PL176318B1

PL176318B1 - Sposób obróbki zawiesin komórek zdolnych do lizy

Info

Publication number: PL176318B1
Application number: PL95316657A
Authority: PL
Inventors: Vivian Granger; David Barnett
Original assignee: North Gen Hospital Nhs Trust
Priority date: 1994-04-05
Filing date: 1997-01-27
Publication date: 1999-05-31
Also published as: CA2187196A1; DK0754301T3; AU2305195A; DE69504646T2; ES2122589T3; ATE170979T1; AU695573B2; EP0754301B1; WO1995027203A1; CN1149338A; DE69504646D1; FI963978A7; EP0754301A1; JPH10503008A; PL316657A1; US5858699A; NO964225D0; NO964225L; BR9507288A; NZ284451A

Abstract

1. Sposób obróbki zawiesin komórek zdolnych do lizy, dajacy stabilizowana zawiesine komórek zachowujacych zdolnosc do lizy, stosowanych zwlaszcza jako material wzorco- wy w jakosciowej kontroli immunofenotypowania leukocytów, protoporfiny cynku, soli kwasu foliowego w krwinkach, w zliczaniu bialych komórek i limfocytów we krwi oraz w monitorowaniu pomiaru cukru u cukrzyków, znamienny tym, ze zawiesine komórek w srodowisku wodnym o pH od 6,5 do 7,5 najpierw poddaje sie dzialaniu starzonego przez okres przynajmniej jednego tygodnia roztworu zwiazku metalu, majacego wlasciwosci kompleksujace i mase atomowa wieksza od 20, utrzymujac przez caly czas pH otrzymanego roztworu w granicach od 6,5 do 7,5 az do wytracenia sie osadu, a nastepnie dodaje sie wodny roztwór paraformaldehydu, utrzymujac pH roztworu w granicach 6,5 do 7,5. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób obróbki zawiesin komórek zdolnych do lizy, dający stabilizowaną zawiesinę komórek zachowujących zdolność do lizy, stosowanych zwłaszcza jako materiał wzorcowy w jakościowej kontroli immunofenotypowania leukocytów, protoporfiny cynku, soli kwasu foliowego w krwinkach, w zliczaniu białych komórek i limfocytów we krwi oraz w monitorowaniu pomiaru cukru u cukrzyków.

Technikami stosowanymi w diagnozie chorób rozrostowych krwi oraz w monitorowaniu procesów chorobowych u pacjentów zainfekowanych wirusem HIV (Human Immunodeficiency Virus) zarówno wtedy, kiedy choroba przebiega bezobjawowo, jak i wtedy, kiedy pacjent narażony jest na cierpienia wywołane ARC lub przy silnym ataku AIDS są mikroskopia w świetle ultrafioletowym i cytometria przepływowa. Kontrola jakościowa (QC) tych dwóch technik jest niezwykle ważna dla prawidłowej diagnozy i kontrolowania skuteczności przyjętych metod leczenia. W stosowanych obecnie metodach kontroli jakościowej używana jest świeżo pobrana krew lub mikrociała pokryte fluorochromem.

Używanie codziennie świeżej krwi jest przy ciągłych zmianach techniki lub wyposażenia bardzo kłopotliwe. Stosowanie mikrociał pokrytych fluorochromem, chociaż pozwala na codzienną kontrolę działania cytometrów przepfywowych, nie może być jednak używane do kontrolowania mikroskopów pracujących w świetle ultrafioletowym. Ponadto, mikrociała nie mogą być stosowane do kontroli jakościowej metodą znaczonych leukocytów. Utrwalanie normalnych leukocytów za pomocą takich związków jak paraformaldehyd, mimo że stabilizuje je przez 5-7 dni, powoduje jednak zwiększenie autofluorescencji komórkowej, uniemożliwiając stosowanie preparatu przez dłuższy czas do kontroli jakościowej. Poza tym liza czerwonych krwinek, przy stosowaniu metody lizy świeżej krwi, wymaga preparatu, który pozwoliłby na jej kontrolę jakościową. Obecnie stosowane metody fiksacji leukocytów są hamulcem takiej procedury lizy, gdyż powodują znaczny wzrost ilościowy pozostałości, które przeszkadzają w przeprowadzeniu testu.

Aparaty do kontroli jakościowej wymagają stosowania próbek świeżej krwi lub produktów krwi do ich kalibracji, przy czym do takich aparatów jak analizatory hematologiczne używa się obecnie utrwalonej kiwi osłów lub indyków, ponieważ źródła stabilizowanej krwi ludzkiej są do tych celów niedostępne. Techniki monitorowanie protoporfiryny cynkowej (ZPP) i folanów czerwonych krwinek także wymagają do celów kalibracji świeżej zawiesiny czerwonych ciałek krwi, gdyż w tym przypadku odpowiednie źródła stabilizowanej krwi są niedostępne. Brak stabilizowanego źródła krwi ludzkiej do celów kalibracyjnych ogranicza również oznaczanie poziomu cukru we krwi przez diabetyków w warunkach domowych.

Z międzynarodowego zgłoszenia PCT, nr WO91/17436, znany jest rozcieńczalnik krwi oraz środek lizujący dla różnicowanego oznaczania krwinek białych (leukocytów), przy stosowaniu jako środka stabilizującego diazolidynylomocznika. Autorzy zgłoszenia nie sugerują stosowania tego typu preparatów leukocytowych do cytometrii przepływowej, najprawdopodobniej z powodu ich niedostatecznej trwałości i braku pewnej, specyficznej aktywności antygenicznej przy rutynowych procedurach kontroli jakościowej, dla oceny których niezbędne są wyniki z dużej liczby laboratoriów.

Z międzynarodowego zgłoszenia PCT, WO92/19951, znane jest zastosowanie diazolidynylomicznika, imidazolidynylomocznika, dimetylo-5,5-dimetylohydantoiny, dimetylomocznika, 2-bromo-2-niiropropano-1,3-diolu i czwartorzędowego adamantanu jako

176 318 utrwalaczy tkankowych nie zawierających aldehydów. Preparaty utrwalające mogą także zawierać sole cynku, wapnia, baru i chromu. W zgłoszeniu brak jest jednak danych odnośnie stabilizujących właściwości tych soli.

Z angielskiego opisu patentowego nr 1563839 znany jest sposób wytwarzania stabilizowanych preparatów zawierających erytrocyty, który polega na poddaniu reakcji zawieśiny erytrocytów w wodnym izotonicznym roztworze, jednocześnie lub kolejno, w dowolnej kolejności, z alifatycznym aldehydem i rozpuszczalną solą dwu lub trójwartościowego chromu. W zamieszczonych przykładach erytrocyty są traktowane formaldehydem i aldehydem glutarowym, a następnie wodnym roztworem chlorku chromu (III).

Okazało się jednak, że zawiesiny krwinek zawierające erytrocyty i traktowane w powyższy sposób, nie nadają się do dłuższego stosowania przy tych metodach, w których stosuje się lizę zdrowej krwi. Dlatego sposób opisany w tym patencie nie może być stosowany do wytwarzania próbek stabilizowanej zdrowej krwi, służącej na przykład do kontroli jakościowej cytometrów przepływowych.

Z angielskiego opisu patentowego nr 2001757 znany jest sposób wytwarzania stabilnej zawiesiny płytek krwi, polegający na dodawaniu do osocza bogatego w płytki jonów chromowych oraz aldehydu. W zamieszczonych w tym opisie przykładach, osocze bogate w płytki krwi traktuje się roztworami dwuchromianu potasu i aldehydu glutarowego. Okazało się jednak, że stosowanie komórek leukocytowych powoduje znacznie zwiększoną autofluorescencję, wskutek czego zawiesina nie nadaje się do stosowania w cytometrii przepfywowej.

Z angielskiego opisu patentowego nr 2279653 znany jest sposób stabilizowania preparatów leukocytowych ze zdrowej krwi poddanej lizie, polegający na dodaniu środka stabilizującego, po czym stabilizowane leukocyty dodawane są ponownie do zdrowej krwi, uprzednio pozbawionej tych leukocytów, w wyniku czego otrzymuje się preparat stabilizowanej zdrowej krwi.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu stabilizacji zawiesiny komórek, zwłaszcza zawiesiny uzyskiwanej ze zdrowej krwi i produktów wytwarzanych z krwi, w celu uzyskania preparatów zachowujących zdolność do lizy i nadających się do zastosowania w kontroli jakości, monitorowaniu, analizie i kalibracji.

Cel ten uzyskano przez poddanie zawiesiny komórek w środowisku wodnym o pH od 6,5 do 7,5 najpierw działaniu starzonego przez okres przynajmniej jednego tygodnia roztworu związku metalu, mającego właściwości kompleksujące i masę atomową większą od 20, utrzymując przez cały czas pH otrzymanego roztworu w granicach od 6,5 do 7,5 aż do wytrącenia się osadu, a następnie dodaje się wodny roztwór paraformaldehydu, utrzymując pH roztworu w granicach 6,5 do 7,5.

W korzystnym wykonaniu wynalazku zawiesina komórek jest preparatem zdrowej krwi.

W innym wykonaniu wynalazku preparat zdrowej krwi otrzymuje się przez połączenie próbek krwi pobranej od różnych dawców.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku do preparatu zdrowej krwi dodaje się inną klasę komórek, przed lub po stabilizacji preparatu zdrowej krwi.

W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku inną klasą komórek są komórki CD34+.

W korzystnym wykonaniu wynalazku dodawanym związkiem metalu jest związek glinu lub związek metalu przejściowego.

W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku dodawanym związkiem metalu jest sól metalu.

W innym korzystnym wykonaniu dodawaną solą metalu jest chlorek glinu.

W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wynalazku dodawaną solą metalu jest chlorek chromu.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku wodny roztwór związku metalu ma pH w granicach od 6,7 do 7,4.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku - związek metalu przechowuje się w postaci stężonego roztworu i przez użyciem rozcieńcza się wodnym roztworem buforowym.

176 318

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku wodny roztwór związku metalu dodawany do zawiesiny komórek ma postać roztworu o stężeniu wagowym od 0,01% do 0,5%.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku zawiesinę komórek poddaje się działaniu wodnego roztworu związku metalu przez okres od 5 minut do 18 godzin w temperaturze od 0°C do 8°C.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku paraformaldehyd dodaje się w postaci wodnego roztworu o stężeniu wagowym od 0,1% do 0,5%.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku pH wodnego roztworu paraiOrmaldehydu mieści się w granicach od 6,7 do 7,4.

W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku przed dodaniem do zawiesiny komórek roztwór paraformaldehydu miesza się ze starzonym wodnym roztworem związku metalu o pH od 6,5 do 7,5, przy czym stosunek związku metalu do paraformaldehydu wynosi od 5:1 do 1:50.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku zawiesinę komórek poddaje się działaniu roztworu paraformaldehydu lub mieszaniny roztworu paraformaldehydu ze starzonym wodnym roztworem związku metalu w czasie od 6 do 24 · godzin, w temperaturze od 0°C do 8°C.

W szczególnie· korzystnym wykonaniu wynalazku odstęp czasu pomiędzy potraktowaniem zawiesiny •komórek starzonym roztworem związku metalu i potraktowaniem tej zawiesiny roztworem paraformaldehydu wynosi od 1 godziny do 24 godzin.

Wynalazek jest poniżej szczegółowo opisany w odniesieniu do otrzymywania preparatów stabilizowanej zdrowej krwi stosowanych do kontroli jakościowej w laboratoriach, przy czym opisany sposób stabilizacji może być wykorzystany do wytwarzania stabilizowanych zawiesin komórek pochodzących z innych źródeł niż krew, na przykład komórek bakterii, komórek roślinnych i podobnych materiałów pochodzących z żywych tkanek.

W niniejszym opisie zawiesina krwinek zdolnych do lizy jest definiowana jako zawiesina komórek takich jak na przykład krwinki zdrowego człowieka, w której specyficzne populacje komórek można selektywnie poddawać lizie stosując erytrocytowe reagenty lizujące. Liza polega na przerwaniu błonki komórkowej i wycieku zawartości krwinki. Reagenty lizujące i warunki selektywnej lizy składnika erytrocytowego zdrowej krwi ludzkiej polegają na przykład na znanym traktowaniu wodnym roztworem soli amonowej, na przykład chlorkiem amonowym lub czwartorzędową solą amoniową i mocznikiem, albo podstawionym mocznikiem lub pochodną mocznika.

Preparaty zdrowej krwi wymienione w poniższym opisie obejmują preparaty zawierające w zasadzie wszystkie składniki świeżej krwi, inne niż plazma.

Sposób otrzymywania stabilizowanej zdrowej krwi składa się z serii etapów, w których stosuje się dodawanie zarówno związków organicznych, jak i nieorganicznych. Początkowy etap, polegający na otrzymaniu porcji krwi, jest dobrze znany specjalistom od wenesekcji.

Korzystne jest stosowanie krwi z dodanym znanym środkiem przeciwkrzepliwym, na przykład solą potasową kwasu etylenodiaminoczterooctowego.

Proces stabilizowania próbki zdrowej krwi prowadzi się zwykle w ciągu 24 godzin, a korzystnie w ciągu 2 godzin po wenesekcji.

Świeżą zdrową krew, zawierającą środek przeciwkrzepliwy, poddaje się najpierw wirowaniu, oddzielając i zachowując otrzymane osocze. Pozostałe krwinki przemywa się i następnie traktuje starzonym wodnym roztworem związku metalu, zwłaszcza roztworem soli metalu ciężkiego, o właściwościach kompleksujących i o ciężarze atomowym większym od 20, na przykład glinem albo też metalu przejściowego, na przykład chromu lub manganu. Do związków metali ciężkich należą również sole kwasów nieorganicznych, zwłaszcza chlorki.

Szczególnie dobre wyniki uzyskuje się stosując do tego celu sole chromowe lub glinowe, na przykład chlorek chromu CrCł? lub chlorek glinu AICI3.

Związek metalu ciężkiego rozpuszcza się w wodzie, przy czym roztwór wodny jest buforowany do pH od 6,4 do 7,5, korzystnie od 6,5 do 7,4, zwłaszcza około 7,2, i poddaje

176 318 starzeniu w czasie potrzebnym, do wytrącenia się osadu. Jako wodne roztwory buforowe można stosować na przykład fosforanowe roztwory buforowe.

Korzystne jest przechowywanie związku metalu ciężkiego w postaci stosunkowo stężonego roztworu, na przykład 1% wagowo, rozcieńczając· go przed użyciem do pożądanego stężenia wodnym roztworem buforowym. Stwierdzono, że stężone roztwory metali ciężkich są trwałe ale wraz z ich rozcieńczeniem i wzrostem pH występuje wytrącanie się osadu. Z tego powodu, roztwór powinien być trzymany przed użyciem przez odpowiednio długi czas, w którym ulega on starzeniu i wytrąceniu osadu. Dla związków metali ciężkich okres ten wynosi jeden tydzień, a korzystnie do jednego miesiąca przed użyciem. Prawdopodobną przyczyną skuteczności korzystnego dłuższego czasu starzenia roztworu jest wytwarzanie się uwodnionych metalicznych układów hydroksyjonowych w roztworze. Zauważono na przykład, że świeżo przygotowane niektóre buforowe roztwory związków chromu w czasie 24 godzin zmieniają barwę z zielonej na purpurową, co wskazuje na obecność odbarzonych ładunkiem jonów kompleksowych. Równocześnie następuje wytrącanie się osadu utworzonego prawdopodobnie ze spolimeryzowanych hydroksy związków chromu, wskutek czego przed użyciem należy roztwór przesączyć w celu usunięcia tych osadów. Ponieważ utworzone osady obniżają stężenie jonów metalu ciężkiego w roztworze, należy przed użyciem przeprowadzić jego analizę w celu określenia czy stężenie związku metalu ciężkiego mieści się w żądanym zakresie. Starzony roztwór związku metalu ciężkiego zachowuje skuteczność działania przez długi czas, przynajmniej 6 miesięcy, a niekiedy cały rok.

Korzystne jest dodawanie do preparatu zdrowej krwi wodnego izotonicznego roztworu związku metalu ciężkiego, w którym optymalne końcowe stężenie wagowe związku metalu ciężkiego jest mniejsze niż 1%, korzystnie zawarte jest w granicach od 0,0005% do 0,75%, a najkorzystniej - w granicach od 0,05% do 0,25% i wynosi na przykład 0,1%. Stężenie jonów wodorowych pH wodnego roztworu przed jego dodaniem wynosi od 6,5 do 7,5, a korzystnie od 6,7 do 7,4. Czas inkubacji preparatu zdrowej krwi z dodanym związkiem metalu ciężkiego wynosi korzystnie od 5 minut do 18 godzin, na przykład około 60 minut.

Temperatura inkubacji wynosi od 0°C do 8°C, korzystnie od 2°C do 6°C, na przykład około 4°C.

Po pierwszym okresie inkubacji zdrową krew traktuje się wodnym roztworem paraformaldehydu, którego końcowe stężenie wagowe wynosi poniżej 1%, a korzystnie od 0,1% do 0,5%, na przykład 0,35%. Przygotowując roztwór paraformaldehydu utrzymuje się temperaturę poniżej 60°C, korzystnie poniżej 50°C, a to w celu uniknięcia rozkładu paraformaldehydu do formaldehydu i wydzielania się kwasu mrówkowego. Ważnym parametrem jest czas starzenia roztworu paraformaldehydu, który winien być zawarty w okresie od 1 tygodnia do 1 miesiąca, a korzystnie około 2 tygodni.

Bardzo dobre-wyniki uzyskuje się przez zmieszanie paraformaldehydu w roztworze wodnym ze starzonym wodnym roztworem związku metalu ciężkiego.

Do tego celu stosuje się opisany poprzednio starzony wodny roztwór metalu ciężkiego o stężeniu wagowym związku metalu ciężkiego wynoszącym od 0,01% do 0,5%. Stosunek związku metalu ciężkiego do paraformaldehydu wynosi od 5:1 do 1:50, korzystnie około 1:3,5.

Stężenie jonów wodorowych pH wodnego roztworu paraformaldehydu wynosi od

6,5 do 7,5, korzystnie od 6,7 do 7,4, przy czym roztwór może zawierać bufor izotoniczny, na przykład 0,85% fosforowy roztwór buforowy. Roztwór zmieszanego paraformaldehydu ze związkiem metalu ciężkiego otrzymuje się na przykład przez zmieszanie roztworu paraformaldehydu o stężeniu wagowym 0,7% z taką samą objętością roztworu metalu ciężkiego o stężeniu wagowym 0,2%.

Czas kontaktowania się zdrowej krwi z paraformaldehydem lub mieszanym roztworem wynosi od 6 do 24 godz. W temperaturze od 0°C do 8°C, korzystnie od 2°C do 6°C, na przykład około 4°C.

Przerwy między pierwszym i drugim etapem obróbki wynoszą co najmniej 30 minut, a korzystnie od 1 do 24 godz.

176 318

Uprzednio wyodrębnione osocze, pochodzące korzystnie z pierwotnego źródła, może być po umyciu w izotonicznym fosforanowym roztworze buforowym z powrotem dodane do stabilizowanego preparatu zdrowej krwi. Korzystne jest również dodawanie do finalnego preparatu inhibitorów wzrostu bakterii i antybiotyków, na przykład gentamycyny, przy czym preparat ten utrzymuje się przez 1 do 5 dni przed jego użyciem w temperaturze od 0°C do 8°C.

Wszystkie opisane wyżej operacje korzystnie jest przeprowadzać w warunkach sterylnych, na przykład w zbiorniku wenesekeyjnym, w którym zgromadzona jest krew od krwiodawców.

W przypadku wytwarzania preparatu stabilizowanej zdrowej krwi według wynalazku na skalę handlową, korzystne jest utworzenie magazynu stabilizowanej krwi zebranej z różnych źródeł. Można na przykład do normalnej zdrowej krwi dodać dodatkowe krwinki CD34+ w formie linii krwinkowej KG1 lub ludzką krew pępowinową (która jest bogata w krwinki CD34+), otrzymując w ten sposób wzorzec jakościowy do pomiarów krwinek CD34+.

Opisany sposób stabilizowania można stosować zarówno do krwinek normalnych, jak białaczkowych, uzyskując w ten sposób znaną specjalistom kontrolę normalną i nienormalną (przy białaczce). Stwierdzono, że najlepsze wyniki uzyskuje się używając, przy krwinkach normalnych, jako związku metalu ciężkiego chlorku chromu, zaś przy krwinkach białaczkowych - chlorku glinu.

Sposób stabilizowania preparatów zdrowej krwi ludzkiej według wynalazku nie przewiduje konieczności lizy czerwonych krwinek (erytrocytów) i oddzielnego stabilizowania leukocytów.

Preparaty stabilizowanej zdrowej krwi według wynalazku są doskonałym, trwałym materiałem do kontroli jakościowej, służąc jako wzorzec stosowany przy liczeniu i rozróżnianiu leukocytów, zarówno za pomocą mikroskopu w świetle ultrafioletowym, jak i cytometrii przepływowej. Preparaty te mogą być również stosowane do kontroli jakościowej przy rozpuszczaniu zdrowej krwi, nie powodując zanieczyszczenia produktami rozkładu. Stabilizowana próbka może zawierać wszystkie normalne leukocyty krwi obwodowej (granulocyty, monocyty i limfocyty) lub ich podklasy. Zastosowana procedura może, w optymalnych warunkach, umożliwiać zapamiętywanie profilów antygenowych leukocytów, fenotypowanie i kontrolę jakościową. Można także oznaczać wartości powszechnych' determinantów antygenowych, które nie ulegają zmianie przez ponad 300 dni. Badacze mogą również wyznaczyć wartości pochodne dla przeciwciał, będące przedmiotem ich szczególnego zainteresowania. Poza tym preparat można wykorzystać do analizy jakościowej zróżnicowania leukocytów, przeprowadzanego metodą cytometrii przepływowej. Zróżnicowanie leukocytów jest parametrem analizowanym przy monitorowaniu terapii antywirusowej u osobników zainfekowanych wirusem HIV.

Nowe sposoby fenotypowania próbek krwi, określane terminami bez mycia lub 'bez lizy, nie wymagają ich traktowania, po jej barwieniu, środkiem lizującym. Preparaty zdrowej krwi według wynalazku można stosować do jakościowej kontroli tych metod, jak również do cytometrów przepływowych analizujących również metodami bez mycia lub bez lizy.

Ogólnie, preparaty stabilizowanej zdrowej krwi według wynalazku można wykorzystywać do kontroli jakościowej w mikroskopii w świetle ultrafioletowym, do immunofenotypowania z użyciem cytometrów przepływowych zarówno w metodzie z lizą zdrowej krwi, jak i bez lizy.

Badania prowadzone z użyciem preparatów stabilizowanej zdrowej krwi według wynalazku wykazują także możliwość ich stosowania w analizie immunocytochemicznej z użyciem techniki alkalicznej fosfatazowej, anty-alkalicznej fosfatazowej oraz immunocytochemicznej (APAAP), iak również do wyznaczania profilu antygenowego leukocytów na wymazach krwi obwodowej.

176 318

Preparaty stabilizowanej zdrowej krwi według wynalazku mogą także służyć jako wzorce codzienne lub wzorce do zewnętrznej (międzylaboratoryjnej) kontroli jakościowej.

Rozmazy wielokrotne można robić z wyprzedzeniem i następnie przetrzymywać je w temperaturze -20°C aż do momentu użycia. Rozmazy można również codziennie zabarwiać lub używać jako wzorców do barwienia innych rozmazów. Preparaty stabilizowanej zdrowej krwi według wynalazku mogą również znaleźć zastosowanie jako wzorcowe materiały odniesienia w metodach wykorzystujących próbki enzymu związanego z immunosorbentem (ELISA) oraz w metodach immunoradiometiycznych.

Dalsze zastosowanie preparatów stabilizowanej zdrowej krwi według wynalazku w pracy laboratoryjnej obejmuje również kontrolę jakościową i kalibrację analizatorów hematologicznych oraz użycia ich jako materiałów odniesienia w kontroli jakościowej przy monitorowaniu deficytu żelaza metodą z protoporfiryną cynkową (ZPP), a także jako materiałów do kontroli jakościowej techniki z solami kwasu foliowego krwinek czerwonych. Mogą one również znaleźć zastosowanie w kontroli jakościowej testów poziomu glukozy we krwi, umożliwiając zastosowanie tej techniki przez cukrzyków w warunkach domowych.

Przykład 1. Preparat stabilizowanej zdrowej krwi otrzymano opisanym poniżej sposobem, a własności jego starzenia porównano z podobną nie obrobioną próbką zdrowej krwi.

Sposób wytwarzania: 500 ml krwi z wenesekcji spuszczono na sterylny tampon zawierający 600 mg soli disodowej lub tripotasowej kwasu etylenodiaminoczterooctowego rozpuszczonej w 50 ml fosforanowego roztworu buforowego (PBS), przy czym wirowano ją z prędkością 800 obr./min. przez 1 godzinę, a następnie usunięto i zachowano otrzymane osocze. Pozostałe krwinki dwukrotnie przemyto sterylnym fosforanowym roztworem buforowym (PBS), a sklarowaną ciecz (PBS) usunięto znad osadu. Następnie dodano 300 ml przesączonego 0,1%, starzonego (przed ponad 1 miesiąc) sześciowodnego chlorku chromu (pH=6,7) w PBS i otrzymaną ciecz poddano inkubacji przez 1 godzinę, w ciemności, w temperaturze 4°C, stosując okresowe mieszanie, po czym wirowano ją przez 45 minut z prędkością 800 obr./min. i zdekantowano roztwór znad osadu. Powtórnie zawieszono pozostałość w 300 ml starzonego (przed ponad 1 miesiąc) przesączonego 0,1% roztworu sześciowodnego chlorku chromu (pH=6,7) w 0,35% paraformaldehydzie w PBS i całość inkubowano w temperaturze 4°C w ciemności przez 16 do 22 godzin, po czym wirowano ją przez 45 minut z prędkością 800 obr./min. i zdekantowano ciecz znad osadu. Osad przemyto dwukrotnie PBS stosując wirowanie z prędkością 800 obr./min., po czym zdekantowano ciecz znad osadu. Powtórnie zawieszono stabilizowaną zdrową krew w osoczu i postępowano tak jak w poprzednim etapie, po czym dodano antybiotyki o szerokim spektrum działania, takie jak gentamycyna, ciprofloxacin. Preparat trzymano w temperaturze -4°C na 2-3 dni przed użyciem.

Fosforanowy roztwór buforowy pH 7,2 zawiera:

7,38 g/l chlorku sodu

0,36 g/l soli disodowej kwasu etylenodiaminoczterooctowego (EDTA)

0,28 g/l chlorku potasu

0,26 g/l ortofosforanu jednopotasowego (jednozasadowego)

2,35 g/l disodowego wodorofosforanu (dizasadowego)

Wyniki porównawcze zilustrowano na załączonym rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia charakterystyki pomiarów w cytometrz.e przepywowym świeżej'’ krwi po barwieniu dla przeciwciał CD3, CD4, CD8 i CD20, przy czym barwienie przeprowadzono techniką lizy świeżej krwi i powiązano poziomy pozytywne z negatywnymi poziomami kontrolnymi, uzyskując obraz rozproszenia czołowego i bocznego (FSC&SSC) (a), CD3 PE i CD20 FITS (b), CD3 FITC i CD4 PE (c) i CD3 FITC i CD8 PE (d); fig. 2 - zależność pomiędzy starzeniem a właściwościami cytometrycznymi FSC i SSC świeżej niestabilizowanej krwi przez 8 dni: (a) dzień 1, (b) dzień 2, (c) dzień 3, (d) dzień 8; fig. 3a i 3b - wpływ starzenia na wyrazistość antygenów opisanych na fig. 1b, c oraz d w ciągu 10 dni: 3a (i), (ii), (iii) dzień 1 oraz 3b (i), (ii), (iii) dzień 10, fig. 4a i 4b - stabilność FSC, SSC i negatywne wyniki

176 318 kontrolne określone techniką cytometrii przepływowej dla preparatu stabilizowanej zdrowej krwi przez okres 60 dni: 4a - 3 dnia, 4b - 60 dnia; fig. 5a i 5b - stabilność antygenów CD3, CD4, CD8, CD19 i CD16 + CD56, mierzoną techniką cytometrii przepływowej przez okres 57 dni: 5a - 3 dnia, 5b - 60 dnia; fig. 6 - wpływ przechowywania świeżej krwi przez 8 dni na zróżnicowanie leukocytów za pomocą cytometru przepływowego FACScan, przy czym dalsza analiza po 8 dniu nie była możliwa z powodu wyraźnego pogorszenia się próbki; fig. 7 - wpływ czasu na stabilność zróżnicowania leukocytów za pomocą cytometru przepływowego FACScan dla preparatu stabilizowanej krwi przez okres 25 dni; fig. 8 stabilność poziomu protopoffiryny cynkowej (ZPP) w próbie preparatu stabilizowanej zdrowej krwi przez okres 36 dni, mierzony w ^molach ZPP/mol hemoglobiny; fig. 9 stabilność całkowitej liczby białych ciałek krwi i całkowitej ilości limfocytów przez okres 117 dni w próbce preparatu stabilizowanej zdrowej krwi, mierzoną za pomocą analizatora hematologicznego Toa (Sysmex) NE8000, a fig. 10 - wyniki pomiaru soli kwasu foliowego czerwonych krwinek dla próbki preparatu stabilizowanej zdrowej krwi i zapasu świeżej zdrowej krwi przez okres 50 dni.

Figura 1 przedstawia obraz uzyskany z pomiaru wykonanego za pomocą cytometru przepływowego, ilustrujący normalną pozycję limfocytów, monocytów i granulocytów po lizie czerwonych krwinek. Na fig. 1b, c, d i e pokazano także obrazy uzyskane dla barwionych antygenów. Obrazy otrzymane za pomocą cytometru przepływowego i wyrazistość antygenowa zmieniają się wraz z czasem życia próbki (fig. 2). Ósmego dnia ilość produktów rozkładu uniemożliwiała przeprowadzenie analizy. Stwierdzono również pogorszenie własności fluorescencyjnych znaczonych próbek (fig. 3).

Figura 4 przedstawia wyniki rozpraszania bocznego i przedniego razem z negatywnym wynikiem kontroli stabilizowanej próbki w dniu 3 i 60. Indywidualne populacje zostały zachowane w ich odpowiednich pozycjach, w jakich się znajdowały po stabilizacji próbki. Po 60 dniach zabezpieczenia - obrazy rozproszenia bocznego i przedniego, uzyskane za pomocą cytometru przepływowego, pozostały takie same (fig. 4b). Ponadto wyrazistość antygenów w ciągu tego okresu pozostała nie zmieniona (fig. 5). Pomiary wykonano przy zachowaniu takich samych parametrów aparaturowych.

Stabilizowany preparat krwi można stosować przy kontrolowaniu zróżNicowania leukocytów. Używając specyficznej kombinacji przeciwciał, skierowanych przeciwko antygenom CD14 i CD45, można uzyskać zróżnicowanie na trzy grupy. Figura 7 pokazuje stabilność tego parametru w ciągu 25 dni, a fig. 6 - Niestabilność tego zróżnicowania dla świeżej zdrowej krwi w ciągu 8 dni. Wyniki analizy świeżej zdrowej krwi, uzyskane po 8 dniach, z powodu zanieczyszczenia produktami rozkładu zostały pominięte.

Jak pokazano na fig. 8, poziom ZPP w preparacie stabilizowanej zdrowej krwi pozostał zasadniczo nie zmieniony, wykazując tylko niewielki wzrost po 36 dniach. Podobnie jak pokazano na fig. 9, całkowita liczba białych ciałek i całkowita liczba limfocytów zależą jedynie w niewielkim stopniu od czasu, co stwierdzono w wyniku pomiaru po 117 dniach.

Figura 10 pokazuje, jak bardzo polepszyła się stabilność soli kwasu foliowego czerwonych krwinek w preparacie stabilizowanej zdrowej krwi.

Przykład 2. Preparat stabilizowanej zdrowej krwi otrzymano sposobem opisanym w przykładzie 1 z tą różnicą, że reakcję z sześciowodnym chlorkiem chromu i paraformaldehydu prowadzono w fosforanowym roztworze buforowym o pH 7,2.

Figura 11 przedstawia wyniki oznaczenia stabilności przesunięcia bocznego (SSC) i przedniego (FSC) (fig. 11a) oraz negatywne wyniki kontroli (fig. 1Tb), uzyskane metodą cytometrii przepływowej dla preparatu stabilizowanej zdrowej krwi w 11 dni po stabilizacji. Figura 12a, b i c przedstawia wyniki oznaczenia stabilności antygenów CD3, CD4, CD8 i CD 19, uzyskane metodami cytometrii przepływowej w 11 dni po stabilizacji.

Figura 13a i b przedstawia wyniki oznaczenia stabilności przesunięcia bocznego (SSC) i przedniego (FSC) oraz negatywnej kontroli, uzyskane metodą cytometrii przepływowej dla preparatu stabilizowanej zdrowej krwi w 29 dni po stabilizacji. Na figurze 14a, b i c

176 318 pokazano wyniki oznaczenia stabilności antygenów CD3, CD4, CD9 i CD19, uzyskane metodą cytometrii przepływowej w 29 dni po stabilizacji.

Przykład 3. Preparat stabilizowanej zdrowej krwi otrzymano sposobem opisanym w przykładzie 1 z tą różnicą, że zamiast sześciowodnego chlorku chromu użyto sześciowodnego chlorku glinu, a reakcję z chlorkiem glinu lub mieszaniną chlorku glinu i paraformaldehydem prowadzono przy pH 7,2.

Figura 15 a i b przedstawia wyniki oznaczenia stabilności przesunięcia bocznego (SSC) i przedniego (FSC) oraz charakterystykę negatywnej kontroli, uzyskane metodą cytometrii przepływowej dla preparatu stabilizowanej zdrowej krwi w 11 dni po stabilizacji. Figura 16 a, b i c przedstawia wyniki oznaczenia stabilności antygenów CD3, CD4, CD8 i CD19, uzyskane metodą cytometrii przepływowej w 11 dni po stabilizacji. Figura 17 a i b przedstawia wyniki oznaczenia stabilności przesunięcia bocznego (SSC) i przedniego (FSC) oraz charakterystykę negatywnej kontroli, uzyskane metodą cytometrii przepływowej dla preparatu stabilizowanej zdrowej krwi w 29 dni po stabilizacji. Na figurze 18a, b i c pokazano wyniki oznaczenia stabilności antygenów CD3, CD4, CD9 i CD 19, uzyskane metodą cytometrii przepływowej w 29 dni po stabilizacji.

Otrzymane wymki wskazują na bardzo dobrą stabilizację preparatu zdrowej krwi przy bardzo małej ilości produktów rozkładu nawet po 29 dniach, jak również dobrą retencję cech antygenicznych.

176 318 krwinki typ

W

CD3-/CD19*

CD3*/CD19*

CD3-/CD19CO3*/CD19LL korekcja

JLL korekcja

CD3

Liczba bramkowana . 2661

Liczba sumaryczna : 1ΘΘΘΘ

01 CD3/CD19	5 ok
02 CD3/C019	Θ ok
03 CD3/CD19	14 ok
04 CD3/CD19	81 ok

FIG

18a cn

·.·«!
W

CD 3

Liczba bramkowana : 25Θ7

Liczba sumaryczna : 1ΘΘΘΟ

	krwinka typ		korekcja
		LL
1	CD3-/CD4*	5
2	CD3+/CD4*	43
3	CD3-/CD4-	13
4	CD3+/CD4-	39	X ιΛ°
Q1	CD3/CD4		5 ok
02	CD3/CD4		43 ok
03	CD3/CD4		13 ok
04	CD3/CD4		39 ok

FIG

18b

Cl] krwinka typ Korekcja

Liczba

CD3-/CD8*

CD3+/CD8*

C03-/CD8CD3+/CD8LL

CD 3 bramkowana : sumaryczna .

01 CD3/CD8	3 ok
02 CD3ZCD8	39 ok
03 CD3/CD8	15 ok
04 CD3/CD8	43 ok

korekcja

2475 loeee

FIG 18c

176 318

UJ

Γ5Γ

Liczba bramkowana Z 3750 Liczba sumaryczna Z15000 korekcja kwadrantowa:Tak

FIG I7a tu


——

Liczba bramkowana . 2597

Liczba sumaryczna

krwinka typ	korekcja
ŁL
HSS PE	0
NSS **	0 100 tiicb&frftone.
HSS FIK	0

FIG

17b

176 318

Liczba bramkowana : 243»?

Liczba sumaryczna . joino krwinki /mm

FIG 16a krwinka typ

CU

ŁL

718

238

668 ok ok 14 ok 48 ok

Liczba sumaryczna

FIG

16b korekc^a krwinka typ

233

1348 korekcja ok 8 ok 14 ok 32 ok

X krwinki/mm korekcja <n c

(-!

, ·»· ’ ?· Λ, ·
	W

CD 3

603-/608»

6D3-/6D8CD3-/CD8603-/6D8LL·

668

288

668 krwinki/mm' korekcja

81 603'6K	3 ok
•32 C03/CDS	48 ok
•13 603/603	17 ok
14 6D3/603	48 ok

Liczba bramkowana Liczba sumaryczna

2583

FIG

16c

176 318

Cii

r - FSC.

Liczba bramkowana : 3511

Liczba sumaryczna :

i

Korekcja kwadrantowa : Tak

FIG 15a krwinka tyD

Cii

Liczba sumaryczna: JO»My

N33 Fi NSS *··

NSS FtTC

Korekcja

LL o

Θ

103 l&W

Θ

Krwinki / mm' niebarwione

FIG

15b

176 318 tn krwinka typ

-- IL·

Korekcja

Q4 CD3/CD19

2257

JLL

Korekcja

Liczba

Liczba ok θ ok 14 ok 81 ok

Liczba bramkowana sumaryczna

FIG

14a krwinki typ

LL korekcja

Cl]

bramkowana. ,

JLL 3 ok 42 ok 16 ok 39 ok

CD3/CD4

FIG

14b krwinka typ

LL·

Korekcja tu

; [_ Korekcja ok 39 ok 15 ok 43 ok

C03/CD8

Liczba bramkowana : 2885

Liczba sumaryczna : 8808

FIG

14c

176 318

Cl]

Liczba bramkowana .· 4126

Liczba sumaryczna: 1500Θ

korekcja kwadrantowa: Tak

FIG 13a [13

Liczba bramkowana _; 2147

Liczba sumaryczna . θθθθ korekKrwinka typ^c^^a

- _ LL.

NSS PE 0

NSS ♦♦ O

Ιθθ niebarwione NSS F1TC Θ

FIG 13b

176 318 korekCD 19

C13

.· 1·’ .

CD 3

krwinka typ	c ja Lk_	krwinki
1 C03-/CD19*	5	“ 70
2 C03-/C019··	0	0
3 CD3-/C019-	13	190
4 CD3*-/CD19-	82	1210
		Korekty
Poziom	X L
01 C03/C01?		5 ok
02 C03/CD19		0 ok
03 CD3/C019		13 ok
04 CD3/CD19		82 ok

FIGURĘ 12a krwinka typ korekcja

Łk_ krwinki /mm'

11J

650

210

580

Korekcja ok ok 14 ok 39 ek

FIGURĘ 12b krwinka typ korekcja krwinki /mm' in

5000

560

220

640

Corr korekcja ok ok 15 ok 43 ok

Liczba Liczba sumaryczna

HG

12c

176 318

C1J

rsc

Liczba bramkowana : *245

Liczba sumaryczna : 15008

korekcja kwadrantowa : Tak

FIG 11a cu krwinki typ

NSS PE

NSS ♦♦ niebarwione

NSS FITC korekcja

2_L_ <3 β

188 β krwinki./mm^

1488

Liczba bramkowana _: 2288

Liczba sumaryczna . 3θ<χι

FIG 11b

176 318

Porównanie w okresie 50 dni stabilizowanej zdrowej krwi i zapasu świeżej zdrowej krwi stosując folate czerwonych krwinek

(AOd bu) ąaupftją ąoKuoftjazo eąe-[oj

176 318

Stabilność całkowitej liczby białych krwinek i limfocytów w okresie 117 dni w stabilizowanej zdrowej krwi

z

Q

Os cń ii176 318

Poziomy protoporfiryny cynkowej (ZPP) w próbce stabilizowanej zdrowej krwi

ddZ Krnorzod

OO ó

iZ

176 318

Stabilność zróżnicowania leukocytów według cytometrii przepływowej oznaczona w okresie 25 dni c

co o

CO ω

Lp

C

O

CO c

•r-ł λ;

o

Q i

C

O

-P o

Φ

CQ

Φ

Ή

O

CO

U (0 o«

CO

CO c:

o c

o ♦H £2

O u

OP

N

CO

C

ł osoąaefl

Dni cn

LU

176 318

ZDROWA KREW

1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8

DNI

-X- LIMFOCYTY

-6- MONOCYTY

GRANULOCYTY

Fig.6.

176 318

Korekcja Krwinka/Typ %[_

ON τ~ α

-j· α

<_j oo α


	JL.
CD3
. w. '2?.
	W:
CD3
	< -.te · »· · % ,
	^Ł

CD3

CD3-/CD19+

CD3YCD19*

CD3-/CD1912

CD3+/CD19- 72

Korekcja

Krwinka/Typ

1	CD3-/CD4*	3
2	C03<£D4+	48
3	CD3YCD4-	25
4	CD3YCD4-	24

Fig. 5 b

Korekcja

Krwinka/Typ ί ĆD3<D8+ —5

CD3*/CD8* 23

CD37CD8- 23

CD3O8- 49

Korekcja

Krwinka/Typ o£|_ ~ C03-16J56* “Ϊ5 CD3+16 56* 2

CD3-1C56- 13 CD3*16.56- 70

176 318

Korekcja

Krwinka/Typ

CD3-/ĆD19+ ~ΐΓ

CD37CD19+ 0

CO3-/CD19- 15

CO3*/CD19- 73

Korekcja

\| « z·.
if

CD3

Krwinka/Typ	%L
CD3-ĆD4+	A·
CDMD4*	49
CD37CD4-	23
CD37CD4-	24

Krwinka/Typ

CD3-£D8+

CD3+/CD8*

CD37CD8CO3<D8Korekcja -2ÓL.

Fig.Sa

Korekcja Krwinka/Typ y

C03-16_56+

CD3*16_56+

CD3-16.56CD3*lC56α

UJ

176 318

Korekcja

Krwinka/Typ Krwinki/mm +

ΚΊ s° c*o os

Φ c

o •H

U

CO <D •H c

u.

υη on z:

3-DiuiuDg ΰ

cm

LU

Ή

X c

Ή

U a»

O O CA O O

Φ

Cu C £1 ·ί£ ίτϊ; ϊζ

-* tOtO 5 LO .5 » -H i c s«i

3-DuuuDg _a <fcn

LU

O\	O
r*	o
vn	o
m	tn

• ·
(0	ίϋ
LJ C	C
to 2	N
“ o	U >>
Od	U
β	<0
to	S
L	P
40	w
(0	co
40	43
N	N
o	O
‘H	H
J	J

DSS

In §

2° tn

LJ- 2	to
Zs	c N 0
0	>>
X	L
a	to
tfl	s
L	3
40	to
tO	(0
40	40
N	N
O	O
•H	H
J	J

176 318

I ·> .·.	•

CD3

Krwinka/Typ

CDEh/cbi⁷

CDSYCD3+ negatywne

CD8-/CD3*

Korekcja %L

Fig. 3 q{ iii)

CD3

Krwinka/Typ β/θρ
CD8+/CD3-	9
CD8+/CD3+	13
negatywne	48
CD8-/CD3*	30

Fig.3b(iii)

176 318

DAKO CD3

1 ¹ ^T<··

nie specyficzne Q negatywne 23

B-Limfocyty 12

Korekcja Krwinka/Typ %

T-Limfocyty 65

DAKO CD 20

Fig.3a(i) m O I—I

O

X <

O

··’··

DAKO CD 20

Krwinka/Typ L T-Limfocyty 41 ie specyficzne 6 negatywne B-Limfocyty 13

Fig.3b (i)

Fig.3a(i i)

Krwinka/Typ ~ CD4+/CDl·CD3VCD4+ negatywne CD3+/CD4Korekcja r«i

Krwinka/Typ οςρ

-ίο

¹ ‘I	w ;>·^·

CD4*/ED3CD3+/CD4+ negatywne

CD3*/CD44

CD3

Fig.ab(ii)

176 318

FSC

Liczba bramkowana ; 3646

Liczba sumaryczna : 15000

Fig.2a.

. FSC

Liczba bramkowana ; 2409

Liczba sumaryczna · 15000

Fig.2 b.

FSC.

Liczba bramkowana ; 3149

Liczba sumaryczna 15000

Fig.2c.

FSC

Liczba bramkowana : 7289

Liczba sumaryczna : 50000

Fig.2d.

176 318

\ * ·

CD3

Liczba bramkowana ; 2396

Liczba sumaryczna ; 10000

Korekcja

	Krwinka/Typ	%L	krwinkom**»
1	CD4+/CD3-	2	30
2	CD3VCD4+	18	310
3	negatywne	8	140
4	CD3+/CD4-	71	1210

Fig.1 c.

	Krwinka/Typ	Korekcja %L	Krwink
1	CD8+/CD3-	3	50
2	CD8+/CD3*	71	1210
3	negatywne	7	120
4	CD8-/CD3+	19	320

oo

O

CD3

Fig.ld.

176 318

FSC

Liczba bramkowana . 364-6

Liczba sumaryczna : 15000

Korekcja kwadratowa Tak

Fig. 1 q.

	Krwinka/Typ	% L Korekcja	krwinki/»
1	CD3+/CD20-	89	1510
2	CD3+/CD20+	2	30
3	CD3-/CD20-	7	120
4	CD3-/CD20-	2	30

Leu 16

Liczba bramkowana Liczba sumaryczna

CD20

2271

10000

Fig.lb.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób obróbki zawiesin komórek zdolnych do lizy, dający stabilizowaną zawiesinę komórek zachowujących zdolność do lizy, stosowanych zwłaszcza jako materiał wzorcowy w jakościowej kontroli immunofenotypowania leukocytów, protoporfiny cynku, soli kwasu foliowego w krwinkach, w zliczaniu białych komórek i limfocytów we krwi oraz w monitorowaniu pomiaru cukru u cukrzyków, znamienny tym, że zawiesinę komórek w środowisku wodnym o pH od 6,5 do 7,5 najpierw poddaje się działaniu starzonego przez okres przynajmniej jednego tygodnia roztworu związku metalu, mającego właściwości kompleksujące i masę atomową większą od 20, utrzymując przez cały czas pH otrzymanego roztworu _ w granicach od 6,5 do 7,5 aż do wytrącenia się osadu, a następnie dodaje się wodny roztwór paraformaldehydu, utrzymując pH roztworu w granicach 6,5 do 7,5.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiesina komórek jest preparatem zdrowej krwi.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że preparat zdrowej krwi otrzymuje się przez połączenie próbek krwi pobranej od różnych dawców.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do preparatu zdrowej krwi dodaje się inną klasę komórek, przed lub po stabilizacji preparatu zdrowej krwi.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że inną klasą komórek są komórki CD34+.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodawanym związkiem metalu jest związek glinu lub związek metalu przejściowego.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodawanym związkiem metalu jest sól metalu.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dodawaną solą metalu jest chlorek glinu.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że dodawaną solą metalu jest chlorek chromu.
10. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że wodny roztwór związku metalu ma pH w granicach od 6,7 do 7,4.
11. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że związek metalu przechowuje się w postaci stężonego roztworu i przez użyciem rozcieńcza się wodnym roztworem buforowym.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wodny roztwór związku metalu dodawany do zawiesiny komórek ma postać roztworu o stężeniu wagowym od 0,01% do 0,5%.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiesinę komórek poddaje się działaniu wodnego roztworu związku metalu przez okres od 5 minut do 18 godzin w temperaturze od 0°C do 8°C.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że paiaformaldehyd dodaje się w postaci wodnego roztworu o stężeniu wagowym od 0,1% do 0,5%.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że pH wodnego roztworu paraformaldehydu mieści się w granicach od 6,7 do 7,4.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed dodaniem do zawiesiny komórek roztwór paraformaldehydu miesza się ze starzonym wodnym roztworem związku metalu o pH od 6,5 do 7,5.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że stosunek związku metalu do paraformaldehydu wynosi od 5:1 do 1:50.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiesinę komórek poddaje się działaniu roztworu paraformaldehydu lub mieszaniny roztworu paraformaldehydu ze

176 318 starzonym wodnym roztworem związku metalu w czasie od 6 do 24 godzin, w temperaturze od 0°C do 8°C.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odstęp czasu pomiędzy potraktowaniem zawiesiny komórek starzonym roztworem związku metalu i potraktowaniem tej zawiesiny roztworem paraformaldehydu wynosi od 1 godziny do 24 godzin.