i D. Matthews, J. Roy. Soc. Health, 3-5 (February 1991).

W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na spoiwo fibrynowe, które może być stosowane u pacjenta bez ryzyka zakażenia wirusowego lub innych działań niepożądanych.

Zestaw spoiwa fibrynowego według wynalazku składa się z wodnej kompozycji zawierającej monomer fibryny o stężeniu równym 10 - 200 mg/ml, której pH równa się 1 - 5 i kompozycji wybranej z grupy obejmującej wodę destylowaną i bufor alkaliczny wybrany z grupy obejmującej układ 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 -10,5, 0,5 - 0,75 M wodorowęglan sodu/NaOH o pH 10,0, 1,5 M glicyna/NaOH o pH 10,0, 0,5 - 1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5, 1 M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5, 0,5 M tricyna o pH 8,5,1 M kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS) o pH 8,0, 1 M kwas trishydroksymetyloaminoetamoufonowy (TES) o pH 8,0 i 0,5 M kwas cykloheksytotuninoetanosulfonowy (CHES).

175 443

Zestaw według wynalazku jako bufor alkaliczny zawiera korzystnie bufor wybrany z grupy obejmującej układ 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 -1.0,5, 0,5 -1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5, 1M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5 i 1M kwas trishydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0.

Zestaw według wynalazku zawierający bufor alkaliczny lub woda destylowana korzystnie dodatkowo zawiera źródło jonów wapnia.

Zestaw według wynalazku korzystnie zawiera jony wapnia o stężeniu równym 30 mM.

Dla celów wynalazku stosuje się następujące definicje:

Fibryna - Fibryna oznacza dowolną postać fibryny. Do nieograniczających przykładów fibryny należą fibryna I, fibryna II i fibryna des BB. Fibryna może mieć postać monomeryczną lub polimeryczną, przy czym w postaci polimerycznej jest usieciowana albo nieusieciowana. Monomer fibryny - Monomer fibryny obejmuje dowolną postać fibryny, na przykład fibrynę I, fibrynę II lub fibrynę des BB, przy czym fibryna jest w postaci monomerycznej lub oligomerycznej, która może być solubilizowana w kompozycji zawierającej monomer fibryny, a monomer fibryny może być przekształcony w polimer fibryny.

Polimer fibryny - Polimer fibryny obejmuje dowolną formę fibryny, na przykład fibrynę I, fibrynę II lub fibrynę des BB, przy czym wspomniana fibryna j est w postaci polimerycznej, albo nieusieciowanej albo usieciowanej.

Fibryna nieusieciowana - Fibryna nieusieciowana obejmuje dowolną postać fibryny, na przykład fibrynę I, fibrynę II lub fibrynę des BB, przy czym wspomniana fibryna jest nieusieciowana i może być przekształcona w fibrynę usieciowaną. Fibryna nieusieciowana może być monomerem fibryny lub nieusieciowanym polimerem fibryny.

Fibryna usieciowana - Fibryna usieciowana obejmuje dowolną postać fibryny, na przykład fibrynę I, fibrynę II lub fibrynę des BB, przy czym wspomniana fibryna jest polimerem fibryny, który jest usieciowany.

Kompozycja fibryny zawierająca monomer fibryny, może zawierać dowolną postać monomeru fibryny, która może być przekształcona w polimer fibryny. Do nieograniczających przykładów należą monomer fibryny I, monomer fibryny II lub monomer fibryny des BB, przy czym preferowany jest monomer fibryny I. Oczywiście kompozycja może zawierać mieszaniny monomerów fibryny. Dla celów niniejszego wynalazku określenie polimer fibryny obejmuje dowolny polimer otrzymany przez polimeryzację monomeru fibryny. Zatem na przykład w wyniku konwersji monomeru fibryny I do polimeru fibryny może powstać polimer fibryny I nieusieciowany albo usieciowany i/lub polimer fibryny II, usieciowany lub nieusieciowany, zależnie od tego, jak jest przeprowadzany etap konwersji.

Preferowany jest monomer fibryny I, ponieważ może on być, w przeciwieństwie do fibrynogenu, łatwo poddany konwersji do polimeru fibryny bez stosowania trombiny lub czynnika XIII. W istocie, monomer fibryny I może spontanicznie tworzyć polimer fibryny I, który może działać jako skrzep fibryny, niezależnie od tego, czy polimer fibryny I jest usieciowany czy nieusieciowany, lub dalej ulec konwersji do polimeru fibryny II. Zatem, ponieważ tworzenie polimeru fibryny I z monomeru fibryny I jest spontaniczne, polimer fibryny I może być utworzony bez trombiny i czynnika XIII, przez co unika się problemów związanych z trombiną bydlęcą. (Należy zauważyć, że jeśli monomer fibryny I jest stosowany tak, że wchodzi on w kontakt z krwią pacjenta, na przykład na ranie, trombina i czynnik XIII pacjenta mogą spowodować konwersję polimeru fibryny I do usieciowanego polimeru fibryny II).

Jako fibrynę nieusieciowaną kompozycja zawiera dowolną postać fibryny. Do nieograniczających przykładów nieusieciowanej fibryny należą nieusieciowana fibryna I, nieusieciowana fibryna II i fibryna des BB, przy czym preferowana jest nieusieciowana fibryna I. Oczywiście kompozycja może zawierać mieszaniny nieusieciowanej fibryny. Dla celów niniejszego wynalazku określenie fibryna usieciowana obejmuje również dowolną formę fibryny, otrzymaną przez konwersję nieusieciowanej fibryny w fibrynę usieciowaną. Zatem jako usieciowana fibryna, otrzymana na przykład w wyniku konwersji nieusieciowanej

175 443 fibryny I w fibrynę usieciowaną, może być stosowana usieciowana fibryna I i/lub usieciowana fibryna II, zależnie od tego, jak jest przeprowadzany etap konwersji.

Nieusieciowana fibryna I jest preferowana, ponieważ w porównaniu z fibrynogenem jej konwersja do fibryny usieciowanej jest łatwiejsza. W istocie, uważa się, że fibryna I może tworzyć usieciowaną fibrynę I, która może działać jako spoiwo fibrynowe. Zatem tworzenie usieciowanej fibryny I z nieusieciowanej fibryny I może być przeprowadzone bez trombiny, dzięki czemu unika się problemów związanych z trombiną bydlęcą, jakkolwiek może być niezbędny aktywowany czynnik XIII. (Należy zauważyć, że jeśli nieusieciowana fibryna I jest stosowana tak, że wchodzi ona w kontakt z krwią pacjenta, na przykład na ranie, trombina i czynnik XIII pacjenta mogą przekształcić fibrynę I w usieciowaną fibrynę II).

Nieusieciowana fibryna może być polimerem, oligomerem lub monomerem, jakkolwiek; preferowany jest oligomer lub monomer, to jest monomer fibryny. Jest to związane z faktem, że nieusieciowana fibryna w postaci polimerycznej jest na ogół żelem, a zatem bardzo trudne jest dostarczenie jej do żądanego miejsca i daje ona mniej bliski kontakt z komórkami w żądanym miejscu. W przeciwieństwie do tego uzyskana fibryna nieusieciowana w postaci oligomerycznej lub monomerycznej jest rozpuszczalna i może być zatem łatwiej dostarczana do żądanego miejsca i zapewnia bliższy kontakt z komórkami. Oczywiście kompozycja może zawierać mieszaninę takich form nieusieciowanej fibryny.

Źródłem kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę może być dowolne źródło znane lub takie, które będzie opracowane w przyszłości, jeśli tylko monomer fibryny może być przekształcony w polimer fibryny lub nieusieciowana fibryna może być przekształcona w fibrynę usieciowaną. Do nieograniczających przykładów kompozycji zawierających monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę należą krew, korzystnie krew ssaków a jeszcze bardziej korzystnie krew ludzka, hodowle komórkowe wydzielające fibrynogen oraz fibrynogen rekombinacyjny, przy czym korzystna jest krew. Krew może mieć dowolną postać, na przykład może być to krew pełna lub preparowane preparaty fibrynogenu. Krew może być również zastosowana do wytwarzania autologicznych spoiw fibrynowych.

Zaobserwowano, że kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę I w postaci monomeru fibryny I albo polimeru fibryny I, przygotowana z krwi pełnej w sposób opisany poniżej, może być przekształcona w usieciowaną fibrynę II bez dodawania trombiny, czynnika XIII ani innych substancji niezbędnych do koagulacji krwi! Uważa się, że jest to związane z faktem, że kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę I, przygotowana z krwi pełnej zatrzymuje wystarczające ilości protrombiny, czynnika XIII i takich innych substancji niezbędnych z osocza, że nieusieciowana fibryna I może być przekształcona w usieciowaną fibrynę II bez dodawania egzogennej trombiny i czynnika XIII. Ta endogenna protrombina i czynnik XIII mogą być wykorzystane w spoiwie fibrynowym według wynalazku jako komponenty kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę.

Jednakże należy zauważyć, że endogenna trombina i czynnik XIII nie są zatrzymywane w ilościach wystarczających do konwersji fibrynogenu w usieciowaną fibrynę II z szybkością reakcji odpowiednią dla spoiwa fibrynowego. Uważa się, że do konwersji fibrynogenu w usieciowaną fibryną II potrzeba jest więcej trombiny niż do przekształcenia nieusieciowanej fibryny I w usieciowaną fibrynę II przy równoważnej szybkości reakcji.

Każde z tych trzech źródeł zawiera fibrynogen, który może być przekształcony w monomer fibryny lub w fibrynę nieusieciowaną. Poza takim etapem konwersji uzyskana kompozycja zawierająca monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę musi być w formie zagęszczonej. Korzystnie stężenie monomeru fibryny jest nie niższe niż około 10 mg/ml, bardziej korzystnie wynosi od około 20 mg/ml do około 200 mg/ml, jeszcze bardziej korzystnie od około 20 mg/ml do około 100 mg/ml, a najbardziej korzystnie od około 25 mg/ml do około 50 mg/ml.

Ponadto korzystnie monomer fibryny lub nieusieciowana fibryna są niedynamiczne. Dla celów niniejszego wynalazku określenie niedynamiczna kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę oznacza, że nieusieciowana fibryna w takiej kompozycji nie sieciuje się przez co najmniej około 1,5 minuty, korzystnie przez co najmniej około 3 minuty,

175 443 a najbardziej korzystnie przez co najmniej około 30 minut po przygotowaniu takiej kompozycji. Dla celów niniejszego wynalazku określenie niedynamiczna kompozycja zawierająca monomer fibryny oznacza, że monomer fibryny w takiej kompozycji nie polimeryzuje przez co najmniej około 1,5 minuty, korzystnie przez co najmniej około 3 minuty, bardziej korzystnie przez co najmniej około 30 minut, a jeszcze bardziej korzystnie przez co najmniej około 2 godziny po przygotowaniu takiej kompozycji. W istocie, należy zauważyć, że kompozycja zawierająca monomer fibryny może być niedynamiczna przez co najmniej kilka dni, to jest około 72 godziny po jej przygotowaniu!

Kompozycja zawierająca monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę może być otrzymana z krwi. W wyniku tej metody uzyskuje się polimer fibryny połączony wiązaniami wodorowymi, który jest formą nieusieciowanej fibryny. Taki polimer może być następnie wykorzystany jako komponent spoiwa fibrynowego lub przekształcony w monomer fibryny metodą określaną jako solubilizacja, tak jak to opisano poniżej. Korzystne jest również przygotowywanie kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w jałowym środowisku.

Kompozycje zawierające monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę mogą być otrzymane z krwi pełnej przez pobranie krwi od dawcy, korzystnie w obecności antykoagulanta. Może być zastosowany dowolny antykoagulant. Nieograniczającymi przykładami antykoagulantów są heparyna, EDTA, hirudyna, cytrynian lub dowolny inny czynnik, który może bezpośrednio lub pośrednio zapobiegać tworzeniu trombiny, przy czym korzystny jest cytrynian.

Następnie z krwi pełnej wydziela się osocze, które zawiera fibrynogen. Może być zastosowana dowolna technika separacji, na przykład sedymentacja, wirowanie lub filtracja. Wirowanie może być przeprowadzone z przyspieszeniem około 3000 cm/s² przez około 10 minut. Jednakże jeśli pożądane jest otrzymywanie osocza bogatego w płytki, wirowanie może być prowadzone z niższym przyspieszeniem, na przykład 500 cm/s2 przez około 20 minut. Supematant, który zawiera osocze, może być wydzielony zwykłymi technikami.

Filtracja może być prowadzona przez przepuszczenie krwi pełnej przez odpowiedni filtr, który rozdziela krwinki od osocza. Korzystnie jako filtr stosuje się membranę mikroporowatą, charakteryzującą się dobrą przepuszczalnością białka.

Następnie na uzyskane osocze działa się tak, aby przeprowadzić konwersję fibrynogenu w monomer fibryny lub w nieusieciowaną fibrynę. Konwersja ta może być prowadzona dowolną znaną techniką.

Korzystnie monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę wytwarza się za pomocą enzymu trombino-podobnego, co obejmuje trombinę. Enzymem trombino-podobnym jest każdy enzym, który może katalizować tworzenie fibryny z fibrynogenu. Typowym źródłem enzymów trombino-podobnych są jady węży. Korzystnie enzym trombino-podobny oczyszcza się z jadu węża. Zależnie od doboru enzymu trombino-podobnego taki enzym trombino-podobny może uwalniać fibrynopeptyd A, który tworzy fibrynę I, fibrynopeptyd B, który tworzy fibrynę des BB lub zarówno fibrynopeptyd A jak i B, które tworzą fibrynę II. Należy zauważyć, że te enzymy trombino-podobne, które uwalniają fibrynopeptyd A i B mogą robić to z różnymi szybkościami. Zatem uzyskana kompozycja może być na przykład mieszaniną fibryny II i fibryny I lub mieszaniną fibryny II i fibryny des BB.

Tabela 1 przedstawia nieograniczającą listę źródeł jadów węży, które mogą być wykorzystane do wytwarzania kompozycji według wynalazku, nazwę enzymu trombino-podobnego oraz fibrynopeptyd(y), uwalniane przez działanie enzymem.

175 443

Tabela 1

ŹRÓDŁO	NAZWA	UWALNIANY FIBRYNOPEPTYD
Agkistrodon acutus	Acutin	A
A.contortrix contortrix	Venzyme	B,(A)*
A halys Pallas		B, (A)*
A (Calloselasma) rhodostoma	Ancrod, Arvin	A
Bothrops asper (B.atrox)	Asperase	A
B Atrox	Batroxobin, Reptilase-Reagent	A
B. insularis		A, B
B. jararaca	Botropase	A
B. Moojeni (B.Atrox)	Batroxobin, Defibrase	A
Lachesis muta muta		A, B
Crotalus adamanteus	Crotalase	A
C. durissus terrificus		A
Trimeresurus flavoviridis	Flavoxobin	A
T. gramineus		A
Bitis gabonica	Gabonase	A, B

* () oznacza niską aktywność

Przegląd enzymów trombino-podobnych z jadów węży przedstawili H. Pirkle i

K. Stocker w Thrombosis and Haemostasis, 65(4): 444-450 (1991).

Korzystnymi enzymami trombino-podobnymi są Baxotrobin, zwłaszcza z B. Moojeni, B. Maranhao i B. atrox oraz Ancrod, zwłaszcza z A. rhodostoma.

Monomer fibryny lub nieusieciowana fibryna mogą być otrzymane przez kontaktowanie osocza z enzymem trombino-podobnym, przez co umożliwia się przekształcenie fibrynogenu z osocza w monomer fibryny. Jednakże uzyskany monomer fibryny spontanicznie polimeryzuje, tworząc polimer związany wiązaniami wodorowymi w postaci żelu, który oddziela się od pozostałego osocza, które jest roztworem. Żel jest formą kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.

Ten żel nieusieciowanej fibryny może być zebrany na przykład przez wirowanie (3000 cm/s² przez 10 minut), bezpośrednie ręczne oddzielenie od nieusieciowanej fibryny z osocza, filtrację, bezpośrednio lub pod ciśnieniem, a następnie usunięcie oddzielonego osocza. (Może być wykorzystany filtr o wielkości porów 1-100 mikrometrów, na przykład filtr ze spiekanego polipropylenu o wielkości porów 20 mikrometrów z Porex Inc., filtr teflonowy o wielkości porów 20-70 mikrometrów z Fluorotechniques Inc. lub filtr z nylonu 66 o wielkości porów 22-46 mikrometrów z Costar Inc.).

W wyniku tego zebrania oddziela się żel nieusieciowanej fibryny od osocza, które jest roztworem, zatęża żel nieusieciowanej fibryny w stosunku do osocza. Należy zauważyć, że żel nieusieciowanej fibryny zatrzymuje co najmniej część protrombiny, czynnika XIII i takie inne niezbędne substancje z osocza, że nieusieciowana fibryna I może być przekształcona w usieciowaną fibrynę II bez dodawania egzogennej trombiny lub czynnika XIII. Ta endogenna protrombina i czynnik XIII mogą być wykorzystane w spoiwie fibrynowym według wynalazku jako komponenty kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę.

Od siły wirowania lub ciśnienia filtracji podczas zbierania zależy, jak dużo osocza zostanie usunięte z żelu nieusieciowanej fibryny, zaś im wyższa taka siła lub ciśnienie, tym bardziej zatężony jest uzyskany żel nieusieciowanej fibryny. Jednakże korzystne jest, aby taka siła lub ciśnienie nie były tak wysokie, aby spowodować usunięcie protrombiny lub czynnika XIII z żelu nieusieciowanej fibryny.

Żel nieusieciowanej fibryny jest obecnie gotowy do użycia jako komponent spoiwa fibrynowego jako forma kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Zaobserwowano, że gdy taką kompozycję otrzymuje się z krwi pełnej, to w kompozycji obecne jest od około

175 443

60% do około 90% pierwotnego fibrynogenu, ale oczywiście w formie nieusieciowanej fibryny.

Kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę może być wykorzystana bezpośrednio po jej przygotowaniu. W istocie szczególnie korzystne jest wykorzystanie takiej kompozycji bezpośrednio po jej przygotowaniu gdy kompozycja jest autologiczna. Jeśli kompozycja nie zostanie wykorzystana bezpośrednio po jej przygotowaniu, może być przechowywana. Przechowywanie kompozycji wymaga, aby kompozycja była konserwowana przez na przykład zamrożenie lub liofilizację kompozycji lub przechowywanie kompozycji w 4°C. Kompozycja w postaci zamrożonej lub liofilizowanej będzie trwała przez miesiące. Jeśli kompozycja będzie przechowywana w 4°C, będzie trwała przez okres co najmniej dni.

Jeśli kompozycja zostanie zamrożona, przed użyciem musi zostać rozmrożona.

Technika ta, której skutkiem jest utworzenie żelu nieusieciowanej fibryny, powoduje konwersję fibrynogenu w żel nieusieciowanej fibryny i zatężenie takiego żelu w jednym etapie. Alternatywnie, ale mniej korzystnie, można zatężyć fibrynogen za pomocą zwykłych technik, na przykład przez krioprecypitację i precypitację przy użyciu różnych reagentów, na przykład glikolu polietylenowego, eteru, etanolu, siarczanu amonu lub glicyny. Zatężony fibrynogen może być następnie przekształcony w żel nieusieciowanej fibryny za pomocą technik opisanych powyżej, lub korzystnie, ponieważ fibrynogen jest już zatężony, fibrynogen może być następnie przekształcony w kompozycję zawierającą monomer fibryny bez potrzeby tworzenia najpierw żelu nieusieciowanej fibryny. Może to być przeprowadzone przez kontaktowanie zatężonego fibrynogenu z czynnikiem chaotropowym z utworzeniem roztworu fibrynogenu.

Czynnik chaotropowy jest niezbędny dla zapobieżenia spontanicznej polimeryzacji monomeru fibryny, który tworzy się w wyniku kontaktu fibrynogenu z enzymem trombinopodobnym. Czynnik chaotropowy miesza się z kompozycją fibrynogenu, a następnie miesza przez około 1 do 2 minut, otrzymując roztwór fibrynogenu. Następnie fibrynogen może być poddany konwersji do monomeru fibryny za pomocą na przykład enzymu trombino-podobnego jak opisano powyżej lub za pomocą enzymu trombino-podobnego immobilizowanego na podłożu, jak opisano poniżej.

Do odpowiednich czynników chaotropowych należą mocznik, bromek sodu, chlorowodorek guanidyny, KCNS, jodek potasu i bromek potasu. Korzystne stężenie molowe czynnika chaotropowego wynosi od około 0,2 do około 6,0 a najbardziej korzystnie od około 0,3 do około 2,0. Korzystnie czynnik chaotropowy stosuje się w najmniejszej możliwej ilości, zapobiegającej jeszcze spontanicznej polimeryzacji monomeru fibryny.

Należy zauważyć, że korzystnie do czynnika chaotropowego nie dodaje się źródła jonów wapnia dopóki nie jest potrzebna konwersja monomeru fibryny w polimer fibryny, jak opisano poniżej. Zapewnia to, że monomer fibryny nie będzie sieciowany w związku z aktywacją jakiegokolwiek z endogennych czynników koagulacji krwi.

W korzystnej postaci enzym trombino-podobny jest immobilizowany na nośniku. Taka postać jest korzystna, ponieważ można łatwo oddzielić immobilizowany enzym od osocza, zapobiegając przez to zanieczyszczeniu enzymem kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.

W niniejszym wynalazku może być wykorzystany każdy nośnik, do którego może być przyłączony enzym trombino-podobny. Do nieograniczających przykładów odpowiednich nośników należą celuloza, polidekstrany, agaroza, polistyreny, krzemionka, kwasy poliakrylowe, poliakryloamidy, alkohole poliwynylowe, perełki szklane, policzterofluoroetylen, poliwęglany, kolagen, pochodne celulozy, teflon i ich kompozyty, przy czym korzystne są krzemionka, polistyren i agaroza, a najbardziej korzystna jest agaroza.

W innej korzystnej postaci enzym trombino-podobny jest przyłączony do nośnika, który jest filtrem lub na jednej stronie filtra i przyłączony do innego nośnika, na przykład perełek. W przeciwnym razie enzym trombino-podobny przejdzie przez filtr. Zatem wielkość porów filtra powinna być taka, aby immobilizowany enzym trombino-podobny nie mógł przejść przez filtr, ale nieusieciowana fibryna mogła przejść przez filtr. Nieusieciowaną fibrynę otrzymuje się przez kontaktowanie osocza z enzymem trombino-podobnym na

175 443 jednej stronie filtra z utworzeniem monomeru fibryny, który razem z resztą osocza przechodzi przez filtr. Zatem konieczne jest, aby uzyskana kompozycja, zawierająca nieusieciowaną fibrynę, była oddzielana od enzymu trombino-podobnego. Monomer fibryny po przejściu przez filtr spontanicznie polimeryzuje z utworzeniem polimeru nieusieciowanej fibryny.

W celu immobilizowania enzymu trombino-podobnego na nośniku nośnik musi być aktywowany. Można tego dokonać dowolną z odpowiednich technik. Na przykład różnymi dostępnymi grupami aktywującymi do derzwatzzacji nośników są: grupy diazoniowe, grupy izocyjannianowe, grupy chlorków kwasowych, grupy bezwodników kwasowych, grupy chlorków sulfonylowych, grupy dinitrofluorofenylowe, grupy izotiocyjanianowe, grupy hydroksylowe, grupy aminowe, grupy N-hydroksysukcynoimidowe, grupy triazynowe, grupy hydrazynowe, grupy karbodiimidowe, grupy silanowe i bromek cyjanogenu. Techniki te są opisane na przykład w opisie patentowym niemieckim nr 2440254 firmy Pentapharm oraz w P.D.G. Dean, W.S. Johnson i F.A. Middle (edytorzy) Affinity Chromatography A Practical Approach, rozdział 2, Activation Procedures, 1991, IRL Press Offord.

Korzystnie jako grupy aktywujące stosuje się grupy hydrazydowe. W wyniku zastosowania nośników aktywowanych hydrazydem uzyskuje się najwyższe procentowo utrzymanie aktywności enzymu trombino-podobnego przy w zasadzie braku wypłukiwania enzymu (co najmniej około 30% do około 50%, zmierzone za pomocą techniki S2238, patrz Axelsson

G. et al., Thromb. Haemost., 36:517(1976). W celu zapobieżenia degradacji enzymu mogą być również wykorzystane niskie wartości pH, na przykład pH 4-6.

Generalnie nośnik aktywuje się związkiem silnie reaktywnym, który następnie reaguje z grupą funkcyjną ligandu, na przykład -OH, -NH2, -SH, -COOH, -CHO, z utworzeniem wiązania kowalencyjnego. Korzystnymi technikami aktywacji do stosowania w wynalazku są techniki:

(a) z wykorzystaniem grup triazynowych, a korzystnie grup triazynohalogenkowych;

(b) z wykorzystaniem grupy chlorku tresylu;

(c) z wykorzystaniem grupy karbonylodiimidazolu;

(d) z wykorzystaniem grupy bromku cyjanogenu; i (e) z wykorzystaniem grupy hydrazydowej lub aminowej. W technikach (a) - (d) białko sprzęga się za pomocą reakcji z grupami -NH2, -SH lub -OH, natomiast w technice (e) białko sprzęga się poprzez utlenioną grupę węglowodanową, to jest -CHO. Przy użyciu tych technik uzyskuje się maksymalne procentowe zatrzymanie aktywności enzymu trombinopodobnego (co najmniej około 30% do około 50%, mierzone techniką S2238) przy prawie całkowitym braku wypłukiwania.

Do aktywacji triazyną stosuje się dwie różne metody. Pierwsza metoda polega na połączeniu pierścienia triazynowego bezpośrednio z powierzchniowymi grupami OH. Jest to metoda podobna do metody aktywacji CNBr, gdzie powierzchniowe grupy diolowe reagują z CNBr. Przy aktywacji triazynowej grupy OH z agarozy reagują z triazyną (chlorkiem cyjanurowym).

Generalnie nośnik aktywuje się silnie reaktywnym związkiem, który następnie reaguje z grupą funkcyjną ligandu, na przykład -OH, -NH2, -SH, -CHO, tworząc wiązanie kowalencyjne. Pozostałe grupy reaktywne, które nie mają przyłączonego enzymu trombino-podobnego mogą być zablokowane związkami niereaktywnymi, takimi jak etanoloamina, bezwodnik octowy lub glicyna, ale nie jest to konieczne.

Korzystnymi technikami aktywacji do wykorzystania w niniejszym wynalazku są:

(a) Aktywacja bromkiem cyjanogenu, a następnie bezpośrednie sprzężenie enzymu poprzez grupy NH2 białka.

(b) Aktywacja nośnika za pomocą monochlorotriazyny, a następnie sprzężenie enzymu poprzez grupy -NH2, -OH lub -SH.

(c) Aktywacja nośnika dichlorotriazyną, a następnie sprzężenie enzymu poprzez grupy -NH2, -OH lub -SH.

(d) Aktywacja nośnika chlorkiem trezylu, a następnie sprzężenie enzymu poprzez grupy -NH₂, -OH lub -SH.

175 443 (e) Aktywacja nośnika hydrazydem kwasu adypinowego lub hydrazyną, a następnie sprzężenie utlenionego enzymu poprzez grupy -CHO.

(f) Aktywacja nośnika ligandem aminowym, a następnie sprzężenie utlenionego enzymu poprzez grupy -CHO.

We wszystkich powyższych korzystnych metodologiach jako nośnik stosuje się agarozę, jednakże możliwe jest stosowanie krzemionki. Przy użyciu tego nośnika korzystnymi technikami aktywacji są:

(a) Aktywacja gamma-glicydoksypropylotrimetoksysilanem z bezpośrednim sprzężeniem enzymu trombino-podobnego poprzez grupy -NH2 białka.

(b) Aktywacja bromkiem cyjanogenu, a następnie bezpośrednie sprzężenie enzymu poprzez grupy NH₂ białka.

(c) Aktywacja gamma-gjicydoksytrimetoksysilanem, a następnie otwarcie pierścienia epoksydowego z utworzeniem grupy diolowej, która może być następnie aktywowana za pomocą bromku cyjanogenu. Bezpośrednie sprzężenie enzymu można przeprowadzić poprzez grupy -NH₂ na białku.

(d) Aktywacja gamma-glicydoksytrimetoksysilanem, a następnie otrzymanie aminokrzemionki przez działanie roztworem amoniaku.

Amino-krzemionka może być następnie aktywowana chlorkiem cyjanurowym (triazyna) a enzym sprzężony poprzez grupy -NH 2, -OH lub -SH.

Sprzęganie enzymu z aktywowanym nośnikiem musi być prowadzone przy odpowiednim pH w celu uzyskania optymalnego wiązania enzymu. Generalnie przy standardowych technikach aktywacji, takich jak sprzęganie enzymu z aktywowanym nośnikiem przy użyciu gamma-glicydoksypropylotrimetoksysilanu i sprzęganie dowolnego białka z grupami aktywnymi przy użyciu bromku cyjanogenu wymaga buforowania na pH o 1-2 jednostki wyższym niż pKa amin pierwszorzędowych i drugorzędowych enzymu. Jednakże zastosowanie chlorku cyjanurowego jako optymalnego aktywatora umożliwia stosowanie buforów o znacznie niższym pH (optymalne pH sprzęgania wynosi 4-6). Inna metoda sprzęgania glikoprotein, takich jak batroxobin, z obojętnym nośnikiem polega na wykorzystaniu ich grup węglowodanowych. Polega to na najpierw utlenieniu grup cukrowych do grup -CHO, a następnie bezpośrednim sprzężeniu przy pH kwasowym z grupą aminową, taką jak w hydrazydzie. Można stosować szeroki zakres buforów do sprzęgania. Przykłady takich buforów są przedstawione w tabeli 2.

Tabela 2

Przykłady buforów do sprzęgania stosowanych do immobilizacji enzymu z nośnikiem krzemionkowym i agarozowym

Nośnik	Metoda aktywacji	Bufor do sprzęgania
Krzemionka	gamma-glicydoksypropylo- trimetoksysilan	0,1 M wodorowęglan sodu pH 8-9,10 mM HEPES pH 7,0
Krzemionka	gamma-glicydoksypropylotrimetoksysilan + bromek cyjanogenu	0,1 M wodorowęglan sodu pH 8-9,10 mM HEPES pH 7,0
Krzemionka	bromek cyjanogenu	Woda pH 7,0 0,1 M wodorowęglan sodu pH 7-9,10 mM HEPES pH 7,0
Agaroza	monochlorotriazyna	50 mM octan sodu/ 1M NaCl, pH 4,0
Agaroza	dichlorotriazyna	0,1 M fosforan potasu/ 1 M NaCl, pH 8,0-9,0
Agaroza	chlorek trezylu	50 mM fosforan potasu/ 0,5 M NaCl, pH 7,7
Agaroza	hydrazyd	50 mM octan sodu pH 5,5 10 mM NaBHą
Agaroza	amina	50 mM octan sodu pH 5,5 10 mM NaBH4

175 443

Po aktywacji nośnik będzie posiadał więcej miejsc aktywnych niż jest wymagane do sprzęgania z enzymem. Miejsca te, jeśli nie zostaną zdezaklywowane, mogą wiązać kowalencyme zanieczyszczające białka, które mogą wpływać na funkcję biologiczną immobilizowanego enzymu.

Nadmiar grup można zdezaktywować poprzez kowalencyjne związanie małych, nieinterferujących amin, takich jak etanoloamina.

Jeśli stosuje się nośniki aktywowane hydrazydem lub aminą, zablokowanie resztkowych grup reaktywnych po sprzęganiu z enzymem można przeprowadzić przy użyciu bezwodnika octowego.

Zależnie od metody immobilizacji oraz nośnika, podczas procesu immobilizacji zachodzi inaktywacja enzymu. Przy użyciu nośnika krzemionkowego i najbardziej korzystnej techniki aktywacji (to jest bromku cyjanogenu) traci się do 80-90% aktywności enzymatycznej. Jednakże przy zastosowaniu jako nośnika agarozy straty aktywności enzymatycznej są mniejsze.

W celu scharakteryzowania efektywności enzymu immobilizowanego na nośniku mogą być wykorzystane dwie metody oceny: Oznaczenie czasu tworzenia skrzepu (Clot Time Assay)Clauss A., Acta Haematologica., 17:237 (1957) oraz oznaczenie S2238 - patrz Axelsson G. et al., Thromb. Haemost., 36:517 (1976).

W celu oszacowania wypłukiwania enzymu z nośnika może być zastosowane oznaczenie opisane poniżej.

Wypłukiwanie enzymu można oznaczyć przez radioznakowanie enzymu trombinopodobnego na przykład za pomocą I²⁵ batroxobinu. Jednakże przed przeprowadzeniem oznaczenia wypłukiwania niezbędne jest usunięcie całego niezwiązanego radioznacznika. Można to przeprowadzić przez kolejne przemywanie nośnika następującymi roztworami: 50 ml 50 mM octan sodu o pH 5,5,100 ml 50 mM glicyna/! M chlorek sodu o pH 3,0,100 ml 50 mM węglan sodu/1 M chlorek sodu o pH 10,0,100 ml 50 mM fosforan sodu/1 M chlorek sodu o pH 7,0,100 ml wody i 100 ml 50 mM fosforan sodu/1 M chlorek sodu o pH 7,0. Po takiej procedurze przemywania w przemywkach nie wykrywa się radioznacznika, zaś > 50% początkowo użytego radioznacznika jest sprzężone z nośnikiem.

Wymagana ilość enzymu

Ilość enzymu wymagana do obróbki 30-70 ml osocza (uzyskanego z 60-150 ml krwi pełnej) wynosi 30-200 jednostek po mieszaniu przez około 10-15 minut.

Jeśli jako matrycę nośnika stosuje się agarozę, przy użyciu 30-200 jednostek batroxobinu nieusieciowana fibryna tworzy się po około 7-20 minutach. W tym systemie stosuje się aktywację hydrazydem i 0,25 g -1,0 g suchej agarozy. W tym przypadku nie jest wymagane blokowanie pozostających grup aktywnych.

Reakcja immobilizowanego enzymu z fibrynogenem osocza

Generalnie reakcję immobilizowanego enzymu z fibrynogenem z osocza przeprowadza się w sposób następujący: do znanej ilości wysuszonego nośnika, zawierającego immobilizowany enzym trombino-podobny dodaje się 30-70 ml osocza. Zawiesinę miesza się delikatnie (wirowanie w mikserze spiralnym lub mieszanie ręczne) przez około 7-20 minut. Przez ten czas fibrynogen z osocza ulega rozszczepieniu przez immobilizowany enzym, uwalniając fibrynopeptyd A i/lub fibrynopeptyd B, z utworzeniem związanego wiązaniami wodorowymi polimeru fibryny I, związanego wiązaniami wodorowymi polimeru fibryny des BB lub związanego wiązaniami wodorowymi polimeru fibryny II, przy czym każdy z polimerów jest połączony z immobilizowanym enzymem.

Jak opisano powyżej, związany wiązaniami wodorowymi polimer fibryny ma postać żelu i może być zebrany na przykład przez wirowanie (3000 cm/s2 przez 10 minut) lub filtrację (przez filtr membranowy 1-50 mikrometrów). Takie zebranie powoduje oddzielenie związanego wiązaniami wodorowymi polimeru fibryny od osocza i w związku z tym zagęszczenie polimeru.

Należy zauważyć, że jeśli stosuje się enzym trombino-podobny, w wyniku czego następuje aktywacja czynnika XIII, to korzystne jest modyfikowanie kompozycji osocza w czasie stosowania enzymu trombino-podobnego w celu zapobieżenia tworzeniu się usiecio12

175 443 wanej fibryny, na przykład usieciowanej fibryny I lub II z nieusieciowanej fibryny, na przykład nieusieciowanej fibryny I lub II. Oczywiście może być niezbędne modyfikowanie kompozycji osocza jeśli kompozycja ta jest wykorzystywana jako spoiwo fibrynowe bezpośrednio po przekształceniu fibrynogenu w nieusieciowaną fibrynę.

Kompozycja osocza może być modyfikowana w celu zapobieżenia sieciowania nieusieciowanej fibryny za pomocą dowolnej znanej techniki. Można to przeprowadzić przez blokowanie endogennej trombiny, która może aktywować czynnik XIII, na przykład za pomocą hirudyny lub inhibitorów trombiny, lub przez blokowanie działania aktywowanego czynnika XIII, na przykład za pomocą metali ciężkich (Hg), tiomerosalu lub przeciwciał hamujących. Sieciowanie fibryny I lub II wymaga obecności jonów wapnia. Zatem jeśli z kompozycji osocza usunie się wapń, sieciowanie fibryny I lub II może być zahamowane. Patrz Carr et al., J. Biochem., 239:513 (1986); Kamiński et al., J. Biol. Chem. 258:10530 (1983) oraz Kanaide et al., 13:229 (1982). W celu zapobieżenia sieciowaniu fibryny I lub II do kompozycji mogą być dodane chelatory wapnia. Takie chelatory wiążą się z wapniem, zapobiegając w ten sposób sieciowaniu. Może być zastosowany każdy chelator wapnia. Do nieograniczających przykładów chelatorów wapnia należą kwas cytrynowy, kwas sacharynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), kwas nitrylotri-octowy (NTA), kwas hydroksyetylenodiaminotrioctowy (HEEDTA), kwas etylenodiamino-[o-hydroksyfenylooctowy] (EDDHA), kwas etylenoglikolobis-(2-aminoetyloetero)tetraoctowy (EGTA), kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA), kwas 1,2-diam.inocykloheksanotetraoctowy (DCTA), N,N-bishydroksyetyloglicyna, kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) i kwas N-hydroksyetyloiminodioctowy (HIMdA) i ich sole, przy czym korzystne są sole kwasu cytrynowego.

W niniejszym wynalazku może być wykorzystana każda hodowla komórkowa, wydzielająca fibrynogen. Fibrynogen w hodowli komórkowej może być przekształcony w monomer fibryny lub w nieusieciowaną fibrynę za pomocą takich samych technik jak opisane powyżej w odniesieniu do osocza. Jednakże przed taką konwersją korzystne jest usunięcie resztek ścian komórkowych.

Proces może być prowadzony w sposób następujący: komórki HEPG2 namnaża się i utrzymuje w sposób opisany w standardowych tekstach dotyczących hodowli komórek ssaków. Patrz również Liu et al., Cytotechnology, 5:129-139 (1991). Komórki posiewa się w kolbach w minimalnej pożywce podstawowej zawierającej 10% surowicy cielęcej i buforowanej 5% CO 2 przy stosunku rozszczepienia między 1:4 a 1:8.

Po 24-36 godzinach wzrostu w 37°C pożywkę usuwa się i zastępuje pożywką pozbawioną surowicy, zawierającą odpowiedni inhibitor proteazy i 2 j.m./ml heparyny. Hodowlę kontynuuje się przez następne okresy 24-godzinne z kolejnymi trzema zmianami pożywki pozbawionej surowicy.

Kondycjonowaną pożywkę wiruje się przy 3000 cm/s² przez 10 minut w celu usunięcia wszelkich resztek komórkowych, a sklarowany supernatant zawierający fibrynogen miesza się następnie delikatnie z enzymem trombino-podobnym przez 4-5 godzin. Korzystnie enzym trombino-podobny immobilizuje się. Odpowiedni stosunek ustalonej objętości agarozy-enzym trombino-podobny na 500 ml pożywki wynosi od około 1,0 ml do około 50 ml. Jak opisano powyżej, można stosować nośniki inne niż agaroza. Uzyskany monomer fibryny spontanicznie polimeryzuje i jest oplątywany wokół nieruchomego nośnika.

Supernatant, który teraz nie zawiera fibrynogenu, dekantuje się od koniugatu nośnik/żel fibryny, który następnie przemywa się kolejno czterokrotnie zmienianym 0,15 M NaCl przy stosunku od około 10 ml do około 100 ml na 1,0 ml początkowo ustalonej objętości nośnika. Przemyty żel następnie odwadnia do połowy objętości, stosując lejek ze spiekanego szkła pod próżnią.

Zastosowanie hodowli komórkowych, które wydzielają fibrynogen jest szczególnie korzystne gdy stosuje się kompozycję zawierającą monomer fibryny. Jest to spowodowane tym, że uważa się, iż taka kompozycja może być zastosowana z utworzeniem polimeru fibryny, mającego zastosowanie jako spoiwo fibrynowe niezależnie od tego, czy polimer fibryny ulega ostatecznie sieciowaniu. Zatem, ponieważ takie hodowle komórkowe nie

175 443 zawierają czynnika XIII, który ma znaczenie podstawowe dla sieciowania, do wytworzenia efektywnego spoiwa fibrynowego nie będzie potrzebny egzogenny czynnik XTTT.

Kompozycja nieusieciowanej fibryny może być również otrzymana z fibrynogenu rekombinacyjnego. Ostatnio fibrynogen wytworzono technikami rekombinacyjnymi. Patrz S. Roy et al., The Journal of Biological Chemistry, 266:4758-4763 (1991). Roy i współpr. wydają się być pierwszą grupą, której udało się uzyskać ekspresję wszystkich trzech łańcuchów fibrynogenu oraz nauczyć komórki COS ekspresji, łączenia i wydzielania łańcuchów w formie, która posiada zdolność tworzenia skrzepu indukowanego przez trombinę. Uzyskana kompozycja fibrynogenowa może być następnie wykorzystana do wytworzenia kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę przy użyciu technik opisanych powyżej w odniesieniu do hodowli komórkowych wydzielających fibrynogen. Jednakże korzystnie przed utworzeniem kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę resztki komórkowe usuwa się za pomocą technik opisanych powyżej w odniesieniu do hodowli komórkowych. Resztki komórkowe mogą być usunięte przez wirowanie lub filtrację.

Zastosowanie fibrynogenu rekombinacyjnego jest szczególnie korzystne gdy stosuje się kompozycję zawierającą monomer fibryny. Jest to spowodowane tym, że uważa się, że taka kompozycja jest przydatna jako spoiwo fibrynowe niezależnie od tego czy polimer fibryny ostatecznie ulega sieciowaniu. Ponieważ hodowla komórkowa fibrynogenu rekombinacyjnego nie zawiera czynnika XIII, który ma znaczenie podstawowe dla sieciowania, do wytworzenia efektywnego spoiwa fibrynowego nie będzie potrzebny egzogenny czynnik XIII.

W wyniku konwersji fibrynogenu do nieusieciowanej fibryny za pomocą na przykład enzymu trombino-podobnego tworzy się fibryna w postaci polimeru związanego wiązaniami wodorowymi. Jednakże jak omówiono powyżej, korzystne jest aby kompozycja zawierała nieusieciowaną fibrynę i dla kompozycji zawierającej monomer fibryny znaczenie podstawowe ma, aby miała ona formę oligomeryczną lub monomeryczną. Można to przeprowadzić przez solubilizację kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.

Solubilizacja jest szczególnie korzystna gdy nieusieciowaną fibrynę otrzymuje się przy udziale enzymu trombino-podobnego immobilizowanego na nośniku. Jest to spowodowane tym, że w wyniku użycia enzymu trombino-podobnego immobilizowanego na nośniku generalnie otrzymuje się związany wiązaniami wodorowymi polimer nieusieciowanej fibryny zasocjowany z takim immobilizowanym nośnikiem. A zatem, ponieważ korzystne jest aby otrzymywana kompozycja nie zawierała nośnika, solubilizacja umożliwia również usunięcie z kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę nośnika razem z immobilizowanym enzymem.

Solubilizacja może być prowadzona za pomocą dowolnej znanej techniki w wyniku której otrzymuje się monomer fibryny. Solubilizacja może być prowadzona przez kontaktowanie kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę z odpowiednim roztworem bufora kwasowego, korzystnie bufora kwasowego mającego pH poniżej około 5, a korzystnie od około 1 do około 5. Do nieograniczających przykładów odpowiednich roztworów buforów kwasowych należą kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas glukuronowy, kwas cysternowy, kwas krotonowy, kwas itakonowy, kwas glutaminowy, kwas mrówkowy, kwas asparaginowy, kwas adypinowy i ich sole, przy czym korzystne są kwas bursztynowy, kwas asparaginowy, kwas adypinowy i sole kwasu octowego, a najbardziej korzystny octan sodu. Zaobserwowano, że korzystne bufory kwasowe funkcjonują znacznie bardziej efektywnie niż pozostałe testowane bufory kwasowe.

Korzystnie stężenie bufora kwasowego wynosi od około 0,02 M do około 1 M, a najbardziej korzystnie od około 0,1 M do około 0,3 M. Takie korzystne stężenie sprawia, że siła jonowa kompozycji jest bardziej kompatybilna biologicznie.

Korzystnie stosuje się najmniejszą objętość bufora kwasowego, która ciągle jeszcze solubilizuje nieusieciowaną fibrynę z utworzeniem roztworu wodnego zawierającego monomer fibryny. W wyniku tego tworzy się roztwór wodny zawierający monomer fibryny o

175 443 wysokim stężeniu monomeru fibryny. Generalnie wymagane jest od około 1 ml do około 4 ml bufora kwasowego na około 1 ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.

Bufor kwasowy miesza się z nieusieciowaną fibryną i następnie miesza energicznie przez około 1 do 2 minut dla zapewnienia zakończenia solubilizacji.

Solubilizacja może być również prowadzona przy pH obojętnym przy użyciu czynnika chaotropowego. Do odpowiednich czynników chaotropowych należą mocznik, bromek sodu, chlorowodorek guanidyny, KCNS, jodek potasu i bromek potasu. Korzystne stężenie molowe czynnika chaotropowego wynosi od około 0,2 do około 6,0, a najbardziej korzystnie od około 3,5 do około 5,0.

Tak jak w przypadku bufora kwasowego, korzystnie stosuje się najmniejszą objętość czynnika chaotropowego, która ciągle jeszcze solubilizuje nieusieciowaną fibrynę. Generalnie wymagane jest od około 1,0 ml do około 1,5 ml czynnika chaotropowego na około 1 ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.

Czynnik chaotropowy miesza się z taką kompozycją i następnie miesza energicznie przez około 1 do 2 minut dla zapewnienia zakończenia solubilizacji.

Zgodnie z tym w wyniku solubilizacji otrzymuje się kompozycję zawierającą monomer fibryny, a w szczególności roztwór wodny zawierający monomer fibryny. Korzystnie stężenie monomeru fibryny w roztworze wodnym jest nie niższe niż około 10 mg/ml, bardziej korzystnie wynosi od około 20 mg/ml do około 200 mg/ml, jeszcze bardziej korzystnie od około 20 mg/ml do około 100 mg/ml, a najbardziej korzystnie od około 25 mg/ml do około 50 mg/ml.

Jeśli stosuje się enzym trombino-podobny immobilizowany na nośniku, w wyniku czego taki enzym jest obecny w kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę, to po solubilizacji immobilizowany enzym może być usunięty z kompozycji zawierającej monomer fibryny. Można to przeprowadzić na przykład przez filtrację przez każdy odpowiedni filtr, który może oddzielić enzym. Do odpowiednich filtrów należą filtr ze spiekanego polipropylenu o wielkości porów 20 mikrometrów z Porex Inc., filtr teflonowy o wielkości porów 20-70 mikrometrów z Fluorotechniques Inc. oraz filtr z nylonu 66 o wielkości porów 22-46 mikrometrów z Costar Inc.

Alternatywny sposób zapewnienia, że w kompozycji zawierającej monomer fibryny nie jest obecny enzym trombino-podobny, na przykład baxotrobin, polega na tym, że w układzie stosuje się rozpuszczalny enzym trombino-podobny i usuwa enzym po solubilizacji polimeru fibryny związanego wiązaniami wodorowymi. Usunięcie enzymu można przeprowadzić poprzez użycie matrycy powinowactwa, na przykład w postaci ligandu związanego z obojętnym nośnikiem, który posiada specyficzne powinowactwo do enzymu trombino-podobnego lub za pomocą nośnika wymiany jonowej lub hydrofobowego lub najbardziej efektywnie przy użyciu układu biotyna-awidyna. Interakcja biotyna-awidyna charakteryzuje się jedną z najsilniejszych stałych wiązania niekowalencyjnego (Kdis = 10’¹⁵ M) spotykanych w przyrodzie. Patrz E.A. Bayer i M. Wilchek, Methods in Biochemical Analysis, 26:1 (1980).

W procesie tym biotynę wiąże się kowalencyjnie na przykład z batroxobinem, a koniugat biotyna-batroxobin (który jest rozpuszczalny) poddaje się bezpośrednio reakcji z osoczem, na przykład 10 BU plus 50 ml osocza poddaje się reakcji w 37°C przez 10 minut. Wytworzony polimer fibryny I jest zbierany przez wirowanie lub filtrację i solubilizowany ponownie w około 4 ml 0,2 M octanu sodu o pH 4,0, zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Do roztworu fibryny I dodaje się nadmiar molowy awidyny sprzężonej z obojętnym nośnikiem, takim jak agaroza. Następnie kompleks agaroza:awidyna:b.iotynabatroxobin oddziela się od fibryny I przez wirowanie lub filtrację, otrzymując kompozycję zawierającą monomer fibryny pozbawiony w znacznym stopniu batroxobinu, który może być poddany repolimeryzacji jak opisano poniżej z utworzeniem spoiwa fibrynowego.

Kompozycja zawierająca monomer fibryny w znacznym stopniu jest pozbawiona enzymu trombino-podobnego. Przez określenie 'w znacznym stopniu pozbawiona uważa się, że cały trombino-podobny enzym został usunięty względnie, że jakiekolwiek trombino-podobne enzymy jakie pozostały w kompozycji stanowią niewystarczające ilości do wywołania niepożądanego efektu farmakologicznego. Tak więc pozbawione w

175 443 znacznym stopniu pożądane kompozycje mogą, zawierać enzym trombino-podobny w ilości około 0-10% pierwotnego enzymu, a korzystnie około 0-2% trombino-podobnego enzymu stosowanego do wytwarzania kompozycji monomeru fibryny.

Tak otrzymana kompozycja zawierająca monomer fibryny jest gotowa do wykorzystania jako komponent spoiwa fibrynowego. Zaobserwowano, że gdy kompozycję taką otrzymuje się z pełnej krwi, to zawiera ona od około 60% do około 90% pierwotnego fibrynogenu, ale oczywiście w postaci monomeru fibryny.

Kompozycja zawierająca monomer fibryny może być wykorzystana bezpośrednio po jej otrzymaniu. W istocie jest szczególnie korzystne wykorzystanie takiej kompozycji po jej otrzymaniu w przypadku gdy kompozycja jest autologiczna. Jeśli kompozycja nie zostanie wykorzystana bezpośrednio po jej otrzymaniu, może być przechowywana. Przechowywanie kompozycji wymaga, aby została ona zakonserwowana na przykład przez zamrożenie lub liofilizację lub też przechowywanie kompozycji w 4°C. Uważa się, że kompozycja w postaci zamrożonej lub liofilizowanej będzie trwała przez miesiące. Przy przechowywaniu kompozycji w 4°C uważa . się, że będzie ona trwała przez okres co najmniej dni.

Jeśli kompozycja zostanie zamrożona, to podczas jej stosowania musi zostać rozmrożona. Jeśli kompozycja jest liofilizowana, to korzystnie podczas stosowania powinna zostać roztworzona przez dodanie tego samego bufora kwasowego, który został użyty w etapie solubilizacji, jeśli ten kwas jest lotny, na przykład kwasu octowego, lub jeśli zastosowano czynniki chaotropowe, to przez dodanie wody destylowanej. Tak jak w etapie solubilizacji, przy roztwarzaniu należy stosować najmniejszą ilość roztworu bufora kwasowego lub wody destylowanej, przy której jeszcze otrzymuje się rozpuszczalny monomer fibryny. Roztwarzanie liofilizowanej kompozycji zawierającej monomer fibryny może spowodować utworzenie roztworu wodnego zawierającego monomer fibryny, w którym stężenie takiego monomeru wynosi do 200 mg/ml. Przed liofilizacją do kompozycji może być dodany środek zwiększający objętość, na przykład mannitol lub laktoza. Alternatywnie, kompozycja liofilizowana może być wykorzystana w postaci liofilizowanej. Taka postać jest szczególnie korzystna gdy potrzeba do kompozycji dodać adiuwanty, na przykład antybiotyki.

Kompozycja zawierająca monomer fibryny może mieć dowolną postać, na przykład roztworu, zawiesiny, emulsji lub substancji stałej, przy czym roztwór jest korzystny. Zatem taka kompozycja może na przykład mieć postać cieczy, żelu, pasty lub balsamu. Oczywiście kompozycja może mieć również postać granulek, na przykład liofilizowanego monomeru fibryny, które mogą być przetworzone na roztwór, emulsję lub zawiesinę .bezpośrednio przed użyciem.

Do utworzenia roztworu może być użyty dowolny odpowiedni rozpuszczalnik, ale oczywiście korzystny jest rozpuszczalnik nietoksyczny. Do nieograniczających przykładów rozpuszczalników należą woda, alkohol etylowy, gliceryna i glikol propylenowy, przy czym korzystnym rozpuszczalnikiem jest woda.

Przykładem zawiesiny jest zawiesina otrzymana przez zmieszanie kompozycji zawierającej monomer fibryny z rozpuszczalnikami organicznymi, na przykład etanolem, do końcowego stężenia etanolu ponad 3,0 M i wytrząśnięcie. Monomer fibryny wytrąci się i może być wyodrębniony przez odwirowanie. Precypitat powinien być przemyty fazą organiczną w celu usunięcia roztworu wodnego stosowanego w etapie solubilizacji. Etanolowa zawiesina monomeru fibryny może być następnie nałożona bezpośrednio na bandaż lub inny nośnik lub nawet nałożona bezpośrednio na ranę. Fazie organicznej pozwala się odparować. W przypadku bandażu lub innego podłoża zawiesina może być ponownie uwodniona przez skontaktowanie z miejscem nałożenia lub w inny sposób, a fibrynie pozwala się spolimeryzować.

Alternatywnie organiczna zawiesina monomeru fibryny w fazie silnie lotnej, na przykład w eterze dietylowym, może być zatomizowana i dostarczona do żądanego miejsca w postaci zawiesiny w spray'u. Korzystnie faza lotna jest niepalna. Możliwe jest dostarczanie organicznej zawiesiny fibryny do ucha, nosa, gardła lub płuc przez rozpylanie lub wdychanie lub dostarczanie do krwawiących uszkodzeń przełyku lub żołądka przez połknięcie.

175 443

Zestaw spoiwa fibrynowego według wynalazku stosuje się przez skontaktowanie żądanego miejsca z kompozycją zawierającą monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę i konwersję monomeru fibryny do polimeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny do nieusieciowanej fibryny jednocześnie ze wspomnianym etapem kontaktowania i utworzenie przez to skrzepu fibrynowego.

Dla celów niniejszego wynalazku określenie żądane miejsce oznacza miejsce, gdzie chce się utworzyć skrzep fibryny. Czym jest żądane miejsce i gdzie się znajduje zależy od zastosowania zestawu spoiwa fibrynowego według wynalazku. Należy również zauważyć, że spoiwo fibrynowe może być wykorzystane nie tylko u ludzi ale również i u innych ssaków. Ponadto jeśli źródłem spoiwa fibrynowego jest krew, to korzystne jest ale nie konieczne, aby krew pochodziła od tego samego gatunku, u którego spoiwo fibrynowe będzie zastosowane.

Zestaw spoiwa fibrynowego według wynalazku może być wykorzystany w dowolnym znanym zastosowaniu spoiwa fibrynowego. Sposoby, zestawy lub spoiwo fibrynowe może być stosowane do łączenia tkanek lub narządów, zatrzymywania krwawienia, gojenia ran, spajania ran chirurgicznych, stosowane w chirurgii naczyń, w tym do zapewniania hemostazy przy szyciu otworów krwawiących w zespoleniach tętnic wieńcowych; linii szwów lewego przedsionka; miejsc nacięć aorty i kaniulacji; rozlanych krwawień mięśnia sercowego przy operacjach ponownych; oraz przy sączeniu się z miejsca krwawienia żylnego, na przykład na poziomach tętnicy, żył głównych lub prawego przedsionka. Wynalazek znajduje również zastosowanie do spajania dakronowych przeszczepów tętnic przed przeszczepieniem, spajania tkanek poza organizmem, wytwarzania masy fibryny do namnażania komórek, zatrzymywania krwawienia z uszkodzonej śledziony (ratowanie przez to narządu), wątroby i innych narządów miąższowych; spajanie zespoleń tchawicowych i oskrzelowych oraz przecieków powietrza i okaleczeń płuc, spajanie końców oskrzelowych, przetok oskrzelowych i przełykowych; do bezszwowego gojenia (technika z^jpper) oraz embolizacji w radiologii AVM naczyń wewnątrzmózgowych, AVM wątroby, angiodysplazji okrężnicy, żylakach przełyku, pompowania pacjentów z krwawieniem żołądkowo-jelitowym spowodowanym wrzodem trawiennym, etc. Wynalazek niniejszy znajduje również zastosowanie do zapewniania hemostazy w transplantacjach rogówki, krwawieniach z nosa, usunięciu migdałków, ekstrakcji zębów i w innych zastosowaniach. Patrz G.F. Gestring i R. Lermer, Vascular Surgery, 294-304, Sept./Oct. 1983. Ponadto zestaw spoiwa fibrynowego według wynalazku jest szczególnie przydatny u osób z zaburzeniami krzepnięcia.

Dawka kompozycji zawierającej monomer fibryny lub kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę zależy od konkretnego zastosowania spoiwa fibrynowego, ale powinna to być dawka zapewniająca przeprowadzenie zamierzonego wykorzystania kompozycji. Generalnie dla kompozycji zawierającej monomer fibryny będącej roztworem wodnym uważa się, że dawka takiej kompozycji równa od około 3 ml do około 5 ml jest wystarczająca do tego, aby była ona skutecznym spoiwem. Jednakże zależnie od zastosowania kompozycji dawka może być zawarta w zakresie od około 0,05 ml do około 40 ml. Również jeśli stosowana jest kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę w formie polimeru lub kompozycja ma postać stałą, to powinna ona zawierać taką ilość fibryny, jaka jest w takim roztworze wodnym.

Dla celów niniejszego wynalazku określenie, że konwersja monomeru fibryny do polimeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny do usieciowanej fibryny jednocześnie ze wspomnianym etapem kontaktowania oznacza, że taki etap konwersji i taki etap kontaktowania zachodzi w okresie czasu każdego z etapów tak, aby wytworzyć skrzep fibryny w żądanym miejscu. Zatem określenie jednocześnie może oznaczać, że po etapie kontaktowania monomer fibryny jest przekształcany w polimer fibryny lub że nieusieciowana fibryna jest przekształcana w usieciowaną fibrynę. Przeprowadza się to przez kontaktowanie kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę, po nałożeniu takiej kompozycji na żądane miejsce, z kompozycją która może przekształcić monomer fibryny w polimer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w usieciowaną fibrynę. Etap konwersji powinien generalnie zachodzić w ciągu około 0,5 minuty po etapie kontaktowania. W przeciwnym

175 4-43 razie kompozycja zawierająca monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę, zwłaszcza jeśli nieusieciowaną fibryną jest monomer fibryny, może spływać z żądanego miejsca.

Jednocześnie może również oznaczać, że etap kontaktowania i etap konwersji mają miejsce jednocześnie. Przeprowadza się to przez kontaktowanie żądanego miejsca z kompozycją zawierającą monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w tym samym czasie, w którym taka kompozycja jest kontaktowana z kompozycją, która może przekształcić monomer fibryny w polimer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w usieciowaną fibrynę.

Ostatecznie i korzystnie jednocześnie może oznaczać również, że etap konwersji może zaczynać się przed etapem kontaktowania, chociaż nie tak daleko przed etapem kontaktowania, aby cały monomer fibryny uległ konwersji do polimeru fibryny lub cała nieusieciowana fibryna uległa konwersji do usieciowanej fibryny. W przeciwnym razie cały monomer fibryny uległby konwersji do polimeru fibryny lub cała nieusieciowana fibryna uległaby konwersji do usieciowanej fibryny przed etapem kontaktowania, w wyniku czego powstałoby bardzo złe spoiwo fibrynowe. Tę postać wynalazku przeprowadza się przez zmieszanie kompozycji zawierającej monomer fibryny z kompozycją, która może przekształcić monomer fibryny w polimer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę w usieciowaną fibrynę, przed etapem kontaktowania. Ponieważ doprowadzenie do końca etapu konwersji trwa około 30 sekund, etap konwersji nie powinien rozpoczynać się na więcej niż 30 sekund i korzystnie nie więcej niż 3 sekundy przed etapem kontaktowania. Ta postać jest korzystna, ponieważ zapewnia ona, że maksymalna ilość kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę pozostanie w żądanym miejscu i jeszcze utworzy doskonały skrzep fibrynowy.

Konwersję monomeru fibryny do polimeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny do usieciowanej fibryny można prowadzić dowolną techniką znaną lub opracowaną w przyszłości. Jednakże to, jak prowadzony jest etap konwersji zależy od tego, jakie jest źródło kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę, na przykład pełna krew lub fibrynogen rekombinacyjny, od postaci monomeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny, na przykład fibryny I lub fibryny des BB oraz w mniejszym stopniu od tego, czy żądane miejsce będzie w czasie stosowania spoiwa fibrynowego zawierać krew pacjenta lub inne płyny ustrojowe.

Jeśli do etapu konwersji stosuje się oddzielną kompozycję, taką jak bufor alkaliczny (jak omówiono poniżej), to zestaw według wynalazku można aplikować na przykład za pomocą strzykawki dwucylindrowej. Strzykawka dwucylindrowa może mieć kształt litery Y, dzięki czemu możliwe jest zmieszanie kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę oraz kompozycji stosowanej w etapie konwersji bezpośrednio przed etapem kontaktowania. Również zamiast strzykawki dwucylindrowej w kształcie litery Y można stosować strzykawkę dwucylindrową z dwoma otworami. Umożliwia to jednoczesne zachodzenie kontaktowania żądanego miejsca i konwersji do polimeru fibryny lub usieciowanej fibryny. Kompozycje w strzykawkach dwucylindrowych mogą być również rozpylane na żądane miejsce. Patrz H.B. Kram et al., The American Surgeon, 57:381 (1991).

Jeśli źródłem kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę jest krew, to wtedy tak jak omówiono powyżej, uważa się, że kompozycja zatrzyma wystarczającą ilość protrombiny, czynnika XIII i innych substancji niezbędnych do konwersji takiego monomeru fibryny lub nieusieciowanej fibryny do usieciowanej fibryny, na przykład aktywatorów protrombiny. Jeśli nieusieciowaną fibryną jest polimer fibryny, to jest nieusieciowana fibryna nie została solubilizowana, to nieusieciowana fibryna może być poddana konwersji do usieciowanej fibryny poprzez aktywację protrombiny i czynnika XIII w takiej kompozycji z utworzeniem usieciowanej fibryny. Taka aktywacja może być prowadzona przez kontaktowanie kompozycji ze źródłem jonów wapnia. Do nieograniczających źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie o stężeniu 30 mM. Alternatywnie, ale mniej korzystnie jony wapnia mogą być dostarczane poprzez krew do żądanego miejsca.

Jeśli nieusieciowana fibryna jest solubilizowana, to znaczy jest to monomer fibryny, to sposób konwersji monomeru fibryny do usieciowanej fibryny zależy od sposobu przeprowadzenia solubilizacji. Jeśli nieusieciowaną fibrynę solubilizowano za pomocą bufora kwa18

175 443 sowego, to usieciowana fibryna może być utworzona przez podniesienie pH kompozycji zawierającej monomer fibryny tak, że monomer fibryny może polimeryzować. Można to przeprowadzić przez skontaktowanie takiej kompozycji z dowolnym odpowiednim buforem alkalicznym. Do nieograniczających przykładów buforów alkalicznych należą HEPES, wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek wapnia, bufory wodorowęglanowe, takie jak wodorowęglan sodu, trimetaliczne sole kwasu cytrynowego, sole kwasu octowego i sole kwasu siarkowego. Do korzystnych buforów alkalicznych należą: 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 -10,5, 0,5 - 0,75 M wodorowęglan sodu/glicyna o pH 10,0,1,5 M glicyna/NaOH o pH 10,0,0,5 -1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetanosulfonowy) (BES) o pH 7,^, 1 M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosul-fonowy (EPPS) o pH 8,5, 0,5 M tricyna o pH 8,5 1 M kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS) o pH 8,0,1 M kwas trihydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0 i 0,5 M kwas cykloheksyloaminoetanosulfonowy (CHES) o pH 10,0; przy czym najbardziej korzystne ' są bufory 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 - 10,5, 0,5 - 1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetanosulfonowy) (BES) o pH 7,5, 1M kwas hydroksyetylopiperazynopropa^n^c^^r^konc^wy (EPPS) o pH 8,5, i kwas trihydroksymetyloaminoeta^n^c^^uU^^n^c^wy (TES) o pH 8,0.

Ilość użytego bufora alkalicznego powinna być wystarczająca do spolimeryzowania nieusieciowanej fibryny. Korzystnie od około 10 części do około 1 części kompozycji zawierającej monomer fibryny miesza się z 1 częścią bufora alkalicznego. Jeszcze bardziej korzystnie stosunek ten wynosi około 9:1. Należy zauważyć, że korzystny stosunek zależy od wyboru bufora i pożądanej mocy polimeru fibryny. Oczywiście żądana moc polimeru fibryny zależy od końcowego zastosowania spoiwa fibrynowego.

Jeśli solubilizację prowadzi się za pomocą czynnika chaotropowego, to monomer fibryny może być poddany konwersji do usieciowanej fibryny przez rozcieńczenie kompozycji zawierającej monomer fibryny na przykład wodą destylowaną. Rozcieńczenie powinno być prowadzone przy użyciu minimalnej ilości rozcieńczalnika. Generalnie stężenie molowe czynnika chaotropowego uzyskane po rozcieńczeniu powinno wynosić od około 0,5 do około 0,1.

Oprócz zwiększania pH lub rozcieńczania czynnika chaotropowego kompozycji zawierającej monomer fibryny korzystnie protrombinę i czynnik XIII z takiej kompozycji aktywuje się z utworzeniem usieciowanej fibryny. Taką aktywację można przeprowadzić przez kontaktowanie kompozycji ze źródłem wapnia. Źródło jonów wapnia może być częścią bufora alkalicznego lub częścią bufora kwasowego stosowanego w etapie solubilizacji. Do nieograniczających przykładów źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie o stężeniu 30 mM. Alternatywnie, ale mniej korzystnie źródło jonów wapnia może być dostarczane przez krew do żądanego miejsca.

Należy zauważyć, że jeśli jako bufor alkaliczny stosuje się bufor węglan/wodorowęglan, to źródło jonów wapnia musi być dodane do bufora kwasowego podczas etapu solubilizacji. Jest to spowodowane tym, że chlorek wapnia jest nierozpuszczalny w buforze węglan/wodorowęglan. Korzystnie stosuje się stężenie jonów wapnia w roztworze bufora kwasowego od około 5 milimolowego do około 150 milimolowego, a bardziej korzystnie od około 5 mM do około 50 mM.

Uważa się, że uzyskany skrzep fibrynowy będzie usieciowaną fibryną II niezależnie od tego, która postać nieusieciowanej fibryny, to jest monomer fibryny lub polimer fibryny jest obecna. Jednakże jeśli nieusieciowana fibryna ma postać fibryny des BB, to uważa się, że w celu przeprowadzenia konwersji fibryny des BB do usieciowanej fibryny może być niezbędne źródło dodatkowej trombiny. Takim źródłem trombiny może być na przykład osocze pacjenta, przy czym takie osocze dodaje się do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.

Jeśli żądane miejsce zawiera krew i stosuje się kompozycję zawierającą monomer fibryny, to jest nieusieciowana fibryna jest solubilizowana, to krew ta może być wykorzystana jako rozcieńczalnik czynnika chaotropowego lub do zwiększenia pH kompozycji zawierającej monomer fibryny. Zatem nie potrzeba stosować rozcieńczalnika ani bufora alkalicz175 443 nego. W tej postaci korzystnie źródło jonów wapnia jest zawarte w buforze kwasowym lub czynniku chaotropowym stosowanym w etapie solubilizacji. Również jeśli w tej postaci kompozycja zawierająca monomer fibryny może być umieszczona na stałym podłożu, na przykład bandażu, szwie, protezie lub opatrunku, będzie ona w kontakcie z żądanym miejscem. Taki nośnik umieszcza się następnie w kontakcie z żądanym miejscem na przykład aż do utworzenia skrzepu fibryny.

Jednakże należy zauważyć, że jeśli kompozycja zawierająca monomer fibryny nie zatrzyma dosyć protrombiny i czynnika XIII do utworzenia usieciowanej fibryny, to taka kompozycja jest mimo to przydatna jako spoiwo fibrynowe, ponieważ polimeryzacja monomeru fibryny per se może być wykorzystana do tworzenia skrzepu fibrynowego. Taka kompozycja może również być jeszcze wykorzystana do utworzenia usieciowanej fibryny przez dodanie źródła jonów wapnia i aktywowanego czynnika XIII (lub prekursorów aktywowanego czynnika XIII) i ewentualnie trombiny. Takie źródło jonów wapnia, aktywowanego czynnika XIII i trombiny może być dodane do kompozycji zawierających monomer fibryny. Aktywowany czynnik XIII może być dodany do kompozycji zawierającej monomer fibryny w stężeniu końcowym od około 1,0 do około 20 jednostek czynnika XIII na ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Alternatywnie czynnik XIII może być dostarczany do żądanego miejsca przez krew lub płyny ustrojowe lub przez dodanie osocza autologicznego do kompozycji zawierającej monomer fibryny. Do nieograniczających źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie w stężeniu 30 mM. Alternatywnie, ale mniej korzystnie jony wapnia mogą być dostarczane w żądane miejsce przez krew lub płyny ustrojowe. Można dodać od około 4 jednostek do około 500 jednostek trombiny na ml kompozycji zawierającej monomer fibryny lub trombina może być dostarczana przez żądane miejsce.

Jeśli źródłem kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę są hodowle komórkowe wydzielające fibrynogen lub fibrynogen rekombinacyjny, a nieusieciowaną fibryną jest polimer fibryny, to jest nieusieciowana fibryna nie jest solubilizowana, to w celu utworzenia usieciowanej fibryny musi być zastosowane źródło jonów wapnia i aktywowanego czynnika XIII (lub prekursorów aktywowanego czynnika XIII). Czynnik XIII musi być zastosowany, ponieważ te źródła nieusieciowanej fibryny nie zawierają wcale czynnika XIII. Aktywowany czynnik XIII może być dodany do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę w stężeniu końcowym od około 1,0 do około 20 jednostek czynnika XIII na ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Alternatywnie czynnik XIII może być dostarczany przez krew lub płyny ustrojowe w żądane miejsce lub przez dodanie do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę autologicznego osocza. Do nieograniczających źródeł jonów wapnia należy chlorek wapnia, korzystnie w stężeniu 30 mM. Alternatywnie ale mniej korzystnie jony wapnia mogą być dostarczane przez krew lub płyny ustrojowe w żądane miejsce. Również ewentualnie do takiej kompozycji może być dodawana trombina w celu zapewnienia tworzenia się usieciowanej fibryny fibryny II. Można dodać od około 4 jednostek do około 500 jednostek trombiny na ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę lub trombina może być dostarczona do żądanego miejsca.

Jeśli nieusieciowana fibryna jest solubilizowana, to znaczy jest monomerem fibryny, to sposób przeprowadzenia konwersji monomeru fibryny do polimeru fibryny zależy od sposobu przeprowadzenia solubilizacji, na przykład za pomocą bufora kwasowego lub czynnika chaotropowego. Tworzenie polimeru fibryny można przeprowadzić tymi samymi metodami jak opisano powyżej. Ten polimer fibryny w razie potrzeby może być poddany konwersji do usieciowanej fibryny przez dodanie do kompozycji zawierającej monomer fibryny źródła jonów wapnia i aktywowanego czynnika XIII (lub prekursorów aktywowanego czynnika XIII) i ewentualnie trombiny, jak opisano powyżej. Aktywowany czynnik XIII może być dodany do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę w stężeniu końcowym od około 1,0 do około 20 jednostek czynnika XIII na ml kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Alternatywnie czynnik XnI może być dostarczany przez krew lub płyny ustrojowe w żądane miejsce lub przez dodanie osocza autologicznego do kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę. Do nieograniczających źródeł jonów wapnia należy

175 443 chlorek wapnia, korzystnie w stężeniu 30 mM. Alternatywnie ale mniej korzystnie jony wapnia mogą być dostarczane przez krew lub płyny ustrojowe w żądane miejsce. Można dodać od około 4 jednostek do około 500jednostek trombiny na ml kompozycji zawierającej monomer fibryny lub trombina może być dostarczona w żądane miejsce.

Spoiwo fibrynowe może ponadto zawierać adiuwanty, na przykład antybiotyki, takie jak gentamycyna, cefotaksym, nebacetin i sisomicin, antagoniści histaminy H2, na przykład ranitydyna oraz leki przeciwnowotworowe, na przykład OK-432. Może to przeprowadzić przez dodanie żądanego antybiotyku do kompozycji zawierającej monomer fibryny lub nieusieciowaną fibrynę. Patrz M.C. Gersdorff i T.A.J. Robillard, Laryngoscope, 95:1278-80 (1985); A. Ederle et al., Ital. J. Gastroenterol., 23:354-56 (1991); V. Ronfard et al., Burns, 17:181-84 (1991); T. Sakurai et al., J. Control. Release, 18:39-43 (1992); T. Monden et al., Cancer, 69:636-42 (1992); F. Greco, J. of Biomedical Materials Research, 25:39-51 (1991) oraz H.B. Kram et al., Journal of Surgical Research, 50:175-178 (1991). Mogą być również dodane inne adiuwanty, na przykład fibronectin, inhibitory fibrynolityczne, takie jak aprotinin, alfa-2 antiplasmin, PAI-1, PAI-2, kwas 6-aminoheksanowy, kwas 4-aminometylocykloheksanowy, kolagen lub keratynocyty. Dawka takiego adiuwanta jest taka sama jak dawka stosowana w znanych spoiwach fibrynowych.

Przedmiotem wynalazku są zestawy spoiwa fibrynowego. Zestaw może zawierać jako pierwszy komponent kompozycję zawierającą monomer fibryny a jako drugi komponent bufor alkaliczny, który jest zdolny do polimeryzowania monomeru fibryny lub wodę destylowaną, zależnie od tego jak przeprowadza się etap solubilizacji. Drugi komponent może ewentualnie zawierać źródło jonów wapnia. Alternatywnie zestaw może jako pierwszy komponent zawierać kompozycję zawierającą nieusieciowaną fibrynę, a jako drugi komponent źródło jonów wapnia. Jeśli źródłem fibrynogenu stosowanego do otrzymania kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę są hodowle komórkowe wydzielające fibrynogen lub rekombinacyjny fibrynogen, to pierwszym komponentem może być kompozycja zawierająca nieusieciowaną fibrynę, drugim komponentem może być źródło jonów wapnia a trzecim komponentem jest aktywowany czynnik XIII.

Przykłady

Przykład I. Otrzymywanie osocza z pełnej krwi

Pełną krew (100 ml) zbiera się do standardowych, dostępnych w handlu torebek na krew zawierających antykoagulant takie jak układ cytrynian/fosforan/dekstroza. Następnie krew przenosi się do pojemnika odpowiedniego do wirowania i wiruje w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 3000 cm/s2 Klarowne osocze z supernatanta (około 50 ml) dekantuje się, a składniki komórek odrzuca.

Alternatywną metodą otrzymywania osocza z pełnej krwi jest filtracja. 100 ml pełnej krwi zbiera się do standardowych, dostępnych w handlu torebek na krew zawierających antykoagulant taki jak układ cytrynian/fosforan/dekstroza. Następnie krew recyrkuluje się za pomocą pompy perystaltycznej poprzez filtr charakteryzujący się dobrą transmisją białek. Spadek ciśnienia poprzez membranę powoduje przepychanie osocza wraz ze składnikami komórkowymi pozostającymi w recyrkulującej krwi. Osocze (50 ml) zbiera się do dalszej przeróbki.

Przykład II. Immobilizacja batroxobinu na agarozie

W badaniach immobilizacji zastosowano perełki agarozowe (Pharmacia). Użyto usieciowaną w 4% agarozę o średnicy 45-165 μ m (90% cząstek). Materiał ten po uwodnieniu 5-krotnie zwiększa swoją objętość. Baxotrobin najpierw utlenia się przez 1 godzinę 0,1 M nadjodanem sodu w temperaturze pokojowej w zakrytym naczynku scyntylacyjnym. Batroxobin oczyszcza się przez przepuszczenie przez kolumnę z żelem sephadex PD10. Następnie utleniony batroxobin sprzęga się przez noc z aktywowanym hydrazydem żelem agarozowym w temperaturze pokojowej w 50 mM octanie sodu o pH 5,5 plus 10 mM borowodorek sodu (30-200 U na 1,75 g wilgotnego żelu). Niezwiązane reagenty usuwa się z żelu przez przemycie: 50 ml octanu sodu o pH 5,5, 100 ml układu 50 mM glicyna/1 M chlorek sodu o pH 3,0,100 ml układu 50 mM węglan sodu/1 M chlorek sodu o pH 10,0,100 ml

175 443 układu 50 mM fosforan sodu/1 M chlorek sodu o pH 7,0, 100 ml wody, 100 ml 50 mM fosforanu sodu/1 M chlorek sodu o pH 7,0,100 ml 50 mM fosforanu sodu o pH 7,0.

Przykład III. Reakcja immobilizowanego enzymu z fibrynogenem z osocza z wytworzeniem kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę

Immobilizowany enzym (350 mg) dodaje się do około 50 ml odwirowanego lub przefiltrowanego osocza i miesza delikatnie przez 7 do 20 minut aż do utworzenia skrzepu polimeru nieusieciowanej fibryny II.

Polimer fibryny I plus zasocjowany immobilizowany enzym zbiera się następnie przez: a) wirowanie przy 3000 - cm/s2 przez 10 minut a następnie usunięcie supematanta surowicy przez dekantację, albo przez b) filtrację przez odpowiedni fil'tr wiążący białka niskocząsteczkowe, a następnie odrzucenie przefiltrowanej surowicy i zatrzymanie polimeru fibryny I wraz z immobilizowanym enzymem do dalszej obróbki. Ten polimer fibryny I jest przykładem kompozycji zawierającej nieusieciowaną fibrynę.

Przykład IV. Solubilizacja polimeru fibryny I z wytworzeniem kompozycji zawierającej monomer fibryny I

Solubilizację polimeru fibryny I przeprowadza się przez dodanie do zebranego polimeru fibryny I wraz z immobilizowanym enzymem około 1-4 ml 0,2 M octanu sodu o pH 4,0, zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Następnie próbkę miesza się energicznie przez 2 minuty, na przykład w mikserze wirowym. Następnie przeprowadza się usunięcie immobilizowanego enzymu przez filtrację roztworu fibryny I przez filtr wiążący białka niskocząsteczkowe 1 do 20um. Enzym immobilizowany na agarozie pozostanie na filtrze, co umożliwi usunięcie go z układu. Pozostały roztwór, kompozycja zawierająca monomer fibryny I, składa się z zatężonego kwasowego roztworu monomeru fibryny I wraz z innymi białkami osocza. Generalnie z około 100 ml pełnej krwi otrzymuje się około 4 ml lub 5 ml kompozycji zawierającej monomer fibryny, w której stężenie monomeru fibryny wynosi od około 25 mg/ml do około 35 mg/ml. Jest ona gotowa do podawania pacjentowi pojedynczo lub wytłaczania razem z buforem do repolimeiyzacji, z utworzeniem spoiwa fibrynowego.

Przykład V. Repolimeryzacja kompozycji zawierającej monomer fibryny I

Repolimeryzację przeprowadza się przez jednoczesne mieszanie 9 części roztworu zawierającego monomer fibryny I z 1 częścią odpowiedniego buforu do repolimeryzacji, na przykład buforu 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10,0. Stosunek ten może być zmieniony, jednakże stosunek 9:1 pozwala na utrzymanie wysokiego stężenia fibryny I w produkcie końcowym. Przy łącznym wytłaczaniu fibryna I spontanicznie repolimeryzuje i przechodzi konwersję do fibryny II a następnie ulega sieciowaniu w ciągu okresu około 30 minut.

Przykład VI. Aktywowanie agarozy hydrazydem i sprzęganie węglowodanowej grupy enzymu

W celu przereagowania grupy węglowodanowej batroxobinu z nośnikiem aktywowanym hydrazydem cukier musi być najpierw utleniony z utworzeniem wolnych grup -CHO. Przeprowadza się to poniższym sposobem.

1-7 mg batroxobinu rozpuszcza się w 2 ml wody i 0,2 ml 0,1 M nadjodanu sodu. Mieszaninę inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym odsala na kolumnie filtracyjnej z żelem Sephadex G-25. Utleniony aktywny batroxobin eluuje się z kolumny 0,9% w/v chlorkiem sodu.

Do bezpośredniego sprzężenia wolnych grup aldehydowych (-CHO) można zastosować standardowe, dostępne w handlu agarozy aktywowane hydrazydem (Bio-Rad Laboratories Ltd, Wielka Brytania) lub dowolną grupę z wolnymi terminalnymi grupami aminowymi. Jeśli stosuje się hydrazydo-agarozę, to procedura sprzęgania jest następująca.

1-5 g żelu hydrazydo-agarozowego zawiesza się w 4 ml 50 mM octanu sodu o pH 5,5. Do zawiesiny dodaje się 1m110 mM borowodorku sodu razem z żądaną ilością utlenionego batroxobinu (zwykle 100-200 BU na gram wilgotnego żelu).

Próbkę miesza się przez noc w temperaturze pokojowej a następnie przemywa na lejku ze spiekanego szkła następującymi buforami: 50 ml 50 mM octanu sodu o pH 5,5, 100 ml układu 50 mM glicyn a/1 M chlorek sodu o pH 3,0,100 ml układu 50 mM węglan

175 443 sodu/1 M chlorek sodu o pH 10,0, 100 ml układu 50 mM fosforan sodu/1 M chlorek sodu 0 pH 7,0,100 ml wody i 100 ml układu 50 mM fosforan sodu/1 M chlorek sodu o pH 7,0 i na końcu 100 ml 50 mM fosforanu sodu o pH 7,0.

Reakcję immobilizowanego batroxobinu z osoczem przeprowadza się w następujący sposób.

pH osocza zmniejsza się do 5,5 przez dodanie kwasu octowego. Do osocza dodaje się równoważnik 100-200 BU batroxobinu immobilizowanego na około 1,75 g (ciężar wilgotnego żelu) agarozy. Osocze inkubuje się w 37°C przez 10-15 minut, po czym pH zwiększa się do 7,4 przez dodanie wodorotlenku sodu. Polimeryzacja fibryny I zachodzi niemal jednocześnie. Polimer fibryny I zbiera się przez wirowanie przez 10 minut przy 3500 rpm i rozpuszcza ponownie w 3-4 ml 0,2 M octanu sodu o pH 4,0, zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Enzym sprzężony z agarozą oddziela się następnie od fibryny I przez wirowanie lub filtrację. Fibrynę I repolimeryzuje się następnie z utworzeniem spoiwa fibrynowego przez dodanie 9 części roztworu fibryny I do 1 części buforu 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10,0.

Przykład VII. Wychwycenie enzymu za pomocą układu biotyna-awidyna

Wychwycenie enzymu przeprowadza się przez najpierw biotynylowanie batroxobinu i wychwycenie koniugatu biotynaenzym za pomocą immobilizowanej awidyny (awidyna sprzężona z 6% usieciowaną agarozą).

Biotynylowanie białek można przeprowadzić stosując wiele reagentów. W tym przypadku stosuje się N-hydroksysukcynoimido-biotynę (nierozpuszczalną w wodzie, dostępną w handlu z firmy Amersham). NHS-biotynę (50 μ l) dodaje się do 1 mg batroxobinu przy pH 8,6 i inkubuje roztwór w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Nadmiar reagenta biotynylującego usuwa się przez filtrację żelową na kolumnie Sephadex G-25, stosując jako eluent 0,1 M fosforan potasu o pH 7,5.

Równoważnik 10 BU biotyno-batroxobinu dodaje się do 50 ml osocza i inkubuje w 37°C przez 10 minut. Polimer fibryny I zbiera się przez wirowanie (3500 rpm przez 10 minut) i ponownie rozpuszcza w 3-4 ml 0,2 M octanu sodu o pH 4,0, zawierającego 30 mM chlorku wapnia. Do fibryny I dodaje się awidyno-agarozę (dostępna w handlu z firmy Sigma Chemical Co.) w ilości 0,2 g (wilgotny żel) na ml fibryny I. Próbkę inkubuje się przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wiruje przez 10 minut przy 2000 rpm. Otrzymana fibryna I jest pozbawiona w wysokim stopniu batroxobinu. Repolimeryzację fibryny z utworzeniem spoiwa fibrynowego przeprowadza się w sposób · opisany powyżej w przykładzie V.

175 443

175 443

Cl

N=/

-O

N—\

Immobitizacja

<E)-nh₂ <E>-sh <P)~oh

H

X oznacza OH lub Cl FIG. I ®oznacza proteinę

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zestaw spoiwa fibrynowego, znamienny tym, że składa się z wodnej kompozycji zawierającej monomer fibryny o stężeniu równym 10 - 200 mg/ml, której pH równa się 1 - 5 i kompozycji wybranej z grupy obejmującej wodę destylowaną i bufor alkaliczny wybrany z grupy obejmującej układ 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 -10,5, 0,5 - 0,75 M wodorowęglan sodu/NaOH o pH 10,0,1,5 M glicyna/NaOH o pH 10,0, 0,5 -1,0 M kwas bis(hydroksyetyloaminoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,,5,1M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5, 0,5 M tricyna o pH 8,5,1M kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS) o pH 8,0, 1 M kwas trishydroksymetyloaminoetanosulfonowy (TES) o pH 8,0 i 0,5 M kwas cykloheksyloaminoetanosulfonowy (CHES).
2. 2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że jako bufor alkaliczny zawiera bufor wybrany z grupy obejmującej układ 0,5 - 0,75 M węglan/wodorowęglan sodu o pH 10 -10,5, 0,5 -1,0 M kwas bis(hydroksyetyloammoetano)sulfonowy (BES) o pH 7,5, 1M kwas hydroksyetylopiperazynopropanosulfonowy (EPPS) o pH 8,5 i 1 M kwas trishydroksymetyloaminoetanosuHonowy (TES) o pH 8,0.
3. 3. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że bufor alkaliczny lub woda destylowana dodatkowo zawiera źródło jonów wapnia.
4. 4. Zestaw według zastrz. 3, znamienny tym, że stężenie jonów wapnia równa się 30 mM.

   * * *