PL177743B1 - Sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej i wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny - Google Patents

Sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej i wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny

Info

Publication number
PL177743B1
PL177743B1 PL94311691A PL31169194A PL177743B1 PL 177743 B1 PL177743 B1 PL 177743B1 PL 94311691 A PL94311691 A PL 94311691A PL 31169194 A PL31169194 A PL 31169194A PL 177743 B1 PL177743 B1 PL 177743B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
flavonoid
hydroxylase
plants
gene
color
Prior art date
Application number
PL94311691A
Other languages
English (en)
Other versions
PL311691A1 (en
Inventor
Timothy A. Holton
Yoshikazu Tanaka
Original Assignee
Int Flower Dev Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AUPM4698A external-priority patent/AUPM469894A0/en
Application filed by Int Flower Dev Pty Ltd filed Critical Int Flower Dev Pty Ltd
Publication of PL311691A1 publication Critical patent/PL311691A1/xx
Publication of PL177743B1 publication Critical patent/PL177743B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A01H6/1424—Chrysanthemum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/30—Caryophyllaceae
    • A01H6/305—Dianthus carnations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/74—Rosaceae, e.g. strawberry, apple, almonds, pear, rose, blackberries or raspberries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13088—Flavonoid 3',5'-hydroxylase (1.14.13.88)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Sposób uzyskiwania nowej barwy rosliny ozdobnej, znamienny tym, ze do komórek rosliny wprowadza sie wektor binarny zawierajacy rekombinowany gen chimeryczny, w którego sklad wchodzi promotor pochodzacy z genu kodujacego enzym szlaku flawo- noidów oraz kontrolowana przez ten promotor sekwencja kodujaca 3’, 5’ -hydroksylaze flawonoidowa, zwieksza sie ilosc wytwarzanych antocyjanidynowych pochodnych anto- cyjanów pochodzacych od delfinidyny wywolujac ekspresje genu chimerycznego. 6. Wektor binarny zawierajacy rekombinowany gen chimeryczny, w którego sklad wchodzi promotor pochodzacy z genu kodujacego enzym szlaku flawonoidów oraz kon- trolowana przez ten promotor sekwencja kodujaca 3’,5’ -hydroksylaze flawonoidowa. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej, charakteryzujący się tym, że do komórek rośliny wprowadza się wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny, w którego skład wchodzi promotor pochodzący z genu kodującego enzym szlaku flawonoidów oraz kontrolowana przez ten promotor sekwencj a koduj ąca 3 ’, 5 ’-hy droksylazę flawonoidową, zwiększa się ilość wytwarzanych antocyjanidynowych pochodnych anocy-janów pochodzących od delfinidyny wywołując ekspresję genu chimerycznego.
177 743
Korzystnie sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidowąstosowana w sposobie według wynalazku pochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, w szczególności z petunii lub lisianthusa. Równie korzystnie promotor stosowany w sposobie według wynalazku pochodzi z genu kodującego syntetazę chalkonową (CHS).
Korzystnie wektorem binarnym wprowadzanym w sposobie według wynalazku jest plazmid wybrany z grupy, do której należąpCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458. Korzystnie komórki roślinne stosowane w sposobie według wynalazku pochodzą z rośliny takiej jak róża, goździk albo chryzantema.
Kolejnym aspektem wynalazku jest wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny, w którego skład wchodzi promotor pochodzący z genu kodującego enzym szlaku, flawonoidów oraz kontrolowa przez ten promotor sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidową.
Korzystnie wektor binarny według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidowąpochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, w szczególności z petunii lub lisianthusa. Korzystnie wektor binarny według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor stanowi promotor genu CHS.
Korzystnie wektor binarny według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest to plazmid wybrany z grupy, do której nale:żąpCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458.
W sposobie według wynalazku wytwarzana jest roślina transgeniczna, lub jej potomstwo, dobrana z grupy, do której należą róża, goździk i chryzantema, wytwarzająca polipeptyd wykazujący aktywność 3’,5’ -hydroksylazy flawonoidowej, przy czym ta roślina transgeniczna wytwarza większe ilości antocyjanów pochodnych delfinidyny, niż nietrasgeniczne rośliny tego samego gatunku.
W szczególności wytwarzana jest roślina transgeniczna, lub jej potomstwo, dobrana z grupy, do której należą róża, goździk i chryzantema, wykazująca ekspresję polipeptydu o aktywności 3’,5’ -hydroksylazy flawonoidowej, przy czym ta roślina transgeniczna wytwarza większe ilości delfinidyny i/lub pochodnych delfinidyny, niż nietransgeniczne rośliny tego samego gatunku.
Ekspresjonowany polipeptyd pochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, korzystnie, peptyd stanowi 3’,5’ -hydroksylaza flawonoidowa, a najkorzystniej, 3’,5’ -hydroksylaza pochodząca z petunii.
Stosowana sekwencja genów zawiera cząstkę kwasu nukleinowego, kodującą sekwencję koduj ącą3’,5’ -hydroksylazę i, jeżeli to niezbędne, zawierająca dodatkowe sekwencje genetyczne, takie jak np. sekwencje promotorowe i terminatorowe, umożliwiające ekspresję cząsteczki w roślinie transgenicznej. Gdy sekwencję genów stanowi DNA, może to być cDNA lub DNA genomowe. DNA występuje wpostaci wektora binarnego, zawierającego sekwencję genów chimerycznych, zdolną do włączenia do genomu rośliny w celu wytworzenia rośliny transgenicznej.
Sekwencja genów chimerycznych zawiera promotor roślinny, jak np. CHS lub też sekwencj a genowa 3’ ,5 ’ -hydroksylzzy może być zmodyfikowana w taki sposób , aby zwiększyćekspresję i spowodować podwyższenie poziomu delfinidyny i/lub jej pochodnych. Promotor CHS jest szczególnie korzystny, ponieważ stanowi on promotor roślinny szlaku flawoaoidowżgo i kieruje wysokim poziomem ekspresji sekwencji genetycznych za promotorem. Najkorzystniejsze wektory binarne stanowiąpCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458.
„Cząsteczka kwasu nukleinowego” w rozumieniu niniejszego opisu oznacza dowolny ciąg zasad nuklidowych, określających sekwencj ę aminokwasów 3’,5 ’ -hydroksyl<sz'’ Kwas nukleinowy może kodować enzym o pełnej długości lubjego czymaąpochodną. Termin „pochodna” oznacza dowolnąpochodną, u^^^at^iąpoprzez pojedyncząl^ mnogąsuastytucję, delecję i/lub addycję aminokwasów w porównaniu z enzymem występującym naturalnie. W tym rozumieniu kwas nukleinowy zawiera naturalnie występującą sekwencję nukleotydową, kodiu^t^ią3’,5’ hydroksy^ę,
177 743 lub też sekwencję poddaną pojedynczej lub mnogiej substytucji, delecji i/lub addycji nukleotydów w porównaniu z sekwencją występującą naturalnie. Terminy „analogi” i „pochodne” obejmująrównież dowolne czynne ekwiwalenty chemiczne 3’,5’ -hydroksylazy pod warunkiem, że taka cząsteczka kwasu nukleinowego przy wytwarzaniu rośliny transgenicznej według niniejszego wynalazku powoduje, że roślina transgeniczna wykazuje jedną lub więcej z następujących właściwości:
(i) wytwarzanie 3’,5’ -hydroksylazo-swoistego mRNA;
(ii) wytwarzanie białka 3’,5’ -hydroksylazy;
(iii) wytwarzanie delfinidyny i/lub jej pochodnych, i/lub (iv) zmieniony kwiatostan.
W szczególności, roślina transgeniczna wykazuje jedną lub więcej z następujących właściwości:
(i) podwyższenie poziomu- 3’,5’ -hydroksylazo-swoistego mRNA w porównaniu z nietransgenicznym poziomem endogennym;
(ii) zwiększone wytwarzanie białka 3’,5’ -hydroksylazy;
(iii) zwiększone wytwarzanie delfinidyny i/lub jej pochodnych, w porównaniu z nietransgenicznym poziomem endogennym, i/lub (iv) zmieniony kwiatostan.
Cząsteczki kwasów nukleinowych mogą być stosowane same lub w połączeniu z cząsteczką wektora, korzystnie, wektora ekspresyjnego. Takie cząsteczki wektora uleg^jćąreplikacji i/lub ekspresji w komórkach eukariotycznych i/lub prokariotycznych. Korzystnie, cząsteczki wektora, lub jej części mają zdolność włączania się do genomu rośliny. Cząsteczka kwasu nukleinowego może dodatkowo zawierać sekwencję ułatwiającą to włączenie i/lub sekwencję promotorową zdolną do kierowania ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce roślinnej. Cząsteczka kwasu nukleinowego i promotor mogą wchodzić do komórki w różny sposób, np. poprzez elektroporację, bombardowanie mikropociskami lub przeniesienie poprzez Agrobacterium.
W sposobie według wynalazku komórki transgenicznej dobranej z grupy, do której należą róża, goździk i chryzantema, wprowadza się cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą 3’,5’ -hydroksylazę, przez co możliwa staje się przemiana DHK i/lub innych odpowiednich substratów w pochodne antocyjanowe antocyjanidyn, takichjak petunidyna, malwidyna i w szczególności delfinidyna. Wytwarzanie tych antocyjanów odgrywa rolę w wytwarzaniu różnych odcieni barwy niebieskiej lub barwy zbliżonej do niebieskiej, lub też w inny sposób modyfikuje barwę kwiatów, zmieniając wytwarzanie antocyjanów, z wytwarzania pelargonidyny, cyjanidyny i peonidyny, i ich pochodnych, ku wytwarzaniu delfinidyny i jej pochodnych. Ekspresja sekwencji kwasu nukleinowego w roślinie może być cechąkonstytucyjną wywołaną lub rozwojową. Wyrażenie „zmieniony kwiatostan” oznacza dowolną zmianę barwy kwiatów w porównaniu z barwą kwiatów występujących naturalnie, biorąc pod uwagę naturalne wahania pomiędzy poszczególnymi kwitnieniami. Korzystnie, „zmiana kwiatostanu” oznacza wytwarzanie różnych odcieni barwy niebieskiej, purpurowej lub różowej, różnych od występujących w roślinach nietransgenicznych.
Powstające w sposobie według wynalazku transgeniczne rośliny kwitnące, wykazująpodwyższony poziom wytwarzania delfinidyny i/lub jej pochodnych w porównaniu z nietransgenicznym poziomem endogennym, przy czym sposób ten polega na wprowadzaniu do komórki rośliny, dobranej z grupy, do której należąróża, goździk i chryzantema, cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującej sekwencję kodującą 3’,5’-hydroksylazę w warunkach umożliwiających ostateczną ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego, regenerację rośliny transgenicznej z komórki i uzyskanie wzrostu rośliny transgenicznej przez pewien czas w warunkach odpowiednich dla osiągnięcia ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego w enzym 3’,5’ -hydroksylazę.
W sposobie według wynalazku następuje wytwarzanie rośliny transgenicznej, dobranej z grupy, do której należąróża, goździk i chryzantema, w sposób polegający na wprowadzaniu do rośliny sekwencji genowej, zawierającej sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą 3’,5’ -hy6
177 743 droksylazę flawonoidową, przez co roślina transgeniczna wytwarza większe ilości antocyjanów pochodnych delfinidyny w porównaniu z roślinami nietransgenicznymi, odpowiednio, tego samego gatunku.
W preferowanym wykonaniu sposobu powstająca transgeniczna roślina kwitnąca wykazuje zmianę właściwości kwiatostanu z jednoczesnym zwiększeniem poziomu wytwarzania delfinidyny, przy czym zmiana kwiatostanu polega na wytwarzaniu kwiatów niebieskich lub w odcieniach niebieskawych, w zależności od stanu fizjologicznego rośliny biorcy. W przypadku niektórych gatunków roślin korzystne może być dobranie „wysokiej linii pH”, zdefiniowanej jako odmiana wykazująca wyższe niż przeciętne pH w wakuolach płatków. Rekombinacyjna 3’,5’ - hydroksylaza lub jej mutanty i pochodne mogą pochodzić z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, lisianthusa, dzwonka lub bakłażana.
W związku z tym w sposobie według wynalazku wytwarzana jest transgeniczna róża, goździk lub chryzantema, zawierająca całą lub część cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującej 3’,5’ -hydroksylazę i/lub jej dowolne homologii lub formy pochodne, w szczególności zaś rośliny transgeniczne wykazujące wysoki poziom 3’,5’ -hydroksylazo-swoistego mRNA i/lub zwiększone wytwarzanie pochodnych delfinidyny i/lub zmienione właściwości kwiatostanu. Rośliny transgeniczne zawierają wprowadzoną w sposób stabilny cząsteczkę kwasu nukleinowego, zawierającą sekwencję nukleotydową, kodującą enzym 3’,5’ -hydroksylazę. Produktami sposobu według wynalazkujest ponadto potomstwo takich roślin transgenicznych, jak również ich materiał reprodukcyjny (np. nasiona). Takie nasiona, zwłaszcza, jeśli są barwne, nadają się m. in. do zastosowania jako znaczniki roślin.
Niniejszy wynalazek opisano poniżej w odniesieniu do następujących, nie ograniczających, figur i przykładów.
Na figurach:
Figury 1 (A) i (B) stanowią schematyczne przedstawienie szlaku biosyntezy barwników flawonoidowych. Enzymy w pierwszej części szlaku oznaczono następująco: PAL = liaza fenyloalaninowo-amonowa: C4H = 4-hydroksylaza cynamonowa; 4CL = ligaza 4-kumarynoCoA; CHS = syntetaza chalkonowa; CHI = izomeraza chalkonowo - flawononowa; F3H = 3-hydroksylaza flawononowa; DFR = 4-reduktaza dihydroflawonolowa; UFGT = 3-0-glukozylotransferazaUDP-glukozo-flawonoidowa. Następne etapy odpowiadąjąkonwersjom zachodzącym w kwiatach P. hybrida i stanowią: 1 = przyłączenie ramnozy do reszty glukozylowej cyjanidyno-3-glukozydu i delfinidyno-3-glukozydu; 2 = acylację i 5-0-glukozylację; 3 = metylację w pozycji 3’; 4 = metylację w pozycji 5’; 5 = metylację w pozycjach 3’, 5’.
Figura 2 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP812, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 3. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II; GUS = region kodujący β -glukuronidazy. Zaznaczono opisany w przykładzie 3 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.
Figura 3 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP485, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 4. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II. Zaznaczono opisany w przykładzie 4 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.
Figura 4 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP628, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 5. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; rB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II. Zaznaczono opisany w przykładzie 5 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.
Figura 5 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP653, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 6. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II.
177 743
Zaznaczono opisany w przykładzie 6 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.
Figura 6 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP484, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 7. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II. Zaznaczono opisany w przykładzie 7 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.
Figura 7 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP1458, którego wytwarzanie opisano w Przykładzie 8. nptI = gen oporności na fosfotransferazę I neomycyny; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II. Zaznaczono opisany w przykładzie 8 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.
Figura 8 stanowi zdjęcie autoradiograficzne hybrydyzacji sposobem Southern tkanki przyrannej odmiany Royalty transformowanej pCGP628. DNA genomowe zostało przecięte EcoRI i sondowane 720 bp ECoRV fragmentem wewnętrznym Hf1 cDNA. Kontrolę ujemną(N) stanowi tkanka przyranna odmiany Royalty, transformowana pCGP293. Kontrola dodatnia (H) zawiera 10 pg fragmentu Hf1. Strzałki wskazują 2 kb fragment ECoRI, którego obecność jest spodziewana w transformowanych roślinach.
Figura 9 stanowi zdjęcie autoradiograficzne hybrydyzacji sposobem Southern tkanki przyrannej chryzantemy odmiany Blue Ridge transformowanej pCGP484. DNA genomowe zostało przecięte XbaI, który uwalnia 2,3 kb fragment Hf1-PLTP, i sondowane 1,8 kb fragmentem FspI/BspHI, uwolnionym z pCGP602, zawierającym Hf1 cDNA. Kontrolę ujemną (N) stanowi DNA genomowe wyizolowane z nietransformowanych roślin odmiany Blue Ridge. Kontrolę dodatnią (P) stanowi DNA plazmidowe pCGP485, pocięte XbaI. Strzałki wskazują2,3 kb produkt, którego obecność jest spodziewana w transformowanych roślinach.
Przykład 1. Materiał
Eriodiktiol i dihydrokwercetynę uzyskano z firmy Carl Roth KG, a naringeninę - z firmy Sigma. Dihydromirycetynę wytworzono chemicznie z mirycetyny (Extra Synthese, Francja) sposobem opisanym przez Vercruysse i wsp. (1985). [3H]-naringeninę (5,7 Ci/mmol) i [3H]-dihydrokwercetynę (12,4 Ci/mmol) uzyskano z firmy Amersham. Wszystkie enzymy uzyskano ze źródeł handlowych i zastosowano zgodnie z zaleceniami producentów.
Zastosowany szczep Escherichia coli stanowił:
DH5 α supE44, Δ (lacZYA-ArgF)U169,<^_80lacZAM15, hsdR17(rk-,mk+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, deoR (Hanahan, 1983 i BRL, 1986).
Niewirulentne szczepy Agrobacterium tumefaciens AGLO (Lazo i wsp., 1991) i LBA 4404 (Hoekema i wsp., 1983) uzyskano, odpowiednio, od dr. R Ludwig, Department of Biology, University of California, Santa Cruz, Stany Zjednoczone, i z firmy Calgene, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone.
Wirulentny szczep Agrobacterium tumefaciens ICMP 8317 uzyskano od dr. Richarda Gardnera, Centre for Gene Technology, Department of Cellular and Molecular Biology, University of Auckland, Nowa Zelandia.
Wektor klonujący pBluescript uzyskano z firmy Stratagene. Rośliny hodowano w wyspecjalizowanych cieplarniach, przy czym światło dzienne utrzymywano przez 14 godzin na dobę, a natężenie oświetlenia wynosiło co najmniej 10000 luksów, w temperaturze 22-26°C.
Przykład 2. Wytwarzanie pCGP 90
Plazmid pCGP90 wytworzono, klonując insert cDNA z pCGP602 (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe PCT/AU92/00334; numer publikacji WO 93/01290), za promotorem Mac (Comai i wsp., 1990) pCGP293.
Binarny wektor ekspresyjny pochodził z wektora binarnego Ti pCGN1559 (McBride i Summerfelt, 1990). Plazmid pCGN1559 pocięto KpnI, a wystające końce 3’ usunięto, stosując polimerazę DNA T4, zgodnie ze standardowymi protokołami (Sambrook i wsp., 1989). Wektor cięto następnie XbaI, a powstałe w wyniku tego wystające końce 5’ poddano reparacji za pomocą
177 743 fragmentu Klenow polimerazy I DNA. Następnie wektor poddano powtórnej ligacji dla uzyskania pCGP67. Z pCGP40 wyizolowano 1,97 kb fragment PstI, zawierający promotor Mac, terminator mas i różne miejsca klonujące (Comai i wsp., 1990), i włączono go do miejsca Pst I pCGP67, w wyniku czego wytworzono pCGP293.
Plazmid pCGP40 wytworzono, usuwając gen GUS (Jefferson i wsp., 1987) jako fragment BamHI-SacI zpCGN7334, i zastępując go fragmentem BamHI-SacI z M13 pBluescribe, w skład którego wchodzi miejsce multiklonujące. Plazmid pCGN 7334 (uzyskany z firmy Calgene, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone) wytworzono poprzez insercję fragmentu zawierającego chimeryczny gen Mac-GUS-mas do miejsca XhoI pCGN7329 (Comai i wsp., 1990)
Z pCGP602 wyizolowano następnie fragment BamHI/KpnI, zawierający wyżej wzmiankowany insert cDNA, i fragment ten poddano ligacji z fragmentem BamHI/KpnI pCGP293. Poprawność insercji insertu pCGP90 stwierdzono za pomocą analizy restrykcyjnej DNA, wyizolowanego z transformantów opornych na gentamycynę.
Przykład 3. Wytwarzanie pCGP 812
Binarny wektor ekspresyjny pCGP812 pochodził z wektora binarnego Ti pCGN1558 (McBride i Summerfelt, 1990). ZpKIWI 101 (Jannsen i Gardner, 1989) wyizolowano 5,2 kb fragment XhoI, zawierający chimeryczny gen mas-35S-GUS-ocs, a następnie fragment ten subklonowano do miejsca Xhol pBluescript KS dla wytworzenia pCGP82. Następnie ponownie wyizolowano fragment 5,2 kb poprzez trawienie HindIII/KpnI, i subklonowano go do miejsc HindII/KpnI pCGN1558 dla wytworzenia pCGP83.
Plazmid pCGP83 poddano restrykcji za pomocąKpnI, a wystające końce 3’ usunięto, stosując polimerazę DNA T4, zgodnie ze standardowymi protokołami (Sambrook i wsp., 1989). Następnie do wypełnionych miejsc KpnI dołączono adaptor SmaI-BamHI (Pharmacia) dla wytworzenia „lepkich” końców BamHI. Do „lepkich” końców BamHI pCGP83 przyłączono 3,8 kb fragment BgIII, zawierający chimeryczny gen Mac-Hf1 -mas, pochodzący z pCGP807 (opisanego poniżej), dla wytworzenia pCGP812 (Fig. 2).
Plazmid pCGP807 wytworzono poprzez ligację 1,8 fragmentu BamHI-KpnI, zawierającego wyżej wzmiankowany insert Hf1 cDNA, pochodzący z pCGP602, wraz z końcami BamHi-KpnI pCGP40.
Przykład 4. Wytwarzanie pCGP 485
Binarny wektor pCGP485 pochodził z wektora binarnego Ti pCGN 1547 (McBride i Summerfelt, 1990). Wytworzono gen chimeryczny, zawierający (i) sekwencję promotorową z genu CHS lwiej paszczy, (ii) region kodujący wyżej wzmiankowanego insertu cDNA z pCGP602 petunii oraz (iii) sekwencję terminatorową białka transferazy fosfolipidowej petunii (PTLP). Promotor CHS zawiera 1,2 kb fragment genowy 5’ miejsca inicjacji translacji (Sommer i Saedle, 1986). Insert cDNA petunii składa się z 1,6 kb fragmentu Bcll/FspI, pochodzącego z klonu cDNApCGP602 (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe PCT/AU92/00334; numer publikacji WO 93/01290). Sekwencja terminatorowa PLTP składa się z 0,7 kb fragment SmaI/XhoI, pochodzącego z pCGP 13 Δ Bam (Holton, 1992), w skład którego wchodzi 150 bp region nie poddany translacji z poddanego transkrypcji regionu genu PLTP. Chimeryczny gen CHS/insert cDNA/PLTP klonowano do miejsca PstI pCGN1547 dla wytworzenia pCGP485.
Przykład 5. WytwarzaniepCGP628
Plazmid pCGP176 (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe PCT/-AU92/00334; numer publikacji WO 93/01290) pocięto EcoRI i SpeI. Pocięte DNA upakowano do fragmentów Klenow zgodnie ze standardowymi protokołami (Sambrook i wsp., 1989), po czym uległy one samorzutnej ligacji. W ten sposób uzyskany plazmid oznaczono jako pCGP627. Trawienie pCGP627 przez XbaI/KpnI dało w wyniku 1,8 kb fragment, który następnie poddano ligacji z fragmentem 14,5 kb, uzyskanym poprzez trawienie pCGP293 za pomocąXbaI/Kpn'I. Plazmid uzyskany w ten sposób oznaczono jako pCGP628.
Przykład 6. Wytwarzanie pCGP 653
Plazmid pCGP293 (opisany powyżej w przykładzie 2) poddano trawieniu XbaI, a powstałe w wyniku tego wystające końce 5’ upakowano stosując fragment Klenow, zgodnie ze standardo177 743 wymi protokołami (Sambrook i wsp., 1989). Następnie poddano go trawieniu HindIII. Podczas tej procedury promotor Mac (Comai i wsp., 1990) uległ delecji. 0,8 kb promotor CHS-A z petunii, pochodzący z pCGP669 (opisanego poniżej) poddano ligacji z tym „rdzeniem”jako fragment EcoRI/HindIII o tępych końcach. Ten produkt plazmidowy oznaczono jako pCGP672. Trawienie pCGP807 (opisanego w powyższym przykładzie 3) za pomocąXbaI/Asp718 pozwoliło uzyskać 1,8 kb fragment, zawierający Hf1 cDNA, który poddano ligacji z 16,2 kb fragmentem XbaI/Asp718, pochodzącym z pCGP672. Plazmid uzyskany w ten sposób oznaczono jako pCGP653.
Fragment promotorowy genu CHS-A podano amplifikacji metodą PCR, stosując jako primery oligonukleotydy CHSA-782 i CHS+34 (porównaj poniższe sekwencje), oraz genomowe DNA Petunia hybrida V30jako matrycę. Produkt PCRklonowano następnie do pBluescript o końcu ddT (Holton i Graham, 1991), a orientację fragmentu genu sprawdzano poprzez mapowanie enzymem restrykcyjnym. Plazmid uzyskany w ten sposób oznaczono jako pCGP669. Te primery oligonukleotydowe zostały opracowane dla opublikowanej sekwencji promotora CHS-A petunii (Koes, 1988).
CHSA-782
5’ GTTTTCCAAATCTTGACGTG 3’
CHSA+34
5’ ACGTGACAAGTGTAAGTATC 3’
Przykład 7. Wytwarzanie pCGP 484
Wytwarzanie pCGP 484 przebiega identycznie, jak opisane powyżej w przykładzie 4 wytwarzanie pCGP485, z tym wyjątkiem, że pCGP484 zawiera fragment 3,4 kb PstI (zawierający chimeryczny gen CHS-Hf1-PLTP) o przeciwnej orientacji.
Przykład 8. Wytwarzanie pCGP 1458
Plazmid pCGP1458 wytworzono, stosując jako rdzeń 10 kb wektor binarny pBIN19 (Bevan, 1984). Plazmid pBIN19 trawiono EcoRI, a powstałe w wyniku tego końce 5’ upakowano, stosując fragment Klenow, zgodnie ze standardowymi sposobami (Sambrook i wsp., 1989). Plazmid pCGP485 trawiono PstI dla usunięcia chimerycznego genu CHS/insert cDNA/PLTP, jako fragmentu 3,5 kb. Wystający koniec 3’, powstały w wyniku trawienia za pomocą PstI, usunięto za pomocąpolimerazy DNA T4, a następnie fragment ten poddano ligacji do upakowanego miejsca EcoRI plazmidu pBIN19.
Przykład 9. Transformacja E. coli i A. tumefaciens
Transformację komórek DH5 a szczepu Escherichia coli jednym z wektorów pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653, pCGP484 lub pCGP1458 przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami (Sambrook i wsp., 1989, lub Inoue i wsp., 1990). Plazmid pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653, pCGP484 lub pCGP1458 wprowadzano do odpowiedniego szczepu Agrobacterium tumefaciens, poprzez dodanie 5 pg plazmidowego DNA do 100 pl 1 kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens, wytworzonych przez inokulację 50 ml hodowli MG/L (Garfinkel i Nester, 1980) i dalsze prowadzenie hodowli przez 16 godzin z zastosowaniem mieszania, w temperaturze 28°C. Komórki poddano następnie granulacji i resuspendowano w 0,5 ml 85% (v/v) 100 mM CaCl2/15% (v/v) glicerolu. Mieszaninę DNA/Agrobacterium zamrażano poprzez inkubację w płynnym N2 przez 2 minuty, po czym rozmrożono poprzez inkubację w temperaturze 37°C przez 5 minut. Mieszaninę DNA/bakterii umieszczono następnie w lodzie na kolejne 10 minut. Komórki zmieszano potem z 1 ml pożywki MG/L i inkubowano, mieszając, przez 16 godzin w temperaturze 28°C. Na płytkach agarowych MG/L, zawierających 100 pg/ml gentamycyny, wyselekcjonowano komórki A. tumefaciens, zawierające pCGPŚ 12, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653 lub pCGP484. Komórki A. tumefaciens, zawierające pCGP1458, wyselekcjonowano na płytkach agarowych MG/L, zawierających 100 pg/ml kanamycyny. Obecność plazmidu potwierdzono analizą Southern DNA wyizolowanego z transformantów opornych na gentamycynę.
177 743
Przykład 10. Transformacja Dianthus caryophyllus
a. Materiał roślinny
Sadzonki Dianthus caryophyllus (odmiany Crowley Sim, Red Sim, Laguna) uzyskano z firmy Van Wyk and Son Flower Supply, Victoria, Australia. Usunięto liście zewnętrzne i sadzonki krótko wyjałowiono w 70% (v/v) etanolu, a następnie w 1,:25% (w/v) podchlorynie sodowym (z dodatkiem Tween 20) przez 6 minut, i przemyto trzykrotnie jałową wodą. Przed wspólną hodowląusunięto pod mikroskopem disekcyjnym wszystkie widoczne liście i pączki pachwinowe.
b. Wspólna hodowla Agrobacterium i tkanki Dianthus
Szczep Agrobacterium tumefaciens AGLO (Lazo i wsp., 1991), zawierający dowolny z wektorów binarnych pCGP90, pCGP812, pCGP485 i pCGP653, utrzymywano w temperaturze 4°C na płytkach agarowych MG/L (Garfinkel i Nester, 1980), zawierających 100 mg/l gentamycyny. Pojedyncze kolonie hodowano przez noc w płynnym bulionie MG/L i rozcieńczono do stężenia 5 x 108 komórek/ml następnego dnia, przed inokulacją. Tkankę Dianthus hodowano wspólnie z Agrobacterium na pożywce Murashige i Skoog (1962) (MS) z dodatkiem 3% sacharozy (w/v), 5 mg/l kwasu α-naftalenooctowego (NAA), 20 pM acetosyringonu i 0,8% agaru Difco Bacto (pH 5,7).
c. Regeneracja transgenicznych roślin Dianthus
Po wspólnej hodowli tkankę przeniesiono do pożywki MS z dodatkiem 1 mg/l benzyloaminopuryny (BAP), 0,1 mg/l NAA, 150 mg/l kanamycyny, 500 mg/l tikarcyliny i 0,8% agaru Difco Bacto (pożywka selekcyjna). Po trzech tygodniach przeszczepy przeniesiono do świeżej pożywki selekcyjnej; na tym etapie z przeszczepów łodyg starannie usunięto pędy pachwinowe.Po 6-8 tygodniach hodowli na pożywce selekcyjnej zdrowe pędy przybyszowe przeniesiono do pozbawionej hormonów pożywki MS, zawierającej 3% sacharozy, 150 mg/l kanamycyny, 500 mg/l tikarcyliny i 0,8% agaru Difco Bacto. Na tym etapie dla zidentyfikowania pędów transgenicznych stosowano test histochemiczny GUS (Jefferson, 1987) i/lub test dot-blotNPT II (McDonnell i wsp., 1987). Pędy transgeniczne przenoszono do pożywki MS z dodatkiem 3% sacharozy, 500 mg/l tikarcyliny i 0,4% (w/v) Gelrite Gellan Gum (Schweizerhall) dla pobudzenia ukorzeniania. Wszystkie hodowle prowadzono z oświetleniem przez 16 godzin na dobę (zimnym białym światłem fluorescencyjnym 120 pE) w temperaturze 23 ± 2°C. Kiedy rośliny ukorzeniły się i osiągnęły wysokość 4-6 cm, aklimatyzowano je we mgle. Do aklimatyzacji zastosowano mieszaninę o wysokiej zawartości perlitu (75% lub więcej), nasiąkniętą mieszaniną hydroponiczną (Kandreck i Black, 1984); aklimatyzacja trwała, typowo, 4-5 tygodni. Rośliny aklimatyzowano w temperaturze 23°C, stosując oświetlenie przez 14 godzin na dobę (światłem rtęciowo-halogenowym 200 pE).
Przykład 11. Transformacja Rosa hybrida
1. Rosa hybrida odmiany Royalty
Tkanki roślinne róży odmiany Royalty transformowano według sposobu opisanego w PCT 91/04412, o numerze publikacji WO92/00371.
2. Rosa hybrida odmiany Kardinal
a. Materiał roślinny
Pędy Kardinal uzyskano z firmy Vand Wyk and Son Flower Supply, Victoria, Australia. Usunięto liście i pozostałe pędy (5-6 cm) wyjałowiono w 1,25% (w/v) podchlorynie sodowym (z dodatkiem Tween 20) przez 5 minut, i przemyto trzykrotnie jałową wodą. Izolowane czubki pędów namoczono na 1 godzinę w jałowej wodzie, po czym prowadzono hodowlę wstępną przez 2 dni na pożywce MS zawierającej 3% sacharozy, 0,1 mg/l BAP, 0,1 mg/l kinetyny, 0,2 mg/l kwasu giberelowego, 0,5% (w/v) poliwinylopirolidonu i 0,25% Gelrite Gellan Gum, przed hodowlą wspólną
b. Wspólna hodowla Agrobacterium i tkanki pędu Rosa
Szczepy Agrobacterium tumefaciens ICMP 8317 (Janssen i Gardner 1989) i AGLO, zawieraj ące wektor binarny pCGP812, utrzymywano w temperaturze 4°C na płytkach agarowych MG/L, zawierających 100 mg/l gentamycyny. Pojedyncze kolonie poszczególnych szczepów Agrobacterium hodowano przez noc w płynnym bulionie MG/L. Końcowe stężenie,
177 743 wynoszące 5 x 108 komórek/ml, wytwarzano następnego dnia poprzez rozcieńczenie w płynnym MG/L. Przed inokulacją obie hodowle Agrobacterium mieszano w stosunku 10:1 (AGLO/pCGP812:8317/pCGP812). Na czubku pędu wykonywano cięcie podłużne i umieszczano tam 2 μΐ próbkę mieszaniny hodowli Agrobacterium, w postaci kropli. Czubki pędów hodowano, poddawano następnie wspólnej hodowli przez 5 dni na tej samej pożywce, co stosowana do hodowli wstępnej.
Szczep Agrobacterium tumżyacieas AGLO, zawierający wektor binarny pCGP1458, utrzymywano w temperaturze 4°C na płytkach agarowych mG/L, zawierających 1 θ0 mg/l kanamycyny. Pojedyncze kolonie poszczególnych szczepów Agrobacterium hodowano przez noc w płynnym bulionie MG/L. Końcowe stężenie, wynoszące 5 x 108 komórek/ml, wytwarzano następnego dnia poprzez rozcieńczenie w płynnym MG/L.
c. Regeneracja tpankgżniczaych roślin Rosa
Po wspólnej hodowli czubki pędów przenoszono na pożywkę selekcyjną. Czubki pędów przenoszono na świeżą pożywkę selekcyjną co 3-4 tygodnie. Galasy, stwierdzane na czubkach pędów, obcinano, kiedy osiągały średnicę 6-8 mm. Oddzielone galasy przenoszono na pożywkę MS, zawierającą 3% sacharozy, 25 mg/l kanamycyny, 250 mg/l cefotaksymu i 0,25% Gelrite Gellan Gum, w celu wytwarzania pędów. Regenerowane z tkanki galasowej pędy izolowano i przenoszono na pożywkę selekcyjną. W celu zidentyfikowania pędów traasgeniczazch stosowano test histochemiczny GUS i test tkanki przyrannej. Pędy traakgżaicsaż przenoszono na pożywkę MS, zawierającą 3% sacharozy, 200 mg/l cefotaksymu i 0,25% Gelrite Gellan Gum, w celu pobudzenia ukorzeniania. Wszystkie hodowle prowadzono, stosując oświetlenie przez 16 godzin na dobę (zimnym białym światłem fluorescencyjnym 60 μΕ) w temperaturze 23 ± 2°C. Kiedy system korzeniowy był dobrze rozwinięty, a pędy osiągały długość 5-7 cm, tpaasgeaicsae róże przenoszono do 8 cm rurek, napełnionych wyjałowioną w autoklawie mieszanką doniczkową Debco 514110/2. Po 2-3 tygodniach rośliny przesadzano do 15 cm donic, stosując tę samą mieszankę doniczkową, i utrzymywano w temperaturze 23°C, stosując oświetlenie przez 14 godzin na dobę (światłem rtęciowo-halogenowym 300 μΕ). Po 1-2 tygodniach donice z roślinami przenoszono do cieplarni (temperatura w dzień/w nocy: 25-28/14°C) i hodowano aż do kwitnienia.
Przykład 12. Transformacja Chpykaathżmum monfolium
a. Materiał roślinny
Sadzonki Ch^santhemum monfolium (odmiany Blue Ridge, Pemine Chorus) uzyskano z F & I Baguley Flower and Plant Growers, Victoria, Australia. Z sadzonek usunięto liście, po czym sadzonki wyjałowiono krótko w 70% (v/v) etanolu, a następnie w 1,25% (w/v) podchlorynie sodowym (z dodatkiem Tween 20) przez 3 minuty, i przemyto trzykrotnie wodąjałową. Do wspólnej hodowli stosowano przekroje łodyg na poziomie między węźla.
b. Wspólna hodowla Agrobacterium i tkanki Chpykanthemum
Agrobacterium tumefaciens szczepu LBA4404 (Hoekema i wsp., 1983), zawierający dowolny z wektorów binarnych pCGP90, pCGP484, pCGP485 i pCGP628, hodowano na płytkach agarowych MG/L, zawierających 50 mg/l riyampicyay i 10 mg/l gentamyczay. Pojedyncze kolonie poszczególnych Agrobacterium hodowano przez noc na tej samej płynnej pożywce. Z tych płynnych hodowli wytwarzano 10% zawiesiny w glicerolu, i próbki o objętości 1 ml przenoszono do zamrażarki (-80°C). Próbki o objętości 100-200 μl poszczególnych zamrożonych szczepów Agrobacterium hodowano przez noc na płynnym MG/L, zawierającym 50 mg/l rifampiczay i 10 mg/l gżntamzcyaz. Końcowe stężenie, wynoszące 5 x 108 komórek/ml, wytwarzano następnego dnia poprzez rozcieńczenie w płynnym MS, zawierającym 3% (w/v) sacharozy. Przekroje łodyg hodowano następnie wraz z Agrobacterium, zawierającym dowolny z LBA4404/pCGP90, LBA4404/pCGP484, LBA4404/pCGP485, LBA4404/pCGP628, na pożywce do wspólnej hodowli, przez 4 dni.
c. Regeneracja traakgeaiczazch roślin Chrykaathemum
Po wspólnej hodowli, przekroje łodyg przenoszono na pożywkę selekcyjną. Po 3-4 tygodniach regenerujące przeszczepy przenoszono na świeżą pożywkę. Pędy przybyszowe, które przeżyły selekcję kaaamzcyaową, izolowano i przenoszono na pożywkę MS, zawi erąjąc ąkana12
177 343 mycynę i cefotaksym, dla uzyskania wzrostu pędów i ukorzenienia. Przy wszystkich hodowlach stosowano oświetlenie przez 16 godzin na dobę (zimnym białym światłem fluorescencyjnym 80 μΕ) w temperaturze 23 ± 2°C. Z roślin, które ukorzeniły się na kanamycynie, pobierano, próbki liści i za pomocą analizy Southern biot identyfikowano rośliny transgeniczne. Kiedy transgeniczne chryzantemy osiągały długość 4-5 cm, przenoszono je do 8 cm rurek, napełnionych wyjałowioną w autoklawie mieszanką doniczkową Debco 51410/2. Po 2 tygodniach rośliny przesadzano do 15 cm donic, stosując tę samą mieszankę doniczkową, i utrzymywano w temperaturze 23°C, stosując oświetlenie przez 14 godzin na dobę (światłem rtęciowo-halogenowym 300 μΕ). Po 2 tygodniach donice z roślinami przenoszono do cieplarni (temperatura w dzień/w nocy: 25-28/14°C) i hodowano aż do kwitnienia.
Przykład 13. Analiza Southern
a. Izolacja genomowego DNA z Dianthus
DNA z tkanki izolowano w zasadzie w sposób opisany przez Dellaporta i wsp. (1983). Preparaty DNA oczyszczano następnie przez odwirowywanie hydrostatyczne CsCl (Sambrook i wsp., 1989).
b. Izolacja genomowego DNA z Chrysanthemum
DNA izolowano z tkanki liści, stosując bufor ekstrakcyjny, zawierający 4,5 M tiocyjanianu guanidynowego, 50 mM EDTA o pH 8,0,25 mM cytrynianu sodowego o pH 7,0,0,1 M 2-merkaptoetanolu, 2% (v/v) sarkozyny laurylowej. Tkankę roślinną rozdrabniano na miałki proszek w płynnym N2, po czym dodawano bufor ekstrakcyjny (5 ml/g tkanki) i roztwór mieszano w wirówce przez 16 godzin. Mieszaninę ekstrahowano dwukrotnie fenolem: chloroformem: izoamyloalkoholem (w stosunku 50:49:1), a genomowe DNA poddawano precypitacji, dodając trzykrotną objętość etanolu i stosując odwirowanie przez 15 minut z prędkością 10000 obrotów/minutę.
c. Izolacja genomowego DNA z Rosa
DNA ekstrahowano, rozdrabniając tkankę w obecności płynnego N2 w moździerzu i dodając 1 ml bufora ekstrakcyjnego (0,14 M sorbitu, 0,22 M Tris-HCl [o pH 8,0], 0,022 M EDTA, 0,8 M NaCl, 0,8% (w/v) CTAB, 1% N-laurylosarkozyny), ogrzanego do temperatury 65°C. Następnie do mieszaniny dodano chloroformu (200 μΐ) i inkubowano ją w temperaturze 65°C przez 15 minut. Po odwirowaniu supernatant ekstrahowano za pomocą fenolu-chloroformu, po czym dodano do równej objętości izopropanolu, odwracając dla wymieszania. Mieszaninę tę odwirowano, a grudkę przemyto 95% etanolem, ponownie odwirowano i przemyto 70% etanolem. Grudkę wysuszono pod próżnią i resuspendowano w 30 μΐ bufora TE (o pH 8,0).
d. Southern Biot
Genomowe DNA (10 μg) poddawano trawieniu przez 60 jednostek EcoRI przez 16 godzin, a następnie elektroforezie na 0,7% (w/v) żelu agarozowym w przepływającym buforze TAE (40 mM Tris-octanu, 50 mM EDTA). DNA denaturowano następnie w roztworze denaturującym (1,5 M NaCl/0,5M NaOH) przez 1-1,5 godziny, zobojętniano w 0,5 M Tris-HCl (o pH 7,5)/1,5 M NaCl przez 2-3 godziny, po czym DNA przenoszono na filtr Hybond N (Amersham) w 20 x SSC.
Analiza metodą Southern domniemanych transgenicznych Dianthus, Rosa i Chrysanthemum, uzyskanych po selekcji na kanamycynie, potwierdziła integrację odpowiednich genów chimerycznych do genomu.
Przykład 14. Analiza Northern
a. RNA Dianthus i Chrysanthemum
Z tkanki, którą uprzednio poddano zamrażaniu w płynnym N2 i rozdrabnianiu na miałki proszek w moździerzu, wyizolowano całkowite DNA. Do tkanki dodano bufor ekstrakcyjny, zawierający 4 M izotiocyjanianu guanidynowego, 50 mM Tris-HCl (o pH 8,0), 20 mM EDTA, 0,1% (v/v) sarkozylu, po czym mieszaninę homogenizowano przez 1 minutę, stosując politron ustawiony na maksymalną prędkość. Zawiesinę przefiltrowano przez Miracloth (Calbiochem) i odwirowano w wirówce JA20 przez 10 minut z prędkością 10000 obrotów/minutę, po czym supernatant zebrano i dodano do 0,2 g/ml CsCl (w/v). Próbki nałożono następnie warstwowo na
177 743 ml „podlkadki”, utworzone z 5,7 M CsCl, 50 mM EDTA (o pH 7,0) w 38,5 ml iru-kach do odwirowywania Quick-seal (Beckman) i odwirowano z prędkością 42000 obrotów/minutę przez 12-16 godzin w temperaturze 23°C w wirówce Ti-70. Grudki resuspendowano w TE/SDS (10 mM Tris-HCl (o pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 (w/v) SDS) i ekstrahowano mieszaniną fenolu : chloroformu: alkoholu izoamylowego (w stosunku 25:24:1) saturowanąw 10 mM EDTA (o pH 7,5). Po precypitacji etanolowej grudki RNA resuspendowano w TE/SDS. Próbki RNA poddano elektroforezie na mieszaninie zawierającej 2,2 M formaldehydiE1,2% (w/v) żel agarozowy, stosując przepływający bufor o składzie: 40 mM kwasu morfolinopropanosulfonowego (o pH 7,0), 5 mM octanu sodowego, 0,1 EDTA (o pH 8,0). RNA przeniesiono na filtry Hybond-N (Amersham) w sposób podany przez producenta, i sondowano fragmentem cDNA, znakowanym 32P( 108 cpm/pg, 2 x 106 cpm/ml). Prehybrydyzację (1 godzina w temperaturze 42°C) i hybrydyzację (16 godzin w temperaturze 42°C) przeprowadzono w mieszaninie 50% (v/v) formamidu. 1 MNaCl, 1%o(w/v) SDS, 10% (w/v) siarczanu dekstranowego. W etapie hybrydyzacji do próbki znakowanej 32P dodawano zdegradowane DNA spermy łososiowej (100 pg/ml). Filtry przemywano w 2 x SSC/1% (w/v) SDS w temperaturze 65°C przez 1 -2 godzin, a następnie w 1,2 x SSC/1% (w/v) SDS w temperaturze 65°C przez 0,5-1 godziny, po czym filtry eksponowano na film Kodak XAR z zastosowaniem ekranu wzmacniającego w temperaturze -70°C przez 48 godzin.
Analiza Northern Dianthus odmiany Red Sim, transgenicznego z plazmidem pCGP90, wykazała, że na trzynaście roślin osiem było dodatnich.
b. RNA Rosa
Z płatków (pączków i kwiatów 5 dni po ich zebraniu) wyekstrahowano całkowicie RNA sposobem opisanym przez Maneiega (1991).
Przykład 15. Znakowanie próbek DNA za pomocą 32P
Fragmenty DNA (50-100 ng) znakowano radioaktywnie, stosując 50 pCi [α-32P]-dCTP, z wykorzystaniem zestawu do oligoznakowania (Bresatec). Niezwiązany [a-32P]-dCTP usunięto poprzez chromatografię na kolumnie Sephadex G-50 (Fine).
Przykład 16. Analiza antocyjanidyny
Przed analiząHPLC cząsteczki anSocyjjeów, obecne w wyciągu z płatków, poddawano hydrolizie kwaśnej dla usunięcia cząstek glikozylowych z rdzenia aeSocyjaeidynowego. Wzorzec hydroksylacji na pierścieniu B barwników aeSocyjaeowych określano poprzez analizę HPLC cząsteczki rdzennej antocyjanidyny. W analizie tej stosowano system HpLC Hewlett-Packard 1050, wyposażony w detektor wielu długości fali (MWD). Rozdzielenie za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami przeprowadzono na kolumnie nabojowej Spherisorb S5 ODS2, 250 mm x 4 mm ID.
a. Ekstrakcja anSocyjanów i flawonoidów
Barwniki kwiatowe ekstrahowano z segmentów płatków (ca. 50 mg), stosując 5 ml metanolu, zawierającego 1%o (v/v) wodnego 6 M kwasu solnego. Wyciągi rozcieńczano wodą(1:9) i filtrowano (Millex HV, 0,45p) przed iniekcją do systemu HPLC.
b. Hydroliza aeSocyjaeów
Niepreparowane wyciągi metanolowe (100 pl), wytworzone w powyższym punkcie a., odparowywano do sucha w Pierce ReactiVials, stosując strumień suchego azotu w temperaturze pokojowej. Pozostałości rozpuszczano w 200 pl 2M HCl, fiolki kapslowano, po czym ogrzewano w temperaturze 100°C przez 30 minut. Mieszaninę hydrolitycznąrozcieńczono wodą (w stosunku 1:9) i przefiltrowano (Millex HV, 0,45p) przed analizą HPLC.
c. Chromatografia
Rozdzielenie barwników kwiatowych przeprowadzono poprzez elucję gradientową z zastosowaniem następującego systemu:
Rozpuszczalnik A : (trójetylojmiina:stęż. H3PO4: H2O) ((3 : 2,5 : 1000)
Rozpuszczalnik B: acetonitryl
Warunki gradientowe: 5% B do 40% B przez 20 minut
Prędkość przepływu: 1 ml/min
177 743
Temperatura: 35°C
Wykrywanie: MWD z symultanicznym zbieraniem danych przy długości fali 280, 350 i 546 nm.
Piki antocyjanidyn identyfikowano w odniesieniu do znanych standardów. Inny sposób analizy cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, można znaleźć u Brugliera i wsp., 1994.
Analizę HPLC przeprowadza się dla wykrycia obecności barwników delfinidyny, pelargonidyny i cyjanidyny w próbkach tkanki goździka, chryzantemy i róży po ich transformacji jednym z plazmidów pCGP90, pCGP485, pCGP484, pCGP628, pCGP653 lub pCGP1458. Reprezentatywne dane, dotyczące pCGP90, pCGP485 i pCGP653 w transgenicznych goździkach przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1
Analiza HPLC kwiatów transgenicznych pCGP90, pCGP485 i pCGP653
Próbka % Delfinidyny % Pelargonidyny % Cyjanidyny
Goździk nietransgeniczny: Odmiana: Red Sim 0 85,3 0,8
Goździk transgeniczny: Red Sim + pCGP90 (i) Nr 1933 1,9 82,7
(ii) Nr 2011 3,7 76,9 -
Red Sim + pCGP485 (i) Nr 3654B 13,0 75,1 2,3
Red Sim + pCGP653 (i) Nr 3660/2 18,1 71,4 3,2
(ii) Nr 3655 35,6 49,1 7,5
Nr - numer nabycia rośliny (-) - nie wykryto
Przykład 17. Wytwarzanie wyciągów roślinnych do testu aktywności 3’,5’ -hydroksylazy
Tkankę roślinną homogenizowano w 10-krotnej objętości lodowatego bufora ekstrakcyjnego (100 mM fosforanu potasowego (o pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,25 M sacharozy, 0,25 M mannitu, 0,1% (w/v) BSA, 0,1 mg/ml PMSF, 20 mM 2-merkaptoetanolu i 10 mg/ml poliklarowego AT). Homogenizat odwirowywano z prędkością 13000 obrotów na minutę w wirówce JA20 (Beckman) przez 10 minut w temperaturze 4°C, po czym oznaczano aktywność 3’ ,5 ’ - hydroksylazy w próbce supernatantu.
Test 3’,5’ -hzdro0kylazz
Aktywność enzymu 3’,5’ - hydroksylazy mierzono stosując zmodyfikowaną wersję sposobu opisanego przez Stotz i Forkmann (1982). Testowa mieszanina reakcyjna typowo zawierała 195 μΐ wyciągu roślinnego, 5 μΐ 50 mM NADPH w buforze testowym (100 mM fosforanu potasowego (o pH 8,0), 1 mM EDTA i 20 mM 2-merkaptoetanolu), oraz 105 dpm [14C] naringeniny w końcowej objętości 200 μΐ. Po inkubacji przez noc w temperaturze 23°C mieszaninę reakcyjną dwukrotnie ekstrahowano, stosując 0,5 ml octanu etylowego. Fazę octanu etylowego wysuszono pod próżnią a następnie resuspendowano w 10 μl octanu etylowego. Znakowane radioaktywnie cząsteczki flawonoidów oddzielano następnie na cienkowarstwowych płytkach celulozowych
177 743 (Merck Art 5577, Niemcy), stosując system rozpuszczalnikowy chloroform: kwas octowy: woda (w stosunku 10:9:1 v/v). Po wykonaniu chromatografii płytki TLC wysuszano na powietrzu, a produkty reakcji lokalizowano poprzez autoradiografię i identyfikowano przez porównanie z nieradioaktywnymi standardami naringeniny, eriodiktiolu, dihydrokwercetyny i dihydromirycetyny, umieszczonymi obok produktów reakcji i uwidocznionymi w promieniach UV.
Przykład 18. Transformacja różnych odmian
Geny chimeryczne, zawarte w dowolnej z sekwencji pCGP90, pCGP812, pCGP628, pCGP485, pCGP653, pCGP484 lub pCGP1458 wprowadza się do odmian róży, goździka lub chryzantemy, stosując transfer genów poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładach 10, 11 i 12. Integrację odpowiedniego genu chimerycznego dogenomu rośliny potwierdź się analiząSouthem roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej, a dla wykrycia obecności antocyjanów stosuje się analizę HPLC, jak to opisano w powyższym przykładzie 16. Rośliny, które udało się uczynić transgenicznymi, zdolne do ekspresji transgenu według niniejszego wynalazku, wykazują znaczący poziom aktywności enzymu 3’,5’ -hydroksylazy, jak również 3’,5’ -hydroksylowanych antocyjanów (por. przykład 16) w porównaniu z nietransgenicznymi roślinami kontrolnymi, które nie zawierają genu niezbędnego do wytwarzania aktywności 3’,5’ -hydroksylazy.
Przykład 19. Goździk odmiany Crowley Sim + pCGP 90
Do goździka odmiany Crowley Sim wprowadzono plazmid pCGP90, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 10. Integrację sekwencj i do genomu rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dziewięć roślin badano na obecność genów nptII i Hf1 oraz na wytwarzanie delfinidyny. Osiem z dziewięciu analizowanych roślin było dodatnich zarówno ze względu na nptII, jak i Hf1, lecz w analizie HPLC nie udało się wykryć żadnego dowodu wytwarzania delfinidyny przez te rośliny (por. tabela 2; „kan” = kanamycyna).
Tabel a 2
Lp. Nr Kan Hf1 Delfinidyna
1 1930A + + -
2 1942B + + -
3 2008B - - -
4 2217A + + -
5 2217B + + -
6 2338A + + -
7 2338B + + -
8 2338C + + -
9 2338D + + -
Przykład 20. Goździk odmiany Laguna + pCGP 485
Do goździka odmiany Laguna wprowadzono plazmid pCGP485, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 10. Integrację sekwencji do genomu rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dla wykazania obecności 3’,5’ -hydroksylowanych pochodnych antocyjanów przeprowadzono analizę HPLC cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, zgodnie z procedurą opisaną w powyższym przykładzie 16. Te 3’,5’ -hydroksylowane antocyjany wytwarzane są tylko dzięki ekspresji egzogennej sekwencji DNA, tzn. sekwencji Hf1 cDNA, wprowadzonej poprzez transformację binarnym wektorem pCGP485.
Przykład 21. Róża odmiany Royalty + pCGP 485/pCGP 628
Do róży odmiany Royalty wprowadzono plazmidy pCGP485 i pCGP628, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 11. Integrację sekwencji do genomu
177 743 rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dla wykazania obecności 3’,5’ - hydroksylowanych pochodnych antocyjanów przeprowadzono analizę HPLC cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, zgodnie z procedurą opisaną w powyższym przykładzie 16. Te 3’,5’ -hydroksylowane antocyjany wytwarzane sątylko dzięki ekspresji egzogennej sekwencji DNA, tzn. sekwencji Hf1 cDNA, wprowadzonej poprzez transformację binarnym wektorem pCGP485 lub pCGP628.
Przykład 22. Róża odmiany Kardinal + pCGP 1458
Do róży odmiany Kardinal wprowadzono plazmid pCGP1458, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 11. Integrację sekwencji do genomu rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dla wykazania obecności 3’,5’ -hydroksylowanych pochodnych antocyjanów przeprowadzono analizę HPLC cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, zgodnie z procedurą opisaną w powyższym przykładzie 16. Te 3’,5’ - hydroksylowane antocyjany wytwarzane sątylko dzięki ekspresji egzogennej sekwencji DNA, tzn. sekwencji Hf1 cDNA, wprowadzonej poprzez transformację binarnym wektorem - pCGP1458.
Przykład 23. Chryzantema odmiany Blue Ridge + pCGP 484/pCGP485/pCGP628
Do chryzantemy odmiany Blue Ridge wprowadzono plazmidy pCGP484, pCGP485 i pCGP 628, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 12. Integrację sekwencji do genomu rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dla wykazania obecności 3’, 5’ -hydroksylowanych pochodnych antocyjanów przeprowadzono analizę HPLC cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, zgodnie z procedurą opisaną w powyższym przykładzie 16. Te 3’, 5’ -hydroksylowane antocyjany wytwarzane sątylko dzięki ekspresji ezgogennej sekwencji DNA, tzn. sekwencji Hf1 cDNA,wprowadzonej poprzez transformację binarnym wektorem pCGP484, pCGP485 lub pCGP 628.
Przykład 24. Zmiana kwiatostanu
Ekspresja aktywności wprowadzonego enzymu 3’,5’ -hydroksylazy flawonoidowej rośliny transgenicznej może wywierać istotny wpływ na zabarwienie kwiatu. Tkanki kwiatowe w roślinach transgenicznych mogą ulegać zmianie, w porównaniu z bladoróżowym lub czerwonym zabarwieniem nietransgenicznych roślin kontrolnych, do barw z zakresu od ciemnoróżowej/kasztanowatej do niebieskiej/purpurowej. Barwy można również opisywać w odniesieniu do numerów Karty Barw Królewskiego Towarzystwa Ogrodniczego. Ogólnie rzecz biorąc, zmiany można opisać jako przejście zabarwienia z odcieni różu bladego lub o średnim natężeniu, odpowiadających 60C/D - 65C/D, do odcieni ciemniejszych, bardziej niebieskich/purpurowych, jak na wielu spośród kwadratów barwnych 70-85 (jednak nie na wszystkich z nich). Należy pamiętać, że inne warunki biochemiczne i fizjologiczne mogą wpływać na poszczególne przypadki i wspomnianych w niniejszym opisie konkretnych barw nie należy interpretować jako definiowania możliwego zakresu.
W przypadku transgenicznego goździka, o numerze nabycia 3655, wytwarzanego z zastosowaniem wyżej opisanej sekwencji plazmidowej pCGP653, zaobserwowano ewidentny wpływ na zabarwienie płatków, tzn. uzyskanie koloru bardziej niebieskiego. Goździki odmiany Red Sim, wykazujące zwykle zabarwienie pomarańczowoczerwone (odpowiadające mniej więcej 45A/B Karty Barw Królewskiego Towarzystwa Ogrodniczego), zmieniły odcień na niebieski/purpurowy.
Dla specjalisty oczywiste jest, że opisany wynalazek można stosować w różnych odmianach i modyfikacjach, odmiennych od konkretnie przedstawionych w niniejszym opisie. Należy rozumieć, że zakres wynalazku obejmuje wszystkie takie odmiany i modyfikacje. Zakresem wynalazku objęte są również wszystkie etapy, cechy, kompozycje i składniki, wspomniane i wskazane w niniejszym opisie, pojedynczo lub zbiorczo, w dowolnej i we wszystkich kombinacjach dowolnych dwóch lub więcej etapów lub cech.
177 743
Literatura
Bethesda Research Laboratories. BRL pUC host: E. coli DH5a ™ competent cells. Bethesda Res. Lab. Focus 8(2):9, 1986.
Bevan, M. Nucleic Acid Res. 12:8711-8721, 1984.
Brugliera, F., Holton, T.A., Stevenson, T.W., Farcy, E., Lu, C-Y. i Cornish, E. C., Plant J.
5(1):81-92, 1994.
Comai, L., Moran, P. i Maslayr, D., Plant Molecular Biology 15:373-381, 1990. Dellaporta, S. J., Wood, J. i Hick, J. B., Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21,1983.
Ebel, J. i Hahlbrock, K., w: The Flavonoids: Advances Research Since 1980. Red.: Harborne, J. B., Academic Press, New York, Stany Zjednoczone, 641 -679, 1988.
Forkmann, G. Plant Breeding 106: 1-26, 1991.
Garfinkel, D. J. i Nester, E. W., J. Bacteriol. 144:732-743,1980.
Hahlbrock, K., i Grisebach, H., Annu. Rev. Plant Physiol. 30: 105-130, 1979.
Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166: 557, 1983.
Holton, T. A., praca doktorska, University of Melbourne, Australia, 1992.
Holton, T. A. i Graham, M. W., Nucleic Acid Res., 19:1156, 1991.
Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., Eichholz, D.,
Rogers, S. G. i Fraley, R. T., Science 227: 1229-1231,1985.
Inoue, H., Nojima, H. i Okayama, H., Gene 96: 23-28,1990.
Jannsen, B-J. J. i Gardner, R. C., Plant Mol. Biol. 14: 61-72, 1989.
Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. i Bevan, M. W., EMBO J. 6(13): 3901-3907,1987. Kandreck, K. A. i Black., N. D., Growing media for ornamental plants and turf., str. 317,
NSW University Press, Kensington, Australia, 1984.
Koes. R. F. Genes involved in flavonoid biosynthesis in Petunia hybrida: The chalcone synthase multigene family. Praca doktorska, Vrije Universiteit, Amsterdam, Holandia, 1988.
Lazo, G. R., Pascal, A. S. i Ludwig, R. A., Bio/technology 9: 969^-^7^(537,1991. McDonnell, R. E., Clarke, R. D., Smith, L. A. i Hinchee, M. A., Plant Mol. Biol. Rep., 4:
380-386, 1987.
Manning, K. Anal. Biochem. 195: 45-50,1991.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (wydanie II). Cold Spring Harbor laboratory Press, Stany Zjednoczone, 1989.
Schram, A. W., Jonsson, L. M. V. i Bennink, G. J. H., „Biochemistry of flavonod synthesis in Petunia hybrida”, w:
Petunia, pod red. Sink, K. C., Springer-Verlag, Berlin, Niemcy, str. 68-75, 1984. Sommer, H. i Saedler, H., Mol. Gen. Genet., 202: 429-434, 1986.
Stafford, H. A., Flavonoid Metabolism, CRC Press, Inc., Boca Raton, Floryda, Stany Zjednoczone, 1990.
Stotz, G. i Forkmann, G., Z. Naturforsch 37c: 19-23,1982.
Vercruysse, S. A. R., Delcour, J. A. i Dondeyne, P., J.
Chromatography 324: 495-497,1985.
Wiering, H. i De Vlaming, P., „Inheritance and Biochemistry ofPigments”, w; Petunia, pod red. Sink, K. C.,
Springer-Verlag, Berlin, Niemcy, str. 49-^fS, 1984.
ΠΊ 743
Fig. 1
177 743
Tetrahydroksychalkon
ICHI
HO,
OH
HO 0
Naringenina |F3H ηο'τΔχ>οη
HO O °H Dihydrokaempferol
DFR
3'Hydroksylaza
HO.
UFGT
-OH O-GIc
3',5*Hydroksylaza
HO θ'21'
Pełargonidyno-3-giukozyd ιΠίΊΙ-Ι 3'.5’-Hydroksylaza lit OH OH
HO O
Dihydrokwercetyna
HO O
Dihydromirecetyna
Fig. IA
ΠΊ 743 η Ο ^ΟΗ HQ
ΊξΚΜΧΟΗ 3',5'-Hydroksyl V Υ ΟΗ Laza
ΗΟ Ο
XX
ΗΟΟ
ΟΗ
ΟΗ ΟΗ'ΟΗ
Dihydrokwercetyna
DFR
ΗΟ.
UFGT
ΟΗ Ώ>~ ΟΗ
Dihydromirycetyna
DFR I UFGTy nu H0XX?
HO O-Glc
Delfinidyno-3-glukozyd
HO O-Glc
Cyjanidyno-3-glukozyd
Cyjanidyno-3-nrtynozyd
HQ
Glu-O
OH OH
OH
O-GIc-O-Rha-pCum Glc-O O-GIc-O-Rha-pCum —Delfinidyno-3 (ρ-Kumarylo) Rttynozydo-5-Glukozyd
OH O>-OH HCX^
Cyjanidyno-3(p-Kumarylo) Rutynozydo-5-Glukozyd
CHo :o>-oh
OCH3 sy-0H
HO.
Glu-0 O-GIc-O-Rha-pCum
Peonidyno-3(p-Kumaryló)Ku.ćynozydo-5-Glukozyd
Fig.l B
HO
(0X5
OH
O-GIc-O-Rha-pCum
Petunidyno-3-(p-Kumarylo)Rutynozydo-5-Glukozyd
Glc-0
Glc-0
OCH o f»-OH
OCH3 O-GIc-O-Rha-pCum
Malwidyno-3-(p-Kumarylo) Rutynozydo-5-Glukozyd
177 743
BamHI Xhol
GUS
Fig. 2
Xhol RB Hindlll
pCGP485
18.10 Kb
Fig. 3 m 743
Fig. 5
Fig.
Maci
nptll
17.97 Kb
KpnI mas3‘ v//7/
sp718 mas3'
177 743
Pstl
\O
2P
E
177 743
rώ £
177 743
2 3 5 6 8 9 10 11 12 17 Ν
24 29 30 31 39 47 48 51 Ν
Fig. 8
I
177 743
Fig. 9
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł..

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej, znamienny tym, że do komórek rośliny wprowadza się wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny, w którego skład wchodzi promotor pochodzący z genu kodującego enzym szlaku flawonoidów oraz kontrolowana przez ten promotor sekwencj a koduj ąca 3’ ,5 ’ -hydroksylazę flawonoidową, zwiększa się ilość wytwarzanych antocyjanidynowych pochodnych antocyjanów pochodzących od delfinidyny wywołując ekspresję genu chimerycznego.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidową pochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, w szczególności z petuni lub lisianthusa.
  3. 3. Sposób według dowolnego z zastrz. 1, znamienny tym, że promotor pochodzi z genu kodującego syntetazę chalkonową (CHS).
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprowadzanym wektorem binarnym jest plazmid wybrany z grupy, do której nale&ąpCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki roślinne pochodząz rośliny takiej jak róża, goździk albo chryzantema.
  6. 6. Wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny, w którego skład wchodzi promotor pochodzący z genu kodującego enzym szlaku flawonoidów oraz kontrolowana przez ten promotor sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidową.
  7. 7. Wektor binarny według zastrz. 6, znamienny tym, że sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidową pochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, w szczególności z petunii lub lisianthusa.
  8. 8. Wektor binarny według zastrz. 6, znamienny tym, że promotor stanowi promotor genu
    CHS.
  9. 9. Wektor binarny według zastrz. 6, znamienny tym, że jest to plazmid wybrany z grupy, do której należą pCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458.
    * * *
    Przedmiotem niniejszego wynalazku sątransgeniczne rośliny kwitnące. W szczególności, przedmiotem niniejszego wynalazku sątransgeniczne róże, goździki i chryzantemy, zmodyfikowane genetycznie w taki sposób, aby umożliwić ekspresję 3’,5’ -hydroksylazy flawonoidowej, umożliwiając w ten sposób manipulację substancjami pośrednimi w szlaku przemian flawonoidów.
    W przemyśle kwiatowym dąży się do opracowania nowych, różnych odmian roślin kwitnących, o ulepszonej charakterystyce, od odporności na choroby i patogeny aż do zmian kwiatostanu. Jakkolwiek zastosowanie klasycznych technik hodowli dało pewne rezultaty, sposób ten ma pewne ograniczenia, związane z pulą genetyczną danego gatunku. Tak więc np. rzadko zdarza się, aby ujednego gatunku występował pełny zakres odmian barwnych. W związku z tym trwają prace nad wytworzeniem roślin transgenicznych, wykazujących pożądaną charakterystykę. I tak np. opracowanie niebieskich odmian głównych gatunków kwiatów ciętych, takich jak róża, goździk i chryzantema, byłoby bardzo korzystne dla rynku kwiatów ciętych i rynku roślin ozdobnych.
    ΠΊ 743
    Barwa kwiatów zależy przede wszystkim od typów barwników: flawonoidów i karotenoidów. Flawonoidy odgrywąjąrolę w powstawaniu barw od żółtej do czerwonej i niebieskiej. Karotenoidy nadają zabarwienie pomarańczowe lub żółte; stanowią one zwykle jedyny barwnik w kwiatach żółtych i pomarańczowych. Cząsteczki flawonoidów, odgrywające największą rolę w zabarwieniu kwiatów, stanowią antocyjany, które sąglikozylowanymi pochodnymi cyjanidyny, delfinidyny, petunidyny, peonidyny, malwidyny i pelargonidyny, i znajdują się w wakuoli. Różne antocyjany mogą dawać wyraźne różnice zabarwienia. Barwa kwiatów zależnajest również od kopigmentacji flawonoidami bezbarwnymi, kompleksami metali, od glikozylacji, acylacji, metylacji i wpływu pH wakuoli (Forkmann, 1991).
    Szlak biosyntezy barwników flawonoidowych (zwany w dalszej części niniejszego opisu „szlakiem flawonoidowym”) jest dobrze znany; przedstawiono go na Fig. 1 (Ebel i Hahlbrock, 1988;HahlbrockiGrisebach, 1979, Wiering i de Vlaming, 1984; Selmami wsp., 1984, Stafford, 1990). W pierwszym etapie szlaku zachodzi kondensacja trzech cząsteczek malonylo-CoA z jedną cząsteczką p-kumarylo-CoA. Reakcję tę katalizuje enzym syntetaza chalkonowa (CHS). Produkt tej reakcji, 2’,4,4’, 6’ -czterohydroksychalkon, w warunkach prawidłowych szybko ulega reakcji izomeryzacji z wytworzeniem naringeniny, przy udziale enzymu izomerazy chalkonowo-flawanonowej (CHI). Następnie naringenina jest hydroksylowana w pozycji 3 pierścienia centralnego przez 3-hydroksylazę flawanonową(F3H), a produktem reakcji jest dihydrokaempferol (DHK).
    Pierścień B dihydrokaempferolu może ulegać hydroksylacji w pozycji 3’ lub w pozycjach 3’ i 5’, z wytworzeniem, odpowiednio, dihydrokwercetyny (DHQ) i dihydromirycetyny (DHL). Kluczowe enzymy w tym szlaku stanowią 3’ -hydroksylaza flawonoidowa i 3’,5’ -hydroksylaza flawonoidowa, 3 ’ -hydroksylaza flawonoidowa katalizuje reakcję DHK z wytworzeniem DHQ i reakcję naringeniny z wytworzeniem eriodiktiolu. 3’,5’ - hydroksylaza flawonoidowa (zwana w dalszym ciągu niniej szego opisu 3’ „5 ’ -hydroksyazzą) saanowi enzym o szerokim spektrum, kaaalizujący hydroksylację naringeniny i DHK w pozycjach 3’ i 5’ oraz hydroksylację eriodiktiolu i DHQ w pozycji 5 ’ (SSoSz i Forkmamn, 1982!), przy czym w obu tych przypadkach powstają, odpowiednio, pentahydroksyflawanon i DHM. Wzorzec hydroksylacji pierścienia B antocyjanów odgrwa kluczową rolę w powstawaniu zabarwienia płatków.
    Z powodu omówionych wyżej ograniczeń, związanych z pulą genową, wiele głównych gatunków kwiatów ciętych nie posiada 3’,5’ -hydroksylazy, w związku z czym nie uzyskuje się pełnego spektrum barw, które w przeciwnym wypadku byłoby możliwe do uzyskania. Dotyczy to w szczególności róż, goździków i chryzantem, które stanowią większą część światowego rynku kwiatów ciętych. Istnieje zatem potrzeba modyfikacji roślin, w szczególności róż, goździków i chryzantem, dla wytworzenia roślin ttaesgenicznych, zdolnych do wytwarzania 3’,5’ -hydroksylazy z zapewnieniem środków modulacji metabolizmu DHK, jak również metabolizmu innych substratów, takich jak DHQ, naringenina i eriodiktiol. Taka modulacja dotyczy wzorca hydroksylacji aetocyjaeów i umożliwia wytwarzanie anSocyjanów pochodnych delfinidyny i w ten sposób zmianę zabarwienia płatków, oraz osiągnięcie przez pojedynczy gatunek pełnego spektrum zabarwienia kwiatów; W szczególności, istnieje potrzeba wytworzenia roślin ttaesgeeicsnych, wytwarzających duże ilości antocyjanów pochodnych delfinidyny. Według niniejszego wynalazku, wytwarza się sekwencje genów dla wytworzenia roślin Sransgeniczeych, wykazujących ekspresję wysokiego poziomu delfinidyny i/lub jej pochodnych, w porównaniu z nieSransgeeicznymi roślinami tego samego gatunku. Wytwarzanie tych dużych ilości delfinidyny i pochodnych cząsteczek jest w szczególności korzystne dla wytwarzania roślin wykazujących zmienione właściwości kwiatostanu.
PL94311691A 1993-05-20 1994-05-20 Sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej i wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny PL177743B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPL886293 1993-05-20
AUPM4698A AUPM469894A0 (en) 1994-03-24 1994-03-24 Transgenic flowering plants-II
PCT/AU1994/000265 WO1994028140A1 (en) 1993-05-20 1994-05-20 Transgenic flowering plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL311691A1 PL311691A1 (en) 1996-03-04
PL177743B1 true PL177743B1 (pl) 2000-01-31

Family

ID=25644460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94311691A PL177743B1 (pl) 1993-05-20 1994-05-20 Sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej i wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0703982A1 (pl)
JP (1) JPH08511683A (pl)
KR (1) KR100337755B1 (pl)
CN (1) CN1127015A (pl)
CA (1) CA2163220A1 (pl)
NZ (1) NZ266401A (pl)
PL (1) PL177743B1 (pl)
SG (1) SG45175A1 (pl)
WO (1) WO1994028140A1 (pl)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPN298895A0 (en) * 1995-05-16 1995-06-08 International Flower Developments Pty Ltd Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same
WO2000050613A2 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Transgenic plants and method for transforming carnations
US7129393B1 (en) 1999-02-22 2006-10-31 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Transgenic plants and method for transforming carnations
EP1546340B1 (en) * 2002-08-30 2012-03-07 Suntory Holdings Limited Flavonoid 3',5'hydroxylase gene sequences and uses therefor
KR101100930B1 (ko) 2003-08-13 2012-01-02 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 꽃의 색상이 변경된 장미의 제조 방법
KR100726874B1 (ko) 2005-01-04 2007-06-14 한국생명공학연구원 새로운 국화품종
CN100422336C (zh) * 2005-06-28 2008-10-01 北京林业大学 根癌农杆菌介导的地被菊花的转基因方法
CN1329517C (zh) * 2005-09-22 2007-08-01 华南师范大学 深圳5号非洲菊的转基因技术
EP2159283A4 (en) * 2007-06-20 2010-07-07 Int Flower Dev Pty Ltd ROSE WITH FLAVON AND MANUFACTURING METHOD THEREFOR
AU2008264442A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-24 Suntory Holdings Limited Rose containing flavone and delphinidin, and method for production thereof
EP2187730B1 (en) * 2007-11-15 2016-04-06 Suntory Holdings Limited Genetically modified chrysanthemums
EP2860248A1 (en) 2008-10-27 2015-04-15 Suntory Holdings Limited Cineraria-derived chromosomal DNA involved in synthesis of flavonoid, and use thereof
USPP21595P3 (en) * 2008-12-19 2010-12-28 International Flower Developments Pty Ltd. Dianthus plant named ‘Floriagate’
CA2759261A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Suntory Holdings Limited Method for production of chrysanthemum plant having petals containing modified anthocyanin
EP2479269B1 (en) 2009-04-24 2016-07-13 Suntory Holdings Limited Perilla frutescens var. crispa-origin promoter functioning in petal
CN102421903B (zh) * 2009-04-24 2014-04-16 独立行政法人农业·食品产业技术综合研究机构 生产在花瓣中含有花翠素的菊花植物的方法
KR20130114093A (ko) 2010-09-17 2013-10-16 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 꽃잎에 델피니딘을 함유하는 백합의 생산 방법
EP3054011A1 (en) 2012-02-24 2016-08-10 Suntory Holdings Limited Torenia-originated promoter capable of acting in petals
WO2013157502A1 (ja) 2012-04-16 2013-10-24 サントリーホールディングス株式会社 新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子及びその使用
WO2017184500A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Bloomsburg University of Pennsylvania Compositions and methods of delivering molecules to plants
CN108330146B (zh) * 2018-01-31 2020-06-02 天津大学 催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法
CN116584386B (zh) * 2023-05-24 2024-03-19 北京林业大学 一种用于杨梅的组培培养基及杨梅种子萌发方法和杨梅组培快繁方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9116071D0 (en) * 1991-07-25 1991-09-11 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
AU680401B2 (en) * 1992-03-02 1997-07-31 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Novel plant gene

Also Published As

Publication number Publication date
EP0703982A4 (pl) 1996-04-17
CA2163220A1 (en) 1994-12-08
WO1994028140A1 (en) 1994-12-08
EP0703982A1 (en) 1996-04-03
JPH08511683A (ja) 1996-12-10
SG45175A1 (en) 1998-01-16
PL311691A1 (en) 1996-03-04
NZ266401A (en) 1996-09-25
CN1127015A (zh) 1996-07-17
KR100337755B1 (ko) 2002-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4116668B2 (ja) フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子配列およびそれらの使用
PL177743B1 (pl) Sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej i wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny
EP0873410B1 (en) Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same
JP4690197B2 (ja) 花色が変更されたバラの製造方法
US5859329A (en) Genetic sequences encoding flavonol synthase enzymes and uses therefor
JP4977835B2 (ja) メチルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子配列及びそのための使用
JP2000023686A (ja) フラボノイド３′，５′―ヒドロキシラ―ゼ活性を有する蛋白質及びそれをコ―ドする核酸
EP0640136B1 (en) Genetic sequences encoding flavonoid pathway enzymes with flavonoid 3&#39;-hydroxylase activity and uses thereof
US5948955A (en) Transgenic plants having altered anthocyann levels
AU672308B2 (en) Transgenic flowering plants