PL176690B1 - Sposób oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami w plazmie lub surowicy ludzkiej krwi - Google Patents

Abstract

Sposób oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami w plazmie lub surowicy ludzkiej krwi, umożliwiający wykrywanie raka u ludzi i monitorowanie postępu tej choroby, polegający na rozcieńczeniu wodą próbki plazmy lub surowicy, wymieszaniu, ekstrakcji mieszaninąchlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego oraz na pomiarze intensywności zabarwieniawytworzonego przez dodanie odczynnika tworzącego w podwyższonej temperaturze barwny kompleks z kwasem sialikowym wyekstrahowanym do fazy organicznej, znamienny tym, że stosunek objętościowy składników mieszaniny ekstrakcyjnej zawierającej niższy węglowodór alkilowy i niższy alkohol alkilowy wynosi około 1:1, przy czym reakcję tworzenia zabarwienia z kwasem sialikowym przeprowadza się bezpośrednio w fazie organicznej, powstającej podczas ekstrakcji kwasu sialikowego z rozcieńczonej próbki plazmy lub surowicy:

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami w plazmie lub surowicy ludzkiej krwi, umożliwiający wykrywanie raka u ludzi i monitorowanie postępu tej choroby, polegający na rozcieńczeniu wodą próbki plazmy lub surowicy, wymieszaniu, ekstrakcji mieszaniną chlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego oraz na pomiarze intensywności zabarwienia wytworzonego przez dodanie odczynnika tworzącego w podwyższonej temperaturze barwny kompleks z kwasem sialikowym wyekstrahowanym do fazy organicznej.

Wiele prac wskazuje na to, że podwyższona zawartość kwasu sialikowego w surowicy krwi pacjentów jest wskazówką obecności raka. Na przykład Davidson i współtwórcy w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 146 603 ujawniają i zastrzegają dość skomplikowaną serię procedur, według których podwyższona zawartość kwasu sialikowego jest wskaźnikiem określającym specyficzne rodzaje raka.

MacBeth i Bekesi w Cancer Res. 22,1170-1176 (1962) mierzyli ilość glikoprotein w plazmie i stwierdzili obecność galaktozy i mannozy w przypadkach raka piersi bez przerzutów. Kloppeli współautorzy w Proc. Natl. Acad. Sc. 74,3011-3013 (1977) donosząo2,5 krotnym wzroście glikolipidów kwasu sialikowego u mysz z przeszczepionym rakiem gruczołów mlecznych i 2-krotny wzrost u ludzi chorych na raka. Kloppel i współautorzy w Am. J.Vet. Res. 39, 1377-1380 (1978) donieśli również o wzroście poziomu kwasu sialikowego u 93% z 24 psów. W przypadku białaczki AKR/J u myszy, Lengle w J. Natl. Cancer Inst. 62, 1565-1567 (1979) stwierdził wzrost poziomu kwasu sialikowego związanego z lipidami w ich plazmie i grasiczych limfocytach. Zwiększony poziom kwasu sialikowego związanego z lipidami wykryto w plazmie i erytrocytach ludzi cierpiących na czerniaka. Portouklian i współautorzy w Biochem. Biophys. Res. Commun. 85 916-920 (1978) mówiąo chromatograficznym rozdzieleniu i oczyszczeniu na kolumnach, po którym następowała ocena na płytkach chromatograficznych. Silver i współauto176 690 rzy w Cancer 41. 1497-1499 (1978) i Cancer Res. 39, 5036-5042 (1979) donoszą o związanym z obecnością nowotworu podwyższonym poziomie kwasu sialikowego w surowicy pacjentów cierpiących na czerniaka. Jednakże, 36% pacjentów z nowotworami nie wykazywało podwyższonego poziomu kwasu sialikowego w surowicy. Hogan-Ryan i współautorzy omawiając w Br. J. Cancer 41, 587-592 (1980) całkowitą ilość związanego kwasu sialikowego w surowicy pacjentek z rakiem piersi stwierdzili, że jego podwyższony poziom odpowiada stadium nowotworu.

Specyficzny sposób oznaczania kwasu sialikowego jest opisany przez Katopodisa i współautorów w American Association for Cancer Research Annual Meeting Proceedings Vol 21, marzec 1980, Abstrakt nr 728. Według tego sposobu 100 μΐ plazmy ekstrahuje się 6 ml mieszaniny chloroformu z metanolem (w stosunku objętościowy 2:1). Ekstrakt lipidowy uzyskany z plazmy jest poddany podziałowi między fazą organiczną i wodną przez dodanie 0,2 objętości wody. Fazę wodną odparowuje się całkowicie i pozostałość ponownie rozpuszcza się w wodzie. Następnie oczyszcza się związany z lipidami kwas sialikowy, przez wytrącanie kwasem trój chlorooctowym i kwasem wolframofosforowym. Po oddzieleniu cieczy od powstałego osadu, osad ten jest oznaczany metodą Svennerholma i Miettiena (Svennerholm). Ilościowe oznaczanie kwasu sialikowego..., Biochem. Biophys. Acta, 24, str. 604-611 (1957)).

Inny sposób ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 342 567. Sposób ten jest podobny do poprzedniego omówionego, ale wymaga próbki jedynie o objętości około 50 μ!. Ponadto wyeliminowano etap suszenia i stosowanie kwasu trójchlorooctowego. Konieczne jest jednak stosowanie kwasu wolframofosforowego.

Sposób ten wykazuje szereg niedogodności, zwłaszcza konieczność ściśle określonej objętości próbki wyjściowej wynoszącej 44,7 μΕ przy czym związany z lipidami kwas sialikowy tracony jest na etapie inwersji probówki, co powoduje zmniejszoną wartość końcową oznaczenia, ponadto strącanie związanego z lipidami kwasu sialikowego nie jest całkowite, co jest szczególnym problemem przy obróbce próbek, w których nadmiarowa ilość kwasu w stosunku do ilości normalnej jest niewielka (na przykład we wczesnym okresie rozwoju raka). Ponadto szybkość wykonania testu jest ograniczona 5 minutowym oczekiwaniem po dodaniu kwasu wolframofosforowego, a koszt wykonania oznaczenia jest stosunkowo wysoki.

Inny sposób oznaczenia kwasu sialikowego, ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 748 128, składa się z następujących etapów:

a) rozcieńczenie określonej objętości plazmy lub surowicy krwi wodą destylowaną do objętości około cztery razy większej od objętości początkowej;

b) mieszanie rozcieńczonej próbki przez odpowiedni czas, aż do uzyskania zasadniczo zhomogenizowanej próbki;

c) oziębianie wymieszanej, rozcieńczonej próbki do 0° - 5°C;

d) dodawanie do oziębionej próbki mieszaniny chlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego, przy czym objętość dodawanej mieszaniny jest około sześćdziesięciokrotnie większa niż objętość próbki plazmy lub surowicy krwi, a stosunek objętości chlorowanego węglowodoru do alkoholu wynosi około 2:1, zaś temperatura 0° do 5°C;

e) mieszanie powstałej mieszaniny przez odpowiedni czas, w celu rozpuszczenia materiału obecnego w próbce w roztworze chlorowcopochodnej węglowodoru i alkoholu;

f) rozcieńczanie powstałej mieszaniny destylowaną wodą dejonizowaną w temperaturze od 0°C do 5°C, przy czym dodawana objętość wody jest około dziesięciokrotnie większa od objętości próbki plazmy lub surowicy krwi;

g) obróbka rozcieńczonej mieszaniny przez odpowiedni czas, aż do wytworzenia zasadniczo klarownej fazy górnej;

h) pobranie określonej objętości ze sklarowanej fazy górnej;

i) dodanie do pobranej objętości fazy górnej pewnej ilości mieszaniny środka wytrącającego białka i materiału adsorbującego, przy czym ilość dodawanej mieszaniny musi powodować skuteczne wytrącenie kwasu sialikowego związanego z lipidami i zaadsorbowanie wytrąconego kwasu sialikowego związanego z lipidami;

j) mieszanie powstałej mieszaniny;

176 690

k) pobranie powstałego zaadsorbowanego osadu;

l) wytworzenie zawiesiny osadu w odpowiedniej ilości destylowanej wody; oraz

m) dodanie do zawiesiny osadu określonej objętości odczynnika zawierającego rezorcynę, mieszanie, a następnie gotowanie przez 15 minut, oziębianie przez 10 minut na łaźni z lodem, odwirowanie, dodanie mieszaniny octanu i n-butanolu (stosunek objętości 85:15) o objętości około dwukrotnie większej od objętości odczynnika zawierającego rezorcynę, mieszanie, odwirowywanie, oddzielanie warstwy organicznej, pomiar intensywności wyekstrahowanego zabarwienia niebieskiego warstwy organicznej przy długości fali 580 nm i określenie ilości kwasu sialikowego związanego z lipidami przez porównanie odczytów gęstości optycznej uzyskanych w tych samych warunkach przy długości fali 580 nm z krzywą wzorcową znanej próbki kwasu n-acetyloneuraminowego (KNAN).

Podobne sposoby oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami są znane z europejskich opisów patentowych nr 0 159 563 i nr 0 159 564. W obu tych rozwiązaniach w sposobie oznaczania kwasu sialikowego wymagane jest jego strącanie, w pierwszym przypadku kwasem wolframofosforowym, a w drugim przypadku mieszaniną kwasu wolframofosforowego i kwasu trichlorooctowego. Wskutek wytrącania kwasem wolframofosforowym następuje uszkadzanie naturalnych białek plazmy lub surowicy. W obu tych opisach patentowych wymaga się ekstrahowania kwasu sialikowego mieszaniną chlorowcopochodnej niższego węglowodoru i alkoholu o wzajemnym stosunku 15:1 do 5:1 w patencie europejskim nr 159 563 i 2:1 w patencie europejskim 159 564.

Celem wynalazku jest uproszczenie sposobu oznaczania kwasu sialikowego i obniżenie kosztu tego oznaczania. Cel ten osiągnięto przez zmianę sposobu ekstrakcji kwasu sialikowego związanego z lipidami i zmianę sposobu przygotowania próbek plazmy i surowicy krwi przed pomiarem kolorymetrycznym. Najbardziej istotne jest wyeliminowanie konieczności wytrącania kwasu sialikowego związanego z lipidami, osiągnięte dzięki właściwemu doborowi mieszaniny ekstrakcyjnej.

Sposób oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami charakteryzuje się tym, że stosunek objętościowy składników mieszaniny ekstrakcyjnej zawierającej niższy węglowodór alkilowy i niższy alkohol alkilowy wynosi około 1:1, przy czym reakcję tworzenia zabarwienia z kwasem sialikowym przeprowadza się bezpośrednio w fazie organicznej, powstającej podczas ekstrakcji kwasu sialikowego z rozcieńczonej próbki plazmy lub surowicy'. .

Korzystnie stosowana objętość mieszaniny chlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego jest około dwudziestokrotnie większa od objętości pierwotnej próbki plazmy lub surowicy krwi. Przykładowo, jeśli początkowa objętość próbki wynosi 50 μΐ, to objętość dodawanej mieszaniny wynosi około 1,0 ml.

W korzystnym rozwiązaniu wynalazku jako niższy alkohol alkilowy stosuje się metanol, a jako niższą chlorowcopochodną węglowodoru alkilowego chloroform.

Sposób według wynalazku jest prostszy, tańszy, szybszy i łatwiejszy do automatyzacji. Ponadto wymaga mniej odczynników chemicznych oraz jest bardziej specyficzny i czulszy niż znane sposoby. Zaletą sposobu według wynalazku jest wyeliminowanie użycia czynnika strącającego białka, takiego jak kwas wolframofosforowym, i materiału absorbującego (kwas krzemowy) wytrącany kwas sialikowy, co jest nieoczekiwanym efektem zastosowania do ekstrakcji mieszaniny o stosunku chlorowcopochodnej węglowodoru do alkoholu w przybliżeniu 1:1.

Znaczącym osiągnięciem niniejszego wynalazku jest sposób przygotowania czystej frakcji organicznej (górna faza), która po liofilizacji stanowi podstawowy materiał do wytwarzania monoklonowych przeciwciał, co jest możliwe dlatego, że naturalne białka plazmy lub surowicy nie sąniszczone przez ekstrakcję i wytrącanie kwasem wolframofosforowym, tak jak się to dzieje w znanych sposobach.

Wreszcie, w sposobie według wynalazku eliminuje się potrzebę stosowania mieszaniny octanu butylu i n-butanolu, tak jak to się dzieje w znanych sposobach. Oprócz obniżenia kosztu oznaczenia, eliminuje to konieczność pracy z tą mieszaniną, mającą odrażający zapach i powodującą podrażnienie błon nosowych u ludzi.

176 690

Oznaczenie kwasu sialikowego związanego z lipidami opisano poniżej:

Próbkę plazmy lub surowicy uzyskuje się z krwi pobieranej od pacjenta. Do oznaczenia kwasu sialikowego wykorzystano próbkę o objętości 50 μΐ, rozcieńczono jąwodą destylowaną o objętości 250 μΙ i po wymieszaniu dodano 1 ml mieszaniny chloroformu i metanolu o stosunku objętościowym 1:1. Po wstępnym wymieszaniu przez około 10 s, umożliwiającym ekstrakcję kwasu sialikowego związanego z lipidami, mieszaninę odwirowywano przez około 5 minut przy około 3500 obr./min. aż do uzyskania klarownej fazy górnej. Z uzyskanej fazy górnej pobrano 200 μΙ cieczy, dodano do niej 1 ml roztworu rezorcyny i mieszaninę gotowano na łaźni wodnej przez 15 minut, po czym oziębiono ją przez umieszczenie w zimnej wodzie na 5 minut. Następnie mieszaninę odwirowywano przez 5 minut przy 3500 obr./min. Stężenie kwasu sialikowego związanego z lipidami oznaczano przez pomiar intensywności niebieskiego zabarwienia fazy organicznej przy długości fali 580 nm i wyliczano przez porównanie odczytu przy 580 nm dla próbki badanej i dla wzorca, zawierającego znane stężenie kwasu sialikowego związanego z lipidami, przy zastosowaniu wzoru LSA [mg/100 ml plazmy] = A x B/C, gdzie A = znane stężenie wzorca, B = optyczna gęstość próbki i C = optyczna gęstość wzorca.

Jako wzorzec stosowano dostępny w handlu kwas n-acetyloneuraminowy (KNAN), który poddano identycznej obróbce i w tym samym czasie jak badana próbka.

Badanie które doprowadziły do wynalazku pozwoliły stwierdzić, że użycie do ekstrakcji mieszaniny metanolu i chloroformu w stosunku objętościowym 1:1, sprawia, iż oznaczenie staje się czulsze i wyeliminowana jest konieczność używania reagentu wytrącającego białka. Przyczyną tego jest fakt, że mieszanina o tym stosunku wytwarza fazę górną o dużo większej objętości i praktycznie pozbawioną zanieczyszczeń. Duża objętość klarowej fazy górnej daje możliwość wykonania kilku oznaczeń z tej samej fazy górnej. Z tabeli I wynika wzrost czułości oznaczenia według wynalazku w przypadku stosowania mieszaniny metanolu do chloroformu w stosunku objętościowym 1: 1 oraz zmniejszenie czułości w przypadku zmiany tego stosunku do wartości 45: 55. Jeśli stosunek metanolu do chloroformu zostaje zwiększony do 60:40, obserwuje się bardzo słabe oddzielenie zanieczyszczonej górnej fazy, którą nie można wykorzystać do przeprowadzenia oznaczenia sposobem według wynalazku. Natomiast, jeśli stosunek metanolu do chloroformu zwiększony jest do 70:30, w ogóle nie następuje rozdzielenie faz, jak to wynika z tabeli I.

W tabeli II pokazano wpływ stosunku metanolu do chloroformu na objętość fazy górnej, dla objętości próbki wynoszącej 1300 μΐ. Jak to wynika z tabeli II, przy stosunku 50:50 objętość klarownej fazy górnej mieszaniny wynosi 700 μΐ, a fazy dolnej 600 μΐ. Gdy stosunek metanolu do chloroformu wynosi 52,5 : 47,5 objętości tych dwóch faz są w przybliżeniu takie same, natomiast przy stosunku 55:45, objętość górnej fazy wzrasta do 760 μΐ, a przy stosunku do 60:40 objętość wzrasta do 840 μΐ, lecz rozdzielenie faz jest bardzo słabe, przy czym faza górna nie jest klarowna. Przy stosunku 70:30 w ogóle nie występuje rozdzielenie. Na odwrót, przy zmniejszeniu wartości stosunku metanolu do chloroformu do 48:52, objętość górnej fazy zmniejsza się do 600 μΐ, a objętość dolnej fazy zwiększa się do 700 μΐ, zaś przy stosunku 45:55, objętość górnej fazy zmniejsza się do 500 μΐ, a objętość fazy dolnej wzrasta do 800 μΐ. Z danych tabeli I i tabeli II wynika więc, że zwiększoną czułość oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami, przy największej objętości klarownej fazy górnej, występuje przy stosunku metanolu do chloroformu 50:50 czyli 1:1.

W tabeli III pokazano wzrost czułości sposobu oznaczania według wynalazku, wyrażonej wyższym procentem pozytywnych rezultatów u pacjentów chorych na raka, w porównaniu ze sposobami znanymi. W tabeli tej zebrano wyniki testów na różnego typu nowotwory u 532 pacjentów, u których innego typu testy potwierdziły obecność nowotworu w 343 przypadkach. Testy według niniejszego wynalazku zidentyfikowały 79% pacjentów mających nowotwory, podczas gdy test według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 4 748 128 zidentyfikował tylko 52% przypadków. Tak więc, test według niniejszego wynalazku wykazał wzrost wykrywalności nowotworów o 27% w porównaniu z testem znanym (patrz tabele I, II i III).

Sposób według wynalazku może być wykorzystany do rozpoznawania raka u ludzi przez oznaczanie ilości kwasu sialikowego związanego z lipidami w próbce plazmy lub surowicy krwi

176 690 i porównywanie oznaczonej w ten sposób ilości kwasu z wartościami uzyskanymi dla pacjentów, o których wiadomo, iż są chorzy na raka, albo alternatywnie, porównywanie w ten sposób oznaczonej ilości kwasu z wartościami uzyskiwanymi u tego samego pacjenta w ciągu dłuższego czasu.

Sposób według wynalazku może być również stosowany do regularnego oznaczania ilości kwasu sialikowego obecnego w plazmie lub surowicy krwi chorych i w ten sposób do monitorowania postępów leczenia przez porównywanie z poprzednią ilością kwasu oznaczoną w ten sam sposób.

Sposób według wynalazku może być wykorzystany do monitorowania rozwoju raka u pacjentów, obejmujący oznaczanie w regularnych odstępach czasu ilości kwasu sialikowego związanego z lipidami w próbkach plazmy lub surowicy krwi pacjentów i porównywanie ilości kwasu w ten sposób oznaczonej z ilością oznaczoną poprzednio u tego samego pacjenta.

Tabela I

Wpływ stosunku metanol/chloroform na wartości LSA

Stosunek metanolu do chloroformu (metanol/chloroform)
Próbka	45/55	48/52	50/50	52,5/47,5	55/45	60/40	70/30
#1	8,0*	8,3	8,9	7,2	5,1	rozdzielenie faz	nie ma
#2	10,3	12,2	13,4	12,0	10,4	słabe do wyko-	rozdzielenia
#3	20,7	23,9	24,3	21,2	17,6	nania testu
#4	22,0	25,5	26,9	20,3	18,5
#5	43,1	46,5	48,3	39,7	27,9

*

Stężenie kwasu sialikowego związanego z lipidami w próbkach (mg/100 ml)

Tabela II

Wpływ stosunku metanolu do chloroformu na objętość górnej fazy 1300 mikrolitrowej próbki

Stosunek metanolu do chloroformu
	45:55	48:52	50:50	52,5:47,5	55:45	60:40	70:30
objętość fazy górnej w μΐ	500	600	700	700	760	słabe rozdzielenie 460	nie ma rozdzielenia 1300
objętość fazy dolnej w μΐ	800	700	600	600	540	540	nie ma rozdzielenia 1300

Tabela III

Wzrost czułości sposobu według wynalazku identyfikowania przypadków raka u pacjentów, o których wiadomo z innych testów, że cierpią na tę chorobę

Rodzaj nowotworu	Liczba testowanych pacjentów	Liczba pacjentów chorych	Procent pozytywnie zidentyfikowanych przypadków choroby
Wcześniej znany test	Test według wynalazku
piersi	168	62	37%	66%
okrężnicy	92	71	38	56
jajnika	70	53	66	91
płuc	55	40	75	87
prostaty	45	39	59	79
policzka	24	5	20	80
różne	78	73	68	95
Całkowite	532	343	52% (średnio)	79% (średnio)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób oznaczania kwasu sialikowego związanego z lipidami w plazmie lub surowicy ludzkiej krwi, umożliwiający wykrywanie raka u ludzi i monitorowanie postępu tej choroby, polegający na rozcieńczeniu wodą próbki plazmy lub surowicy, wymieszaniu, ekstrakcji mieszaniną chlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego oraz na pomiarze intensywności zabarwienia wytworzonego przez dodanie odczynnika tworzącego w podwyższonej temperaturze barwny kompleks z kwasem sialikowym wyekstrahowanym do fazy organicznej, znamienny tym, że stosunek objętościowy składników mieszaniny ekstrakcyjnej zawierającej niższy węglowodór alkilowy i niższy alkohol alkilowy wynosi około 1:1, przy czym reakcję tworzenia zabarwienia z kwasem sialikowym przeprowadza się bezpośrednio w fazie organicznej, powstającej podczas ekstrakcji kwasu sialikowego z rozcieńczonej próbki plazmy lub surowicy.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosowana objętość mieszaniny chlorowcopochodnej niższego węglowodoru alkilowego i niższego alkoholu alkilowego jest około dwudziestokrotnie większa od objętości pierwotnej próbki plazmy lub surowicy krwi.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako niższy alkohol alkilowy stosuje się korzystnie metanol.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako niższą chlorowcopochodną węglowodoru alkilowego stosuje się korzystnie chloroform.