PL177771B1 - Linie komórek hybrydoma i preparaty przeciwciał

Info

Abstract

Description

Claims

PL177771B1

Publication number: PL177771B1
Application number: PL93309637A
Authority: PL
Inventors: Ellis L. Kline; Daniel H. Zimmerman
Original assignee: Cell Med Inc; Molecular Rx Inc; Molecular Rxinc
Priority date: 1992-12-18
Filing date: 1993-12-17
Publication date: 2000-01-31
Also published as: EP0674661A1; EP0674661A4; WO1994014846A1; US5883227A; NZ259636A; RU2137131C1; ATE244299T1; EP0674661B1; US5645997A; AU689091B2; PL309637A1; AU5850994A; DE69333076D1; DE69333076T2

1. Linia komórek hybrydoma, znamienna tym, ze jest linia zlozona w ATCC i oznaczo- na numerem ATCC HB11152. 2. Linia komórek hybrydoma, znamienna tym, ze jest linia zlozona w ATCC i oznaczo- na numerem ATCC HB 11153. PL

Przedmiotem wynalazku jest linia komórek hybrydoma HB11152 z Amerykańskiego Zbioru Kultur (ATCC), wytwarzająca monoklonalne przeciwciała i wykazująca specyficzność na determinantę antygenową związaną ze stwardnieniem rozsianym u pacjentów z tą chorobą.

Przedmiotem wynalazku jest linia komórek hybrydoma HB11153 z Amerykańskiego Zbioru Kultur (ATCC), wykazująca specyficzność na determinantę antygenową związaną ze stwardnieniem rozsianym u pacjentów z tą chorobą.

Wynalazek obejmuje także preparaty przeciwciał zawierające diagnostyczną dawkę przeciwciał lub ich fragmentów wiążących, która skutecznie kompetycyjnie hamuje wiązanie monoklonałnego przeciwciała wytwarzanego przez linię komórek hybrydoma ATCC HB11152 lub ATCC HBU153 w odpowiedzi na antygeny związane ze stwardnieniem rozsianym, zgodnie z pomiarem według enzymatycznego testu immunologicznego lub innego testu immunologicznego na hamowanie kompetycyjne. Obejmuje to wszelkie przeciwciała lub ich fragmenty wiążące, inhibitujące przeciwciała HB11152 lub HB11153 z odpowiednimi determinantami antygenowymi stwardnienia rozsianego. Determinanty antygenowe są strukturalnymi składnikami cząsteczki antygenu odpowiedzialnymi za specyficzne oddziaływanie z cząsteczkami przeciwciał.

Wynalazek ma zastosowanie w sposobie i kompozycji do łagodzenia objawów stanów' chorobowych związanych z demielinizacją obserwowaną w stwardnieniu rozsianym. Sposób obejmuje podawanie ludziom lub zwierzętom chorym na stwardnienie rozsiane skutecznej dawki antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym lub ich sekwencji nukleotydowych. Skuteczną. dawką jest dawka nie powodująca efektów ubocznych takich jak odpowiedź anafilatyczna.

Specyficzne znaczniki antygenów dla stwardnienia rozsianego, przeciwciała specyficzne dla znaczników i odpowiedni test do diagnozowania stwardnienia rozsianego nie były znane aż do obecnego wynalazku.

Wynalazek znalazł zastosowanie do opracowania wrażliwego testu immunologicznego do wykrywania stwardnienia rozsianego u ludzi.

Innym zastosowaniem wynalazku jest opracowanie testu immunologicznego wysoce specyficznego do wykrywania stwardnienia rozsianego, nie dającego fałszywych wyników u pacjentów z innymi chorobami centralnego układu nerwowego.

Dalszym zastosowaniem -wynalazku jest opracowanie wrażliwego testu immunologicznego do wczesnego wykrywania stwardnienia rozsianego u ludzi.

Jeszcze innym zastosowaniem wynalazku jest opracowanie wrażliwego testu immunologicznego do rutynowego monitorowania pacjentów ze stwardnieniem rozsianym na rozwój choroby lub odpowiedź na leczenie.

Kolejnym zastosowaniem wynalazku jest tani sposób wykrywania stwardnienia rozsianego, w przeciwieństwie do obecnego sposobu złożonego z serii testów eliminujących wszystkie inne podobne zaburzenia nerwowe.

Innym zastosowaniem wynalazku jest opracowanie szybkiego sposobu wykrywania stwardnienia rozsianego w teście immunologicznym.

Inną korzyścią wynalazku jest umożliwienie leczenia pacjentów ze stwardnieniem rozsianym tak szybko, jak to jest tylko możliwe, dzięki pojedynczemu testowi diagnostycznemu stwardnienia rozsianego.

Innym zastosowaniem wynalazku jest opracowanie sposobu i kompozycji do łagodzenia objawów .stanów·’ chorobowych związanych z demielinizacyjnymi chorobami takimi jak stwardnienie rozsiane.

Innym zastosowaniem wynalazku jest opracowanie oczyszczonego białka związanego z obecnością stwardnienia rozsianego lub innych demielinizacyjnych chorób u ludzi i zwierząt.

Te i inne zastosowania, cechy i korzyści płynące z niniejszego wynalazku staną się oczywiste po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem sposobów realizacji wynalazku oraz z załączonymi zastrzeżeniami.

177 771

Krótki opis rysunków

Figura 1 ilustruje wyniki testu immunologicznego na surowicach otrzymanych z kilku królików immunizowanych ekstraktem PBL stwardnienia rozsianego i testowanych antygenami stwardnienia rozsianego lub ekstraktem z komórek normalnych.

Figura 2 pokazuje wyniki plamkowej analizy Western ekstraktów PBL z PBL od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i pacjentów zdrowych.

Figura 3 pokazuje wyniki analizy surowic myszy immunizowanych antygenami związanymi ze stwardnieniem rozsianym.

Figura 4 jest wykresem pokazującym wyniki testu ELISA surowic pochodzących od pacjentów zdrowych i pacjentów diagnozowanych na stwardnienie rozsiane stosując poliklonalne, przeciwciała wobec antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym.

Figura 5 jest wykresem pokazującym wyniki testu ELISA surowic pochodzących od pacjentów zdrowych i pacjentów diagnozowanych na stwardnienie rozsiane stosując monoklonalne przeciwciało 6D4.2 wobec antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym.

Przedmiotem wynalazku są monoklonalne lub poliklonalne przeciwciała specyficzne dla antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym. Przeciwciała takie wykorzystuje się następnie w testach immunologicznych do wykrywania antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym pozwalając na diagnozowanie stwardnienia rozsianego.

Przedmiotem wynalazku jest monoklonalne przeciwciało wytwarzane przez linię komórek hybrydomą HBl1l52 z ATCC, wykazujące specyficzność na determinantę antygenową związaną zę · stwardnieniem rozsianym u pacjentów z tą chorobą. Przedmiotem wynalazku jest także monoklonalne przeciwciało wytwarzane przez linię komórek hybrydoma HB11153 z ATCC, wykazujące specyficzność na determinantę antygenową związaną ze stwardnieniem rozsianym u pacjentów z tą chorobą.

Wynalazek obejmuje także preparaty przeciwciał zawierające diagnostyczną dawkę przeciwciał lub ich fragmentów wiążących, która skutecznie kompetencyjnie hamuje wiązanie monoklonalnego przeciwciała wytwarzanego przez linię komórek hybrydoma ATCC HB11152 lub ATCC HB11153 w odpowiedzi na antygeny związane ze stwardmeniem rozsianym, zgodnie z pomiarem enzymatycznym testem immunologicznym lub innym testem immunologicznym na hamowanie kompetycyjne. Obejmuje to wszystkie przeciwciała lub ich fragmenty wiążące, inhibitujące przeciwciała HB11152 lub HB11153 z odpowiednimi determinantami antygenowymi stwardnienia rozsianego. Determinanty antygenowe są strukturalnymi składnikami cząsteczki antygenu odpowiedzialnymi za specyficzne oddziaływanie z cząsteczkami przeciwciał.

Przeciwciała wytwarzane przez linie komórek hybrydoma HB11152 i/lub HB11153, albo przeciwciała kompetycyjnie hamujące wiązanie przez przeciwciała wytwarzane przez linie komórek HB11152 i/lub HB11153 można stosować w teście wykorzystującym przeciwciała do wykrywania antygenów. Testy obejmują immunologiczne testy enzymatyczne, radiologiczne, fluorescencyjne, bioluminescencyjne i chemiluminescencyjne, testy plamkowe i analizy plamkowe Western.

Z przedmiotem wynalazku jest także związane oczyszczone białko lub białka, albo związane z nimi sekwencje nukleotydowe RNA lub DNA, które wykazują związek z obecnością stwardnienia rozsianego lub innych chorób demielinizacyjnych. Analiza sekwencji DNA jest dobrze znana fachowcom 'i obejmuje analizę plamkową Southern i procedury hybrydyzacyjne Northern opisane w Current ,Protocols in Immunology, tom 2, wydawca John E. Coligan i in., strony 10.6.1 do 10.6.14 i 10.12.1 do 10.12.8 (1991). Antygen związany ze stwardnieniem rozsianym jest białkiem, które można wydzielić z limfocytów. Białko ma masę cząsteczkową od około, 14000 do okNo 16000 daltonów uderzoną na żelu poiakaylotmiidowym SDS. Wykazano, że białko występuje u pacjentów chorujących na stwardnienie rozsiane.

Polipeptyd zdolny do selektywnego łączenia się z przeciwciałami wytwarzanymi przez linie komórek hybrydoma oznaczone ATCC HB11152 i HB11153 jest całkowicie równoważny polipeptydowi, który , (i) występuje tylko we frakej i białych ałałek pacjenta chorego nastwaądnienie Γοζ5ίαηε lub podobną chorobę; oraz

177 771 (ii) ma masę cząsteczkową od ok oto 14000 dookoło 10)000 mieeonąna żelu poliakryloamidowym SDS.

Sposób wytwarzania mouoOiouaiuych przeciwciał wydzielanych przez Olouowaue liuie OomóreO hybrydoma B wobec autygeua zwiezauego ze stwardnieuiem rozsiauym. Hybrydomę i przeciwciało mouoOloualue możua wytworzyć ua wiele różuych sposobów zuauych fachowcom. Stosuje się staiudardowe techuiOi immauizacji, testowauia, fuzji, hodowli i Olmowauia, takie jaO opisuje Zimmermau i iu. w Commercial Applicatious of Mouocloual Autibodies to Bacteria (1985), tom II, str. 283-320, Oołkczouym uiuiejszym jaOo oOudśuiO literatarowy. JaO podaje opracowauie, celem jest azysOauie specyficzuych przeciwciał, Otóre możua oczyścić i stosować saOcesywuie w wielu procedurach, w tym testach immanologiczuych.

Przeciwciała te wytwarza się z liuii OomóreO hybrydoma otrzymywauych przez fuzję i Olouowauie OomóreO wytwarzających przeciwciała, stosując up. immuuizowaue limfocyty ze śledzimy i drugą strouę fuzji, up. liuię OomórOową SP2/i. Immuuizowaue limfocyty ze śledzimy wytwarza się z jeOuoOdmórOowej zawiesiuy wytworzouej ze śledzimy myszy BALB/c, Otóra wytwarza przeciwciała antygeuów. ReaOtywuość weryfiOuje się metodą plamOową Western i euzymatyczuym testem immunologicznym (ELISA) ua próbOach surowicy immumzowauych myszy. Przeciwciała te mogą reagować ua Oetermiuauty autygeuowe ua powierzchui autygeuów, a pochodzą z Olouowauych liuii OomóreO.

Przeciwciała wytwarzam w opisauy sposób są specyficzue dla autygeuów związauych ze stwardnieuiem rozsiauym i są różue w zależuości od izotypu: HB11152 wytwarza 6D4, będący podOlasą 3 IgG, a HB11153 wytwarza 3D3, będący przeciwciałem IgM. Pouieważ hybrydomy rozrastają się bez Oońca, stauowią ciągłe źródło pojedyuczego przeciwciała. Obie hybrydomy umieszczouo w depozycie patentowym ATCC w RocOville, MD, ozuaczając je HB11152 i HB11153.

Poza stosowauiem oczyszczouych przeciwciał mouoOloualuych jaOo odczyumOa przechwytującego, iuue czyuuiOi, dzięOi Otórym możua polepszać specyficzuość, czułość i waruuOi testu, obejmują między iuuymi stosowauie (1) bezpośreduiego euzymu (w tym peroOsydazy chrzauu, fosfatazy alOaliczucj, oOsydazy gluOozy i ureazy, (2) sprzężouych z biotyuą przeciwciał mouoOloualuych, (3) przeciwciał zuaczouych bio- lub chemolumiuesceucyjuie, (4) przeciwciał zuaczouych fluoresceucyjuie oraz (5) przeciwciał zuaczouych radiologiczuie.

Przeciwciała specyficzue wobec antygeuów związauych ze stward^i^euiem rozsiauym możua stosować w wielu różuych testach Oiaguostyczuych. Testy te obejmują między iuuymi test ELISA, test plamOowy Westeru, immunologicmy test radiologiczuy, biolumiuesceucyjuy i chemolumiuesceucyjuy. TaOie testy są dobrze zuaue fachowcom; ich opisy możua zualeźć up. w rozdziale 2 Curreut Protocols iu Immuuology, wyd. Coligau i iu., Greeu Publishiug Associates & Wiley Iuterscieiuce, 1991.

Procedury i wyuiOi testu saudwiczowego ELISA z przeciwciałami według wyualazOu opisauo w przyOładach 11 i 12.

Jędrnym z przyOładów testu wyOorzystajkcegd przeciwciała według wyualazOu specyficzue dla antygeuów stwarduieuia rozsiauego jest procedura ELISA. Zgoduie z uią pobiera się próbOę ludzOiej Orwi. Korzystuie z próbOi wydziela się limfocyty z Orwi obwodowej (PBL) i przetwarza się je w celu eOstraOcji mitogeuów związauych ze stwardnieniem rozsiauym z całych PBL, jeśli taOie występują. WyualazeO obejmuje stosowauie seOweucji uuOleotydowych lub ich fragmeutów związauych z białOiem stwarOnieuia rozsiauego dla diag^zowauia stwardnieuia rozsiauego lub chorób poOrewuych w testach taOich jaO techuiOi hybrydyzacji Northeru lub Southeru seOweucji uaO1eotyOowych.

Następuie eOstraOt PBL wprowadza się do pojemuiOa o właściwym Oształcie zawierającego przeciwciała specyficzue dla autygeuu stwarOuieuia rozsiauego związaue już z pojemuiOiem. Uwięzioue przeciwciała reagują z autygeuami związauymi ze stwardnieniem rozsiauym. Obecuie w eOstraOcie PBL autygeuy związaue ze stwarOnieniem rozsiauym zwiążą uastępuie przeciwciała związaue z pojemuiOiem.

Po czym do mieszauiuy dodaje się uastępuy zestaw przeciwciał pieΓOΌtnych specyficzuych dla autygeuów związauych ze stwardmeuiem rozsiauym. Te pierwotue przeciwciała

177 771 będą wiązały tylko antygeny związane ze stwardnieniem rozsianym, które już zwiążą się z przeciwciałami utrzymywanymi przez pojemnik. Pierwotne przeciwciała różnią się także tym, że są zmodyfikowane dodatkiem znacznika, takiego jak enzym. Pojemniki przemywa się następnie w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Znacznik będzie wówczas obecny tylko w ilości odpowiadającej ilości antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym.

Alternatywnie test można przeprowadzić stosując trzy różne przeciwciała. Zamiast sprzęgać pierwotne przeciwciało, można zastosować wtórne, sprzężone przeciwciało selektywne dla pierwotnego. Zastosowanie wtórnego przeciwciała wzmacnia wynikowy sygnał. Alternatywnie można zastosować znaczone biotyną przeciwciała z enzymami znaczonymi awidynąlub streptawidyną albo przeciwbiotynowe przeciwciała sprzężone z enzymami.

Niezależnie od zastosowanych rodzajów przeciwciał sprzężone przeciwciało może być znaczone następującym czynnikiem: radioizotopem, enzymem, środkiem wywołującym fluorescencję lub środkiem wywołującym luminescencję. Stwierdzanie obecności antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym można prowadzić w odpowiedni sposób: radiometryczny, enzymatyczny, fluorometryczny lub luminescencyjny.

Dla wszelkich celów diagnostycznych przeciwciała i inne niezbędne reagenty i urządzenia można skompletować w zestawy do dogodnego i łatwego wykonywania testów.

Sposób łagodzenia objawów stwardnienia rozsianego i podobnych chorób obejmuje podawanie ludziom lub zwierzętom z chorobą dcmieliniz^icyjną taką jak stwardnienie rozsiane skutecznej dawki antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym, ich części, związanych sekwencji nukleotydowych lub ich części. Skuteczną dawką jest ilość nie powodująca odpowiedzi anafilaktycznej.

Czynniki związane ze stwardnieniem rozsianym oznaczają jedno lub kilka białek związanych ze stwardnieniem rozsianym, frakcje lub pochodne takich białek, sekwencje nukleotydowe RNA lub DNA lub ich części, związane z białkiem stwardnienia rozsianego. W praktyce sposób polega na podawaniu mniej niż 10'² mg w dawce dla człowieka lub zwierzęcia ze stwardnieniem rozsianym. Korzystna dawka czynników związanych ze stwardnieniem rozsianym lub związanych sekwencji nukleotydowych, ich części lub aktywnej pochodnej, wynosi od około 10'² do około 10’¹⁰ mg. Korzystniejsza dawka tych czynników wynosi od około 10⁴ do około 10'⁸ mg. Najkorzystniejsza dawka tych czynników wynosi około 10'⁷ mg. Korzystnie łączna okresowa dawka dzienna nie powinna prz^kro^:zyć około 10’² mg na pacjenta, a korzystniej nie powinna przekroczyć od około 5 x 10‘³ do 104 mg.

Podawane są ilości nie przekraczające 10'2 mg, chociaż w pewnych przypadkach łączna ilość czynników związanych ze stwardnieniem rozsianym podanych jednego dnia może przekroczyć tą korzystną granicę. Czynniki związane ze stwardnieniem rozsianym można podawać w postaci cieczy lub ciała stałego, w którym wiążą się one z biodegradowalną matrycą. Może to być matryca do spowolnionego uwalniania. Takie matryce są dobrze znane fachowcom i nie są istotnym czynnikiem w niniejszym wynalazku. Korzystną drogą podawania czynników związanych ze stwardnieniem rozsianym jest zastrzyk podskórny lub droga podjęzykowa. Możliwe jest także podawanie domięśniowe, pozajelitowe, dożylne lub przezskórne.

W jednej z odmian nośnikiem dostarczaj ącym jest wodny roztwór zawarty w obojętnym pojemniku. W innej odmianie kompozycja ma postać czopka. Ciekłą postać korzystnie jest wstrzykiwać podskórnie, chociaż może to być inny rodzaj zastrzyku. Ponadto kompozycje można podawać przez błony śluzowe, np. w nosie. Ciekłe nośniki obejmują między innymi, 0,1% fenol w solance (0,9% NaCl). Można stosować też inne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki czynników związanych ze stwardnieniem rozsianym.

Czynniki związane ze stwardnieniem rozsianym można podawać w standardowy sposób, w tym domięśniowo i podskórnie. Można je też podawać pod język lub do nosa. Ponieważ skuteczna dawka jest bardzo niewielka, kompozycje można też podawać przezskórnie, doodbytniczo lub doustnie. Dawki mogą mieć postać ciekłą lub stałą. Typową dawkę można podawać maksymalnie 4 razy dziennie, a w pewnych przypadkach częściej.

Poniżej zilustrowano wynalazek przykładami, które jednak nie nakładają ograniczeń na zakres wynalazku. Przeciwnie, należy rozumieć, że możliwe są różne inne odmiany, modyfikacje i równoważne sposoby, które po zapoznaniu się z opisem mogą stać się oczywiste dla

177 771 fachowców, a nie wymagają odchodzenia od ducha wynalazku i/lub zakresu załączonych zastrzeżeń.

Przykład 1. Zbieranie, oddzielanie i homogenizację antygenowych limfocytów PBL przeprowadza się w następujący sposób. Próbki krwi pacjentów diagnozowanych jako mających stwardnienie rozsiane lub inne stany neurologiczne otrzymano od dr Gary Duncana z Neurology Associates, Nashville, Tennessee. Ponadto członkowie grup wspierających leczenie stwardnienia rozsianego z Greenville, South Carolina, także dostarczyli próbki krwi.

Antygenowe limfocyty z krwi obwodowej (PBL) wytworzono z krwi osób cierpiących na stwardnienie rozsiane lub inne choroby w następujący sposób. Krew zebrano przez nakłucie z żyły rami cenowej, jeśli nie podano inaczej. Około 17 ml od każdej osoby umieszczono w specjalnych probówkach Vacutainer Brand Evacuated Blood Collection Tubes (BectonDickinson, Baltimore, MD.) z żółtymi korkami. Każda zawierała 8,5 ml krwi i 1,5 ml roztworu cytrynianu glukozy, antykoagulantu. Napełnione zamknięte probówki, trzymane w temperaturze pokojowej, przewieziono w nocy z różnych, miejsc do laboratorium Cell Med., Inc. w Columbia, MD.

Po otrzymaniu próbki wytrząsa się kilkakrotnie w celu wytworzenia zawiesiny przed odwirowaniem. Odwirowuje się je przez 10 minut w wirówce IC przy 2000 obrotach na minutę. Żółtawą powłokę z granicy osocza z komórkami zebrano przy pomocy jednorazowych pipet Pasteura i rozcieńczono do 6,5 ml solanką buforowaną fosforanem (PBS). PBS składa się z 9,0 g/l NaCl, 0,8 g/l Na₃HPO4 i 0,15 g/l KH2PO4 z pH ustawionym na około 7,4. Równe ilości żółtawej substancji powłokowej układa się na 3 ml handlowej substancji do rozdzielania (Histopaque H-1077 z Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.) w dwu 15 ml probówkach do odwirowywania. Substancję odwirowuje się następnie przez 40 minut przy 2000 obrotach na minutę. PBL można także wydzielić z pełnej krwi nakładanej na Ficoll.

Po odwirowaniu warstwę wzbogaconą w PBL zbiera się pipetą Pasteura i uzupełnia do 15 ml PBS, granuluje w wirówce przez 10 minut i ponownie umieszcza w zawiesinie w 3 ml PBS. Substancję homogenizuje się co najmniej 5 razy wciągając ją do pipety, a następnie przenosi się do homogenizatora Dounce Glass Homogenizer. Komórki homogenizuje się przez co najmniej 20-krotne przejście tłuczka. Alternatywnie komórki nozn'wa się, a następnie homogenizuje przeciskając je 20 razy przez igłę nr 27. Wyekstrahowane substancje przechowuje się zamrożone w temperaturze -70°C.

W przypadku otrzymania jednocześnie zbyt wielu próbek do szybkiego przetwarzania komórki PBL można zbierać PBS po rozdzielaniu Histopaque, a zamiast umieszczenia w zawiesinie w PBS do homogenizacji komórki można zawiesić w 1 ml Cryomedia (RMPI 1640, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 7,5% dimetylosulfotlenku) i zamrozić w temperaturze -70°C. Komórki rozmraża się następnie w temperaturze 37°C, rozcieńcza 13 ml PBS, wydziela przez odwirowanie przez 10 minut przy 2000 obrotach na minutę, zawiesza ponownie w PBS i homogenizuje jak powyżej.

Przykład 2. Preparaty ekstraktów z PBL do immunizacji krtól^k^^-w i myszy wytwarza się następująco. Ekstrakty PBL od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym zbiera się w ilości takiej, aby stanowiły reprezentatywną próbkę do immunizacji kilku zwierząt. Po zebraniu dostatecznej ilości rozmraża się substancję, miesza przez kilkakrotne odwrócenie, umieszcza w czystym pojemniku i miesza przed podzieleniem na próbki 2 ml umieszczane w 2 ml probówkach do zamrażania. Zawartość białka określona metodą Pierce BCA (Pierce Rockford, IL.) wynosi 0,8-1,1 mg/ml dla kilku reprezentatywnych próbek. Substancję tę przechowuje się zamrożoną w temperaturze około -70°C przed użyciem.

Do immunizacji antygeny rozmraża się i miesza z równą ilością zarobki Freunda (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.). Zaróbka jest albo kompletna, do początkowego szczepienia, albo niekompletna, do kolejnych immunizacji. Mieszaninę emulguje się przez wirowanie w dobrze zamkniętej fiolce zawierającej szklane kulki (średnica 4-6 mm). Emulgowany preparat odstawia się na 10 minut dla upewnienia się w trwałości emulsji, przenosi do strzykawek i podaje zwierzętom.

Przykład 3. Immunizacja królik^^-w i myszy w celu wytworzenia przeciwciał na czynniki związane ze stwardnieniem rozsianym.

177 771

Każdego królika (New Zealand White, masa 4-6 funtów) szczepi się w co najmniej dwu miejscach, z każdej strony. Każde szczepienie obejmuje 0,5 ml opisanego wyżej emulgowanego preparatu. Dla myszy (Balb/C, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN.) całkowita dawka immunizacyjna wynosi 0,1 ml, dootrzewnowo. Zwykle króliki immunizuje się i pobiera im próbki krwi w dniu 0, 14, 28 i 42. Krew królików pobiera, się z żyły usznej przez nakłuwanie, pozwala się jej na zakrzepnięcie i oddziela surowicę od komórek tego samego lub następnego dnia. Myszom pobiera się krew tylko raz lub dwa razy z żyły obwodowej lub ogonowej. Jeśli dokonuje się innych procedur, np. szczepienia antygenem, testowe pobrania wykonuje się przed immunizacją.

Przykład 4. Analizy odpowiedzi immunologicznej dokonuje się w następujący sposób. Surowice z immunizowanych myszy i królików testuje się na specyficzną reaktywność z antygenami związanymi ze stwardnieniem rozsianym na różne sposoby, głównie technikami ELISA i WB.

Najpierw płytki mikrotestowe (silnie wiążące, Nunc, Helsinki, Finlandia) powleka się metodą absorpcji fizycznej immunizującymi antygenami przy optymalnym rozcieńczeniu, określonym wcześniej jako rozcieńczenie od około 1/100 do około 1/1000, w buforze wodorowęglanowym (1,602 g/l Na2CO3, 2,93 g/l NaHCO3 oraz 0,2 g/l NaN₃) przez 2 do 7 dni w temperaturze około 4°C. Przed użyciem powleczone studzienki mikrotestowe blokuje się 0,2% białkiem surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (0,2% BSA/PBS). Można zastosować inne środki blokujące, np. żelatynę i hydrolizowane chude mleko. Po 15-minutowej blokadzie płytki przemywa się PBS z 0,05% Tween 20 (obie substancje z Sigma Chemical Company). Inkubację prowadzi się w temperaturze około 37°C przez 1-2 godziny.

Stosuje się objętość próbki, czynnika sprzęgającego i substratu 100 μΐ na studzienkę z przemywaniem 200 μΐ bufora PBS/Tween. Próbki surowic zawierających przeciwciała rozcieńcza się w stosunku około 1M00 lub więcej przy pomocy PBS. Środki sprzęgające (HRPanty-mysz lub HRP-anty-królik, z Kirkegaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithesburg, MD.) rozcieńcza się 1/1000 w 5% BSA w PBS. Zabarwienie osiąga się przez konwersję substratu, o-fenylenodiaminy (OPD) (Sigma Chemical Company) w żółty produkt i konwersję na zakończenie reakcji przez dodanie 100 μl na studzienkę 4N kwasu azotowego, co daje pomarańczowy produkt. Zawartość produktu można odczytywać przy długości 490 nm na czytniku do płytek Bio Tech ELISA.

Łącznie sekwencja operacji procedury obejmuje powlekanie, blokowanie, przemywanie, roztwór przeciwciała, przemywanie, roztwór środka sprzęgającego, przemywanie, substrat, roztwór zatrzymujący i odczyt.

Figura 1 ilustruje wyniki testu immunologicznego na surowicach otrzymanych z kilku królików immunizowanych ekstraktem PBL związanym ze stwardnieniem rozsianym i testowanych antygenami stwardnienia rozsianego lub ekstraktem z normalnych komórek. Próbki zbierano w dniach oznaczonych na osi X. Strzałki wskazują na punkty związane z czasem immunizacji. Fig. 1 pokazuje, że w ekstrakcie związanym ze stwardnieniem rozsianym są obecne pewne antygeny nieobecne w normalnym ekstrakcie.

Przykład 5. Odpowiedzi w przypadku myszy.

Figura 3 pokazuje wyniki analizy opisanej w przykładzie 4 odpowiedzi immunologicznej dla myszy, jednak tylko z jednym punktem czasowym, ponieważ zbiór wielokrotny nie jest praktyczny. Jak w przypadku królików wiadomo, że w ekstrakcie związanym ze stwardnieniem rozsianym są obecne pewne antygeny nieobecne w normalnym ekstrakcie. Analiza plamkowa Western potwierdziła ten fakt. Ponadto pewne antygeny rozpoznawane przez myszy i króliki wykazują tę samą ruchliwość.

Przykład 6. Analiza plamkowa Western przeciwciał antygenówimmunizujących.

Ekstrakty PBL od pacjentów normalnych i ze stwardnieniem rozsianym przetwarza się i poddaje elektroforezie w sposób rekomendowany przez wytwórcę chemikaliów i sprzętu (Mini-Gel Apparatus, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA.). Po elektroforezie próbki plamki przeniesiono zgodnie z rekomendacją i następnie zablokowano przy pomocy 0,2% BSA, jak opisano powyżej.

177 771

Elektroforetyczną separację różnych białek wykonano w warunkach z zastosowaniem SDS i merkaptoetanolu. Proces ten pozwala na oddzielenie podstawowych pódjednostek łańcucha polipeptydowego w funkcji ich mas cząsteczkowych. Substancję z elektroforezy przenosi się z żeli poliakryloamidowych (PAGE) na nośnik, taki jak papier nitrocelulozowy, który wiąże białka.

Inkubację plamek na papierze nitrocelulozowym przeciwciał króliczych lub mysich (anty-stwardnienie rozsiane) prowadzi się w temperaturze pokojowej przez około 2 godziny, a przemywania dokonuje się tym samym buforem przemywającym (PBS/Tween) jak w przykładzie 4. Próbki zawierające przeciwciała rozcieńczono 1/100 przy pomocy PBS. Środek sprzęgający, alkaliczną fosfatazową IgG anty-króliczą lub anty-mysią (z KPL) rozcieńcza się 5% BSA w PBS. Zabarwienie reakcji wynika z konwersji substratu BCIP/NBT (z KPL) do nierozpuszczalnego błękitu.

Sekwencja reakcji jest następująca: przeciwciała, przemywanie, sprzęgająca alkaliczna fosfatazowa IgG anty-krclicza (lub alkaliczna fosfatazowa IgG anty-mysia, jeśli stosuje się mysie przeciwciała), przemywanie, substrat BCIP/NBT i na końcu woda dla zatrzymania reakcji.

Wybrana próbkę surowicy testuje się wobec próbki PBL ekstraktu normalnego lub ze stwardnieniem rozsianym, zgodnie z zaleceniami Bio-Rad. Próbka ta daje widmo z dwoma głównymi pasmami i kilku mniejszymi na stałym nośniku, które wydają się być charakterystyczne dla ekstraktu ze stwardnieniem rozsianym (fig. 2). Zastosowanie standardu masy molekularnej pozwala na określenie masy cząsteczkowej na 14000 do 16000 daltonów dla mniejszego pasma, które jest tym dobrze widocznym dla przeciwciał monoklonalnych. Inne większe pasma mogą odzwierciedlać postać prekursora, jak to często bywa, lub zmienioną postać np. silnie glikozylowaną lub niezredukowaną. Przeciwciało monoklonalne reaguje tylko z odpowiednikiem pasma o najniższej masie molekularnej.

Przykład 7. Przetwarzanie i sprzęganie króliczego antygenu IgG stwardnienia rozsianego.

Przeciwciała z królika 5866, pobierane w dniu 42, przetworzono w standardowy sposób strącaniem 40% roztworem siarczanu amonowego, a następnie dializą ponownie rozpuszczonego wytrąconego białka wobec 0,01 M fosforanu sodowego, pH 7,2 i chromatografią DEAE DE-52, zgodnie z zaleceniami wytwórcy (Whatman, Freehold, NJ). 5 ml roztworu zawierającego te przeciwciała poddano ekstensywnej absorpcji normalnym ekstraktem PBL sprzężonym z Affi-Gel 10 (Bio-Rad Laboratories). W końcu sprzęgania króliczego IgG antystwardnienie rozsiane z biotyną przy pomocy NHS-biotyny dokonuje się zgodnie z zaleceniami wytwórcy (Pierce Chemical, Rockford, I/L.). Sprzęgnięta z biotyną IgG antystwardnienie rozsiane jest w tym przypadku rozpoznawana przez enzym HRP ze streptawidyną (KPL).

Przykład 8. Zastosowanie mysiej immunoglobuliny w teście ELISA.

Antygeny stwardnienia rozsianego można wykrywać stosując test ELISA, w którym oczyszczone monoklonalne przeciwciało stosuje się do powlekania studzienek mikrotestowych i służy do wiązania antygenów pochodzących z ekstraktu PBL ze stwardnieniem rozsianym. Unieruchomione antygeny wykrywa się następnie i generuje sygnał użyciem drugiego przeciwciała.

W tym przykładzie zastosowano przeciwciało poliklonalne z królika. Do początkowego stadium użyto mysich przeciwciał z Mouse 2. Wytworzono mysie immunoglobuliny strącaniem w 40% soli amonowej, podobnie jak przy oczyszczaniu IgG królika w przykładzie 7. Immunoglobuliny mysiej używa się do powlekania płytek mikrotestowych w buforze powlekającym przy stężeniu bialka 5 pg/ml. Płytki blokuje się i przemywa w taki sam sposób, jak w przykładzie 4.

Test jest podobny do testu wykrywania przeciwciał opisanego w przykładzie 4, tylko płytki są pokrywane przeciwciałami, blokowane, przemywane, inkubowane z ekstraktem antygenowym PBL, przemywane jak poprzednio, inkubowane ze sprzęganym przeciwciałem, przemywane, inkubowane (w razie potrzeby) z drugim sprzęganym przeciwciałem. Enzym jest wiązany tylko wtedy, gdy jedno lub oba (w układzie podwójnym) przeciwciała wykryją

177 771 antygeny. Objętości są w tyra przypadku o połowę mniejsze, wynoszą 50pl. Inkubacja trwa około 1-2 godzin w temperaturze około 37°C. Przeciwciała można sprzęgać bezpośrednio z peroksydazą chrzanu (HRP) lub alkaliczną peroksydazą (AP).

Na koniec związany - enzym może przt?k^zta^cić roztwór substratu w roztwór nowego produktu. Nowy produkt absorbuje lub w przypadku produktów fluoryzujących emituje przy długości fali innej niż substrat .nieprzereagowany.

Figura 4 jest analizą pacjentów normalnych i pacjentów z diagnozą stwardnienia rozsianego. Jak pokazuje wykres; próbki związane ze stwardnieniem rozsianym rozkładają się na wyższym końcu skali, a znane próbki negatywne na końcu niższym.

Przykład 9. Wytwarzanie hybrydom HB11152 i HB11153 zdeponowanych w ATCC.

W celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych immunizuje się myszy Balb/C tak jak opisano w przykładzie 3, dwoma próbkami antygenów PBL stwardnienia rozsianego, jedną od pacjentów z South Carolina. wcześniejszą od pacjentów z Tennessee.

Dla otrzymania hybrydom opisanych w wynalazku zwierzęta zabija się przez dyslokację kręgów szyjnych i wykonuje standardowy preparat pojedynczej komórki limfoidalnej przerywając kapsułę śledziony i uwalniając limfocyty z innych składników tkanki łącznej przez ścieranie pomiędzy płytkami z matowego szkła. Komórki śledziony przemywa się dwukrotnie w środowisku wolnym od surowicy i wykonuje się fuzję z PEG. Komórki inkubuje się w hipotanzynie z aminopteryną i tymidyną (HAT) w temperaturze około 37°C przy wilgotności względnej 100%, ,95% powietrzu i 5% CO2. Wzrost komórek obserwuje się w wyznaczony sposób poczynając od 10 dnia.

Hodowle w mikrostudzienkach -pochodzące z fuzji przemyto i komórkom dano HAT, RMPI 1640 z Hybrimax z Sigma Chemica, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), OPI (kwas szczawiooctowy, pirogronowy i insulina), Fungizone, penicylinę i streptomycynę. Od dnia 10 studzienki obserwowano pod kątem wzrostu potencjalnych hybrydom, przerostu fibroblastów oraz zanieczyszczenia bakteriami i grzybami.

Przykład 10. Analiza monoklonalnych przeciwciał wytwarzanych przez hybrydomy wytworzone w przykładzie 9.

Tabela 1 podsumowuje wyniki badania właściwości dwu monoklonalnych przeciwciał wobec antygenowego ekstraktu PBL stwardnienia rozsianego. Tabela 1 podaje podsumowanie linii komórkowych i ich produktów, odpowiednich monoklonalnych przeciwciał. Tabela 2 porównuje rozkład sygnałów absorbancji między dwoma monok.lonalny.mi przeciwciałami i trzecim, 2A2.

Tabela 1

Właściwości dwu monoklonalnych przeciwciał wobec antygenowego ekstraktu PBL stwardnienia rozsianego

Hybrydoma lub przeciwciało	Metoda klonowania	Reprezentatywne klony	Izotop przeciwciała	Masa cząst. met. Western
6D4	ograniczająca	6D4.2 lub 3	IgG3	14-16000 daltonów
3D3	ograniczająca	3D3.2 lub 3	IgM	14-16000 daltonów

Tabela 2

Rozkład sygnałów, gdy stosuje się surowy płyn z hodowli tkanki hybrydomy jako źródła przeciwciała wiązanego anty-stwardnienie rozsiane w sprzężeniu z zaabsorbowanym znaczonym biotyną króliczym antygenie anty-stwardnienie rozsiane

177 771

N = materiał od 8 normalnych pacjentów

MS = materiał od 8 pacjentów ze stwardnieniem rozsianym

Przeciwciało 6D4 jest monoklonalnym przeciwciałem IgG3 dającym reakcję plamkową Western.

Tabela zawiera analizę rozkładu sygnałów generowanych przez rozcieńczoną, w proporcji 1:4 surowicę (osocze) normalnych pacjentów i pacjentów diagnozowanych na stwardnienie rozsiane. Test wykorzystuje powłokę z oczyszczonej metodą powinowactwa immunoglobulin anty-mysich i hodo Vvlę tkankową z monoklonalnymi przeciwciałami. Następnie testuje się próbkę od pacjenta, przeciwciało królicze anty-stwardnienie rozsiane znaczone biotyną i streptoawidyną-HRP.

Przykład 11. Powlekające przeciwciało do testu ELISA przygotowuje się w następujący sposób. Przeciwciało 3D3.2. klon monoklonalnego przeciwciała częściowo oczyszczony z materiałów puchlinowych. Po pierwsze, każdą próbkę płynu puchlinowego rozcieńcza się taką samą ilością zimnej destylowanej wody. Następnie dodaje się taką samą ilość 100% nasyconego roztworu siarczanu amonowego i próbkę starannie miesza i pozostawia na kilka godzin w temperaturze około 4°C. Następnie wytrącone immunoglobuliny, w tym 3D3.2 IgM, odwirowuje się (10000 G przez 15 minut). Supernatant odrzuca się i osad immunoglobuliny zawiesza ponownie w niewielkiej ilości wody. Materiał dializuje się 2 x PBS przez 3 dni, następnie zmienia roztwór bufora. Po dializie próbkę oczyszcza się i powstały materiał przechowuje się w temperaturze około -20°C.

W celu powleczenia próbkę zamrożonego przeciwciała rozmraża się i rozcieńcza około 1:1000 w tym samym buforze, jak w przykładzie 4. Powleczone mikrostudzienki przechowywano w temperaturze około 4°C w pojemniku o dużej wilgotności. Przed zastosowaniem płytki blokuje się 0,2% albuminą surowicy bydlęcej i przetwarza jak w przykładzie 4.

Przykład 12. Monoklonalne przeciwciało sprzęgane do testu ELISA wytwarza się w następujący sposób. Inne monoklonalne przeciwciało (6D4) z klonu 6D4.2 sprzęga się z peroksydazą chrzanu, według procedury Nakane i in., A Peroxidase Antibody: A New Method of Conjugation Histochem Cytochem, 22: 1084 (1974). Po pierwsze, przeciwciało oczyszcza się z materiałów puchlinowych stosując Pierce Protein A Antibody Purification Kit w następujący sposób. Próbkę 1,5 ml płynu puchlinowego rozcieńcza się 1,5 objętości próbki Binding Buffer, odwirowuje się (10000 G przez 15 minut) i podaje na 5 ml kolumnę staph-A, przemywa starannie buforem wiążącym i przeciwciało eluuje się buforem eluującym. Ponieważ przeciwciało zachowuje się jak krioglobulina, szczególnie na poziomie lub poniżej fizjologicznej siły jonowej, wszystkie etapy prowadzi się w temperaturze pokojowej poza dializą i odwirowaniem, które przebiegają w temperaturze około 4°C. Podobnie w każdym możliwym miejscu stosuje się 2 x PBS, szczególnie ze względu na preferowane wysokie stężenia 6D4. Przeciwciało sprzęga się z enzymem (1:4) po standardowym okresie aktywacji HRP. Oddzielanie sprzężonego i niesprzężonego HRP osiąga się przez wytrącenie siarczanem amonowym osadu związku sprzężonego. Rozpuszcza się go i dializuje ekstensywnie wobec 2 X PBS i przechowuje się w temperaturze około -20°C.

Test prowadzi się jak w przykładzie 8, tylko ze względu na stosowanie sprzężonej substancji HRP-6D4 potrzebny jest tylko jeden etap, a nie dwa w sekwencji biotyna-przeciwciało i streptoawidyna-HRP.

Wyniki pokazano na fig. 5, przy czym pierwsze 7 próbek stanowiło próby kontrolne o znanej diagnozie, a ostatnie dwie grupy próbek, CU 21 - CU 28 i CU 29 - CU 37 miały próby ślepe. Pierwsza grupa próbek, otrzymana z zakodowanymi nazwami, była oznaczona jako CU 21 - CU 28; dla wszystkich wynik testu był negatywny. Druga grupa oznaczona CU 29 12

177 771

CU 37, dała wyniki pozytywne· Po ujawnieniu kodów i zidentyfikowaniu pacjent (ów dających próbki krwi stwioηdZ.fnf, że pierwsza grupa składała się wyłącznie z pacjentów bez stwardnienia rozsianego, chociaż jeden z pacjentów był synem diagnozowanego pacjenta ze stwardnieniem rozsianym, a jeden miał epilepsję i porażenie nerwu kr^i^-^^owego. Druga grupa próbek pochodziła od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym lub stanami podejrzewanymi o początki tej choroby.

Przykład 13. Przetestowano kilku pacjentów z diagnozą stwardnienia rozsianego w sposób opisany w przykładzie 8 z zastosowaniem związku sprzężonego HRP-6D4.2. Ponadto przetestowano tak samo 6 pacjentów nie cierpiących na stwardnienie rozsiane. Wyniki podano w tabeli 3.

Tabela 3

Pacjenci	Negatywnie	Pozytywnie
Normalni	6	0
Ze stwardnieniem	0	14

Jak widać z tabeli 3, test z zastosowaniem sposobu według wynalazku jest w stanie pozwolić na rozróżniente pacjentów normalnych i cierpiących na stwardnienie rozsiane.

Należy oczywiście rozumieć, że powyższy opis dotyczy tylko korzystnych odmian, ale możliwe są różne modyfikacje, nie wymagające odchodzenia od zakresu wynalazku przedstawionego w załączonych zastrzeżeniach.

177 771

gjEAlCTYNMCLSc C-A-B^oRgA/j_c

RELAITVE REACTIYITY (ABSORB ANCES)

177 771

S cO i *3 «Λ O—

AGsoGBan cją

ABSORBANCE

177 771

FIG . 5

B3

Wł

V

C9 g £ 3 jq ą o o e o

A-BSogągftNC'-¹ AABSORBANCE νπ 771

’3 $

ο\

Μ¹ . ίΜ : Β &

«, Μ*

Ο\ >2 &

§ §

ί ς| ΐΰ ο

1=) w

Ś ίΛ ² ω LU £Χ _ d ζ

Μ

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Zakres sygnału

Zastrzeżenia patentowe

1. Linia komórek hybrydoma, znamienna tym, że jest linią złożoną w ATCC i oznaczoną numerem ATCC HB11152.
2. Linia komórek hybrydoma, znamienna tym, że jest linią złożoną w ATCC i oznaczoną numerem ATCC hB 11153.
3. Preparat przeciwciała, znamienny tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment, oznaczone 6D4 i wydzielane przez linię komórek hybrydoma złożoną w ATCC i oznaczoną numerem ATCC HB 11152.
4. Preparat przeciwciała, znamienny tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment, oznaczone 3D3 i wydzielane przez linię komórek hybrydoma złożoną w ATCC i oznaczoną numerem ATCC HB 11153.
5. Preparat przeciwciała, znamienny tym, że zawiera diagnostycznie skuteczną ilość przeciwciała lub jego wiążącego fragmentu, które kompetycyjnie hamuje wiązanie monoklonalnego przeciwciała wytwarzanego przez linię komórek hybrydoma ATCC nr HB11152 do antygenu związanego ze stwardnieniem rozsianym, mierzone w enzymatycznym teście immunologicznym lub innym teście immunologicznym na hamowanie kompetycyjne.
6. Preparat przeciwciała, znamienny tym, że zawiera diagnostycznie skuteczną ilość przeciwciała lub jego wiążącego fragmentu, które kompetycyjnie hamuje wiązanie monoklonalnego przeciwciała . wytwarzanego przez linię komórek hybrydoma ATCC nr IIB11153 do antygenu związanego ze stwardnieniem rozsianym, mierzone w enzymatycznym teście immunologicznym lub innym teście immunologicznym na hamowanie kompetycyjne.

Zgłoszenie jest częściową kontynuacją zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/992641 złożonego 18 grudnia 1992 roku.

Przedmiot wynalazku jest związany z wykrywaniem chorób demielinizacyjnych takich jak stwardnienie rozsiane. Dokładniej przedmiotem wynalazku są linie komórek hybrydoma oraz preparaty przeciwciała mające zastosowanie w testach do wykrywania antygenu (antygenów) związanych ze stwardnieniem rozsianym i pokrewnymi chorobami. Wynalazek można wykorzystać w diagnozowaniu stwardnienia rozsianego i następuj ącym rutynowym monitorowaniu pacjentów ze stwardnieniem rozsianym na rozwój choroby lub odpowiedź na leczenie.

Stwardnienie rozsiane jest powoli postępującą chorobą centralnego układu nerwowego, charakteryzującą się patologicznie rozsianymi plamami demielinizacji w mózgu i rdzeniu kręgowym, a klinicznie licznymi objawami i oznakami z remisjami i wytwarzaniem fałszywych wyników pozytywnych wskutek innych chorób centralnego układu nerwowego, innych zaburzeń odpornościowych lub przyjętych leków. Ponadto sposoby takie powinny umożliwiać zdiagnozowanie stwardnienia rozsianego we wczesnych stadiach, nie powinny wymagać bolesnego i ryzykownego pobierania próbek tkanek i korzystnie powinny korzystać ze standaryzowanych technik laboratoryjnych nie wymagających kosztownej lub skomplikowanej aparatury.

Wynalazek jest związany z wykrywaniem stwardnienia rozsianego u pacjenta, w szczególności z monoklonalnym lub poliklonalnym przeciwciałem specyficznym dla antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym. Przeciwciała takie wykorzystuje się następnie w testach immunologicznych do wykrywania antygenów związanych ze stwardnieniem rozsianym pozwalając na diagnozowanie stwardnienia rozsianego.

177 771