PL176727B1 - Sposób oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi i zestaw do oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi - Google Patents
Sposób oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi i zestaw do oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwiInfo
- Publication number
- PL176727B1 PL176727B1 PL94313392A PL31339294A PL176727B1 PL 176727 B1 PL176727 B1 PL 176727B1 PL 94313392 A PL94313392 A PL 94313392A PL 31339294 A PL31339294 A PL 31339294A PL 176727 B1 PL176727 B1 PL 176727B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- binding
- rapamycin
- pharmaceutical
- competitor
- cyclosporin
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 83
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 74
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims abstract description 74
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims abstract description 70
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims abstract description 64
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims abstract description 55
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 claims abstract description 55
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims abstract description 46
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 44
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims abstract description 44
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 108010016648 Immunophilins Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000000521 Immunophilins Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- -1 FK506 compound Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 102100038796 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM13 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101000664589 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase TRIM13 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- NGEWQZIDQIYUNV-UHFFFAOYSA-N L-valinic acid Natural products CC(C)C(O)C(O)=O NGEWQZIDQIYUNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims description 8
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 14
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 14
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 14
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108010006877 Tacrolimus Binding Protein 1A Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 4
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 4
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 3
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- ZMKGDQSIRSGUDJ-VSROPUKISA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-30-propyl-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,1 Chemical compound CCC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZMKGDQSIRSGUDJ-VSROPUKISA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108010072220 Cyclophilin A Proteins 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- ZMKGDQSIRSGUDJ-UHFFFAOYSA-N NVa2 cyclosporine Natural products CCCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZMKGDQSIRSGUDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102100034539 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A Human genes 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 108010019249 cyclosporin G Proteins 0.000 description 2
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TYFOVYYNQGNDKH-HHPJSCBPSA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-ethyl-33-[(1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhexyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17,20,23, Chemical compound CCCC[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](CC)NC1=O TYFOVYYNQGNDKH-HHPJSCBPSA-N 0.000 description 1
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027913 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 241001647839 Streptomyces tsukubensis Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 108010040764 dihydrocyclosporin A Proteins 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000003808 methanol extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003217 pyrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9493—Immunosupressants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Fishing Rods (AREA)
- Input Circuits Of Receivers And Coupling Of Receivers And Audio Equipment (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigation Of Foundation Soil And Reinforcement Of Foundation Soil By Compacting Or Drainage (AREA)
- Sanitary Device For Flush Toilet (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Control Of Motors That Do Not Use Commutators (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
1. Sposób oznaczania stezenia farmaceutyków wiazacych immunofiliny we krwi, przy czym stezenie to wynosi co najmniej 0,7 ng/ml krwi, znamienny tym, ze do próbki krwi dodaje sie czynnik wspólzawodniczacy w wiazaniu w takiej ilosci, która jest wystarczajaca do wypierania farmaceutyku z kompleksów lmmunosupre- sor-immunofilina we krwi, nastepnie dodaje wiazacy sie z farmaceutykiem receptor, który z czynnikiem wspólzawodniczacym w wiazaniu wiaze sie tylko w stopniu nieznacznym, a jego zdolnosc do reakcji krzyzowej pomiedzy farmaceutykiem a czynnikiem wspólzawodniczacym w wiazaniu wynosi mniej niz 1%, nastepnie wydziela sie kompleks receptor-farmaceutyk z próbki i okresla sie ilosc farmaceutyku, przy czym jako farmaceutyk wiazacy sie z immunofilina stosuje sie zwiazek wybrany z grupy obejmujacej: (a) cyklosporyne, (b) zwiazek FK506 albo (c) rapamycyne albo 40-0-hydroksyetylorapamycyne, jako czynnik wspólzawodnicza- cy w wiazaniu stosuje sie odpowiednio: (a) [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-cyklosporyne, (b) rapamycyne albo (c) zwiazek FK506, a jako receptor stosuje sie odpowiednio: (a) monoklonalne przeciwcialo specyficzne dla cyklosporyny, (b) monoklonalne przeciwcialo specyficzne dla zwiazku FK506 albo (c) monoklonalne przeciw- cialo specyficzne dla rapamycyny albo dla 40-0-hydroksyetylorapamycyny. 5 Zestaw do oznaczania stezenia farmaceutyków wiazacych immunofiliny we krwi, przy czym stezenie to wynosi co najmniej 0,7 ng/ml krwi, znamienny tym, ze zawiera czynnik wspólzawodniczacy w wiazaniu w takiej ilosci, która jest wystarczajaca do wypierania farmaceutyku z kompleksów immunosupresor-immuno- filina we krwi i zawiera wiazacy sie z farmaceutykiem receptor, który z czynnikiem wspólzawodniczacym w wiazaniu wiaze sie tylko w stopniu nieznacznym, a jego zdolnosc do reakcji krzyzowej pomiedzy farmaceuty- kiem, a czynnikiem wspólzawodniczacym w wiazaniu wynosi mniej niz 1%, przy czym farmaceutykiem wiazacym sie z immunofilina jest zwiazek wybrany z grupy obejmujacej: (a) cyklosporyne, (b) zwiazek, FK506 albo (c) rapamycyne albo 40-O-hydroksyetylorapamycyne, czynnikiem wspólzawodniczacym w wiazaniu jest odpowiednio: (a) [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-cyklosporyna, (b) rapamycyna albo (c) zwiazek FK506, a receptorem jest odpowiednio (a) monoklonalne przeciwcialo specyficzne dla cyklosporyny, (b) monoklonalne przeciwcialo specyficzne dla zwiazku FK506 albo (c) monoklonalne przeciwcialo specyficzne dla rapamycyny albo dla 40-0-hydroksyetylorapamycyny. PL PL PL
Description
Wynalazek dotyczy sposobu przeprowadzania oznaczania i zestawu, służącego do oznaczania stężenia farmaceutyków w świeżej krwi w obecności specyficznych białek wiążących. Sposób i zestaw są szczególnie przydatne do określania poziomu we krwi leków wiążących immunofiliny np. cyklosporyn, rapamycyn lub związków FK506.
Cyklosporyny obejmują klasę strukturalnie odrębnych, cyklicznych, poli-N metylowanych undekapeptydów posiadających generalnie, w większym lub mniejszym stopniu, aktywność immunosupresyjną, przeciwzapalną, przeciwwirusową i/lub przeciwpasożytniczą. Pierwszą spośród zidentyfikowanych cyklosporyn był grzybowy metabolit cyklosporyna A (Cyklosporin A lub Ciclosporin), a jej struktura jest podana w The Index Merck wydanie 11; Merck and Co., Inc.; Rahway, New Jersey, USA (1989) pod numerem 2759. Później zidentyfikowanymi cyklosporynami są cyklosporyny B, C, D oraz G, które są również wymienione w Indeksie Mercka pod numerem 2759. Znana jest również duża liczba syntetycznych analogów, a reprezentatywne przykłady są przedstawione w EP 296 122, EP 484 281 i GB 2222770.
Rapamycyna jest immunosupresyjnym makrolidem, który jest wytwarzany przez Streptomyces hygroscopicus i który okazał się farmaceutycznie przydatny, znajdując szereg zastosowań, szczególnie jako immunosupresor stosowany w leczeniu i zapobieganiu odrzucania transplantowanych narządów oraz w chorobach autoimmunologicznych. Struktura rapamycyny jest podana w Kesseler H., i wsp., 1993; Helv. Chim. Acta; 76:117. Zsyntetyzowano dużą liczbę pochodnych rapamycyny, włączając w to między innymi acylo- i aminoacylo- pochodne rapamycyny (np. patent USA 4316885, patent USA 4650803 i patent USA 5151413), 27-demetylorapamycyna (WO 92/14737), 26-dwuwodororapamycyna (patent USA 5138051), pewne pochodne pirazolowe (patent USA 5164399), pewne pochodne alkoksyestrowe (patent USA 5233036) i pochodne 40-O-alkilowane (WO 94/09010). Rapamycyna i jej strukturalnie podobne analogi i pochodne są ogólnie określane w tym opisie jako rapamycyny.
FK506 jest immunosupresyjnym makrolidem, który jest wytwarzany przez Streptomyces tsukubaensis Nr 9993. Struktura FK506 jest podana w dodatku do Indeksu Mercka jako pozycja A5. Znanych jest również wiele pokrewnych związków, które zachowują podstawową strukturę i właściwości immunologiczne FK506. Związki te są opisane w wielu publikacjach, na przykład EP 18-4162, EP 315973, EP 323042, EP 423714, EP 427680, EP 465426, EP 474126, WO 91/13889, WO 91/19495, EP 484936, EP 532088, EP 532089, WO 93/5059 i temu podobnych. Związki te są ogólnie określane w tym opisie jako związki FK506.
Ze względu na niezwykle użyteczne własności farmaceutyczne, cyklosporyny (a w szczególności cyklosporyna A oraz G), rapamycyny i związki FK506 mają szerokie zastosowanie na przykład przy zapobieganiu odrzucania przeszczepów oraz w chorobach autoimmunologicznych. Jednakże związki te mają w wyższych dawkach efekty uboczne, a zatem ich stężenie we krwi musi być utrzymywane w pewnych terapeutycznych zakresach. Dostępność biologiczna i szybkość przemian metabolicznych wydaje się być specyficzna dla pacjenta, a więc dawkowanie jest swoiste dla pacjenta. Jest zatem konieczne śledzenie stężenia tych immunosupresorów we krwi w regularnych odstępach.
Opracowano pewne metody oznaczania oparte na wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC), niestety kłopotliwe w użyciu lub niedostatecznie specyficzne. Dlacyklospo4
176 727 ryny A i FK506 uzyskano specyficzne monoklonalne przeciwciała i wprowadzono metody oznaczania oparte o te przeciwciała. Jednakże wszystkie metody oznaczania dotychczas dostępne wymagają, aby próbki krwi lub osocza były uprzednio ekstrahowane rozpuszczalnikiem (takim jak metanol), który następnie usuwa się poprzez odparowanie lub rozcieńczenie. Następnie do próbki dodaje się przeciwciało i przeprowadza test radioimmunologiczny (RIA). Metoda oznaczania oparta o specyficzne monoklonalne przeciwciała działa dobrze, ale konieczność wykonania etapu ekstrakcji i następującego po tym usunięcia rozpuszczalnika może powodować, że test staje się mniej czuły i mniej precyzyjny, jeżeli nie jest wykonywany dostatecznie starannie. A zatem oznaczenie musi być wykonywane przez biegłego technika i jest metodą czasochłonną.
Z tego powodu, biorąc pod uwagę ważność cyklosporyn, rapamycyn i związków FK506 jako farmaceutyków istnieje zapotrzebowanie na prosty, czuły test dla określania ich stężenia we krwi.
Sposób oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi, według wynalazku, umożliwia przeprowadzenie oznaczenia już przy stężeniu wynoszącym 0,7 ng/ml krwi i charakteryzuje się tym, że dodaje się czynnik współzawodniczący w wiązaniu w takiej ilości, która jest wystarczająca do wypierania farmaceutyku z kompleksów immunosupresorimmunofilina we krwi. Następnie dodaje się wiążący się z -farmaceutykiem receptor, który z czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu wiąże się tylko w stopniu nieznacznym, a jego zdolność ‘do reakcji krzyżowej pomiędzy farmaceutykiem a czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu wynosi mniej niż 1%. W następnej kolejności wydziela się kompleks receptor-farmaceutyk z próbki i określa się ilość farmaceutyku. Jakofarmaceutyk wiążący się z iminunofiliną stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej: (a) cyklosporynę, (b) związek FK506 albo (c) rapamycynę albo 40-O-hydroksyetylorapamycynę. Jako czynnik współzawodniczący w wiązaniu stosuje się odpowiednio: (a) [Thr2, Leu5, D-Hiv8; Leu^j-cyklosporynę, (b) rapamycynę albo (c) związek FK506, ajako receptor stosuje się odpowiednio: (a) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla cyklosporyny, (b) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla związku FK506 albo (c) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla rapamycyny albo dla 40-0-hydroksyetylorapamycyny.
Stwierdzono, że część cyklosporyn, rapamycyn i związków FK506 obecnych we krwi występuje w formie kompleksu farmaceutyk-immunofilina. Ponieważ farmaceutyk jest wypierany z kompleksu przy użyciu czynnika współzawodniczącego, nie istnieje konieczność ekstrahowania próbki krwi stosując metanol, a więc niedogodności związane z ekstrakcją i usunięciem metanolu są wyeliminowane. Opracowana metoda oznaczania daje dokładne wyniki, jest prosta i stanowi nieoczekiwany przełom w oznaczaniu cyklosporyn, rapamycyn i związków FK506. Przykładowo, metoda oznaczaniajest w stanie wykryć stężenia tak niskie jak 0,7 ng (cyklosporyny A)/ml (pełnej krwi) ze współczynnikiem odchylenia mniejszym niż 30%. Jest to znacznie lepiej niż w testach na cyklosporynę A, które są handlowo dostępne.
Immunofiliny jest to rodzina wewnątrzkomórkowych białek wiążących, które wiążą cyklosporyny, rapamycyny i związki FK506. Znane są obecnie dwie odrębne rodziny immunofilin; cyklofiliny, które wiążą się z cyklosporynami i makrofiliny, które wiążą z rapamycynami i związkami FK506. Struktura pewnych immunofilin jest opisana w Walkinshaw i wsp.; 1992; Transplantation Proceedings, 24, 4(2), 8-13. Konkretnymi przykładami są cyklofilina A i makrofilina-12 (często znana jako FKBP-12).
Ilość czynnika współzawodniczącego w wiązaniu, który będzie trzeba użyć do wyparcia farmaceutyku z kompleksu farmaceutyk-immunofilina będzie prawdopodobnie różnić się od farmaceutyku do farmaceutyku oraz od jednego do drugiego czynnika współzawodniczącego. Jednakże w każdym przypadku optymalny zakres może być łatwo określony poprzez wykonanie oznaczenia dla kilku stężeń (włączając w to ślepą próbę) farmaceutyku i dla kilku stężeń czynnika współzawodniczącego. Próbki rozcieńcza się następnie dwu- lub trzykrotnie i przeprowadza się ponownie oznaczanie dla każdego rozcieńczenia. Czułości oznaczeń są następnie porównywane i stężenia czynnika współzawodniczącego, który daje zmniejszoną czułość są odrzucane.
Receptorem, który rozpoznaje i wiąże się z farmaceutykiem może być dowolny specyficzny związek wiążący, taki jaki stosuje się w konwencjonalnych oznaczeniach np. poliklonalne, monoklonalne lub zrekcmbincwane przeciwciała, fragmenty przeciwciał lub cząsteczki
176 727 polimerów o zdeterminowanej strukturze (np. jak opisano przez Vlatakis i wsp., (1993) Nature 361: 645), najlepiej stosować przeciwciała monoklonalne.
Po uwolnieniu farmaceutyku z kompleksu farmaceutyk-immunofilina, ilość farmaceutyku związanego z receptorem może być określona przy zastosowaniu dowolnej metody oznaczenia, najchętniej oznaczenia opartego o monoklonalne przeciwciała np. testu współzawodnictwa mierzącego zdolność farmaceutyku do współzawodniczenia o wiązanie do przeciwciała lub receptora, lub test bez współzawodnictwa. W najchętniej stosowanych testach współzawodnictwa używa się np.wyznakowanego farmaceutyku (wskaźnika) jako czynnika współzawodniczącego dla przeciwciał w obecności i nieobecności badanej próbki. Wskaźnik może być tak wyznakowany, aby możliwy był odpowiedni odczyt np. odczyt radioaktywności, fluorescencji, luminescencji lub kolorymetryczny, tak jak to się zwykle stosuje w tej dziedzinie. Alternatywnie czynnikiem współzawodniczącym dla receptora może być nie wyznakowany farmaceutyk (ewentualnie kompleks farmaceutyk-białko immunogenne stosowany do wytworzenia przeciwciał) opłaszczający powierzchnię komory do oznaczeń np. w enzymatycznym teście immunosorpcyjnym (ELISA) lub w systemie, gdzie przeciwciała dla farmaceutyku są same wyznakowane. Przeciwciało lub receptor mogą być wolne w roztworze testowym lub mogą opłaszczać ścianę komory do oznaczeń, zależnie od zastosowanego sytemu oznaczenia. W teście współzawodnictwa odczyt (np. ilość wskaźnika związanego z przeciwciałem lub receptorem) jest odwrotnie proporcjonalny do ilości farmaceutyku w badanej próbce. Standardowe roztwory zawierające znane stężenie farmaceutyku mogą być stosowane do standaryzacji oznaczenia, tak jak robi się to zwykle.
Gdy mówimy o receptorze, który wiąże się z farmaceutykiem, a nie wiąże się znacząco z czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu, rozumiemy przez to, że,siła reakcji krzyżowej receptora pomiędzy farmaceutykiem i czynnikiem współzawodniczącym nie wystarcza do wywarcia znaczącego wpływu na czułość oznaczenia. Dokładna siła reakcji krzyżowej pomiędzy farmaceutykiem i czynnikiem współzawodniczącym (i/lub czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu i wskaźnikiem w testach współzawodnictwa), która może być tolerowana różni się oczywiście do pewnego stopnia od względnego powinowactwa czynnika współzawodniczącego w wiązaniu do immunofiliny w porównaniu z farmaceutykiem: im wyższe powinowactwo tym niższe stężenie niezbędne do wyparcia farmaceutyku i większa siła reakcji krzyżowej z receptorem, która może być zatem tolerowana bez wpływu na dokładność oznaczenia. W praktyce znaczenie reakcji krzyżowej można najlepiej oszacować poprzez porównywanie standardowych krzywych, stosując różne ilości czynnika współzawodniczącego w wiązaniu; kiedy osiągnięte zostaje minimalne stężenie czynnika współzawodniczącego w wiązaniu wystarczające dla wyparcia farmaceutyku, krzywe standardowe nie powinny różnić się znacząco przy wzroście stężenia czynnika współzawodniczącego w wiązaniu do najwyższego poziomu branego pod uwagę celem użycia w oznaczeniu, co pokazuje, że reakcja krzyżowa z przeciwciałem nie ma znaczenia w kontekście oznaczenia (jeżeli nie ma reakcji krzyżowej z przeciwciałem obecność wysokiego stężenia czynnika współzawodniczącego w wiązaniu będzie miała tendencję do zawyżania obserwowanego pomiaru poziomu leku, ponieważ oznaczenie mierzy lek plus czynnik współzawodniczący w wiązaniu). Znaczenie odchyleń między krzywymi standardowymi w obecności i nieobecności czynnika współzawodniczącego w wiązaniu można określić stosując standardowe metody statystyczne, np. test-t. Jednakże, ponieważ czynnik współzawodniczący w wiązaniu jest zwykle obecny w badanej próbce w znacznie większym stężeniu niż farmaceutyk, orientacyjnie, siła reakcji krzyżowej receptora z farmaceutykiem i z czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu powinna być np. poniżej 1%, najkorzystniej poniżej 0,1%, jak zmierzono w teście współzawodnictwa w buforze.
W jednym z aspektów wynalazku, farmaceutykiem jest cyklosporyna, a czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu jest analog cyklosporyny, który wiąże się z cyklofilinami. Korzystne jest, jeżeli czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu jest [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu1°]-Ciclosporin, który jest opisany w EP 296 122 i który współzawodniczy w wiązaniu się do cyklofiliny A. Korzystnie jeżeli receptorem jest specyficzne dla cyklosporyny, monoklonalne przeciwciało, np. takie jak opisane w WO 86/2080. Przykładami cyklosporyn są immunosupre6
176 727 sory cyklosporyna A i cyklosporyna G oraz związek przeciwdziałający replikacji HIV, [Melle4]-Ciclosporin, przedstawiony w EP 484 281.
W przypadku stosowania do oznaczania poziomu cyklosporyny testu współzawodnictwa czynnikiem współzawodniczącym o receptor może być cyklosporyna związana ze ścianą komory do oznaczania (np. koniugat cyklosporyna-białko jak opisano w WO 86/2080) lub wyznakowana cyklosporyna (wskaźnik), np. (i) wyznakowana radioaktywnie cyklosporyna, np. dihydrocyklosporyna A znakowana trytem lub (ii) wyznakowane pochodne cyklosporyn: [Thr2]-Ciclosporin, [(D)Lys8]-Cyclosporin lub [0-2-hydroksyetylo(D)Ser8]-Ciclosporin, np. pochodne mające zdolność dostarczania sygnału fluorescencyjnego, luminescencyjnego lub kolorymetrycznego, np. pochodna dansylowa lub biotynylowa, np. [e-N-biotynylo(D)Lys8]Cyclosporin lub [O-(2-biotynyloksyetylo10Thr2]-Ciclosporin. Tak wyznakowane cyklosporyny są otrzymywane generalnie tak, jak opisano w WO 86/2080 lub poprzez zastosowanie jednego z licznych dostępnych handlowo zestawów do znakowania związków, na przykład z firmy Sigma lub Amersham.
Szczególnie korzystna metoda mierzenia poziomów związku Ciclosporin obejmuje opłaszczanie ścian komory testowej (np. płytki do mikromiareczkowania) monoklonalnymi przeciwciałami specyficznymi dla tej cyklosporyny (np. opłaszczając komorę kozimi antymysimi przeciwciałami, umożliwiając w ten sposób wiązanie regionu Fc monoklonalnego przeciwciała, specyficznego dla cyklosporyny, do kozich antymysich przeciwciał tak, ze region wiążący przeciwciała dla cyklosporyny jest wolny). Badana próbka (np. krew pacjenta), czynnik współzawodniczący w wiązaniu (np. [Thr, Leu5, D-Hiv, Leu10]-Ciclosporin), i wyznakowany (np. wyznakowany biotyną) wskaźnik dla cyklosporyny (np. [0-(2-biotynoloksyetylo)Thr2]-Ciclosporin) są następnie łączone razem w komorze testowej i inkubowane przez określony czas. Okres inkubacji jest czasem wystarczającym dla umożliwienia przeciwciału związanie się z farmaceutykiem i ze wskaźnikiem, np. co najmniej jedna godzina, a lepiej przynajmniej dwie godziny. Następnie komora jest przemywana. Poziom związanego wskaźnika jest mierzony zwykłym sposobem, zależnie od typu zastosowanego znakowania; znakowanie biotyną może być wykrywane na przykład przy użyciu handlowego testu z streptawidyną (białko bakteryjne z wysokim powinowactwem do biotyny) przyłączoną do enzymu, np. peroksydazy z chrzanu, która rozszczepia substrat dając odczyt fluorescencyjny, luminescencyjny lub kolorymetryczny.
W innym aspekcie wynalazku, farmaceutykiem jest związek FK506, np. FK506, a współzawodniczący czynnik wiążący jest związkiem, który wiąże się z makrofiliną-12. Może być użyty dowolny związek wiążący makrofilinę-12, który jest zdolny do wypierania FK506. Rapamycyna współzawodniczy z FK506 w wiązaniu się z makrofiliną-12 i jest najchętniej stosowana jako czynnik współzawodniczący. Do wykrywania można użyć odpowiednich przeciwciał dla związku FK506, najchętniej przeciwciał specyficznych, np. jak opisano w EP-A 0 293 892. Tam, gdzie stosowany jest test współzawodnictwa, czynnikiem współzawodniczącym o przeciwciało może być związek FK506 związany z płytką testową lub chętniej wyznakowana pochodna FK506, np. wyznakowana radioaktywnie pochodna, np. FK 506 wyznakowana trytem lub inna wyznakowana pochodna, np. POD-FK566 (opisana jako wyznakowana POD FR-900506 w EP-A 0 293 892).
W trzecim aspekcie wynalazku, farmaceutykiem jest rapamycyna, np. Rapamycin lub 40-O-hydroksyetylorapamycyna z WO 94/09010, a czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu jest związek, który wiąże się z makrofiliną-12. Może być użyty dowolny odpowiedni związek wiążący się z makrofiliną. FK506 współzawodniczy z rapamycyną w wiązaniu się z makrofiliną-12 i jest najchętniej stosowany jako czynnik współzawodniczący. Receptorem jest najchętniej monoklonalne przeciwciało specyficzne dla rapamycyny albo 40-O-hydroksyetylorapamycyny. Uwaga: Monoklonalne przeciwciała swoiste dla rapamycyny nie zostały opisane w literaturze. My otrzymaliśmy jednakże wysoce swoiste przeciwciała, stosując standardową technikę Kohler-Milstein, gdzie antygenem jest immunogenny koniugat rapamycyny, np. rapamycyna połączona z immunogennym białkiem poprzez jedną z grup hydroksylowych rapamycyny, najchętniej grupę hydroksylową położoną w części cykloheksylowej rapamycyny (Rapamycin - pozycja 40) lub reszcie hydroksylowej odpowiadającej pozycji 28 rapamycyny. Rapamycyna jest łączona z białkiem najpierw poprzez utworzenie rapamycyny niosącej zakty176 727 wowaną grupę wiążącą, a następnie dołączenie zaktywowanej rapamycyny do białka. Zaktywowaną grupą wiążącą jest grupa zdolna do bezpośredniego reagowania z częścią białka z wytworzeniem kowalencyjnego wiązania bez konieczności użycia czynnika łączącego (np. związków karboksyimidowych) dla umożliwienia wywierania wpływu lub zapoczątkowania reakcji z białkiem. Przykładowo, 40-O-aktywowana rapamycyna jest O-acylowana przy użyciu bezwodnika bursztynianowego w obecności DMAP i pirymidyny celem wytworzenia hemibursztynianu (40-O-(3-karboksy)propanoilorapamycyny), która jest następnie aktywowana Nhydroksylosukcynimidem w obecności EDC, Et3N i CH2Cl2 z wytworzeniem sukcynimidooksysukcynilorapamycyny (ester 40-O-(3-karboksy)propanoilorapamycyria-Nhydroksysukcynimid). 28-O-aktywowana rapamycyna jest otrzymywana analogicznie przy zastosowaniu wstępnego blokowania grupy 40-hydroksy, a następnie dołączana do białka z wytworzeniem immunogennego koniugatu połączonego wiązaniem 28-0, który może być zastosowany do otrzymywania przeciwciał mających odmienną specyficzność od tych otrzymanych przy zastosowaniu koniugatu połączonego wiązaniem 40-0, np. wysoce czułych na różnice w regionie cykloheksylowym rapamycyny]. Tam, gdzie stosowany jest test współzawodnictwa, czynnikiem współzawodniczącym o przeciwciało może być rapamycyna związana z płytką testową lub chętniej rapamycyna wyznakowana np. rapamycyna wyznakowana fluorescencyjnie otrzymana np poprzez przeprowadzenie reakcji aktywowanej rapamycyny, takiej jak opisano powyżej, z grupą znakującą np. biotynową lub dansylową lub poprzez radioaktywne wyznakowanie rapamycyny, np. znakowanie rapamycyny trytem.
Sposób przeprowadzania oznaczenia według wynalazku ma takie zalety, że może ono być przeprowadzane szybko i łatwo przy użyciu standardowego wyposażenia biochemicznego, dając dokładne i powtarzalne wyniki. Ponadto można używać pełnej krwi bez potrzeby ekstrakcji.
Zestaw do oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi, według wynalazku umożliwia pomiar przy stężeniu, wynoszącym co najmniej 0,7 ng/ml krwi i charakteryzuje się tym, że zawiera czynnik współzawodniczący w wiązaniu w takiej ilości, która jest wystarczająca do wypierania farmaceutyku z kompleksów immunosupresor-immunofilina we krwi. Ponadto zawiera wiązący się z farmaceutykiem receptor, który z czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu wiąże się tylko w stopniu nieznacznym, a jego zdolność do reakcji krzyżowej pomiędzy farmaceutykiem a czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu wynosi mniej niż 1%. W zestawie według wynalazku farmaceutykiem wiążącym się z immurofilirą jest związek wybrany z grupy obejmującej: (a) cyklosporynę, (b) związek FK506 albo (c) rapamycynę albo 40-O-hydroksyetylorapamycyrę. Czynnikiem współzawodniczącym W wiązaniu jest odpowiednio (a) [Thr2, Leu5, D-Hivs, Leu10]-cyklosporyna, (b) rapamycyna albo (c) związek FK506, a receptorem jest odpowiednio (a) monoklonalne przeciwciało, specyficzne dla cyklosporyny, (b) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla związku FK506 albo (c) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla rapamycyny albo dla 40-O-hydroksyetylorapamycyny.
Korzystnie, jeżeli przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne, które jest specyficzne dla farmaceutyku.
Jeżeli farmaceutykiem jest cyklosporyna, czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu może być analog cyklosporyny, który wiąże się z cyklofilinami. Korzystne jest, jeżeli czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu jest [Thr2, Leu5, D-Hiv8, LeiiJ-Ciclosporin. Korzystnie, jeżeli przeciwciałem jest monoklonalne przeciwciało specyficzne dla związku Ciclosporin, takie jak opisane w WO 86/2080.
JeŻeli farmaceutykiem jest związek FK506 lub rapamycyna albo jej analog 40-0-hydroksyetylorapamycyna, współzawodniczącym czynnikiem wiążącym może być odpowiednio, rapamycyna lub FK506 lub jego analog, który wiąże się z makrofiliną-12. Mogą być użyte dowolne przeciwciała dla związku FK506 lub związku rapamycyny, korzystnie rapamycyny albo 40-O-hydroksyetylorapamycyny, najchętniej przeciwciała specyficzne np. otrzymane tak, jak opisano powyżej dla rapamycyny lub jak opisano w EP-A 0 293 892.
Zestaw może zawierać ponadto odpowiednio wyznakowany wskaźnik, standard i instrukcję stosowania. Wskaźnik może być tak wyznakowany, aby możliwy być odpowiedni odczyt, np. odczyt radioaktywności, fluorescencji, lub kolorymetryczny. Tam, gdzie to jest wygodne, składniki zestawu mogą być w postaci zliofilizowanej.
176 727
W końcu, w dalszym aspekcie, wynalazek dostarcza nowe zastosowanie dla związku wiążącego immunofiliny jako czynnik współzawodniczący w wiązaniu immunofilin w zestawie do oznaczania lub w metodzie pomiaru poziomu we krwi innego związku wiążącego immunofiliny, np. zastosowanie dla związku [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]Ciclosporin w zestawie do oznaczania lub w metodzie mierzenia poziomu cyklosporyny we krwi; zastosowanie dla rapamycyny w zestawie do oznaczania lub w metodzie mierzenia poziomu związku FK506 we krwi oraz zastosowanie dla FK506 w zestawie do oznaczania lub w metodzie mierzenia poziomu rapamycyny we krwi.
Opisane poniżej przykłady, nie ograniczają zakresu wynalazku. Będzie oczywiste dla biegłych w tej dziedzinie, że mogą występować różnice w dokładnych stężeniach składników reakcji i warunkach prowadzenia reakcji z chwilą kiedy farmaceutykjest uwolniony z kompleksu farmaceutyku związanego z immunofiliną, może być on oznaczany dowolnym z konwencjonalnych sposobów.
Przykład 1- Oznaczanie cyklosporyny A
Próbki kalibracyjne: 16 pg cyklosporyny A dodaje się do 1ml 70% v/v wodnego roztworu etanolu i przechowuje w 4°C. 50 pl roztworu cyklosporyny A rozcieńcza się w 1 ml ludzkiej krwi (otrzymanej z Blutspendezentrum Basel) do stężenia cyklosporyny 800 ng/ml. Następnie przygotowuje się próbki kalibracyjne o stężeniu 400 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,2 ng/ml, 3,1 ng/ml, 1,6 ng/ml, 0,8 ng/ml i 0,4 ng/ml poprzez kolejne rozcieńczenia 500 pl roztworu cyklosporyny A w 1ml ludzkiej krwi. Próbki krwi bez cyklosporyny A przygotowuje się jako ślepe próby.
Wstępnie przygotowane płytki do mikromiareczkowania: Każde wgłębienie na kilku płytkach do miareczkowania o 96 wgłębieniach opłaszcza się 100 pl kozich antymysich przeciwciał (GaM IgG Fc nieskoniugowane, Pierce 31170) rozcieńczonych do 10 pg/ml w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS). Płytki do mikromiareczkowania inkubuje się przez noc w 4°C. Kozie antymysie przeciwciała usuwa się i do każdego wgłębienia dodaje się 200 pl roztworu blokującego (2 g albuminy z surowicy cielęcej rozpuszczonej w 100 ml PBS). Płytki do mikromiareczkowania inkubuje się w 37°C przez 2 godziny i następnie przemywa w urządzeniu do płukania płytek, stosując 3 x 300 pl roztworu PBS/Tween 20 (0,5 g Tween 20 w 1 litrze PBS). Tak przygotowane płytki do mikromiareczkowania są przechowywane w 4°C.
Płytka z przeciwciałami: 1 ml roztworu PBS/Tween 20 dodaje się do fiolki ze specyficznym dla cyklosporyny A przeciwciałem monoklonalnym w postaci zliofilizowanej. Przeciwciało jest opisane w WO 86/2080 i stanowi część handlowo dostępnego zestawu SandimmunR-kit. Roztwór przeciwciała rozcieńcza się następnie 1:10 w roztworze PBS/Tween 20 i 100 pl nanosi się pipetą do wybranych wgłębień wstępnie przygotowanej płytki do mikromiareczkowania. Do pozostałych wgłębień nanosi się pipetą po 100 pl roztworu PBS/Tween 20. Płytkę do mikromiareczkowania inkubuje się przez noc w 4°C.
Wskaźnik cyklosporyny: Fiolkę zawierającą 1 ml radioaktywnej dwuwodnej cyklosporyny A w 96% v/v wodnym roztworze alkoholu otrzymano z handlowo dostępnego zestawu SandimmunR-kit.
Roztwór czynnika współzawodniczącego; 4,2 mg związku [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-Ciclosporin, otrzymanego tak, jak opisano w EP 296 122, rozpuszcza się w 1 ml metanolu i przechowuje w 4°C.
125 pl każdej próbki kalibracyjnej (włączając ślepą próbę) nanosi się pipetą do wgłębienia niczym nie traktowanej płytki do mikromiareczkowania. 125 pl próbek testowanej krwi nanosi się pipetą do każdego z pozostałych wgłębień. Do każdego wgłębienia dodaje się 100 pl roztworu PBS/Tween 20 i 25 pl wskaźnika cyklosporyny. Płytkę do mikromiareczkowania wytrząsa się przez 5 minut, a następnie inkubuje w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do każdego wgłębienia dodaje się 3 pl roztworu czynnika współzawodniczącego, płytkę do mikromiareczkowania wytrząsa się przez 5 minut i tak traktowane próbki kalibracyjne i próbki krwi inkubuje się przez noc w 4°C.
Płytkę z przeciwciałami przemywa się 3 x 300 pl roztworu PBS/Tween 20 i 100 pl przygotowanej uprzednio próbki kalibracyjnej lub przygotowanej uprzednio próbki krwi dodaje się do każdego z wgłębień. Płytkę do mikromiareczkowania inkubuje się przez 3 godziny w 4°C,
176 727 a następnie przemywa 3 x 300 gl roztworu PBS/Tween 20. Do każdego wgłębienia dodaje się
100 fil roztworu 1 g siarczanu sodowego dodecylu rozpuszczonego w 100 ml wody, płytkę do mikromiareczkowania wytrząsa się prz'ez-5 minut w temperaturze pokojowej i następnie inkubuje przez 15 minut w 37°C. 100 gl roztworu z ' każdego wgłębienia analizuje się przy użyciu licznika scyntylacyjnego Packard 2000CA.
Krzywą kalibracyjną przygotowuje się na podstawie wyników otrzymanych dla próbek kalibracyjnych. Krzywą przedstawia się jako procent wiązania przeciwciało-wskaźnik w porównaniu do ślepej próby naniesionej na wykres, w stosunku do log stężenia cyklosporyny A.
Współczynnik zmienności dla wyników jest mniejszy niż 30% w zakresie od 0,7 ng cyklosporyny A/ml krwi do 400 ng cyklosporyny A/ml krwi. Zakres ten, z którym można pracować wskazuje, że wysoka dokładność może być otrzymana nawet dla bardzo niskich stężeń.
Wiarygodność oznaczenia potwierdza się poprzez powtórzenia. 100 ng i 400 ng cyklosporyny A rozpuszcza się w 1 ml ludzkiej krwi tak, aby otrzymać stężenia 100 ng/ml i 400 ng/ml. Celem określenia stężenia każdą próbkę analizuje się czterokrotnie, stosując metodę opisaną w przykładzie 1.
Wyniki przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1: Dokładność
| Test | Kontrola (ng/ml) | Średnia wartość mierzona (ng/ml) | % Odchylenia |
| 1 | 100 | 99,0 | 1 |
| 400 | 450,0 | 12,5 | |
| 2 | 100 | 102,0 | 2 |
| 400 | 405,5 | 1,4 | |
| 3 | 100 | 99,5 | 0,5 |
| 400 | 429,5 | 7,4 | |
| 4 | 100 | 90,0 | 10 |
| 400 | 385,5 | 3,6 |
Dla 100 ng/ml średnia wartość wynosi 97,6 ng/ml, dając średnie odchylenie 2,4%. Dla 400 ng/ml średnia wartość wynosi 417,6 ng/ml dając średnie odchylenie 4,4%.
Wyniki te wskazują, że wysoki stopień dokładności może być otrzymywany w sposób powtarzalny.
Przykład 2 - oznaczanie FK506
Przygotowanie płytki do mikromiareczkowania: Każde wgłębienie opłaszcza się 100 gl kozich antymysich przeciwciał w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS). Płytki do mikromiareczkowania inkubuje się przez noc w 4°C. Kozie antymysie przeciwciała usuwa się i do każdego wgłębienia dodaje się 200 gl roztworu blokuj ącego (2 g albuminy z surowicy cielęcej rozpuszczonej w 100 ml PBS). Płytki do mikromiareczkowania inkubuje się w 37°C przez 2 godziny i następnie przemywa w urządzeniu do płukania płytek, stosując roztwór 3 x 300 gl PBS/Tween 20 (0,5 g Tween 20 w 1 litrze PBS). Płytki do mikromiareczkowania są przechowywane w 4°C.
Sto gl króliczego anty-FK506 przeciwciała rozcieńcza się 1000 razy w roztworze PBS/Tween 20 i dodaje do każdego wgłębienia. Płytkę do mikromiareczkowania inkubuje się przez noc w 4°C.
Próbki kalibracyjne: FK506 rozcieńcza się albo w ludzkiej pełnej krwi albo w PBS/Tween 20 do stężenia 200 ng/ml, 20 ng/ml lub 2 ng/ml. Próbka krwi bez FK506 stanowi ślepą próbę.
Roztwór czynnika współzawodniczącego: Wyznakowany trytem FK506 rozcieńcza się kolejno do uzyskania 10000 cp m w 25 gl.
Oznaczenie: 25 gl próbki kalibracyjnej w pełnej krwi lub w buforze dodaje się i miesza ze 100 gl PBS/Tween 20 zawierającego 50, 10, 1 o 0 gg/ml rapamycyny. Do każdego wgłębienia
176 727 dodaje się 25 gl roztworu czynnika współzawodniczącego. Płytkę do mikromiareczkowania inkubuje się 3 godz. w 4°C, a następnie przemywa 3 razy 300 gl PBS/Tween 20. Do każdego wgłębienia dodaje się 100 μΐ roztworu 1 g siarczanu sodowego dodecylu rozpuszczonego w 100 ml wody, płytkę do mikromiareczkowania wytrząsa się przez 5 minut w temperaturze pokojowej i następnie inkubuje przez 15 minut w 37°C. 100 gl roztworu z każdego wgłębienia analizuje się przy użyciu licznika scyntylacyjnego Packard 2000CA.
Wyniki: Oznaczenie przy użyciu próbek w buforze daje podobne krzywe standardowe z różnymi stężeniami rapamycyny, jak z czynnikiem wypierającym. Wyniki pokazują, że królicze przeciwciała anty-FK506 nie reagują krzyżowo z rapamycyną.
Oznaczenie wykonane przy użyciu próbek w pełnej krwi daje bardzo niski sygnał, gdy nie używa się rapamycyny jako czynnika wypierającego, ponieważ FK506 jest związany z białkami wiążącymi znajdującymi się w pełnej krwi i nie jest dostępny dla reakcji z przeciwciałem. Kiedy rapamycyhę dodaje się jako czynnik współzawodniczący dla makrofiliny, otrzymane krzywe standardowe są podobne do tych otrzymanych w buforze.
Claims (8)
1. Sposób oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi, przy czym stężenie to wynosi co najmniej 0,7 ng/ml krwi, znamienny tym, że do próbki krwi dodaje się czynnik współzawodniczący w wiązaniu w takiej ilości, która jest wystarczająca do wypierania farmaceutyku z kompleksów immunosupresor-immunofilina we krwi, następnie dodaje wiążący się z farmaceutykiem receptor, który z czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu wiąże się tylko w stopniu nieznacznym, a jego zdolność do reakcji krzyżowej pomiędzy farmaceutykiem a czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu wynosi mniej niż 1%, następnie wydziela się kompleks receptor-farmaceutyk z próbki i określa się ilość farmaceutyku, przy czym jako farmaceutyk wiążący się z immunofiliną stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej: (a) cyklosporynę, (b) związek FK506 albo (c) rapamycynę albo 40-O-hydroksyetylorapamycynę, jako czynnik współzawodniczący w wiązaniu stosuje się odpowiednio: (a) [Thr2, Leu, D-Hiv8, Leu10]-cyklosporynę, (b) rapamycynę albo (c) związek FK506, a jako receptor stosuje się odpowiednio: (a) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla cyklosporyny, (b) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla związku FK506 albo (c) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla rapamycyny albo dla 40-O-hydroksyetylorapamycyny.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako farmaceutyk wiążący się z immunofiliną stosuje się cyklosporynę, jako czynnik współzawodniczący w wiązaniu stosuje się [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-cyklosporynę, a jako receptor stosuje się przeciwciało monoklonalne specyficzne dla cyklosporyny.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako farmaceutyk wiążący się z immunofiliną stosuje się związek FK506, jako czynnik współzawodniczący w wiązaniu stosuje się rapamycynę, a jako receptor stosuje się przeciwciało monoklonalne specyficzne dla związku FK506.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako farmaceutyk wiążący się z immunofiliną stosuje się rapamycynę albo 40-O-hydrok.syetylorapamycynę, jako czynnik współzawodniczący w wiązaniu stosuje się związek FK506, a jako receptor stosuje się przeciwciało monoklonalne specyficzne dla rapamycyny albo 40-O-hydroksyetylorapamycyny. ’
5. Zestaw do oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi, przy czym stężenie to wynosi co najmniej 0,7 ng/ml krwi, znamienny tym, że zawiera czynnik współzawodniczący w wiązaniu w takiej ilości, która jest wystarczająca do wypierania farmaceutyku z kompleksów immunosupresor-immunofilina we krwi i zawiera wiążący się z farmaceutykiem receptor, który z czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu wiąże się tylko w stopniu nieznacznym, a jego zdolność do reakcji krzyżowej pomiędzy farmaceutykiem a czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu wynosi mniej niż 1 %, przy czym farmaceutykiem wiążącym się z immunofiliną jest związek wybrany z grupy obejmującej: (a) cyklosporynę, (b) związek FK506 albo (c) rapamycynę albo 40-C^-hydroksyetylorapamycynę, czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu jest odpowiednio: (a) [Thr2, Leu5, D-Hiv, Leu10]-cyklosporyna, (b) rapamycyna albo (c) związek FK506, a receptorem jest odpowiednio: (a) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla cyklosporyny, (b) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla związku FK506 albo (c) monoklonalne przeciwciało specyficzne dla rapamycyny albo dla 40-O-hydroksyetylorapamycyny.
6. Zestaw według zastrz. 5, znamienny tym, że farmaceutykiem wiążącym się z immunofiliną jest cyklosporyna, czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu jest [Thr2, Leu5,
176 727
8 10
D-Hiv , Leu ]-cyklosporyna, a receptorem jest przeciwciało monoklonalne specyficzne dla cyklosporyny.
7. Zestaw według zastrz. 5, znamienny tym, że farmaceutykiem wiążącym się z immunofiliną jest związek FK506, czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu jest rapamycyna, a receptorem jest przeciwciało monoklonalne specyficzne dla związku FK506.
8. Zestaw według zastrz. 5, znamienny tym, że farmaceutykiem wiążącym się z immunofiliną jest rapamycyna albo 40-O-hydroksyetylorapamycyna, czynnikiem współzawodniczącym w wiązaniu jest związek FK506, a receptorem jest przeciwciało monoklonalne specyficzne dla rapamycyny albo 40-0)4iydroksyetylorapair)ycy'riy.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB939318612A GB9318612D0 (en) | 1993-09-08 | 1993-09-08 | An assay |
| PCT/EP1994/002986 WO1995007468A1 (en) | 1993-09-08 | 1994-09-07 | Assay kit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL313392A1 PL313392A1 (en) | 1996-06-24 |
| PL176727B1 true PL176727B1 (pl) | 1999-07-30 |
Family
ID=10741695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94313392A PL176727B1 (pl) | 1993-09-08 | 1994-09-07 | Sposób oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi i zestaw do oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0717850B1 (pl) |
| JP (1) | JP2892503B2 (pl) |
| KR (1) | KR100313841B1 (pl) |
| CN (1) | CN1088196C (pl) |
| AT (1) | ATE153769T1 (pl) |
| AU (1) | AU680946B2 (pl) |
| BR (1) | BR9407422A (pl) |
| CA (1) | CA2169162C (pl) |
| CZ (1) | CZ289434B6 (pl) |
| DE (1) | DE69403484T2 (pl) |
| DK (1) | DK0717850T3 (pl) |
| ES (1) | ES2103136T3 (pl) |
| FI (1) | FI111035B (pl) |
| GB (1) | GB9318612D0 (pl) |
| GR (1) | GR3023578T3 (pl) |
| HU (1) | HU218743B (pl) |
| NO (1) | NO960924D0 (pl) |
| NZ (1) | NZ273595A (pl) |
| PL (1) | PL176727B1 (pl) |
| RU (1) | RU2138052C1 (pl) |
| SK (1) | SK281369B6 (pl) |
| WO (1) | WO1995007468A1 (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6187757B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-02-13 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | Regulation of biological events using novel compounds |
| US5650288A (en) * | 1995-07-14 | 1997-07-22 | Macfarlane; Gordon D. | Immunophilin-bound immunosuppressant assay |
| WO1997033604A1 (en) * | 1996-03-12 | 1997-09-18 | Picower Institute For Medical Research | Treatment of hiv-infection by interfering with host cell cyclophilin receptor activity |
| US6106779A (en) * | 1997-10-02 | 2000-08-22 | Biosite Diagnostics, Inc. | Lysis chamber for use in an assay device |
| ATE264863T1 (de) | 1999-08-24 | 2004-05-15 | Ariad Gene Therapeutics Inc | 28-epirapaloge |
| US7067526B1 (en) | 1999-08-24 | 2006-06-27 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | 28-epirapalogs |
| AU2003300076C1 (en) | 2002-12-30 | 2010-03-04 | Angiotech International Ag | Drug delivery from rapid gelling polymer composition |
| US7186518B2 (en) | 2003-11-21 | 2007-03-06 | Dade Behring Inc. | Method and composition useful for determining FK 506 |
| WO2006115509A2 (en) | 2004-06-24 | 2006-11-02 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Small molecule immunopotentiators and assays for their detection |
| AU2006259348B2 (en) | 2005-06-17 | 2010-07-22 | Novartis Ag | Use of sanglifehrin in HCV |
| CN100434901C (zh) * | 2006-01-12 | 2008-11-19 | 上海交通大学 | 血红蛋白凝胶层析的教学试剂盒 |
| US7914999B2 (en) * | 2006-12-29 | 2011-03-29 | Abbott Laboratories | Non-denaturing lysis reagent |
| US7790401B2 (en) * | 2007-08-06 | 2010-09-07 | Siemens Healthcare Diagnostics | Methods for detection of immunosuppressant drugs |
| US8921642B2 (en) | 2008-01-11 | 2014-12-30 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Conditional-stop dimerizable caspase transgenic animals |
| US9658218B2 (en) | 2012-05-07 | 2017-05-23 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Determination of total analyte concentration |
| US9121859B2 (en) * | 2012-12-04 | 2015-09-01 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Compounds and methods for determination of FKBP-binding immunosuppressant drugs |
| EP3008192B1 (en) | 2013-06-11 | 2019-07-17 | Takara Bio USA, Inc. | Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same |
| KR101760707B1 (ko) | 2015-01-05 | 2017-07-24 | 한림대학교 산학협력단 | 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트 |
| CN104749009B (zh) * | 2015-03-30 | 2018-05-04 | 上海云泽生物科技有限公司 | 用于免疫分析的免疫抑制剂药物提取试剂 |
| CN104764883A (zh) * | 2015-03-31 | 2015-07-08 | 上海云泽生物科技有限公司 | 一种检测环孢霉素a浓度的免疫分析方法和试剂盒 |
| ES2992864T3 (en) * | 2018-11-02 | 2024-12-18 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc | Binding competitors for use in macrophilin-binding pharmaceutical assays and methods of use thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1490650A1 (ru) * | 1987-04-06 | 1989-06-30 | Институт биологической физики АН СССР | Способ количественного определени стероидных гормонов |
| DE3886265T2 (de) * | 1987-06-05 | 1994-04-28 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Anti-FR-900506-Stoffe-Antikörper und höchstempfindliches Enzym-Immunoassay-Verfahren. |
| DE3884470T2 (de) * | 1987-06-17 | 1994-03-10 | Sandoz Ag | Cyclosporine und deren Benutzung als Arzneimittel. |
| US5322772A (en) * | 1991-04-09 | 1994-06-21 | Children's Research Institute | Rapamycin assay |
| WO1993025533A1 (en) * | 1992-06-05 | 1993-12-23 | Abbott Laboratories | Methods and reagents for the determination of immunosuppressive agents |
| GB9307491D0 (en) * | 1993-04-08 | 1993-06-02 | Sandoz Ltd | Organic compounds |
-
1993
- 1993-09-08 GB GB939318612A patent/GB9318612D0/en active Pending
-
1994
- 1994-09-07 DK DK94927577.0T patent/DK0717850T3/da active
- 1994-09-07 HU HU9600564A patent/HU218743B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-07 WO PCT/EP1994/002986 patent/WO1995007468A1/en not_active Ceased
- 1994-09-07 CZ CZ1996662A patent/CZ289434B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-09-07 EP EP94927577A patent/EP0717850B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-07 RU RU96107464A patent/RU2138052C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-09-07 SK SK310-96A patent/SK281369B6/sk unknown
- 1994-09-07 PL PL94313392A patent/PL176727B1/pl unknown
- 1994-09-07 BR BR9407422A patent/BR9407422A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-09-07 CA CA002169162A patent/CA2169162C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-07 DE DE69403484T patent/DE69403484T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-07 ES ES94927577T patent/ES2103136T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-07 CN CN94193303A patent/CN1088196C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-07 NZ NZ273595A patent/NZ273595A/en unknown
- 1994-09-07 KR KR1019960701107A patent/KR100313841B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-07 JP JP7508458A patent/JP2892503B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-07 AU AU76948/94A patent/AU680946B2/en not_active Ceased
- 1994-09-07 AT AT94927577T patent/ATE153769T1/de active
-
1996
- 1996-03-04 FI FI961004A patent/FI111035B/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-03-07 NO NO960924A patent/NO960924D0/no unknown
-
1997
- 1997-05-29 GR GR970401194T patent/GR3023578T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6187547B1 (en) | Assay kit | |
| PL176727B1 (pl) | Sposób oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi i zestaw do oznaczania stężenia farmaceutyków wiążących immunofiliny we krwi | |
| US7186518B2 (en) | Method and composition useful for determining FK 506 | |
| US7883855B2 (en) | Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays | |
| US8153594B2 (en) | Tacrolimus standard and methods of using same | |
| BRPI0722361A2 (pt) | Reagente de extração de fármaco imunossupressor para imunoensaios | |
| EP1875250B1 (en) | Methods to measure immunosuppressive tacrolimus, sirolimus, and cyclosporin a complexes in a blood sample | |
| US7223553B2 (en) | Immunoassays for everolimus | |
| Wallemacq et al. | Improvement and assessment of enzyme-linked immunosorbent assay to detect low FK506 concentrations in plasma or whole blood within 6 hours | |
| HK1005754B (en) | Assay kit | |
| CA2004387C (en) | Cyclosporine binding protein and use in an assay for biologically-active cyclosporine | |
| Zhang et al. | Production of a sensitive antibody against sirolimus for chemiluminescence immunoassay potential in its therapeutic drug monitoring |