PL180247B1 - Rekombinantowa, dwuniciowa czasteczka DNA PL PL - Google Patents
Rekombinantowa, dwuniciowa czasteczka DNA PL PLInfo
- Publication number
- PL180247B1 PL180247B1 PL94335570A PL33557094A PL180247B1 PL 180247 B1 PL180247 B1 PL 180247B1 PL 94335570 A PL94335570 A PL 94335570A PL 33557094 A PL33557094 A PL 33557094A PL 180247 B1 PL180247 B1 PL 180247B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gene
- enzyme
- tubers
- dna
- sequence
- Prior art date
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 51
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 19
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims abstract description 100
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 108700023224 Glucose-1-phosphate adenylyltransferases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 63
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 63
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 117
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 abstract description 90
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 48
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 30
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 24
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 abstract 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 64
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 57
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 51
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 46
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 46
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 46
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 39
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 16
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 101710091688 Patatin Proteins 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 14
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 11
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 9
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 9
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 8
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 8
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 7
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OSJPPGNTCRNQQC-UHFFFAOYSA-N 3-phosphoglyceric acid Chemical compound OC(=O)C(O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 6
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 6
- 235000012020 french fries Nutrition 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 5
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 5
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GOSWTRUMMSCNCW-HNNGNKQASA-N 9-ribosyl-trans-zeatin Chemical compound C1=NC=2C(NC\C=C(CO)/C)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O GOSWTRUMMSCNCW-HNNGNKQASA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 4
- 101150013858 glgC gene Proteins 0.000 description 4
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 4
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- GOSWTRUMMSCNCW-UHFFFAOYSA-N trans-zeatin riboside Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O GOSWTRUMMSCNCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N ADP alpha-D-glucoside Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N 0.000 description 3
- WFPZSXYXPSUOPY-UHFFFAOYSA-N ADP-mannose Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O WFPZSXYXPSUOPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N D-fructose 1,6-bisphosphate Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(=O)COP(O)(O)=O XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010043943 Starch Phosphorylase Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 3
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N fructose-1,6-phosphate Natural products OC1C(O)C(O)(COP(O)(O)=O)OC1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000007739 pm medium Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 2
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 2
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 2
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 2
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000030523 Catechol oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010031396 Catechol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701459 Caulimovirus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101100003996 Mus musculus Atrn gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000001746 Pancreatic alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010029785 Pancreatic alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000334993 Parma Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 description 1
- 108010009450 Phosphoglucomutase Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000557119 Platystemon Species 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 102220513475 Rab-interacting lysosomal protein_E35S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 101150044453 Y gene Proteins 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- IPEODUGTOQPXKA-DXOBOGAASA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphono hydrogen phosphate;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O IPEODUGTOQPXKA-DXOBOGAASA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000008848 allosteric regulation Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001049 brown dye Substances 0.000 description 1
- 239000001058 brown pigment Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 108091000085 chlorophyll binding Proteins 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 208000018999 crinkle Diseases 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N glycerol 1-phosphate Chemical compound OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- -1 hexose phosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006259 organic additive Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 101150072645 pea gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004410 pectinesterase Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 235000013573 potato product Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940097022 thiamine 100 mg Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)
- Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)
Abstract
1 1. Rekombinantowa, dwuniciowa czasteczka DNA zawierajaca w sekwencji opera- cyjnej: (a) promotor, którego funkcja w roslinach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w docelowych tkankach roslinnych; (b) strukturalna sekwencje DNA powodujaca wytwarzanie sekwencji RNA kodujacej polipeptyd fuzyjny zlozony z aminoterminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy zdefiniowanego sekwencja o numerze SEQ ID Nr: 4; (c) nietranslacyjna 3 '-sekwencje DNA, której funkcja w komórkach roslinnych jest powodowanie zakonczenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na koncu 3' tej sekwencji RNA, przy czym kodowany przez te czasteczke DNA enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza, jest deregulowany. 3. Rekombinantowa, dwuniciowa czasteczka DNA zawierajaca w sekwencji opera- cyjnej: (a) promotor, którego funkcja w roslinach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w docelowych tkankach roslinnych; (b) strukturalna sekwencje DNA powodujaca wytwarzanie sekwencji RNA koduja- cej polipeptyd fuzyjny zlozony z aminoterminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy zdefiniowanego sekwencja o numerze SEQ ID Nr: 2; i (c) nietranslacyjna 3 '-sekwencje DNA, której funkcja w komórkach roslinnych jest powodowanie zakonczenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na koncu 3' tej sekwencji RNA, przy czym kodowany przez te czasteczke DNA enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza, jest deregulowany. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest rekombinantowa, dwuniciowa cząsteczka DNA. Właściwości podczas długotrwałego magazynowania są podstawową cechą określającą jakość bulw ziemniaczanych. Okresy zatrzymania w rozwoju (obejmujące czas od zbiorów do kiełkowania) decydują o zachowaniu dobrej jakości ziemniaków. W obrocie handlowym, ziemniaki można składować przez długie okresy czasu przed ich przetwarzaniem (do 10 miesięcy i dłużej) w zakresie temperatur na ogół od 2 do 10°C. Magazynowanie w niskiej temperaturze (2-6°C) w odróżnieniu od przechowywania w temperaturze 7-12°C, to najlepsze warunki długotrwałego składowania, zapewniające zahamowanie procesu oddychania, zmniejszenie utraty wody, zakażeń mikrobiologicznych i potrzeby stosowania inhibitorów kiełkowania (Burton, 1989). Niskie temperatury prowadzą jednak do wywołanego zimnem zasłodzenia, a powstające wysokie poziomy cukru przyczyniają się do powstawania niekorzystnej brunatnej barwy produktu smażonego (Coffin i wsp., 1987, Weaver i wsp., 1978). W skład gromadzących się cukrów- wchodzą przede wszystkim glukoza, fruktoza i sacharoza, to znaczy głównie cukry redukujące (zwłaszcza glukoza i fruktoza), wchodzące w reakcję Maillarda z wolnymi grupami aminowymi podczas ogrzewania prowadzonego w różnych procesach przygotowywania posiłków, w tym smażenia, w wyniku czego tworzy się brunatny barwnik (Burton, 1989, Shallenberger i wsp., 1959). Z drugiej strony, sacharoza powoduje czarne zabarwienie podczas smażenia z powodu łatwości karmelizacji i zwęglania. Poziomy cukrów
180 247 redukujących powyżej 0,2% wagowych świeżej masy są wystarczające do powstawania brunatnego barwnika, co decyduje o wykluczeniu niektórych rodzaj ów przetwarzania. Przetwórca ziemniaka może zmniejszyć poziomy cukrów stosując kosztowny i czasochłonny proces blanszowania, o ile poziomy te są niewiele wyższe od granicznej wartości 0,2%. Ziemniaki można rekondycjonować w wyższych temperaturach (18°C) obniżając poziom cukru, jednak często w tych temperaturach poziomy cukru nie ulegają dostatecznemu obniżeniu przed rozpoczęciem kiełkowania i jest wówczas niezbędne użycie chemicznych inhibitorów kiełkowania (Ryall i Lipton, 1979, Hardenburg i wsp., 1986). Rekondycjonowanie zwiększa jednak wymagania co do urządzeń do magazynowania, co w konsekwencji wpływa na końcowy koszt produktu. Wykazano ponadto, że po dłuższych okresach magazynowania rekondycjonowanie jest nieefektywne (Coffin i wsp., 1987). Biorąc pod uwagę negatywny wpływ nadmiernego użycia środków chemicznych na środowisko i zdrowie oraz fakt, że obecne inhibitory kiełkowania mogą być wkrótce wycofane, istnieje potrzeba dysponowania takimi odmianami ziemniaka, które bez użycia środków chemicznych wytrzymywałyby długotrwałe magazynowanie w niskiej temperaturze bez nagromadzania się cukrów redukujących i w których w większym stopniu zachowywałyby się poziomy skrobi.
Po dłuższych okresach magazynowania, kiełkowanie bulw ziemniaka staje się poważnym problemem. Nadmierne kiełkowanie obniża wartość rynkową i może powodować zwiększone poziomy alkaloidów w bulwie.
Dotychczas, w wyniku procesów prowadzonych technikami inżynierii genetycznej uzyskano bulwy ziemniaka zawierające znacznie wyższe poziomy skrobi (opis publikacji zgłoszenia patentowego PCT, WO 91/19806 dokonanego przez Kishore; U.S.S.N. 07/709 663 zgłoszony 6.07.91, włączone do opisu jako odnośnik). W bulwach tych zachodzi ekspresja genu kodującego ADP glukozo-pirofosforylazę (ADPGPP), która katalizuje kluczowy etap w biosyntezie skrobi i glukogenu. Korzystny gen pochodzi z E. coli, otrzymany enzym jest wariantem podlegającym słabej regulacji i wysoce aktywnym. Jeśli w bulwach zachodzi ekspresja mutantu tego genu, glgC16 w sposób właściwy dla bulw, np. z promotora patatyny klasy I, wówczas poziomy skrobi w czasie zbiorów są wyższe od tych, które występują w kontrolnych bulwach nietransgenicznych.
Metabolizm węglowodanów w komórkach roślinnych jest procesem złożonym. Manipulacja wieloma różnymi procesami enzymatycznymi może potencjalnie wpływać na gromadzenie się cukrów redukujących podczas magazynowania w niskiej temperaturze. Przykładowo, cukry mogą być użyte do resyntezy skrobi, co powoduje obniżenie puli wolnego cukru. Do poprawienia właściwości ziemniaków podczas magazynowania w niskiej temperaturze na drodze obniżenia zawartości cukru mogą służyć również inne metody, w tym hamowanie hydrolizy skrobi, usuwanie cukrów na drodze glikolizy, albo konwersja cukrów w inne formy, które nie mają właściwości wchodzenia w reakcję Maillarda. Wyzwaniem dla tych metod byłaby identyfikacja aktywności, dzięki której można byłoby osiągnąć żądany rezultat, uzyskać daną funkcję w niskich temperaturach i zachować jakość produktu pożądaną przez hodowców, przetwórców i konsumentów ziemniaków.
Wysunięto sugestię, że fosfofruktokinaza (PFK) odgrywa ważną rolę w wy woływanym zimnem procesie zesłodzenia (Kruger i Hammond, 1988, ap Rees i wsp., 1988, Dixon i wsp., 1981, Claassen i wsp., 1991). Ap Rees i wsp. (1988) wysunęli przypuszczenie, że obróbka zimnem ma nierównomierny wpływ na różne szlaki metabolizmu węglowodanów, przy czym glikoliza ulega znacznie poważniejszemu obniżeniu w wyniku chwiejności PFK w niskiej temperaturze. Zmniejszenie aktywności PFK mogłoby zatem prowadzić do zwiększonej dostępności heksozo-fosforanów do produkcji sacharozy. Dodatkowym poparciem tego rozumowania jest obserwacja nowo wyhodowanego klonu ziemniaka zawierającego PFK, która nie jest zimnochwiejna i w niskiej temperaturze nie gromadzą się znaczące ilości cukru.
W publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego EP 0 438 904 ujawniono, że zwiększenie aktywności PFK wpływa na zmniejszenie gromadzenia się cukrów podczas magazynowania na drodze usuwania heksoz przez ich glikolizę i dalszy metabolizm. W bulwach ziemniaka dokonano ekspresji enzymu PFK z E. coli, uzyskując zwiększenie aktywności PFK i obniżenie zawartości sacharozy oznaczanej w bulwach w czasie zbiorów. Okazało się jed4
180 247 nak, że w niskich temperaturach pozostaje aktywna fosfotransferaza pirofosforanu do fruktozo -6 fosforanu (PEP) (Claassen i wsp., 1991). Enzym PEP może dostarczyć fruktozo-6fosforan do glikolizy tak samo jak enzym PFK, ponieważ te dwa enzymy katalizują tę samą reakcję. Tak więc, skuteczność takiego podejścia do polepszenia jakości bulw ziemniaka podczas magazynowania w niskiej temperaturze wydaje się wątpliwa. Ponadto, usuwanie cukrów na drodze glikolizy i dalszego metabolizmu mogłoby być naj lepszym sposobem poprawy właściwości magazynowania bulw ziemniaczanych z powodu strat w zawartości cennej suchej masy w wyniku procesu oddychania. Resynteza cukrów do skrobi lub spowolnienie rozkładu skrobi byłoby bardziej korzystne, gdyż byłaby zachowana zawartość suchej masy.
Celem niniejszego wynalazku było wytworzenie takiej rekombinantowej cząsteczki DNA, przy pomocy której można było dokonać takiego rodzaju transformacji roślin ziemniaka aby obniżyć poziom cukru w bulwach ziemniaczanych i przez to polepszyć jakość magazynowanych ziemniaków. Następnym celem było otrzymanie ziemniaków o zwiększonej szybkości i stopniu rekondycjonowania po przechowywaniu w obniżonych temperaturach. Innym celem wynalazku było opracowanie sposobu wydłużania okresu zatrzymywania w rozwoju ziemniaków przechowywanych w temperaturach otoczenia lub temperaturach obniżonych.
Przedmiotem wynalazku jest rekombinantowa, dwuniciowa cząsteczka DNA zawierająca w sekwencji operacyjnej:
(a) promotor indukowany zimnem, którego funkcją w roślinach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w docelowych tkankach roślinnych;
(b) strukturalną, sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złożony z aminoterminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy;
(c) nietranslacyjną 3'-sekwencję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów- na końcu 3' tej sekwencji RNA, przy czym kodowany przez tę cząsteczkę DNA enzym, ADP-glukozopirofosforylaza, jest deregulowany.
Korzystnie cząsteczka DNA koduje ADP-glukozo-pirofosforylazę będącą enzymem glgC z E. coli. Jeszcze bardziej korzystnie cząsteczka DNA koduje ADP-glukozopirofosforylazę będącą enzymem zmutowanym z E. coli. Również korzystnie cząsteczka DNA koduje ADP-glukozo-pirofosforylazę posiadającą sekwencję przedstawioną na SEQ ID Nr: 4. Najbardziej korzystnie cząsteczka DNa stanowi cząsteczkę, w której promotor DNA pochodzi z roślin ziemniaka.
Zastosowanie rekombinantowej cząsteczki DNA według wynalazku pozwala na polepszenie jakości ziemniaków magazynowanych w niskich temperaturach. Użycie tej cząsteczki pozwala na zapewnienie zwiększonego poziomu enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy (ADPGPP) w bulwach ziemniaczanych podczas przechowywania w obniżonych temperaturach, jak też na obniżenie poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych w obniżonych temperaturach przez, zwiększenie aktywności enzymu ADPGPP podczas przechowywania w niskich temperaturach.
Cząsteczka według wynalazku służyć może do przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych ziemniaków przez zwiększenie aktywności enzymu ADPGPP podczas przechowywania. Metody z zastosowaniem cząsteczki według wynalazku polegają na:
(a) insercji do genomu komorkó ziemniaka rekombikantowej, dwuniciwwej c/.ąsteczki DNA zawierającej:
(i) promotor, którego funkcją w roślinach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w docelowych tkankach roślinnych;
(ii) struktur a liną sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny zawierający aminotkrminelny plastydowy peptyd tranzytow-y oraz enzym, ADP-gluOdza-pπΌfdsfarylazę;
(iii) nietranslacyjną 3'-se0wkncję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliedknylawenych nuklkotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA,
180 247 (b) otrzymaniu transformowanych komórek roślinnych i (c) regenerowaniu z tych transformowanych komórek roślinnych transformowanych genetycznie roślin ziemniaka o polepszonych właściwościach magazynowania w niskiej temperaturze.
Przy użyciu cząsteczek według wynalazku można otrzymać nowe rekombinantowe cząsteczki DNA, komórki roślinne i regenerowane rośliny ziemniaka, w których promotor z punktu (a) (i) jest promotorem indukowanym zimnem, pochodzącym z ziemniaka lub Arabidopsis. Enzym, ADP-glukozo-pirofosforylaza (ADPGPP) pochodzi z E. coli i jest znana pod nazwą glgC. Sekwencja genu dla tego enzymu jest przedstawiona poniżej jako SEQ ID Nr: 1, a sekwencja aminokwasowa tego enzymu jest podana pod nazwą SEQ ID Nr: 2. Lepszym enzymem ADPGPP jest mutant ADPGPP, glgC16. Sekwencja genu dla tego enzymu jest podana niżej jako SEQ ID Nr: 3, a sekwencja aminokwasowa - jako SEQ ID Nr: 4. Okazało się, że ten mutant ma większe powinowactwo do substratów w nieobecności aktywatora, 1,6-bisfosforanu fruktozy (FBP) i osiąga połowę maksimum aktywacji przy obniżonym stężeniu FBP.
Stosowany w opisie termin „polepszenie jakości magazynowanych ziemniaków” albo warianty tego terminu oznaczają ziemniaki, które po przechowywaniu posiadają obniżone poziomy cukrów, charakteryzują się niewielką utratą skrobi lub brakiem utraty skrobi, obniżonym kiełkowaniem i/lub zwiększoną szybkością lub stopniem rekondycjono wania.
Określenie „magazynowanie w niskiej temperaturze” albo „przechowywanie w obniżonej temperaturze” oznacza utrzymywanie w temperaturach niższych od 15°C, uzyskiwanych przez chłodzenie przy użyciu urządzeń chłodniczych albo przez, wykorzystanie temperatur otoczenia.
'Termin „promotor indukowany zimnem” oznacza sekwencję zasad DNA inicjującą transkrypcję mRNA z jednej z nici DNA jako matrycy z wytworzeniem odpowiedniej komplementarnej nici RNA przy temperaturze równej lub niższej od 15°C.
Stosowany w opisie termin „przedłużony okres zatrzymania w rozwoju” albo terminy podobne oznaczają opóźnienie początku oddychania i kiełkowania bulw.
Termin „ziemniaki glgC16”, „bulwy glgC16”, „linie glgC16” albo warianty tych określeń oznaczają linie ziemniaczane albo bulwy pochodzące z tych linii, transformowane przez fuzję z opisanym poniżej plastydowym terminalnym peptydem tranzytowym, korzystnie CTP.
Figura 1 przedstawia mapę plazmidu dla wektora do transformacji w roślinach, pMON17316.
Figura 2 przedstawia mapę plazmidu dla wektora do transformacji w roślinach, pMON17279.
Fosforylaza skrobiowa i enzymy amylolityczne są odpowiedzialne za degradację skrobi podczas magazynowania w niskiej temperaturze z wytworzeniem ze skrobi glukozo-1 -fosforanu i/lub glukozy. Glukoza może być przetwarzana w glukozo-1-fosforan i służyć jako substrat dla enzymu ADPGPP, a zatem, do biosyntezy skrobi w bulwach, w których zachodzi ekspresja tego enzymu. Glukozo-1-fosforan może się również tworzyć z produktów degradacji sacharozy pod działaniem inwertazy albo syntetazy sacharozowej. Podczas magazynowania, w wyniku działania inwertazy gromadzą się głównie cukry redukujące, a nie sacharoza (Pressey, 1966). Glukoza i fruktoza uwalniane w wyniku działania inwertazy mogą również służyć jako prekursory substratów do biosyntezy skrobi.
Ekspresja enzymu ADPGPP jest skutecznym sposobem zwalczania efektu zasłodzenia indukowanego zimnem. Przypuszcza się, że podtrzymanie syntezy skrobi podczas przechowywania w niskiej temperaturze powoduje ciągłe zapotrzebowanie na zasoby heksoz, w wyniku czego zmniejsza się akumulacja cukru, a zatem, bulwa nadaje się do przerobu. Jednak za to działanie ADPGPP mogą być również odpowiedzialne inne mechanizmy. Ponadto, przedłużanie okresu zatrzymania w rozwoju ziemniaków przechowywanych w każdej temperaturze można osiągnąć przez utrzymanie niskiego poziomu cukru i opóźnienie początku oddychania i kiełkowania.
Dla osiągnięcia tego celu, do genomu roślin ziemniaka wprowadza się gen do ekspresji enzymu ADPGPP. Ten gen można łączyć z innymi genami (w orientacji sensownej i antysen6
180 247 sownej) w celu regulowania w ziemniakach metabolizmu i katabolizmu skrobi i/lub cukru, np. z genem fosfofruktokinaz (publikacja europejskiego opisu patentowego nr EP 438 904), α- i β-amylaz, syntetaz fosforanu sacharozy, heksokinaz, fosforylaz skrobi, enzymów hamujących rozgałęzianie albo fosfoglukomutaz. Te dodatkowe geny mogą pochodzić z roślin, mikroorganizmów albo ze źródeł zwierzęcych.
Alternatywnie, można osiągnąć zwiększone poziomy ADPGPP w przechowywanych bulwach na drodze mutagenizowania klonów ziemniaka, zwiększając przez, to poziomy aktywności ADPGPP. Takie bulwy można selekcjonować w oparciu o zwiększoną specyficzną aktywność, zwiększone Vmax, obniżone hamowanie przez inhibitor (Pi) lub zmniejszoną zależność maksymalnej aktywności od aktywatora (3-PGa).
Ekspresja genu roślinnego, który występuje w formie dwuniciowego DNA wymaga transkrypcji informacyjnego RNA (mRNA) z jednej nici tego DNA przez enzym, polimerazę RNA i następnego przetworzenia pierwszorzędowego transkryptu tego mRNA wewnątrz jądra. W przetwarzaniu tym bierze udział nie podlegający translacji region 3', dodający poliadenylowane nukleotydy do końca 3' tego RNA.
Transkrypcja DNA do mRNA jest regulowana przez region DNA zazwyczaj zwany promotorem. Region promotora zawiera sekwencję zasad stanowiącą dla polimerazy DNA sygnał do asocjacji z tym DNA i do zapoczątkowania transkrypcji mRNA z użyciem jednej nici tego DNA jako matrycy do syntezy odpowiedniej komplementarnej nici RNA.
W literaturze opisano wiele promotorów aktywnych w komórkach roślinnych. Należą do nich promotory syntetazy nopalinowej (NOS) i syntetazy oktopinowej (OCS), które są przenoszone na wywołujących nowotwory plazmidach Agrobacterium tumefaciens, promotory caulimowirusów, takie jak wirus mozaiki kalafiorowej (CaMV) 19S i 35S oraz promotory mozaiki trędownika 35S, indukowany światłem promotor z małej podjednostki karboksylazy rybulozo-1,5-bis-fosforanowej (ssRUBISCO, powszechnie występującego polipeptydu roślinnego) oraz promotor genu białka wiążącego chlorofil a/b i podobne. Wszystkie te promotory były stosowane do tworzenia różnych typów konstrukcji DNA i wywoływania ich ekspresji w roślinach (np. publikacja opisu patentowego PCT, WP 84/02913).
OkazOło się, że promotory patatyny klasy I użyte w poniższych przykładach 1 i 2, są zarówno wysoce aktywne jak i specyficzne dla bulw (Bevan i wsp., 1986; Jefferson i wsp., 1990). Znanych jest wiele innych genów charakteryzuj ących się ekspresją specyficzną dla bulw albo ekspresją wzmożoną, w tym geny ADPGPP bulw ziemniaczanych, podjednostek dużej i małej (Muller i wsp., 1990), syntetazy sacharozy (Salanoubat i Belliard, 1987, 1989), geny większych białek bulw łącznie z kompleksami białkowymi o masie 22 kD i inhibitorów proteinazy (Hannapel, 1990), gen syntetazy skrobiowej związany z ziarnistościami (GBSS; Rohde i wsp., 1990) oraz geny innych patatyn z klas I i II (Rocha-Sosa i wsp., 1989; Mignery i wsp., 1988). Do innych promotorów, które uważa się za użyteczne w wynalazku należą te, które wykazują zwiększoną lub specyficzną ekspresję w bulwach ziemniaczanych, które są promotorami genów normalnie związanymi z ekspresją enzymów uczestniczących w biosyntezie lub modyfikacji skrobi albo takie, które wykazują różne schematy ekspresji w bulwie ziemniaczanej, ze zwiększoną ekspresją np. w skórze albo w rdzeniu, albo w peridermie bądź takie, których ekspresja zachodzi w różnych czasach podczas rozwoju bulw. Przykłady takich promotorów obejmują promotory genów dla syntetaz skrobi związanych z ziarnistościami lub innych, genów dla enzymów rozgałęziających (Kossmann i wsp., 1991; Blennow A. i Johansson G., 1991; publikacje opisów patentowych PCT, WO 92/14827 i WO 92/11375), genu dla enzymu dysproporcjonującego (Takaha i wsp., 1993), dla enzymów hamujących rozgałęzianie, amylaz, fosforylaz skrobi (Nakano i wsp., 1989; Mori i wsp., 1991), esteraz pektyny (Ebbelaar i wsp., 1993), dla glikoproteiny o masie 40 kD, dla ubikwityny, inhibitora proteinazy asparaginianowej (Stukerlj i wsp., 1990), inhibitora karboksypeptydazy, polifenolooksydaz bulw (Shahar i wsp., 1992; bank genów GenBankR numery akcesyjne M95196 i M95197), geny przypuszczalnego inhibitora trypsyny i inne cDNA bulw (Stiekema i wsp., 1988) oraz dla β-amylazy i sporamin (z Ipomoea batatas); Yoshida i wsp., 1992; Otha i wsp., 1991).
180 247
Ekspresję bakteryjnego ADPGPP z różnych promotorów ziemniaczanych wykazał Kishore w publikacji opisu patentowego PCT, WO 91/19806. W wyniku takiej ekspresji zwiększała się zawartość skrobi w bulwach ziemniaczanych.
W sposobie według wynalazku nie ma potrzeby wychodzenia z bulw z wysoką zawartością skrobi dla osiągnięcia niskiej akumulacji cukrów redukujących podczas przechowywania w niskiej temperaturze. Ekspresję genu glgC16 w ziemniakach można uzyskać z promotora indukowanego zimnem, a więc enzym GlgC16 jest obecny tylko w warunkach magazynowania. Obecność tego enzymu powinna zatem utrzymywać biosyntezę skrobi podczas przechowywania, w wyniku czego można byłoby uniknąć gromadzenia się cukrów.
Istnieje wiele przykładów promotorów indukowanych zimnem, w tym promotorów roślinnych (Yamaguchi-Shinozaki i wsp., 1993; Qoronfleh i wsp., 1992; Minner i wsp., 1992; Houde i wsp., 1992; White i wsp., 1992; Huang i wsp., 1987; Murata i wsp., 1992; Gilmour i wsp., 1992; Hajela i wsp., 1990; Kurkela i wsp., 1990).
Przeprowadzono izolację indukowanych zimnem białek w bulwach ziemniaczanych (van Berkel i wsp., 1991; van Berkel i wsp., 1994). Promotory powodujące indukowaną zimnem ekspresję tych białek można wyizolować metodami znanymi w stanie techniki. Jedna z metod polega na utworzeniu banku cDNA z bulw eksponowanych na zimno i na następnej identyfikacji klonów specyficznych dla zimna przez różnicującą hybrydyzację z bankiem cDNA z bulw nie wystawianych na zimno. Proces ten można uczynić bardziej wydajnym stosując banki subtrakcyjne, czyli takie, z których podczas konstruowania usuwa się klony, z których przebiega ekspresja w sposób niespecyficzny dla niskiej temperatury. Oznaczenie sekwencji nukleotydowych cDNA pochodzącego od takich regulowanych transkryptów powinno również ułatwić izolację odpowiednich regionów promotora. Sekwencje takich cDNA są znane dla wielu regulowanych zimnem transkryptów z bulw ziemniaczanych (van Berkel i wsp., 1994). Następnie można zidentyfikować fragment promotora z klonu genomowego stosując sondy cDNA zidentyfikowane jako zimno-specyficzne. Takie regulowane zimnem promotory zidentyfikowano i oznaczono ich sekwencje (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 1994; Baker, 1994). Fragment promotora może być użyty do bezpośredniej ekspresji genu glgC16 z E. coli w sposób wykorzystujący indukcję zimnem. Ponadto, z tego promotora można prowadzić ekspresję jednego z kilku innych enzymów ADPGPP, wpływając na stężenie cukru w bulwach ziemniaczanych przechowywanych w niskiej temperaturze, poprawiając jakość tych bulw. Promotory hybrydowe albo fuzje elementów regulacyjnych różnych promotorów można również stosować w celu zwiększenia poziomu ekspresji z regulowanego zimnem promotora albo do spowodowania, aby ekspresja ta była bardziej specyficzna dla żądanego organu rośliny. Opisano geny regulowane zimnem, charakteryzujące się ekspresją przebiegającą preferencyjnie w różnych tkankach (Zhu i wsp., 1993) albo geny regulowane bardziej specyficznie zimnem niż innymi bodźcami (Wilhelm i Thomashow, 1993; Nordin i wsp., 1993). Wykazano poza tym, że specyficzne, określone sekwencje o długości od 9 par zasad do kilkuset par zasad kontrolują wrażliwość promotorów na zimno i inne bodźce, takie jak poziomy kwasu abscyzynowego i suszę (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 1994). Znane są promotory wywołujące preferencyjną ekspresję w bulwach. Oznaczono również regiony tych promotorów, które są niezbędne do takiej preferencyjnej ekspresji (Jefferson i wsp., 1990; Liu i wsp., 1990). Te dane umożliwiają skonstruowanie fuzji między małym, czułym na zimno elementem z promotorów takich jak te, które pochodzą np. z cor78, cor15a albo cor15b a promotorem patatyny. Fuzji dokonuje się z regionem -500 do -2000 par zasad promotora patatyny. Nowoczesne techniki genetyki molekularnej, w tym łańcuchowa reakcja z udziałem polimerazy i sterowana miejscem mutageneza a także łatwość syntezy oligonukleotydów umożliwiają dokonanie takiej fuzji.
Amino-terminalny tranzytowy peptyd plastydowy użyty z genem ADPGPP jest potrzebny do przetransportowania tego enzymu do plastydu, gdzie dokonuje się synteza skrobi. Alternatywnie, taki peptyd tranzytowy można pominąć i dokonać insercji genu do DNA obecnego w plastydzie. Transformację chloroplastu można przeprowadzić metodami opisanymi przez Svab’a i wsp. (1990).
180 247
Wytworzenie zmienionych genów ADP-glukozo-pirofosforylazy przez mutagenezę
Dla specjalistów jest zrozumiałe, że jakkolwiek nie jest to wymogiem koniecznym, lepsze wyniki można uzyskać przy użyciu genów ADP-glukozo-pirofosforylazy podlegających zmniejszonej regulacji allosterycznej („deregulowanych”), a bardziej korzystnie, nie podlegających w znaczącym stopniu regulacji allosterycznej („nieregulowanych”) przy zachowaniu odpowiedniej aktywności katalitycznej. Strukturalna sekwencja kodująca dla bakteryjnego lub roślinnego enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy może być zmutagenizowana w E. coli albo w innym odpowiednim gospodarzu i przesiewana na zwiększone wytwarzanie glukogenu, co opisano dla genu glgC16 z E. coli. Należy zaznaczyć, że użycie genu kodującego ADPglukozo-pirofosforylazę, która jest jedynym obiektem dla modulatorów (aktywatorów i inhibitorów) występujących w wybranej roślinie w ilościach, które nie hamują w znaczącym stopniu aktywności katalitycznej tego enzymu, nie będzie wymagało modyfikowania enzymu (genu). Takie „nieregulowane” lub „deregulowane” geny ADP-glukozo-pirofosforylazy wprowadza się następnie do roślin przez insercję, co jest podane w opisie, uzyskując transgeniczne rośliny o zwiększonej zawartości skrobi.
Przykładowo, dowolny gen ADP-glukozo-pirofosforylazy można klonować do E. coli B, szczepu AC70R1-504 (Leung, 1986). Ten szczep ma defektywny gen ADP-glukozopirofosforylazy, o ekspresji 5- do 7-krotnie niższej w stosunku do genów dla innych enzymów biosyntezy glikogenu. Taki gen lub cDNA dla ADP-glukozo-pirofosforylazy można wbudować do plazmidu za promotorem E. coli glgC lub za dowolnym innym promotorem bakteryjnym. Taką konstrukcję poddaje się sterowanej miejscem albo losowej mutagenezie. Po mutagenezie, komórki posiewa się na pożywkę wzbogaconą 1% glukozą. Po uzyskaniu rozwoju kolonii, płytki zalewa się roztworem jodu o składzie: 0,2% wagowo-objętościowych jodu, 0,4% wagowo-objętościowych KJ w wodzie (Creuzet-Sigal, 1972). Przez porównanie z identyczną płytką zawierającą niemutowane kolonie E. coli można wykryć kolonie wytwarzające więcej glikogenu przez ich intensywniejsze zabarwienie.
Ponieważ procedura mutagenezy może powodować mutacje promotora, należy powtórnie klonować każdy przypuszczalny mutant genu ADP-glukozo-pirofosforylazy z pierwszej rundy skriningu do niemutowanego wektora i prowadzić skrining powstałego plazmidu w ten sam sposób. W mutantach, po dwu rundach skriningu oznacza się aktywności ADP-glukozopirofosforylazy z dodatkiem i bez dodawania aktywatorów-' i inhibitorów. Nowy mutant można scharakteryzować przez porównanie odpowiedzi mutowanych ADP-glukozo-pirofosforylaz na aktywatory i inhibitory z reakcjami enzymów niezmutowanych.
Plaxton i Preiss (1987) wykazali, że ADP-glukozo-pirofosforylaza bielma kukurydzy ma właściwości regulacyjne podobne do tych, jakie wykazują ADP-glukozo-pirofosforylazy innych roślin. Autorzy ci wykazali, że opisywane we wcześniejszych pracach spostrzeżenie, że ADPglukozo-pirofosforylaza bielma kukurydzy wykazuje zwiększoną aktywność w obecności aktywatora (3-PGA) i obniżoną wrażliwość na inhibitor (Pi tłumaczy się rozszczepieniem proteolitycznym tego enzymu podczas procedury izolacji. Zmieniając gen ADP-glukozo-pirofosforylazy tak, aby wytwarzał enzym analogiczny do rozszczepionej proteolitycznie ADP-glukozopirofosforylazy endospermy kukurydzy można uzyskać obniżoną regulację allosteryczną.
W celu oznaczenia aktywności ADP-glukozo-pirofosforylazy w ciekłej hodowli E. coli, komórki wirowano w wirówce i zawieszano w około 2 ml buforu do ekstrakcji (0,05 M glicyloglicyny o pH = 7,0, 5,0 mM DTE, 1,0 mM EDTA) na gram pasty komórek. Komórki poddawano lizie przepuszczając je dwukrotnie przez prasę francuską. Ekstrakty komórkowe wirowano w mikrowirówce przez 5 minut i supematanty odsalano przez przepuszczenie przez kolumnę spinową G-50.
Stosowano próbę enzymatyczną na syntezę adenozynodifosforanu glukozy (ADP glukozy) będącą modyfikacją techniki opublikowanej przez Haugen’a (Haugen i wsp., 1976). Każda mieszanina analityczna w ilości 100 pl zawierała: 10 pmoli odczynnika Hepes (pH = 7,7), 50 pg BSA, 0,05 pmola 14C-glukozo-1-fosforanu, 0,15 pmola ATP, 0,5 pmola MgCĘ, 0,1 pg krystalicznej nieorganicznej pirofosfatazy z drożdży, 1 mM molibdenianu amonowego, enzym, aktywatory albo inhibitory według potrzeby i wodę. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C w czasie 10 minut po czym reakcję zatrzymywano przez gotowanie
180 247 w czasie 60 sekund. Próbkę odwirowano w mikrowirówce i 40 pl supematantu wstrzykiwano na kolumnę HPLC aniono-wymienną Synchrom Synchropak AX-100. Próbkę eluowano 65 mM roztworem KPi (pH = 5,5). Nieprzereagowany l4C-gluk0zo-1-fosforan eluował wokoło 7-8 minucie, 14C-ADP-glukoza eluowała w około 13 minucie. Aktywność enzymu oznaczano jako ilość radioaktywności wykrywanej w piku ADP-glukozy.
Aktywność enzymu roślinnego, ADPGPP, jest ściśle regulowana czynnikami zarówno dodatnimi (3-glicerofosforan; 3-PGA) jak i negatywnymi (fosforan nieorganiczny; Pi), co opisali Ghosh i Preiss (1966), Copeland i Preiss (1981), Sowokinos i Preiss (1982), Moreli i wsp., 1987), Plaxton i Preiss (1987), Preiss (1988). Stosunek 3-PGA do Pi odgrywa ważną rolę w regulowaniu biosyntezy skrobi na drodze modulowania aktywności ADPGPP (Santarius i Heber, 1965; Heldt i wsp., 1977; Kaiser i Bassham, 1979). Roślinne enzymy ADPGPP sąheterotetramerami dwu podjednostek dużych „zmarszczonych” i dwu podjednostek małych „kruchych” (Moreli i wsp., 1987; Lin i wsp., 1988a, 1988b; Krishnan i wsp., 1986; Okita i wsp., 1990) i istnieje mocny dowód na to, że heterotetramer jest najbardziej aktywną formą ADPGPP. Potwierdzeniem tej hipotezy jest fakt wyizolowania „bezskrobiowych” mutantów roślin, w których nie występują żadne te podjednostki (Tsai i Nelson, 1966; Dickinson i Preiss, 1969; Lin i wsp., 1988a, 1988b) a także charakteryzacja „ADPGPP” homotetrameru złożonego z małych podjednostek, u którego stwierdzono bardzo niską aktywność enzymu (Lin i wsp., 1988b). Ponadto, dla obydwu podjednostek zidentyfikowano pozostałości zakładanych interakcji efektorowych (Moreli i wsp., 1988). Bezpośrednim dowodem na istnienie aktywnej formy tego enzymu i dalszym potwierdzeniem danych kinetycznych opisanych dla oczyszczonego enzymu ziemniaczanego jest ekspresja aktywności ziemniaczanej ADPGPP w E. coli i porównanie własności kinetycznych tego materiału z materiałem pochodzącym z bulw ziemniaczanych (Iglesias i wsp., 1993).
Nieregulowane warianty roślinnego enzymu ADPGPP zidentyfikowano i scharakteryzowano w sposób podobny do tego, jaki wynikał z izolacji E. coli glgC16 i mutantów pokrewnych, takich jak glgC-SG5 i CL1136. Sklonowano wiele roślinnych cDNA dla ADPGPP lub części tych cDNA dla dużych i małych podjednostek, pochodzących zarówno z roślin jednoliściennych jak i dwuliściennych (Anderson i wsp., 1989a; Olive i wsp., 1989; Muller i wsp., 1990; Bhave i wsp., 1990; du Jardin i Berhin, 1991; Smith-White i Preiss, 1992). Białka kodowane przez roślinne cDNA jak również te, które opisano w bakteriach wykazują wysoki stopień zachowawczości (Bhave i wsp., 1990). W szczególności wykryto wysoce konserwatywny region, również zawierający pewne reszty, którym przypisuje się funkcję enzymu, a także interakcje efektorowe (Moreli i wsp., 1988; du Jardin i Berhin, 1991). Zidentyfikowano klony genów dla podjednostki ADPGPP bulw ziemniaczanych. Należy do nich całkowity gen małej podjednostki otrzymany przez dodanie sekwencji z pierwszego egzonu klonu genomowego z prawie pełnej długości klonem cDNA tego samego genu dla dużej podjednostki. Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NR: 7) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NR: 8) skonstruowanego genu dla małej podjednostki jest podana poniżej. Przedstawiona sekwencja nukleotydowa różni się od genu pierwotnie wyizolowanego następująco: w kodonie ATG wprowadzono miejsce dla BglII+Ncol dla ułatwienia klonowania tego genu do E. coli i do roślinnych wektorów ekspresyjnych techniką sterowanej miejscem mutagenezy z wykorzystaniem oligonukleotydowej sekwencji primera:
GTTGATAACAAGATCTGTTAACCATGGCGGCTTCC (SEQ ID NR: 11).
Miejsce SacI wprowadzono przy kodonie stopu wykorzystując oligonukleotydową sekwencję primera:
CCAGTTAAAACGGAGCTCATCAGATGATGATTC (SEQ ID NR: 12).
Miejsce SacI służy jako miejsce 3' klonowania. Usunięto wewnętrzne miejsce BglII wykorzystując oligonukleotydową sekwencję primera: GTGTGAGAACATAAATCTTGGATATGTTAC (SEQ ID NR: 13).
Ekspresji tak skonstruowanego genu dokonano w E. coli pod kontrolą promotora recA w kasecie ekspresyjnej P recA-gen10L (Wong i wsp., 1988) otrzymując mierzalne poziomy białka. Inicjujący kodon metioniny wbudowano w procesie sterowanej miejscem mutagenezy stosując oligonukleotydową sekwencję primera:
180 247
GAATTCACAGGGCCATGGCTCTAGACCC (SEQ ID NR: 14) do ekspresji dojrzałego genu.
Sekwencja nuklkotyCowa (SEQ ID NR: 9) i sekwencja aminokwasow-a (SEq ID NR: 10) prawie całkowitego genu dla dużej padjednostki są podane poniżej. Inicjujący kodon metioniny umieszczono w miejscu dojrzałego N-końca w procesie kierowanej miejscem mutagenezy wykorzystując dligonukleotydową sekwencję primera:
AAGATCAAACCTGCCATGGCTTACTCTGTGATCACTACTG (SEQ ID NR: 15)).
Celem wprowadzenia inicjującego kodom metioniny było ułatwienie ekspresji genu tej dużej padjednostki w E. coli. Miejsce HindIII ulokowano w odległości 103 par zasad za kodonem stopu. Służy ono jako miejsce klanowenie 3'. Całkowity gen dla dużego enzymu ADPGPP wyizolowano w procedurze 5' RACE (Szybka amplifikecja końców cDNA; Frohman, 1990; Frohman i wsp., 1988; Loh i wsp., 1989). Do tej procedury użyto następujących primerów oligoruklkoty'Cowych:
1) GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGGCCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NR: 16);
2) GGGAATTCAAGCTTGGATCCCGGG (SEQ ID NR: 17) i
3) CCTCTAGACAGTCGATCAGGAGCAGATGTACG (SEQ ID NR: 18).
Pierwsze dwa primery są równoważne z primerami ANpoliC i AN według LoUa i wsp. (1989), a trzeci primer jest odwrotnie komplementarny do sekwencji w genie dla dużego enzymu ADPGPP. Produkty sekwencji 5' z reakcji PCR klonowano jako fragmenty EcoRI/HindIII/BamHI-PstI i z łatwością wbudowywano do istniejących części genu.
Mutanty enzymu ADPGPP o słabej regulacji zidentyfikowano zbierając początkowo kolonie z hodowli mutagenizowanej E. coli wykazującej podwyższony poziom syntezy glikogenu przez barwienie jodem 24-28 godzinnych kolonii na płytkach z agarem Luria-Agar zawierających 1% glukozy, a następnie charakteryzując odpowiedzi enzymów ADPGPP z tych izolatów na czynniki dodatnie i ujemne (Cattereo i wsp., 1969; Prciss i wsp., 1971). Podobne podejście zastosowano do izolacji takich wariantów- roślinnych enzymów ADPGPP. Mając układ ekspresyjny dla genów dla każdej podjednostki, prowadzono oddzielnie mutagenezę każdego genu jednym ze znanych sposobów chemicznych lub fizycznych (Miller, 1972) w hodowlach zawierających gen lub na oczyszczonym DNA. Innym podejściem było zastosowanie reakcji PCR (Ehrlich, 1989) na całkowitym genie w obecności hamujących jonów Mn++, w warunkach, które prowadzą do dużej częstości luk we wbudowywaniu nukleatyCów. Procedurę PCR można również zastosować z primkremi bezpośrednio sąsiadującymi ze specyficznym regionem genu i taki zmutagenizowany fragment reklonować do niezmutowanych fragmentów genu. Do generowania wysoce zmutowanego krótkiego regionu genu można użyć również procedurę mutagenezy losowej z użyciem syntetycznych oligonukleotydów, mieszając nukleatydy w reakcji syntezy, uzyskując luki we wbudowywaniu we wszystkich pozycjach w tym regionie. Ten mały region jest flankowany miejscami restrykcyjnymi, które stosowano do reinsercji tego regionu do pozostałej części genu. Następnie wykonywano skrining wytworzonych hodowli lub transformantów standardową metodą z jodem, poszukując tych, które wykazują poziomy glikogenu wyższe od kontrolnych. Korzystnie, ten skrining prowadzi się w szczepie E. coli z deficytem jedynie aktywności ADPGPP o fenotypie: glikogen (-) następnie uzupełnionym fenotypem: glikogen (+) przez glgC. Szczep E. coli pawinikr zachować te inne rodzaje aktywności potrzebne do wytwarzania glikogenu. Ekspresji obydwu genów dokonuje się łącznie w tym samym gospodarzu E. coli, umieszczając te geny w zgodnych plazmidach wraz z różnymi genami służącymi jako markery selekcji, przy czym te plazmidy cechują się również podobną ilością kopii w gospodarzu bakteryjnym, co maksymalizuje powstawanie
Przykładem takiego układu ekspresyjnego jest kombinacja pMON17335 i pMON17336 (Iglesias i wsp., 1993). Użycie oddzielnych plazmidów umożliwia skrining /mutagenizowanej populacji tylko jednego genu albo w połączeniu z drugim genem po transformacji do kompetentnego gospodarza, w którym zachodzi ekspresja drugiego genu oraz skrining dwu zmutagenizowanych populacji po połączeniu ich w tym samym gospodarzu. Po powtórnej izolacji plazmidowego DNA z kolonii o większej intensywności barwienia jodem reklonuje się sekwencje kodujące ADPGPP do wektorów ekspresyjnych, spraw-dza się fenotyp i aktywność ADPGPP oraz oznacza się odpowiedzi na cząsteczki efektorowe. Warianty ulepszone będą
180 247 wykazywać zwiększone Vmax, zmniejszone hamowanie przez czynnik negatywny (Pi) lub zmniejszoną zależność od aktywatora (3-PGA) dla aktywności maksymalnej. Próba na takie ulepszone właściwości polega na oznaczeniu aktywności ADPGPP wobec Pi w stężeniu 0,045 mM (I0,5 = 0,045 mM) albo w obecności 3-PGA w stężeniu 0,075 mM (Aq,5 = 0,075 mM). Użyteczne warianty będą wykazywać < 40% hamowanie przy takim stężeniu Pi albo > 50% wzrost aktywności przy tym stężeniu 3-PGA. Po izolacji ulepszonych wariantów i oznaczeniu odpowiedzialnej podjednostki lub podjednostek, oznacza się mutacje metodą sekwencjonowania nukleotydów. Mutację potwierdzano przez powtórne otrzymanie tej zmiany metodą sterowanej miejscem mutagenezy i powtórne oznaczenie aktywności ADPGPP wobec aktywatora i inhibitora. Tę mutację przenoszono następnie do równoważnego, całkowitego genu cDNA dla ADPGPP przez reklonowanie regionu zawierającego zmianę ze zmienionej bakteryjnej formy ekspresyjnej do formy roślinnej zawierającej sekwencję kierującą do amyloplastu albo prowadząc kierowaną miejscem mutagenezę genu dla całkowitego roślinnego enzymu ADPGPP.
Przykład I. Konstruowanie wektorów DNA do ekspresji genu glgC16.
W celu ekspresji genu glgC16 z E. coli w komórkach roślinnych i skierowania enzymu do piastydów należało dokonać fuzji tego genu z DNA kodującym peptyd tranzytowy kierujący do plastydu (w dalszej części zwany genem CT'P/.ADP-glukozo-pirofosforyla/.y) i wprowadzić go do właściwych regionów regulacyjnych rośliny. Dokonano tego przez klonowanie genu glgC16 do serii wektorów plazmidowych posiadających żądane sekwencje.
Plazmid pLP226 zawiera gen glgC16 we fragmencie Hindll, klonowanym do wektora pUC 8 w miejscu Hindll (Leung i wsp., 1985). Plazmid pLP226 otrzymano od dr Jack’a Preiss'a z Michigan State University i transformowano nim zamrożone kompetentne komórki E. coli JM101, preparowane metodą z użyciem chlorku wapniowego (Sambrook i wsp., 1989). Transformowane komórki posiewano na płytki 2XYT (jak wyżej) zawierające ampicylinę w stężeniu 100 pg/ml. Plazmid pLP226 oczyszczano stosując procedurę szybkiej ekstrakcji alkalicznej (RAE) z 5 ml jednodniowej hodowli (Bimboim i Doły, 1979).
Do fuzji genu glgC16 z DNA kodującym tranzytowy peptyd chloroplastu było potrzebne miejsce Ncol na końcu 5' tego genu. Do przeniesienia genu CTP/ADP-glukozo-pirofosforylazy do następnego wektora potrzebne było również miejsce SacI, w dół od kodonu zakańczania. W celu wprowadzenia tych miejsc prowadzono reakcję amplifikacji z udziałem polimerazy, PCR (#13), stosując jako matrycę około 20 ng plazmidu pLP226 oczyszczonego przez szybką ekstrakcję alkaliczną. Reakcję prowadzono według wskazówek producenta (Perkin Elmer Cetus). Jako primery stosowano QSP3 i QSP7. QSP3 zaprojektowano tak, aby wprowadzić miejsce NcoI, które mogłoby zawierać kodon startu dla genu glgC16. Primer QSP7 hybrydyzuje z nie podlegającym translacji regionem 3' genu glgC16 i dodaje miejsce SacI. Aparat „Thermal Cycler” zaprogramowano na 30 cykli z etapem denaturacji w czasie 1 minuty w temperaturze 94°C, etapem wiązania w czasie 2 minut w temperaturze 50°C i etapem wydłużenia w czasie 3 minut w temperaturze 72°C. Po każdym cyklu przedłużano etap wydłużenia o 15 sekund.
Primer QSP3: 5' GGAGTTAGCCATGGTTAGTTTAGAG 3' (Sekwencja ID NR: 19).
Primer QSP7: 5' GGCCGAGCTCGTCAACGCCGTCTGCGATTTGTGC 3' (Sekwencja SEQ ID NR: 20).
Produkt reakcji PCR' klonowano do wektora pGEM3zl+ (Promega, Madison, WI) uprzednio trawionego enzymami SacI i HindIII, posiadającego DNA dla modyfikow-amej małej podjednostki CTP a Arabidopsis, ligowanej w miejscu HindIII. Ten DNA i sekwencje aminokwasowe CTP są przedstawione odpowiednio na sekwencjach SEQ ID NR: 5 i SEQ ID NR.: 6.
.Linearyzowany wektor traktowano 5 jednostkami alkalicznej fosfatazy z jelit cielęcych w czasie 30 minut w temperaturze 56°C. Następnie zarówno wektor jak i fragment cyklu 13 (#13) reakcji PCR zawierający gen glgC16 z nowymi miejscami NcoI i SacI poddawano elektroforezie w żelu agarozowym, po czym fragmenty oczyszczano przez wiązanie do błon DEAE. Do oczyszczania tego fragmentu na błonie DEAE zastosowano procedurę Schleicher’a i Schuell'a' pod tytułem „Wiązanie i odzysk DNA i RNA z zastosowaniem błony S i S DEAE”.
180 247
W ligacji #5 dokonano fuzji genu glgC16 i DNA dla modyfikowanej SSU CTP z Arabidopsis z plazmidem pGEM3zf+. Mieszanina ligacyjna zawierała 3 pl wektora, uprzednio trawionego enzymami NcoI i SacI oraz 3 pl produktu CPR z cyklu 13, uprzednio ciętego enzymami NcoI i SacI i powtórnie oczyszczonego z żelu. Ilość 5 pl (z całkowitej ilości 20 pl) mieszaniny ligacyjnej #5 użyto do transformacji zamrożonych, kompetentnych komórek JM101, po czym transformowane komórki posiewano na płytkach 2XYT o składzie: 16 g/litr pożywki Bactotriptone, 10 g/litr wyciągu drożdżowego, 10 g/litr NaCl ( pH = 7) zestalonych 1,5% agarem z dodatkiem ampicyliny.
Po dobowym wzroście z płytki pobrano próbkę 1. Próbkę tę inokulowano do 4 ml pożywki 2XYT i prowadzono wzrost w temperaturze 37°C. Plazmid izolowano metodą szybkiej ekstrakcji alkalicznej i DNA trawiono enzymami EcoRI, NcoI oraz łącznie EcoRI i NcoI. Produkty trawienia rozdzielano na żelu agarozowym i obserwowano spodziewane fragmenty. Plazmid izolowany z próbki 1 oznaczono nazwą pMON20100. Zawierał on pGEM3zf+, DNA dla modyfikowanej SSU CTP z Arabidopsis i gen glgC16. Fuzja nastąpiła w orientacji pozwalającej na transkrypcję z promotora polimerazy SP6.
W celu badania tej konstrukcji służącej do importu ADP-glukozo-pirofosforylazy do izolowanych chloroplastów sałaty, trzeba, aby gen dla białka fuzyjnego, CTP/ADP-glukozopirofosforylazy, podlegał transkrypcji i translacji z wytworzeniem zaznaczonej [35S]-ADPglukozo-pirofosforylazy. Dla uzyskania matrycy DNA do transkrypcji przez polimerazę SP6, region CTP/ADP-glukozo-pirofosforylazy z plazmidu pMON20100 amplifikowano w reakcji PCR w celu generowania dużej ilości liniowego DNA. Aby tego dokonać, około 0,1 pl pMON20100 uprzednio oczyszczonego metodą szybkiej ekstrakcji alkalicznej użyto jako matrycę w reakcji PCR w 80 cyklach. Jako primery zastosowano handlowo dostępny primer promotora SP6 (Promega) i oligo QSP7 (sekwencja SEQ ID NR: 20). Primer SP6 hybrydyzował z promotorem SP 6 w wektorze i zawierał całą sekwencję promotora SP6. Tak więc, produkt PCR z tym primerem oligonukłeotydowym QSP7 będzie zawierał sekwencję rozpoznawaną przez polimerazę SP6. Primer QSP7 (sekwencja SEQ ID NR: 20) będzie hybrydyzował w nie podlegającym translacji 3' regionie genu glgC16. Jest to ten sam primer, który był użyty do wprowadzenia miejsca SacI w dół od kodonu zakańczania glgC16. Aparat „Thermal Cycler” zaprogramowano na 30 cykli z etapami 1 minutowych denaturacji w temperaturze 94°C, 2 minutowych reakcji wiązania w temperaturze 55°C i 3 minutowych reakcji wydłużania w temperaturze 72°C. Po każdym cyklu do etapu wydłużania dodawano 15 sekund.
Primer promotora SP6: 5' GATTTAGGTGACACTATAG 3' (SEQ ID NR: 21).
Ilość 5 ul mieszaniny z reakcji PCR #80 poddano elektroforezie w żelu agarozowym i oczyszczano przez wiązanie na błonie DEAE. DNA eluowano i rozpuszczano w 20 pl TE. Ilość 2 μ1 oczyszczonego w żelu produktu reakcji PCR #80 użyto w reakcji ti^^mskrypcji in vitro z udziałem polimerazy RNA SP6. Stosowano warunki reakcji opisane przez dostawcę (Promega) dla syntezy dużych ilości RNA (reakcja w 100 μ1). RNA wytworzony w reakcji PCR #80 DNA użyto w reakcji translacji in vitro w układzie lizatu retikulocytów królika (Promega). Znakowane 35S-białko uzyskane z pMON20100 (np. w reakcji PCR #80) użyto w uprzednio opisanej próbie importu chloroplastu in vitro. Po próbie importu chloroplastu, próbki poddano elektroforezie w żelach SDS-PAGE w gradiencie 3 do 17% poliakryloamidu. Następnie żele utrwalano w czasie 20-30 minut w roztworze zawierającym 40% metanolu i 10% kwasu octowego, moczono w odczynniku E^HANCE™ przez 20 do 30 minut i suszono je w suszarce do żeli. Żele poddawano autoradiografii stosując ekran intensyfikujący i ekspozycję dobową. Wyniki próby wykazują, że białko fuzyjne zostało importowane do izolowanych chloroplastów.
Konstrukcję w plazmidzie pMON20100 przerobiono następnie tak, aby można było dokonać jej fuzji do wzmocnionego promotora CaMV 35S (Kay R., 1987) i do końca 3' NOS (Bevan M., 1983) wyizolowanego z pMON999. W reakcji PCR #114 wykorzystano plazmid MON20100 jako matrycę i użyto primery QSM11 i QSM10. QSM11 łączono z DNA dla modyfikowanego SSU CTP z Arabidopsis i utworzono miejsce BglII w odległości 7 par zasad w górę od kodonu startu ATG. QSM10 łączono do miejsca 3' genu glgC16 i dodawano miejsce XbaI bezpośrednio za kodonem zakańczania oraz dodano miejsce SacI w odległości 7 par
180 247 zasad za kodonem zakańczania. Miejsce SacI, które dodano wcześniej do genu glgC16 znajdowało się w odległości około 100 par zasad w dół od kodonu zakańczania. Aparat „Thermal Cycler” zaprogramowano na 25 cykli, z denaturacją w czasie 1 minuty i temperaturą równą 94°C, wiązaniem w czasie 2 minut w temperaturze 55°C i z 3 minutowymi etapami wydłużania w temperaturze 72°C. Po każdym cyklu dodawano 15 sekund do etapu wydłużania.
Primer QSM11 (SEQ ID NR: 22):
5' ACiAGAGATCTAGAACAATGGCTTCCAiCTÓAIOCdCGETTCC.GC 3'.
Primer QSM10 (SEQ ID NR: 23):
5' GGCCGAGCTCTAGATTATCGCTCCTGTTTATGCCCTAAC 3'.
Z ogólnej objętości 100 pl reakcji PCR #114 pobrano próbkę 95 pl, strącono ją etanolem i zawieszono w 20 pl buforu TE. Ilość 5 pl tej zawiesiny trawiono 4 jednostkami BglII i 10 jednostkami SacI przez dobę w temperaturze 37°C. W ten sam sposób trawiono 5 pl (5 pg) wektora pMON999, który zawiera wzmocniony promotor CaMV 35S i koniec 3' NOS. Po trawieniu enzymami restrykcyjnymi ten DNA poddawano elektroforezie na żelach agarozowych i oczyszczano przez wiązanie z błonami DEAE. Następnie każdy DNA rozpuszczano w 20 pl TE. Ilość 1 pl mieszaniny z reakcji PCR #114 ligowano z ilością 3 pl wektora w całkowitej objętości 20 pl. Mieszaninę ligacyjną inkubowano w temperaturze 14°C w czasie 7 godzin. Ilością 10 pl tej mieszaniny ligacyjnej transformowano zamrożone kompetentne komórki MM294 i posiewano je na płytki LB o składzie: 10 g/litr Bacto-tryptonu, 5 g/litr wyciągu drożdżowego, 10 g/litr NaCl i 1,5% agaru do zestalenia, z dodatkiem 100 pg/ml ampicyliny. Kolonie zebrano, zaszczepiono nimi probówki zawierające po 5 ml pożywki LB z dodatkiem 100 pg/ml ampicyliny i prowadzono hodowlę przez dobę. Te 5-mililitrowe, dobowe hodowle użyto do szybkich ekstrakcji alkalicznych w celu wyizolowania plazmidowego DNA. Te DNA trawiono enzymem EcoRI i oddzielne próbki trawiono restrykttaąNotI. Po analizie tych próbek w żelach agarozowych potwierdzono, że plazmid pMON20102 posiada fragment EcoRI o długości 497 par zasad, charakterystyczny dla genu glgC16. Ten plazmid zawiera również fragment NotI o długości 2,5 kilozasad zawierający wzmocniony promotor CaMV 35S, DNA dla modyfikowanego SSU CTP z Arabidopsis, gen glgC16 i koniec 3' NOS.
Plazmid pMON20102 użyto następnie do konstruowania wektora DNA, w którym mogłaby zachodzić ekspresja glgC16 w sposób specyficzny dla bulw i który mógłby być użyty do transformowania ziemniaka. Ta konstrukcja powoduje specyficzną ekspresję ADPGPP w bulwach ziemniaczanych i zwiększa poziom skrobi w bulwach.
Wektor użyty do transformowania ziemniaka jest pochodną wektora pMON886 do transformowania roślin modyfikowanego Agrobacterium. Ten plazmid pMON886 składa się z następujących, dobrze scharakteryzowanych segmentów DNA: z fragmentu o wielkości 0,93 kilozasad wyizolowanego z transpozonu Tn7 kodującego oporność bakterii na spektynomycynę i streptomycynę (Spc/Str) i jest determinantą do selekcji w E. coli i w Agrobacterium tumefaciens (Fling i wsp., 1985). Jest on złączony z chimerowym genem oporności na kanamacynę zaprojektowanym do ekspresji w roślinach i pozwalającym na selekcję transformowanej tkanki. Ten chimerowy gen składa się z promotora wirusa mozaiki kalafiorowej 35S o wielkości 0,35 kilozasad (P-35S; Odell i wsp., 1*985), genu fosfotransferazy neomycyny typu II o wielkości 0,83 kilozasad (NPTII) i z 3' nie podlegającego translacji regionu genu syntetazy nopaliny o wielkości 0,26 kilozasad (NOS 3', Fraley i wsp., 1983). Następnym segmentem jest źródło replikacji o wielkości 0,75 kilozasad z plazmidu PK2 (ori-V) opisane przez Stalkera i wsp. (1981). Jest ono połączone z segmentem SalI do Pvul o wielkości 3,1 kilozasad z plazmidu pBR322, który dostarcza źródła replikacji dla utrzymania się w E. coli (ori-322) i miejsca bom do koniugacyjnego przeniesienia do komórek Agrobacterium tumefaciens. Następnym segmentem jest fragment Pvul o wielkości 0,36 kilozasad z plazmidu pTiT37, który zawiera prawy region graniczny T-DNA typu nopaliny (Fraley i wsp., 1985).
Gen glgC16 został skonstruowany do ekspresji głównie w bulwach przez, jego umieszczenie pod kontrolą promotora swoistego dla bulw. Białko GlgC16 jest kierowane do plastydów w komórce roślinnej w wyniku jego syntezy jako C-terminalnej fuzji z N-terminalną porcją białka kodowanego przez sekwencję kierującą do chloroplastów (CTP) pochodzącą z genu SSU 1A z Arabidopsis thaliana (Timko i wsp., 1989). Część CTP jest usuwana pod14
180 247 czas procesu importu z uwolnieniem enzymu GlgC16. Inne sygnały ekspresji w roślinach zawierają również sekwencje 3' poliadenylacji wprowadzone przez sekwencje NOS 3' zlokalizowane w dół od części kodującej kasety ekspresyjnej. Kasetę konstruowano następująco: promotor patatyny wycięto z plazmidu pBI241.3 jako fragment HindIII-BamHI (plazmid pBI241.3 zawiera segment promotora patatyny-1 składający się z miejsca AccI w pozycji 1323 do miejsca DraI w pozycji 2289 (numery pozycji odnoszą się do sekwencji opisanej przez Bevana i wsp., 1986) z łącznikiem HindIII dodanym w pierwszej pozycji i łącznikiem BamHI dodanym w ostatniej pozycji (Bevan i wsp., 1986). Ten promotor patatyny poddano ligacji z fuzją CTPl-glgC16 (fragment BglII-SacI z plazmidu pMON20W2) i z wektorem plazmidowym typu pUC uprzednio ciętym enzymami HindIII i SacI (te miejsca klonowania w wektorze są flankowane przez miejsca rozpoznawane przez NotI). Taką kasetę wprowadzano jako miejsce NotI w pMON886, w taki sposób, że ekspresja genu glgC16 przebiega w tej samej orientacji jak genu NPTII (kanamycyny). Ta pochodna, pod nazwą pMON2O113 jest przedstawiona na fig. 7 publikacji zgłoszenia PCT, WO 91/19806 dokonanego przez Kishore. Transformacja i regeneracja roślin
Wektor pMON20113 mobilizowano w rozbrojonym szczepie Agrobacterium tumefaciens w trójrodzicielskim układzie koniugacyjnym stosując pomocniczy plazmid pRK2013 (Ditta i wsp., 1980). Ten rozbrojony szczep ABI zawierał w sobie plazmid Ti, który został rozbrojony przez usunięcie genów fitohormonu odpowiedzialnego za chorobę guzowatości korzeni. Szczep ABI jest Agrobacterium tumefaciens A208 posiadającym rozbrojony plazmid pTiC58, pMP90RK (Koncz i Schell, 1986). Ten rozbrojony plazmid Ti posiada funkcje genu trFA wymagane do autonomicznej replikacji wektora pMON po koniugacji do szczepu ABI. Kiedy tkankę roślinną inkubuje się z koniugatem ABI::pMON wówczas wektor jest przenoszony do komórek roślinnych dzięki funkcjom vir kodowanym przez rozbrojony plazmid Ti, pMP90RK.
Konstrukcją. pMON2O113, kodującą bakteryjny gen ADPGPP (SEQ ID NR: 1) transformowano ziemniaki Russet Burbank, odmianę Williams w następującej procedurze. Do transformacji ziemniaków Russet Burbank, sterylne hodowle odrośli Russet Burbank utrzymywano w pojemniczkach do lodów zawierających 8 ml pożywki PM wzbogaconej ilością 25 mg/litr kwasu askorbinowego. Pożywka ta, opisana przez Murashige i Skoog’a (MS) zawiera sole nieorganiczne, 30 g/litr sacharozy, 0,17 g/litr NaH2PO,( x H2O, 0,4 mg/litr chlorowodorku tiaminy i 100 mg/litr mioinozytolu i jest zestalona ilością 2 g/litr „Gerlite” (pH = 6,0).
Kiedy odroślą osiągały około 5 cm długości, wycinano segmenty międzywęźli łodyg o długości 3 do 5 mm i zaszczepiano je rozcieńczeniem 1:10 jednodniowej hodowli Agrobacterium tumefaciens z 4-dniowej hodowli na płytce. Te przeszczepy hodowano wspólnie przez 2 dni w temperaturze 20°C na sterylnej bibule filtracyjnej umieszczonej nad 1,5 ml warstwą komórek tytoniu jako żywicielu, nałożonej na pożywkę 1/10 P [1/10 stężenia soli nieorganicznych MS z dodatkiem związków organicznych bez kazeiny, tak jak w pożywce Jarret’a (1980), 30 g/litr sacharozy i 8,0 g/litr agaru]. Po wspólnej hodowli, przeszczepy przenoszono do pożywki P-1 o pełnym stężeniu w celu indukowania powstania kallusa. Pożywka zawierała sole nieorganiczne MS, dodatki organiczne według Jarrefa i wsp. (1980), za wyjątkiem kazeiny, 5,0 mg/litr rybozydu zeatyny (ZR) i 0,10 mg/litr kwasu naftalenooctowego (NAA; jarret i wsp., 1980a, 1980b). Dla zahamowania wzrostu bakterii dodano karbenicylinę (500 mg/litr) i cefotaksim (100 mg/litr) oraz 100 mg/litr kanamycyny w celu selekcji komórek transformowanych.
Po 4 tygodniach przeszczepy przenoszono do pożywki o tym samym składzie, z tym, że zamiast NAA dodawano 0,3 mg/litr kwasu giberelinowego (GA3) (Jarret i wsp., 1981) dla pobudzenia tworzenia się odrośli. Odroślą zaczynały się rozwijać po około 2 tygodniach od przeniesienia na podłoże indukujące powstawanie odrośli. Odroślą te wycina się i przenosi do fiolek z pożywką PM w celu ukorzeniania. Po około 4 tygodniach wzrostu na pożywce indukującej powstawanie korzeni, rośliny przenoszono do gleby i stopniowo hartowano. W odroślach oznaczano oporność na kanamycynę nadaną przez enzym, fosfotransferazę neomycynową II, umieszczając te odroślą na pożywce PM w celu ukorzenienia, która to pożywka zawierała 50 mg/litr kanamycyny dla selekcji komórek transformowanych.
180 247
Regenerowane w hodowli ziemniaki Russet Burbank Williams wysadzano do doniczek o średnicy 6 cali (około 15,24 cm) i prowadzono ich wzrost do okresu dojrzałości w warunkach cieplarnianych. Następnie zbierano bulwy i pozostawiano do skorkowacenia w temperaturze pokojowej w ciągu 2 dni. Wszystkie bulwy większe od 2 cm długości zebrano i przechowywano w temperaturze 3°C w warunkach wysokiej wilgotności.
Ciężar właściwy i oznaczenia skrobi w przechowywanych bulwach
Ciężar właściwy (SG) oznaczano po 3 i 4 miesiącach przechowywania w niskiej temperaturze (3°C) biorąc do oznaczeń naj większe 2 lub 3 bulwy z każdej rośliny o typowej wadze 20-40 gram na bulwę. Na kilka godzin przed oznaczaniem ciężaru właściwego bulwy ogrzewano do temperatury pokojowej w czasie kilku godzin ale nie pozwalano na ich rekondycjonowanie. Ciężar właściwy oznaczano metodą ważenia w powietrzu i w wodzie i wyliczano ze wzoru:
SG = ciężar w powietrzu / (ciężar w powietrzu - ciężar w wodzie)
Procentową zawartość skrobi i procentową zawartość suchej masy wyliczano w oparciu o SG według wzorów (von Scheele, 1937):
procentowa zawartość skrobi = 17,546 + (199,07) (SG - 1,0988) procentowa zawartość suchej masy = 24,182 + (211,04) (Sg - 1,0988)
Analizę skrobi przeprowadzono na świeżych, środkowych sekcjach tkanki przechowywanych bulw w sposób opisany przez Lin’a i wsp. (1988). Nie pozwalano na ogrzanie się bulw przed pobraniem tkanki. Pokrótce, wycinano około 100 mg środkowych sekcji, ważono je, umieszczano w 1,5 ml probówkach do wirowania i zamrażano na suchym lodzie. Następnie tkankę suszono do stałej masy w koncentratorze „Savant Speed-Vac” i oznaczano końcową suchą masę. Na początku usuwano rozpuszczalne cukry przez trzykrotną ekstrakcję ilością 1 ml 80% etanolu w temperaturze 70°C w czasie 20 minut na jedno traktowanie. Po końcowej inkubacji usunięto cały pozostały etanol przez wysuszenie w koncentratorze „Speed-Vac”. Stały materiał zawieszano w 400 pl 0,2 M wodorotlenku potasowego, rozdrabniano i inkubowano w czasie 30 minut w temperaturze 100°C dla solubilizacji skrobi. Roztwory ziębiono i zobojętniano przez dodanie 80 pl 1 N kwasu octowego. Skrobię degradowano do glukozy przez działanie 14,8 jednostkami α-amylazy trzustkowej (Sigma Chemical, St. Louis) w czasie 30 minut, w temperaturze 37°C i następnie 10 jednostkami amyloglukozydazy (Sigma Chemical, St. Louis) w czasie 60 minut w temperaturze 55°C. Glukozę uwolnioną przez trawienie enzymatyczne oznaczano w zestawie z heksokinazą, Sigma, (St. Louis) i uzyskane wartości użyto do wyliczenia zawartości skrobi.
Analiza cukru
Przed analizą cukru bulwy przechowywano w temperaturze 3°C i nie pozwalano na rekondycjonowanie w temperaturze pokojowej. Z przechowywanych bulw wycinano środkowe wycinki i oznaczano ciężary świeżej masy. Następnie tkankę zamrażano na suchym lodzie i suszono w koncentratorze „Savant Speed-Vac”. Średnia waga świeżej masy na próbkę wynosiła 100 mg. Suchy materiał bulw grubo mielono i ekstrahowano cukry trzy razy ilością 0,5 ml 80% etanolu w temperaturze 70°C w czasie 20 minut na ekstrakcję. Po każdej inkubacji nierozpuszczony materiał wirowano przez 2 minuty w mikrowirówce i zebrano supernatant. Supernatanty ze wszystkich trzech ekstrakcji połączono, wysuszono i zawieszono w 1 ml 100 mM buforu Tris (pH = 7,5). Do każdej analizy cukru użyto 10 pl próbki.
Dla każdej próbki oznaczano zawartość glukozy w zestawie diagnostycznym Glucose [HK] firmy Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, postępując według przepisu podanego przez wytwórcę. Pokrótce, 1 ml rekonstytuowanego reagenta inkubowano z ilością 10 pl próbki w temperaturze pokojowej przez l0 minut, po czym oznaczano stężenie w próbce przez pomiar absorbancji przy długości fali 340 nm, odejmując adsorbancję próbki 10 pl w wodzie. Procentową zawartość glukozy wyliczano według równania:
% glukozy = [(A340 x 2,929) /mg świeżej masy] x 100%
Zawartość fruktozy oznaczano przez dodanie do powyższej mieszaniny do oznaczania glukozy 1 pg fosfoglukoizomerazy i odjęcie od zawartości glukozy sumy procentowej zawartości glukozy + fruktozy. Zawartość sacharozy oznaczono przez dodanie do próbki na oznaczanie glukozy HK 1 pg fosfoglukoizomerazy i 100 pg inwertazy drożdżowej i przez
180 247 wydłużenie czasu inkubacji do 30 minut w temperaturze pokojowej. Procentową zawartość sacharozy oznaczano jak powyżej, odejmując wartości otrzymane dla zawartości glukozy i fruktozy.
Hybrydyzacja Westerna przechowywanych bulw
Bulwom przechowywanym w temperaturze 3°C nie pozwalano na ogrzanie przed izolacją tkanki do analizy. Do hybrydyzacji Westerna białka ekstrahowano z wysuszonej pod próżnią, grubo zmielonej tkanki bulwy przez zmielenie w roztworze o składzie: 100 mM Tris (pH = 7,5), 35 mM KCl, 5 mM ditiotreitolu, 5 mM askorbinianu, 1 mM EDTA, 1 mM benzamidyny i 20% glicerolu w stosunku 1:1. Stężenie białka w ekstrakcie oznaczano metodą BCA według Pierce’a i białka rozdzielano na 3-17% żelach poliakryloamidowych SDS (Laemmli, 1970). Enzym ADPGPP z E. coli wykrywano stosując przeciwciała kozie przeciw oczyszczonemu enzymowi ADPGPP z E. coli i skoniugowane alkaliczną fosfatazą przeciwciała królika anty-kozie (Promega, Madison, WI).
Oznaczanie barwy ziemniaków smażonych
Prowadzono hodowle w warunkach polowych w Parmie (Idaho) ośmiu transgenicznych linii ziemniaczanych, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 z E. coli i 20 linii kontrolnych składających się z tych kombinacji linii z transformacji pMON20113, w których nie zachodzi ekspresja genu glgC16 z E. coli oraz kilku nietrćatsgenieznych kontrolnych linii Russet Burbank. Bulwy zebrano i przechowywano przez 2 miesiące w temperaturze 40°C. Barwę frytek oznaczano dla wszystkich linii ziemniaczanych przez pobranie z każdej linii środkowych wycinków z reprezentatywnych próbek i smażenie w temperaturze 375°F w oleju sojowym w czasie 3 minut i 30 sekund. Barwę frytek oznaczano wykonując pomiary fotowoltametryczne. Wartości podano według tablicy klas kolorów dla zamrożonych frytek francuskich.
Wyniki
Wszystkie bulwy zbierano od roślin tej samej odmiany (Russet Burbank Williams 82), tego samego wieku, rosnących obok siebie w identycznych warunkach wzrostu. Analiza metodą hybrydyzacji Westerna wykazała, że poziomy ADPGPP z E. coli były w zasadzie równoważne z poziomami oznaczonymi w czasie zbiorów (tabela 1), co sugeruje, że poziomy białka ADPGPP z E. coli są stabilne podczas przechowywania w niskiej temperaturze. Analiza bulw przechowywanych w temperaturze 3°C w warunkach wysokiej wilgotności wykazała, że rośliny, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 z E. coli gromadzą 5-6krotnie mniej cukrów redukujących niż bulwy kontrolne (tabele 2, 3, 4, 5 i 6). Poziomy sacharozy w bulwach kontrolnych i transgenicznych były porównywalne, natomiast poziomy skrobi były znacznie wyższe w bulwach transgenicznych. Otrzymane wyniki można interpretować w ten sposób, że w miarę, jak skrobia ulega degradacji podczas przechowywania, powstające cukry mają tendencję do resyntezy do skrobi w tych bulwach, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 z E. coli, podczas gdy w bulwach kontrolnych cukry mają tendencję do akumulowania się.
Transgeniczne rośliny ziemniaka, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 uprawiano w warunkach polowych i bulwy ziemniaków linii GłgC16 przechowywano w temperaturze 40°F (4°C) razem z bulwami z kilku innych linii kontrolnych. Kolor frytek, który bezpośrednio koreluje z zawartością cukru, oznaczano po dwóch miesiącach przechowywania w zimie. Średnia barwa frytek z transgenicznych bulw ziemniaczanych była znacznie lepsza (jaśniejsza) niż frytek z bulw kontrolnych (barwa ciemniejsza) przechowywanych w identycznych warunkach (tabela 7), co świadczy o niższym poziomie cukru w bulwach, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 z E. coli. Bezpośredni pomiar zawartości cukrów redukujących w próbce bulw rosnących na polu i przechowywanych przez 14 tygodni w temperaturze 3°C potwierdza wyniki barwy frytek, gdyż w bulwach, w których zachodzi ekspresja genu glgC16 z E. coli znajduje się znacznie mniej cukrów redukujących niż w bulwach kontrolnych (tabela 8). W bulwach transgenicznych roślin ziemniaka analizowano szybkość i stopień rekondycjonowania po przechowywaniu w niskiej temperaturze. Barwa frytek z linii transgenicznych dających bulwy o ciężarze właściwym powyżej 1,083 wskazuje na zwiększoną szybkość i stopień rekondycjonowania w temperaturze 65°F w porównaniu z kontrolą (tabela 9).
180 247
Tabela 1
Ekspresja ADPGPP z E. coli w bulwach ziemniaczanych w czasie zbioru i po 3 miesiącach przechowywania w niskiej temperaturze.
Poziomy ADPGPP z E. coli oznaczono metodą hybrydyzacji Westerna, w porównaniu do znanych standardów.
Wartości są podane w ng GlgC16 na 50 pg wyekstrahowanego białka bulwy. ng GlgC16
| Linia | Okres zbioru | Po 3 miesiącach |
| 353c | 20-25 | 20-25 |
| 535c | 25-30 | 20-25 |
| 448a | 25-30 | 25-30 |
| 182a | 2 | 0,5-1 |
| 199a | 20-25 | 20-25 |
| 288c | 20-25 | 20-25 |
| 194a | 15-20 | 15-20 |
| 524a | 10 | 15-20 |
Tabela 2
Zawartość cukru i skrobi (pomiary suchej masy) w bulwach przechowywanych przez 3 miesiące w niskiej temperaturze.
Cukry redukujące to glukoza i fruktoza, a cukry całkowite to cukry redukujące plus sacharoza. Wartości (w procentach suchej masy) przedstawiają średnie z 9 linii ziemniaczanych glgC16+ o wysokiej zawartości skrobi i 11 linii ziemniaczanych kontrolnych (glgC16-) przechowywanych przez 3 miesiące w temperaturze 3°C.
| Cukry redukujące | Sacharoza | Cukier całkowity | Skrobia |
| glgC16+1,5 | 1,2 | 2,6 | 59,7 |
| Kontrola 7,0 | 0,8 | 7,8 | 53,7 |
Tabela 3
Zawartość cukru i skrobi (pomiary świeżej masy) w bulwach przechowywanych przez 4 miesiące w niskiej temperaturze.
Cukry redukujące to glukoza i fruktoza, a cukry całkowite to cukry redukujące plus sacharoza. Wartości (w procentach świeżej masy) przedstawiają średnie z 9 linii ziemniaczanych glgC16+ o wysokiej zawartości skrobi i 11 linii ziemniaczanych kontrolnych (glgC16-) przechowywanych przez 4 miesiące w temperaturze 3°C.
| Cukry redukujące | Sacharoza | Cukier całkowity | Skrobia |
| glgC16+0,1 | 0,1 | 0,3 | 9,9 |
| Kontrola 0,8 | 0,2 | 1,0 | 6,0 |
180 247
Tabela 4
Zawartość .cukrów redukujących w bulwach ziemniaczanych przechowywanych przez 4 miesiące w niskiej temperaturze.
W tabeli podane są ilości linii roślinnych zawierających poziomy cukru mieszczące się w podanych zakresach. Procentowe zawartości wyliczano w oparciu o świeżą masę.
| Procentowa zawartość cukrów redukujących | ||||||
| 0-0,2 | 0,2-0,4 | 0,4-0,6 | 0,6-0,8 | 0,8-1,0 | 1,0 + | |
| Linie kontrolne | 0 | 2 | 0 | 4 | 2 | 3 |
| Linie glgC16 | 6 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabela 5
Całkowita zawartość cukrów w bulwach ziemniaczanych przechowywanych przez 4 miesiące w niskiej temperaturze. W tabeli podane są ilości linii roślinnych zawierających poziomy cukru mieszczące się w podanych zakresach. Procentowe zawartości wyliczano w oparciu o świeżą masę.
| Procentowa zawartość cukrów redukujących | ||||||
| 0-1 | 1-2 | 2-3 | 3-4 | 4-5 | 5 + | |
| Lmie kontrolne | 0 | 0 | 0 | 2 | 3 | 6 |
| Linie glgC16 | 3 | 4 | 2 | 0 | 0 | 0 |
Tabela 6
Zawartość skrobi w bulwach ziemniaczanych przechowywanych przez 4 miesiące w niskiej temperaturze.
W tabeli podane są ilości linii roślinnych zawierających poziomy skrobi mieszczące się w podanych zakresach. Procentowe zawartości wyliczono w oparciu o świeżą masę.
| Procentowa zawartość skrobi | ||||||
| 2-4 | 4-6 | 6-8 | 8-10 | 10-12 | 12-14 | |
| Linie kontrolne | 1 | 6 | 3 | 1 | 0 | 0 |
| Linie glgC16 | 0 | 0 | 2 | 3 | 3 | 1 |
Tabela 7
Średnia barwa frytek z bulw wyhodowanych na polu po 2 miesiącach przechowywania w temperaturze 40°F.
Skalę oceny barwy frytek przyjęto według opublikowanych standardów barwy dla zamrożonych smażonych ziemniaków, USDA.
W tej skali 0 oznacza barwę bardzo jasną, a 4 - barwę bardzo ciemną.
W tabeli podane są ilości linii roślinnych dających kolory frytek mieszczące się w podanych zakresach.
| Ocena barwy frytek | ||||
| 2-2,49 | 2,5-2,99 | 3,0-3,49 | 3,5-4,0 | |
| Linie kontrolne | 0 | 0 | 4 | 16 |
| Linie glgC16 | 1 | 1 | 6 | 0 |
180 247
Tabela 8
Zawartość cukrów redukujących w bulwach ziemniaczanych hodowanych na polu po przechowywaniu przez 14 tygodni w temperaturze 3°C.
W tabeli podane są ilości linii roślinnych zawierających poziomy skrobi mieszczące się w podanych zakresach.
Procentowe zawartości wyliczano w oparciu o świeżą masę.
| Procentowa zawartość cukrów redukujących | ||||
| 0,5-1 | 1-1,5 | 1,5-2 | 2-2,5 | |
| Linie kontrolne | 0 | 4 | 2 | 2 |
| Linie glgC16 | 4 | 2 | 2 | 0 |
Przykład II.
Po przechowywaniu w niskich temperaturach ziemniaki często nie nadają się do smażenia z powodu podwyższonych poziomów cukru. Takie przechowywane ziemniaki poddaje się procesom polepszającym, takim jak blanszowanie albo rekondycjonowanie. W pierwszej z tych procedur usuwa się cukry przez traktowanie kawałków ziemniaka gorącą wodą, a w drugiej - cukry poddaje się metabolizowaniu podczas przechowywania bulw w wyższych temperaturach (około 65°F). Blanszowanie stosuje się głównie w celu inaktywacji enzymów ale jeśli zawartość cukrów jest wysoka, proces trzeba wydłużać wielokrotnie w stosunku do normalnego. Wydłużenie tego etapu powoduje niższy odzysk produktu i utratę zapachu. Proces jest czasochłonny, wymaga wysokich nakładów energii i daje odpady o wysokich wymaganiach biologicznego tlenu, a zatem nakłada dodatkowe ograniczenia pod względem ścieków. Rekondycjonowanie wymaga dodatkowych możliwości przechowywania w kontrolowanej temperaturze, a do otrzymania optymalnych wyników trzeba prowadzić wiele etapów w różnych temperaturach. Przechowywanie w wyższych temperaturach w dłuższym czasie zwiększa kiełkowanie i zachorowalność. Przypalona barwa frytek powstająca przy smażeniu bulw GlgC16 przechowywanych w niskiej temperaturze jest często słabsza (lepsza) niż ta, jaka powstaje w bulwach kontrolnych, a w niektórych przypadkach jest nawet po 3-4 miesiącach tak niska, że nie jest potrzebne rekondycjonowanie. Te testy rozszerzono na bulwy przechowywane przez 2 miesiące w temperaturze 50°F, a następnie przez 3 miesiące w temperaturze 38°F, a ponadto, prowadzono pomiary stopnia rekondycjonowania.
Badano bulwy roślin transformowanych następującymi wektorami: pMON17316 (z promotorem patatyny 3.5) i pMON17279 (z genem małej podjednostki ziemniaczanej ADPGPP), a także badano bulwy roślin posiadających opisany powyżej wektor: promotor patatyny 1.0/glgC16. Te wektory skonstruowano następująco.
Promotor patatyny 3.5 otrzymano z plazmidu pPB1240.7 (Bevan, 1986). Większość tego promotora 3.5 wycięto z pPBI240.7, od miejsca HindIII (-3500) do miejsca Xbal (-337) i połączono z pozostałą częścią tego promotora, od miejsca Xbal do miejsca BglII w pozycji +22 (poprzednio miejsce DraI) w reakcji potrójnej ligacji do wektora, który zawierał miejsce BglII, otrzymując pMON17280. Ten plazmid służył następnie jako wektor do potrójnej ligacji całkowitego promotora 3.5 i opisanej powyżej fuzji plastydowego . peptydu docelowego - GlgC16 z pMON20102, z utworzeniem kasety do ekspresji w bulwach (w plazmidzie pMON17282). Tę kasetę, zawierającą promotor patatyny 3.5, fuzję plastydowego peptydu docelowego - GlgC16 i sekwencje NOS 3', wprowadzono do wektora do transformacji roślin, pMON17227, będącego plazmidem Ti ujawnionym i opisanym przez Barry’ego w opisie zgłoszeniowym PCT, WO 92/04449 (1991), wprowadzonym do niniejszego opisu jako odnośnik, we fragmencie NotI, konstruując pMON17316 (fig. 1).
Promotor dla genu małej podjednostki ADPGPP bulw ziemniaczanych (SEQ ID NR: 24), otrzymano jako fragment XbaI-BglII klonu genomowego 1-2 i dokonano jego insercji do miejsca XbaI i BamHI w plazmidzie Bluescript II KS (Nakata i wsp., 1992). Ten frag20
180 247 ment promotora składa się z części od miejsca ClaI o długości około 2,0 kilopar zasad w kierunku 5' od przypuszczalnego kodonu inicjacji dla metioniny, rozciągającej się do miejsca HindIII znajdującego się o 12 par zasad przed tym ATG. Miejsce BglII umieszczono w sąsiedztwie miejsca HindIII przez subklonowanie w innym wektorze pUC i połączono je poprzez to drugie miejsce z sekwencjami kodującymi fuzję CTP i glgC16. Tę kasetę, z sekwencją 3' rozpoznawaną w roślinach klonowano do wektorów do transformacji roślin otrzymując pMON 17279 (zawierający również kasetę, w której gen uidA[GUS] z E. coli jest poddawany ekspresji z tego samego promotora ziemniaczanego dla małej jednostki ADPGPP), co jest przedstawione na fig. 2.
Wektory te wprowadzano do komórek ziemniaka metodą transformacji z udziałem Agrobacterium i następnej selekcji N-(fosfonometylo)glicyną (odczynnik glyphosate). W celu transformacji ziemniaków z użyciem N-(fosfonometylo)glicyny jako środka selekcyjnego prowadzono wzrost Agrobacterium w czasie doby 2 ml pożywki LBSCK. Następnego dnia bakterie rozcieńczano w stosunku 1:10 za pomocą MSO albo do ustalenia się odczytu gęstości optycznej na wartość 0,2-0,33. Z łodyg roślin ziemniaka rosnących w sterylnych warunkach przez 3 tygodnie na pożywce PM wzbogaconej ilością 25 mg/ml kwasu askorbinowego usuwano liście, łodygi cięto na odcinki o długości 3-5 mm i zaszczepiano na nich rozcieńczone bakterie w sposób opisany powyżej. Przeszczepy umieszczano na przygotowanych płytkach ko-hodowli. Płytki z ko-hodowlą zawierały 1/10 MSO z dodatkiem 1,5 ml komórek TxD nawarstwionych zwilżoną bibułą. Na płytce umieszczano około 50 przeszczepów. Po 2 dniach okresu ko-hodowli przeszczepy umieszczano na dwa dni na pożywce indukującej powstawanie kallusa zawierającej 5,0 mg/litr rybozydu zeatyny, 10 mg/litr AgNO3 i 0,1 mg/litr kwasu naftalenooctowego (NAA). Następnie przeszczepy przenoszono na pożywki indukujące powstawanie kallusa zawierające 0,025 mM N-(fosfonometylo)glicyny do selekcji. Po 4 tygodniach przeszczepy umieszczano na podłożach indukuj ących powstawanie odrośli zawierających 5,0 mg/litr rybozydu zeatyny, 10 mg/litr AgNO3 i 0,3 mg/litr GA3 oraz 0,025 mM glyphosate do selekcji. Odroślą zaczęły się pojawiać w 8 tygodniu hodowli. Przeszczepy przenoszono do świeżych pożywek indukujących powstawanie odrośli co 4 tygodnie przez 12 tygodni. Odroślą wycinano, umieszczano na pożywkach PM i hodowano na tych pożywkach przez około 2 tygodnie albo do czasu, kiedy będą się nadawać do wysadzenia do gleby.
Dane dla linii GlgC16 Russet Burbank, łącznie z tymi, w których zachodzi ekspresja białka GlgC16 z promotora patatyny 1.0 (HS01; HS03; MT01), patatyny 3.5 (HS13) i z promotora dla małej podjednostki ziemniaczanej ADPGPP (HS10) są przedstawione poniżej (tabela 9). Badano również wiele linii ziemniaków GlgC16 (odmiana Atlantic), MT01, z promotorem patatyny 1.0. Aby uzyskać akceptowalne produkty z ziemniaków wykazujących wartości 2,0 i wyższe w skali barw·, przetwórca w zasadzie powinien prowadzić blanszowanie. Wiele linii Russet Burbank GlgC16 dawało wskaźniki barwy smażonych wyrobów poniżej 2,0 bezpośrednio po składowaniu w niskiej temperaturze, a więc można je przetwarzać bezpośrednio. Wskaźnik barwy ziemniaków smażonych niższy od 2,0 uzyskuje się dla dużej liczby linii po bardzo krótkim czasie rekondycjonowania. Ta lepsza podatność na rekondycjonowanie jest widoczna dla linii o zwiększonym poziomie stałej masy i również dla linii GlgC16, nie wykazujących wzrostu ciężaru właściwego. Poprawa była również widoczna dla wszystkich promotorów użytych do ekspresji GlgC16 w bulwach. Ten efekt otrzymanych linii, które mogą być smażone bezpośrednio po składowaniu i podlegają szybkiemu rekondycjonowaniu jest również widoczny dla odmiany GlgC16 Atlantic. Linia MT01-27 jest również dowodem na to, że zwiększony poziom skrobi w bulwach nie jest konieczny dla otrzymania polepszonych właściwości magazynowania w niskich temperaturach, gdyż ciężar właściwy badanych linii nie różni się znacząco od oznaczonego w bulwach kontrolnych odmiany Atlantic.
180 247
Tabela 9
Barwa ziemniaków smażonych/własności rekondycjonowania ziemniaków zawierających GlgC16. (Barwę frytek oceniano według tablicy USDA w skali od 0 do 4; najniższa - najniższa).
| Ilość dni w temperaturze 65°F | ||||||
| Linia | 0 | 3 | 6 | 10 | 13 | 17 |
| Kontrolna -Russet Burbank | ||||||
| RB02 | 2.2 | 2.3 | 1.8 | 2.0 | 1.0 | 1.3 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| RB03 | 3.5 | 3.3 | 2.5 | 1.7 | 2.3 | 2.5 |
| RB05 | 2.3 | 2.5 | 2.2 | 2.0 | 1.2 | 1.3 |
| GlgC16 Russet Burbank | ||||||
| HS13-47* | 3.0 | 2.5 | 0.7 | 0.7 | 1.3 | 1.3 |
| HS10-15* | 1.3 | 1.3 | 0.4 | 0.8 | 1.0 | 1.0 |
| HS13-50* | 3.2 | 1.0 | 0.5 | 1.0 | 1.2 | 0.8 |
| MT01-82* | 2.2 | 1.2 | 0.7 | 1.0 | 1.5 | 1.0 |
| HS13-36* | 2.2 | 1.3 | 0.7 | 1.2 | 1.2 | 0.8 |
| HS 10-20* | 1.0 | 0.7 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0.5 |
| HS01-58# | 2.8 | 2.5 | 1.3 | 0.7 | 1.5 | 1.8 |
| HS03-20# | 3.2 | 2.3 | 1.7 | 2.8 | 1.8 | 2.0 |
| HS03-18# | 2.0 | 1.8 | 1.7 | 0.7 | 1.3 | 1.3 |
| HS03-12A# | 3.3 | 2.5 | 2.7 | 2.2 | 2.2 | 0.8 |
| HS03-12B# | 3.0 | 3.2 | 2.0 | 2.7 | 1.3 | 2.0 |
| HS 10-49# | 2.2 | 1.3 | 2.3 | 2.2 | 1.5 | 0.8 |
| HS 13-30# | 3.2 | 2.3 | 2.0 | 2.8 | 1.7 | 3.0 |
| Odmiana kontrolna - Atlantic | ||||||
| AT-1 | 2.3 | 2.3 | 2.3 | 1.5 | 1.5 | 1.8 |
| Odmiana GlgC16 Atlantic | ||||||
| MT01-24 | 2.5 | 1.8 | 2.8 | 1.2 | 2.2 | 1.3 |
| MT01-27 | 1.0 | 0.5 | 1.3 | 0.3 | 0.8 | 0.7 |
* ciężar właściwy powyżej 1.083 # ciężar włażciww poniżej 1.083
Przykład III.
Wpływ GłgC16 na opóźnienie kiełkowania oznaczano na populacji bulw przechowywanych w temperaturze 60°F (uprzednio składowanych w temperaturze 38-40°F w czasie 3 miesięcy). Bulwy (po 4 do 6) badano w przedziałach czasu i oceniano na obecność kiełków > 0,5 cm (tabela 10). Opóźnienie w kiełkowaniu, przedstawione jako ilość dni do wystąpienia 50% kiełkowania, często polepszone w liniach GlgC16, obserwowano w trzech badanych odmianach: (Russet Burbank, Atlantic i Norchip), w liniach, w których ekspresja GłgC16 zachodzi z promotora pataty^ 1.0 (HS01, HS03 i MT01), patatyny 3.5 (HS13) i z promotora dla ziemniaczanej podjednostki ADPGPP (HS10) i było widoczne w liniach ze zwiększoną i bez zwiększonej zawartości stałej masy. Linie z opóźnionym kiełkowaniem kiełkowały normalnie po wysadzeniu do gleby.
180 247
Tabela 10
| Odmiana | Linia | Ilość dni do 50% kiełkowania |
| Russet Burbank | Kontrolna | 15 |
| Kontrolna | 14 | |
| Kontrolna | 9 | |
| HS01-25 | 11 | |
| HS01-49 | 15 | |
| HS01-58 | 18 | |
| HS03-3 | 12 | |
| HS03-5 | 13 | |
| HS03-17 | 13 | |
| HS03-26 | 14 | |
| HS03-27 | 12 | |
| HS03-41 | 24 | |
| HS10-10 | 14 | |
| HS10-15 | 26 | |
| HS10-20 | >43+ | |
| HS13-2 | 11 | |
| HS13-13 | 16 | |
| HS 13-23 | 23 | |
| HS 13-30 | 15 | |
| HS13-34 | 25 | |
| HS13-37 | 12 | |
| HS 13-47 | 21 | |
| HS 13-50 | 19 | |
| HS 13-68 | 13 | |
| HS 13-70 | 24 | |
| MT01-10 | 14 | |
| MT01-11 | 13 | |
| MT01-30 | 14 | |
| MT01-37 | 19 | |
| MT01-82 | 16 | |
| Atlantic | Kontrolna | 6 |
| MT01-6 | 11 | |
| MT01-7 | 9 | |
| MT01-15 | 10 | |
| MT01-31 | 6 | |
| Norchip | Kontrolna | 8 |
| MT01-1 | 12 | |
| MT01-5 | 13 |
+ - czas trwania obserwacji; bulwy pochodzące z linii kiełkujących po wysadzeniu do gleby.
Przykład IV.
Dodatkowe badania przeprowadzono z ziemniakami trίensfoπno\/anymi genem glgC16 pod kontrolą dwu różnych promotorów. Promotory dla dużej pod-jednostki ADPGPP bulw ziemniaczanych izoldw'ana z dwu różnych odmian ziemniaków, Russet Burbank (SEQ ID NR: 25) i Desire (SEQ ID NR: 26). Klony identyfikowano metodą hybrydyzacji łysinek z sondą końca 5' cDNA dla dużej podjed^stU ADP-glukozo-pirofosforylazy. Miejsca początku translacji (ATG) tych klonów zidentyfikowano względem roślinnych sekwencji consensus (Lutcke i wsp., 1987). Do wprowadzenia miejsca BamHI w końcu 3' w dół od kodonu
180 247
ATG i miejsca HindIII w końcu 5' w obydwu promotorach użyto primery z łańcuchowej reakcji z udziałem Polimerazy (PCR). Otrzymane promotory Russet Burbank o długości 600 par zasad i Desiree o długości 1600 par zasad poddawano niezależnie ligacji z plazmidem pMON10098 w miejsce promotora E35S i dokonano fuzji z fragmentem BglII-SacI z plazmidu pMON20102 zawierającym gen chimerowy CTP-glgC16. Z tych plazmidów usunięto kasetę E35S-NPTII i zastąpiono ją kasetą FMV-CTP-CP4-E9 z opisanego powyżej plazmidu pMO'N17227 zawierającą fragment Notl-Sall. Otrzymano pMON21522 (z promotorem pochodzącym z Russet Burbank) i pMON21523 (z promotorem! pochodzącym z odmiany Desiree). Plazmid pMON10098 zawiera następujące regiony DNA:
1) chimerowy gen oporności na kanamacynę skonstruowany do ekspresji w roślinach i pozwalający na selekcję transformowanej tkanki. Ten gen chimerowy składa się z promotora 35S o długości 0,35 kilozasad z wirusa mozaiki kalafiorowej, P-35S (Odell i wsp., 1985), genu NPTII o długości 0,83 kilozasad i z 3' nie podlegającego translacji regionu NOS 3' o długości 0,26 kilozasad;
2) fragment ClaI do DraI o długości 0,45 kilozasad z oktopinowego plazmidu Ti, pTi15955, zawierający region z lewego ramienia T-DNA (Barker i wsp., 1983);
3) fragment o długości 0,75 kilozasad zawierający źródło replikacji z plazmidu RK2, ori-V (Stalker i wsp., 1981);
4) fragment SalI do PstI o długości 3,0 kilozasad z plazmidu pBR322 zawierający źródło replikacji dla celów utrzymania w E. coli (ori-322) i miejsce bom służące do koniugacyjnego przeniesienia do komórek Agrobacterium tumefaciens;
5) wyizolowany z transpozonu Tn7 fragment o długości 0,93 kilozasad, kodujący oporność na spektynomycynę i streptomycynę. Spc/Str (Fling i wsp., 1985), stanowiący determinantę selekcyjną w E. coli i w Agrobacterium tumefaciens;
6) fragment PvuI do BclI o długości 0,36 kilozasad z plazmidu pTiT37, zawierający region prawego ramienia T-DNA typu nopalinowego (Fraiey i wsp., 1985) i
7) jako ostatni segment, kasetę ekspresyjną składającą się z promotora 35S z wirusa mozaiki kalafiorowej o długości 0,65 kilozasad (CaMV) wzmocnionego przez duplikację sekwencji tego promotora, P-E35S (Kay i wsp., 1987), syntetycznego poliłącznika z kilkoma unikalnymi miejscami klonowania i z nie podlegającego translacji regionu 3' genu rbcS-E9 z grochu o długości 0,7 kilozasad, E9 3' (Coruzzi i wsp., 1984). Ten plazmid kojarzy się z Agrobacterium tumefaciens, szczepem ABI, w trójrodzicielskim układzie kojarzenia i stosuje się do transformowania linii Russet Burbank, Williams 82.
Polepszenie własności podczas magazynowania wykazano również dla ziemniaków Russet Burbank transformowanych plazmidami pMON22152 i pMON2153. W ziemniakach tych ekspresja GlgC16 przebiega z promotorów dla dużej podjednostki ADPGPP bulw ziemniaczanych. Bulwy wyhodowane w polu przechowywano po zbiorach początkowo przez miesiąc w temperaturze 50°F, po czym umieszczano je w zimnie, w temperaturze 40°F i składowano w czasie 4 miesięcy. W jednym badaniu barwę frytek uzyskanych z tych bulw bezpośrednio po składowaniu oceniano przez oznaczenie współczynnika odbicia smażonego materiału - korzystne są niższe wartości. W drugim badaniu, część składowanych w niskiej temperaturze bulw przenoszono do pomieszczenia o temperaturze 55°F w celu oznaczenia podatności na rekondycjonowanie. Dane z tych oznaczeń, zarówno dla łodygowych jak i pączkowych końców bulw są przedstawione w tabeli 11.
W obydwu przypadkach, wiele linii wykazuje lepsze wskaźniki barwy niż rośliny kontrolne, zarówno przy bezpośrednim smażeniu jak i po rekondycjonowaniu. Przykładowo, linie pMON21522-144, pMON21523-79 i wiele innych wykazuje ogromne polepszenie w porównaniu do kontroli.
180 247
Tabela 11
| pMON21522 | Współczynnik odbicia smażonych ziemniaków1,2 | |||
| Składowanie w 40°F3 | Składowanie w 40°F, 21 dni @ 55°f4 | |||
| LINIA# | pączki % | łodygi5 | pączki | łodygi |
| 144 | 24,3 | 22,1 | 34,6 | 25,4 |
| 209 | 22,8 | 20,1 | 31,4 | 23,2 |
| 149 | 27,1 | 22,4 | 30,7 | 27,5 |
| 178 | 25,3 | 21,1 | 34,9 | 29,3 |
| 194 | 23,7 | 20,8 | 30,6 | 23,5 |
| 204 | 21,3 | 14,7 | 33,9 | 23,0 |
| 218 | 22,8 | 18,9 | 33,3 | 20,7 |
| Kontrola/średnia6 | 19,7 | 16,8 | 31,0 | 25,1 |
| pMON21523 | Współczynnik odbicia smażonych ziemniaków1^ | |||
| Składowanie w 40°F3 | Składowanie w 40°F, 21 dni @ 55°f4 | |||
| LINIA# | pączki % | łodygi5 | pączki | łodygi |
| 33 | 22,1 | 16,5 | 29,8 | 23,1 |
| 34 | 21,2 | 18,2 | 32,1 | 27,3 |
| 38 | 24,0 | 23,2 | 28,3 | 23,6 |
| 40 | 24,4 | 15,3 | 31,5 | 26,2 |
| 47 | 22,0 | 15,6 | 34,9 | 27,7 |
| 48 | 23,0 | 19,3 | 31,1 | 24,9 |
| 79 | 24,4 | 19,7 | 35,8 | 29,7 |
| 80 | 21,8 | 20,5 | 32,7 | 25,5 |
| 93 | 20,7 | 17,4 | 31,1 | 23,2 |
| 99 | 19,8 | 17,1 | 30,6 | 23,4 |
| 31 | 22,1 | 21,6 | 30,2 | 24,7 |
| 35 | 20,0 | 16,8 | 34,5 | 28,4 |
| 37 | 20,6 | 18,5 | 34,2 | 27,2 |
| 39 | 18,0 | 15,8 | 33,1 | 24,4 |
| 42 | 19,2 | 15,1 | 31,9 | 24,1 |
| 43 | 23,9 | 20,7 | 32,1 | 22,0 |
| 60 | 20,7 | 16,3 | 32,4 | 20,3 |
| 64 | 22,3 | 16,1 | 30,0 | 23,0 |
| 71 | 21,8 | 20,9 | 33,1 | 24,7 |
| 76 | 22,8 | 21,5 | 28,5 | 25,0 |
| 81 | 16,5 | 16,0 | 29,1 | 22,7 |
| 92 | 15,3 | 15,0 | 30,3 | 23,5 |
| Kontrola/średnia6 | 19,7 | 16,8 | 31,0 | 25,1 |
1 z każdej z 4-6 bulw wycinano cztery paski środkowe i smażono je w temperaturze 375°F 2 współczynniki odbicia oznaczano w spektrometrze odbiciowym PHOTOVOLT 577 paski przygotowywano z bulw wyrosłych na polu, przechowywanych w temperaturze 50°F przez miesiąc i następnie w temperaturze 40°F przez 4 miesiące (przechowywanie w niskiej temperaturze) 4 paski przygotowywano z bulw wyrosłych na polu, przechowywanych w temperaturze 50°F przez miesiąc, następnie w temperaturze 40°F przez 4 miesiące (przechowywanie w niskiej temperaturze) i rekondycjonowanych w temperaturze 55°F przez 21 dni 5 współczynnik odbicia smażonych pasków mierzono osobno dla pasków pobranych z końców bliższych pączków i bliższych łodyg 6 średnie wartości dla 22 kontrolnych linii Russet Burbank podano dla porównania
180 247
Z powyższego opisu wynika, że niniejszy wynalazek spełnia wszystkie przedstawione cele oraz daje korzyści, które są oczywiste i niepodzielnie związane z wynalazkiem. Jest zrozumiałe, że mogą być stosowane pewne jego cechy i rozwiązania bez odnoszenia się do innych cech i rozwiązań wynalazku. Jest to uwzględnione w zakresie zastrzeżeń. Wynalazek daje wiele możliwości rozwiązań bez odchodzenia od jego zakresu, dlatego jest oczywiste, że wszystko, co zostało przedstawione w opisie i na załączonych rysunkach należy interpretować jako ilustrację, a nie jako ograniczenie zakresu wynalazku.
180 247
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Rekombinantowa, dwuniciowa cząsteczka DNA zawierająca w sekwencji operacyjnej:(a) promotor, którego funkcją w roślinach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w docelowych tkankach roślinnych;(b) strukturalną sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złożony z aminoterminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy zdefiniowanego sekwencją o numerze SEQ ID Nr: 4;(c) nietranslacyjną 3'-sekwencję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA, przy czym kodowany przez tę cząsteczkę DNA enzym, ADP-glukozopirofosforylaza, jest deregulowany.
- 2. Cząsteczka DNA, według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniany enzym kodowany jest przez sekwencję DNA o numerze SEQ ID Nr: 3.
- 3. Rekombinantowa, dwuniciowa cząsteczka DNA zawierająca w sekwencji operacyjnej:(a) promotor, którego funkcją w roślinach jest powodowanie wytwarzania sekwencji RNA w docelowych tkankach roślinnych;(b) strukturalną sekwencję DNA powodującą wytwarzanie sekwencji RNA kodującej polipeptyd fuzyjny złożony z aminoterminalnego plastydowego peptydu tranzytowego oraz enzymu ADP-glukozo-pirofosforylazy zdefiniowanego sekwencją o numerze SEQ ID Nr: 2; i (c) nietranslacyjną 3 '-sekwencję DNA, której funkcją w komórkach roślinnych jest powodowanie zakończenia transkrypcji i dodanie poliadenylowanych nukleotydów na końcu 3' tej sekwencji RNA, przy czym kodowany przez tę cząsteczkę DNA enzym, ADP-glukozopirofosforylaza, jest deregulowany.
- 4. Cząsteczka DNA, według zastrz. 3, znamienna tym, że promotor pochodzi z roślin ziemniaka.
- 5. Cząsteczka DNA, według zastrz. 3, znamienna tym, że enzym kodowany jest sekwencją DNA o numerze SEQ ID Nr: 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7015593A | 1993-05-28 | 1993-05-28 | |
| PCT/US1994/005275 WO1994028149A1 (en) | 1993-05-28 | 1994-05-18 | Method of improving the quality of stored potatoes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL180247B1 true PL180247B1 (pl) | 2001-01-31 |
Family
ID=22093489
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94311755A PL178628B1 (pl) | 1993-05-28 | 1994-05-18 | Sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych, sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych i sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych |
| PL94335570A PL180247B1 (pl) | 1993-05-28 | 1994-05-18 | Rekombinantowa, dwuniciowa czasteczka DNA PL PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94311755A PL178628B1 (pl) | 1993-05-28 | 1994-05-18 | Sposób polepszania jakości bulw ziemniaczanych magazynowanych, sposób obniżania poziomu cukrów w bulwach ziemniaczanych magazynowanych i sposób przedłużania okresu zatrzymania w rozwoju przechowywanych bulw ziemniaczanych |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5648249A (pl) |
| EP (1) | EP0701618A1 (pl) |
| JP (1) | JPH08510645A (pl) |
| CN (1) | CN1127016A (pl) |
| AU (1) | AU687409B2 (pl) |
| CA (1) | CA2162383A1 (pl) |
| HU (1) | HUT73468A (pl) |
| PL (2) | PL178628B1 (pl) |
| WO (1) | WO1994028149A1 (pl) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU644619B2 (en) | 1989-12-21 | 1993-12-16 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Modification of plant metabolism |
| GB9412018D0 (en) * | 1994-06-16 | 1994-08-03 | Cambridge Advanced Tech | Modification of starch content in plants |
| GB9421287D0 (en) * | 1994-10-21 | 1994-12-07 | Danisco | A method of reducing the level of sugar in an organism |
| DE19529696A1 (de) * | 1995-08-11 | 1997-02-13 | Inst Genbiologische Forschung | Transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit gesteigerter Glykolyserate |
| CN1137997C (zh) * | 1995-12-27 | 2004-02-11 | 日本烟草产业株式会社 | 低温诱导性启动子序列 |
| JP2001511007A (ja) * | 1997-02-10 | 2001-08-07 | カナダ国 | 低温誘発性甘味増加の減少を伴うαグルカンＬ−タイプまたはＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼのレベルの低下したトランスジェニックポテト |
| US5998701A (en) * | 1997-06-04 | 1999-12-07 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Department Of Agriculture | Potatoes having improved quality characteristics and methods for their production |
| DE19709775A1 (de) | 1997-03-10 | 1998-09-17 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Nucleinsäuremoleküle codierend Stärkephosphorylase aus Mais |
| BR9811493A (pt) * | 1997-07-30 | 2000-09-19 | Zeneca Ltd | Método genético para o controle de germinação |
| AU9197298A (en) * | 1997-08-07 | 1999-03-01 | Washington State University Research Foundation | Regulatory mutants of adp-glucose pyrophosphorylase and related compositions andmethods |
| AU2321499A (en) * | 1998-01-15 | 1999-08-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plant phosphoglucomutase homologs |
| DE19836099A1 (de) | 1998-07-31 | 2000-02-03 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Nukleinsäuremoleküle kodierend für eine ß-Amylase, Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke |
| GB9820970D0 (en) * | 1998-09-25 | 1998-11-18 | Zeneca Ltd | Promoter |
| US7323560B2 (en) * | 2000-07-17 | 2008-01-29 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plastidic phosphoglucomutase genes |
| NZ535395A (en) | 2002-02-20 | 2009-01-31 | Simplot Co J R | Precise plant breeding using plant DNA border like sequences instead of Agrobacterium borders |
| US7534934B2 (en) * | 2002-02-20 | 2009-05-19 | J.R. Simplot Company | Precise breeding |
| US7868688B2 (en) * | 2008-12-30 | 2011-01-11 | Cosmic Circuits Private Limited | Leakage independent very low bandwith current filter |
| CN109207486B (zh) * | 2018-10-31 | 2022-03-22 | 西南大学 | 马铃薯cisr2基因及其在抗低温糖化中的应用 |
| CN113575673B (zh) * | 2021-06-30 | 2022-06-07 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 马铃薯梯度低氧协同气化熏蒸抗低温糖化贮藏方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU644619B2 (en) * | 1989-12-21 | 1993-12-16 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Modification of plant metabolism |
| EP0536293B1 (en) * | 1990-06-18 | 2002-01-30 | Monsanto Technology LLC | Increased starch content in plants |
-
1994
- 1994-05-18 US US08/406,858 patent/US5648249A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-18 HU HU9503394A patent/HUT73468A/hu unknown
- 1994-05-18 WO PCT/US1994/005275 patent/WO1994028149A1/en not_active Ceased
- 1994-05-18 AU AU69473/94A patent/AU687409B2/en not_active Ceased
- 1994-05-18 PL PL94311755A patent/PL178628B1/pl unknown
- 1994-05-18 CA CA002162383A patent/CA2162383A1/en not_active Abandoned
- 1994-05-18 JP JP7500696A patent/JPH08510645A/ja active Pending
- 1994-05-18 PL PL94335570A patent/PL180247B1/pl unknown
- 1994-05-18 CN CN94192717.2A patent/CN1127016A/zh active Pending
- 1994-05-18 EP EP94917958A patent/EP0701618A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2162383A1 (en) | 1994-12-08 |
| PL178628B1 (pl) | 2000-05-31 |
| US5648249A (en) | 1997-07-15 |
| WO1994028149A1 (en) | 1994-12-08 |
| HU9503394D0 (en) | 1996-01-29 |
| AU6947394A (en) | 1994-12-20 |
| AU687409B2 (en) | 1998-02-26 |
| PL311755A1 (en) | 1996-03-18 |
| JPH08510645A (ja) | 1996-11-12 |
| EP0701618A1 (en) | 1996-03-20 |
| CN1127016A (zh) | 1996-07-17 |
| HUT73468A (en) | 1996-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2148081C1 (ru) | Способ получения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала и рекомбинантная двухцепочечная днк-молекула | |
| US5498830A (en) | Decreased oil content in plant seeds | |
| PL180247B1 (pl) | Rekombinantowa, dwuniciowa czasteczka DNA PL PL | |
| AU720006B2 (en) | Process for selection of transgenic plant cells | |
| AU724942B2 (en) | Transgenic potatoes having reduced levels of alpha glucan L- or H-type tuber phosphorylase activity with reduced cold-sweetening | |
| US20100015319A1 (en) | Precise breeding - low acrylamide foods | |
| EA000634B1 (ru) | Рекомбинантная двухцепочечная последовательность днк для экспрессии сахарозофосфорилазы в растении, способ получения трансгенного растения с повышенной экспрессией сахарозофосфорилазы в различных частях растения и линия трансформированных клеток растения | |
| AU4500493A (en) | Dna sequences and plasmids for the preparation of plants with changed sucrose concentration | |
| AU715002B2 (en) | Transgenic plants with improved biomass production | |
| JP3645260B2 (ja) | 植物におけるトレハロースの生産 | |
| JPH10509033A (ja) | トマト果実プロモーター | |
| JP4410318B2 (ja) | ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物 | |
| CA2235619A1 (en) | Modified plants and plant products | |
| WO2000053746A2 (en) | Method of delaying or inhibiting sprouting in plants | |
| BG63401B1 (bg) | Продуциране на трехалоза в растения | |
| JP4238909B2 (ja) | ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物 | |
| MXPA99006823A (en) | Transgenic potatoes having reduced levels of alpha glucan l- or h-type tuber phosphorylase activity with reduced cold-sweetening | |
| MXPA97006128A (en) | Expression of la sacarosa fosforil |