PL178628B1 - Sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych, sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych i sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych - Google Patents

Sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych, sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych i sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych

Info

Publication number
PL178628B1
PL178628B1 PL94311755A PL31175594A PL178628B1 PL 178628 B1 PL178628 B1 PL 178628B1 PL 94311755 A PL94311755 A PL 94311755A PL 31175594 A PL31175594 A PL 31175594A PL 178628 B1 PL178628 B1 PL 178628B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
adp
tubers
enzyme
glucose pyrophosphorylase
potato
Prior art date
Application number
PL94311755A
Other languages
English (en)
Other versions
PL311755A1 (en
Inventor
Gerard F. Barry
Ganesh M. Kishore
David M. Stark
James C. Zalewski
Original Assignee
Monsanto Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22093489&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL178628(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Monsanto Co filed Critical Monsanto Co
Publication of PL311755A1 publication Critical patent/PL311755A1/xx
Publication of PL178628B1 publication Critical patent/PL178628B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)
  • Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)

Abstract

1 Sposób polepszania jakosci bulw ziemniaczanych magazynowanych w obnizonych temperaturach, polegajacy na zapewnieniu zw iekszonego poziom u aktywnosci enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy w bulwach podczas przechowywania w obnizonych temperatu- rach, znam ienny tym , ze transformuje sie rosliny ziemniaka rekombinantowa, dwuniciow a czasteczka D N A zawierajaca(a) promotor, które- go funkcja w ziemniakach jest powodowanie wytwarzania sekwencji R N A w bulwach, (b) strukturalnasekwencje D N A powoduiaca wytwarza- nie sekwencji R N A kodujacej polipeptyd fuzyjny zlozony z amino-terminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu, A D P -glukozo-pirofosforylazy i (c) m etranslacyjna 3'-sekwencje D N A , której funkcja w komórkach roslinnych jest powodowanie zakon- czenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydow na koncu 3’ tej sekwencji R N A i z tak transformowanych roslin ziemniaka otrzymuje sie bulw y, w których enzym, AD P-glukozo-pirofosforylaza je s t deregulowany 5 Sposób obnizania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych w obnizonych temperaturach polegajacy na zw ie- kszeniu poziomu aktywnosci enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy podczas przechowywania w obnizonych temperaturach, znam ienny tym, ze transformuje sie rosliny ziemniaka rekombinantowa, dwum ciowa czasteczka D N A zaw ierajaca (a) promotor, którego funkcja w ziemnia- kach jest powodowanie wytwarzania sekwencji R N A w bulwach, (b) strukturalna sekwencje D N A powodujaca wytwarzanie sekwencji R N A kodujacej polipeptyd fuzyjny zlozony z amino-terminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzym u, AD P-glukozo-pirofosforyla- zy i (c) nie translacyjna 3'-sekwencje D N A , której fu n kcja w komórkach roslinnych jest powodowanie zakonczenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydow na koncu 3' tej sekwencji R N A i z tak transformowanych roslin ziem niaka otrzymuje sie bulwy, w których A D P-glukozo-pirofosforylaza jest deregulowana 9 Sposób przedluzania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych polegajacy na zwiekszaniu poziomu aktyw- nosci ADP-glukozo-pirofosforylazy w bulwach podczas skladowania, znamienny tym, ze transformuje sie rosliny ziemniaka rekombinantowa dwuniciow a czasteczka D N A zaw ierajaca (a) promotor, którego funkcja w ziemniakach jest powodowanie wytwarzania sekwencji R N A w bulwach, (b) strukturalnasekwencje DN A powodujaca wytwarzanie sekwencji RNA kodujacej polipeptyd fuzyjny zlozony z amino-terminal nego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy i (c) nietranslacyjna 3'-sekwencje D N A, której funkcja w komórkach roslinnych jest powodowanie zakonczenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydow na koncu 3’ tej sekwencji R N A i z tak transformowanych roslin ziemniaka otrzymuje sie bulwy, w których enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza jest deregulowany PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych, sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych1 magazynowanych i sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych.
Właściwości podczas długotrwałego magazynowania sąpodstawowącechąokreślającąjakość bulw ziemniaczanych. Okresy zatrzymania w rozwoju (obejmujące czas od zbiorów do kiełkowania) decydują o zachowaniu dobrej jakości ziemniaków. W obrocie handlowym, ziemniaki można składować przez długie okresy czasu przed ich przetwarzaniem (do 10 miesięcy i dłużej) w zakresie temperatur na ogół od 2 do 10°C Magazynowanie w niskiej temperaturze (2 - 6°C) w odróżnieniu od przechowywania w temperaturze 7 - 12°C, to najlepsze warunki długotrwałego składowania, zapewniające zahamowanie procesu oddychania, zmniejszenie utraty wody, zakażeń mikrobiologicznych i potrzeby stosowania inhibitorów kiełkowania (Burton, 1989). Niskie temperatury prowadzą jednak do wywołanego zimnem zasłodzenia, a powstające wysokie poziomy cukru przyczyniają się do powstawania niekorzystnej brunatnej barwy produktu smażonego (Coffin i wsp., 1987, Weaver i wsp , 1978). W skład gromadzących się cukrów wchodzą przede wszystkim glukoza, fruktoza i sacharoza, to znaczy, głównie cukry redukujące (zwłaszcza glukoza i fruktoza), wchodzące w reakcję Maillarda z wolnymi grupami aminowymi podczas ogrzewania prowadzonego w różnych procesach przygotowywania posiłków, w tym smażenia, w wyniku czego tworzy się brunatny barwnik (Burton, 1989, Shallenberger i wsp , 1959). Z drugiej strony, sacharoza powoduje czarne zabarwienie podczas smażenia z powodu łatwości karmelizacji i zwęglania. Poziomy cukrów redukujących powyżej 0,2% wagowych świeżej masy są wystarczające do powstawania brunatnego barwnika, co decyduje o wykluczeniu niektórych rodzajów przetwarzania. Przetwórca ziemniaka może zmniejszyć poziomy cukrów stosując kosztowny i czasochłonny proces blanszowania, o ile poziomy te są niewiele wyższe od granicznej wartości 0,2%. Ziemniaki można rekondycjonować w wyższych temperaturach (18°C) obniżając poziom cukru, jednak często, w tych temperaturach poziomy cukru nie ulegają dostatecznemu obniżeniu przed rozpoczęciem kiełkowania i jest wówczas niezbędne użycie chemicznych inhibitorów kiełkowania (Ryall i Lipton, 1979, Hardenburg i wsp., 1986). Rekondycjonowame zwiększa jednak wymagania co do urządzeń do magazynowania, co w konsekwencji wpływa na końcowy koszt produktu. Wykazano ponadto, że po dłuższych okresach magazynowania rekondycjonowanie jest nieefektywne (Coffin i wsp., 1987). Biorąc pod uwagę negatywny wpływ nadmiernego użycia środków chemicznych na środowisko i zdrowie oraz fakt, że obecne inhibitory kiełkowania mogą być wkrótce wycofane, istnieje potrzeba dysponowania takimi odmianami ziemniaka, które bez użycia środków chemicznych wytrzymywałyby długotrwałe magazynowa4
178 628 nie w niskiej temperaturze bez nagromadzania się cukrów redukujących i w których w większym stopniu zachowywałyby się poziomy skrobi.
Po dłuższych okresach magazynowania, kiełkowanie bulw ziemniaka staje się poważnym problemem. Nadmierne kiełkowanie obniża wartość rynkową i może powodować zwiększone poziomy alkaloidów w bulwie.
Dotychczas, w wyniku procesów prowadzonych technikami inżynierii genetycznej uzyskano bulwy ziemniaka zawierające znacznie wyższe poziomy skrobi (opis publikacji zgłoszenia patentowego PCT, WO 91/19806 dokonanego przez Kishore; U. S. S. N 07/709, 663 zgłoszony 6.07.91, włączone do opisujako odnośnik). W bulwach tych zachodzi ekspresja genu kodującego ADP glukozo-pirofosforylazę (ADPGPP), która katalizuje kluczowy etap w biosyntezie skrobi i glukogenu. Korzystny gen pochodzi z E. coli, otrzymany enzym jest wariantem podlegającym słabej regulacji i wysoce aktywnym. Jeśli w bulwach zachodzi ekspresja mutantu tego genu, glgC16 w sposób właściwy dla bulw, np. z promotora patatyny klasy I, wówczas poziomy skrobi w czasie zbiorów są wyższe od tych, jakie występują w kontrolowanych bulwach nietransgenicznych.
Metabolizm węglowodanów w komórkach roślinnychjest procesem złożonym. Manipulacja wieloma różnymi procesami enzymatycznymi może potencjalnie wpływać na gromadzenie się cukrów redukujących podczas magazynowania w niskiej temperaturze. Przykładowo, cukry mogą być użyte do resyntezy skrobi, co spowoduje obniżenie puli wolnego cukru. Do poprawienia właściwości ziemniaków podczas magazynowania w niskiej temperaturze na drodze obniżenia zawartości cukru mogą służyć również inne metody, w tym, hamowanie hydrolizy skrobi, usuwanie cukrów na drodze glikolizy albo konwersja cukrów w inne formy, które nie mają właściwości wchodzenia w reakcję Maillarda Wyzwaniem dla tych metod byłaby identyfikacja aktywności, dzięki której można byłoby osiągnąć żądany rezultat, uzyskać daną funkcję w niskich temperaturach i zachować jakość produktu pożądanąprzez hodowców, przetwórców i konsumentów ziemniaków.
Wysunięto sugestię, że fosfofruktokinaza (PFK) odgrywa ważną rolę w wywoływanym zimnem procesie zesłodzema (Kruger i Hammond, 1988,apReesiwsp., 1988,Dixomwsp., 1981, Claassen i wsp , 1991). Ap Rees i wsp., (1988) wysunęli przypuszczenie, że obróbka zimnem ma nierównomierny wpływ na różne szlaki metabolizmu węglowodanów, przy czym, glikoliza ulega znacznie poważniejszemu obniżeniu w wyniku chwiejności PFK w niskiej temperaturze. Zmniejszenie aktywności PFK mogłoby zatem prowadzić do zwiększonej dostępności heksozo-fosforanów do produkcji sacharozy. Dodatkowym poparciem tego rozumowania jest obserwacja nowo wyhodowanego klonu ziemniaka zawierającego PFK, która nie jest zimnochwiejna i w niskiej temperaturze nie gromadzą się znaczące ilości cukru.
W publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0 438 904 ujawniono, ze zwiększanie aktywności PFK wpływa na zmniejszenie gromadzenia się cukrów podczas magazynowania na drodze usuwania heksoz przez ich glikolizę i dalszy metabolizm. W bulwach ziemniaka dokonano ekspresji enzymu PFK z E. coli, uzyskując zwiększenie aktywności PFK i obniżenie zawartości sacharozy oznaczanej w bulwach w czasie zbiorów Okazało się jednak, że w niskich temperaturach pozostaje aktywna fosfotransferaza pirofosforanu do fruktozo-6-fosforanu (PFP) (Claassen i wsp., 1991). Enzym PFP może dostarczać fruktozo-6-fosforan do glikolizy tak samo jak enzym PFK, ponieważ te dwa enzymy katalizują tę samą reakcję. Tak więc, skuteczność takiego podejścia do polepszania jakości bulw ziemniaka podczas magazynowania w niskiej temperaturze wydaje się wątpliwa. Ponadto, usuwanie cukrów na drodze glikolizy i dalszego metablizmu mogłoby nie być naj lepszym sposobem poprawy właściwości magazynowania bulw ziemniaczanych z powodu strat w zawartości cennej suchej masy w wyniku procesu oddychania Resynteza cukrów do skrobi lub spowolnienie rozkładu skrobi byłoby bardziej korzystne, gdyż byłaby zachowana zawartość suchej masy.
Celem niniejszego wynalazku było opracowanie sposobu obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych i polepszenie jakości magazynowanych ziemniaków. Następnym celem wynalazku było otrzymanie ziemniaków charakteryzujących się zwiększoną
178 628 szybkością i stopniem rekondycjonowama po przechowywaniu w obniżonych temperaturach. Innym celem wynalazku było opracowanie sposobu wydłużenia okresu zatrzymania w rozwoju ziemniaków przechowywanych w temperaturach otoczenia lub w temperaturach obniżonych.
Przedmiotem wynalazku jest sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych w obniżonych temperaturach, polegający na zapewnieniu zwiększonego poziomu enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy w bulwach podczas przechowywania w obniżonych temperaturach polegający na tym, że transformuje się rośliny ziemniaka rekombinantową, dwuniciową cząsteczkąDNA zawierającą (a) promotor, którego funkcjąw ziemniakach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w bulwach, (b) strukturalną sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złożony z ammo-terminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy i (c) metranslacyjną 3'-sekwencję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończania transkrypcji dodanie poliadenylowanych nukleotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA i z tak transformowanych roślin ziemniaka otrzymuje się bulwy, w których enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza, jest deregulowany
Korzystnie w sposobie według wynalazku zwiększa się poziom ADP-glukozo-pirofosforylazy będącej enzymem glgC z E. coli, a bardziej korzystnie zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy będącej enzymem zmutowanym z E. coli, a najbardziej korzystnie zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy posiadającej sekwencję przedstawioną na SEQ ID NR: 4.
Przedmiotem wynalazkujest także sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych w obniżonych temperaturach polegający na zwiększeniu aktywności enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy podczas przechowywania w obniżonych temperaturach polegający na tym, ze transformuje się rośliny ziemniaka rekombinantową, dwuniciową cząsteczką DNA zawierającą (a) promotor, którego funkcją w ziemniakach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w bulwach, (b) strukturalną sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złożony z amino-termmalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy i (c) me translacyjną 3'-sekwencję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA i z tak transformowanych roślin ziemniaka otrzymuje się bulwy, w których ADP-glukozo-pirofosforylaza jest deregulowana.
W sposobie tym korzystnie zwiększa się poziom ADP-glukozo-pirofosforylazy będącej enzymem glgC z E. coli. Bardziej korzystnie zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy będącej enzymem zmutowanym z E. coli, a najbardziej korzystnie zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy posiadającej sekwencję przedstawioną na SeQ ID NR: 4
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych polegający na zwiększaniu poziomu ADP-glukozo-pirofosforylazy w bulwach podczas składowania polegający na tym, że transformuje się rośliny ziemniaka rekombinantową, dwuniciową cząsteczką DNA zawierającą (a) promotor, którego funkcjąw ziemniakach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w bulwach, (b) strukturalną sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złożony z amino-terminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy i (c) nietranslacyjną3'-sekwencję DNA, której funkcjąw komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA i z tak transformowanych roślin ziemniaka otrzymuje się bulwy, w których enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza jest deregulowany.
W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku ziemniaki przechowuje się w obniżonych temperaturach. Bardziej korzystnie, zwiększa się poziom aktywności enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy, będącego enzymu glgC z E. coli, znajdującego się pod kontroląpromotora indukowanego zimnem
178 628
Jeszcze bardziej korzystnie powoduje się powstawanie w ziemniakach enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy, będącego zmutowanym enzymem z E. coli, znajdującego się pod kontrolą promotora indukowanego zimnem, a najbardziej korzystnie zwiększa się poziom aktywności enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy, posiadającego sekwencję przedstawioną na SEQ ID NR: 4. Również korzystnie przedłuża się okres zatrzymania w rozwoju bulw ziemniaczanych pochodzących z transformowanych roślin
Technika molekularna stosowana w sposobach według wynalazku nowych rekombmantowych cząsteczek DNA, komórek roślinnych pozwala na wytworzenie regenerowanych roślin ziemniaka, w których promotor z punktu (a) (i) jest promotorem indukowanym zimnem, pochodzącym z ziemniaka lub a Arabidopsis. Te regenerowane rośliny ziemniaka są użyteczne we wszystkich sposobach niniejszego wynalazku.
Korzystny enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza (ADPGPP) pochodzi z E. coli i jest znanąpod nazwą glgC. Sekwencja genu dla tego enzymu jest przedstawiona poniżej jako SEQ ID NR: 1 a sekwencja ammokwasowa tego enzymu jest podana pod nazwą SEQ ID NR: 2. Bardziej korzystnym enzymem ADPGPP jest mutant ADPGPP, glgC16. Sekwencja genu dla tego enzymu jest podana poniżej jako SEQ ID NR· 3 , a sekwencja aminokwasowa - jako SEQ ID NR: 4. Okazało się, że ten mutant ma większe powinowactwo do substratów w nieobecności aktywatora, 16-bisfosforanu fruktozy (FBP) i osiąga połowę maksimum aktywacji przy obniżonym stężeniu FBP
Stosowany w opisie termin „polepszenie jakości magazynowanych ziemniaków” albo warianty tego terminu oznaczają ziemniaki, które po przechowywaniu posiadają obniżone poziomy cukrów, charakteryzują się niewielką utratą skrobi lub brakiem utraty skrobi, obniżonym kiełkowaniem i/lub zwiększoną szybkością lub stopniem rekondycjonowania.
Określenie „magazynowanie w niskiej temperaturze” albo „przechowywanie w obniżonej temperaturze” oznacza utrzymywanie w temperaturach niższych od 15°C, uzyskiwanych przez chłodzenie przy użyciu urządzeń chłodniczych albo przez wykorzystanie temperatur otoczenia.
Termin „promotor indukowany zimnem” oznacza sekwencję zasad DNA inicjującą transkrypcję mRNA z jednej z nici DNA jako matrycy z wytworzeniem odpowiedniej komplementarnej nici RNA przy temperaturze równej lub niższej od 15°C.
Stosowany w opisie termin „przedłużony okres zatrzymania w rozwoju” albo terminy podobne oznaczają opóźnienie początku oddychania i kiełkowania bulw.
Termin „ziemniaki glgC16”, „bulwy glgC16”, linie glgC16” albo warianty tych określeń oznaczają linie ziemniaczane albo bulwy pochodzące z tych linii, transformowane przez fuzję z opisanym poniżej plastydowym terminalnym peptydem tranzytowym, korzystnie CTP.
KRÓTKI OPIS FIGUR NA RYSUNKACH
Figura 1 przedstawia mapę plazmidu dla wektora do transformacji w roślinach, pMON 17316.
Figura 2 przedstawia mapę plazmidu dla wektora do transformacji w roślinach, pMON 17279. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
Fosforylaza skrobiowa i enzymy amylolityczne są odpowiedzialne za degradację skrobi podczas magazynowania w niskiej temperaturze z wytworzeniem ze skrobn glukozo-1-fosforanu i/lub glukozy. Glukoza może być przetwarzana w glukozo-1-fosforan i służyć jako substrat dla enzymu ADPGPP, a zatem, do biosyntezy skrobi w bulwach, w których zachodzi ekspresja tego enzymu. Glukozo-1-fosforan może się również tworzyć z produktów degradacji sacharozy pod działaniem inwertazy albo syntetazy sacharozowej. Podczas magazynowania, w wyniku działania inwertazy gromadzą się głównie cukry redukujące a me sacharoza (Pressey, 1966). Glukoza i fruktoza uwalniane w wyniku działania inwertazy mogąrówniez służyć jako prekursory substratów do biosyntezy skrobi.
Ekspresja enzymu ADPGPP jest skutecznym sposobem zwalczania efektu zasłodzenia indukowanego zimnem. Przypuszcza się, ze podtrzymanie syntezy skrobi podczas przechowywania w niskiej temperaturze powoduje ciągłe zapotrzebowanie na zasoby heksoz, w wyniku
178 628 czego zmniejsza się akumulacja cukru, a zatem, bulwa nadaje się do przerobu. Jednak za to działanie ADPGPP mogą być również odpowiedzialne inne mechanizmy. Ponadto, przedłużanie okresu zatrzymania w rozwoju ziemniaków przechowywanych w każdej temperaturze można osiągnąć przez utrzymanie niskiego poziomu cukru i opóźnienie początku oddychania i kiełkowania.
Dla osiągnięcia tego ceiu, do denomu roślin ziemniaka wprowadza się gen do ekspresji enzymu ADPGPP. Ten gen można łączyć z innymi genami (w orientacji sensownej i antysensownej) w ceiu regulowania w ziemniakach metabolizmu i katabolizmu skrobi i/lub cukru, np. z genem dla fosfofruktokinaz (publikacja opisu patentowego europejskiego EP 438 904), α i β-amylaz, syntetaz fosforanu sacharozy, heksokinaz, fosforylaz skrobi, enzymów hamujących rozgałęzianie albo fosfoglukomutaz. Te dodatkowe geny mogą pochodzić z roślin, mikroorganizmów albo ze źródeł zwierzęcych.
Alternatywnie, można osiągnąć zwiększone poziomy ADPGPP w przechowywanych bulwach na drodze mutagenizowania klonów ziemniaka, zwiększając przez to poziomy aktywności ADPGPP Takie bulwy można selekcjonować w oparciu o zwiększoną specyficzną aktywność, zwiększone Vmax, obniżone hamowanie przez inhibitor (P,) lub zmniejszoną zależność maksymalnej aktywności od aktywatora (3-PGA).
Ekspresja genu roślinnego, który występuje w formie dwuniciowego DNA wymaga transkrypcji informacyjnego RNA (mRNA) z jednej nici tego DNA przez enzym, polimerazę RNA i następnego przetworzenia pierwszorzędowego transkryptu tego mRNA wewnątrzjądra. W przetwarzaniu tym bierze udział nie podlegający translacji region 3', dodający poliadenylowane nukleotydy do końca 3' tego RNA.
Transkrypcja DNA do mRNA jest regulowana przez region DNA zazwyczaj zwany promotorem. Region promotora zawiera sekwencję zasad stanowiącą dla polimerazy DNA sygnał do asocjacji z tym DNA i do zapoczątkowania transkrypcji mRNA z użyciem jednej z nici tego DNA jako matrycy do syntezy odpowiedniej komplementarnej nici RNA.
W literaturze opisano wiele promotorów aktywnych w komórkach roślinnych. Należą do nich promotory syntetazy nopalinowej (NOS) i syntetazy oktopinowej (OCS), które są przenoszone na wywołujących nowotwory plazmidach Agrobactenum tumefaciens, promotory caulimowirusów, takie jak wirus mozaiki kalafiorowej (CaMV) 19S i 35S oraz promotory mozaiki trędownika 35S, indukowany światłem promotor z małej podjednostki karboksylazy rybulozo-1,5-bis-fosforanowej (ssRUBISCO, powszechnie występującego polipeptydu roślinnego), oraz promotor genu białka wiążącego chlorofil a/b i podobne. Wszystkie te promotory były stosowane do tworzenia różnych typów konstrukcji DNA i wywoływania ich ekspresji w roślinach (np. publikacja opisu patentowego PCT, WP 84/02913).
Okazało się, że promotory patatyny klasy I użyte w poniższych przykładach 1,2, są zarówno wysoce aktywne jak i specyficzne dla bulw (Bevan i wsp., 1986; Jefferson i wsp., 1990). Znanych jest wiele innych genów charakteryzujących się ekspresją specyficzną dla bulw albo ekspresją wzmożoną, w tym geny ADPGPP bulw ziemniaczanych, podjednostek dużej i małej (Muller i wsp., 1990), syntetazy sacharozy (Salanoubat i Belliard, 1987, 1989), geny większych białek bulw łącznie z kompleksami białkowymi o masie 22 kD i inhibitorów protemazy (Hannapel, 1990), gen syntetazy skrobiowej związany z ziamistościami (GBSS, Rohde i wsp., 1990) oraz geny innych patatyn z klas I i II (Rocha-Sosa i wsp., 1989; Mignery i wsp., 1988). Do innych promotorów, które uważa się za użyteczne w wynalazku należą te, które wykazują zwiększoną lub specyficzną ekspresję w bulwach ziemniaczanych, które są promotorami genów normalnie związanymi z ekspresją enzymów uczestniczących w biosyntezie lub modyfikacji skrobi albo takie, które wykazują różne schematy ekspresji w bulwie ziemniaczanej, ze zwiększoną ekspresją np. w skórze albo w rdzeniu albo w pendermie bądź takie, których ekspresja zachodzi w różnych czasach podczas rozwoju bulw Przykłady takich promotorów obejmują promotory genów dla syntetaz skrobi związanych z ziamistościami lub innych, genów dla enzymów rozgałęziających (Kossmann i wsp 1991; Blennow A. i Johansson G., 1991; publikacje opisów patentowych PCT, WO 92/14827 i WO 92/11375), genu dla enzymu dysproporcjonującego (Takaha i wsp., 1993),
176 628 dla enzymów hamujących rozgałęzianie, amylaz, fosforylaz skrobi (Nakano i wsp., 1989; Mori i wsp., 1991), esteraz pektyny (Ebbelaar i wsp., 1993), dla glikoproteiny o masie 40 kD, dla ubikwityny, inhibitora proteinazy asparagmianowej (Stukcrlj i wsp., 1990), inhibitora karboksypeptydazy, polifenolo-oksydaz bulw (Shahar i wsp., 1992; bank genów GenBankR numery akcesyjne M95196 i M95197), geny przypuszczalnego inhibitora trypsyny i inne cDNA bulw (Stiekema i wsp., 1988) oraz dla β-amylazy i sporamin (z Ipomoea batatas); Yoshida i wsp., 1992; Ohta i wsp., 1991).
Ekspresję bakteryjnego ADPGPP z różnych promotorów ziemniaczanych wykazał Kishore w publikacji opisu patentowego PCT, WO 91/19806. W wyniku takiej ekspresji zwiększała się zawartość skrobi w bulwach ziemniaczanych.
W sposobie według wynalazku nie ma potrzeby wychodzenia z bulw z wysoką zawartością skrobi dla osiągnięcia niskiej akumulacji cukrów redukujących podczas przechowywania w niskiej temperaturze. Ekspresję genu glgC16 w ziemniakach można uzyskać z promotora indukowanego zimnem, a więc, enzym GlgC16 jest obecny tylko w warunkach magazynowania. Obecność tego enzymu powinna zatem utrzymywać biosyntezę skrobi podczas przechowywania, w wyniku czego można byłoby uniknąć gromadzenia się cukrów.
Istnieje wiele przykładów promotorów indukowanych zimnem, w tym promotorów roślinnych (Yamaguchi-Shinozaki i wsp., 1993; Qoronfleh i wsp., 1992, Miner i wsp , 1992; Houde i wsp., 1992; White i wsp., 1992; Huangiwsp., 1987; Murata i wsp., 1992; Gilmour i wsp., 1992, Hajela i wsp., 1990; Kurkela i wsp., 1990).
Przeprowadzono izolację indukowanych zimnem białek w bulwach ziemniaczanych (van Berkeliwsp., 1991; vanBerkeliwsp., 1994). Promotory powodujące indukowaną zimnem ekspresję tych białek można wyizolować metodami znanymi w stanie techniki. Jedna z metod polega na utworzeniu banku cDNA z bulw eksponowanych na zimno i na następnej identyfikacji klonów specyficznych dla zimna przez różnicującą hybrydyzację z bankiem cDNA z bulw me wystawianych na zimno. Proces ten można uczynić bardziej wydajnym stosując banki subtrakcyjne, czyli takie, z których podczas konstruowania usuwa się klony, z których przebiega ekspresja w sposób niespecyficzny dla niskiej temperatury. Oznaczenie sekwencji nukleotydowych cDNA pochodzącego od takich regulowanych transkryptów powinno również ułatwić izolację odpowiednich regionów promotora. Sekwencje takich cDNA są znane dla wielu regulowanych zimnem transkryptów z bulw ziemniaczanych (van Berkel i wsp., 1994). Następnie można zidentyfikować fragment promotora z klonu genomowego stosując sondy cDNA zidentyfikowane jako zimno-specyficzne. Takie regulowane zimnem promotory zidentyfikowano i oznaczono ich sekwencje (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 1994; Baker, 1994). Fragment promotora może być użyty do bezpośredniej ekspresji genu glgC16 z E. coli w sposób wykorzystujący indukcję zimnem. Ponadto, z tego promotora można prowadzić ekspresję jednego z kilku innych enzymów ADPGPP, wpływając na stężenie cukru w bulwach ziemniaczanych przechowywanych w niskiej temperaturze, poprawiając jakość tych bulw·’. Promotory hybrydowe albo fuzje elementów regulacyjnych różnych promotorów można również stosować w ceiu zwiększenia poziomu ekspresji z regulowanego zimnem promotora albo do spowodowania, aby ekspresja ta była bardziej specyficzna dla żądanego organu rośliny. Opisano geny regulowane zimnem, charakteryzujące się ekspresją przebiegającą preferencyjnie w różnych tkankach (Zhu i wsp., 1993) albo geny regulowane bardziej specyficznie zimnem niż innymi bodźcami (Wilhelm i Thomashow, 1993; Nordin i wsp., 1993). Wykazano poza tym, że specyficzne, określone sekwencje o długości od 9 par zasad do kilkuset par zasad kontrolują wrażliwość promotorów na zimno i inne bodźce, takie jak poziomy kwasu abscyzynowego i suszę (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 1994). Znane sąpromotory wywołujące preferencyjną ekspresję w bulwach. Oznaczono również regiony tych promotorów, które są niezbędne do takiej preferencyjnej ekspresji (Jefferson i wsp., 1990;Liuiwsp , 1990) Te dane umożliwiają skonstruowanie fuzji między małym, czułym na zimno elementem z promotorów takich jak te, które pochodzą np. z cor78, corl5a albo corl5b a promotorem patatyny. Fuzji dokonuje się z regionem -500 do -2000 pary zasad promotora patatyny. Nowoczesne techniki genetyki molekularnej, w tym łańcuchowa reakcja z udziałem poll178 628 merazy i sterowana miejscem mutageneza a także łatwość syntezy oligonukleotydów umożliwiają dokonanie takiej fuzji.
Amino-terminalny tranzytowy peptyd piastydowy użyty z genem ADPGPP jest potrzebny do przetransportowania tego enzymu do plastydu, gdzie dokonuje się synteza skrobii. Alternatywnie, taki peptyd tranzytowy można pominąć i dokonać insercji genu do DNA obecnego w plastydzie. Transformację chloroplastu można przeprowadzić metodami opisanymi przez Svab’a i wsp. (1990).
Wytworzenie zmienionych genów ADP-glukozo-pirofosforylazy przez mutagenezę
Dla specjalistów jest zrozumiałe, że jakkolwiek me jest to wymogiem koniecznym, lepsze wyniki można uzyskać przy użyciu genów ADP-glukozo-pirofosforylazy podlegających zmniejszonej regulacji allosterycznej (”deregulowanych”) a bardziej korzystnie, nie podlegających w znaczącym stopniu regulacji allosterycznej (meregulowanych”) przy zachowaniu odpowiedniej aktywności katalitycznej. Strukturalna sekwencja kodująca dla bakteryjnego lub roślinnego enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy może być zmutagenizowana w E.coli albo w innym ódpowiednim gospodarzu i przesiewana na zwiększone wytwarzanie glukogenu, co opisano dla genu glgC16 z E. coli. Należy zaznaczyć, że użycie genu kodującego ADP-glukozo-pirofosforylazę, która jest jedynym obiektem dla modulatorów (aktywatorów i inhibitorów) występujących w wybranej roślinie w ilościach, które hamująw znaczącym stopniu aktywności katalitycznej tego enzymu, nie będzie wymagało modyfikaowania enzymu (genu). Takie “nieregulowane” albo “deregulowane” geny ADP-glukozo-pirofosforylazy wprowadza się następnie do roślm przez insercję, cojest podane w opisie, uzyskując transgeniczne rośliny o zwiększonej zawartości skrobii.
Przykładowo, dowolny gen ADP-glukozo-pirofosforylazy można klonować do E coli B, szczepu AC70R1-504 (Leung, 1986). Ten szczep ma defektywny gen ADP-glukozo-pirofosforylazy, o ekspresji 5- do 7-krotnie niższej w stosunku do genów dla innych enzymów biosyntezy glikogenu. Taki gen lub cDNA dla ADP-glukozo-pirofosforylazy można wbudować do plazmidu za promotorem E coli glgC lub za dowolnym innym promotorem bakteryjnym. Taką konstrukcję poddaje się sterowanej miejscem albo losowej mutagenezie. Po mutagenezie, komórki posiewa się na pożywkę wzbogaconą 1% glukozą. Po uzyskaniu rozwoju kolonii, płytki zalewa się roztworem jodu o składzie: 0,2% wagowo-objętościowych jodu, 0,4% wagowo-objętościowych KJ w wodzie (Creuzet-Sigal, 1972). Przez porównanie z identyczną płytką zawierąjącąmemutowane kolonie E. coli można wykryć kolonie wytwarzające więcej glikogenu przez ich intensywniejsze zabarwienie.
Ponieważ procedura mutagenezy może powodować mutacje promotora, należy powtórnie klonować każdy przypuszczalny mutant genu ADP-glukozo-pirofosforylazy z pierwszej rundy skriningu do niemutowanego wektora i prowadzić skrining powstałego plazmidu w ten sam sposób. W mutantach, po dwu rundach skriningu oznacza się aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy z dodatkiem i bez dodawania aktywatorów i inhibitorów. Nowy mutant można scharakteryzować przez porównanie odpowiedzi mutowanych ADP-glukozo-pirofosforylaz na aktywatory i inhibitory z reakcjami enzymów niezmutowanych
Plaxton i Preiss (1987) wykazali, że ADP-glukozo-pirofosforylaza bielma kukurydzy ma właściwości regulacyjne podobne do tych, jakie wykazują ADP-glukozo-pirofosforylazy innych roślin. Autorzy ci wykazali, że opisywane we wcześniejszych pracach spostrzeżenie, ze ADP-glukozo-pirofosforylaza bielma kukurydzy wykazuje zwiększoną aktywność w obecności aktywatora (3-PGA) i obniżoną wrażliwość na inhibitor (P,) tłumaczy się rozszczepieniem proteolitycznym tego enzymu podczas procedury izolacji. Zmieniając gen ADP-glukozo-pirofosforylazy tak, aby wytwarzał enzym analogiczny do rozszczepionej proteolitycznie ADP-glukozo-pirofosforylazy endospermy kukurydzy można uzyskać obniżoną regulację allosteryczną.
W ceiu oznaczenia aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy w ciekłej hodowli E. coli, komórki wirowano w wirówce i zawieszano w około 2 ml bufora do ekstrakcji (0,05 M glicyloglicyny o pH = 7.0, 5.0 mM DTE, 1.0 mM EDTA) na gram pasty komórek. Komórki poddawano lizie przepuszczając je dwukrotnie przez prasę francuską Ekstrakty komórkowe wirowano w mi10
178 628 krowirówce przez 5 minut i supernatanty odsalano przez przepuszczenie przez kolumnę spinową G-50.
Stosowano próbę enzymatyczną na syntezę adenozynodifosforanu glukozy (ADP glukozy) będącą modyfikacją techniki opublikowanej przez Haugen’a (Haugen i wsp., 1976). Każda mieszanina analityczna w ilości 100 pl zawierała: 10 (moli odczynnika Hepes (pH = 7.7), 50 pg BSA, 0,05 pmola 14C-glukozo-1-fosforanu, 0,15 pmola ATP, 0,5 pmolaMgClj, 0.1 pg krystalicznej nieorganicznej pirofosfatazy z drożdży, 1 mM molibdenianu amonowego, enzym, aktywatory albo inhibitory według potrzeby i wodę. Mieszaninę reakcyjną mkubowano w temperaturze 37°C w czasie 10 minut, po czym reakcję zatrzymywano przez gotowanie w czasie 60 sekund. Próbkę odwirowano w mikrowirówce i 40 pl supemantantu wstrzykiwano na kolumnę HPLC amono-wymienną Synchrom Synchropak AX-100. Próbkę eluowano 65 mM roztworem Kpi (pH = 5.5). Nieprzereagowany l4C-glukozo-1-fosforan eluował w około 7-8 minucie a 14-C-ADP-glukoza eluowała w około 13 minucie. Aktywność enzymu oznaczano jako ilość radioaktywności wykrywanej w piku ADP-glukozy.
Aktywność enzymu roślinnego, ADPGPP, jest ściśle regulowana czynnikami zarówno dodatnimi (3-glicerofosforan; 3-PGA) jak i negatywnymi (fosforan nieorganiczny; P,), co opisali Ghosh i Preiss (1966), Copeland i Preiss (1981), Sowokinos i Preiss (1982), Moreli i wsp., 1987), Plaxton i Preiss (1987), Preiss (1988). Stosunek 3-PGA do P, odgrywa waznąrolę w regulowaniu biosyntezy skrobi na drodze modulowania aktywności ADPGPP (Santanus i Heber, 1965; Heldt i wsp., 1977; Kaiser i Bassham, 1979) Roślinne enzymy ADPGPP są heterotetramerami dwu podjednostek dużych „zmarszczonych” i dwu podjednostek małych „kruchych” (Moreli i wsp., 1987; Lin i wsp., 1988a, 1988b; Krishnan i wsp., 1986; Okita i wsp., 1990) i istnieje mocny dowód na to, że ten heterotetramerjest najbardziej aktywną formą ADPGPP Potwierdzeniem tej hipotezy jest fakt wyizolowania „bezskrobiowych” mutantów roślin, w których nie występują żadne te podjednostki (Tsai i Nelson, 1966; Dickinson i Preiss, 1969; Lim wsp., 1988a, 1988b),a także charakteryzacja „ADPGPP” homotetrameru złożonego z małych podjednostek, u którego stwierdzono bardzo niską aktywność enzymu (Lin i wsp., 1988b). Ponadto, dla obydwu podjednostek zidentyfikowano pozostałości zakładanych interakcji efektorowych (Moreli i wsp., 1988). Bezpośrednim dowodem na istnienie aktywnej formy tego enzymu i dalszym potwierdzeniem danych kinetycznych opisanych dla oczyszczonego enzymu ziemniaczanego jest ekspresja aktywności ziemniaczanej ADPGPP w E. coli i porównanie własności kinetycznych tego materiału z materiałem pochodzącym z bulw ziemniaczanych (Iglesias i wsp , 1993).
Nieregulowane warianty roślinnego enzymu ADPGPP zidentyfikowano i scharakteryzowano w sposób podobny do tego, jaki wynikał z izolacji E. coli glgC16 i mutantów pokrewnych, takich jak glgC-SG5 i CLI 136. Sklonowano wiele roślinnych cDNA dla ADPGPP lub części tych cDNA dla dużych i małych podjednostek, pochodzących zarówno z roślin jednoliściennych jak i dwuliściennych (Anderson i wsp., 1989a; Olive i wsp., 1989; Muller i wsp., 1990; Bhave i wsp., 1990; du Jardin i Berhin, 1991; Smith-White i Preiss, 1992) Białka kodowane przez roślinne cDNA jak również te, które opisano w bakteriach wykazują wysoki stopień zachowawczości (Bhave i wsp., 1990). W szczególności wykryto wysoce konserwatywny region, również zawierający pewne reszty, którym przypisuje się funkcję enzymu, a także interakcje efektorowe (Moreli i wsp., 1988; du Jardin i Berhm, 1991). Zidentyfikowano klony genów dla podjednostki ADPGPP bulw ziemniaczanych. Należy do nich całkowity gen małej podjednostki otrzymany przez dodanie sekwencji z pierwszego egzonu klonu genomowego z prawie pełnej długości klonem cDNA tego samego genu do prawie całkowitego genu dla dużej podjednostki. Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr: 7) i sekwencja aminokwasowa (SEQ iD Nr- 8) skonstruowanego genu dla małej podjednostki jest podana poniżej. Przedstawiona sekwencja nukleotydowa różni się od genu pierwotnie wyizolowanego następująco: w kodonie ATG wprowadzono miejsce dla Bg1II + Ncol dla ułatwienia klonowania tego genu do E. coli i do roślinnych wektorów ekspresyjnych techniką sterowanej miejscem mutagenezy z wykorzystaniem oligonukleotydowej sekwencji primera:
GTTGATAACAAGATCTGTTAACCATGGCGGCTTCC (SEQ ID NR: 11).
178 628
Miejsce Sacl wprowadzono przy kodonie stopu wykorzystując oligonukleotydową sekwencję primera:
CCAGTTAAAACGGAGCTCATCAGATGATGATTC (SEQ ID NR- 12).
Miejsce Sacl służy jako miejsce 3'klonowania. Usunięto wewnętrzne miejsce Bg111 wykorzystując oligonukleotydową sekwencję primera:
GTGTGAGAACATAAATCTTGGATATCTTAC (SEQ ID NR: 13).
Ekspresji tak skonstruowanego genu dokonano w E. coli pod kontrolą promotora recA w kasecie ekspresyjnej P recA-genl OL (Wong i wsp., 1988) otrzymując mierzalne poziomy białka Inicjujący kodon metioniny wbudowano w procesie sterowanej miejscem mutagenezy stosując oligonukleotydową sekwencję primera:
GAATTCACAGGGCCATGGCTCTAGACCC (SEQ ID NR: 14) do ekspresji dojrzałego genu.
Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NR: 9) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NR· 10) prawie całkowitego genu dla dużej podjednostki są podane poniżej. Inicjujący kodon metioniny umieszczono w miejscu dojrzałego N-końca w procesie kierowanej miejscem mutagenezy wykorzystując oligonukleotydową sekwencję primera:
AAGATCAAACCTGCCATGGCTTACTCTGTGATCACTACTG (SEQ ID NR: 15).
Celem wprowadzenia inicjującego kodonu metioniny było ułatwienie ekspresji genu tej dużej podjednostki w E. coli. Miejsce HindIII ulokowano w odległości 103 par zasad za kodonem stopu. Służy ono jako miejsce klonowania 3'. Całkowity gen dla dużego enzymu ADPGPP wyizolowano w procedurze 5' RACE (Szybka amplifikacja końców cDNA; Frohman, 1990; Frohman i wsp., 1988; Loh i wsp., 1989). Do tej procedury użyto następujących pnmerów oligonukleotydowych:
1) GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGGCCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NR: 16);
2) GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGG (SEQ ID NR: 17) i
3) CCTCTAGACAGTCGATCAGGAGCAGATGTACG (SEQ ID NR: 18).
Pierwsze dwa primery są równoważne z primerami ANpoliC i AN według Loh’a i wsp., (1989) a trzeci primer jest odwrotnie komplementarny do sekwencji w genie dla dużego enzymu ADPGPP. Produkty sekwencji 5' z reakcji PCR klonowano jako fragmenty EcoRI/HindIII/BamHI-PstI i z łatwością wbudowywano do istniejących części genu
Mutanty enzymu ADPGPP o słabej regulacji zidentyfikowano zbierając początkowo kolonie z hodowli mutagenizowanej E. coli wykazującej podwyższony poziom syntezy glikogenu przez barwienie jodem 24-48 godzinnych kolonii na płytkach z agarem Luria-Agar zawierających 1% glukozy, a następnie charakteryzując odpowiedzi enzymów ADPGPP z tych lzolatów na czynniki dodatnie i ujemne (Cattaneo i wsp., 1969; Preiss i wsp., 1971). Podobne podejście zastosowano do izolacji takich wariantów roślinnych enzymów ADPGPP. Mając układ ekspresyjny dla genów dla każdej podjednostki, prowadzono oddzielnie mutagenezę każdego genujednym ze znanych sposobów chemicznych lub fizycznych (Miller, 1972) w hodowlach zawierających gen lub na oczyszczonym DNA. Innym podejściem było zastosowanie reakcji PCR (Ehrlich, 1989) na całkowitym genie w obecności hamujących jonów Mn++, w warunkach, które prowadzą do dużej częstości luk we wbudowywaniu nukleotydów. Procedurę PCR można również zastosować z primerami bezpośrednio sąsiadującymi ze specyficznym regionem genu i taki zmutagenizowany fragment reklonować do niezmutowanych fragmentów genu. Do generowania wysoce zmutowanego krótkiego regionu genu można użyć również procedurę mutagenezy losowej z użyciem syntetycznych oligonukleotydów, mieszając nukleotydy w reakcji syntezy, uzyskując luki we wbudowywaniu we wszystkich pozycjach w tym regionie. Ten mały region jest flankowany miejscami restrykcyjnymi, które stosowano do remsercji tego regionu do pozostałej części genu. Następnie wykonywano skrining wytworzonych hodowli lub transformantów standardową metodą z jodem, poszukując tych, które wykazują poziomy glikogenu wyższe od kontrolnych. Korzystnie, ten skrining prowadzi się w szczepie E. coli z deficytem jedynie aktywności ADPGPP o fenotypie: glikogen (-) następnie uzupełnionym fenotypem: glikogen (+) przez glgC. Szczep E. coli powinien zachować te inne rodzaje aktywności potrzebne do wytwarzania
178 628 glikogenu. Ekspresji obydwu genów dokonuje się łącznie w tym samym gospodarzu E. coli, umieszczając te geny w zgodnych plazmidach wraz z różnymi genami służącymi jako markery selekcji, przy czym te plazmidy cechująsię również podobnąilościąkopii w gospodarzu bakteryjnym, co maksymalizuje powstawanie heterotetrameru. Przykładem takiego układu ekspresyjnego jest kombinacja pMON17335 i pMON17336 (Iglesias i wsp., 1993). Użycie oddzielnych plazmidów umożliwia skrining zmutagemzowanej populacji tylko jednego genu albo w połączeniu z drugim genem po transformacji do kompetentnego gospodarza, w którym zachodzi ekspresja drugiego genu oraz sknning dwu zmutagenizowanych populacji po połączeniu ich w tym samym gospodarzu. Po powtórnej izolacji plazmidowego dNa z kolonii o większej intensywności barwienia jodem reklonuje się sekwencje kodujące ADPGPP do wektorów ekspresyjnych, sprawdza się fenotyp i aktywność ADPGPP oraz oznacza się odpowiedzi na cząsteczki efektorowe. Warianty ulepszone będą wykazywać zwiększone Vmax, zmniejszone hamowanie przez czynnik negatywny (P,) lub zmniejszoną zależność od aktywatora (3-PGA) dla aktywności maksymalnej. Próba na takie ulepszone właściwości polega na oznaczeniu aktywności ADPGPP wobec P, w stężeniu 0,045 mM (Io>5 = 0,045 mM) albo w obecności 3-PGA w stężeniu 0,075 raM (Ao,5 = 0,075 mM). Użyteczne warianty będą wykazywać <40% hamowanie przy takim stężeniu P, albo> 50% wzrost aktywności przy tym stężeniu 3-PGA. Po izolacji ulepszonych wariantów i oznaczeniu odpowiedzialnej podjednostki lub podjednostek, oznacza się mutacje metodą sekwencjonowania nukleotydów. Mutację potwierdzano przez powtórne otrzymanie tej zmiany metodą sterowanej miejscem mutagenezy i powtórne oznaczenie aktywności ADPGPP wobec aktywatora i inhibitora. Tę mutację przenoszono następnie do równoważnego, całkowitego genu cDNA dla ADPGPP przez reklonowame regionu zawierającego zmianę ze zmienionej bakteryjnej formy ekspresyjnej do formy roślinnej zawierającej sekwencję kierującą do amyloplastu albo prowadząc kierowaną miejscem mutagenezę genu dla całkowitego natywnego roślinnego enzymu ADPGPP.
Przykład I. Konstruowanie wektorów DNA do ekspresji genu glgC16
W celu ekspresji genu glgC16 z E. coli w komórkach roślinnych i skierowanie enzymu do plastydów należało dokonać fuzji tego genu z DNA kodującym peptyd tranzytowy kierujący do plastydu (w dalszej części zwany genem CTP/ADP-glukozo-pirofosforylazy) i wprowadzić go do właściwych regionów regulacyjnych rośliny. Dokonano tego przez klonowanie genu glgC16 do serii i wektorów plazmidowych posiadających żądane sekwencje.
Plazmid pLP226 zawiera gen glgC16 we fragmencie HincII, klonowanym do wektora pUC8 w miejscu HincII (Leung i wsp., 1985). Plazmid pLP226 otrzymano od dr Jack’a Preiss’a z Michigan State University i transformowano nim zamrożone kompetentne komórki E. coli JM101, preparowane metodą z użyciem chlorku wapniowego (Sambrook i wsp , 1989). Transformowane komórki posiewano na płytki 2XYT (jak wyżej) zawierające ampicylinę w stężeniu 100 pg/ml. Plazmid pLP226 oczyszczano stosując procedurę szybkiej ekstrakcji alkalicznej (RAE) z 5 ml jednodniowej hodowli (Bimboim i Doły, 1979).
Do fuzji genu glgC16 z DNA kodującym tranzytowy peptyd chloroplastu było potrzebne miejsce NcoI na końcu 5' tego genu. Do przeniesienia genu CTP/ADP - glukozo-pirofosforylazy do następnego wektora potrzebne było również miejsce Sacl, w dół od kodonu zakańczania. W ceiu wprowadzenia tych miejsc prowadzono reakcję amplifikacji z udziałem polimerazy, PCR (#13), stosując jako matrycę około 20 ng plazmidu pLP226 oczyszczonego przez szybką ekstrakcję alkaliczną. Reakcję prowadzono według wskazówek producenta (Perkm Elmer Cetus) Jako primery stosowano QSP3 i QSP7. QSP3 zaprojektowano tak, aby wprowadzić miejsce Ncol, które mogłoby zawierać kodon startu dla genu glgC16. Primer QSP7 hybrydyzuje z nie podlegającym translacji regionem 3' genu glgC16 i dodaje miejsce Sacl Aparat „Thermal Cycler” zaprogramowano na 30 cykli z etapem denaturacji w czasie 1 minuty w temperaturze 94°C, etapem wiązania w czasie 2 minut w temperaturze 50°C i etapem wydłużenia w czasie 3 minut w temperaturze 72°C. Po każdym cyklu przedłużano etap wydłużenia o 15 sekund
Primer QSP3: 5' GGAGTTAGCCATGGTTAGTTTAGAG 3' (Sekwencja ID NR: 19).
178 628
Primer QSP7: 5'GGCCGAGCTCGTCAACGCCGTCTGCGATTTGTGC 3' (Sekwencja SEQ ID NR: 20).
Produkt reakcji PCR klonowano do wektora pGEM3zf+ (Promega, Madison, WI) uprzednio trawionego enzymami Sacl i HindIII, posiadającego DNA dla modyfikowanej małej podjednostki CTP a Arabidopsis, ligowanej w miejscu HindIII. Ten DNA i sekwencje aminokwasowe CTP są przedstawione odpowiednio na sekwencjach SEQ ID NR: 5 i SEQ ID Nr. 6.
Linearyzowany wektor traktowano 5 jednostkami alkalicznej fosfatazy z jelit cielęcych w czasie 30 minut w temperaturze 56°C. Następnie zarówno wektor jak i fragment cyklu 13 (#13) reakcji PCR zawierający gen glgC 16 z nowymi miejscami Ncol i Sacl poddawano elektroforezie w żelu agarozowym, po czym fragmenty oczyszczano przez wiązanie do błon DEAE. Do oczyszczania tego fragmentu na błonie DEAE zastosowano procedurę Schleicher’a i SchuelTa pod tytułem „Wiązanie i Odzysk DNA i RNA z zastosowaniem błony S i S DEAE”.
W ligacji #5 dokonano fuzji genu glgCl 61 DNA dla modyfikowanej SSU CTP z Arabidopsis z plazmidem pGEM3zf+. Mieszanina ligacyjna zawierała 3 μΐ wektora, uprzednio trawionego enzymami Ncol i Sacl oraz 3 pl produktu CPR z cyklu 13, uprzednio ciętego enzymami Ncol i Sacl i powtórnie oczyszczonego w żelu. Ilość 5 pl (z całkowitej ilości 20 pl) mieszaniny ligacyjnej #5 użyto do transformacji zamrożonych, kompetentnych komórek JM101 po czym transformowane komórki posiewano na płytkach 2XYT o składzie: 16 g/litr pożywki Bactotriptone, 10 g/litr wyciągu drozdżowego, 10 g/litr NaCl (pH = 7) zestalonych 1.5 procentowym agarem z dodatkiem ampicyliny.
Po dobowym wzroście z płytki pobrano próbkę 1. Próbkę tę inokulowano do 4 ml pożywki 2XYT i prowadzono wzrost w temperaturze 37°C. Plazmid izolowano metodą szybkiej ekstrakcji alkalicznej i DNA trawiono enzymami EcRI, Ncol oraz łącznie EcoRI i Ncol. Produkty trawienia rozdzielano na żelu agarozowym i obserwowano spodziewane fragmenty. Plazmid izolowany z próbki 1 oznaczono nazwąpMON20100. Zawierał on pGEM3zf+, DNA dla modyfikowanej SSU CTP z Arabidopsis i generał glgC16. Fuzja nastąpiła w ori entacj i pozwalając ej na transkrypcję z promotora polimerazy SP6.
W ceiu badania tej konstrukcji służącej do importu ADP-glukozo-pirofosforylazy do izolowanych chloroplastów sałaty, trzeba, aby gen dla białka fuzyjnego, CTP/ADP-glukozo-pirofbsfbrylazy, podlegał transkrypcji i translacji z wytworzeniem znaczonej [35S]-ADP-glukozo-pirofosforylazy. Dla uzyskania matrycy DNA do transkrypcji przez polimerazę SP6, region CTP/ADP-glukozo-pirofosforylazy z plazmidu pMON20100 amplifikowano w reakcji PCR w celu generowania dużej ilości liniowego DNA. Aby tego dokonać, około 0,1 pl pMON20100 uprzednio oczyszczonego metodą szybkiej ekstrakcji alkalicznej użyto jako matrycę w reakcji PCR w 80 cyklach. Jako pnmery zastosowano handlowo dostępny primer promotora SP6 (Promega) i oligo QSP7 (sekwencja SEQ ID NR: 20) Primer SP6 hybrydyzował z promotorem SP6 w wektorze i zawierał całą sekwencję promotora SP6. Tak więc, produkt PCR z tym pnmerem oligonukleotydowym, QSP7 będzie zawierał sekwencję rozpoznawaną przez polimerazę SP6. Primer QSP7 (sekwencja SEQ ID NR 20) będzie hybrydyzował w nie podlegającym translacji 3' regionie genu glgC16. Jest to ten sam primer, który był użyty do wprowadzenia miejsca Sacl w dół od kodonu zakańczania glgC 16.A.parat “Thermial Cycler” zaprogramowano na 30 cykli z etapami 1 minutowych denaturacji w temperaturze 94°C, 2 minutowych reakcji wiązania w temperaturze 55°C i 3 minutowych reakcji wydłużania w temperaturze 72°C Po każdym cyklu do etapu wydłużania dodawano 15 sekund.
Pnmer promotora SP6: 5' GATTTAGGTGACACTATAG 3' (SEQ ID Nr: 21).
Ilość 5 pl mieszaniny z reakcji PCR #80 poddano elektroforezie w żelu agarozowym i oczyszczano przez wiązanie na błonie DEAE. DNA eluowano i rozpuszczano w 20 pl TE. Ilość 2 pl oczyszczonego w żelu produktu reakcji PCR #80 użyto w reakcji transkrypcji in vitro z udziałem polimerazy RNA SP6. Stosowano warunki reakcji opisane przez dostawcę (Promega) dla syntezy dużych ilości RNA (reakcja w 100 pl). RNA wytworzony w reakcji PCR #80 DNA użyto w reakcji translacji in vitro w układzie lizatu retikulocytów królika (Promega). Znakowane 35 S-białko uzyskane z pMQN20100 (np. w reakcji PCR #80) użyto w uprzednio opisanej próbie importu
178 628 chloroplastu in vitro. Po próbie importu chloroplastu, próbki poddano elektroforezie w żelach SDS-PAGE w gradiencie 3 do 17% poliakryloamidu. Następnie żele utrwalano w czasie 20 - 30 minut w roztworze zawierającym 40% metanolu i 10% kwasu octowego, moczono w odczynniku EN3HANCE™ przez 20 do 30 minut i suszono je w suszarce do żeli. Żele poddawano autoradiografii stosując ekran intensyfikujący i ekspozycję dobową. Wyniki próby wykazują, że białko fuzyjne zostało importowane do izolowanych chloroplastów.
Konstrukcję w plazmidzie pMON20100 przerobiono następnie tak, aby można było dokonać jej fuzji do wzmocnionego promotora CaMV 35S (Kay R., 1987) i do końca 3'NOS (Bevan M., 1983) wyizolowanego z pMON999. W reakcji PCR #114 wykorzystano plazmid MON20100 jako matrycę i użyto primery QSM111QSM10. QSM11 łączono z Dna dla modyfikowanego SSU CTP z Arabidopsis i utworzono miejsce BglII w odległości 7 par zasad w górę od kodonu startu ATG. QSM10 łączono do miejsca 3' genu glgC 16 i dodawano miejsce Xbal bezpośrednio za kodonem zakańczania oraz dodano miejsce SacI w odległości 5 par zasad za kodonem zakańczania. Miejsce SacI, które dodano wcześniej do genu glgCló znajdowało się w odległości około 100 par zasad w dół od kodonu zakańczania. Aparat „Thermal Cycler” zaprogramowano na 25 cykli, z denaturacją w czasie 1 minuty i temperaturą równą 94° C, wiązaniem w czasie 2 minut w temperaturze 55°C i z 3 minutowymi etapami wydłużania w temperaturze 72°C. Po każdym cyklu dodawano 15 sekund do etapu wydłużania.
Primer QSM11 (SEQ ID NR. 22):
5' AGAGAGATCTAGAACAATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGC 3'
Primer QSM10 (SEQ ID NR: 23):
5' GGCCGAGCTCTAGATTATCGCTCCTGTTTATGCCCTAAC 3'.
Z ogólnej objętości 100 pl reakcji PCR #114 pobrano próbkę 95 pl, strącono ją etanolem i zawieszono w 20 pl buforu TE. Ilość 5 pl tej zawiesiny trawiono 4 jednostkami BgIII 110 jednostkami SacI przez dobę w temperaturze 37°C. W ten sam sposób trawiono 5 pl (5 pg) wektora pMON999, który zawiera wzmocniony promotor CaMV 35S i koniec 3' NOS Po trawieniu enzymami restrykcyjnymi ten DNA poddawano elektroforezie na żelach agarozowych i oczyszczano przez wiązanie z błonami DEAE. Następnie każdy DNA rozpuszczano w 20 pl TE. Ilość 1 pl mieszaniny z reakcji PCR#114 ligowano z ilością3 pl wektora w całkowitej objętości 20 pl. Mieszaninę ligacyjnąinkubowano w temperaturze 14°C w czasie 7 godzin. Ilością 10 pl tej mieszaniny ligacyjnej transformowano zamrożone kompetentne komórki MM294 i posiewano je na płytki LB o składzie: 10 g/litr Bacto-tryptonu, 5 g/litr wyciągu drozdżowego, 10 g/litr NaCl 11,5% agaru do zestalenia, z dodatkiem 100 pg/ml ampicyliny. Kolonie zebrano, zaszczepiono nimi probówki zawierające po 5 ml pożywki LB z dodatkiem 100 pg/ml ampicyliny i prowadzono hodowlę przez dobę. Te 5-mililitrowe, dobowe hodowle użyto do szybkich ekstrakcji alkalicznych w ceiu wyizolowania plazmidowego DNA. Te DNA trawiono enzymem EcoRI i oddzielne próbki trawiono restryktaząNotl. Po analizie tych próbek w żelach agarozowych, potwierdzono, że plazmid, pMON20102 posiada fragment EcoRI o długości 497 par zasad, charakterystyczny dla genu glgC16. Ten plazmid zawiera również fragment Notl o długości 2,5 kilozasad zawierający wzmocniony promotor CaMV 35S, DNA dla modyfikowanego SSU CTP z Arabidopsis, gen glgC16 i koniec 3 NOS.
Plazmid pMON20102 użyto następnie do konstruowania wektora DNA, w którym mogłaby zachodzić ekspresja genu glgC16 w sposób specyficzny dla bulw i który mógłby być użyty do transformowania ziemniaka. Ta konstrukcja powoduje specyficzną ekspresję ADPGPP w bulwach ziemniaczanych i zwiększa poziom skrobii w bulwach.
Wektor użyty do transformowania ziemniaka jest pochodną wektora pMON886 do transformowania roślin modyfikowanego Agrobactenum Ten plazmid pMON886 składa się z następujących, dobrze scharakteryzowanych segmentów DNA z fragmentu o wielkości 0,93 kilozasad wyizolowanego z transpozonu Tn7 kodującego oporność bakterii na spektynomycynę i streptomycynę (Spc/Str) i jest determinantą do selekcji w E. coli i w Agrobacterium tumefaciens (Fling i wsp., 1985). Jest on złączony z chimerowym genem oporności na kanamycynę zaprojektowanym do ekspresji w roślinach i pozwalającym na se178 628 lekcję transformowanej tkanki. Ten chimerowy gen składa się z promotora wirusa mozaiki kalafiorowej 35S o wielkości 0,35 kilozasad (P-35S; Odell i wsp., 1985), genu fosfotransferazy neomycyny typu II o wielkości 0,83 kilozasad (NPTII) i z 3' nie podlegającego translacji regionu genu syntetazy nopaliny o wielkości 0,26 kilozasad (NOS 3', Fraley i wsp., 1983) 'Następnym segmentem jest źródło replikacji o wielkości 0,75 kilozasad z plazmidu RK2 (on-V) opisane przez Stalkera i wsp., (1981). Jest ono połączone z segmentem Sali do Pvul o wielkości 3,1 kilozasad z plazmidu pBR322, który dostarcza źródła replikacji dla utrzymania się w E coli (ori-322) i miejsca bom do koniugacyjnego przeniesienia do komórek Agrobactenum tumefaciens. Następnym segmentemjest fragment Pvul o wielkości 0,36 kilozasad z plazmidu pTiT37, który zawiera prawy region graniczny T-DNA typu nopaliny (Fraley i wsp., 1985).
Gen glgC 16 został skonstruowany do ekspresji głównie w bulwach przez jego umieszczenie pod kontrolą promotora swoistego dla bulw Białko GlgC 16 j est kierowane do plastydów w komórce roślinnej w wyniku jego syntezy jako C-terminalnej fuzji z N-terminalną porcją białka kodowanego przez sekwencję kierującą do chloroplastów (CTP) pochodzącą z genu SSU 1A z Arabidopsis thaliana (Timko i wsp., 1989). Część CTP jest usuwana podczas procesu importu z uwolnieniem enzymu GlgC 16. Inne sygnały ekspresji w roślinach zawierają również sekwencje 3' poliadenylacji wprowadzone przez sekwencje NOS 3' zlokalizowane w dół od części kodującej kasety ekspresyjnej. Kasetę konstruowano następująco: promotor patatyny wycięto z plazmidu pBI241.3 jako fragment HindIII-BamHI (plazmid pBI241 3 zawiera segment promotora patatyny-1 składający się z miejsca AccI w pozycji 1323 do miejsca Dral w pozycji 2289 [numery pozycji odnoszą się do sekwencji opisanej przez Bevana i wsp., 1986] z łącznikiem HindIII dodanym w pierwszej pozycji i łącznikiem BamHI dodanym w ostatniej pozycji (Bevan i wsp., 1986). Ten promotor patatyny poddano ligacji z fuzją CTP-1g1gC 16 (fragment BglII-SacI z plazmidu pMON20102) i z wektorem plazmidowym typu pUC uprzednio ciętym enzymami Hindlll i SacI (te miejsca klonowania w wektorze są flankowane przez miejsca rozpoznawane przez Notl). Taką kasetę wprowadzano jako miejsce Notl w pMON886, w taki sposób, ze ekspresja genu glgC16 przebiega w tej samej orientacji jak genu NPTII (kanamycyny). Ta pochodna, pod nazwąpMON20113 jest przedstawiona na fig. 7 publikacji zgłoszenia PCT, WO 91/19806 dokonanego przez Kishore.
Transformacja i regeneracja roślin
Wektor pMON20113 mobilizowano w rozbrojonym szczepie Agrobactenum tumefaciens w trójrodzicielskim układzie komugacyjnym stosując pomocniczy plazmid pRK2013 (Ditta i wsp., 1980). Ten rozbrojony szczep ABI zawierał w sobie plazmid Ti, który został rozbrojony przez usunięcie genów fitohormonu odpowiedzialnych za chorobę guzowatości korzeni. Szczep ABI jest Agrobactenum tumefaciens A208 posiadającym rozbrojony plazmid pTiC58, pMP90RK (Kończ i Schell, 1986). Ten rozbrojony plazmid T1 posiada funkcje genu trfA wymagane do autonomicznej replikacji wektora pMON po koniugacji do szczepu ABI. Kiedy tkankę roślinną inkubuje się z koniugatem ABI’ :pMON wów czas wektor jjesr przenoszony do komórek roślinnych dzięki funkcjom vir kodowanym przez rozbrojony plazmid T1, pMP90RK.
Konstrukcją pMON20113, kodującą bakteryjny gen ADPGPP (SEQ ID NR: 1) transformowano ziemniaki Russet Burbank, odmianę Williams w następującej procedurze. Do transformacji ziemniaków Russet Burbank, sterylne hodowle odrośli Russet Burbank utrzymywano w pojemniczkach do lodów zawierających 8 ml pożywki PM wzbogaconej ilością 25 mg/litr kwasu askorbinowego. Pożywka ta, opisana przez Murashige i Skoog’a (MS) zawiera sole nieorganiczne, 30 g/litr sacharozy, 0.17 g/litr NaH2PO4 x H2O, 0,4 mg/litr chlorowodorku tiaminy i 100 mg/litr mioinozytolu, i jest zestalona ilością 2 g/litr „Gerlite” (pH = 6.0). Kiedy odroślą osiągały około 5 cm długości, wycinano segmenty międzywęźli łodyg o długości 3 do 5 mm i zaszczepiano je rozcieńczeniem 1T0 jednodniowej hodowli Agrobactenum tumefaciens z 4-dniowej hodowli na płytce. Te przeszczepy hodowano wspólnie przez 2 dni w temperaturze 20°C na sterylnej bibule filtracyjnej umieszczonej nad 1,5 ml warstwą komórek tytoniu jako żywicielu, nałożonej na pożywkę 1/10 P [1/10 stężenia soli nieorganicznych MS z dodatkiem związków organicznych bez kazeiny, tak jak w pożywce Jarret’a (1980), 30 g/litr sacharozy i 8 0 g/litr agaru]
178 628
Po wspólnej hodowli, przeszczepy przenoszono do pożywki P-1 o pełnym stężeniu w ceiu indukowania powstania kallusa. Pożywka zawierała sole nieorganiczne MS, dodatki organiczne według Jarret’a i wsp., (1980), za wyjątkiem kazeiny, 5.0 mg/litr rybozydu zeatyny (ZR) i 0,10 mg/litr kwasu nafialenooctowego (NAA; Jarret i wsp., 1980a, 1980b). Dla zahamowania wzrostu bakterii dodano karbenicylinę (500 mg/litr) i cefotaksim (100 mg/litr) oraz 100 mg/litr kanamycyny w ceiu selekcji komórek transformowanych.
Po 4 tygodniach przeszczepy przenoszono do pożywki o tym samym składzie, z tym, że zamiast NAA dodawano 0,3 mg/litr kwasu giberelmowego (GA3) (Jarret i wsp., 1981) dla pobudzenia tworzenia się odrośli. Odroślą zaczynały się rozwijać po około 2 tygodniach od przeniesienia na podłoże indukujące powstawanie odrośli. Odroślą te wycina się i przenosi do fiolek z pożywką PM w ceiu ukorzeniania. Po około 4 tygodniach wzrostu na pożywce indukującej powstawanie korzeni, rośliny przenoszono do gleby i stopniowo hartowano. W odroślach oznaczano oporność na kanamycynę nadaną przez enzym, fosfotransferazę neomycynową II, umieszczając te odroślą na pożywce PM w ceiu ukorzenienia, która to pożywka zawierała 50 mg/litr kanamycyny dla selekcji komórek transformowanych.
Regenerowane w hodowli rośliny ziemniaka Russet Burbank Williams wysadzano do doniczek o średnicy 6 cali (około 15.24 cm) i prowadzono ich wzrost do okresu dojrzałości w warunkach cieplarnianych. Następnie zbierano bulwy i pozostawiano do skorkowacenia w temperaturze pokojowej w ciągu 2 dni. Wszystkie bulwy większe od 2 cm długości zebrano i przechowywano w temperaturze 3°C w warunkach wysokiej wilgotności.
Ciężar właściwy i oznaczenia skrobi w przechowywanych bulwach.
Ciężar właściwy (SG) oznaczano po 3 i 4 miesiącach przechowywania w niskiej temperaturze (3°C) biorąc do oznaczeń największe 2 lub 3 bulwy z każdej rośliny o typowej wadze 20 - 40 gram na bulwę Na kilka godzin przed oznaczaniem ciężaru właściwego bulwy ogrzewano do temperatury pokojowej w czasie kilku godzin ale nie pozwalano na ich rekondycjonowanie. Ciężar właściwy oznaczano metodą ważenia w powietrzu i w wodzie i wyliczano ze wzoru:
SG = ciężar w powietrzu /(ciężar w powietrzu - ciężar w wodzie). Procentową zawartość skrobi i procentową zawartość suchej masy wyliczano w oparciu o SG według wzorów (von Scheele, 1937):
procentowa zawartość skrobi =
17.546 + (199 07) (SG - 1.0988) procentowa zawartość suchej masy =
24.182 + (211.04)(SG- 1.0988).
Analizę skrobi przeprowadzono na świeżych, środkowych sekcjach tkanki przechowywanych bulw w sposób opisany przez Lin’a i wsp., (1988). Nie pozwalano na ogrzanie się bulw przed pobraniem tkanki. Pokrótce, wycinano około 100 mg środkowych sekcji, ważono je, umieszczano w 1,5 ml probówkach do wirowania i zamrażano na suchym lodzie. Następnie tkankę suszono do stałej masy w koncentratorze „Savant Speed-Vac” i oznaczano końcową suchą masę. Na początku usuwano rozpuszczalne cukry przez trzykrotną ekstrakcję ilością 1 ml 80% etanolu w temperaturze 70°C w czasie 20 minut na jedno traktowanie. Po końcowej inkubacji usunięto cały pozostały etanol przez wysuszenie w koncentratorze „Speed-Vac”. Stały materiał zawieszano w 400 μΐ 0,2 M wodorotlenku potasowego, rozdrabniano i inkubowano w czasie 30 minut w temperaturze 100°C dla solubilizacji skrobi. Roztwory ziębiono i zobojętniano przez dodanie 80 pl 1N kwasu octowego. Skrobię degradowano do glukozy przez działanie 14.8 jednostkami α-amylazy trzustkowej (Sigma Chemical, St. Louis) w czasie 30 minut, w temperaturze 37°C i następnie 10 jednostkami amyloglukozydazy (Sigma Chemical, St. Louis) w czasie 60 minut w temperaturze 55°C. Glukozę uwolnioną przez trawienie enzymatyczne oznaczano w zestawie z heksokinazą Sigma (St. Louis) i uzyskane wartości użyto do wyliczenia zawartości skrobi.
Analiza cukru
Przed analizą cukru bulwy przechowywano w temperaturze 3°C i nie pozwalano na rekondycjonowanie w temperaturze pokojowej. Z przechowywanych bulw wycinano środkowe wy178 628 cinki i oznaczano ciężary świeżej masy. Następnie tkankę zamrażano na suchym lodzie i suszono w koncentratorze „Savant Speed-Vac”. Średnia waga świeżej masy na próbkę wynosiła 100 mg. Suchy materiał bulw grubo mielono i ekstrahowano cukry trzy razy ilością 0,5 ml 80% etanolu w temperaturze 70°C w czasie 20 minut na ekstrakcję. Po każdej inkubacji nierozpuszczony materiał wirowano przez 2 minuty w mikrowirówce i zebrano supernatant. Supernatanty ze wszystkich trzech ekstrakcji połączono, wysuszono i zawieszono w 1 ml 100 mM buforu Tris (pH = 7.5). Do każdej analizy cukru użyto 10 pl próbki.
Dla każdej próbki oznaczano zawartość glukozy w zestawie diagnostycznym Glucose[HK] firmy Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, postępując według przepisu podanego przez wytwórcę. Pokrótce, 1 ml rekonstytuowanego reagenta inkubowano z ilością 10 pl próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, po czym oznaczano stężenie w próbce przez pomiar absorbancji przy długości fali 340 nm, odejmując absorbancję próbki 10 pl w wodzie. Procentową zawartość glukozy wyliczano według równania:
% glukozy = [(A340 x 2.929)/ mg świeżej masy] x 100%.
Zawartość fruktozy oznaczano przez dodanie do powyższej mieszaniny do oznaczania glukozy 1 pg fosfoglukoizomerazy i odjęcie od zawartości glukozy sumy procentowej zawartości glukozy + fruktozy. Zawartość sacharozy oznaczono przez dodanie do próbki na oznaczanie glukozy HK 1 pg fosfoglukoizomerazy i 100 pg inwertazy drożdżowej i przez wydłużenie czasu inkubacji do 30 minut w temperaturze pokojowej. Procentową zawartość sacharozy oznaczano jak powyżej, odejmując wartości otrzymane dla zawartości glukozy i fruktozy.
Hybrydyzacja Westerna przechowywanych bulw
Bulwom przechowywanym w temperaturze 3°C nie pozwalano na ogrzanie przed izolacją tkanki do analizy. Do hybrydyzacjiWesterna białka ekstrahowano z wysuszonej pod próżnią, grubo zmielonej tkanki bulwy przez zmielenie w roztworze o składzie: 100 mM Tris (pH = 7.5), 35 mM Kcl, 5 mM ditiotreitolu, 5 mM askorbinianu, 1 mM EDTA, 1 mM benzamidyny 120% glicerolu w stosunku 1:1. Stężenie białka w ekstrakcie oznaczano metodą BCA według Pierce’a i białka rozdzielano na 3 - 17% żelach poliakryloamidowych SDS (Laemmli, 1970). Enzym ADPGPP z E. coli wykrywano stosując przeciwciała kozie przeciw oczyszczonemu enzymowi ADPGPP z E. coli i skomugowane alkaliczną fosfatazą przeciwciała królika anty-kozie (Promega, Madison, WI).
Oznaczanie barwy ziemniaków smażonych
Prowadzono hodowle w warunkach polowych w Parmie (Idaho) ośmiu transgenicznych linii ziemniaczanych, w których zachodzi ekspresja genu glgCló z E. coli i 20 linii kontrolnych składających się z tych kombinacji linii z transformacji pMON20113, w których nie zachodzi ekspresja genu glgC 16 z E. coli oraz kilku metransgenicznych kontrolnych linii Resset Burbank. Bulwy zebrano i przechowywano przez 2 miesiące w temperaturze 40°C. Barwę frytek oznaczano dla wszystkich linii ziemniaczanych przez pobranie z każdej linii środkowych wycinków z reprezentatywnych próbek i smażenie w temperaturze 375°F w oleju sojowym w czasie 3 minut i 30 sekund. Barwę frytek oznaczano wykonując pomiary fotowoltametryczne Wartości podano według tablicy klas kolorów dla zamrożonych frytek francuskich.
Wyniki
Wszystkie bulwy zbierano od roślin tej samej odmiany (Russet Burbank Williams 82), tego samego wieku, rosnących obok siebie w identycznych warunkach wzrostu. Analiza metodą hybrydyzacji Westerna wykazała, że poziomy ADPGPP z E. coli były w zasadzie równoważne z poziomami oznaczonymi w czasie zbiorów (tabela 1), co sugeruje, że poziomy białka ADPGPP z E. coli są stabilne podczas przechowywania w niskiej temperaturze. Analiza bulw przechowywanych w temperaturze 3°C w warunkach wysokiej wilgotności wykazała, że rośliny, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 z E.coli gromadzą5-6-krc)tmc' mniej cukrów redukujących niz bulwy kontrolne (tabele 2, 3, 4, 5 i 6). Poziomy sacharozy w bulwach kontrolnych i transgenicznych, były porównywalne, natomiast poziomy skrobi były znacznie wyższe w bulwach transgenicznych. Otrzymane wyniki można interpretować w ten sposób, że w miarę, jak skrobia ulega degradacji podczas przechowywania, powstające cukry mają tendencję do resyntezy
178 628 do skrobi w tych bulwach, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 z E. coli, podczas gdy w bulwach kontrolnych cukry mają tendencję do akumulowania się.
Transgeniczne rośliny ziemniaka, w których zachodzi ekspresja genu glgC 16 uprawiano w warunkach polowych i bulwy ziemniaków linii GlgC 16 przechowywano w temperaturze 40°F (4°C) razem z bulwami z kilku innych linii kontrolnych. Kolor frytek, który bezpośrednio koreluje z zawartością cukru, oznaczano po dwu miesiącach przechowywania w zimnie. Średnia barwa frytek z transgenicznych bulw ziemniaczanych była znacznie lepsza (jaśniejsza) niż frytek z bulw kontrolnych (barwa ciemniejsza) przechowywanych w identycznych warunkach (tabela 7), co świadczy o niższym poziomie cukru w bulwach, w których zachodzi ekspresja genu glgC 16 z E. coli. Bezpośredni pomiar zawartości cukrów redukujących w próbce bulw rosnących na polu i przechowywanych przez 14 tygodni w temperaturze 3°C potwierdza wyniki barwy frytek, gdyż w bulwach, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 z E. coli znajduje się znacznie mniej cukrów redukujących niż w bulwach kontrolnych (tabela 8). W bulwach z transgenicznych roślin ziemniaka analizowano szybkość i stopień rekondycjonowania po przechowywaniu w niskiej temperaturze. Barwa frytek z linii transgenicznych dających bulwy o ciężarze właściwym powyżej 1.083 wskazuje na zwiększoną szybkość i stopień rekondycjonowania w temperaturze 65°F w porównaniu z kontrolą (tabela 9).
Tabela 1
Ekspresja ADPGPP z E. coli w bulwach ziemniaczanych w czasie zbioru i po 3 miesiącach przechowywania w niskiej temperaturze Poziomy ADPGPP z E coli oznaczono metodą hybrydyzacji Westerna, w porównaniu do znanych standardów Wartości są podane w ng GlgC16 na 50 pg białka bulwy ng GlgCló
Lima Okres zbioru Po 3 miesiącach
353c 20-25 20-25
535c 25-30 20-25
448a 25-30 25-30
182a 2 0,5 - 1
199a 20-25 20-25
288c 20-25 20-25
194a 15-20 15-20
524a 10 15-20
Tabela 2
Zawartość cukru i skrobi (pomiary suchej masy) w bulwach przechowywanych przez 3 miesiące w niskiej temperaturze
Cukry redukujące to glukoza i fruktoza a cukry całkowite to cukry redukujące plus sacharoza. Wartości (w procentach suchej masy) przedstawiają średnie z 9 linii ziemniaczanych glgC 16+ o wysokiej zawartości skrobi 111 linii ziemniaczanych kontrolnych (glgC16-) przechowywanych przez 3 miesiące w temperaturze 3°C
Cukry redukujące Sacharoza Cukier całkowity Skrobia
glgC16+ 1,5 1,2 2,6 59,5
Kontrola 7,0 0,8 7,8 53,7
Tabela 3
Zawartość cukru i skrobi (pomiary świeżej masy) w bulwach przechowywanych przez 4 miesiące w niskiej temperaturze.
Cukry redukujące to glukoza i fruktoza a cukry całkowite to cukry redukujące plus sacharoza Wartości (w procentach świeżej masy) przedstawiają średnie z 9 linii ziemniaczanych glgC16+ o wysokiej zawartości skrobi i 11 linii ziemniaczanych kontrolnych (glgC16-) przechowywanych przez 4 miesiące w temperaturze 3°C
Cukry redukujące glgC16+ 0,1 Kontrola 0,8
Sacharoza Cukier całkowity Skrobia
0,1 0,3 9,9
0,12 1,0 6,0
178 628
Tabela 4
Zawartość cukrów redukujących w bulwach ziemniaczanych przechowywanych przez 4 miesiące w niskiej temperaturze W tabeli podane są ilości linii roślinnych zawierających poziomy cukru mieszczące się w podanych zakresach Procentowe zawartości wyliczano w oparciu o świeżą masę.
Procentowa zawartość cukrów redukujących
Linie 0-0.2 0.2-0.4 0.4-0.6 0.6-0.8 0.8-1.0 1.0+
kontrolne Linie 0 2 0 4 2 3
glgC16 6 3 0 0 0 0
Tabela 5
Całkowita zawartość cukrów w bulwach ziemniaczanych przechowywanych przez 4 miesiące w niskiej temperaturze. W tabeli podane sąilości linii roślinnych zawierających poziomy cukru mieszczące się w podanych zakresach. Procentowe zawartości wyliczano w oparciu o świeżą masę.
Linie kontrolne Linie glgC16
Procentowa zawartość cukrów
0-1 1-2 2-3 2-4 4-5
0 0 0 2 3
3 4 2 0 0
Tabela 6
5+
Zawartość skrobi w bulwach ziemniaczanych przechowywanych przez 4 miesiące w niskiej temperaturze. W tabeli podane są ilości linii roślinnych zawierających poziomy skrobi mieszczące się w podanych zakresach Procentowe zawartości wyliczano w oparciu o świeżą masę.
Procentowa zawartość skrobi 12-14
2-4 4-6 6-8 8-10 10-12
Linie kontrolne 1 6 3 1 0 0
Linie glgC 16 0 0 2 3 3 1
Tabela 7
Średnia barwa frytek z bulw wyhodowanych na polu po 2 miesiącach przechowywania w temperaturze 40°F. Skalę oceny barwy frytek przyjęto według opublikowanych standardów barwy dla zamrożonych smażonych ziemniaków, USDA W tej skali, 0 oznacza barwę bardzo jasną a 4 - barwę bardzo ciemną W tabeli podane są ilości linii roślinnych dających kolory frytek mieszczące się w podanych zakresach.
Ocena barwy frytek
2-2 49 2 5-2 99 3.0-3.49 3.5-4 0
Linie kontrolne 0 0 4 16
Linie glgC16 1 1 6 0
Tabela 8
Zawartość cukrów redukujących w bulwach ziemniaczanych hodowanych na polu po przechowywaniu przez 14 tygodni w temperaturze 3°C. W tabeli podane są ilości linii roślinnych zawierających poziomy skrobi mieszczące się w podanych zakresach. Procentowe zawartości wyliczano w oparciu o świeżą masę
Procentowa zawartość cukrów redukujących
0,5-1
Linie kontrolne 0
Linie glgC 16 4
1-1,5 1,5-2
2
2
2-2,5
Przykład II.
Po przechowywaniu w niskich temperaturach ziemniaki często nie nadają się do smażenia z powodu podwyższonych poziomów cukru. Takie przechowywane ziemniaki poddaje się pro20
178 628 cesom polepszającym, takim jak blanszowame albo rekondycjonowame. W pierwszej z tych procedur usuwa się cukry przez traktowanie kawałków ziemniaków gorącą wodą a w drugiej cukry poddaje się metabolizowaniu podczas przechowywania bulw w wyższych temperaturach (około 65°F). Blanszowame stosuje się głównie w ceiu inaktywacji enzymów ale jeśli zawartość cukrów jest wysoka, proces trzeba wydłużać wielokrotnie w stosunku do normalnego. Wydłużenie tego etapu powoduje niższy odzysk produktu i utratę zapachu. Proces jest czasochłonny, wymaga wysokich nakładów energii i daje odpady o wysokich wymaganiach biologicznego tlenu a zatem, nakłada dodatkowe ograniczenia pod względem ścieków. Rekondycjonowame wymaga dodatkowych możliwości przechowywania w kontrolowanej temperaturze a do otrzymania optymalnych wyników trzeba prowadzić wiele etapów w różnych temperaturach. Przechowywanie w wyższych temperaturach w dłuższym czasie zwiększa kiełkowanie i zachorowalność. Przypalona barwa frytek powstająca przy smażeniu bulw GlgC 16 przechowywanych w niskiej temperaturze jest często słabsza (lepsza) niż ta, jaka powstaje w bulwach kontrolnych, a w niektórych przypadkach jest nawet po 3 - 4 miesiącach tak niska, że nie jest potrzebne rekondycjonowame Te testy rozszerzono na bulwy przechowywane przez 2 miesiące w temperaturze 50°F, a następnie przez 3 miesiące w temperaturze 3 8°F a ponadto, prowadzono pomiary stopnia rekondycjonowania
Badano bulwy roślin transformowanych następującymi wektorami· pMON17316 (z promotorem patatyny 3.5) i pMON17279 (z genem małej podjednostki ziemniaczanej ADPGPP), a także badano bulwy roślin posiadających opisany powyżej wektor: promotor patatyny 1.0/glgC16. Te wektory skonstruowano następującoPromotor patatyny 3.5 otrzymano z plazmidu pPBI240.7 (Bevan, 1986). Większość tego promotora 3.5 wycięto z pPBI240.7, od miejsca HindIII (-3500) do miejsca XbaI (-337) i połączono z pozostałą częścią tego promotora, od miejsca XbaI do miejsca BgIII w pozycji +22 (poprzednio miejsce Dral) w reakcji potrójnej ligacji do wektora, który zawierał miejsce Bglll, otrzymując pMON 17280. Ten plazmid służył następnie jako wektor do potrójnej ligacji całkowitego promotora 3.5 i opisanej powyżej fuzji plastydowego peptydu docelowego - GlgC16 z pMON20102, z utworzeniem kasety do ekspresji w bulwach (w plazmidzie pMON17282). Tę kasetę, zawierającą promotor patatyny 3,5, fuzję plastydowego peptydu docelowego- GlgC16 i sekwencje NOS 3', wprowadzono do wektora do transformacji roślin, pMON17227, będącego plazmidem Ti ujawnionym i opisanym przez Barry’ego w opisie zgłoszeniowym PCT, WO 92/04449 (1991), wprowadzonym do mniejszego opisu jako odnośnik, we fragmencie Notl, konstruując pMON17316 (fig. 1).
Promotor dla genu małej podjednostki ADPGPP bulw ziemniaczanych (SEQ ID NR- 24), otrzymano jako fragment XbaI-BglII klonu genomowego 1 -2 i dokonano jego insercji do miejsca XbaI i BamHI w plazmidzie Bluescnpt Π KS-(Nakata i wsp., 1992). Ten fragment promotora składa się z części od miejsca Ciał o długości około 2.0 kilopar zasad w kierunku 5' od przypuszczalnego kodonu inicjacji dla metioniny, rozciągającej się do miejsca HindIII znajdującego się o 12 par zasad przed tym ATG. Miejsce BgIII umieszczono w sąsiedztwie miejsca HindIII przez subklonowanie w innym wektorze pUC i połączono je poprzez to drugie miejsce z sekwencjami kodującymi fuzję CTP i glgC 16. Tę kasetę, z sekwencją3' rozpoznawaną w roślinach klonowano do wektorów do transformacji roślm otrzymując pMON17279 (zawierający rów nież kasetę, w której gen uidA[GUS] z E. coli jest poddawany ekspresji z tego samego promotora ziemniaczanego dla małej jednostki ADPGPP), co jest przedstawione na fig 2
Wektory te wprowadzano do komórek ziemniaka metodą transformacji z udziałem Agrobactenum i następnej selekcji N-(fosfonometylo)glicyną (odczynnik glyphosate) W celu transformacji ziemniaków z użyciem N-ffosfonometylojlicyny jako środka selekcyjnego prowadzono wzrost Agrobactenum w czasie doby w 2 ml pożywki LBSCK. Następnego dnia bakterie rozcieńczano w stosunku 1:10 za pomocą MSO albo do ustalenia się odczytu gęstości optycznej na wartość 0.2 - 0.33. Z łodyg roślin ziemniaka rosnących w sterylnych warunkach przez 3 tygodnie na pożywce PM wzbogaconej ilości ą25 mg/ml kwasu askorbinowego usuwano liście, łodygi cięto na odcinki o długości 3 - 5 mm i zaszczepiano na nich rozcieńczone bakterie w
178 628 sposób opisany powyżej. Przeszczepy umieszczano na przygotowanych płytkach ko-hodowli. Płytki z ko-hodowlą zawierały 1/10 MSO z dodatkiem 1,5 ml komórek TxD nawarstwionych zwilżoną bibułą. Na płytce umieszczano około 50 przeszczepów. Po 2 dniach okresu ko-hodowli przeszczepy umieszczano na dwa dni na pożywce indukującej powstawanie kallusa zawierającej 5.0 mg/litr rybosydu zeatyny, 10 mg/litr AgNO31 0.1 mg/litr kwasu nafialenooctowego (NAA). Następnie przeszczepy przenoszono na pożywki indukujące powstawanie kallusa zawierające 0,025 mM N-(fosfonometylo)glicyny do selekcji. Po 4 tygodniach przeszczepy umieszczano na podłożach indukujących powstawanie odrośli zawierających 5.0 mg/litr rybozydu zeatyny, 10 mg/litr AgNO3 i 0.3 mg/litr GA3 oraz 0.025 mM glyphosate do selekcji. Odroślą zaczęły się pojawiać w 8 tygodniu hodowli. Przeszczepy przenoszono do świeżych pożywek indukujących powstawanie odrośli co 4 tygodnie przez 12 tygodni Odroślą wycinano, umieszczano na pożywkach PM i hodowano na tych pożywkach przez około 2 tygodnie albo do czasu, kiedy będą się nadawać do wysadzenia do gleby
Dane dla linii GlgC 16 Russet Burbank, łącznie z tymi, w których zachodni ekspresja białka GlgC 16 z promotora patatyny 1.0 (HS01; HS03; MT01), patatyny 3 5 (HS13) i z promotora dla małej podjednostki ziemniaczanej ADPGPP (HS 10) sąprzedstawione poniżej (tabela 9). Badano również wiele linii ziemniaków GlgC16 (odmiana Atlantic), MT01, z promotorem patatyny 1.0. Aby uzyskać akceptowalne produkty z ziemniaków wykazujących wartości 2.01 wyższe w skali barw, przetwórca w zasadzie powinien prowadzić blanszowanie. Wiele linii Russet Burbank GlgC16 dawało wskaźniki barwy smażonych wyrobów poniżej 2.0 bezpośrednio po składowaniu w niskiej temperaturze, a więc, można je przetwarzać bezpośrednio Wskaźnik barwy ziemniaków smażonych niższy od 2.0 uzyskuje się dla dużej liczby linii po bardzo krótkim czasie rekondycjonowania. Ta lepsza podatność na rekondycjonowame jest widoczna dla linii o zwiększonym poziomie stałej masy i również dla linii GlgCló, me wykazujących wzrostu ciężaru właściwego. Poprawa była również widoczna dla wszystkich promotorów użytych do ekspresji GlgC16 w bulwach. Ten efekt otrzymanych linii, które mogą być smażone bezpośrednio po składowaniu i podlegają szybkiemu rekondycjonowaniu jest również widoczny dla odmiany GlgC16 Atlantic. Linia MT01-27 jest również dowodem na to, że zwiększony poziom skrobi w bulwach mejest konieczny dla otrzymania polepszonych właściwości magazynowania w niskich temperaturach, gdyż ciężar właściwy badanych linii nie różni się znacząco od oznaczonego w bulwach kontrolnych odmiany Atlantic.
Tabela 9
Barwa ziemniaków smażonych/własności rekondycjonowania ziemniaków zawierających GlgCló (Barwę frytek oceniano według tabeli USDA w skali od 0 do 4, najniższa - najniższa)
Ilość dni w temperaturze 65°F
Linia 0 3 6 10 13 17
Kontrola-Russet Burbank
RB02 2.2 23 1 8 20 1.0 1 3
RB03 3.5 3 3 25 1.7 23 2 5
RB05 2 3 25 22 20 1 2 1 3
GlgC16 Russet
Burbank
HS13-47* 3.0 25 07 07 1.3 1 3
HS10-15* 1 3 1 3 04 08 1 0 1 0
HS 13-50* 3 2 1 0 0.5 1.0 1 2 08
MT01-82* 22 1.2 07 1 0 1 5 1 0
HS13-36* 2 2 1 3 0.7 1.2 1 2 08
HS 10-20* 1.0 07 05 05 04 05
178 628 tabela 9 (ciąg dalszy) * ciężar właściwy powyżej 1.083
HS01-58# 2.8 2.5 1.3 0.7 1 5 1.8
HS03-20# 3.2 2.3 1 7 2.8 1.8 2.0
HS03-18# 2.0 1.8 1.7 0.7 1.3 1.3
HS03-12A# 3 3 2.5 2.7 2.2 2.2 0.8
HS03-12B# 3.0 3 2 20 2.7 1.3 20
HS01-49# 2.2 1.3 2.3 2.2 1 5 , 08
HS 13-30# 3.2 23 20 2.8 1.7 3.0
# - ciężar właściwy poniżej 1 083
Odmiana kontrolna - Atlantic
AT-1 2 3 2.3 23 1.5 1 5 1.8
Odmiana GlgC 16 Atlantic
MT01-24 2.5 1 8 2.8 1 2 2.2 1 3
MT01-27 1 0 05 1 3 03 0.8 0.7
Przykład III.
Wpływ GlgC16 na opóźnienie kiełkowania oznaczano na populacji bulw przechowywanych w temperaturze 60°F (uprzednio składowanych w temperaturze 38-40°F w czasie 3 miesięcy). Bulwy (po 4 do 6) badano w przedziałach czasu i oceniano na obecność kiełków > 0.5 cm (tabela 10). Opóźnienie w kiełkowaniu, przedstawione jako ilość dni do wystąpienia 50% kiełkowania, często polepszone w liniach GlgC 16, obserwowano w trzech badanych odmianach: (Russet Burbank, Atlantic i Norchip), w liniach, w których ekspresja GlgC16 zachodzi z promotora patatyny 1.0 (HS01, HS03 i MT01), patatyny 3.5 (HS13) i z promotora dla ziemniaczanej małej podjednostki ADPGPP (HS10) i było widoczne w liniach ze zwiększonąi bez zwiększonej zawartości stałej masy Linie z opóźnionym kiełkowaniem kiełkowały normalnie po wysadzeniu do gleby.
Tabela 10
Odmiana Linia Ilość dni do 50% kiełkowania
Russet Kontrolnn 15
Burbank Kt^ntt^r^lnńi 14
Kontrolna 9
HS01-25 11
HS01-49 15
HSO1-58 18
HS03-3 12
HS03-5 13
HS03-17 13
HS03-26 I14
HS03-27 12
HS03-41 2-4
HS10-10 114
HS10-15 26
HS10-20 >43+
HS13-2 11
HS13-13 Hi
HS13-23 23
HS13-30 15
HS13-34 25
HS13-37 12
178 628
tabela 10 (ciąg dalszy)
HS13-47 21
HS13-50 19
HS13-68 13
HS13-70 24
MT01-10 14
MT01-11 13
MT01-30 14
MT01-37 19
MT01-82 16
Atlantic Kontrolna 6
MT01-6 11
MT01-7 9
MT01-15 10
MT01-31 6
Norchip Kontrolna 8
MT01-1 12
MT01-5 13
+ - czas trwania obserwacji; bulwy pochodzące z linii kiełkujących po wysadzeniu do gleby.
Przykład IV.
Dodatkowe badania przeprowadzono z ziemniakami transformowanymi genem glgC 16 pod kontrolą dwu różnych promotorów. Promotory dla dużej podjednostki ADPGPP bulw ziemniaczanych izolowano z dwu różnych odmian ziemniaków, Russet Burbank (SEQ ID NR: 25) i Desire (SEQ ID NR: 26). Klony identyfikowano metodą hybrydyzacji łysmek z sondąz końca 5' cDNA dla dużej podjednostki ADP-glukozo-pirofosforylazy. Miejsca początku translacji (ATG) tych klonów zidentyfikowano względem roślinnych sekwencji consensus (Lutcke i wsp., 1987). Do wprowadzenia miejsca BamHI w końcu 3' w dół od kodonu ATG i miejsca Hindlll w końcu 5' w obydwu promotorach użyto pnmery z łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy (PCR). Otrzymane, promotor Russet Burbank o długości 600 par zasad i Desiree o długości 1600 par zasad poddawano niezależnie ligacji z plazmidem pMON 10098 w miejsce promotora E35S i dokonano fuzji z fragmentem Bglll-Sacl z plazmidu pMON20102 zawierającym gen chimerowy CTP-glgC 16. Z tych plazmidów usunięto kasetę E35S-NPTII i zastąpionojął^2s^e^tąIMV^-^CTT^-^C^F^4-E9 z opisanego powyżej plazmidu pMON 17227 zawierającą fragment Notl-SaU. Otrzymano pMON21522 (z promotorem pochodzącym z Russet Burbank) i pMON21523 (z promotorem pochodzącym z odmiany Desiree). Plazmid pMON 10098 zawiera następujące regiony DNA: 1) Chimerowy gen oporności na kanamycynę skonstruowany do ekspresji w roślinach i pozwalający na selekcję transformowanej tkanki. Ten gen chimerowy składa się z promotora 35S o długości 0 35 kilozasad z wirusa mozaiki kalafiorowej, P-35S (Odell i wsp., 1985), genu NPTII o długości 0.83 kilozasad i z 3' nie podlegającego translacji regionu NOS 3' o długości 0.25 kilozasad, 2) fragment Ciał do Dral o długości 0.45 kilozasad z oktopinowego plazmidu Ti, pTi 15955, zawierający region z lewego ramienia T-DNA (Barker i wsp., 1983), 3) fragment o długości 0.75 kilozasad zawierający źródło replikacji z plazmidu RK2, on-V (Stalker i wsp., 1981), 4) fragment Sali do Pstl o długości 3.0 kilozasad z plazmidu pBR322 zawierający źródło replikacji dla celów utrzymania w E. coli (on-322) i miejsce bom służące do koniugacyjnego przeniesienia do komórek Agrobactenum tumefaciens, 5) wyizolowany z transpozonu Tn7 fragment o długości 0.93 kilozasad, kodujący oporność na spektynomycynę i streptomycynę, Spc/Str (Fling i wsp., 1985), stanowiący determinantę selekcyjną w E. coli i w Agrobacterium tumefaciens, 6) fragment Pvul do Bell o długości 0.36 kilozasad z plazmidu pTiT37, zawierający region prawego ramienia T-DNA typu nopalinowego (Fraley i wsp., 1985) 17)jako ostatni segment, kasetę ekspresyjną składającą się z promotora 35S z wirusa mozaiki kalafiorowej o długości 0.65 kilozasad (CaMY) wzmocnionego
178 628 przez duplikację sekwencji tego promotora, P-E35S (Kay i wsp., 1987), syntetycznego poliłącznika z kilkoma unikalnymi miejscami klonowania i z me podlegającego translacji regionu 3' genu rbcS-E9 z grochu o długości 0.7 kilozasad, E9 3' (Coruzzi i wsp., 1984). Ten plazmid kojarzy się z Agrobactenum tumefaciens, szczepem ABI, w trójrodzicielskim układzie kojarzenia i stosuje się do transformowania linii Russet Burbank, Williams 82.
Polepszenie własności podczas magazynowania wykazano również dla ziemniaków Russet Burbank transformowanych plazmidami pMON22152 i pMON21523. W ziemniakach tych ekspresja GlgC16 przebiega z promotorów dla dużej podjednostki ADPGPP bulw ziemniaczanych. Bulwy wyhodowane w polu przechowywano po zbiorach początkowo przez miesiąc w temperaturze 50°F, po czym umieszczano je w zimnie, w temperaturze 40°F i składowano w czasie 4 miesięcy. W jednym badaniu barwę frytek uzyskanych z tych bulw bezpośrednio po składowaniu oceniano przez oznaczenie współczynnika odbicia smażonego materiału - korzystne są niższe wartości. W drugim badaniu, część składowanych w niskiej temperaturze bulw przenoszono do pomieszczenia o temperaturze 55°F w celu oznaczenia podatności na rekondycjonowanie. Dane z tych oznaczeń, zarówno dla łodygowych jak i pączkowych końców bulw są przedstawione w tabeli 11.
W obydwu przypadkach, wiele linii wykazuje lepsze wskaźniki barwy niż rośliny kontrolne, zarówno przy bezpośrednim smażeniu jak i po rekondycjonowamu. Przykładowo, linie pMON21522-144, pMON21523-791 wiele innych wykazuje ogromne polepszenie w porównaniu do kontroli.
pMON21522
Tabela 11
Współczynnik odbicia smażonych ziemniaków 12
Składowanie w 40°F3
Składowanie w 40°F.
dm@55°F4
LINIA# 0/ pączki “ łodygi5 pączki łodygi
144 24 3 22.1 34.6 25.4
209 22 8 20 1 31 4 22 2
149 27 1 2^..4 30 7 227 5
178 25 3 21 1 34 9 22 3
194 23 7 20 8 30 6 22 2
204 21 3 114 7 33.9 221 0
218 22 8 18 9 33.3 20.7
Kontrola/
średnia6 19 7 16.8 3101 25 1
pMON21523 Współczynnik odbicia smażonych ziemniaków^
Składowanie w 40°F3 Składowanie w 40°F.
dni@ 55°F4
LINIA# pączki% łodygi5 pączki łodygi
33 22.1 16.5 29 8 23 1
34 21 2 18 2 32 1 2Ί 3
38 24 0 23 2 28 3 23 6
40 24.4 15 3 31.5 236 2
47 22.0 15.6 34 9 271 7
48 23 0 19 3 231 1 24 9
79 24 4 19 7 35.8 29 7
80 21.8 20 5 32.7 25 5
178 628 tabela 11 (ciąg dalszy)
93 20.7 17.4 31 1 23 2
99 198 17.1 30 6 23.4
31 22.1 21.6 30 2 24.7
35 20.0 16.8 34 5 28.4
37 20 6 185 34 2 27 2
39 180 15 8 33 1 24 4
42 19 2 15 1 31.9 24 1
43 23.9 20 7 32 1 22 0
60 20.7 16.3 32 4 20.3
64 22.3 16.1 30 0 23 0
71 21 8 20.9 33 1 24 7
76 22.8 21.5 28 5 25 0
81 16 5 160 29 1 22 7
92 15.3 150 30.3 23 5
Kontrola/
średnia6 19.7 168 31.0 25.1
Z każdej z 4 - 6 bulw wycinano cztery paski środkowe i smażono je w temperaturze 375°F.
Współczynniki odbicia oznaczano w spektrometrze odbiciowym PHOTOVOLT 577.
3 Paski przygotowywano z bulw wyrosłych na polu, przechowywanych w temperaturze 50°F przez miesiąc i następnie w temperaturze 40°F przez 4 miesiące (przechowywanie w niskiej temperaturze).
4 Paski przygotowywano z bulw wyrosłych na polu, przechowywanych w temperaturze 50°F przez miesiąc, następnie w temperaturze 40°F przez 4 miesiące (przechowywanie w niskiej temperaturze) i rekondycjonowanych w temperaturze 55°F przez 21 dni.
5 Współczynnik odbicia smażonych pasków mierzono osobno dla pasków pobranych z końców bliższych pączków i bliższych łodyg.
6 Średnie wartości dla 22 kontrolnych linii Russet Burbank podano dla porównania
Z powyższego opisu wynika, że niniejszy wynalazek spełnia wszystkie przedstawione cele oraz daje korzyści, które są oczywiste i niepodzielnie związane z wynalazkiem. Jest zrozumiałe, że mogą być stosowane pewne jego cechy i rozwiązania bez odnoszenia się do innych cech i rozwiązań wynalazku. Jest to uwzględnione w zakresie zastrzeżeń. Wynalazek daje wiele możliwości rozwiązań bez odchodzenia od jego zakresu, dlatego jest oczywiste, że wszystko, co zostało przedstawione w opisie i na załączonych rysunkach należy interpretować jako ilustrację a nie jako ograniczenie zakresu wynalazku.
Piśmiennictwo:
Anderson, et al. (1989a) J. Biol Chem. 264 (21): 12238-12242
Anderson, et al. (1989b) First International Symposium on the Molecular Biology of the Potato, Bar Harbor, Maine.
ap Rees, et al. (1988) Symp. Soc. Exp. Biol. 42:377-393.
Baker, S. S., et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:701-713.
Barker, et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2.335-350.
Bevan, et al. (1983) Nature (London) 304:184-187.
Bevan, et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14 (l 1):4625-4638.
Bhave, et al. (1990) Plant Cell 2.581-588.
Bimboim, et al. (1979) Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.
Blennow, et al. (1991) Phytochemistry 30:437-444.
Burton, W. G (1989) The Potato. Longman Scientific and Technical, Harlow, England, pp 365-522
Cattaneo, et al. (1969) Biochem Biophys. Res. Commun. 34 (5):694-701.
Chang, et al. (1978) J. Bactenol. 134:1141-1156.
178 628
Claassen, et al. (1991) Plant Physiol. 95:1243-1249 Coffin, et al. (1987) J. Food Sci. 52:639-645.
Copeland, L. and J. Preiss (1981) Plant Physiol. 68:996-1001.
Coruzzi, et al. (1984) EMBO J. 3(8): 1671-1679.
Creuzet-Sigal, et al. (1972) „Genetic Analysis and Biochemical Characterization of Mutants Impairing Glycogen Metabolism m
Escherichia coli K12” in Biochemistry of the Glycosidic Linkagc An Integrated View, Edited by R. Piras and H. G. Pontis. 647-680. New York: Academic Press Inc
Dickinson, D. B. and J. Preiss (1969) Plant Physiol. 44:1058-1062.
Ditta, et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77, 7347-7351.
Dixon, et al. (1981) Phytochemistry 20:969-972.
du Jardin, P. and Berhm, A. (1991) Plant Mol. Biol. 16'349-351.
Ebbelaar, et al. (1993) Int. Symp. on Gen. Manip. of Plant Metabolism and Growth, 29-31
March, Norwich UK Abstract #9.
Ehrlich, H. A. (1989) Ed. PCR Technology - Principles and Applications for DNA Amplification. Stockton Press, New York.
Fling, et al. (1985) Nucleic Acids Research 13 no. 19, 7095-7106.
Fraley, et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80, 4803-4807.
Fraley, et al (1985) Bio/Technology 3, 629-635.
Frohman, M. A. (1990) In: PCR Protocols. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Snincky, J. J., and White, T. J. eds. Academic Press, San Diego, CA. pp. 28-38.
Frohman, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85'8998-9002 Ghosh, et al. (1966) J. Biol. Chem. 241 (19):4491-4504.
Gilmour, et al. (1992) Plant Mol. Biol. 1813-21.
Hajela, et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252.
Hannapel, D. J. (1990) Plant Physiol. 94:919-925 Hardenburg, et al. (1986) USDA Agric. Handbook No 66, pp 66-68 Haugen, et al (1976) J. Biol. Chem. 251. (24) 7880-7885 Heldt, et al. (1977) Plant Physiol. 59:1146-1155.
Houde, et al. (1992) Plant Physiol. 99(4): 1381-1387.
Huang, R. C., et al. (1987) FED Proc. 46(6) '2238.
Iglesias, et al., (1993) J. Biol. Chem 268:1081-1086.
Jarret, et al. (1980a) Physiol. Plant. 49:177-184.
Jarret, et al. (1980b) J. Atmer. Soc. Hort. Sci. 105:238-242.
Jarret, et al. (1981) In Vitro 17:825-830
Jefferson, et al. 1990. Plant Mol. Biol. 14:995-1006.
Kaiser, W. M. and J. A. Bassham (1979) Plant Physiol. 63:109-113.
Kay, et al. (1987) Science 236:1299-1302.
Koncz, C. and Schell, J. (1986) Mol. Gen. Genet. 204'383-396.
Kossmann et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 230:39-44.
Krishnan. et al. (1986) Plant Physiol 81:642-645.
Kruger, N. J. and Hammond, J. B. W. (1988) Plant Physiol. 86:645-648 Kurkela, et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:137-144 Laemmh, U. K. (1970) Nature (London) 227:680-685.
Leung, et al. (1986) J Bact. 167 (l):82-88.
Lin, et al. (1988a) Plant Physiol. 86:1131-1135.
Lin, et al. (1988b) Plant Physiol. 88:1175-1181 Liu, X. J., et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223:401-406.
Loh, et al. (1989) Science 243.217-220.
Lutcke et al. (1987) EMBO J. 6(l):43-48.
Mignery, et al. (1988) Gene Gene 62:27-44.
Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
178 628
Miner, et al. (1992) J. Neurosci. Res. 33(1):10-18.
Moreli, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:633-637 Moreli, et al. (1987) Plant Physiol, 85:182-187.
Mori et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:18446-18453.
Muller, et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 224.136-146.
Murata, et al. (1992) Nature 356:710-713.
Nakano et al. (1989) J. Biochem. 106:691-695.
Nakata, et al. (1992) J. Cell. Biochem. Suppl. 16F, Abst. Y311, p266.
Nordin, K, et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21:641-653.
Odęli, et al. (1985) Nature 313, 810-812.
Ohta et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225’ 369-378.
Okita, et al. (1990) 93: 785-790.
Olive, et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 525-538.
Plaxton, etal. (1987) Plant Physiol. 83: 105-112.
Preiss, Jack. (1988) „Biosynthesis of Starch and Its Regulation” m The Biochemistry of Plants, Edited by J. Preiss. 184-249. Orlando, FL: Academic Press.
Preiss, et al. (1971) Biochem. Biophys. Res. Comm. 42: 180-186.
Pressey, R. (1966) Arch. Biochem. Biophys. 113: 667-674.
Qoronfleh, et al. (1992) J. Bacteriol. 174(24): 7902-7909.
Rocha-Sosa, et al. (1989) EMBO J. 8(1): 23-29.
Rohde et al. (1990) J. Genet & Breed. 44- 311-315.
Ryall, A. L. and Lipton, W. J. (1979) Vegetables and Melons, Vol. 1. AVI,
Westport, CT, pp 225-230, 272-279.
Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Ed Cold Spring
Harbor Laboratory Press, N. Y
Santanus, et al. (1965) Biochim. Biophys. Acta 102: 39-54.
Shahar etal (1992) Plant Cell 4. 135-147.
Shallenberger, et al. (1959) Agric. and Food Chem 7: 274-277.
Smith-White, B. and J. Preiss (1992) J. Mol. Evol. 34: 449-464.
Solanoubat, M. and G. Belliard (1987) Geneg 60: 47-56.
Solanoubat, M. and G. Belliard (1989) Geneg 84: 181-185.
Sowokinos, J. R., and J. Preiss. (1982) Plant Physiol. 69: 1459-1466.
Stalker, et al (1981) Mol Gen Genet 181, 8-12.
Stiekema et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 255-269.
Stukerlj et al. (1990) Nuci. Acids Res. 18: 46050.
Svab, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530.
Takaha et al. (1993) J. Biol. Chem 26 8- 1391-1396.
Timko, et al (1985) Nature (London) 318’ 579-582.
Tsai, C. Y. and O. E. Nelson. (1966) Science 151: 341-343.
Vasil, V., F. Redway and I. Vasil. (1990) Bio/Technology 8: 429-434.
VanBerkel, J., et al. (1991) Abstract #1576 presented at the International Congress of Plant
Molecular Biology, Tucson, AZ.
van Berkel, J., et al. (1994) Plant Physiol. 104: 445-452.
Von Scheele, C. (1937) Landw Ver Stn 127: 67-96.
Weaver, et al. (1978) Am. Pot. J. 55: 83-93.
White, T. C., et al (1992) Plant Physiol. 99 (Suppl. 1): 78.
Wilhelm, K. S., et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23: 1073-1077.
Wong, et al. (1988) Geneg 68: 193-203.
Yamaguchi-Shinozaki, et al (1993) Mol. Gen. Genet. 238· 331-340.
Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki, K. (1994) The Plant Celi 6’ 251-264.
Yoshida et al. (1992) Geneg 10: 255-259.
Zhu, B., et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21: 729-735.
178 628
WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWA: Monsanto Company (B) ULICA: 800Nor& Lmdbergh (c) MIASTO: St Louis (D) STAN Missouri (E) KRAJ· Słany Zjednoczone Ameryki (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 63167 (G) TELEFON (314) 694-3131 (H) TELEFAKS- (314) 694-5435 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sposób polepszania jakości magazynowanych ziemniaków (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI· 26 (iv) FORMA KOMPUTEROWA:
(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER. zgodny z IBM PC
C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/ MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE Patentin Redease #1 0, weraja #1.25 (EPO) (vi) DANE O POPRZEDNIM ZGŁOSZENIU (Ą) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/000155 (B) DATA ZGŁOSZENIA. 28 maj 1CJ^3 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR: 1: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ :
(B) TYP, , (C) ILOSC NICI:
(D) TOPOLOGIA:
1296 pir zasad kwas nukleinowy dwee Indowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ· CDS LOKALIZACJA 1......1296 (ix) OPIS SEKWENCJI.
SEQEDNR: 1:
ATG GTT AGT TTA Leu GAG Glu 5 AAG Lys AAC Asn GAT Asp CAC TTA AGG TGG Leu CGG Ala GCC Arg AGA Gln 15 TGC Leu 48
Met 1 Val Ser His Leu 10 Met
CCA TTG AAA TCT GTT GCC CTG ATA CTG GCG GGA GGA CGT GGT ACC CGC 96
Pro Leu Lys Ser 20 Val Ala Leu Ile Leu 25 AAs Gly Gly Aat Gly 30 Thr Arg
CTG AAG GAT TTA ACC AAT AAG CGA CAC A?A CGG GCG TAA ACC TCC GCC 144
Leu Lys Asp 35 Leu Thr Asn Lys Arg 40 Ala Lys Pro Ala Val 45 His Phe Gly
GGT AAG TTC CGC ATT ATC GAC TTT GCG CCT TCT AAC TTC ATC AAC TCC 192
Gly Lys 50 Phe Arg Ile Ile Asp 55 Phe Ala Llu Ser Asn 60 CCS Ile Asn Ser
178 628
GGG Gly 65 ATC Ile CGT CGT ATG Met (G3C Gly 70 GTG Val ATC AGC CAG TAC (CAG Gln TCC Ser CAC ACT CTG Leu 80 240
Arg TArg Ile Thh Gln 75 His Thr
GTG CAG CAC ATT CAG CGC GGC TGG TTC TTC TTC .GCT gaa GAG ATG AAC 2(08
Val Gln His Ile Gln 85 .Arcg Gly TTr? Ssr Phe 90 Phe Asn Glu Glu Met 95 Asn
GAG TTT GTC GAT CTG CTG CCA GCA CAG CAG AGA ATG AAA GGG GAA AAC 336
Glu Phe Val Asp 100 Leu Leu Pro Ala Gln 105 Gln Arg Met Lys Gly 110 Glu Asn
TGG TAT CGC <G5C ACC GCA GAT GCG GGC ACC CAA AAC CTC GAC ATT ATC 384
Trp Tyr Arg 115 Gly TTuo Ala Asp Ala 110 Val Thr Gln Asn Leu 125 Asp litr Ile
CGT CGT TATA TAAC GCG GAT TAC GTG GTC ATC CTG GCG GGC GAC CAT ATC 432
Arg Arg 130 Tyr Lys Ala Glu Tyr 115 Val Va^l Ile Leu Ala 140 Gly Asp His Ile
TAC AAG CCC GAC TAC TCG CGT ATG CCT ATC GAT CAC GTC GAA AAA GGT 400
Tyr 145 Lys Gln Asp Tyr Ser 150 .Arg Met Llu Ile Asp 155 His Val Glu Lys Gly 160
GTA CGT TGT ACC GTT GTT TGT ATG cca GTA CCG ATT GAA GAA GCC TCC 520
Val Arg Cys Thr Val 165 Val Cys Met Ppo Val 1-70 Pro Ile Glu Glu Ala 175 Ser
GCA TTT GGC GTT ATG GCG GTT GAT GAG AAC GAT AAA ACT ATC GAA TTC 576
Ala Phe Gly Val 180 Met Ala Val Asp du 185 Asn Asp Lys Thr He 190 Glu Phe
GTG GAA A.AA CCT GCT ACC CCG CCG TTC ATG CCG .AAC GAT CCG AGC AAA 624
Val Glu Lys 195 Pro Ala Asn Pro Pro 2(30 Ssu Met Pro Asn Asp 205 Pro Ser Lys
TCT CTG GCG AGT ATG GGT ATC TAC GGT ttt GAC GCC GAC TAT CTG TAT 672
Ser Leu 210 Ala Ser Met Gly 11 es 215 Tyr Val Phe Asp Ala 220 Asp Tyr Leu Tyr
GAA CTG CTG GAC GAC GAC GAT CGC GGG GAG TGGC TCC AGC CAC GAC TTT 720
Glu 225 Leu Leu Glu Glu Asp 230 Asp Arg Asp Glu Asn 2315 Ser Ser His Asp Phe 240
GGC AAA GATA TTG ATT CCC AAG ATC AGC GAC GCC GGT CTG GCC TAT GCG 768
Gly Lys Asp Leu Ile 245 Pro Lys Uli TTlh Glu 250 Ala Gly Leu Ala Tyr 255 Ala
CAC CCG TTC CCG CTC TCT TGC GTA CCA TCC GAC CCG GAT GCC GAG CCG 816
His Pro Phe Pro 260 Leu Ser Cys Val dm 265 Ser Asp Pro Asp Ala 270 Glu Pro
TAC TGG CGC GAT GTG GGT ACG CTG GAG GCT TAC TCGS AAA GCG AAC CTC 864
Tyr Trp Arg 275 Asp Val Gly Thr Leu 220 GGu Ala Tyr Trp Lys 2(05 Ala Asn Leu
GAT CTG GCC TCT GTG GTG CCG .AAT CCT GAT I^TG TAC GAT CGC AAT TGG 912
Asp Leu 290 Ala Ser Val Val Pro 225 Lls Llu Asp Met Tyr 300 Asp Arg Asn Trp
CCA ATT CGC ACC TAC ATT G.AA TCA TTA CCG CCA GCG AAA TTC GTG CAG 960
Pro 305 Ile Arg Thr Tyr Asn 330 Glu Ssr Llu Pro Pro 315 Al a Lys Phe Val Gln 320
178 628
GAT CGC TCC GGT AGC JCAC (CC ATT Ser His Gly Met 325 ACC CTT JTC TTA CCG GCT TCC CCC Gly 1008
Asp Arg Ser Gly Thr- Leu 3350 Asn Jer Leu Vv1 Ter 335
GGT TGT gtg T^TC TCC (TCT TCG GTG gtg GTG CCG TCC TCC CCT TTC TCG 1056
Gly Cys Val 11 es Ser Gly See Vvl Val Val Gln Ter Vvl Llu Phe Ser
340 345 330
CGC GTT CGC GTC JGAT TCA TTC TGC JGAC ATT GAT TTC GCC GTA TTG TTA 1104
Arg Val Ar g Val Asn Ser Phe Cys Asn 11 β Asp Tee AAu Val Leu Leu
355 360 365
CCG GAA GTA TtTC GTA (TCT CGC TK- ttcc JTCT CTG CCC CCC TGC GTC ATC 1152
Pro Glu Val Tir? Val Gly JAg See Cys JAg Llu JAg JAg Cy£i Val Ile
370 375 380
GAT CGT GCT TGT GCT ATT CCG GGA GGC ATG GCTC ATT GGT GCA JT^C CCA 1200
Asp Arg Ala <yys Val Ile Pro Glu Gly Met Vvl I1u Gly Glu Asn Ala
385 390 395 400
GAG GAA GAT CGT (TCT TTC TAT CGT TCA GCA TCT (TCC ATC GTG CTG 1248
Glu Glu Asp Ala Arg JAg Phe Ttyr (Ag Ser Glu Glu Gly Ilu Val Leu
405 410 41 ii
GTA ACG CGC <3GAA ATG CTA CGG JGCG TTA ictc CCT JTTA CAG GAG CGA TTG 1296
Val Thr Arg Glu Met Leu (Ag Lys Leu Gly His Lys Gln Glu Arg
420 445 440
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR; 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : 43 1 MEńnolwaaóów (3) TYP: mnnolóvasóva (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ED NR· 2.
Met 1 Val Ser Leu Glu 5 Lys Asn Asp His Leu 10 Met Leu Ala Arg Gln 15 Leu
Pro Leu Lls eer 20 Val Ala Leu Ile Leu 25 Ala Gly Gly Arg Gly 30 Thr Arg
Leu Lys Asp 35 Leu Thr Asn Lys Arg 40 Ala Lys Pro Ala Val 45 His Phe Cly
Gly Lys 50 Phe Arg Ile Ile Asa» 55 Phh Ala Gua SeL Ain 60 eer Ily Asn Ser
Cly Ile Arg Arg eet Gly Val I 1u Thr Tin Tyc n In Tyr U1s rhr Leu
-70 75 80
Val Cln His 1le Gln 85‘ Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Guu Met Gin
90 95
Clu Phe Val Asp Leu Leu Pro Ala Gln Cln Arg Met Lys Gly Glu Asn
100 105 110
Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gln Asn Leu Asp Ile Ile 115 120 125
178 628
Arg Arg 130 Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val 135 IIe Leu Ala Gly Asp 140 His Ile
Tyr Lys Gln Asp Tyr Ser Arg Met Leu lee Asp His Val Glu Lye Gly
145 150 155 160
Val Arg Cys Thr Val Val Cys Met Pro Val Pro Ile Glu Glu Ala Ser
165 170 175
Ala Phe Gly Val Met AHa Val Asp Glu Asn Asp Lys Thr Ile Glu Phe
180 185 190
Val Glu Lls Pro Ala Asn Pro Pro Ser Aet Pro Asn Assp Pro Ser Lys
195 200 205
Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Asp Ala Asp eTyiA Leu eTyr
210 215 2220
Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe
225 230 223 5 2-40
Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala
245 250 255
His Pro PPh Pro Leu Ser Cys Val Gln Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro
260 265 270
Tyr Trp Arr Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu
275 280 285
Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Lye Leu Asp Aet lyr Asp Arg Asn Tirą
290 295 300
Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu P ro Pro Ala Lys Phe Val Gln
305 310 335 320
Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Gly
325 330 335
Gly Cys Val Ile Ser Gly Ser Val Val Val Gln Ser Val Leu Phe Ser
340 335 350
Arg Val A^ Val Asv ler Ahn CyS Asn lls sap e er Al.a Val Aeu Leu
355 360 335
Pro Glu Val Trp Val Gly Arg Ser Cys AA-g Leu Arg Arg Cys Val Ile
370 375 380
Asp Arg Ala Cys Val Ile Pro Glu Gly Met Val Ile Gly Glu Asn Ala
385 390 335 400
Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Ser du Glu Gly Ile Val Leu
405 411 415
Val Thr A^ Glu MeG ueu Arg Lys Laa Lls euG lys His Glu Arg
420
445
430 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ (B) TYP; .
(c) ILOŚĆ NICI. (D) TOPOLOGIA:
1296 par zasad kwas nukleinowy dwie lmiowa
178 628 (ϋ) TYP CZĄSTECZKI: DNA(genomowy) (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ (B) lokalizacja.
CDS
1296 (ix) OPIS SEKWENCJI:
SEQ ID NR: 3'
CGC CGG AGT TTA GCC CCC ccc: AAT CCC HA
eut 5 ail Ser Leu Glu 5 Lyy Asn Asp His Ceu H
GGC dC AAA TCT GCT GCC CTG ATA CCG
roo yuu Lys Ser 20 Val Alu Leu Ilu Lyu 22 CLLa
CGC CU GAT TTA ACC CCT CAG CCC GCA CCA
yuu Lys Asp 05 Leu The Asn Lys h g 40 Alu CyT
CCG CU TTC CGC ATT ATC GAC TTT GCC CCG
dy Lys 50 Phe iCrg Ilu Ilu Asp 55 Phe Ail Leu
CCC CGC CGT CGT ATG ggc: GTG ATC ACC CU
Cly 65 llu Arg Arg Met Gly 70 Val Ile: The GCu
CGC CU CAC ATT CAG CCC GGC AGC TCA TGC
ail Cln His Ile Gln 85 Arg Gly Trp Sei: pre 90
CCC GGG GTC CAT CTG CCG CCA GCA CU Ci^i;
Clu reu Val Asp 500 Leu Lyu Pro Ala GCu 1(J0 dn
GCC GCG CGC GGC ACC GCA GAT GCG GTC ACC
Gop Gyo Arg 555 Giy Thr Ala Asp Ala 150 Val TGe
CCG CCG TAT GCCC GCC GCA TAC GTG GCG ACC
Cog Cog 500 Tyr Lys Ala GCu Tyr 155. Val Val Ilu
GCC CU CTCC GAC TAC TCC CGT ATG CCG ACC
Gyo 545 Lys Gln Asp Tyr Ser 150 Arg Met Leu Ilu
CGC CCG TGT? ACC GTT GTT TGT ATG CCC Gd
ail Cog Cys Th r Val 565 Val Ccs Met Pro Val 157
CCC GGG GGC GTT ATG GCG GTT GAT GCC CCC
Cli reu Gly Val 580 Met Ala Val Asp GCu 155 Asn
CGC CCC AAA CCT GCC’ CCC CCG CCG TCA ACG
ail du Lys 505 Pro Ala Asn Pro Pro 200 Se^r Meu
GCG CGC GCG AGT ATG GGT ATC TAC GCC TTT
eto yuu 250 Ala Ser Meu Gly Hu 225 Tyr Val pre
CCG TTG GCG CGC CAG CTG 48
Met Leu Ala CCg Gln Leu
CGC GGA CG^T CGT ACC CGC 96
CCy Gly hg Gly Thr Arg
CCG GCC GTA CAC TTC GGC 1-44
Aro Ala Val His Phe Gly
CGT MAC TGC ATC CCCC TCC 1592
Set Asn Ces Ile Asn Ser
CGC CC^tG TCC CAC ACT CTC^CG 240
CGr Gln Ser His Tłiio Leu
80
CGG ClAT GCA GAA ATG CCCC 288
Cre Asn GGu Glu Met Asn
CGA ATG JCA GGG GAA CCCC 006
CiO Met Lys Gly Glu Asn
150
CCA AAC CTC GAC ATT ATC 384
CGn Asn Leu Asp Ile Ile
125
CCG GCG GGC GAC CAT ATC 402
Cyu Ala GGy Asp His Ile
140
CCC CAC GTC GAA CCCC GGT 480
Cep His Val Glu Lys Gly 155 160
SCC ATT GAA GAA GCC TCC 528
Cro Ile GGu Glu Ala Ser
1055
CCC CHA ACT ATC GGCC TTC 576
Aip Lys Thr Ile Glu Phe
100
CCC CAC GAT CCG AGC AHC 624
Pro Asn Asp Pro Ser Lys
205
CCC GCC GAC TAT CTG TAT 672
Cis Ala Asp Tyr Leu Tyr
220
178 628
GAA Glu 225 CTG Leu CTG GGA GGA GAC GAT CGC Gi^T GAG GAC TCC AGC CAC HHs GAC GAp TTT Phe 240 720
Leu Glu Glu Asp Asp Arg 230 Asp du Asn 235 Seu Geu
GGC AAA GAT TTG ATT CCC GAG AAC GLC2C GGA GCC dG GCG GGC GCG 768
Gly Lys Asp Leu 11 e Pro Lys Ile TGh dl Ala dy Geu Ala ^T^sr Ala
245 250 255
CAC CCG TTC CCC^CS CTC TCT tgc GG^A CCA GTC GAC ccc; GGC ^AG CCG 816
His Pro Phe Pro Leu Ser gcs vvi ^Gn Seu Asp Ppg Asp GGu du Pro
260 265 270
TAC TGG CGC CGG^A? GTG GGGT ACG CCT GGA GGC TAC ttg GTA GGA GAC CTC 864
Tyr Trp Arg Val Gly TTh: Leu du GGu. Tyr TTg» GlS GGu GAn Leu
275 280 285
GAT CTG GCC TCT GIG GTG CCG GGA CGO ATG TTG GAT GCG GAG TGG 912
Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Gil Geu Arp Ge^^ Tts GAp GAg Asn Trp
290 295 300
CCA ATT CGC ACC TAC GAT GGA TTA TTA GCA CCA GCG GTA TTT cag 960
Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Seu Leu Ghr Pro Ala Lys PPh Vvl Gln
305 310 315 320
GAT CGC TCC GGT AGC CAC GGG AGO AAC GAT GAC TCA CTG GTT TCC GAC 1008
Asp Arg Ser Gly Ser HlS Gly Meu TTh Geu Asn Seu Leu Vvl Geu Asp
325 330 335
GGT TGT GTG ATC TCC GGT TCG GGT TTG CAG TCC GTT cct; TTC TCG 1056
Gly Cys Val I Ie- Ser Gly Ser Vvl Vvl Gvl Gln Seu Val Leu Phe Ser
340 345 350
CGC GTT CGC GTG GAT TCA TTC TTO GAC GTT GAT ttc GCC GTA TGG TTA 1104
Arg Val Arg Val Asn Ser Phe Ccs Gas GIu Asp Seu Ala Vvl Geu Leu
355 360 365
CCG GAA GTA TGG GTA GGT CCC TTC TTG SCT CTG CCG CCC TTG TGG ATC 1152
Pro Glu Val Tr p Val Gly Arg Seu Ccs SAg Leu Arg GAg Ccs Gvl Ile
370 335 330
GAT CGT GCT TGT GTT ATT CCG GGA Gd STT GTG ATT GGT GGA GAC GCT 1200
Asp Arg Ala Cys Val 11 e Pito dl dl Meu Val Hu Gly du Asn Ala
385 390 395 400
GAG GAA GAT GCA CGT CGT TTC TT^G CCT GCA GAA GGA GGC ATC GGG CTG 1248
Glu Glu Asp Ala Arg Arg Phe Tts ATg Ser Glu GGu dy Illi Vvl Leu
405 410 415
GTA ACG CGC GGA ATG CTA CCG AA^^ ΤΤΛ GGG CAT AGA GAG GG^G CGH taa 1296
Val Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu du His Lys Gln du Arg
420 425 430
(2) INCOSRMCCAO SEKKTKRCI SEQ ID NR: 4.
(i) CHCRCKTKRYETYKC SKKWKRCA (C) DŁUGSSC :
(B) TYP (D) TSPSLSGIC; (ii) TYP CZĄETKCZKI: (xi) SPIE EKKWKRCIS:
431 aminokwasów amwokwasowa liniowa białko
SEQ ED NIL 4.
178 628
Met 1 Val Ser Leu Glu Lys Asn Asp His Leu Met Leu Ala Arg Gln Leu
5 10 15
Pro Leu Lys Ser Val Ala Leu Ile Leu Ala Gly Gly Arg Gly Thr Arg
20 25 30
Leu Lys A3p Leu Thr Asn Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val His Phe Gly
35 40 45
Gly Lys Phe Arg Ile Ile Asp Phe Ala Leu Ser Asn Cys Ile Asn Ser
50 55 60
Gly Ile Arg Arg Met Gly Val Ile Thr Gln Tyr Gln Ser His Thr Leu
65 70 75 80
Val Gln His Ile Gln Arg Gly Trp Ser Phe Phe Asn Glu Glu Met Asn
85 90 95
Glu Phe Val Asp Leu Leu Pro Ala Gln Gln Arg Met Lys Gly Glu Asn
100 105 110
Trp Tyr Arg Gly Thr Ala Asp Ala Val Thr Gln Asn Leu Asp Ile Ile
115 120 125
Arg Arg Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Val Ile Leu Ala Gly Asp His Ile
130 135 140
Tyr Lys Gln Asp Tyr Ser Arg Met Leu Ile Asp His Val Glu Lys Gly
145 150 155 160
Val Arg Cys Thr Val Val Cys Met Pro Val Pro Ile Glu Glu Ala Ser
165 170 175
Ala Phe Gly Val Met Ala Val Asp Glu Asn Asp Lys Thr Ile Glu Phe
180 185 190
Val Glu Lys Pro Ala Asn Pro Pro Ser Met Pro Asn Asp Pro Ser Lys
195 200 205
Ser Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Asp Ala Asp Tyr Leu Tyr
210 215 220
Glu Leu Leu Glu Glu Asp Asp Arg Asp Glu Asn Ser Ser His Asp Phe
225 230 235 240
Gly Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ile Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ala
245 250 255
His Pro Phe Pro Leu Ser Cys Val Gln Ser Asp Pro Asp Ala Glu Pro
260 265 270
Tyr Trp Arg Asp Val Gly Thr Leu Glu Ala Tyr Trp Lys Ala Asn Leu
275 280 285
Asp Leu Ala Ser Val Val Pro Glu Leu Asp Met Tyr Asp Arg Asn Trp
290 295 300
Pro Ile Arg Thr Tyr Asn Glu Ser Leu Pro Pro Ala Lys Phe Val Gln
305 310 315 320
Asp Arg Ser Gly Ser His Gly Met Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Asp
325 330 335
178 628
Gly Cys Val Ile 340 Ser Gly Ser Val Val 345 Val Gln
Arg Val Arg 355 Val Asn Ser Phe Cys 360 Asn Ile Asp
Pro Glu 370 Val Trp Val Gly Arg 375 Ser Cys Arg Leu
Asp 385 Arg Ala Cys Val Ile 390 Pro Glu Gly Met Val 395
Glu Glu Asp Ala Arg 405 Arg Phe Tyr Arg Ser 410 Glu
Val Thr Arg Glu Met Leu Arg Lys Leu Gly His
420 425
Ser Val Leu Phe Ser 350
Ser Ala Val Leu Leu 365
Arg Arg Cys Val Ile 380
Ile Gly Glu Asn Ala 400
Glu Gly Ile Val Leu 415
Lys Gln Glu Arg 430 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI
DŁUGOŚĆ TYP, ,
ILOSC NICI: TOPOLOGIA
355 par zasad kwas nukleinowy dwie liniowa (u) TYP CZĄSTECZKI. DNA (genomowy) (tt) CECHA (A) NAZWA/KLUCZ:
(B) LOKALIZACJA
CDS
88.......354 (ix) OPIS SEKWENCJI.
SEQ ID NR: 5
AAGCTTGTTC TCATTGTTGT TATCATTATA TATAGATGAC CAAAGCACTA GACCAAACCT 60
CAGTCACACA AAGAGTAAAG AAGAACA ATG GCT TCC TCT ATG CTC TCT TCC 111
Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser
5
GCT Ala ACT ATG GTT Val GCC TCT CCG GCT CAG Pro Ala Gln 15 GCC Ala ACT Thr ATG Met 20 GTC GCT CCT TTC Phe 159
Thr 10 Met Ala Ser Val Ala Pro
AAC GGA CTT AAG TCC TCC GCT GCC TTC CCA GCC ACC CGC AAG GCT AAC 207
Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn
25 30 35 40
AAC GAC ATT ACT TCC ATC ACA AGC AAC GGC GGA AGA GTT AAC TGC ATG 255
Asn Asp Ile Thr Ser Ile Thr Ser Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met
45 50 55
178 628
CAG Gln GTG Val TGG CCT CCG AAT CHA AAG A3AG JAAG Lys CTT GAG AAT CTC TCT TAC 303
Trp Pro Pro 60 IIu Gly Lys Lys 65 Pili* Gto Thr Leu 70 Ser hyr
CTT CCT GAC (TtTT ACC GAA TCC GGT GGT CGC GTC /AC TGC ATG CCG GCC 351
Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala
75 80 85
ATG G 355
Aet
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR. 6(i) charakterystyka sekwencji Ą) DŁUGOŚĆ : k) TYP:
(D) TOPOLOGA:: (il) TYP CZĄSTECZKI: (xi) OPIS SEKWENCJI:
aminokwasów ammolwasjowa liniowa białko
SEQ ID NR: 6:
Aut 1 Ala Ser Ser Met 5 Leu SSr Ser Ala Thr Aet Val Ala Ser Pro Ala
10 15
Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Uuu Lys Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp Ilu Thr Ser Ile Thr Ser
35 40 45
Asn Gly Gly Arg Val Asn Cci Aet Gln Val Trp Pro Pro Ile Gly Lys
50 55 60
Lys Lys Phe Glu hhr Luu Sua hyr Leu Pro Asp Uuu ThA Asp Ser Gly
65 70 75 80
Gly Arg Val Asn Cys Aut Gln Ala Aet
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR. 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA sekwencji (Ą) DŁUGOŚĆ :
(B) TYP, (C) ILOŚĆ NICI.
(D) TOPOLOGIA
1575 par zasad kwas nukleinowy dwie tonowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ.
BOKALIZACJA.
CDS
3......1565
178 628 (ix) OPIS SEKWENCJI SEQ ID NR 7.
CC ATG GCG GCT TCC ATT GGA GCC CCA AAT TCT CCT T CT CTC ATC C4
Met Ala Ala Ser Ile Gly Ala Leu Lys Ser Ser Pro Ser Ser Asn
1 5 11 15
AAT TGC AAT AAT GAG AGA AGA AAT GAT TCT ACA CGT G]AΓ GTA TCC AGC 95
Asn Cys Ile Asn Glu Arg Arg Asn Asp Ser TTh cap Ala Val Ser Ser
20 22 30
AGA AAT CTC TCA TTT TCG TCT TCT CAT CCTC GGC CGA GAC CATG TTG ATG 143
Arg Asn Leu Ser Phiu Ser Ser Ser His Leu ATa Gly Asp Lys Leu Met
05 40 44
CCT GTA TCG TCC TTA CGT TCC CCTA (GGA GTC CCG TTC (ATT GTG AGA AGA 191
Pro Val Ser Ser Leu CCrg Ser Gln Gly Val aao PPh Asn Val Arg Arg
50 55 60
AGT CCA ATG ATT GTG TCG CCA AAG GCT GTT TAC AAT TCG CAG AAT TCA 239
Ser Pro Met; Ile Val Ser Pro Lys Ala Val Ser· Asp Ser Gln Asn Ser
65 70 75
CAG ACA TGT CTA GAC CCA GAT GCT AGC CCG ATG AGT TTG GGA ATT ATT 287
Gln Thr Cys Leu Asp Pro Asp Ala Ser CArg Seu Val Leu Gly 11 e Ile
80 85 90 95
CTT GGA GGT GGA GCT (cc:ϊ ACC CGA CTT TAA CCT ACT ACT CAAr CAAr AGA 3Α3Ϊ5
Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu TTr Ppo Aeu Thr Lys Lys Arg
100 115 110
GCA AAG CCA GCT GTT CCA CTT GGA GCA AAA GTC CCG CTG ATT gac ATT 383
Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu Gly Ala Am CTy AA ρ Aeu Ile Asp Ile
115 112 115
CCT GTA AGC ccrc TGC TTG cctc AGT CC\T AAA TTC AAC ATT tat GTT CTC 431
Pro Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Asn Ile Cer Ces Cle Tyr Val Leu
100 115 114
ACA CAA TTC cctc TCT GCC TCT CTG CTtT CCG CCT: CCT TCA CGA GCA TAT 479
Thr Gln Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn AAp Hii Aeu Cer Arg Ala Tyr
145 110 155
GCT AGC AAC ATG GGA GGA TAC CTtC CGA CGG ATT AGA GGAT GTT CTT 557
Ala Ser Asn Met Gly Gly Tyr Lys Ans CGe CGe CPh Cal Glu Val Leu
160 166 170 115
GCT GCT CCCT CCC^ AGT CCA GAG cctc CCC GGA CTG CTT AAC GGC ACG GCT 555>
Ala Ala Gln Gln Ser Pro Glu Asn Pio CAp Cap CPh AGe Gly Thr Ala
180 118 110
GAT GCT GTC AGA CAA TAT CTG TGG TTT ctt CGC CGC CCC ACT GTT CTT 663
Asp Ala Val Arg Gln T's Lee Trp Le^u CPh CGe CGe Cii TTr Val Leu
195 220 22E>
178 628
GAA TAC Glu Tyr CIC? ATT. CTT GCC IGA CGA GGS HHi CTG (T^T CCG. AST CGA ATS GAA 671
Leu 210 II u Lue AAa dy Css 215 Leu T^r Asg Gee Ass 222 Gyr Glu
AAG TTT ATS? CAAA GCC CAC aga IGA ACA GAT G(GT GGA AST AAC OT GCC 719
Lys Phe Ile Gln AAa HHi (Ag Hu TTh Asp Ala Asf) AIu ITh Cal (Gla
225 220 235
GCA CTG CCA AST GAC GAG AAG ICG GGC ACT G<GA TTT CGG CCT CAT CAG 767
Ala Leu Pro Met Asp du Aus (Gsg ASa Thr Al ił PPh Hy Cue Cee Lys
240 225 2150 255
ATT GAC GJGA GAAG TCA CGC AGAT AST? GGA. ATT GCS GGA CAAA CCG AGA! AHA 815
Ile Asp Glu Glu GG.y Asg CIe CIe du Phe Ala de Cus Ipo dn Gly
260 265 220
GAG CAA TTG CAAG GGCG ATC AAA CTC GGA ACT ACC AST TTA AGT CGT GAT 863
Glu Gln Leu Gln Ala Met Lu' Val Ass Thr Thr Ile Leu de Cue Asp
275 280 285
GAC AAG AGA GCT AAA. GGAA ATC CCT TTT ATT GCC AST ATG TCT ATA TAT 911
Asp Lys Arg Ala Lys Glu Met Pro A»Ph Ile Ala Sse Met de IIu Tyr
290 295 300
GTC ATT AGC CAAG GAC GTG ATG TTA (AC CTA CTT CCG GAC ASA AT?C AACT 959
Val Ile Ser Lys Asp Val Met Lue Asn Leu Leu Aa- Asp Lus PPe Pro
305 310 315
GGG GCC AAT ?GA^G? TTT GGT AkA5^ GGAG GTT ATT CCT GGG GCAA AST TCA CTT 1007
Gly Ala Asn Asp Phe Gly Ser Hu (al Ile Pro Gly Ala TTr Ssu Leu
320 325 330 335
GGG ATG AGA GTG CAAA GCT TAT TTA TTA GAT GGG TTS ATG GAA GAT ATT 1055
Gly Met Arg Val Gln Ala Tys Luu ATrs Asp Gly Tyr Trp du Asp Ile
340 345 330
GGT ACC ATT GGAA GCT TTC TAC (SGT GCC AAT TTG GGC ATT ACA (AA AAG 1103
Gly Thr Ile Glu Ala PPe Tys Asn ASa Asn Leu Gly IIa ΤΤτ Lus Lys
355 336 365
CCG GTG CCA GAT TTT AGC TTT TTC GGA CGA TCA TCC CCA AAC TTC ACC 1151
Pro aal Pro Asp Phe Ssr PPh Tys Asp Arg Ser ASa Ppo AIu Tys Thr
370 375 330
CAA CCT CGA TAT CTA CCA CCA TCA ASA ATG CTT GGA ICC CAT GTC ACA 1199
Gln Pro Ar ej Tyr Leu A^jtjo Ppo Ssr Ly Met Leu Asp Ala Asp Val Thr
385 330 395
GAT AGT GTC ATT GGT GGAG GGT ATG AGT ATC AAG AAA ATG AAA CTT CAT 1247
Asp Ser Val Ile Gly Hu Hu Cc' Val Ale Lys Asn ces Cys AIu His
400 445 410 415
CAT TCC GTG GTT GGA CTC AGA TTA TTG ATA TCA GAA AGA ACA ATT ATA 1295
His Ser Val Val Gly Leu Arg Isr Ces Ile Ser du dy AAa IIu Ile
420 425 430
178 628
GAA TAC TCA Chh GTT ATG CTT GCA Ala GAT TAC GAG GAG Glu AAC? GAT GCT TGh Asp Ala 445 GAC Asp
Glu Asp Ser Leu Uru Met Gly Asp Tyr 440 TyA
435
ATT aat TTG CTG GCG GTCA jaag GGC AGT GTC CCA ATG GGC ATC GTC CAAG
Arg Lys Leu Ueu Ala Ala Lul Gly Ser Val Pro Ilu Gly GIe Gly Lul
450 455 460
AAG GTG (CAC AGT AAA AGA GCC ATT ATC GAC AAG AAG GCC gct ATA GTG
Asn Cys His Ile Lys JAg Ala Ile Ile Asp Uys Asn AGu CAA GIe Gly
465 470 475
GAC AAT GTG» AAG AGC ACT caac AAA GAC CAAC GGT CAA GCAr GCC GTC AAU
Asp Asn Val Lys Ile IIu Asn Lys Asp Asn Val Gin Glu Ale. Ala caa
480 485 400 405
GAA ACA GAA GGA TAC CTC ATC AAC» AGT GCTT AGG GGC AAC GTG ATC AAG
Clu hhr Arp Gly Tyr PPh GIe Lys Ser Gly Ilu ViU TGh Gv1 H.e Gul
500 505 510
TAG TCG TTG agg CCA att TTA ATC ATC ATC TGATGAGCTC
Asp Ala Luu Ile Pao Srr Gly Ile Ile Ile
515 520
13343
13391
1439
1487
1535
TC7C (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : 521 aminokwasów
TYP: anonoawiowwa
TOPOLOGIA; Uo^c^wa (ii) TYP CZĄSTECZKI: biaHm (xi) OPIS SEKWENCJI; SEQ ID NR: 8:
Aet Ala AAu Sua ll e ll e m e Uli Ls e Ur g Ure Ar e Ure Ure ss e s.sn 15 10 15
Cys Ile Asn GUl Arg Arg Asn Asp Ser hhr Arg Ala Val Ser Ser Arg 20 25 30
Asn Lru Ser Phe Ser Ser Ser His Leu Ala Gly Asp Lys Leu Met Pro 35 40 45
Val Sur Ser Leu Arg Ser Gln Gly Val Arg PPh Asn Val Arg Arg Ser 50 55 66
Pro Aut Ile Val Ser Pro Lys Ala Val Ser Asp Ser Gin Asn Ser Gln 65 70 77 80 hhr Cys Leu Asp Pro Asp Ala Sur Arg Ser Vv1 Leu Gly Ile Ile Leu 85 90 95
Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Luu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys Arg Ala 100 H5 no
178 628
Lys Pro Tla Vil Pro Leu Gly Ala 110 Gsn Tyr Grg Leu Ile 125 Asp Ile Pro
115
Val Sur Asn Cys Leu Asn S^r Am He See TLS I In Ter Mv1 Leu Thr
130 113 140
Cln Phe Asn Ser Ala Ser Leu Am Arg His Llu Ser Arg Ala I^r Ala
145 HO 115 160
Ser Tsn Met Gly Gly TTr Lys Asn Glu Cly Ptn Val Glu Val Leu Ala
165 110 175
Tla Gln Gln Ser Pro Glu Asn Pro Asp Ttrp Phe Gln Gly Thr Ala Asp
180 118 190
Ala Val iAg Gln Cy^r Leu Trp Leu PPe Glu Glu His Thr Val Leu Glu
195 200 205
Tyr Leu Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Tts ju— MeU AGP Tts· Glu Lys
210 215 220
Phe Ile Gln Ala His Arg Glu Thr Asp Ala Asp Ile Thn Val Ala Ala
225 230 223 240
Leu Pro Met Asp Glu Lys Grg Ala Thr Ala Ptn Gly Leu Met Lys Ile
245 220 255
Gip Clu Glu Gly Arg Ile Ile Glu Phh Ala Glu Lys Pro Gln Gly Glu
260 265 270
Cln Leu Gln Ala Met Lys Val Asp Thr Thr Ile Leu Gly Leu Asp Asp
275 280 285
Lys Grg Ala Lys Glu Met Pro Phe Ile Alu Ter MeU Gln IIn Tyr Val
290 295 300
Ile Ser Lys Asp Vćl1 Met Leu Asn Leu Leu Arg Asp Lys Phu Pro Gly
305 310 335 320
Tla Gsn Asp Phe Gly Ser GLu Vćl1 Ile Pro Glu Ala Thr Sur Leu Gly
325 330 335
Mut Grg Val Gln Ala Tyr Leu Tyr Asp Gly Tyr Trp Glu Asp Ile GLy
340 335 350
Thr Ile Glu Ala Phe Tyr Asn Ala Asn Leu GLy Ile Thr Lys Lys Pro
355 3(30 365
Val Pro Asp Phe Ser Phe Tyr Gsp Arg Ssu Ala Ppo IIn Tyr Thn GLn
370 375 380
Pro Grg Tyr Leu Pro Pro Sun Lys Met Leu Asp Ala Asp Val Thn Asp
385 390 3^^ 400
Ser Val ILu Cly Clu CLy Cys VaL ILu Lys Gm Cys Lys ILe His His
405 410 415
178 628
euo ail Val GCy ^ey Aio 420 euo Ctys Ilu Suo 422 Clu dy Aia Ile 430 Ile Glu
Csp euo Leu Lyu Cee tCu Cli Asp Tyr Gyo Clu Thr Asp Ala Asp Aog
405 440 445
Lys yuu Leu Aia Ala yys Gly Ser Val Pro lle dy Ile Gly Lys Asn
450 455 460
Cys iss Ile LyS Arg Cli Ile Ile Asp Lys Asn Cli Arg Ile Gly Asp
465 470 475 480
Csn ail Lys Ile Ile Csn Lys Asp Asn Val Cln du Ala Ala Arg Glu
485 400 405
Geo Csp Gly Τ’Τ Che ule yys Ser Gly llu Val Gto VaC Ile Lys Asp
500 55)^ 5L0
Cli yuu Ile Pro Cer Gly llu Ile Ile
555 520
(2) IFNOORMACA O SEKKWNCJJ SEQ ID NR: 9.
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : 1519 par Msad (B) TYP, , ‘ ' (C) ILOŚĆ NICI:
(D) TOPOLOGIA:
kwas nukleinowy <hvie ińnowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:
(B) LOKALIZACJA: (ix) OPIS SEKWENCJI:
CDS
1410
SEQ ID NR: 9:
CCC CCC ATC CCCC CCT GGG GTT GCT TGC Ct:T GTG ATC ACT ACT GAA ZClT 4(8
Csn yys Ile Lys Pro Gly Val Ala Τ’τ Ssr Val Ile Thr Thr Glu Asn
5 5 50 55
CCC CCC CAG ACT GTG TTC GTA GCT AC! CCA CGT CTT GAG AGA CGC CGG 96
Csp Geo Gln Thr Val Phe Vai Asp Meu Cro Arg Leu Glu Arg Arg Arg
20 25 00
CCC CCG CCA ACCG GAT GTG GCT GCA GTC UG CTG GGA GGA GGA GAA GGG 144
Cli Csn Pro Lys Asp Val Ala Ala Vai Hu Leu Gly Gly Gly Glu Gly
05 40 45
CCC CCC HA IGC CCA CGG ACA CCG AGA ACT GCA ACC CCT GCT GTT CCC 192
Geo yys Leu reu Pro yuu Thr euo Arg Thr Ala T’r Pro Ala Vai Pro
555
178 628
TGG Val 65 TTG GGTG TGC CyS tac aat; CCA ATA GAC ATC CGCA ATG AGC GAG TGT ATC 240
Cly Gly Tyr Arg 70 Luu Ile Asp IIe Pro 75 Met S^r Asn Cyi Ilu 80
AAC GTG GCT ATT CAAC CAG AAT· TTT GTG ctg AACA CAG TAA CAT ttc· TCG 288
Asn SUA Ala Ile Asn Lys IIe Phe Val Luu TThA Gln Tir Arn Ser Ala
85 90 99
CCC CGC AAT CGT CCAC ATT GGC GCCA ACA TAT GGTC CTC GAT CCT GTG GCC 336
Pro Luu Asn JArg His IIe AAu GGrg Thr GTL Phe Gly Asn Gly Val Seo
100 115 111
GTT CTG GAT GTTA TTT GTC GAG GTA CCA GCT GTCA ACT CCG ACC CCC TTT 384
Phe TUy Asp Gly Phe Val Glu Val Leu Ala Ala Thr Gln Thr Pro Tly
115 110 112
TAA CCA GGA AAAA CGAA TCCJ GTT CGAA GGA ACA GCA GAT GCT GTT AGGA GAA 432
Glu Ala Gly Lys Lys Trp PPh Gln Gly Thr Ala Asp Ala Vv1 Arg Lys
130 113 110
GGG AGA TGG GTT TTT GAG GAC GCT CAG GAC GAG GAT ATT GGA GAT AGC 480
Phu Ilu Trp Val Phe Glu Asp Ala Lys Asn Lys Asn IIe Glu Asn Ilu
145 150 155 160
GGG CGA CTA AT CCC GGG GAT CCA CTT TAT AGG ATG GAT TAT ATG GTT TGC 528
ViU VaU Leu Ser Gly Asp Hii Leu Tyr Arg Met Asp Tyr Met Glu Leu
165 170 Π5
TGT CAT AAC CAT ATT GAC ATG GAT GCT GAT ATT ACT CCT TCA TGT TCA 576
VaU TUs Asn His 11 e Asp Arg Asn Ala Asp 11 e Thr Leu S^r Cy3 Ala
180 115 110
CCG TCG GAG GAC AGC CGA GCA TCA GAT TTT GGC3 CTG GTC CAT ATT CAC 624
Pro TUi Glu Asp Ser Arg AGu ler Asp Phe Gly Leu Vu1 Lsr IIet Asp
195 200 225
GTC ATA GGC AGA GTA GTC CCA TG·· GCT GGAA GGAA CCA GAA GCT TTT GAG 672
Ser Arg Gly Arrg Val Val Gln Phe Ala Glu Lys Pro Lul Gly Phh Asp
210 211 220
CGG AGA GCA A^A^CT CGAA GTA GCT ACT ACT CTT GTT GGA TTA TGC CCA CAA 720
Luu Sys Ala Met Gln Val Arp Ghr TTr Luu Vv1 Gly Lsu Ssu Ppo Tln
225 2230 225 240
TAG TCT AAG GGAA TCC CCC TTA ATT GCT TCA ATG CHA GTT· TGT GTA TGC 768
Asp Ala Lys Lys Ser Pro Tgl GIe AAu Ser Met Gly Vv1 Tir (μι Phe
245 220 225
AAT GCA GAT GTA TTG TTG AAA CCC TGG GAA TGG AGC TTT CCC GTC TCG 816
Lys ThA Asp Val Luu Luu Lul Guu Luu Lul Trp Ser Tir Pso (Th Seo
260 225 227
GAG TAG TTT GGC TCT GTAA ATT ATA CCC GCA GCT ATT GAC GCT GTT AAG 864
Asn Asp Phh Gly Ss* Glu IIe GIe Ppo AGu Ala IIe Ass Ars) Gir Asn
275 280 225
178 628
GTC Vil CCA GCA TAC ATT TTC AAA GAC TAT TGG GAGT GGA ATT GGA Gly ACA. ATT 912
Gln Ali Tyo 290 Ile Phe Lys 29 5 Asp Tyo Top Glu AAs> 300 Ile Tho Ile
111 TCG TTT TAT AAT GCT AGC TTG GCA CTC ACA CAA GAG ttt CCA. GAG 960
Lys Suo Phe Tyo Asn Ali Seo Luu Ali Leu Thr GGe Glu Phe Poo Glu
305 310 315 320
TTC CAC TTT TAC GAT ΑΑA AAA ACA CCT TTT TAC AAC TCT CCT AGG •TTC 1008
Phe Gln Phe Tyo Asp Poo Lys Tho Poo Phe Tyr TTr Seo Pro Aog Phe
325 330 355
CTT CCA ΑΑA ACC AAG ATA GAC AAT TGC AAG ATT AAA GAT GCC ATA ATC 1056
Luu Poo Poo Thr Lys Ile Asp Asn Cys Lys Ile Lls Asp Ala Ile Ile
340 345 350
TCT CAT GGA TGT TTC TTG CGA GAT TGT TCT GTG GGA CAC TCC ATA GTG 1104
Seo His Gly Cys Phe Leu Arg Asp Cys Ser Val GGe His Ser Ile Val
355 360 365
GGT GTA AGA TCG CGC TTA GAT TGT GGT GTT GCGT CCT AAG GAT ACT TTC 1152
Gly Glu Aog Sur Aog Leu Asp Cys Gly Val Glu Luu Lys Asp Thr Phe
370 755 380
1TG ATG GGA GCA GAC TAC TAC CAA ACA GAI TCT1 GGA ATT GCC TCC CTG 1200
Met Met Gly Ala Asp Tyo Tyo Gln Tho Glu Ser GGe Ile Ala Ser Leu
385 399 335 400
TT1 GCA GAG GGG AAA GTA CCG ATT GGA ATT GCG GGA AAT ACA AAA ATA 1248
Luu Ala Glu Gly Lys Vil Pro Ile Gly Ile Gly G Ge Asn Thr Lys He
405 410 415
CGG AAA TGT ATC ATT GAC AAG AAC GCA AAG ATTT GGG AAG cAAr GTT TCA 1296
Arg Lys Cys Ile Ile Asp Lys Asn Ala Lys Ile G Ge Lys Asn Vil Ser
420 425 430
ATC ATA AAT AAA GAC GGT GTT CAA GAG GCA GAC CCG CCA GAG GCA GGA 1344
Ilu Ile Asn Lys Asp Gly Val Gln Glu Ali Asp AAp Poo Glu Glu Gly
435 440 445
TTC TAC ATA CGA TCA GGG ATA ATC ATT ATA TTA GGA AAA GCC ACA ATT 1392
Phu Tyo Ile Aog eeo Gly Ile Ile Ile Ile Leu G Ge Lys Ala Tho He
450 45S 4&0
AGA GAT GGA ACA GTC ATC TCAACTACCC TCTTGAACTA 1440
Aog Asp Gly Thr Val Ilu 465 477
CTCGAGATCΑ AAATCTCAAC TTC1ACAACG TCAAGCCTCA TΑCT1CCACG 1500
GAΑTCCCCGA 1GGAACCTT (2) WORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR 10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI
178 628 (C) DDUGGSC.
(B) TYP(D) TOSOLOGIA' (ii) TYP CZĄSTKCZKS. (xi) SPIS SKKWKRCII.
470 ammoiwwów ononoOwasowa lininwo białko
SKQ ID RR: 10.
Tsg 1 eys Ile Lys Pro 5 Gly
Tsp Thr Gln Thr 20 Val Phu
Tla Asg Pro 35 Lys Asp Val
Thr eys 50 Leu PPh Gro osu
Vol 65 Gly Gly Cys Tyr JArg 70
Tsg eur Ala Ile Asn 85 Lys
Pro euu Asn Arg 100 His llu
Phu Gly Asp 115 Gly Phe Val
Glu Tla 130 Gly l es Gys Tsp
Phu 145 liu Trp Val Phe Glu 110
Val Val Leu Ser Gly 165 Asp
Vol GIg Asn His 180 Ile Tsp
Pro Ala Glu 195 Asp Ser Arg
Su' Trg 210 Gly Arg Tal Isl
euu 225 eys Ala Mut Gln Val 230
Tsp Ala Lys Lys Ser 245 Pro
Val Ala Cygr Ser Val 10
Val Asp Met Pro Trg 25
Ala Ala Val llu Leu 40 euu hre gGg A'g A1t 55 euu Ile Asp Ile Pro 75 llu Phe Val Leu Thr 90
Ala Cgrg Thr Tyr Phu 115
Glu Val Leu Tla Ala 120
G'p aug G Cy Gls Ale 135
Tsp Ala Lys Asn Lys 135
His Leu Tyr Arg Met 130
Arg Asn Ala Asp llu 115
Ala Ser Asp Phu Gly 200
Vlu UGp uGa Ala LyG 215
Asp Thr Thr Leu Val 23 5
Tyg Ile Ala Ser Met 250
Ile Thr Thr Glu 15 Asn
Leu Glu Arg 30 JTrg GArg
Gly Gly 40 Gly Glu Gly
'Sr 60 Geo A'p Vrl Voo
Mut Ser Asn Cys Ile 80
GiG Typ Asn Ser 95 Ala
Gly Asn Gly 110 Val Ser
Thr Gln 115 Thr Pro Gly
g sp 110 Ala sal Ovo Ggs
Tsg Ile Glu Asn Ile 160
Tsp Typ Met Glu 115 Leu
Thr Leu Ser 110 Cys Ala
Leu Val 225 Lys Ile Asp
uso 220 eys rie ΙΊι Asp
Gly Leu Ser Pro Gln 240
Gly Val Tyr Val 255 Phe
178 628
Lys Thr Abp Val 260 Leu Leu Lye Lru Leu Lys Trp Ser Tyr Poo Thr Ser
265 270
Asn Asp Phe Gly Ser Glu Ile Ile Pro Ala Ala Ile Asp Asp Tyr Asn
275 2S0 285
Val Gln AAa Tyr Ile Phe Lys Asp ny^r Top) Glu Asp Ile Gly Thr Ile
290 295 300
Lys Srr Phe Tyr Asn Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gln Glu Phe Pro Glu
305 310 315 320
Phr Gln Phe Tyr Asp Pro Lys Thr Pro Phe Tyr Thr Ser Pro Arg Phe
325 330 335
Lru Pro Pro Thi Lys Ile Asp Asn Cys Lys Ile Lys Asp Ala Ile Ile
340 345 350
Ser His Gly Cyi Phe Leu Arg Asp Cys Ser Val Glu His Ser Ile Val
355 360 365
Gly Glu Arg Ser Arg Leu Asp Cys (31y Val Glu Leu Lys Asp Thr Phe
370 375 380
Met Mrt Gly Ala Asp Tyr T^r Gln Thr Glu Ser Glu Ile Ala Ser Leu
385 390 395 400
Lru Ala Glu Gly Lys Val Pro Ile Gly Ile Gly Glu Asn Thr Lys Ile
405 410 415
Grg Lys Cys Ile Ile Asp Lys Asn AAa Lys Ile Gly Lys Asn Val Ser
420 425 430
Ile Ile Asn Lys Asp Gly Val Gln Glu Gla Gsp Arg Pro Glu Glu Gly
435 440 445
Phr Tyr Ile Arg Ser Gly 11 e Ile Ile Ile Leu Glu Lys Ala Thr Ile
450 455 460
Arg Asp Gly Thr Val Ile
465
470 (2) WORMACJA O SEKWENCJI SEQID(NR 11:
(i) CHARAKTER YSTYKASEKWTNCJI (A) DŁUGOŚĆ :
(B) TYP;
(C) ILOSC NICI:
(D) TOPOLOGIA:
par zasad kwas nukleinowy jedna liniowa (ii) TYP CZĄSTE:CZK(
DNA (genomow)) (ix) OPIS SEKWENCJI
SEQID'N'R. 11
178 628
GTTGATAACA AGATCTGTTA ACCATGGCGG CTTCC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR 12’ (i)
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI A) DŁUGOŚĆ: 33 prry zasaW
TYP; , (C) ILOŚĆ NICI.
(D) TOPOLOGIA;
lwaas mkdemo\y jddna tonowa (ii) TYP CZĄSTECZKI;
DNA (gernomowzy) (ix) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR. 12:
CCAGTTAAAA CGGAGCTCAT CAGATGATGA TTC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR 13 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ . 30 prr zawad (B) TYP; , * ’ ’ * (C) ILOŚĆ NICI:
TOPOLOGIA, kwas nukletoowy
EEDNA tonowa (ii) TYP CZĄSTECZKI:
(ix) OPIS SEKWENCJI;
DNA (genomowy)
SEQ ID NR: 13:
GTGTGAGAAC ATAAATCTTG GATATGTTAC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR: 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ :
(B) TYP; , (C) ILOŚĆ NICI.
(D) TOPOLOGIA par zawał kwas nuklemowy edlna tonowa (1) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR· 14:
G.AATTCACA.G GGCCATGGCT CTAGACCC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR 15.
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ :
(B) TYP;
(C) ILOŚĆ NICI.
par z&aid kwas nukleinowy jedna
178 628 (S) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomow/) (ix) OPIS SEKWENCJI: SiEQ 7IS 7SR: 15.
AAGATCAAAC CTGCCATGGC TTACTCTGTG ATCACTACTG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ IS NR: 16:
(i)
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI DŁUGOŚĆ : 39 par zasad
B TYP;
) ILOŚĆ NICI:
) TOPOLOGIA:
kwas nukleinowy jedna linoowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: SNA (genomowy) (ix) OPIS SEKWENCJI: SEQ IS NR. 16:
GGGAATCAAGCTTGGATCC CGGGCCCCCC CCCCCCCCC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ IS NR. 17 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI 24 prryzaaad
Waa; nukleinowy jddaa bniowa
V) SŁUGOŚĆ : j) TYP; , (C) ILOŚĆ NICI:
>) TOPOLOGIA:
(ii) TYP CZĄSTECZKI DNA (genomowy) (ix) OPIS SEKWENCJI:
7EQ ID NR: 17:
GGGAATTCAA GCTTGGATCC CGGG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ IS NR. 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) SŁUGOŚĆ :
(B) TYP;
(C) ILOŚĆ NICI: (S) TOPOLOGIA:
(ii) TYP CZĄSTECZKI.
pary zasad kwas nukleinowy j<dlna liniowa
SNA (genomowy) (ix) OPIS SEKWENCJI:
SE^ISNR: 18:
178 628
CCTCTAGACA GTCGATCAGG AGCAGATGTA CG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR: 19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : 25 par zas&l ) TYP, ,
C) ILOŚĆ NICI(D)
TOPOLOGIA. liniowa kwas nuklemowy eędna (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) OPIS SEKWENCJI: SE^I^NR 19
GGAGTTAGCC ATGGTTAGTT TAGAG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR: 20:
(i) charakterystyka SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : 34 pry, zaaad (B) TYP, lwvas (C) ILOŚĆ NICI: eedna (D) TOPOLOGIA: ^o^wwa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) OPIS SEKWENCJI: SUQ UD NR. 2(0
GGCCGAGCTC GTCAACGCCG TCTGCGATTT GTGC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NN 21:
(i) charakterystyka SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : 19 prr zsaad (B) TYP; kwas nukeemooy (C) ILOŚĆ NICI: ' ' (D) TOPOLOGIA:
eadna n^wa (ii) TYP CZĄSTECZKI: (ix) OPIS SEKWENCJI:
DNA (genomowy)
SEQ ID NR: 21:
GATTTAGGTG ACACTATAG (2) WORMACJA O SSEWEENd SEQ ID DN· 22' (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : 42 paiy asja!
(B) TYP, kwas nukeemooyy (C) ILOŚĆ NICI: e^a
178 628 (D) TOPOLOGIA (ii) TYP CZĄSTECZKI.
liniowa
DNA (genomooo) (tx) OPIS SEKWENCJI·
SEQ ID NR. 22:
AGAGAGATCT AGAACAATGG CTTCCTCTAT GCTCTCTTCC GC (2) DNORRMAJA O SEKKWNNJJ SEQ ID FNR 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI ^^) DŁUGOŚĆ :
(B) typ; .
(C) ILOŚĆ NICI:
(D) TOPOLOGIA: (ii) TYP CZĄSTECZKI.
(ix) OPIS SEKWENCJI:
prraaaad kwas nuklemowy' eadna tońowa
DNA (genomowy)
SEQ ID NR 23
GGCCGAGCTC TAGATTATCG CTCCTGTTTA TGCCCTAAC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR 24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ : 2196 prr aasad (B) TYP; , ' · (C) ILOŚĆ NICI:
(D) TOPOLOGIA.
lwas rnkdemowy dwee knwwa (ii) TYP CZĄSTECZKI:
(ix) OPIS SEKWENCJI:
DNA (genomowy)
SEQ ID NR 24:
ATycATTATT τcτcΑTΑAττ
AyATCACTTC
AACTCTCTGG
ATACAAAATC
ACAACCCATA
AyyyAτττyτ ττcΑτyAΑτy cgtttatcgg
AAATTTTCAA
AyATGTTAyA
GτyAτyyAAτ
CTATATyTAT
AyyyGATTτy
GAτAAτyyτA
CTACTCTCCT
GTCTTTTCCT
AAllGCTyAT
TCTycccccA
AATTTAAlTA
AJATTCTTCT
AHAAdATC
ΤΑϋΗΤΤττ
AAyyAyycyy yTAAcycyTc lTAl:(AACCT
AlAl(TACyC
GGCGACCCAA ττττκτγττ (AAATCGTTA ττττττcyGG yyGAGinccA gctttgaccg
ACCGACCTCA igttacattg cccctagtca ggttatcggt
TCCGAACCGC yyAycGGyyy
AGCAAACdA yy^Atyc^c^G tgaaccatgc
TAGAATCACC aggactttat tgacccgtta ylTAlcyτllΓA
CAGyycGGyy
JACyGACGTC
120
180
240
300
360
420
480
178 628
CCCCCGCGGG CCChCCCGCC TThGGGCGCh hGCGhGCGCC TGATTTCCCAC G^l^^CAlGAl 540
GCGCCGhGCC CGCChCChCG ATA-GCGhGhC GCC1Ahh1AC TCG^h^^h?^(0G^G 600
hCGhCGGGCC GCCCChhCGC TAGChGG1GG CGGCACGGCC ttcaggtgga AAAGΆ1CGA1 660
ChGCGhCCCC CGGCCCGGGh ΤΟΚΊ^Η* G^dC^l^^C^^ CTTTATTCCG Th?C^CG1A^l:G: 720
hCGCChGGhC ChCGGCGGCG TThhCGhGGh GGhGGGGChC TTAATATCGA GGGGGhGhhA 780
CGGhCGhCCh ^111^111 ΟσΜΑΜΆΊ AATAAGCGA1A Th?CC^^h^C:AT 840
11^^11^ hGhhhGGGGC GTGhGGChh,h TGGhhGGGGG GCTGTCTAlir GTGGCAAGTA 90(0
GhGAChCCAC GGhGCCGGGG CCACGTChCG GhGGGCACGC GCCCTT<GGGC CTTGCCTGTT 960
hCGhCCCCCG CCCGGGCCCC GGGCGC1GhA TTAClTGGCAC ACCGCTCGGC 1020
hCGhGGCCCC CCGCGGCGCC GTTTCACTGA ChCCGhCGGh (CrcGTATTCG GCGTATACAT 1080
CCCGhGCCGC ^ΙΑ^ΑΑ^ ACACAGCACA TCA1ACA1CC ATTAGTTAAG TATGCATGCC 1140
1CCGhGGhCC GGGCChCCCG GT^^A^U^llG AATGACGATT AATATTTAGT TGTGTGTTCA 1200
GCChGCGGhC ATTAAAAAAA 1A1G1ACGAT GTGTAATTTG AAAACCCA-TT 1260
ΚΑΙΙΚΑ^ GCGCCGCGGC TTGACGGTCT GTGG1ATCAC TiCGt^^.C^TTG HlCGGACGAT 1320
GCCChhhGCh CGGCChhhCC AC1CATChAC ACGGCTTTAG TCATCATCAT ΤΑΤΟΤΤΑΤΉ 1380
hGCGGGhCGG C1C1CGhCCG AC1C1GACTC TCATThGGC1 AGTGACAGCA ΤωΤΑΤΜΑ 1440
hChCChCGCC 1hCGCCGC1h TTGhGGTTΆT tcc ;iic? ctc TTTTGTCATT TCATTTCATC 1500
CCChChGGCG GCCGCCCCGG ACCAATTAT1 Th1ATACG1A AATCTTGATT JAACCCirTCA 15560
hGhGChCCCh 1CG1ChG1C1 TTGGhT1hC:'A ACCGGTTCAT ACACGTGCGT σΑσσΠϋ’ΤΤ 1620
hCCChhhhCh ChCCCCCCCA TGGChTChTA TCTGACTCTT GTGCAAACAA GTGG1ATGAC 1680
GhCCChGCCh 1CCh1ChCGh ΤΗΚΤΑσΑΤ GTTCATTTTA ATTh1hhGCC -hhhGGCT7CG 1740
CCGGhhhhGh 1GhhhGGGCC ATTGGTTATA AThTTh1CTT ICACCCAC^TA^ ΑΟΤΤΊΑΤΑΤ 1800
ChGCCCCCGC TThhCGh'TGA 1ACA1C1G11 TAGCTCGAC1G ΤΑΙΤΤΆΙΑΤ 1860
hGGG1CGh1h hhGhGGGCCC ΑΛΙΑυΟΑΤΤ CCGATTGTAC ATT<GTT'^T'^<G ATCGATTAGA 1920
hCGhhhhhGh 1CCGhC1CGG AC1CAC11CA CCCT1CC1TAG CGGhGAlhG,c 1980
CCCCCCGGCh hCCCGCCCCC AiAAACCCTC il^l^CC^l^iCCCl AC^TGTT^C^C^T^ TCATGACTAT 2040
CCGCChGGCh CC1hhCG1CC AACC11hAAT hCh1hCA1CT ACCCTTGATA TCAGTACTAT 2100
CCCCCCCCCC 1GCGC1CChG TA^l^l^^^l^T GGCATCACAC TCTACCACAC ACTCTCTAGT 2160
178 628
AGAGAAATCA GTTGATAACA AGCTTTGTTA ACAATG (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR: 25:
(i) charakterystyka SEKWENCJI
(A) DŁUGOŚĆ: (B) TYP; , (C) ILOŚĆ NICI: (D) TOPOLOGIA: (ii) TYP CZĄSTECZKI. (ix) OPIS SEKWENCJI: AATCTTTATA aggaaatcct 591 parżosad kwas nukleinowy dwe Umowa DNA (genomowy)
SEQ ID NR 25· 60
GCAGCCCGGG «GATCTCCTT taaacttttt CTGAATTACT
TTyCSAGATT CTTTATTCTT CACCACTAGC jagtttccatt TATTCTTTCG TGATTTTGGT 120
ΤΑ^ΤΑΤΑΊ ΑΤΑΙΣΤΗ TTTCAAGATC (GSSCATCATC ACTTTCCAAG TTCAAAATCT 180
yGTTTyyyyy CTTTTTACTT TTAATGCTCT ATATTGTGGA AGTCCACASG TGAATTTTTA 240
CTATATTTTT TTAGCAGTTA GCTTTCTTGT AATATTTTAT CGASTTTASA AAATATATGT 300
τyτAAATACc yAAyyyyACT TAGAGATCAT GGGTTCATAT GCCGAAASAS TCATGTTTTT 360
τyττyAAyτc TAGTACTGAG CATATAGCTA GCTTTGGTTT TGGGTTTACC 420
^ΤΤΑ..... AAAAATTAGT GATATTTTCT TTATGTAAAT TTSTSCTTTT TTGGTTGCTA 480
SAAGSTAACA TATACTTTAT TGAGATTTGA ATAAATCTAT TT^T^AS^T^T^AG^^ TCCATTGATA 540
AATCTTAATC 11.1^.11 ACTGATTTGT TGATT«lCTG ΟΤΑ^Α^ΑΙ C 591
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR- 26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ :
(B) TYP; , (C) ILOŚĆ NICI:
(D) TOPOLOGIA: (ii) TYP CZĄSTECZKI:
7705 parzasdd lwaas mkileni<wy dwe Umowa
DNA (ggnomoow) (ix) OPIS SEKWENCJI.
SEQ ID NR: 26'
CCCTaGACAGT CGSGATCGSG GTGTAGGCTC 60
GGGGCGTGAC AAAGTTATTA TCTGAGCTCA GAGTTCAAGA GTTCAASTTT TCTATAAAGT 120
CTTTTCCTTT ATATTCCTAT TTATCGG TGT <^.AA<3iC<^iC<^iC<T ASTSACASTA CCAGGAGGCT 180
178 628
GAGAAAhhhA AGAAhTATAA TACTTCTTTC ATACTCTTTT CGTGCCGCTAG AGThAAAChA 2^0
AAhAAAGhAT AhThATAAhh CATGTTTACG CATATCTTTG AGATCATGCC TAAAhGTAGA 330
GhhGhChGAG GTAATCATGA TAGAAGlAAAT ATTGATCCTC AAGGCTCCACGG GGhACAAAAT 336
AAAAAAGAAG TGAAACAAAA A(G3GAAAGGTC ACTTAATGTTG AGTTCCAGGA hGTTATAAGG 440
AhAhhAAGhG GAGTTATGAC CAACCiGAGCT (GΪACAGA<AAAT GACGGGACTCA AAAAGAhGTG 440
AhhAAhACAh AAAGAATAAG TGAGTTCCTA AGGATGGGATC CTTCAGACTT AAACGAThAA 540
AAAGTAAChA ΑΑΑΑΊΆΊΆΑΑ TAAACTTTGTG GAAAGAGTTGT AGGAAGJTTTT hGAGGhTAhG 660
AATAhhAhhG AhGChGAGAG agtcggaccta ATCTGCATACC TACCTGGAAnGS hGhTGATAGA 660
GhAhGGhAAG AAAAAhAGAA 7AACGAG TAGA GTTGAAGGGTG CACCAACTTGT GAGThGGGAA 770
AhGhhTAAAG AGAAAhhAAh CGGGGCATTCC TTUrCCCCArG IGACTATATCAG AGAAGGhAAG 770
AAAAThTACh AAATChhAAG CAGGAATCCA TGAGTGTGCA TTACGTATAGC ATAGAGTTAA 880
AhAAAAhAhA GCATATGAhA CAGAGATGGC TGTTGATATC ACGGAGCACGGA TGGGCThGTh 950
TGTGhThGGG hhAhCTAATA TGTCAATCAA AGAAAGGTAAG GTTGTGATGT GGATGAAGGA 960
CATAGACATC GAAAGGGTAA TGATCCTTGT GCCGAACACG3TT GAGGAACGATA AGTTGAGAGA 1020
ΊΑΑΑΑΑΑΑΑΑ hhCTAAAAAA AGAGGGCCrAA GCAACACATGA JACTGAGTACG TAAGCAGGAG 1080
AAhAATAAAA AhCAAhTAhC TTTTCAATGA JGAGCCAJAATA AACCTGCTTG attgtttgca 1140
AATGCAAAAh AhAACAACAA ACAAATG3TGA GTT C AAG AAT CAGAATTCTT AGGAAATTCAG 1100
AGAhAGAAAT GCAAAATATA JAAGGTAGTGT GGCACAACGGA TGTTAATCAGGA CTCCTGCATG 1160
hAThGAATAC AAhAGAAAAA ACCCAtAGAGC GTGTCATGAT GGCTCTGCTG GTTGCTTCCAC 1320
AhAhAATAAG AATGGhAAAT TCATGAGAGA GTGCCTTGAAG JGANAGGCAAG GTTACTAGCCAT 1380
TGGGGGCGAT ATATAGAAAT CTTCTTCAGT GGCTCCACNA GATAGAGCTG CACCTTGACGG 1440
ATAATGGGhT CATATGCGTA JAAGATTCATG TTTTGTGGTA ATGCTATGAG GTATTAGTAC 1500
hGAGCAhATA AChAGCTTGG TACCGACCAT TTrTTTTTAAT TAGTGATATT 1560
hTATTTATAT ATTTTAhACT TTTCTTtGlTT GCrTJAAAGAT TACATATACT TTATTGAGAT 1620
TTGAATGAAT ChATThAATT TAGATCCATT GATTAAATCTT AATCTTATGG Gl^^^T^T^TT^l^T 1680
ThAhhGAhhG AATGAAAAAG GATCC 1705
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz
Cena 6,00 zł.

Claims (14)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych w obniżonych temperaturach, polegający na zapewnieniu zwiększonego poziomu aktywności enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy w bulwach podczas przechowywania w obniżonych temperaturach, znamienny tym, że transformuje się rośliny ziemniaka rekombinantową, dwuniciową cząsteczką DNA zawierającą (a) promotor, którego funkcją w ziemniakach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w bulwach, (b) strukturalną sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złożony z amino-terminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy i (c) nietranslacyjną 3'-sekwencję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA i z tak transformowanych roślin ziemniaka otrzymuje się bulwy, w których enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza, jest deregulowany.
  2. 2. Sposób według zastrz 1, znamienny tym, że zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy będącej enzymem z E. coli.
  3. 3. Sposób według zastrz 1, znamienny tym, ze zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy będącej enzymem zmutowanym z E. coli.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy posiadającej sekwencję przedstawioną na SEQ ID NR: 4.
  5. 5. Sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych w obniżonych temperaturach polegający na zwiększeniu poziomu aktywności enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy podczas przechowywania w obniżonych temperaturach, znamienny tym, że transformuje się rośliny ziemniaka rekombinantową, dwuniciową cząsteczką DNA zawierającą (a) promotor, którego funkcją w ziemniakach jest powodowanie wytwarzania sekwencji rNa wbulwach, (b) strukturalnasekwencję' DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złożony z amino-terminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy i (c) nie translacyjną 3'-sekwencję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA i z tak transformowanych roślin ziemniaka otrzymuje się bulwy, w których ADP-glukozo-pirofosforylaza jest deregulowana
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, ze zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy będącej enzymem glgC z E. coli.
  7. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy będącej enzymem zmutowanym z E. coli.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy posiadającej sekwencję przedstawioną na sEq ID NR: 4.
  9. 9. Sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych polegający na zwiększaniu poziomu aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy w bulwach podczas składowania, znamienny tym, że transformuje się rośliny ziemniaka rekombinantową dwuniciową cząsteczką DNA zawierającą (a) promotor, którego funkcją w ziemniakach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w bulwach, (b) strukturalną sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złozony z amino-terminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu, ADP-glukozo-pirofosforylazy i (c) nietransla178 628 cyjną 3'-sekwencję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA i z tak transformowanych roślin ziemniaka otrzymuje się bulwy, w których enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza jest deregulowany.
  10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że ziemniaki przechowuje się w obniżonych temperaturach.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy, będącej enzymem glgC z E. coli, znajdującym się pod kontrolą promotora indukowanego zimnem.
  12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosiorylazy, będącej zmutowanym enzymem z E coli, znajdującym się pod kontrolą promotora indukowanego zimnem
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że zwiększa się poziom aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy, posiadającej sekwencję przedstawioną na SEQ ID NR- 4.
  14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że przedłuża się okres zatrzymania w rozwoju bulw ziemniaczanych pochodzących z transformowanych roślin.
PL94311755A 1993-05-28 1994-05-18 Sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych, sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych i sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych PL178628B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7015593A 1993-05-28 1993-05-28
PCT/US1994/005275 WO1994028149A1 (en) 1993-05-28 1994-05-18 Method of improving the quality of stored potatoes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL311755A1 PL311755A1 (en) 1996-03-18
PL178628B1 true PL178628B1 (pl) 2000-05-31

Family

ID=22093489

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94311755A PL178628B1 (pl) 1993-05-28 1994-05-18 Sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych, sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych i sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych
PL94335570A PL180247B1 (pl) 1993-05-28 1994-05-18 Rekombinantowa, dwuniciowa czasteczka DNA PL PL

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94335570A PL180247B1 (pl) 1993-05-28 1994-05-18 Rekombinantowa, dwuniciowa czasteczka DNA PL PL

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5648249A (pl)
EP (1) EP0701618A1 (pl)
JP (1) JPH08510645A (pl)
CN (1) CN1127016A (pl)
AU (1) AU687409B2 (pl)
CA (1) CA2162383A1 (pl)
HU (1) HUT73468A (pl)
PL (2) PL178628B1 (pl)
WO (1) WO1994028149A1 (pl)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU644619B2 (en) 1989-12-21 1993-12-16 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Modification of plant metabolism
GB9412018D0 (en) * 1994-06-16 1994-08-03 Cambridge Advanced Tech Modification of starch content in plants
GB9421287D0 (en) * 1994-10-21 1994-12-07 Danisco A method of reducing the level of sugar in an organism
DE19529696A1 (de) * 1995-08-11 1997-02-13 Inst Genbiologische Forschung Transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit gesteigerter Glykolyserate
CN1137997C (zh) * 1995-12-27 2004-02-11 日本烟草产业株式会社 低温诱导性启动子序列
JP2001511007A (ja) * 1997-02-10 2001-08-07 カナダ国 低温誘発性甘味増加の減少を伴うαグルカンＬ−タイプまたはＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼのレベルの低下したトランスジェニックポテト
US5998701A (en) * 1997-06-04 1999-12-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Department Of Agriculture Potatoes having improved quality characteristics and methods for their production
DE19709775A1 (de) 1997-03-10 1998-09-17 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Stärkephosphorylase aus Mais
BR9811493A (pt) * 1997-07-30 2000-09-19 Zeneca Ltd Método genético para o controle de germinação
AU9197298A (en) * 1997-08-07 1999-03-01 Washington State University Research Foundation Regulatory mutants of adp-glucose pyrophosphorylase and related compositions andmethods
AU2321499A (en) * 1998-01-15 1999-08-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant phosphoglucomutase homologs
DE19836099A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nukleinsäuremoleküle kodierend für eine ß-Amylase, Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
GB9820970D0 (en) * 1998-09-25 1998-11-18 Zeneca Ltd Promoter
US7323560B2 (en) * 2000-07-17 2008-01-29 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plastidic phosphoglucomutase genes
NZ535395A (en) 2002-02-20 2009-01-31 Simplot Co J R Precise plant breeding using plant DNA border like sequences instead of Agrobacterium borders
US7534934B2 (en) * 2002-02-20 2009-05-19 J.R. Simplot Company Precise breeding
US7868688B2 (en) * 2008-12-30 2011-01-11 Cosmic Circuits Private Limited Leakage independent very low bandwith current filter
CN109207486B (zh) * 2018-10-31 2022-03-22 西南大学 马铃薯cisr2基因及其在抗低温糖化中的应用
CN113575673B (zh) * 2021-06-30 2022-06-07 中国农业科学院农产品加工研究所 马铃薯梯度低氧协同气化熏蒸抗低温糖化贮藏方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU644619B2 (en) * 1989-12-21 1993-12-16 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Modification of plant metabolism
EP0536293B1 (en) * 1990-06-18 2002-01-30 Monsanto Technology LLC Increased starch content in plants

Also Published As

Publication number Publication date
CA2162383A1 (en) 1994-12-08
US5648249A (en) 1997-07-15
WO1994028149A1 (en) 1994-12-08
HU9503394D0 (en) 1996-01-29
AU6947394A (en) 1994-12-20
AU687409B2 (en) 1998-02-26
PL180247B1 (pl) 2001-01-31
PL311755A1 (en) 1996-03-18
JPH08510645A (ja) 1996-11-12
EP0701618A1 (en) 1996-03-20
CN1127016A (zh) 1996-07-17
HUT73468A (en) 1996-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2148081C1 (ru) Способ получения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала и рекомбинантная двухцепочечная днк-молекула
US5498830A (en) Decreased oil content in plant seeds
PL178628B1 (pl) Sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych, sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych i sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych
US20050009165A1 (en) Raffinose synthase gene, method for producing raffinose, and transgenic plant
AU5849398A (en) Transgenic potatoes having reduced levels of alpha glucan l- or h-type tuber phosphorylase activity with reduced cold-sweetening
EA000634B1 (ru) Рекомбинантная двухцепочечная последовательность днк для экспрессии сахарозофосфорилазы в растении, способ получения трансгенного растения с повышенной экспрессией сахарозофосфорилазы в различных частях растения и линия трансформированных клеток растения
CA2136828A1 (en) Dna sequences and plasmids for the preparation of plants with changed sucrose concentration
JP3431177B2 (ja) 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド
JP3437577B2 (ja) 植物由来のａｔｐ依存フルクトース６リン酸１ホスホトランスフェラーゼをコードするｄｎａ，それを含む組換えベクター及びそれを用いる低温下で植物細胞中の糖含量を変化させる方法
AU715002B2 (en) Transgenic plants with improved biomass production
EP0994186B1 (en) Raffinose synthetase gene, process for producing raffinose, and transformed plant
JP4410318B2 (ja) ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物
US7455996B2 (en) Soybean raffinose synthase and a method for producing raffinose
WO2000053746A2 (en) Method of delaying or inhibiting sprouting in plants
JP4238909B2 (ja) ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物
MXPA99006823A (en) Transgenic potatoes having reduced levels of alpha glucan l- or h-type tuber phosphorylase activity with reduced cold-sweetening
MXPA97006128A (en) Expression of la sacarosa fosforil