PL178931B1 - Spirozwiązki i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, enancjomery i racematy oraz związki czwartorzędowe, działające na układ cholinergiczny i agonistyczne względem receptora muskarynowego oraz kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Abstract

1. Spirozwiazki i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, enancjomery i racematy oraz zwiazki czwartorzedowe, pochodzace od tych zwiazków, które zawieraja trzeciorzedowy atom azotu, które to spirozwiazki zawieraja pie cioczlonowa reszte, w której polaczenie spiro wystepuje przy jej atomie wegla i równoczesnie przy atomie wegla nasy­ conego ukladu pierscieniowego zawierajacego jeden atom azotu i charakteryzuja sie tym, ze wymieniona piecioczlonowa reszta jest wybrana z grupy obejmujacej 3-etylohydantoine, 1-acetylo-hydantoine, 3-metylo-hydantoi ne, 3-propargilohydantoine, 2,4-ditiohydantoine, 2-tiohydantoine, oksazolidyno-2-tion, 3-etylooksazolidyn-2-on, oksa- zolidyno-2,4-dion, 3-etylo-oksazolidyno-2,4-dion, 2-metylo-1,4-oksazoIidyn-3-on, 2-metylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 2,4-di- metylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 2-etylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 2-etylo-4-metylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 3-metylo-1,4-oksatiolan-2- -on, 2-etylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 5-metylo-1,3-oksazolidyne, 4-etylo-1,3-oksazolidyne, 3-etylo-1,4-oksatiolan-2-on, 5-metylo-1,3-dioksolan-4-on, N-metylosukcynimid, N-etylosukcynimid, 3-t-butylohydantoine, 3-(4-pirolidyno-2-bu- tynylo)hydantoine, 3- (2-butynylo)-hydantoine, 2,5-bis-(metylotio)-4H-imidazoI, 3-etylo-4-tiohydantoine, 4-metylotio- imidazolino-2-tion, 3- etylo-2,4-ditiohydantoine, 4-etylotio-3-imidazolino-2-tion, 1-etyIo-2-etylotio-2-imidazolino-5- tion, 2,5-bis(aminometylo)-4H-imidazol, 2-metylo-2-tiazoline, 2-metylo-2-imidazoline, 2-metylo-2-oksazolin-4-on, 2-metylo-4H(5H)-imidazol-5(4)-on, 2-metylotio- 5-metoksy-4H-imidazol, 2-metylotio-5-amino-4H-imidazol, 2-metylo tio-5-aminometylo- 4H-imidazol, 2-tiono-3-etylohydantoine, 2-tiono-3-t-butylohydantoine, 2-metylotio-2-imidazo- lin-5(4)-on, 1-etylo-2-etyIotio-2-imidazolin-5-on i 1-etylo-2-imidazolin-5-on, a nasycony uklad pierscieniowy zawie­ rajacy jeden atom azotu okreslony jest wzorem K: przy czym uklad ten jest niepodstawiony lub jest podstawiony 1- 3 podstawnikami wybranymi sposród C 1 - 6 alkilu i hy­ droksylu, a mostek w strukturze K jest przylaczony jednym koncem do pozycji 1, a drugim do pozycji 4 lub 5, a m oznacza 1, 2 lub 3. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku są spirozwiązki i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, enancjomery i racematy oraz związki czwartorzędowe oraz kompozycje farmaceutyczne zawierające te związki spiranowe przeznaczone do leczenia chorób ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego.

Nowe związki spiro-chinuklidynowe, w których pierścienie oksatiolanowe były związane połączeniem spiro z pierścieniami chinuklidynowymi opisano np. w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0205247A2, opublikowanym 17 grudnia 1986 i w patentach USA, nr nr 4 855 290 (wydanym 8 sierpnia 1989),4 981 858 (wydanym 1 stycznia 1991),4 900 830 (wydanym 13 lute178 931 go 1990) i 4 876 260 (wydanym 24 października 1989). Podobnie, niektóre spiro-oksazoliny opisano w patencie USA nr 5 053 412, a niektóre spiro-oksazoliny i spiro-tiazoliny ujawniono w zgłoszeniu patentowym USA, Nr seryjny 07/685 397. Należy rozumieć, że cała treść wymienionych powyżej patentów i zgłoszenia USA 07/685 397, jak również innych patentów i publikacji, wymienionych w niniejszym zgłoszeniu, powołana tu została jako literatura. Nowe związki wymienione w powyższych patentach wykazują aktywność w stosunku do ośrodkowego układu nerwowego. Szczególnie intensywnym badaniom poddano aktywność biologiczną 2-metylospiroll^-oksatiolano-ó^chinuklidyny, występującej w postaci izomerów geometycznych cis- i trans-, w zależności od tego, czy grupa 2-metylowa znajduje się po tej samej stronie pierścienia oksatiolanowego co atom azotu w pierścieniu chinuklidynowym (cis), czy po drugiej stronie w stosunku do atomu azotu w pierścieniu chinuklidynowym (trans), i na podstawie badań przedklinicznych stwierdzono, że związki cis- (kod nr AF102B) były szczególnie obiecujące w leczeniu demencji starczej typu Alzheimer’a (SDAT). Jestrównież istotne, że każdy z izomerów cis- i trans- można optycznie rozdzielić, i w wielu przypadkach badano również biologiczną aktywność izomerów optycznych.

Zasadniczym celem wynalazku jest opracowanie nowych związków spiranowych. Dalszym celem wynalazku jest opracowanie użytecznych kompozycji farmaceutycznych.

Nowe związki według wynalazku zawierają pięcioczłonową resztę, w której połączenie spiro występuje przy jej atomie węgla i równocześnie przy atomie węgla nasyconego układu pierścieniowego zawierającego jeden atom azotu i charakteryzują się tym, że wymieniona pięcioczłonowa reszta jest wybrana z grupy obejmującej 3-etylohydantoinę, 1-acetylo-hydantoinę, 3-metylo-hydantoinę, 3-propargilohydantoinę, 2,4-ditiohydantoinę, 2-tiohydantoinę, oksazolidyno-2-tion, 3-etylooksazolidyn-2-on, oksazolidyno-2,4-dion, 3-etylo-oksazolidyno-2,4-dion, 2-metylo-1,4-oksazolidyn-3-on, 2-metylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 2,4-dimetylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 2-etylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 2-etylo-4-metylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 3-metylo-l,4-oksatiolan-2-on, 2-etylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 5-metylo-l,3-oksazolidynę, 4-etylo-l,3-oksazolidynę, 3-etylo-l,4-oksatiolan-2-on, 5-metylo-l,3-dioksolan-4-on, N-metylosukcynimid, N-etylosukcynimid, 3-t-butylohydantoinę, 3-(4-pirolidyno-2-butynylo)hydantoinę, 3-(2-butynylo)-hydantoinę, 2,5-bis-(metylotio)-4H-imidazol, 3-etylo-tiohydantoinę, 4-metylo-tioimidazolino-2-tion, 3-etylo-2,4-ditiohydantoinę, 4-etylotio-3-imidazolino-2-tion, 1 -etylo-2-etylotio-2-imidazolino-5-tion, 2,5-bis(aminometylo)-4H-imidazol, 2-metylo-2-tiazolinę, 2-metylo-2-imidazolinę, 2-metylo-2-oksazolin-4-on, 2-metylo-4H(5H)-imidazol-5(4)-on, 2-metylotio-5-metoksy-4H-imidazol, 2-metylotio-5-amino-4H-imidazol, 2-metylotio-5-aminometylo-4H-imidazol, 2-tiono-3-etylohydantoinę, 2-tiono-3-t-butylohydantoinę, 2-metylotio-2-imidazolin-5(4)-on, 1 -etylo-2-etylotio-2-imidazolin-5-on i 1 -etylo-2-imidazolin-5-on, a nasycony układ pierścieniowy zawierający jeden atom azotu określony jest wzorem K:

4

CH₂—CH CH^CH^mU

N-----CH?

(K) przy czym układ ten jest niepodstawiony lub jest podstawiony 1 -3 podstawnikami wybranymi spośród C! _₆ alkilu i hydroksylu, a mostek w strukturze K j est przyłączony j ednym końcem do pozycji 1, a drugim do pozycji 4 lub 5, a m oznacza 1, 2 lub 3.

Korzystnie w związkach według wynalazku nasycony układ pierścieniowy zawierający jeden atom azotu jest wybrany z grupy obejmującej piperydynę, 1-metylopiperydynę, 1-propargilopiperydynę, N-metylonortropan i chinuklidynę.

Przykładami korzystnych związków według wynalazku są: l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2', 5^,-bis(metylotio)-4^imidazol); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-4'-tiohydantoi

178 931 na); l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(4'-metylotio-3^/-imidazolino-2^/-tion); 1-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-2', 4,'-ditiohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(4'-etylotio-3'-imidazolino-2'-tion); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2', 5'-bis-(aminometylo)-4^/H-imidazol); l-metylo-piperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyn-2'-on); 1 -metylopiperydyno-4-spiro -4'-(2'-metylo-2^/-tiazolina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'(5')-(2^/-metylo-2'-imidazolina); l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-2'-oksazolin-4'-on]; 1-metylopiperydyno-4-spiro-4'(5')- pLmetylo^^STlj-imidazol-S^yon; 1 -metylopiperydyno-4-spiro -4'- (2'-metylotio-5^/-metoksy-4Ή-imidazol); i l-metylo-piperydyno-4spiro-4'-(2'-metylotio -5^/-aminometylo-4Ή-imidazol).

Szczególnie korzystne są następujące związki według wynalazku l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-( Γ-acetylohydantoina); piperydyno-4spiro-5'-(3'-etylohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylohydantoina); piperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylohydantoina); l-metylo-piperydyno-4-spiro-5'-(3'-propargilohydantoina); Nmetylo-nortropano-3-spiro-5'-hydantoina; N-metylonortropano-3-spiro-5'-(3'-metylohydantoina); N-metylonortropano-3-spiro-5'-(3'-etylohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'- (2',4'-ditiohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5^,-(oksazolidyno-3''-tion); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'(3'-etylooksazolidyn-2'-on); l-metylopiperydyno-4-spiro-5^,-(oksazolidyno-2^/, 4'-dion); 1-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyno-2'4'-dion); 1 -metylopiperydyno-4 -spiro-5'-(2'-metyΪο-Γ, 4'-oksazolidyn-3'-on); l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-r, 4'-tiazolidyn-3'-on); l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-dimetylo-l', 4'-tiazolidyn-3'-on); l-metylo-piperydyno-4spiro-5'-(2'-etylo-4-metylo- Γ, 4'-tiazolidyn-3'-on); piperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylo- Γ, 4'-oksatiolan-2'-on); piperydyno-4-spiro-5^/-(2'-metylo-l^/, 4'-tiazolidyn-3'-on); l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(l'-tlenek 2^/-metylo-3' okso-Γ, 4'-tiazolidyny); l-metylopiperydyno-4-spiro-2'-(4^/-etylo-l^/, 3'-oksazolidyna); l-metylopiperydyno-4-spiro-5^/-(3^/-etylo-T, 4'-oksatiolan-2^/-on); 1-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo- Γ, 4'-tiazolidyn-3'-on); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-2'-(5^,-metylo-Γ, 3'-dioksolan-4'-on); 2-N-metylospiro-( l,3-sukcynimido-4,. ,3')chinuklidyna; oraz 2-N-etylospiro-(l,2-sukcynimido-4,3')chinuklidyna, a zwłaszcza l-metylopiperydyno-4-spiro-5'(3'-(4-pirolidyno-2-butynylo)hydantoina; l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-t-butylohydantoina); 1 -propargilopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'[3'-(2-butynylo)hydantoina); piperydyno -4-spiro-5'-(3'-propargilohydantoina); oraz 2-metylo-l,4-tiazolidyn-3-ono-spiro[5, S^-chinuklidyna. Korzystne są też następujące związki 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiono-3'-etylohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'- (2'-tiono-3'-t-butylohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'(5Ó-(2'-metylotio-2'-imidazolin-5'(4')-on); 1-metylopiperydyno -4-spiro-4'-(r-etylo-2'-etylotio-2'-imidazolin-5'-on); oraz l-metylopiperydyno-4-spiro-4'- (r-etylo-2'-imidazolin-5'-on), a szczególnie enancjomerycznie czysty d- i l-l-metylopiperydyno-4-spiro-5'(2'-metylo-1,4'-tiazolidyn-3'-on) i d- i l-l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-etylo- l,4'-tiazolidyn-3'-on).

Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do stosowania w leczeniu chorób ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego u ssaków, która zawiera skuteczną do leczenia tych chorób ilość co najmniej jednego spirozwiązku jak określone powyżej lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli, enancjomeru i racematu lub związku czwartorzędowego, wraz z co najmniej jednym farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem, nośnikiem lub adiuwantem. Kompozycja taka korzystnie występuje w postaci odpowiedniej do podawania doustnego, doodbytniczego, pozajelitowego lub przezskómego (w tym przypadku kompozycja może zawierać dodatkowo kwas tłuszczowy o niskim ciężarze cząsteczkowym), albo do podawania przez wdmuchiwanie lub wtryskiwanie do nosa, i może ona być w postaci dawki jednostkowej. Co najmniej jeden związek według wynalazku, jak określony powyżej, może być zawarty w dawce jednostkowej w ilości w zakresie, np. około 0,5 do około 100 mg, korzystnie około 5 do około 100 mg, a zwłaszcza około 10 do około 50 mg.

Opisana powyżej kompozycja farmaceutyczna może dodatkowo zawierać co najmniej jeden następny farmakologicznie aktywny związek wybrany spośród fizostygminy, tetrahydroaminoa

178 931 krydyny, choliny, lecytyny, piracetamu, aniracetamu, pramiracetamu, oksyracetamu, 4-aminopirydyny, 3,4-diaminopirydyny, somatostatyny, pirenzepiny, N-metyloatropiny, N-butyloskopolaminy, skopolaminy, klonidyny, kwanfamycyny, propanteliny, metanteliny, glikopirolatu, tropencylium, nortryptyliny, amitryptyliny, imipraminy, minapryny, sekoweryny, AFDX-116, nikotyny, alaproklatu, zimelidyny, deprenylu i Czynnika Wzrostu Nerwu. Łączna ilość substancji aktywnych w kompozycji wynosi od około 0,5% do około 90% wagowych całej kompozycji, a stosunek spiro związku do dodatkowej substancji czynnej wynosi od około 99% wagowych do około 1% wagowych.

Choroby ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego u ssaków można leczyć sposobem, który obejmuje podawanie im skutecznej do leczenia tych chorób ilości co najmniej jednego ze spirozwiązków według wynalazku, łącznie z ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami, enancjomerami, tautomerami i racematami. Związki takie, przeznaczone do tych celów, można oczywiście stosować w postaci kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, jak określona powyżej.

W jednym z konkretnych wykonań, wynalazek dostarcza spirozwiązków o wskazanych poniżej wielkościach cząsteczki, w których: r jest punktem odniesienia wyznaczonym przez pozycję anionu odpowiadającego kationowej postaci nie związanego podwójnie atomu azotu, określonego jako N*, w pierścieniu A (lub A¹) takiego związku w jego najbardziej stabilnej konformacji, X* oznacza heteroatom pierścieniowy w 5-członowym pierścieniu, przy czym ten heteroatom pierścieniowy znajduje się w pozycji sąsiadującej z atomem węgla spiro, Z* przedostatni atom pierścieniowy w stosunku do X* we wspomnianym 5-członowym pierścieniu, a Q* oznacza końcowy atom C lub N w łańcuchu bocznym przyłączony do atomu w pierścieniu pomiędzy atomami X* i Z* w 5-członowym pierścieniu określonym powyżej, przy czym w tym przypadku atomy wodoru w łańcuchu bocznym sąnieuwzględnione; takie wielkości cząsteczkowe mają zasadniczo następujące wartości, mianowicie kąt dwuścienny r-X*-Q*-Z* = od -54° do -170°; odległości cząsteczkowe r-N* = 3,0 χ 10'¹ nm (odległość odniesienia), r-X* = od 6,7 do 6,75 χ 10’¹ nm, r-Q* = od 7,9 do 8,90 x 10’'nm, x-Q* = od2,4 do 2,8 A x HUnm; takie związki o tak określonym rozkładzie cząsteczkowym wykazują aktywność agonisty receptorów muskarynowych. Definicja taka oparta na wielkościach cząsteczkowych poparto testami biologicznymi, patrz zwłaszcza tabela 1, poniżej.

Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna według wynalazku, która zawiera co najmniej jeden związek według wynalazku, jak określony powyżej, i dodatkowo Czynnik Wzrostu Nerwu (NGF), przy czym związek (związki) według wynalazku sąobecne w ilości wspomagającej aktywność wzrostową nerwu czynnika NGF. Większość związków według wynalazku, inaczej niż niektóre znane związki działające na ośrodkowy lub obwodowy układ nerwowy, nie pobudzają aktywności wzrostu nerwu w nieobecności NGF, umożliwiając tym samym lepszą kontrolę, gdy wspomaganie wzrostu nerwu jest wymagane w leczeniu. Jednakże, niektóre z najbardziej aktywnych związków według wynalazku pobudzają aktywność wzrostu nerwu niezależnie od NGF. Ponadto związki według wynalazku mają aktywność wybraną spośród następujących:

(a) aktywność agonisty muskarynowego, (b) aktywność podobną do neurotroficznej lub synergicznej z NGF, (c) aktywność wydzielania białka prekursorowego amyloidu i zmniejszania poziomu β-amyloidów, (d) aktywność zwiększającą ilość defosforylowanych białekτ i (e) aktywność NGF-podobną.

Testy prowadzone na potwierdzenie biologicznej aktywności związków według wynalazku opisano poniżej.

Związki według wynalazku mogą być stosowane do leczenia chorób u ssaków, które zdiagnozowano jako nadające się do leczenia (w kontekście powyższych działań a-e) skuteczną ilością związku(ów) oraz mogą być stosowane w postaci kompozycji farmaceutycznych zawierających skuteczną ilość takiego związku (ów).

Sposoby stosowane do wytwarzania związków według wynalazku sązasadniczo znanymi w chemii organicznej sposobami tworzenia pięcioczłonowych pierścieni, podstawiania pierścieni, zmiany stopnia nasycenia i nienasycenia pierścienia, interkonwersji soli i zasad, wytwarzania soli

178 931 czwartorzędowej, itd. Dla specjalisty oczywiste będzie, oprócz opisanych poniżej przykładowych sposobów wytwarzania pewnych związków, stosować można również inne metody.

Gdy żądanym pięcioczłonowym pierścieniem jest, na przykład, hydantoina, pierścień ten można utworzyć przez reakcję odpowiedniego nasyconego N-heterocyklicznego ketonu (np. l-metylopiperydyn-4-onu) z (NH₄)₂CO₃ + CN, a następnie atom 3-N może być w znany sposób podstawiony. Reakcje te można następująco zilustrować:

ch₂ch /\

CHn-N C=0 +(NHą)₂C0o ³ \ / +CN“ ch₂----ch₂ >

ch₂ch /\

CHo-NC \/ ch₂ch

NH---C=0 (AA)

C(=0)~NH (AA) + R°-(grupa opuszczająca)—>

CHn----CHo NH---C=0 / ² \ /

CHo-N C (B) ³ \ / \ .

ch₂---ch₂ C(O)-NR np. AF160, R° Et; AF178, R° = Me; AF185, R° = propargil; AF167, R° = Me, analog*; i AF 168, R° = Et, analog* (*w którym resztaN-metylopiperydynowa zawiera mostek 2,6-etylenowy, tj. analog N-metylonortropanu).

Grupą opuszczającą w „R°- (grupa opuszczająca)” może być np. bromek, chlorek lub p-toluenosulfonian, a R° ma znaczenia jak określono uprzednio, z wyjątkiem H, alkoksylu i alkanoilu. Tę reakcję podstawienia można prowadzić w zasadniczo znanych warunkach, np. przez reakcję 3'-niepodstawionej hydantoiny w obecności substancji alkalicznej, takiej jak KOH, i stosując rozpuszczalnik, taki jak etanol. Odpowiedni Γ, 3'-dipodstawiony związek można otrzymać w powyższej reakcji, stosując nadmiar reagenta „R°- (grupa opuszczająca)”, lub przez reakcję związku (B) z „R°- (grupa opuszczająca)”.

Grupę 1-metylową we wzorze (B) można usunąć przez reakcję ze środkiem demetylującym, takim jak CH₃CH(C1)OCOC1:

(B) + środek demetylujący —>

CHo----CH_? NHC=0 /\ /

H-NC \/ \ .

ch₂----CH₂ C(=o)-NR (C) np. AF160 (Des), R° = Et; AF179, R° = Me.

Związek (B) można również wytworzyć, jak następuje:

CH₂----ch₂ nh₂ /\ /

CHo-N C + R°-N=C=O; H⁺ —»(B) \/ \ ch₂—-ch₂co (np. AF213, R° = tert-butyl)

178 931

Podstawienie R°-N=C=S w analogicznej reakcji prowadzi do wytworzenia (B)-3-tionu, np. AF181 (R=Et), AF184 (R = tert-butyl).

Reakcja związku (AA) z halogenkiem alkanoilu lub bezwodnikiem alkanowym w standardowych warunkach alkanoilowania, prowadzi do podstawienia w pozycji 1', jak poniżej:

(AA) + środek alkanoilujący ch₂

CHo-N \ ch₂ alkanoil •ch₂ n----c=o \ / c

/ \ €H₂ C(=O)-NH np. AF 164, alkanoitoacetyl

Gdy żądanym pięcioczłonowym pierścieniem jest ditiohydantoina, związki takie wytworzyć można, np. tworząc ten pierścień przez reakcję odpowiedniego nasyconego N-heterocyklicznego ketonu z CN, NH₄C1 i CS₂. Gdy hydantoiny podstawia się (np. przez alkilowanie) przy atomach azotu, z tiohydantoin powstają produkty N- i/lub S-podstawione. Przykłady (poniżej) ilustrują warunki reakcji, które prowadzą do wytworzenia innych produktów, bądź mieszanin produktów, które można rozdzielić. Reakcje te można przedstawić następująco, a przykładowym N-heterocyklicznym ketonem jest l-metylopiperydyn-4-on:

CH₂ / CHo-N \ ch₂

----ch₂ c=o + NHąCl, / cs₂/cn

----ch₂ ------>

ch₂---ch₂ nh—os /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂----CH₂ C (=S) -NH (AF173) + R°- (grupa opuszczająca)

CH?---CH₂ N==C-SR“ /\ /

CH_ą-Nc \/ \ ch₂----CH₂ C(-SR )=n

CH_?----CH_? NH-----C=S / \ /

CHo-N C \ \ · ch₂----ch₂ C(-SR )=N (D) np. AF177, R° = Me i/lub np. AF183, R° = Me AF176, R° = Et

CH₂----CH₂ N C-SR° /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂--CH₂ C(=S)---N—R° (E) i/lub np. AF170, R° = Et

178 931

Grupa opuszczająca oraz znaczenie R° w „R°-(grupa opuszczająca)” mogą być takie jak opisane powyżej w odniesieniu do hydantoin. Reakcje podstawienia można prowadzić w zasadniczo znanych warunkach.

Ditiohydantoiny można również wytworzyć przez reakcję odpowiednich hydantoin w P₂S₅, np. w taki sposób:

(B) + pięciosiarczek —> (AF160) fosforu

CHn----CH₂ NHC=s /\ /

H-N — C \/ \ .

ch₂----CH₂ C(=S)-NR np. AF163, R° = Et

Gdy związek (E) poddaje się reakcji z 20% HC1, S-R° hydrolizuje się, z wytworzeniem następującego związku:

CH₂----CH₂ NHC=0 /\ /

CHn-Nc \I \

CH₂----CH₂ C(=S)---N—R° np. AF182, R° = Et

W podobnej reakcji związku (D) z 20% HC1 wytwarza się związek o następującym wzorze (patrz np. przykład 12):

CH₂----CH₂ NH---C=S /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ C(=0)-NH

Związek ten wytwarza się również przez hydrolizowanie analogu zawierającego =NR° zamiast O=; analog =NR° można wytworzyć w reakcji związku AF173 z R°NH₂ (patrz np. przykład 13, gdzie R° = β-hydroksyetyl).

Związki według wynalazku, które stanowią okso- lub tiono-podstawione oksazolidyny, można wytworzyć, np. jak następuje:

CH₂----CH₂ OH /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ ch₂nh₂ + CS₂ substancja alkaliczna

CH_?/ CHo-N \ ch₂-ch₂ \

c /

ch₂ \

CH₂---NH (AF165)

CH₂----CH₂ OH /\ /

CHo-Nc \/ \ ch₂----ch₂ ch₂nhr’ + Ν,Ν'-karbonylodiimidazol

178 931 ch₂----ch₂ oc=o /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂---ch₂ ch₂—nr’ np. AF172, R° = Et ch₂----ch₂ nhr° /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ ch₂oh + Ν,Ν'-karbonylodiimidazol—>

ch₂ch

CHo-Nc \ / ch₂ch nhr’-c=o /

np. AF174, R° = Et

CH₂----CH₂ OH /\ /

CHn-Nc \/ \ ch₂----ch₂ conh₂ + Et₂CO₃/KOMe/EtOH^

CH₂----CH₂ 0C=0 /\ /

CHo-NC ° \/ \ ch₂----CH₂ C(=O)-NH (AF169) R° - (grupa opuszczająca) ch₂----ch₂ oc=o /\ /

CHn-NC \/ \ ch₂----ch₂ C(=O)-NR° np. AF 180, R° = Et

Grupa opuszczająca, jak również znaczenia R°, w „R°- (grupa opuszczająca)” mogą być takie jak opisane powyżej w odniesieniu do hydantoin. Reakcję podstawienia można prowadzić w zasadniczo znanych warunkach.

Związki według wynalazku, w których pięcioczłonowy pierścień stanowi sukcynimid, można wytworzyć, na przykład, jak następuje:

CH₂----CH COOEt / / \ / ch₂ <ch₂)₂ c \ / / \

N------CH₂ CH₂C00Et + R°NH₂

3-karboetoksy-3-karboetoksymetylochinuklidyna

178 931

CH₂----CH / / \ ch₂ (ch₂)₂ c \ / /

N------CH₂

C(=O)-NR° / \ ch₂—c=o np. AF133, R° = Me

AF134, R° = Et

Tiazoliny według wynalazku można otrzymać, np. w taki sposób:

ch₂ ch₂ N—·=C—r /\ /

CH,-NC \ / \ _H+ ch₂----ch₂ ch₂-----o + pięciosiarczek fosforu ->

CH₂----CH₂ N=~~ 'C-R /\ /

CHn-N C(F) \/ \

CH₂----CH₂ CH₂-----s np. AF 151 (S), R = Me

Na marginesie wspomnieć można, że związek

CH₂----CH₂ SC-Me / \ /|

CHo-N C1 \ / \I

CH₂----CH₂ CH₂N oznaczony AF 150 (S) został już opisany w naszym zgłoszeniu w USA nr 07/685,397, podczas gdy związki o wzorze (F) nie zostały tam konkretnie przedstawione. Jednakże, obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że związki o wzorze (F), jak przykładem jest związek AF151 (S), są nieoczekiwanie znacznie bardziej obiecujące ze względu na ich aktywność farmakologiczną, niż klasa związków, których przykładem jest AF150 (S).

Imidazoliny według wynalazku można wytworzyć, przykładowo, zgodnie z następującym schematem:

CH₂----ch₂ nh₂ /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ ch₂nh₂ + R(C=NH)0Et ---->

ch₂----ch₂ N R /\ /

CHo-Nc \/ \

CH₂----CH₂ CH₂NH (G)

CH₂----CH₂ NHC-R / \ /I

CHo-NC \ / \I

CH₂----CH₂ CH₂N (H)

W tym przypadku, produkt, np. AF 190, R = Me może występować w postaci mieszaniny tautomerów o wzorach (G) i (H).

Oksazolidyny i tiazolidyny według wynalazku, takie jak o wzorach (J) (takie jak AF264, R=Me, R-H; AF268, R=H, R-Et) i (K) (takie jak AF261, R=Me, R°=H; AF267, R=Et, R°=H; AF266, R=R°=Me), wytworzyć można, np. jak przedstawiono poniżej.

178 931

CH₂----CH₂ NH-----CHR ’ /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂----CH₂ oCHR

CH₂----CH₂ S------CHR /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ nr’c=o (J) (K)

Przykładowo, związki (J) i (K) wytwarza się poddając N-metylopiperydon reakcji z HOCHRCHR'NH₂ lub z (HSCHRCO₂H + R°NH₂), odpowiednio.

Następujące związki, w których R i R° mają określone powyżej znaczenia, ale korzystnie każdy oznacza, np. Me lub Et, również stanowią korzystne związki według wynalazku:

ch₂---ch₂ N===C-R /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ ch₂C=0

CH_?----CH₂ N~ C-R /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ ch₂c=ch

AF200

AF210 ch₂----ch₂ Ν’· ^'CH /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂---CH₂ C(=0)—nr’

AF220 ch₂---ch₂ N==C-R /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂---CH₂ C{=0)—NH

AF230

CH₂--CH₂ N=CH /\ /

CHo-NC \/ \ .

CH₂----CH₂ 0------NR

AF240

CH₂----CH₂ /\

CHo-NC \/ ch₂ch

NHAF250

-c=o

-NR

178 931

CH?----CH_? NH--C=0 /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂----CH₂ oCHR

CH₂----CH₂ C (=0) —CHR /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ oc=o

AF26O

CH₂----CH₂ N—CR /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂----CH₂ CH-N

AF270 ch₂----ch₂ SNR’ /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ ch₂o

AF280

AF290

CH₂----CH₂ 0------NR’ /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ ch₂s

AF30O ch₂----CH₂ CHOR---NR’ /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂----CH₂ NHC=0

AF320

CH₂-----CH₂· 'CR /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂----CH₂ N—-N

CH_?----CHp 0NR’ /\ /

CHo-NC \/ \ ch₂----ch₂ ch₂o

AF310

CH₂----CH₂ C(«=0)—NR’ /\ /

CHo-NC \/ \

CH₂----CH₂ NHCHOH

AF33O

CH₂----CH₂ N-— ' CR /\ /

CHn-NC \/ \

CH₂----CH₂ 0------NH

AF390

AF370

Jest zrozumiałe, że gdy w następującym opisie przykładowe związki według wynalazku zawierająpierścień piperydynowy, nortropinowy i chinuklidynowy, dowolny atom azotu w pierścieniu heterocyklicznym określony tu jako odpowiedni do konfiguracji spiro z omawianym pięcioczłonowym pierścieniem spiranowym może być podstawiony. Podobna uwaga odnosi się do przykładów praktycznych, które są tylko ilustracyjne, a nie mają charakteru ograniczającego.

Związki spiranowe według wynalazku są na ogół odpowiednie do stosowania w leczeniu przedstarczej i starczej demencji, demencji starczej typu Alzheimera (SDAT), atypowej choroby Alzheimera (Perry i in., Advances inNeurology, wyd. R. J. Wurtman i in., 51:41,1990), demencji niedokrwiennej w połączeniu z chorobą Alzheimera, zaburzeń pamięci związanych z wiekiem (AAMI), ostrych zaburzeń orientacji, zaburzeń emocjonalnych i koncentracji, stanów maniakalnych, opóźnionej dyskinezy, hiperkinezy, choroby Alzheimera w połączeniu z chorobą Parkinsona, afazji, stanów halucynacyjno-paranoidalnych, zespołu amnezji po zapaleniu mózgu, objawów

178 931 związanych z odstawieniem alkoholu, pląsawicy Huntingtona, choroby Pieką, ataksji Friedrick’a, choroby Gilles de la Tourett’a i zespołu Downa, ponieważ wszystkie te stany chorobowe sązaburzeniami, które przynajmniej w pewnej mierze sązwiązane z niedoczynnością ośrodkowego układu cholinergicznego.

Związki według wynalazku są ponadto potencjalnie skuteczne w leczeniu postępującego porażenia nadjądrowego; sąrównież środkami znieczulającymi, tak więc mogą być stosowane w leczeniu stanów ostrego bólu, takich jak reumatyzm, artretyzm i stan terminalny choroby.

Jak wyraźnie wskazano powyżej, związki spiranowe według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w kombinacji z co najmniej jednym dodatkowym, farmakologicznie aktywnym, związkiem, na przykład, z inhibitorami acetylocholinesterazy, takimi jak fizostygmina lub tetrahydroaminoakrydyna; w kombinacji z prekursorami acetylocholiny, takimi jak cholina lub lecytyna; jako dodatek do leków „nootropowych” takich jak piracetam, aniracetam, oksyracetam lub pramiracetam; ze związkami, które oddziaływują z kanałami Ca₂₊, takimi jak 4-aminopirydyna lub 3,4-diaminopirydyna; bądź razem z peptydami, które mogą mieć działanie modulacyjne na uwalnianie acetylocholiny, takimi jak somatostatyna; w kombinacji ze środkami przeciwmuskarynowymi obwodowymi (takimi jak pirenzepina, N-metyloatropina, N-butyloskopolamina, propantelina, metantelina, glikopirolat lub tropenzilium) do przeciwdziałania skutkom ubocznym w obwodowym układzie nerwowym, których oczekiwać można przy wysokich dawkach, takim jak ślinienie się, biegunka, wydzielanie żołądkowe lub wymioty, lub w kombinacji z podawaną przezskómie skopolommą, taką jak Scopoderm (R) do przeciwdziałania nudnościom i/lub wymiotom; w kombinacji ze środkami przeciwdepresyjnymi, takimi jak nortryptylina, amitryptylina, imipramina, minapryna, w celu łagodzenia zarówno zaburzeń funkcji poznawczych, jak i objawów depresji towarzyszących czasami SDAT, AAMI, połączonym chorobom SDAT/choroba Parkinsona (PD); w kombinacji z lekami przeciwmuskarynowymi M2, takimi jak sekoweryna, AFDX-116 (patrz Hammer i in., 1986, Life Sci. 38: 1653) dla przeciwdziałania skutkom ubocznym w obwodowym układzie nerwowym, których można się spodziewać przy wysokich dawkach związków, oraz aby przeciwdziałać hamującemu działaniu takich agonistów przy receptorach presynaptycznych i postsynaptycznych typu M2 w ośrodkowym układzie nerwowym i wzmóc uwalnianie acetylocholiny przez hamowanie inhibitujących autoreceptorów typu M2 przy nienaruszonych końcach; w kombinacji z agonistami receptora nikotynowego, takimi jak nikotyna, w celu stymulowania receptorów zarówno nikotynowego jak i muskarynowego w mózgu; w kombinacji z agonistą receptora adrenergicznego (klonidyną lub kwanfamycyną) dla złagodzenia zaburzeń funkcji poznawczych i innych związanych z mieszanym niedoborem cholinergiczno-noradrenergicznym w SDAT; w kombinacji z inhibitorami wychwytu zwrotnego neuronalnej serotoniny, takimi jak alaproklat, zimelidyna dla złagodzenia zaburzeń funkcji poznawczych i emocjonalnych w SDAT; w kombinacji z inhibitorami oksydazy-B monoaminowej, jak deprenyl, dla złagodzenia zaburzeń funkcji poznawczych i motorycznych związanych z połączonymi stanami, takimi jak SDAT/PD; w kombinacji z czynnikiem wzrostu nerwu (NGF), który jest podawany albo przez rozpylanie donosowe albo podawanie do komory mózgowej.

Związki spiranowe według wynalazku, z lub bez wymienionych dodatkowych substancji aktywnych, można podawać na przykład przez iniekcję w odpowiednim rozcieńczalniku lub nośniku, doustnie, doodbytniczo w postaci czopków, przez wdmuchiwanie lub rozpylanie do nosa, przez infuzję lub przezskómie w odpowiednim podłożu z lub bez fizostygminy lub tetrahydroaminoakrydyny.

Związki spiranowe mogą być również stosowane w leczeniu zaburzeń wymagających podawania środka cholinergicznego o przedłużonym działaniu i łagodnej aktywności miejscowej. Taki środek jest użyteczny w zaburzeniach takich jak jaskra, ponieważ związek nie ulega zniszczeniu przez enzym deaktywujący acetylochinę, to jest acetylo- i butyrylo-cholinoesterazę, jak również może być stosowany w leczeniu zaburzeń w obwodowym układzie cholinergicznym, takich jak miastenia gravis, dysfunkcja pęcherza moczowego, choroba Adfego i Eaton-Lamberta. Związki te mogąbyć również stosowane w zaburzeniach, w których słaba aktywność cholinergiczna jest wywołana przez leki.

178 931

Gdy związki spiranowe według wynalazku są środkami antycholinergicznymi (co może być łatwo rozpoznane przez specjalistę), mogą być one potencjalnie stosowane w leczeniu zaburzeń związanych z nadczynnością cholinergiczną, niezależnie od tego, czy jest ona spontaniczna czy uwarunkowana lekami. Ponadto, związki według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu rozmaitych chorób, takich jak PD, pseudo-PD, połączone AD/PD, pierwotne dystonie, kurczowy kręcz szyi, dystonia czaszkowa, depresja, choroby ośrodków ruchu, akatyzja (po odstawieniu neuroleptyków), nadciśnienie obwodowe, urazy głowy, opóźniona dyskineza w połączeniu z PD, depresja maniakalna, jako środki pomocnicze w chirurgii zamiast atropiny, skopolaminy, itd.; w zatruciach spowodowanych nadmiarem acetylocholiny wskutek hamowania acetylocholinesterazy. Mogą być również stosowane w oftalmologii, gdy wymagane jest przedłużone albo krótkotrwałe rozszerzenie źrenicy.

Związki spiranowe według wynalazku mogą być również stosowane w leczeniu chorób charakteryzujących się nadaktywnością podobną do obwodowej, takich jak astma, przewlekłe obturacyjnej choroby płuc, wrzody trawienne. W tych zaburzeniach obwodowych jest szczególnie zalecane stosowanie czwartorzędowych soli związków według wynalazku.

Czwartorzędowe sole amoniowe są obecnie szeroko stosowane w leczeniu. Tak więc, przykładami takich agonistów cholinericznych są chlorek acetylocholiny, chlorek betanecholu i karbachol (patrz np. Goodman & Gilman „The Pharmacological Basis of Therapeutics”, wyd. 7, Macmillan Publishing Co., 1985, na stronie 104). Czwartorzędowymi środkami przeciwko cholinoesterazie są np. bromek neostygminy, bromek demecarium i jodek echotypatu; chlorek pralidoksymu jest stosowany jako reaktywator cholinoesterazy (patrz Goodman & Gilman, jak cyt., na stronach 122-123).

Czwartorzędowe pochodne alkaloidów belladonny, np. bromek metskopolaminy i metylobromekhomatropiny oraz syntetyczne związki czwartorzędowe, np. bromek metanteliny i bromek propanteliny, sąstosowane w leczeniu zaburzeń żołądkowo-j elito wy ch (patrz Goodman & Gilman, jak cyt. na stronach 139-140).

W „Medicinal Chemistry” Alfreda Burgera, wyd. 2, Interscience Publishers, 1960, na stronie 497 zamieszczono przypuszczenie, że czwartorzędowe jony amoniowe, niezależnie od ich budowy chemicznej, wywołują porażenie kuraropodobne jak również potwierdzenie tego przypuszczenia. Ta właściwość związków czwartorzędowych jest wykorzystywana w anestezji, np. stosuje się je jako środki pomocnicze w znieczuleniach chirurgicznych, aby uzyskać rozluźnienie mięśni szkieletowych (patrz Goodman & Gilman, jak cyt. w rozdziale 11 pod tytułem „Neuromuscular Blocking Agents”, na stronach 222-235).

Aktywność blokowania nerwowo-mięśniowego czwartorzędowych związków, jak omówiono powyżej, nie zahamowała rozwoju i zastosowania czwartorzędowych związków w leczeniu klinicznym w ciągu ostatnich lat. Dla specjalisty będzie oczywiste, że na dobór odpowiedniego związku (łącznie ze związkiem czwartorzędowym) do stosowania w leczeniu klinicznym, wpływ ma wiele czynników, np. skuteczność dla zamierzonego celu, bezpieczeństwo, możliwość wystąpienia efektów ubocznych i wskaźnik terapeutyczny. Tak więc specj alista w tej dziedzinie będzie dobrze wiedział, jak rozumieć pojęcie „farmaceutycznie dopuszczalne związki czwartorzędowe”, które strukturalnie pochodzą od związków według wynalazku zawierających trzeciorzędowy atom azotu, oraz jak pojęcie to funkcjonuje w niniejszym opisie i zastrzeżeniach w świetle dostępnej wiedzy związanej z tą dziedziną techniki.

Wynalazek zilustrowany będzie następującymi nie ograniczającymi go przykładami.

Przykład 1: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoina) AF160

a) 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-hydantoina

Mieszaninę roztworów 1-metylopiperydyn-4-onu (36,44 g, 0,322 mola) w etanolu (150 ml), węglanu amonu (93,0 g, 0,968 mola) w wodzie (400 ml) i cyjanku potasu (25,8 g, 0,396 mola) w wodzie (82 ml) ogrzewano w 60°C przez 2,5 godziny, po czym pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej. Odsączono wytrąconą l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-hydantoinę i przemyto niewielką ilością zimnej wody, etanolem i eterem i otrzymano krystaliczny proszek

178 931 (27,0 g). Po zatężeniu przesączu i przemy wek uzyskano drugi rzut (20,0 g). Produkt krystalizowano z metanolu, temp. topn. 265-276 (rozkład).

IR(KBr) 3170 (NH); 1700 (C=O) cm'¹.

Widmo mas m/e 183 (M⁺, 38%); 71 (100%).

‘H-NMR (D₂O) 1,8 (2H); 2,06 (sekstet, 2H); 2,49 (s, -CH₃); 2,58 (t, 2H); 3,14 (t, 1H); 3,20 (t, 1H) ppm.

b) Kwas 4-amino-l-metylopiperydyno-4-karboksylowy l-metylopiperydyno-d-spiro-SMiydantoinę (9,75 g, 0,0533 mola) i oktahydrat wodorotlenku barn (28,8 g, 0,0913 mola) w wodzie (150 ml) ogrzewano w temperaturze 160°C w bombie przez 3 godziny. Połączono zawartość czterech szarż, a wytrącony węglan baru odsączono. Przesącz zobojętniono za pomocą stałego CO₂ i usunięto przez odsączenie. Po zatężeniu przesączu uzyskano kwas 4-amino-l-metylopiperydyno-4-karboksylowy (32,0 g, 95%), temp. topn. 275-280°C (rozkład).

IR (KBr) 3300, 1655, 1580 cm-¹.

Widmo mas m/e 158 (M⁺, 90%); 141 (89%, M-OH); 113 (12%, M-CO₂H); 96 (100%); 71 (52%). .

‘H-NMR (C₅D₅N+D₂O) 1,2 (m, 2H); 1,48 (s, CH₃N-); 1,7 (m, 2H); 1,9 (m, 2H); 2,0 (m, 2H) ppm.

c) l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoina), AF160

Do mieszaniny l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-hydantoiny (5 g, 27 mmoli) i wodorotlenku potasu(2,08 g, 37 mmoli) w 100 ml absolutnego etanolu dodano bromku etylu (15 g, 137 mmoli). Mieszaninę ogrzewano w 80°C, pobierano próbki w odstępach 0,5 godziny i sprawdzono metodą GLC w odniesieniu do wzorca wewnętrznego (difenylometanu). Zasadowość monitorowano przez miareczkowanie (IN HC1), a następnie przez dodanie wodorotlenku potasu (w całkowitej ilości 2,1 g). Po uzyskaniu maksymalnej wydajności (2,5 godziny) roztwór odparowano, dodano wody (50 ml), wodny roztwór ekstrahowano chloroformem i poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując mieszaninę chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku (80:20:1) jako układ eluentów. Produkt rozpuszczono w eterze i wytrącono jako chlorowodorek za pomocą dodatku HC1 w izopropanolu. Temp. topn. 278-280°C.

Widmo mas m/e 211 (M⁺, 45%); 71 (100%).

‘H-NMR (wolna zasada, CDC1₃), 1,2 (t, J = 6 Hz, 3H); 1,6-1,7 (m, 2H); 1,9-1,95 (m, 2H); 2,1-2,2 (m, 2H); 2,34 (S, 3H); 2,85-2,95 (m, 2H); 3,5 (q, J = 6 Hz, 2H);

‘H-NMR (sól HC1, D₂O) 1,1 (t,J = 6Hz, 3H); 1,95-2,05 (m, 2H); 2,2-2,3 (m, 2H); 2,85 (S, 3H); 3,0-3,2 (m, 2H); 3,4-3,5 (m, 2H); 3,5 (q, J = 6 Hz, 2H) ppm.

¹³C-NMR (wolna zasada, CDC1₃) 14,0; 33,0; 33,1; 46,0; 52,8; 59,9; 157,0; 177,0 ppm.

UV (wolna zasada, H₂O) lambda_max 208 nm (ε 3500).

Przykład 2: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(l'-acetylohydantoina) AF164

a) AF164A. Mieszaninę l-metylopiperydyno-4-spiro-5 -hydantoiny (3,52 g) w bezwodniku octowym (50 ml) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 3 godziny. Nadmiar reagenta usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskano substancję stałą, którą zdyspergowano w eterze i przesączono, otrzymując białą substancję stałą(3,75 g), wykrystalizowany z mieszaniny metanol-dichlorometan, temp. topn. 250-254°C (rozkład), AF164A..

‘H-NMR (D₂O) 1,89 (m, 2H); 2,44 (s, CH₃CO-); 2,86 (s, CH₃N-), 2,98 (m, 2H); 3,41 (m, 2H); 3,67 (m, 2H) ppm.

¹³C-NMR (D₂O, dioksan jako wzorzec wewnętrzny) 26,6 (C₃ & C₅); 26,9 (CH₃CO-); 43,8 (CH₃N-); 51,4 (C₂&C₆); 62,0 (C₄); 67,3 (dioksan); 166,0(C₂); 173,8 (CH₃CO-); 189,2 (CJ ppm.

MS m/e 225 (M⁺); 210, 166; 155; 123'95; 71; (100%); 70.

b) AF164B. Część AF164A (1,10 g) zalkalizowano nasyconym wodnym roztworem Na₂CO₃ i ekstrahowano mieszaniną metanol-dichlorometan. Ekstrakt odparowano, a pozostałość ponownie ekstrahowano tą samą mieszaniną rozpuszczalników. Ekstrakt przesączono, a przesącz odparowano i pozostałość (1,0 g) roztarto z acetonem, otrzymując białą substancję stałą AF164B, temp. topn. 225-230°C (rozkład) (krystalizowaną z CH₂C1₂-CH₃OH-CH₃CN).

‘H-NMR (D₂O) 1,53 (m, 2H); 2,21 (s, CH₃CO-); 2,39 (s, CH₃N-); 2,65-2,80 (m, 6H) ppm.

178 931 ^,3C-NMR (D₂0, z dioksanem jako wzorcem wewnętrznym), 26,9 (CH₃CO-); 28,3 (C₃ & C₅); 45,0 (CH₃N-); 50,9 (C₂& C₆); 64,9 (C₄); 67,3 (dioksan); 168,8 (C₂3; 173,6 (CH₃CO-); 193,9 (C^ppm.

MS m/e 225 (M⁺); 183 (M⁺ - CH₂=C=O); 166; 154; 123; 95; 71 (100%).

c) AF164 (sól HC1). Wytworzono chlorowodorek związku AF164, traktując roztwór AF164A lub AF ϊ 64B w metanolu HC1 rozpuszczonym w izopropanolu, aż do uzyskania kwasowego pH (pH 1-2). W krótkim czasie wytrąciła się sól AF164 (chlorowodorek) w postaci białej substancji stałej, temp. topn. 301-2°C (rozkład).

'H-NMR (D₂O) 2,17 (m, 2H), 2,50 (s, CH₃CO-); 2,93 (s, CH₃N-); 3,10 (m, 2H); 3,48-3,71 (m, 4H) ppm.

¹³C-NMR (D₂O, dioksan jako wzorzec wewnętrzny) 26,7 (C₃ & C₅); 26,9 (CH₃CO-); 43,9 (CH₃N-);51,1(C₂&C₆);61,8(C₄);67,3 (dioksan); 154,8 0; 173,4(CH₃CO-); 176,0 O ppm.

Hydroliza AF164

AF 164 A i AF 164B hydrolizowano przez ogrzewanie do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w 0,2 N wodnym roztworze NaOH (1-2 godziny) i otrzymano l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-hydantoinę, zidentyfikowaną przez porównanie jej TLC i ‘H-NMR z autentyczną próbką.

Przykład 3: Piperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoina) AF160 (Des)

Do roztworu suchego AF160 (2,0 g, 9,5 mmola) w dichloroetanie (25 ml, wysuszony na sitach molekularnych) dodano w temperaturze pokojowej chloromrówczanu a-chloroetylu (1,0 ml, 9,3 mmola) i mieszaninę ogrzewano do temperatury 60°C przez 1 godzinę. Dichloroetan usunięto pod próżnią, a wytworzoną stałą substancję rozpuszczono w 20 ml metanolu i roztwór ogrzewano jeszcze przez 30 minut w 60°C. Metanol usunięto pod próżnią, a otrzymaną oleistą stałą substancję rozpuszczono w wodnym roztworze węglanu sodu i przemyto eterem. Warstwę wodną ekstrahowano chloroformem, a ekstrakt odparowano, uzyskując surowy produkt olejowy, którym następnie oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Po elucji mieszaniną chloroform:metanol:wodny roztwór amoniaku (4:1:0,1) uzyskano AF160 (Des) (1,12 g, 60% wydajności) w postaci białego proszku, temp. topn. 225-227°C.

MS m/e 197 (M⁺ podstawowy pik); 57 ¹ H-NMR (CDC1₃) 1,17 (t, J = 6 Hz, 3H); 1,65-1,7 (m, 2H); 1,85-2,0 (m, 2H); 2,75-2,85 (m, 2H); 3,05-3,15 (m, 2H); 3,5 (q, J = 6 Hz, 2H) ppm.

Przykład 4: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylohydantoina) AF178

Do mieszaniny l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-hydantoiny (5,0 g, 27,3 mmola) i wodorotlenku sodu (2,0 g, 50 mmoli) w 120 ml metanolu dodano tosylanu metylu (11,2 g, 60 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, metanol usunięto przez odparowanie, a olejową pozostałość rozpuszczono w wodnym roztworze węglanu potasu i ekstrahowano chloroformem. Ekstrakty organiczne odparowano, a otrzymany surowy produkt następnie oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce, eluując mieszaniną chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku (9:1:0,1). Otrzymano 1,2 g (22%) stałej substancji o temp. topn. 229-231°C.

MS m/e 197 (M⁺, 30%); 71 (100%).

‘H-NMR (wolna zasada, CDC1₃), 1,6-1,7 (m, 2H); 2,1-2,3 (m, 4H); 2,34 (s, 3H); 2,85-2,95 (m, 2H); 3,02 (s, 3H) ppm.

Przykład 5: Piperydyno-4-spiro-5'-(3-metylohydantoina) AF179

Biały proszkowy produkt, który otrzymano w taki sam sposób jak w przykładzie 3, rozpuszczono w izopropanolu i zakwaszono stosując kwas solny i uzyskano biały osad. Temp. topn. powyżej 320°C (rozkład).

MS m/e 183 (M⁺, podstawowy pik); 57.

‘H-NMR (sól HC1, D₂O); 2,0 (m, 2H); 2,2 (m, 2H); 2,96 (s, 3H); 3,3 (m, 2H); 3,6 (m, 2H).

Przykład 6: Synteza l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-propargilohydantoiny) (AF185).

Zawiesinę KH (11 g, 0,1 mola; 35% wag./wag/ dyspersja w oleju mineralnym) i 1-metylopiperydyno-4-spiro-5'-hydantoiny (wysuszonej nadP₂O₅,25 g, 0,13 ml) mieszano w temperatu

178 931 rze pokojowej w suchym DMF (500 ml). Dodano chlorku propargilu (15 g, 0,2 mola) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano do 50°C przez 20 minut. Mieszaninę oziębiono i zakwaszono do pH 3 (za pomocą wodnego roztworu kwasu solnego), a DMF usunięto przez ekstrahowanie mieszaniną eteru naftowego i eteru 1:1, a następnie eterem. Fazę wodną zalkalizowano węglanem sodu do pH~10 i ekstrahowano 2 razy chloroformem. Ekstrakty w chloroformie połączono, wysuszono i odparowano, uzyskując surowy olej (27 g), który poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Po eluowaniu mieszaniną chloroform/metanol/amoniak (80:19:1) otrzymano 3,0 g czystego AF185 i kilka frakcji (całość: 10 g) zawierających nieznaczne zanieczyszczenia. Wolna zasada wytrąciła się w postaci soli HC1; 3,2 g białej niehigroskopijnej soli uzyskano w wyniku krystalizacji z metanolu.

*H-NMR(D₂O, sól HCl)Ó2,0 (m, 4H); 2,64 (t, 1H, J = 3,5 Hz); 2,91 (s, CH₃N-); 3,1-3,2 (m, 2H); 3,5-3,7 (m, 2H); 4,27 (bs, 2H) ppm.

Ή-NMR (D₂O, nadmiar węglanu sodu) δ 1,65-1,75 (m, 2H); 1,9-2,05 (m, 2H); 2,25 (s, CH₃N-); 2,2-2,3 (m, 4H); 2,8-2,9 (m, 4H); 4,25 (s, 2H) ppm.

Ή-NMR (CDC1₃, wolna zasada) δ 1,85-1,95 (m, 4H); 2,2 (m, 2H); 2,23 (t, 1H, J = 3,5 Hz); 2,4 (s, CH₃N-); 2,9-2,95 (m, 2H); 4,3 (d, 2H, J = 3,5 Hz); 6,4 (bs, 1H) ppm.

MS m/e 221 (M⁺, podstawowy pik); 206 (M-15); 149.

Przykład 7: l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2', 5'-bis(metylotio)-4^imidazol) AF177 Do roztworu l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-ditiohydantoiny) (1,00 g, 4,65 mmola; patrz przykład 11) w metanolu (15 ml) dodano NaOH (0,30 g, 7,50 mmola), a następnie stopniowo roztworu jodku metylu (1,00 g, 7,04 mmola) w metanolu (3,0 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Wytrącony NaBr przesączono i przemyto metanolem. Przesącz i przemywki połączono, a rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość zalkalizowano za pomocą wodnego roztworu K₂CO₃ i ekstrahowano eterem. Ekstrakty organiczne wysuszono (Na₂SO₄) i usunięto rozpuszczalnik, otrzymując pozostałość, którą poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników eter/chloroform/metanol/amoniak (wodny roztwór) 78:18:3:1 i po krystalizacji z heksanu uzyskano AF 177, temp. topn. 101-102°C (465 mg).

Ή-NMR (CDC1₃) 1,33 (m, 2H); 1,98 (m, 2H); 2,39 (s, CH₃N-); 2,56 (s, CH₃S-); 2,59 (s, CH₃S-); 2,48-2,64 (m, 2H); 2,82 (m, 2H) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃) 14,1 (CH₃ S-); 14,2 (CH₃ S-); 34,9 (C₃ & C₅); 46,1 (CH₃ N-); 52,2 (C₂ & C₆); 83,0 (C₄); 171,6 (C₂-), _203>5 ppm.

MS m/e 244 (M⁺ +1); 185; 149; 93; 75

IR (KBr) 2920; 2797; 1535; 1477; 1465; 1452; 1378; 1316; 1286; 1210; 1108; 1054; 1000; 965; 942; 900; 776; 969 cm¹.

UV (EtOH) lambda_max 257 nm (ε 16100).

Przykład 8: 1 -metyl opiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-4'-tiohydantoina) AF182

Porcję 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'-(l'-etylo-2'-etylotio-2'-imidazolino-5'-tionu) AF 170 (100 mg; patrz przykład 12) rozpuszczono w 20% HC1 (1 ml) i roztwór ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną zalkalizowano za pomocą stężonego roztworu NaOH do wartości pH = 14, a następnie ekstrahowano dichlorometanem. Ekstrakty organiczne wysuszono (Na₂SO₄), a rozpuszczalnik odparowano, uzyskując l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-4'-tiohydantoinę) w postaci białej substancji stałej (74 mg) krystalizowanej z mieszaniny eter naftowy-dichlorometan, temp. topn. 176-178°C.

Ή-NMR (CDC1₃) 1,25 (t, J = 7,2 Hz, CH₃CH₂-); 1,54 (m, 2H); 2,10 (m, 2H); 2,36 (s, CH₃ N-); 2,41 (m, 2H); 2,96 (m, 2H); 3,94 (q, J = 7,2 Hz, -CH₂CH₃); 7,23 (NH) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃) 11,8 (CH₃CH₂-); 36,9 (C₃ & C₅); 37,4 (-CH₇CH₃); 46,1 (CH₃N-); 51,2 (C₂ & C₆); 68,1 (C₄); 157,1 (C/); 208,1 (C/) ppm. ~

MS m/e 227 (M⁺ ); 211 (M⁺ -O); 194 (M⁺ -SH); 170 (M⁺ -C₃H₇N); 71; 70 (100%).

UV (EtOH) lambda_max 280 nm (ε 13600), 229 nm (ε 4400).

Przykład 9: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(4'-metylotio-3'-imidazolino-2'-tion)

AF183

178 931

Powtarzając przykład 7, ale stosując równoważne ilości jodku metylu, wodorotlenku sodu i ditiohydantoiny, otrzymano, obok pochodnej bis-(metylotio) AF177, l-metylopiperydyno-4spiro-5'-(4'-metylotio-3'-imidazolino-2'-tion) AF183, temp. topn. 218-220°C (rozkład) (z mieszaniny CH₂Cl₂-aceton).

^-NMR (CDC1₃) 1,74 (m, 2H); 2,07 (m, 2H); 2,37 (m, 2H); 2,39 (s, CH₃N-); 2,69 (s, CH₃S-); 2,95 (m, 2H); 10,3 (szer. s, -NH-) ppm.

MS m/e 229 (M⁺); 182 (M⁺ -CH₃S); 123; 122; 70.

UV (EtOH) lambda^ 312 nm (ε 12000), 280 nm (ε 15300).

Przykład 10: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-2', 4'-ditiohydantoina) AF163

Sproszkowaną l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoinę) (0,570 g) i pięciosiarczek fosforu (0,570 g) dokładnie mieszano i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w tetralinie (15 ml) przez 2 godziny. Następnie mieszaninę pozostawiono aby oziębiła się do temperatury pokojowej i wytworzył się brunatny osad. Tetralinę usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a osad rozdrobniono i przemyto eterem naftowym. Zalkalizowano go za pomocą stężonego wodnego roztworu NaOH i ekstrahowano dichlorometanem. Ekstrakt wysuszono (Na₂SO₄) i odparowano, otrzymując pozostałość (0,250 g), którą poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (Merck) (60,15 g). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform/eter/metanol/amoniak (wodny roztwór) 77:18:4:1 i po krystalizacji z mieszaniny CH₂Cl₂-eter, uzyskano czysty AF163, temp. topn. 223-225°C (rozkład).

‘H-NMR (CDC1₃) 1,27 (t, J = 7,2 Hz, CH₃CH₂-); 1,55-1,67 (m, 2H); 2,03-2,19 (m, 2H); 2,26-2,46 (m, 2H), 2,36 (s, CH₃N-); 2,89-3,04 (m, 2H), 4,27 (q, J = 7,2 Hz, -CH₂CH₃); 8,25 (szer. s, -NFI-) ppm.

¹³C-NMR (DMSO-d₆) 11,6 (CH₃CH₂-); 36,9 (C₃ & C₅); 39,9 (-CH₂CH₃); 45,9 (CH₃N); 49,9 (C₂ & C₆); 72,9 (C₄); 179,8 (C^; 207,8 (C^ ppm. ’

MS m/e 243 (M⁺); 186 (M⁺ -C₃H₇N); 149; 71; 70 (100%); 57.

IR (KBr) 3177 (NH); 2930; 2778; 1513; 1434; 1357; 1231; 1116; 1090; 1070; 1040; 961; 801; 780; 626; 546; 457 cm-¹.

UV (EtOH) lambda^ 302 nm (ε 34200), 226 nm (ε 7700).

Synteza winianu związku AF163

Do roztworu wolnej zasady AF 163 (0,735 g, 3,025 mmola) w chlorku metylenu (15 ml) i metanolu (5 ml) dodano kwasu L(+) winowego (0,214 g, 1,427 mmola) w metanolu (2,0 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny, po czym rozpuszczalniki odparowano, a pozostałość zawieszono w mieszaninie eter-chlorek metylenu, przesączono i przemyto tą samą mieszaniną rozpuszczalników, uzyskując żółtą substancję stałą AF163 (winian), temp. topn. 221-225°C (rozkład; 0,923 g, 96% wydajności).

Ή-NMR (D₂O) 1,27 (t, J=7,2 Hz, CH₃CH₂-); 2,08 (m, 2H); 2,49 (m, 2H); 3,01 (s, CH₃N-); 3,31 (m, 2H); 3,76 (m, 2H); 4,26 (q, J = 7,2 Hz, -CH₂CH₃); 4,37 (s, -CHOH) ppm.

Przykład 11: 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-ditiohydantoina) AF 173

Roztwór l-metylo-4-piperydonu (29,35 g, 0,260 mmola), KCN (26,57 g, 0,408 mmola), NH₄C1 (21,00 g, 0,393 mmola) i CS₂ (26 ml) w etanolu (200 ml) i wodzie (50 ml) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną (50-55°C) przez 8 godzin. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w temperaturze pokoj owej na noc, a wytworzony osad przesączono i przemyto wodą, a następnie etanolem, otrzymując żółtą substancję stałą (26,3 g; 47,0% wydajności), temp. topn. 250-253°C (rozkład), krystalizowaną z metanolu, temp. topn. 252-254°Ć (rozkład).

‘H-NMR (DMSO-d₆) 1,43-1,56 (m, 2H); 1,89-2,05 (m, 2H); 2,21 (s, CH₃N-); 2,26-2.40 (m, 2H); 2,64-2,79 (m, 2H); 11,14 (szer. s, -NH-) ppm.

^,3C-NMR (DMSO-d₆) 36,2 (C₃ & C₅); 45,5 (CH₃N-); 49,9 (C₂ & C₆); 74,8 (C₄); 181,5 (C^; 212,0 (C^ ppm.

MS m/e 215 (M⁺); 183 (M⁺ -S), 182 (M⁺ -SH); 181; 15 8 (M⁺ -C₃H₇N); 123; 77; 71 (100%).

IR (KBr) 3130 (NH); 1484; 1449; 1350; 1295; 1231; 1198; 1176; 1145; 1083; 1062; 957; 721; 545; 504 cm¹

UV (0,1 N HC1) lambda_max 298 nm (ε 32000), 220 nm (ε 8000).

178 931

Przykład 12: l-metylopiperydyno-4-spiro-5^/-(3'-etylo-2^/, 4'-ditiohydantoina) AF163; l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(4'-etylotio-3'-imidazolino-2'-tion) AF176;

l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(l'-_etylo-2'-etylotio-2'-imidazolino-5'-tion) AF170.

Do zawiesiny l-metylopiperydyno-4-spiro-5^/-(2^/, 4'-ditiohydantoiny) AF173 (3,30 g, 15,3 mmola) w suchym DMF (30 ml) dodano NaH (0,760 g, 60% w oleju mineralnym; 19,0 mmoli) i mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C przez 1,5 godziny. Do powyższej mieszaniny stopniowo dodano roztworu EtBr (1,85 g; 17,0 mmoli) w DMF (6 ml) i mieszaninę mieszano w 75-80°C przez 4 godziny. Po odstaniu w temperaturze pokojowej przez noc, wytworzony osad (NaBr) przesączono i przemyto eterem. Przesącz i przemywki połączono i odparowano, otrzymując olej, z którego oddzielono nierozpuszczalną w dichlorometanie substancję stałą (1,5 g) i stwierdzono, że stanowi ona materiał wyjściowy (identyczne dane NMR i TLC). Pozostałość poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników eter/chloroform/etanol/amoniak (wodny roztwór) 68:27:4:1 uzyskano najpierw l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-2', 4'-ditiohydantoinę) AF163 (0,95 g), identyczną z produktem uzyskanym wcześniej z reakcji AF160 z P₂S₅. Eluowanie prowadzono dalej i otrzymano l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(4'-etylotio-3'-imidazolino-2'-tion) AF176 (0,15 g), krystalizowany z mieszaniny heksan-CH₂Cl₂, temp. topn. 212-215°C (rozkład).

Ή-NMR (CDC1₃) 1,42 (t, J = 7,2 Hz, CH₃CH₂-); 1,72 (m, 2H); 2,06 (m, 2H); 2,31 (m, 2H); 2,38 (s, CH₃N-); 2,95 (m, 2H); 3,33 (q, J = 7,2 Hz, -CH₂CH₃); 10,0 (br. -NH-) ppm.

¹³C-NMR (DMSO-d₆) 14,2 (CH₃CH₂-); 25,6 (-CH₂CH₃); 35,0 (C₃ & C₅); 45,8 (CH₃N-); 50,5 (C₂ & C₆); 74,3 (C₄); 192,1 (C_r) 198,1 (C₄0 ppm.

MS m/e 243 (M⁺); 182 (M⁺ -EtS, 100%); 156 (M⁺ -EtSCN); 123; 124; 96; 71; 70; 57.

IR(KBr) 3135 (NH); 2930; 2788; 1476; 1463; 1446; 1281; 1257; 1232; 1158; 1141; 1121; 1096; 958; 711; 674; 535 cm'¹.

UV (EtOH) lambda_max 314 nm (ε 5400) inf. 282 nm (ε 6700).

Powtórzenie powyższej reakcji z 1,5 molowym nadmiarem EtBr w stosunku do AF173 dało, obok wymienionej wyżej pochodnych monoetylowych, pochodną dietylową 1-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(l^/-etyło-2^/-etylotio-2'-imidazolino-5^,-tionu) AF170, temp. topn. 66-67°C (krystalizowana z heksanu).

Ή-NMR (CDC1₃) 1,24 (t, J = 7,2 Hz, CH₃CH₂-); 1,24 (m, 2H); 1,44 (t, J = 7,2 Hz, CH₃CH₂-); 2,27 (m, 2H); 2,39 (s, CH₃N-); 2,52 (m, 2H); 2,81 (m, 2H); 3,24 (q, J = 7,2 Hz, -CH₂CH₃); 3,93 (q, J = 7,2 Hz, -CH₂CH₃) ppm.

¹³C-NMR (DMSO-d₆) 12,2 (CH₃CH₂-); 13,9 (CH₃CH₂-); 25,7 (-CH₂CH₃); 36,8 (C₃ & C₅); 39,0 (-CH₂CH₃); 46,1 (CH₃N-); 51,5 (C₂ & C₆); 82,2 (C₄); 158,5 (¾ 216,7 (C₅') ppm.

MS m/e 271 (M⁺); 242 (M⁺ -Et); 214 (M⁺-C₃H₇N); 185; 162; 75; 71; 70 (100%); 57.

IR(KBr) 1574 (C=N); 1446; 1372; 1354; 1212; 1071; 1060; 936 cm'¹.

UV (EtOH) _max (ε) 296 (22000); 252 (17700) nm.

Hydroliza kwasowa AF176

Do AF176 (48 mg) dodano wodnego roztworu HC1 (1 ml, 20%). Natychmiast zaobserwowano zapach merkaptanu. Wytworzony roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, po czym odparowano w temperaturze 50°C pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując chlorowodorek l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiohydantoiny) (X) w postaci białej substancji stałej.

Ή-NMR (D₂O) 2,10-2,43 (m, 4H); 2,94 (s, CH₃N-); 3,20 (m, 1H); 3,47-3,78 (m, 3H) ppm.

MS m/e 199 (M⁺); 181; 171 (M⁺-CO); 156 (M⁺-HNCO); 142 (M⁺-C₃H₇N); 111; 96; 71; 70; 57. '

UV (H₂O) lambda_max 264 nm (ε 20400) 224 nm (ε 8600).

Przykład 13: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiohydantoina) AF195 (a) Roztwór l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-ditiohydantoiny) (AF173) (10,0 g) w etanoloaminie (40 ml) i wodzie (75 ml) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1,75 godziny. Rozpuszczalnik i nadmiar reagenta usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Po kolejnych

178 931 krystalizacjach pozostałości z mieszaniny acetonitryl-dichlorometan; z acetonu i mieszaniny etanol-acetonitryl uzyskano czystą 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5^/-(2'-tio-4'-(8β-hydroksyetyloiminohydantoinę), temp. topn. 230-231°C (rozkład).

Ή-NMR (D₂O) 11,74 (m, 2H); 1,94 (m, 2H); 2,26 (s, CH₃N-) 2,17-2,34 (m, 2H); 2,92 (m, 2H); 3,54 (t, J = 5,4 Hz, -CH₂OH); 3,74 (t, J = 5,4 Hz, =NCH₂-) ppm.

¹³C-NMR (DMSO-d₆) 33,7 (C₃ & C₅); 45,4 (-CH₂-); 45,9 (CH₃N-); 50,6 (C₂ & C₆); 59,2 (-CH₂-); 66,3 (C₄); 182,5 (-C=S); 195,0 (-C=N-) ppm.

MS m/e 242 (M⁺); 224 (M⁺ -H2O); 199; 195; 172; (M⁺ -70); 154; (M⁺ -70-H2O); 71; 70.

UV (0,01 N HC1) lambda_max 227 nm (ε 22200) 242 nm (ε 10200).

Pochodną iminohydantoiny (1,40 g) rozpuszczono w wodnym HC1 (5,0 ml, 1:1) i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość krystalizowano z metanolu, otrzymując chlorowodorek l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiohydantoiny) (0,756 g), identyczny z produktem otrzymanym w wyniku hydrolizy AF176 (patrz przykład 12).

(b) Roztwór 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-ditiohydantoiny) (AF 173) (10,0 g, 0,0465 mmola) i n-butyloaminy (17,0 g, 0,233 mola) w etanolu (80 ml) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1,5 godziny. Krystaliczną substancję stałą, która wydzieliła się z zimnej mieszaniny reakcyjnej, przesączono, przemyto niewielką ilością etanolu, eterem i eterem naftowym i otrzymano l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tio-4-etyloiminohydantoinę) (AF189) (11,1 g, 0,0437 mmola), z wydajnością 94%. Produkt krystalizowano z mieszaniny dichlorometan-metanol i otrzymano igiełki, temp. topn. 236-239°C (rozkład).

Ή-NMR (CDC1₃+CD₃OD) 0,94 (t, J=7,2 Hz, CH₃CH₂-); 1,3 8 (m, 2H); 1,60 (m, 2H); 1,69 (m, 2H); 1,89 (m, 2H); 2,40 (m, 2H); 2,41 (s, CH₃N-); 2,91 (m, 2H); 3,47 (t, J=7,2 Hz, -CH₂-N=) ppm.

MS m/e 254 (M⁺); 197 (M⁺, -C4H9); 184 (M⁺ -70); 149; 128; 71; 70; 57 (C4H₉ ⁺).

Pochodną iminohydantoiny AF189 (10,45 g) rozpuszczono w wodnym roztworze kwasu solnego (15,0 ml, 16%) i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną destylowano, aż pozostała tylko niewielka ilość cieczy. Po dodaniu do pozostałości etanolu (50 ml) i oziębieniu, otrzymano stałą substancję, którą przesączono i przemyto niewielką ilością etanolu i eterem i otrzymano chlorowodorek l-metylopiperydyno-4-spiro-5^/-(2^/-tiohydantoiny) (AF195) (8,42 g, 87% wydajności), temp. topn. >295°C (rozkład), identyczny z produktem otrzymanym uprzednio.

Przykład 14: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(oksazolidyno-2'-tion) AF165

Do bezwodnego DMSO (10 ml), zawierającego niewielką ilość sproszkowanego KOH, dodano podczas mieszania 4-aminometylo-4-hydroksy-l-metylopiperydyny (0,595 g, 4,13 mmola), a następnie dwusiarczku węgla (0,340 g, 4,47 mmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 50°C przez 2 godziny. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a pozostałość kilka razy krystalizowano z metanolu, acetonu i CH₂C1₂, otrzymując krystaliczną substancję stałą, temp. topn. 190-195°C (211 mg).

Ή-NMR (CDC1₂) 1,80-1,98 (m, 2H); 2,03-2,16 (m, 2H); 2,32 (S, CH₃N-); 2,44-2,72 (m, 4H); 3,51 (s -CH₂N-C=S) ppm.

¹³C-NMR(DMSO-dc) 35,1 (C₃C1₅); 45,7 (CH₃N-); 51,5 (C₂C1C₆); 53,1 (-CH₂NH-); 86,4 (C₄); 187,2 (-C=S) ppm.

Przykład 15: N-metylonortropano-3-spiro-5'-(3'-metylohydantoina) AF167 iN-metylonortropano-3-spiro-5'-(3'-etylohydantoina) AF168

a) N-metylonortropano-3-spiro-5'-hydantoina

Mieszaninę tropinonu (45 g, 0,32 mmola) w etanolu (160 ml), węglanu amonu (93 g, 0,96 mmola) w wodzie (400 ml) i KCN (25,8 g, 0,40 mmola) w wodzie (84 ml) ogrzewano w temperaturze 60°C przez 2 godziny, po czym przetrzymywano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Wydzielono N-metylonortropano-3-spiro-5'-hydantoinę (61,33 g, 0,29 mmola, 92% wydajności) i wysuszono w eksykatorze; temp. topn. 330°C.

Widmo mas m/e 209 (M⁺)

Ή-NMR (CD₃COOD) 2,1 (m, 2H, H6=H7 (a)), 2,3 (m, 2H, H2=H4 (β)), 2,4 (m, 2H, H2=H4 (a)), 2.7 (m, 2H, H6=H7 (β)), 2,9 (s, 3H), 3,0 (bs, NH) 4,1 (bs, 2H, H1=H5) ppm.

178 931 'H-NMR (DCI, D₂0) 2,3 (m, 4H, H6=H7 (a) i H2=H4 (β)), 2,5 (m, 2H, H2=H4 (a)), 2,7 (m, 2H, H6=H7 (β)), 2,9 (s, 3H), 4,15 (bs, 2H, H1=H5) ppm.

¹³C-NMR (DCI, D₂0) 25,5 (C6=C7, t), 33,5 (C2=C4, t), 39,7 (CH₃, q), 59,3 (C3-C5', s), 63,0 (C1=C5, d), 159,3 (C2', s), 180,2 (C4', s) ppm.

b) AF167 i AF168

N-metylonortropano-3-spiro-5'-hydantoinę (1 równ.) i KOH (1 równ.) mieszano w wodzie w temperaturze pokojowej przez kilka minut. Do wodnego roztworu wkroplono jodku metylu lub bromku etylu (2 równ.) w metanolu lub etanolu. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano chloroformem i wysuszono nad siarczanem magnezu, po czym odparowano. Produkty AF 167 i AF 168 otrzymano z wydajnością około 10%.

AF167 'H-NMR (D₂O) 1,65 (m, 2H, H6=H7 (a)), 1,8 (m, 2H, H2=H4 (β)), 2,2 (m, 2H, H2=H4 (a)), 2,4 (m, 2H, H6=H7 (β)), 2,55 (s, 3H), 2,85 (s, 3H), 3,25 (bs, 2H, H1=H5) ppm.

Ή-NMR (CDC1₃) 1,55 (m, 2H, H6=H7 (a)), 1,75 (m, 2H, H2=H4 (β)), 2,2 (m, 2H, H2=H4 (a)), 2,4 (s, 3H), 2,45 (m, 2H, H6=H7 (β)), 3,0 (s, CH3), 3,3 (bs, 2H, H1=H5), 6,3 (bs, NH) ppm.

Widmo mas m/e 223 (M⁺)

AF168

Ή-NMR (CDC1₃, CD₃OD) 1,1 (t, 3H), 1,6 (m, 2H, H6=H7 (a)), 1,75 (m, 2H, H2=H4 (β)), 2,2 (m, 2H, H2=H4 (a)), 2,35 (s, 3H), 2,4 (m, 2H, H6=H7 (β)), 3,3 (bs, 2H, H1=H5), 3,55 (q, 2H) ppm.

Ή-NMR (CDC1₃) 1,2 (t, 3H), 1,6 (m, 2H, H6=H7 (a)), 1,75 (m, 2H, H2=H4 (β)), 2,2 (m, 2H, H2=H4 (a)), 2,4 (s, 3H), 2,45 (m, 2H, H6=H7 (β)), 3,3 (bs, 2H, H1=H5), 3,55 (q, 2H), 6,3 (bs, NH) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃, δ) 13 (CH₃CH₂), 25 (C6-C7), 35 (C2=C4), 40 (N-CH₃), 40,5 (N-CH₂), 59 (C3-C53, 60 (C1=C5), 159 (C23, 180 (C43 ppm.

Widmo mas m/e 237 (M⁺)

Przykład 16: l-metyIopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyn-2'-on) AF172

a) 4-acetamidometylo-4-hydroksy- 1-metylopiperydyna

4-aminometylo-4-hydroksy-l-metylopiperydynę (2,95 g, 0,02 mola), węglan potasu (6,5 g, 0,047 mola) i bezwodnik octowy (8,5 g, 0,08 mola) w metanolu mieszano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Dodano wodorotlenku sodu w celu zobojętnienia i roztwór ekstrahowano chloroformem. Po odparowaniu otrzymany żółty olej zidentyfikowano jako 4-acetamidometylo-4-hydroksy-l-metylopiperydynę (3,4 g, 0,018 mola, wydajność 91%).

b) 4-etyloaminometylo-4-hydroksy-1 -metylopiperydyna

4-acetamidometylo-4-hydroksy-l-metylopiperydynę (3,4 g, 0,018 mola) w suchym THF ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w obecności wodorku litowo-glinowego (4 g). Po 3 dniach mieszaninę wylano do wody z lodem i przesączono przez Celit. Rozpuszczalnik odparowano i po dodaniu wody roztwór ekstrahowano chloroformem, po czym ekstrakt wysuszono nad siarczanem magnezu i odparowano, uzyskując 1,03 g (33% wydajności) surowego materiału. Tak otrzymany produkt, 4-etyloaminometylo-4-hydroksy-l-metylopiperydynę, stosowano bez dalszego oczyszczania.

c) l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyn-2-on) AF172

4-etyloaminometylo-4-hydroksy-l-metylopiperydynę (16,8 g, 0,1 mola) i Ν,Ν'-karbonylodiimidazol (32 g, 0,2 mola) mieszano w 400 cm³ chloroformu pod azotem. Po odparowaniu otrzymano 50 g surowego materiału, który przemyto starannie heksanem, a następnie odparowano, uzyskując l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyn-2-on) AF172 w postaci żółtawego oleju (16,8 g, 0,085 mmola, 85% wydajności).

Ή-NMR (CDC1₃) δ 1,15 (t, 3H), 1,8 (m, 2H), 1,95 (m, 2H), 2,3 (s, 3H), 2,55 (m, 2H), 3,28 (s, 2H), 3,32 (q, 2H) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃) 13 (CH₃CH₂), 22 (CH₃CH₂), 37 (CH₃CH₂N), 39 (CH₂NEt), 52 (NCH₂CH₂), 55 (C-O), 157,5 (C=O) ppm.

Widmo mas m/e 198 (M⁺)

178 931

Przykład 17: l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(3'-etylooksazolidyn-2-on) AF174

a) 4-acetamido-4-hydroksymetylo-1 -metylopiperydyna 4-amino-4-hydroksymetylo-l-metylopiperydynę (2,95 g, 0,02 mola), węglan potasu (6,5 g, 0,047 mola) i bezwodnik octowy’ (8,5 g, 0,08 mola) w metanolu mieszano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Dodano wodorotlenku sodu w celu zobojętnienia i roztwór ekstrahowano chloroformem. Po odparowaniu otrzymaną białą substancję stałą krystalizowano z acetonu, otrzymując 4-acetamido-4-hydroksymetylo-l-metylopiperydynę (1,67 g, 0,009 mola, 45% wydajności).

b) 4-etyloamino-4-hydroksymetylo-1 -metylopiperydyna

4-acetamido-4-hydroksymetylo-l-metylopiperydynę (1,6 g, 8,6 mmoli) w suchym THF ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w obecności wodorku litowo-glinowego (3 g). Po 4 godzinach mieszaninę przelano do wody z lodem i przesączono przez Celit. Rozpuszczalnik odparowano i po odparowaniu większości wody roztwór ekstrahowano chloroformem, wysuszono nad siarczanem magnezu i odparowano, uzyskując 1,13 g (77% wydajności) całkiem czystego materiału. Produkt, 4-etyloamino-4-hydroksymetylo-l-metylopiperydynę, tak wytworzoną stosowano bez dalszego oczyszczania.

c) l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(3'-etylooksazolidyn-2-on) AF174

4-etyloamino-4-hydroksy-l-metylopiperydynę (172 mg, 1 mmol) i N,N'-karbonylodiimidazol (486 mg, 3 mmole) mieszano w chloroformie pod azotem przez 3 godziny. Po odparowaniu tak otrzymany produkt przemyto dokładnie heksanem, po którego odparowaniu uzyskano produkt, l-metylopiperydyno-4-spiro-4''-(3^/-etylooksazolidyn-2-on) AF174 w postaci białej substancji stałej (140 mg, 0,71 mmola, 71% wydajności).

Ή-NMR (CDC1₃)Ó1,10 (t, 3H); 1,6 (m, 2H); 1,95 (m, 4H); 1,95 (m, 4H); 2,25 (s, 3H); 2,85 (m, 2H); 3,2 (q, 2H), 4,1 (s, 2H) ppm.

Widmo mas m/e 198 (M⁺).

Przykład 18: 2-N-metylospiro-(l,3-sukcynimido-4,3^z)chinuklidynaAF133

a) (3-chinuklidylideno)-cyjanooctan etylu

Mieszaninę 3-chinuklidynonu (30 g, 0,24 mola), cyjanooctanu etylu (40 g, 0,35 mola), octanu amonu (3,8 g), kwasu octowego (11 g) i 120 ml benzenu ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną i usunięto wodę przez destylację azeotropową (całkowita ilość wody 4 ml). Roztwór benzenowy oziębiono, i dodano węglanu potasu (30 g) w 120 ml wody i ekstrahowano mieszaninę toluenem (3 x 500 ml). Ekstrakty w toluenie połączono i wysuszono. Wytrącił się produkt w postaci chlorowodorku z wydajnością 63 g (95%) surowego produktu.

TLC wodorotlenek amonu (25% w wodzie) 2% obj./obj. w metanolu na krzemionce Art 5735 (Merck), R_f 0,67. Produkt można następnie oczyścić przez krystalizację w etanolu lub izopropanolu.

Ή-NMR δ (CDC1₃-TMS) wolna zasada: 1,29 (t, 3H, CH₃); 4,2 (q, 2H, CH₂); 1,7-1,9, 2,8-3,2 (m, szkielet chinuklidynowy).

¹³C-NMRÓ(CDC1₃-TMS): 14(CH₃); 62(CH₂O); 189 (C=O); 162(C=N); 115(C-CN); 100 (C=C); 33,7 (C-H)

b) 3-karboetoksy-3-karboetoksymetylochinuklidyna (3-chinuklidylideno)-cyjanooctan etylu (64 g, 0,24 mola) i cyjanek potasu (17 g, 0,26 mola) rozpuszczone w 25 ml wody, rozpuszczono w 125 ml etanolu. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 20 minut, oziębiono, zdekantowano znad chlorku potasu, a pozostały chlorek potasu przemyto dwoma 50 ml porcjami etanolu. Połączone roztwory alkoholowe odparowano, a olejową pozostałość rozpuszczono w 250 ml stężonego kwasu solnego i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 24 godziny. Następnie roztwór odparowano, a pozostałość przemyto kilka razy acetonem i wysuszono. Wysuszoną stałą substancję ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w etanolu nasyconym chlorowodorem przez 20 godzin. Następnie etanol usunięto, a pozostałość ostrożnie zalkalizowano, stosując węglan sodu, i ekstrahowano do chloroformu. Roztwór chloroformu wysuszono, odparowano, po czym surowy diester oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej, stosując 2% metanol w chloroformie jako układ eluentów.

178 931

MS m/e 2,69 (M⁺); podstawowy pik m/e 196 (M-C-OEt).

Ή-NMR δ (CDC1₃-IMS) 1,2 (dt, 6H, CH₃); 4,2-4,3 (dt, 4H), CH₂O); 1,3-1,6, 2,6-3,1 (m, szkielet chinuklidynowy).

c) 2-N-metylo-spiro-(l,3-sukcynimido-4,3') chinuklidyna AF133

3-karboetoksy-3-karboetoksymetylochinuklidynę (3,35 g, 12 mmoli) rozpuszczono w 4,5 g metyloaminy i ogrzewano pod ciśnieniem w temperaturze 190°C (90 godzin). Mieszaninę reakcyjną oziębiono, odparowano, a stałą pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce, stosując 2% metanol w chloroformie zawierającym 0,2 amoniaku jako układ eluentów. AF133 otrzymano w postaci białej substancji stałej, temp. topn. 94-96°C, 1,2 g, (5,7 mmola). MS M⁺ 209 'H-NMRÓ(CDC1₃-TMS), 3,4 (d, 1H) (H₂); 2,96 (s, 3H) (CH₃); 2,5 (d, 1H) (H₂); 1,5-1,9 (m, szkielet chinuklidynowy).

Przykład 19: 2-N-etylo-spiro-(l,3-sukcynimido 4,30 chinuklidyna AF134

Surową 3-karboetoksy-3-karboetoksymetylochinuklidynę (20 g) rozpuszczono w 70% wodnym roztworze etylaminy i ogrzewano w temperaturze 140°C pod ciśnieniem przez siedem godzin. Reakcję monitorowano metodą G. C. Surowy produkt ekstrahowano chloroformem, a następnie wysuszono i odparowano. Olejową pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce, stosując mieszaninę chloroform/eter nafto wy/etanol/wodny roztwór amoniaku 17/13/3/0,4. Wytrąciła się wolna zasada w postaci chlorowodorku i otrzymano 6,6 g białej substancji stałej, temp. topn. 270-272°C. TLC, wodorotlenek amonu (25% w wodzie) 2% obj./obj. w metanolu na krzemione Art 5735 Merck R_f 0,47.

MS M⁺ 222

Ή-NMR δ (CDC1₃-TMS) wolna zasada: 1,5 (t, 3H, CH₃),3,5 (q, 2H, N-CH₂); 1,6-3,3 (m, szkielet chinuklidynowy).

Przykład 20: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(oksazolidyno-2', 4'-dion) AF169 i l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyno-2', 4'-dion) AF180

a) 4-hydroksy-4-cyjano-1 -metylopiperydyna

Do świeżo destylowanego l-metylopiperydyn-4-onu (81,72 g, 0,72 mola) w wodzie (200 cm³) dodano około 100 cm³ 37% HC1 do wartości pH = 3. Mieszaninę reakcyjną oziębiono w łaźni lodowej i dodano cyjanku potasu (49 g, 0,75 mola) w wodzie (200 cm³) z szybkością odpowiednią do utrzymania wewnętrznej temperatury około 10°C. Mieszanię mieszano jeszcze przez 2 godziny po dodaniu i następnie przesączono. Po przemyciu wodąi wysuszeniu otrzymano produkt, 4-hydroksy-4-cyjano-l-metylopiperydynę z wydajnością 67%, w postaci białego proszku (67 g, 0,48 mmola, temp. topn. 135°C). Ή-NMR (CDC1₃) δ 1,9 (m, 2H); 2,2 (m, 2H); 2,4 (s, 3H); 2,45 (m, 2H); 2,75 (m, 2H); 2-3,5 (bm, 1H, OH) ppm.

b) 4-hydroksy-4-karbamoilo-1 -metylopiperydyna

Do kwasu siarkowego (80 ml), przy zewnętrznym oziębianiu, dodano stopniowo 4-hydroksy-4-cyjano-l-metylopiperydyny (36,4 g, 0,26 mola). Mieszaninę utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 41 godzin, po czym dodano do sproszkowanego lodu (30 g). Wytworzony roztwór zobojętniono węglanem baru (376 g) do wartości pH 8-9 i po dodaniu wody wytworzony siarczan baru oddzielono i przemyto metanolem. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt, 4-hydroksy-4-karbamoilo-1-metylopiperydynę (28,16 g, 0,18 mola, 69% wydajności) wykrystalizowano z etanolu w postaci białej substancji stałej (temp. topn. 180°C).

Ή-NMR (CD₃OD) δ l ,51 (m, 2H); 2,15 (m, 2H); 2,25 (s, 3H), 2,4 (m, 2H); 2,7 (m, 2H) ppm.

Widmo mas m/e 158 (M⁺).

c) l-metylopiperydyno-4-spiTO-5'-(oksazolidyno-2', 4'-dion) AF169

Do roztworu metanolanu potasu (9,8 g, 0,14 mola) w suchym etanolu (60 ml) dodano roztworu 4-hydroksy-4-karboksamido-N-metylopiperydyny (27,5 g, 0,17 mola) i węglanu dietylu (26,23 g, 0,22 mola) w etanolu (300 ml). Wytworzoną mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w 80°C przez 60 godzin. Mieszaninę reakcyjną odparowano, a pozostałość wytrząsano z zimną wodą (70 ml) i zobojętniono za pomocą HC1 (2 N) do wartości pH = 7. Roztwór zatężono do połowy objętości, a biały osad przesączono. Po roztarciu z etanolem uzyskano

178 931 l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(oksazolidyno-2', 4'-dion) AF169 (22 g, 0,12 mola) z wydajnością 70%, w postaci białej substancji stałej (temp. topn. 285°C (rozkład)).

‘H-NMR (D₂O, pH 7) 2,07 (m, 2H); 2,27 (m, 2H); 2,95 (s, 3H), 3,30 (m, 2H); 3,60 (m, 2H) ppm.

Widmo mas (pH związku wynosi 7) m/e 185 i 184 (M⁺ + 1 i M⁺).

d) l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyno-2', 4'-dion) AF180

Do roztworu l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(oksazolidyno-2', 4'-dionu) (2,8 g, 0,015 mola) w suchym DMF (100 cm³) dodawano powoli wodorku potasu (65% w oleju), aż mieszanina przestała się ogrzewać (zużyto 4,9 g). Białą zawiesinę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotnąprzez 1 godzinę i oziębiono. Wkroplono bromku etylu (4,6 g, 0,042 mola). Mieszanina samoistnie ogrzała się. Gdy mieszanina oziębiła się do temperatury pokojowej, ogrzewano jądo wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 2 godziny. Po oziębieniu oddzielono białą substancję stałąi przemyto etanolem. Po odparowaniu rozpuszczalników, surowy produkt poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym, stosując chloroform i metanolu jako eluenty. Odparowano frakcje zawierające czysty produkt. Produkt w postaci wolnej zasady oddzielono i zidentyfikowano. Do praktycznego stosowania produkt przekształcono w chlorowodorek za pomocą roztworu HCl/eter/etanol, z którego wytrącił się jako chlorowodorek 1-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyno-2', 4'-dionu) (0,746 g, 0,003 mole, 21%) (temp, topn, 305°C, rozkład).

’Η-NMR (CDC1_S, wolna zasada) δ 1.2 (t, 3H), 1.75 (m, 2H), 2.15 (m, 2H), 2.3 (s, 3H), 2.32 (m, 2H), 2.80 (m, 2H), 3.55 (q, 2H)ppm.

¹³C-NMR (CDCI3, wolna zasada) δ 13 (CH₃CH₂), 32 (CH₂CH₃), 35 (CH₂-CH₂-C, 46 (N-CH₃), 50 (CH₂-N-CH₃), 85 (^spiro), 155 (OC=O), 175 (C-C=O) ppm.

Widmo mas (wolna zasada) m/e 212 (M⁺).

Przykład21: l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2'-metylo-2'-tiazolina) AF151 (S)

a) Mieszaninę l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2'-metylo-2'-oksazolmy), AF151 (1,85 g, 11,01 mmola), pięciosiarczku fosforu (1,83, 8,23 mmola) i monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego (4,20 g, 22,08 mmola) w ksylenie (70 ml) mieszano magnetycznie i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 3 godziny. Rozpuszczalnik usunięto przez destylację azeotropową, a otrzymanąpozostałość zalkalizowano stężonym wodnym roztworem NaOH, po czym ekstrahowano dichlorometanem. Ekstrakty organiczne wysuszono (Na₂SO₄), rozpuszczalnik usunięto otrzymując brązowy olej (2,10 g), który poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym (Kieselgel S, 0,032-0,63 mm, Riedel DeHaen, 70 g). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników 97% chloroform-3% metanol, który zawierał 10 M amoniaku, otrzymano frakcje zawierające czysty AF151 (s) (0,90 g).

b) Dokładnie zmieszane sproszkowane 4-acetamido-4-hydroksy-metylo-l-metylopiperydynę (8,00 g, 0,043 mola) i pięciosiarczek fosforu (6,10 g, 0,0275 mola) zawieszono w ksylenie (120 ml), mieszano magnetycznie i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 6 godzin. Mieszaninę reakcyjnąpozostawiono w temperaturze pokojowej przez noc i wytworzony osad przesączono i przemyto eterem naftowym (40-60°C), otrzymując szary proszek (13,0 g). Uzyskany proszek oziębiono i zalkalizowano stężonym wodnym roztworem NaOH, po czym kilka razy ekstrahowano dichlorometanem. Połączone ekstrakty organiczne wysuszono (Na₂SO₄) i odparowano. Pozostałość ekstrahowano heksanem i po usunięciu heksanu otrzymano czerwony olej (3,53 g), który destylowano, uzyskując bezbarwny olej, temp, wrzenia 60-68°C (0,4 mm), (2,40 g), który poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym 60 (Merck, 100 g). Po eluowaniu mieszaniną CHCl₃:Et₂O:MeOH:NH₄OH (70:25:4:1) otrzymano czysty AF151 (S) (1.71 oc).

‘H-NMR (CDC1₃) 1.65-1.78 (m, 2H); 1.90-2.04 (m, 2H); 2.19 (s, CH₃C=N-); 2.32 (s, CH₃N-); 2.30-2.43 (m, 2H); 2.60-2.75 (m, 2H); 3.11 (s, CH₂S-)ppm.

¹³ C-NMR (CDC1₃) 19.9 (CH₃C=N-); 35.8 (C₃&C₅); 43.1 (-CH₂S-); 45.6 (CH₃N-); 52.1 (C₂&C₆); 78.5 (C₄); 161.0 (S-C=N-) ppm.

MS m/e 184 (M⁺, 100%); 110 (26%); 109 (56%); 72 (93%); 71 (24%).

Przykład 22: l-metylopiperydyno-4-spiro-4'(5)'-(2'-metylo-2'-imidazolina) AF190

178 931

a) 4-ammo-4-cyj ano-1 -metylopiperydyna l-metylopiperydyn-4-on (33,0 g, 0,292 mola), cyjanek potasu (19,5 g, 0,299 mola) i chlorek amonu (16,5 g, 0,308 mola) zawieszono w metanolu (225 ml) i wodzie (150 ml) i mieszaninę mieszano przez 12 dni w temperaturze pokoj owej. Wytworzony osad przesączono i przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Po usunięciu wody, która pozostała, do pozostałości dodano etanolu, po czym poddano destylacji azeotropowej. Ponownie dodano etanolu do pozostałości, która rozpuściła się częściowo, a pozostałą nieorganiczną substancję stałą przesączono i przemyto etanolem. Połączono przesącz i przemywki i usunięto rozpuszczalnik otrzymując lepki olej (35,5 g), który wykazał dwie plamy na TLC (chloroform:metanol: wodny roztwór wodorotlenku amonu, 17:2:1 - żel krzemionkowy). Olej ten krystalizowano z eteru i otrzymano substancję stałą którą dalej krystalizowano z tego samego rozpuszczalnika i otrzymano 4-cyjano-4-hydroksy1 -metylopipeiydynę w postaci kryształów, temp. topn. 130-133°C. Po zatężeniu roztworu macierzystego uzyskano drugi rzut substancji krystalicznej, którą w większości stanowiła 4-amino-4-cyj ano-1 -metylopiperydyna.

Ή-NMR (CDC1₃) 1,72-1,88 (m, 2H); 2,01 (m, 2H); 2,25-2,37 (m, 2H); 2,32 (s, CH₃N-); 2,74-2,83 (m, 2H) ppm.

MS m/e 139 (M⁺); 112 (M⁺-HCN); 71,70.

Po acetylowaniu 4-amino-4-cyjano-l-metylopiperydyny bezwodnikiem octowym i pirydyną uzyskano 4-acetamido-4-cyj ano-1-metylopipeiydynę, którą krystalizowano z mieszaniny eter naftowy-dichlorometan, temp. topn. 143-144°C.

Ή-NMR (CDC1₃) 1.78-1.96 (m, 2H); 2.04 (s, CH₃CON-); 2.32 (s, CH₃N-); 2.35-2.50 (m, 4H); 2.66-2,84 (m, 2H); 6.22 (s, -NHCO-) ppm.

MS m/e 181 (M⁺); 122 (M⁺-CH₃CONH₂)

IR (CHC1₃) 3438, 3303, 2940, 2804; 2242 (C=N); 1670 (amid) cm-¹.

Po hydrolizie kwasowej (H₂SO₄) 4-amino-4-cyjano-l-metylopiperydyny otrzymano 4-amino-4-karbamoilo-l-metylopiperydynę, którą krystalizowano z mieszaniny octan etylu- dichlorometan, temp.topn. 145-147°C.

Ή-NMR (CDC1₃) 1.44 (m, 2H); 1.68 (br-NH₂); 2,12-2.34 (m, 4H); 2.30 (s, CH₃N-); 2.70-2.82 (m, 2H); 5.47 (br -NH-); 7.39 (br, -NH-) ppm.

MS m/e 158 (M⁺ + 1); 157 (M⁺); 140 (M⁺ -NH3, 100%); 113 (M⁺ - CONH2); 96; 71.

b) 4-amino-4-aminometylo-1 -metylopiperydyna

Do mechanicznie mieszanej zawiesiny LiAlH₄ (3,0 g) w suchym dimetoksyetanie w atmosferze azotu dodano roztworu 4-amino-4-cyjano- 1-metylopiperydyny (3,60 g) w suchym dimetoksyetanie, z taką szybkością aby temperatura nie przekroczyła 50°C. Pod koniec dodawania mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin. Nadmiar LiAlH₄ zlikwidowano dodając do zimnej (0°C) mieszaniny, podczas mieszania i pod azotem, 4 MNaOH (10 ml), wody (3 ml), nasyconego roztworu NaOH (10 ml) i wody (5 ml). Oddzielono organiczny rozpuszczalnik i fazę wodną ekstrahowano kilka razy gorącym THF. Organiczny rozpuszczalnik oddzielono, a ekstrakty w THF połączono, wysuszono (Na₂SO₄) i usunięto rozpuszczalniki, uzyskując związek tytułowy w postaci lepkiego oleju (3,17 g), który oczyszczono przez destylację temp, wrzenia 60-62°C (0,8 mm).

Ή-NMR (CDC1₃) 1,43 (m, 2H); 1,58 (m, 2H); 2,15 (br. -NH₂); 2,30 (s, CH₃N-); 2,30 (m, 2H); 2,56 (s, -CH₂NH₂); 2,56 (m, 2H) ppm.

Po acetylowaniu wytworzonej diaminy otrzymano diacetamid w postaci substancji stałej, temp. topn. 175-176°C (z acetonitrylu).

Ή-NMR (CDC1₃) 1,74 (m, 2H); 1,96-2,10 (m, 2H); 1,99 (s, CH₃CON-); 2,02 (CH₃CON-); 2,21 (m, 2H); 2,28 (s, CH₃N-); 2,51-2,61 (m, 2H); 3,50 (d, J = 5,7 Hz, -CH₂NH-); 5,62 (s, -NHCO-); 7,18 (t, CH₂NHCO-) ppm.

MS m/e 227 (M⁺); 184 (M⁺ -CH3CO); 169 (M⁺ -CH3CONH); 168 (M⁺ CH₃CONH₂); 167; 155; 112; 109 (100%); 96; 71; 70.

178 931

Diacetamid otrzymano również przez uwodornienie 4-amino-4-cyjano-1 -metylopiperydyny wodorem (50 psi) w obecności niklu Raneya jako katalizatora w gorącym (60°C) bezwodniku octowym zawierającym octan sodu.

c) l-metylopiperydyno-4-spiro-4'(5)'-(2'-metylo-2'-imidazolina) AF 190.

Do roztworu 4-amino-4-aminometylo-l-metylopiperydyny z punktu b) (0,248 g, 1,734 mmola) w dichlorometanie (5 ml) dodano chlorowodorku acetoimidanu etylu (0,282 g, 2,282 mmola) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniej szonym ciśnieniem, a pozostałość zalkalizowano stężonym wodnym roztworem Na₂CO₃, po czym ekstrahowano dichlorometanem. Ekstrakt wysuszono (Na₂SO₄) i usunięto rozpuszczalnik, otrzymując bezbarwny olej (191 mg), który poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników metanol:chloroform:l% wodny roztwór wodorotlenku amonu z wzrastającązawartością metanolu od 10% do 99%, uzyskano czysty produkt AF190 w postaci oleju, który zestalił się po zamrożeniu.

Ή-NMR (CDC1₃) 1.57-1.84 (m, 4H); 1.93 (s, CH₃C=N-) 2.17-2.33 (m, 2H); 2.29 (s, CH₃N-); 2,56 (m, 2H); 3.37 (s, -CH₂-N-) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃) 15.2 (CH₃C=N-); 37.3 (C₃ & C₅); 46.1 (CH₃N-); 52.5 (C₂ & C₆); 59.7 (C₄); 63.7 (-CH₂N-); 162.1 (-C=N-) ppm.

MS m/e 167 (M⁺); 152 (M-CH₃); 138; 109 (100%); 97; 96; 72; 71; 70.

IR (nierozcień.) 3260; 2933; 2852; 2800; 1620 (-C=N) cm’¹.

Przykład 23: l-metylopiperydyno-4-spiro-4^/(5^/)-[2'-metylo-4Ή(5Ή)-imidazol-5^/ (4>on] AF230

4-acetamido-4-cyjano-l-metylopiperydynę (1,03 g) rozpuszczono w stężonym kwasie siarkowym (4,0 ml) i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 4 dni. Mieszaninę reakcyjną przeniesiono do zimnej wody (10 ml), a następnie dodawano węglanu baru, aż do momentu, gdy nie zachodziła już reakcja. Odsączono wytrącony siarczan baru i przemyto wodąi etanolem. pH połączonego przesączu i przemy wek nastawiono do wartości 13 stężonym roztworem NaOH, a rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość ekstrahowano etanolem, ekstrakt odparowano i pozostałość ekstrahowano dichlorometanem i po odparowaniu ekstraktu otrzymano olej (0,75 g), który poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym 60 (Merck 0,040-0,063 mm, 32 g). Po eluowaniu mieszaniną metanolu (zawierającego 15% wag./wag. ΝΉ₃) i chloroformu otrzymano czysty AF230 (0,185 g) krystalizowany z mieszaniny dichlorometan-eter, temp. topn. 231-234°C.

Ή-NMR (CDC1₃) δ 1.49 (m, 2H), 1.97 (m, 2H), 2.20 (s, CH₃-). 2.34 (s. CH₃-), 2.48 (m, 2H), 2.80 (m, 2H), 9,83 (br. -NH-) ppm.

Ή-NMR (D₂O)δ 1.55 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 2.22 (s, CH₃-), 2.29 (s, CH₃-), 2.33 (m, 2H), 2,90 (m, 2H) ppm.

MS m/e 181 (M⁺); 111 (M⁺-70); 104; 94; 77; 71(100%); 70.

UV (EtOH) lambda_max 224 nm. (ε 4650), 248 nm. (ε 2450).

IR(KBr) 3140; 2795; 2540; 1665; 1540 cm-¹.

Cyklizację 4-acetamido-4-cyjano-l-metylopiperydyny można również przeprowadzić w ośrodku zasadowym. Tak więc, ogrzewanie tego związku do wrzenia w 1 N etanolowym roztworze KOH lub w 1 N wodnym roztworze NaOH, również prowadzi do AF230. W tym ostatnim przypadku, otrzymuje się również 4-acetamido-4-karbamoilo-l-metylopiperydynę, temp. topn. 207-208°C (rozkład), krystalizowaną z mieszaniny dichlorometan-metanol.

Ή-NMR (CDC1₃)Ó2.05 (CH,CO-), 2.08-2.30 (m, 6H), 2.28 (CH₃N-), 2.63 (m, CH₂-), 5,40 (brs. -NH-), 5,56 (brs, -NH-), 7.04 (brs, -NH-) ppm.

MS m/e 199 (M⁺); 181 (M⁺-H2O); 155 (M⁺ -CONH2); 140 (M⁺-CH₂CONH₂); 122; 112; 111; 96; 71(100%); 70.

AF230 może występować również w postaci tautomerów, jak wskazano w tytule.

Przykład 24: 1 -metylopipery dyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-2'-oksazolin-4'-on), AF238

a) 4-acetamidokarbonylo-4-acetoksy-1 -metylopiperydyna

178 931

Do mieszaniny 4-cyjano-4-hydroksy-1 -metylopiperydyny (2,55 g, 18 mmoli) i bezwodnika octowego (11 ml, 108 mmoli) w kolbie trójszyjnej, wkroplono 5,1 g (2 równoważniki) 60% roztworu kwasu nadchlorowego (HC1O₄). Reakcja była egzotermiczna, ale temperatura spadła po 20 minutach. Roztwór mieszano przez 2 godziny i pozostawiono do odstania przez noc w temperaturze pokojowej. Odsączono biały osad i przemyto eterem i eterem naftowym. Otrzymano sól kwasu nadchlorowego 4-acetamidokarbonylo-4-acetoksy-l-metylopiperydyny prawie z ilościową wydajnością.

Ή-NMR [nadchloran] (D₂O] 02,2-2,4 (m, 2H), 2,26 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,5 (m, 2H), 2,95 (s, 3H), 3,32 (m, 2H), 3,58 (m, H) ppm.

Ή-NMR [wolna zasada] (CDC1₃) δ 2,05-2,27 (m, 4H), 2,13 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,67-2,75 (m,4H),8,4(bs, lH,NH)ppm.MSm/e242(M⁺); 182,167,139,123(100%), 114,96,82,70,60.

UV (H₂O) lambda_max 206 nm (ε 20400).

IR(KBr) 3380, 3020, 1740, 1670 (sh), 1550, 1400, 1380, 1250 cm-'

b) 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-2'-oksazolin-4'-on), AF23 8.

Sól kwasu nadchlorowego 4-acetamidokarbonylo-4-acetoksy-l-metylopiperydyny (70 mg, 0,25 mmola) w ksylenie ogrzewano w temperaturze 172°C (temperatura łaźni z olejem silikonowym), po czym biała zawieszona substancja stała zmieniła zabarwienie na żółte. Podczas przebiegu reakcji był wyczuwalny silny zapach kwasu octowego. TLC wykazała całkowitą konwersję do l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-2^/-oksazolin-4'-onu), AF238, który scharakteryzowano jako sól kwasu nadchlorowego.

'H-NMR(D₂O)Ó2,2 (m, 3H); 2,25 (m, 2H); 2,45 (m, 2H); 2,8 (s, 3H); 3,25 (m, 2H); 3,5 (m, 2H) ppm.

MS m/e 182 (M⁺); 140, 123, 112, 104, 96, 77, 70 (100%).

Przykład 25: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(l'-metylo-3'-etylohydantoina), AF161

Do mieszaniny AF 160 (100 mg, 0,47 mmola) i KH( 100 mg, 35% wag./wag. w oleju mineralnym) w 5 ml DMF dodano p-toluenosulfonianu metylu (0,4 g, 1 mmol) i roztwór mieszano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym zakwaszono roztworem kwasu szczawiowego w eterze. Osad rozpuszczono w wodzie, zalkalizowano i ekstrahowano eterem naftowym. Ekstrakty zatężono i poddano chromatografii na krzemionce, stosując mieszaninę chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku, 90:10:1. Czyste frakcje połączono i odparowano, a pozostałość rozpuszczona w eterze wytrąciła się w postaci soli HC1 (85 mg, wydajność 72%).

'H-NMR (wolna zasada, CDC1₃) δ 1,2 (t, J = 6 Hz, 3H), 1,6-1,65 (m, 2H), 2,0-2,1 (m, 2H), 2,39 (s, 3H), 2,75-2,85 (m, 4H), 2,86 (s, 3H), 3,55 (q, J = 6 Hz, 2H) ppm.

'H-NMR (sól HC1, D₂O) δ 1,2 (t, J = 6 Hz, 3H), 2,1-2,15 (m, 2H), 2,3-2,4 (m, 2H), 2,95 (s, 3H), 3,5 (q,J=6Hz, 2H) ppm.

MS m/e 225 (M⁺ 18%); 71(100%).

Przykład 26: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(l', 3'-dietylohydantoina) AF162

Do mieszaniny 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-hydantoiny (110 mg, 0,6 mmola) i KH (0,2 g, 35% wag./wag. w oleju mineralnym) w 3 ml DMF dodano bromku etylu (0,5 g, 4,6 mmola) i roztwór mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej, rozcieńczono eterem i zakwaszono nadmiarem kwasu szczawiowego. Osad rozpuszczono w wodzie, zalkalizowano i ekstrahowano kilka razy chloroformem. Ekstrakty połączono, zatężono i poddano chromatografii na żelu krzemionkowym, stosując gradient chloroformu i mieszaniny rozpuszczalników chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku 90:10:1. Otrzymano czysty AF162 (60 mg, wydajność 42%).

Ή-NMR (wolna zasada, CDC1₃) δ 1,2 (t, J=6 Hz, 6H), 1,65-1,7 (m, 2H), 1,96-2,15 (s, 3H), 2,5-2,6 (m, 4H), 3,3 (q, J = 6Hz, 2H) ppm.

Ή-NMR (sólHCl, D₂O) δ 1,15 (t, J = 6 Hz, 6H), 2,05-2,15 (m, 2H), 2,25-2,35 (m, 2H), 2,9 (s, 3H), 3,3 (q, J = 6Hz, 3H) ppm.

¹³ C-NMR (sól HC1, D,O) δ 14,0; 28,6; 35,0; 44,0; 52,7; 59,2; 157,0; 177,0 ppm.

MS m/e 239 (M⁺, 75%); 71 (100%).

Przykład 27: 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4^/-(2^/-metylo-tio-5'-metoksy-4^/H-imidazol) AF191

178 931 l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2', S^dimetylotio^U-imidazol) AF177 (0,700 g, 2,881 mola) i metanolan sodu (0,360 g, 6,667 mmola) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w metanolu (15 ml) przez 3,5 godziny. Zaobserwowano wydzielanie się gazu. Rozpuszczalnik usunięto z mieszaniny reakcyjnej, a pozostałość ekstrahowano dichlorometanem. Ekstrakt organiczny odparowano i uzyskano stałą pozostałość (0,613 g), którą ekstrahowano gorącym eterem naftowym. Rozpuszczalnik odparowano z ekstraktu i otrzymano pozostałość (0,263 g), z której po krystalizacji z eteru naftowego uzyskano czysty AF191, temp, topn, 84-85°C.

‘H-NMR(CDC1₃) 1.40 (m, 2H); 1.97 (m, 2H); 2.36 (s, CH₃N-); 2.52 (s, CH₃S-); 2.53 (m, 2H); 2.70-2.80 (m, 2H); 4.10 (s, CH₃O-) ppm.¹³C -NMR(CDCI₃) 13.6 (CH₃S-); 32.3 (C₃); 46.2 (CH₃N-);51.9 (C₂); 57.9 (CH₃O-); 74.2 (C₄); 171.6 (-N=C-SCH₃); 196.0 (-N=C-OCH₃) ppm.

MS m/e 228 (M⁺ + 1).

Przykład 28: l-metylopiperydyno-4-spiro-4'’-(2^,-metylotio-5'-amino-4Ή-imidazol) AF192

Roztwór związku AF 177 (0,411 g) w reagencie (15 ml) wytworzonym przez rozpuszczenie amoniaku w metanolu (15% wag./wag.) mieszano przez 3 dni w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną odparowano i do pozostałości dodano świeżą porcję 15 ml reagenta i reakcję powtórzono jeszcze 2 razy. W końcu, mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a stałą pozostałość przemyto acetonem, otrzymując AF192 w postaci białej substancji stałej (0,266 g), temp. topn.>240°C (rozkład) (z etanolu).

H-NMR (D₂O) 1,48 (m, 2H); 1,89 (m, 2H); 2,29 (s, CH₃N-); 2,46 (m, 2H); 2,48 (s, CH₃S-); 2,86 (m, 2H) ppm.

MS m/e (212 M⁺);142 (M⁺- 70); 70.

Przykład 29.1 -metylopiperydyno-4-spiro-4^,-(2^/-metylotio-5^,-aminometylo-4Ή-imidazol) AF193 i l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2', 5'-bis (aminometylo)-4'H-imidazol) AF194

Roztwór związku AF177 (0,338 g) w wodnym roztworze metyloaminy (5,0 ml, 35%) ogrzewano w 80°C przez 2 godziny. Wodę i nadmiar reagentu usunięto przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym (Merck 60, 0,040-0,06 mm). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku 80:20:1 otrzymano AF193 w postaci białej substancji stałej (0,061 g). Krystalizacja z acetonitrylu dała produkt o temp. topn. 193-194°C.

‘H-NMR(CDC1₃) 1.44(m, 2H); 1.85 (m, 2H); 2.38 (s, CH₃N-); 2.52 (s, CH₃S-); 2.66 (m, 2H); 2.81(m, 2H); 3.06 (s, CH₃NH-); 6.47(-NH-) ppm.

MS m/e 226 M⁺); 179 (M⁺ -CH3S); 170 (M⁺ -CH3NHCN); 169; 156(M⁺-70).

Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku 50:50:1 otrzymano AF194 w postaci białej substancji stałej (0,130 g). Krystalizacja z acetonitrylu dała produkt o temp. topn. 113-114°C.

Ή-NMR (CDC1₃ + CD₃OD) 1.44 (m, 2H); 1.81 (m, 2H); 2.37 (s, CH₃N-); 2.57 (m, 2H); 2.80 (m, 2H); 2.95 (s, CH₃NH-); 2.96 (m, CH₃NH-) ppm.

MS m/e 209 M⁺); 152; 139(M⁺-70).

Powtarzając powyższąreakcję, ale stosując dwa mole metyloaminy na każdy mol związku AF177 otrzymano AF193 jako produkt główny i jedynie śladowy AF194.

Przykład 30: l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2^/-metylo-2^,-oksazolina) AF150 (a) Chlorowodorek l-metylo-4-nitrometylopiperydyn-4-olu

Ten związek wyjściowy wytworzono nieznacznie modyfikując sposób A.D. Cale'a (patent USA 4,746,655,1988). Do dobrze mieszanego 20% roztworu etanolanu sodu (1,28 mola), w etanolu dodano mieszaninę N-metylopiperydynonu (142 g, 1,28 mola) i nitrometanu (78,1 g, 1,28 mola), utrzymując temperaturę wewnętrzną 5-8°C. Wytrąciła się biała substancja stała i mieszanie kontynuowano przez 20 minut i jeszcze przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Wytworzony roztwór zakwaszono 500 ml 7,2 N roztworu HC1 w alkoholu izopropylowym. Chlorowodorek i sole nieograniczne ekstrahowano CH₃OH (3 x 200 ml), a rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, uzyskując związek tytułowy, temp. topn. 180-182°C (niehigroskopijny).

178 931 m/z; 174 (M⁺ wolnej zasady, 100%), 157 (M-OH, 20%), 127 (M-H-NO₂, 25%), 113 (M-NO₂-CH₃, 40%).

(b) Chlorowodorek 4-aminometylo-l-metylopiperydyn-4-olu

Do roztworu 1 -metylo-4-nitrometylopiperydyn-4-olu (133,5 g) w metanolu (1500 ml) dodano w porcjach palladu na węglu drzewnym (10%, 4 g). Związek uwodorniano w kolbie Paara pod ciśnieniem 55 psi w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Roztwór ostrożnie przesączono, potraktowano aktywnym węglem drzewnym, rozpuszczalnik usunięto, a pozostałość roztarto z etanolem (200 ml). Otrzymano związek tytułowy, temp. topn. 177-179°C.

m/z: 174 (M⁺ wolnej zasady, 15%), 127 (M-OH, 25%), 114 (M-CH₂N₂, 100%).

(c) l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2'-metylo-2'-oksazolina) AF150

Do roztworu chlorowodorku 4-aminometylo-1 -metylopiperydyn-4-olu (3,61 g, 0,02 mola) w absolutnym metanolu (50 ml) dodano do roztworu KOH (1,43 g, 86%) w metanolu (50 ml). Po mieszaniu przez 10 minut, dodano roztworu chlorowodorku acetoimidanu etylu (2,7 g) w 20 ml absolutnego metanolu i mieszano dalej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik usunięto, a staląpozostałość rozpuszczono w roztworze 2,8 gNa₂CO₃ w 50 ml wody i zatężono do suchości pod próżnią Białą substancję stałą ekstrahowano 2 x 50 ml chloroformu, potraktowano aktywnym węglem drzewnym, wysuszono (Na₂SO₄) i usunięto rozpuszczalnik, otrzymując produkt tytułowy (62,5% wydajności), temp. topn. 45°C (sublimował w 40°C/0,05 mm Hg), który dał pojedynczą plamkę na krzemionce TLC eluowanej 2% NH₃ w CH₃OH, Rf= 0,4.

m/z: 168 (M⁺ wolnej zasady, 100% przy 7,5 ev).

^lH-NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 3,56 (2H, q, J = 1,5 Hz), 2,53 (4H, m), 2,34 (3H, s), 1,96 (3H, t, J = 1,5 Hz), 1,82 (4H, m).

Zastąpienie stosowanego w tym przykładzie KOH równoważną ilością NaOH lub Et₃N dało podobne rezultaty.

(d) AF150-dibenzoilo-D-winian

Do związku AF 150 (5,5 g, 32 mmole) rozpuszczonego w 200 ml suchego toluenu dodano podczas mieszania gorący roztwór kwasu dibenzoilo-D-winowego (5,4 g, 15 mmoli) w 500 ml toluenu. Wytrącił się osad i zdekantowano supematant. Resztkową substancję stałą przemyto 3 x 100 ml suchego toluenu i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 8,4 g (80% wydajności) białej mało higroskopijnej substancji stałej. TLC chloroform/tlenek glinu (Merck Art 5581) RF = 0,4.

m/z: 168 (M⁺) ‘H-NMR (300MHz, D₂O zawierający 1,5 mgNa₂CO₃/0,5 mlD₂O): δ 1,95 (s, 6H, CH₃-C), 2,35 (s, 6H, CH₃-N), 3,5 (s, 4H, CH₂), 5,7 (s, 2H), 7,5-8,2 (m, 10H, aromatyczne wodory).

Przykład 31: 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2'-etylo-2'-oksazolina) (2'-etylowy analog związku AF150)

Związek ten wytworzono podobnie do związku z przykładu 31, stosując równoważną ilość chlorowodorku propionoimidanu etylu zamiast chlorowodorku acetoimidanu etylu. Produkt otrzymano w postaci cieczy, temp, wrzenia 53°C/0,03 mm Hg, wydajność 60,5%.

‘H-NMR (300 MHz, CDC1₃); δ 3,52 (2H, t, J = 1,5 Hz), 2,47 (4H, m), 2,30 (3H, s), 2,26 [2H, kwarter (J = 7 Hz), triplety (J = 1,5 Hz)], 1,86 (2H, m), 1,72 (2H, m), 1,18 (3H, t).

Przykład 32: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-2'-oksazolina) AF151 (a) 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-hydantoina

Mieszaninę roztworów l-metylopiperydyn-4-onu (36,44 g, 0,322 mola) w etanolu (150 ml), węglanu amonu (93,0 g, 0,968 mola) w wodzie (400 ml) i cyjanku potasu (25,8 g, 0,396 mola) w wodzie (82 ml) ogrzewano w 60°C przez 2,5 godziny, a następnie pozostawiono w temperaturze pokojowej przez noc, po czym oddzieliła się l-metylo-4-spiro-5'-hydantoina. Odsączono ją i przemyto niewielką ilością zimnej wody, etanolu i eteru i otrzymano krystaliczny proszek (27,0 g). Po zatężeniu przesączu i przemywek uzyskano drugi rzut (20,0 g). Produkt krystalizowano z metanolu, temp. topn. 265-267°C (rozkład).

IR (KBr) 3170 (NH); 1700 (C=O) cm'¹ m/z 183 (M⁺, 38%); 71 (100%)

178 931

Ή-NMR (300 MHz, D₂O): δ 1,8 (2Η), 2,06 (sekstet, 2Η), 2,49 (S, CH₃), 2,58 (t, 2H), 3,14 (t, 1H), 3,20 (t, 1H).

(b) Kwas 4-amino-l-metylopiperydyno-4-karboksylowy l-metylo-4-spiro-5'-hydantoinę (9,75 g, 0,0533 mola) i oktahydrat wodorotlenku baru (28,8 g, 0,00913 mola) w wodzie (150 ml) ogrzewano w autoklawie w temperaturze 160°C przez 3 godziny. Zawartość czterech takich szarż połączono, a wytrącony węglan baru odsączono. Przesącz zobojętniono stałym ditlenkiem węgla, a osad usunięto przez odsączenie. Przesącz zatężono do małej objętości i uzyskano kwas 4-amino-l-metylopiperydyno-4-karboksylowy (32,0 g, 95% wydajności), temp. topn. 275-280°C (rozkład).

IR (KBr) 3300, 1655, 1580 cm·' m/z 158 (Μζ 90%); 141 (98%, M-OH); 113 (12%, M-CO₂H); 96 (100%); 71 (52%)

Ή-NMR (300 MHz, C₅D₅N + D₂O): δ 1.2 (m, 2H), 1.48 (s, CH₃N-), 1.7 (m, 2H), 1.9 (m, 2H), 2.0 (m, 2H).

(c) 4-amino-4-hydroksymetylo-1 -metylopiperydyna

Sproszkowany wodorek litowo-glinowy (15,62 g, 0,412 mola) w suchym tetrahydrofurame (THF) (600 ml) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 15 minut, po czym w porcjach, dokładnie mieszając, pod azotem, dodano kwasu 4-amino-l-metylopiperydyno-4-karboksylowego (31,0 g, 0,196 mola) w postaci suchego proszku. Po zakończeniu dodawania, mieszaninę reakcyjną ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez cztery godziny, oziębiono do 0°C pod azotem, dokładnie mieszając, po czym ostrożnie i powoli dodano wody (20 ml), 15% wodnego roztworuNaOH (20 ml) i znowu wody (10 ml). Mieszaninę reakcyjną przesączono i osad ekstrahowano wrzącym THF (3 x 150 ml). Połączono przesącz w THF i ekstrakty, a rozpuszczalnik usunięto przy 25 mm, uzyskując żółty lepki olej (28,0 g, 98,9% wydajności).

IR (nierozcieńczony), 3320 (NH) (br. OH), 1587 (NH₂), 1468, 1448 cm'¹ m/z 144 (M⁺, 15%); 127 (M-OH); 113 (M-CO₂H); 96 (100%); 70 (41%).

Ή-NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 1.41 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 2.24 (s, CH₃-N), 2.29 (m, 2H), 2.48 (m, 2H), 2.50 (br., -NH₂), 3.29 (s, - CH₂OH).

(d) l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-2'-oksazolina) AF151

Mieszaninę 4-amino-4-hydroksymetylo-l-metylopiperydyny (1,80 g) z kwasem octowym (20 ml) i ksylenem (20 ml) przez 28 godzin poddawano azeotropowej destylacji. Pozostający kwas octowy i ksylen usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem (25 mm Hg), uzyskując resztkowy lepki olej, który zalkalizowano wodnym roztworem K₂CO₃ do wartości pH 11. Po ekstrahowaniu chloroformem i odparowaniu ekstraktu otrzymano małą ilość resztkowego brązowego oleju (0,27 g). Wodny roztwór pozostający po ekstrakcji chloroformem odparowano, aby usunąć wodę, aresztkową substancję stałą ekstrahowano chloroformem i ekstrakt wysuszono (Ńa₂SO₄) i odparowano. Uzyskano, jako pozostałość, wysoce higroskopijną substancję stałą (3,0 g). TLC wykazała, że ta druga substancja stała daje głównie jednąplamkę, która była bardziej polarna niż wyjściowy aminoalkohoL Porcja higroskopijnej substancji stałej, o temp. topn. 150-160°C, ogrzewana pod próżnią prawie natychmiast zaczęła destylować w postaci bezbarwnego oleju w 45°C/0,15 mm Hg. Olej ten, po przetrzymywaniu w chłodziarce, wytworzył krystaliczne igiełki topiące się w temperaturze pokojowej. Destylat stanowiła sól kwasu octowego tytułowego związku.

IR (nierozcieńczony) 1664 (-C=N); 1565 & 1398 (-CO₂- - ); 1256 (C-O) cm’¹ m/z 168 (M⁺ wolnej zasady); 109; 70.

Ή-NMR (300 MHz, CDC1₃); δ 1.77 (m, 2H), 1.96 (m, 2H), 1.98 (s, CH₃-), 2.0 (s, CH₃-), 2.49 (s, CH₃-N-), 2.91 (m, 4H), 3.95 (s, - CH₂O-), 9.30 (br. s, -CO₂H).

¹³C-NMR (300 MHz, CDC13): δ 14.0 (CH3CO2-), 22.9 (CH3C=N-), 35.6 (C3 i C5), 44.4 (CH3N⁺), 51.1 (C2i C₆), 67,0 (C₄), 77.4 (C_y), 164.3 (C-=N), 176.7 (-CO₂-).

Ή NMR wolnej zasady (300 MHz, CDC1₃): δ 1.64 (m, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.98 (s, CH₃-), 2.26 (m, 2H), 2,30 (s, CH₃-), 2.69 (m, 2H), 3.94 (s, -CH₂-).

Przykład 33: l -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-etylo-2'-oksazolina) (analog 2' - etylowy związku AF 151)

178 931

Mieszaninę 4-amino-4-hydroksymetylo-l-metylopiperydyny (3,0 g) z kwasem propionowym (50 ml) i ksylenem (90 ml) poddawano destylacji azeotropowej przez 5 godzin. Pozostałość (7 ml) zalkalizowano do pH 11-12 wodnym roztworem K₂CO₃. Po ekstrakcji chloroformem i odparowaniu ekstraktu otrzymano mieszaninę niepolamych związków (0,80 g). Pozostały po ekstrahowaniu chloroformem wodny roztwór odparowano, aby usunąć wodę, a resztkową substancję stałą ekstrahowano chloroformem. Ekstrakt wysuszono (Na₂SO₄) i odparowano, otrzymując jako pozostałość higroskopijnąsubstancję stałą (3,6 g). TLC wykazała, że substancja ta daje głównie jedną plamkę, która jest bardziej polarna niż wyjściowy aminoalkohol (żel krzemionkowy, mieszanina rozpuszczalników metanol-chloroform-wodny roztwór amoniaku, 40:58:2). Porcję higroskopijnej substancji stałej (1,5 g) ogrzewano pod próżniąi prawie natychmiast wydestylowała ona w postaci lepkiego bezbarwnego oleju w 50°C/0,l mm Hg. Destylat stanowiła sól kwasu propionowego tytułowego związku.

m/z 182 (M⁺ wolnej zasady, 14%): 167 (5%), 154 (71%), 125 (9%), 109 (100%), 96 (45%), 81 (30%), 74 (89%), 57 (64%).

'H-NMR (300 MHz, CDC1₃); δ 1.12 (t, >7.5 Hz. CHCH₂-), 1.17 (t, >7.6 Hz, CH₃CH₂-), 1.75 (m, 2H), 2.00 (m, 2H), 2.29 (q, >7.5, CH₃CH₂-), 2.30 (q. >7.6, CH₃CH₂-), 2.56 (s, CH₃N-), 3.02 (m, 2' -CH₂-), 3.95 (s, -CH₂O-), 7.52 (br. -CO₂H).

Do roztworu powyższej soli kwasu propionowego (700 mg) w CHC1₃ podczas mieszania dodawano nasyconego wodnego roztworu K₂CO₃, aż przestał wydzielać się CO₂. Mieszaninę mieszano przez 0,5 godziny i oddzielono fazy. Fazę wodną ekstrahowano CHC1₃, oddzieloną fazę CHC1₃ połączono z ekstraktami i wysuszono (Na₂SO₄), a rozpuszczalnik odparowano, otrzymując tytułowy związek (wolną zasadę) w postaci resztkowego bezbarwnego oleju (550 mg), który wykazał pojedyńcząplamkę na TLC.

'H-NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 1.17 (t, >7.6 Hz, CH₃CH_r), 1.61 (m, -CH₂-), 1.86 (m, -CH₂-), 2.18 (m, -CH₂-), 2.29 (q, >7.6, CH₃CH₇-), 2.30 (s, CH₃N-), 2.71 (m, -CH₂-), 3.94 (s, -CH,O-).

m/z 182 (M⁺25%), 167 (9%), 154 (78%), 125 (17%), 109 (100%), 96 (65%), 81 (54%), 70 (96%), 57 (77%).

Alternatywny sposób wytwarzania związków takich jak AF 150 i AF 151 polega na odwodnieniu z cyklizacją odpowiednich amidów. W powyższych reakcjach można stosować środki odwadniające, takie jak P₂O₅, kwas siarkowy, eterat-BF₃, CaCl₂ i sita molekularne. W analogicznych reakcjach, stosując P₂S₅, można otrzymać odpowiednie tiazoliny zamiast oksazolin.

Przykład 34: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-2'-tiazolina) AF150 (S) (a) 4-acetamidometylo-4-hydroksy-1 -metylopiperydyna 4-amino-4-hydroksy-l-metylopiperydynę (0,83 g, 5,7 mmola) rozpuszczono w 10 ml CHC1₃ i dodano bezwodnika octowego (0,58 g, 5,7 mola). Mieszanina reakcyjna samoistnie ogrzała się do 40-50°C. Po 30 minutach rozpuszczalnik odparowano, a surową pozostałość poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym (Merck 7734), stosując jako eluent mieszaninę 2% wodny roztwór amoniaku-metanol, 33:67.

m/z 186 (M⁺) 'H-NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 1.60 (multiplet, 4H, H3 i H4), 2.01 (singlet, 3H, CH₃-C), 2.29 (singlet, 3H, CH₃-N), 2.38 (multiplet, 2H, HI), 2.55 (multiplet, 2H, H2), 2.98 (multiplet, 1H, NH), 3.26 (dublet, 2H, H5) ppm.

'H-NMR (300 MHz, D₂O): δ 1.42 (multiplet, 4H, H3 i H4), 1.81 (singlet, 3H, CH₃-C), 2,08 (singlet, 3H, CH₃-N), 2.27 (multiplet, 2H, HI), 2.46 (multiplet, 2H, H2), 3.03 (singlet, 2H. H) ppm.

Zanieczyszczenia dają pik przy 3,44 ppm.

(b) l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-2'- tiazolina) AF150 (S)

Mieszaninę 4-acetamidometylo-4-hydroksy-l-metylopiperydyny (6,5 g, 35 mmoli) z pięciosiarczkiem fosforu (10 g, 22 mole) ogrzewano w temperaturze 220°C przez 30 minut, oziębiono i rozpuszczono w 30 ml stężonego wodnego HCL Roztwór mieszano ze 100 ml zimnego stężonego wodnego roztworu NaOH, ekstrahowano 2 x 100 ml CHC1₃, a połączone ekstrakty wy

178 931 suszono i odparowano, otrzymując 5 g zabarwionej na czarno olejowej pozostałości, którą oczyszczono przez destylację przy 75°C/1 mm Hg i otrzymano 1,8 g klarownej cieczy.

m/z: 184 (M⁺)

Ή-NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 1,8-2,0 (m, 4H), 2,17 (t, 3H, CH₃-C), 2,2 (s, 3H, CH₃-N), 3,9 (q, 2H, CH₂-pierścień tiazolinowy).

Przykład 35: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiono-3'-etylohydantoina) AF181

Do roztworu kwasu 4-amino-l-metylopiperydyno-4-karboksylowego (1,78 g, 0,0113 mola) i wodorotlenku sodu (0,47 g, 0,0118 mola) w wodzie (3,0 ml) dodano izotiocyjanianu etylu (1,00 g, 0,0111 mola) i mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotnąprzez 6,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono do wartości pH 1 za pomocą stężonego kwasu solnego i dalej ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 1,5 godziny. Po odstaniu w temperaturze pokojowej z mieszaniny reakcyjnej wytrąciła się stała substancja (0,61 g), którą krystalizowano z metanolu i otrzymano kryształy (83 mg), temp. topn.>260°C (rozkład). Widmo Ή-NMR tej stałej substancji wykazało, że jest to chlorowodorek związku AF181.

Ή-NMR(D₂O)δ 1,16 (t, >7,2 Hz, CH₃CH₂-); 2,0-2,4 (m, 4H); 2,94 (s, CH₃N-); 3,20 (m, 1H); 3,4-3,74 (m, 3H); 3,80 (q, >7,2 Hz, CH₃CH₂-) ppm.

Roztwory macierzyste uzyskane po oddzieleniu i krystalizacji powyższej soli połączono, zalkalizowano do wartości pH = 13 za pomocąstężonego wodnego roztworu wodorotlenku sodu, po czym ekstrahowano dichlorometanem. Ekstrakt wysuszono (Na₂CO₃) i odparowano, otrzymując żółtawą substancję stałą którąpoddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (Merck 60,0,04-0,06 mm). Po eluowaniu mieszaninąchloroform/metanol/wodny roztwór wodorotlenku amonu 96:3:1 otrzymano najpierw l,3-dietylo-2-tiomocznik (0,287 g), temp, topn, 76-78°C (kryształy z eteru), a następnie 8-metylo-3-etylo-l,3,8-triazaspiro[4.5]dekan-4-ono-2-tion (AF 181)(135 mg) w postaci wolnej zasady, którą krystalizowano z mieszaniny eter-dichlorometan i otrzymano igiełki, temp. topn. 180°C.

Ή-NMR (CDCl₃) δ 1,24 (t, >7,2 Hz, CH₃CH₂-); 1,69 (m, 2H); 2,05-2,30 (m, 4H); 2,35 (s, CH₃N-); 2,90 (m, 2H); 3,87 (q, >7,2 Hz, CH₃CH₂-) ppm.

MS m/e 227 (M·); 71; 70.

Przykład36: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiono-3'-t-butylohydantoina)AF184

Mieszaninę kwasu 4-amino-1 -metylopiperydyno-4-karboksylowego (1,80 g, 0,0114 mola) i izotiocyjanianu t-butylu (1,00 g, 0,0087 mola) w wodzie (3,0 ml) ogrzewano w 80°C przez 5 godzin. Ponieważ TLC wykazała, że reakcja nie zakończyła się, dodano etanolu (4,0 ml) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną jeszcze przez 1 godzinę. Mieszaninę zakwaszono do pH 1 stężonym kwasem solnym i dalej ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotnąprzez 1 godzinę. Po odstaniu przez noc w temperaturze pokojowej wydzielił się osad, który przesączono, otrzymując wyjściowy aminokwas (0,60 g). Roztwór macierzysty odparowano, a pozostałość zalkalizowano stężonym wodnym roztworem wodorotlenku sodu, po czym ekstrahowano dichlorometanem. Ekstrakt organiczny wysuszono (Na₂SO₄), a rozpuszczalnik usunięto, otrzymując krystaliczną stałą substancję (0,101 g), a po krystalizowaniu z mieszaniny eter-dichlorometan igiełki, temp. topn. 200-201°Ć.

Ή-NMR (CDC1₃) δ 1.63 (m, 2H); 1.81 [s, (CH₃)₃C-]; 2.00-2,21 (m, 4H); 2.33 (s, CH₃N-); 2.87 (m, 2H); 7.82 (bs, -NH-) ppm.

MS m/e 255(M⁺); 199(M⁺-C₄H₈); 96; 71; 70; 57.

Przykład 37: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-t-butylohydantoina) AF213

Związek tytułowy syntetyzowano podobnie jak AF181. Produkt otrzymano w postaci chlorowodorku l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-t-butylohydantoiny) AF213 i krystalizowano z metanolu, temp. topn. 300-303°C (rozkład).

Ή-NMR (D₂O) δ 1,55 [s, (CH₃)₃ C-]; 2,01 (m, 2H); 2,22 (m, 2H); 2,92 (s, CH₃N-);2,97 3,5 (m, 2H); 3,62 (m, 2H) ppm.

Otrzymaną wolną zasadę krystalizowano z mieszaniny eter-dichlorometan i miała ona temp. topn. 221 - 223°C.

178 931 ‘H-NMR (CDC1₃) δ 1.57 (m, 2H); 1.60 [s, (CH₃)₃C-]; 2.01-2.18 (m, 4H); 2.31 (s, CH₃N-); 2.88 (m, 2H); 4.77 (bs, -NH-) ppm.

¹³C-NMR(CDC1₃)Ó28.6 [(CH₃)₃C-]; 33.5 (C6&C10); 46.2 (CH₃N-); 51.0 (C7&C9); 57.5 i 58.1 [C5 & (CH₃)₃C-]; 158.4 (C2); 177.4 (C4) ppm.

MS m/e 239(M⁺); 237; 224 (M⁺-CH₃); 194; 181; 155; 110; 104; 71; 56; 43.

Przykład 38: l-propargilopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoina) AF196

Mieszaninę piperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoiny) (AF160)DES (40,9 mg, 0,21 mola) i bromku propargilu (24,7 mg, 0,21 mola, 80% wag./wag. w toluenie) w metanolu (1,0 ml) mieszano w 25°C przez 24 godziny. Metanol usunięto za pomocą strumienia azotu, a wytworzoną substancję zalkalizowano wodnym roztworem węglanu sodu i ekstrahowano chloroformem. Ekstrakty w chloroformie odparowano, a pozostałość oczyszczono na płytce preparatywnej z żelem krzemionkowym (mieszanina chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku 90/10/1) i wytrącono za pomocą nadmiaru kwasu szczawiowego, uzyskując krystaliczną substancję stałą (29 mg).

‘H-NMR (D₂O, sól kwasu szczawiowego) δ 1,12 (t, 3H, J = 6 Hz, CH₃CH₂-); 2,1-2,35 (m, 6H); 3,12 (t, 1H, J=3,5 Hz), 3,5 (q, J=6 Hz, CH₃CH₂-); 3,7-3,85 (m, 2H); 4,12 (d, J = 3,5 Hz) ppm.

MS m/e 235 (M⁺); 196 (M⁺-C₃H₃); 95; 80; 67; 56.

Przykład39:l -metylopiperydyno-4-spiro-5'-[3'-(4-pirolidyno-2-butyny lo)hydantoina] AF197.

Mieszaninę l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-propargilohydantoiny) (AF185) (204 mg, 0,92 mmola), pirolidyny (88 mg, 1,23 mmola), paraformaldehydu (52 mg, 1,7 mmola) i chlorku miedziawego (4,2 mg) mieszano w dioksanie (10 ml) przez 70 godzin w temperaturze pokojowej. Dioksan usunięto za pomocą strumienia azotu, a wytworzoną substancję zalkalizowano wodnym roztworem węglanu potasu i ekstrahowano chloroformem. Ekstrakty w chloroformie odparowano, a 50% wag. pozostałości oczyszczono na preparatywnej płytce z żelem krzemionkowym (mieszanina chloroform/metanol/eter/wodny roztwór amoniaku 150/20/100/6) i krystalizowano dwukrotnie z eteru, uzyskując krystaliczną substancję stałą (25 mg).

Ή-NMR (CDC1₃, wolna zasada)Ó 1,12 (m); 2,1-2,2 (m); 2,35 (s, 3h); 2,6 (m): 2,9-2,95 (m); 3,4 (t, 2H, J = 3,5 Hz); 4,15 (t, 2H, J = 3,5 Hz); 5,9 (bs, 1H) ppm.

MS m/e 304 (M⁺); 234 (M⁺-C₄H₈N): 71 (C₄H₉N⁺). .

Przykład 40: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-l', 4'-oksazolidyn-3'-on) AF260.

Mieszaninę 1-metylo-4-piperydonu (5,0 g, 44,2 mmola), (s)-mleczanu etylu (5,75 g, 48,8 mmola), węglanu amonu (6,38 g) i kwasu p-toluenosulfonowego (2,1 g) w toluenie (100 ml) umieszczono w zamkniętym zbiorniku ciśnieniowym ze stali nierdzewnej i ogrzewano w 107°C mieszając przez 24 godziny. Toluen usunięto z mieszaniny reakcyjnej przez destylację, a pozostałość poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym (Merck 60). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform/metanol/amoniak 92:7:1 otrzymano frakcję (1,01 g), którą następnie oddzielono metodą chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Po elucji mieszaniną rozpuszczalników chloroform/eter/metanol/wodorotlenek amonu 54:37:7:2 otrzymano surowy produkt (0,441 g), który krystalizowano z mieszaniny eter naftowy-eter, a następnie z toluenu i otrzymano l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-l', 4'-oksazolidyn-3'-on) AF260 w postaci igiełek (85 mg), temp. topn. 148-150°C.

‘H-NMR (CDC1₃) δ 1,42 (d, J = 6,6 Hz, CH₃CH-); 1,85 (m, 4H); 2,31 (s, CH₃N-); 2,52 (m, 4H); 4,40 (q, J = 6,6 Hz, CH₃CH-); 7,64 (bs, -NH-) ppm.

MS m/e 184 (M⁺); 156; 126; 114; 84; 71; 70; 43 (100%).

Przykład41:l -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo- Γ, 4'-tiazolidyn-3'-on) AF261; i

Przykład 42: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-dimetylo-l', 4'-tiazolidyn-3'-on) AF266.

a) Mieszaninę 1-metylo-piperydonu (5,65 g, 0,050 mola), kwasu tiomlekowego (6,37 g, 0,060 mola) i węglanu amonu (7,20 g), w benzenie (150 ml) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotnąprzez 16 godzin, po czym wysublimowaną stałą substancję (węglan amonu) skroplono na zewnątrz kolby reakcyjnej. Od czasu do czasu substancj ę te dodawano ponownie do kolby rea

178 931 kcyjnej z dodatkową porcją węglanu amonu (całość 6,2 g). Na koniec usunięto benzen przez destylację, a pozostałość przemyto eterem i otrzymano substancję rozpuszczalną w eterze (0,76 g) i substancję nierozpuszczalną w eterze (12,9 g), którą rozpuszczono w małej ilości metanolu i zaIkalizowano roztworem amoniaku w metanolu, a następnie odparowano i poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym (Merck 60). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform/metanol/amoniak 98:10:1 otrzymano frakcję (0,61 g), którą zidentyfikowano jako l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-dimetylo-T, 4'-tiazolidyn-3'-on) AF266. Jest to higroskopijna substancja stała o niskiej temperaturze topnienia.

Ή-NMR (CDC1₃)Ó 1.53 (d, J = 7Hz, CH₃CH-); 1.69 (m, 2H); 2.16-2.44 (m, 4H); 2.32 (s, CH₃N-); 2.87 (m, 2H); 2.90 (s, CH₃NCO-); 3.79 (q, J = 7Hz, CH₃CH-) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃)δ 19.7 (CH₃CH-); 27.2 (CH₃NCO-); 36.0 i 37.3 (C6&C10); 39.7 (C2); 45.3 (CH₃N-); 51.8 i 52.2 (C7&C9); 68.5 (C5); 172.8 (C3) ppm.

Chlorowodorek związku AF266 wytworzono traktując roztwór wolnej zasady w eterze roztworem kwasu solnego w alkoholu izopropylowym. Uzyskano higroskopijną substancję stałą, którą krystalizowano z alkoholu izopropylowego, temp. topn. 238-240°C (rozkład).

Ή-NMR (D₂O, chlorowodorek) δ 1,48 (d, J = 7.2 Hz, CH₃CH-); 2.05 (m, 2H); 2.57 (m, 2H); 2.89 i 2.91 (2s, CH₃N⁺- i CH₃NCO-); 3.31 (m, 2H); 3.61 (m, 2H); 4.04 (q, J = 7.2 Hz, CH₃CH-) ppm.

MS m/e 214 (M⁺); 181; 156; 125; 124; 96; 71; 70; 57 (100%); 43.

Prowadząc dalej elucję kolumny mieszaniną rozpuszczalników chloroform/metanol/amoniak 85:14:1, otrzymano frakcję (3,50 g), którą krystalizowano z mieszaniny eter-dichlorometan, uzyskując l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-l', 4'-tiazolidyn-3'-on) AF261 w postaci igiełek (1,83 g), temp. topn. 133-134°C.

Ή-NMR (CDC1₃) δ 1.53 (d, J = 7 Hz, CH₃CH-); 1.9-2.20 (m, 4H); 2.20-2.42 (m, 2H); 2,30 (s, CH₃N-); 2.68 (m, 2H); 3.85 (q, J=7Hz, CH₃CH-); 6.90 (bs, -NH-) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃) δ 19.9 (CH₃CH-); 41.0 i 41.3 (C6&C10); 41.3 (C2); 45.7 (CH₃N-); 52.5 i 52.8 (C7&C9); 63.6 (C5); 176.3 (C3) ppm.

MS m/e 200 (M⁺); 167, 140 (M⁺-CH₃CHS-); 91:71: 70: 69: 57.

Chlorowodorek związku AF261 otrzymano traktując roztwór wolnej zasady w eterze roztworem kwasu solnego w alkoholu izopropylowym, temp. topn. 285-287°C.

Ή-NMR (chlorowodorek w D₂O) δ 1.50 (d, J = 7.1 Hz, CH₃CH-); 2.17-2.44 (m, 4H); 2,89 (s, CH₃N-); 3.24 (m, 2H); 3.59 (m, 2H); 4.10 (q, J = 7.1 Hz, CH₃CH-) ppm.

b) Mieszaninę l-metylo-4-piperydonu (5,65 g, 0,050 mola), kwasu tiomlekowego (6,37 g, 0,060 mola) i węglanu amonu (7,20 g) w benzenie (100 ml) umieszczono w zamkniętym zbiorniku ciśnieniowym ze stali nierdzewnej i ogrzewano przez noc w 95°C, mieszając magnetycznie. Z mieszaniny reakcyjnej usunięto rozpuszczalnik, a pozostałość rozpuszczono w małej ilości metanolu i załadowano na suchą kolumnę z żelem krzemionkowym (Merck 60, 200 g). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku 94:5:1 uzyskano najpierw AF266 (0,71 g), a następnie AF261 (3,02 g).

c) Mieszaninę l-metylo-4-piperydonu (2,50 g, 22,1 mola), kwasu tiomlekowego (2,81 g, 26,5 mmola) i metyloaminy (0,90 g, 29,0 mmola) w toluenie (60 ml) umieszczono w zamkniętym zbiorniku ciśnieniowym z nierdzewnej stali i ogrzewano, mieszając w temperaturze 96°C przez 24 godziny. Z mieszaniny reakcyjnej, którą stanowił lepki olej, rozdzielono osad i roztwór toluenowy. Roztwór oddzielono i rozpuszczalnik usunięto przez destylację. Pozostałość (1,68 g) destylowano pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano czysty 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-dimetylo-l', 4'-tiazolidyn-3'-on) AF266, o temp, wrzenia 100°C (0,35 mm Hg) w postaci substancji stałej (1,02 g), temp. topn. 43-45°C.

Przykład 43:1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-etylo-l',4'-tiazolidyn-3'-on) AF267;i

Przykład 44: 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-etylo-4-metylo-1',4'-tiazolidyn-3'-on) AF272.

Tytułowy związek AF267 otrzymano jak opisano odnośnie wytwarzania związku AF261, stosując kwas 2-merkaptomasłowy zamiast kwasu 2-merkaptopropionowego (kwasu tiomlekowego).

178 931

Związek krystalizowano z acetonu, temp. topn. 140-141°C.

^lH-NMR(CDCl₃)Ó1.02(t,J = 7.2Hz,CH₃CH₂-); 1.75 i 2.06 (m, CH₃CH₂-); 1.98 (m,4H); 2.30 (s, CH₃N-); 2.32 (m, 2H); 2.67 (m, 2H); 3.81 (dd, -CHS-); 6.35 (bs, -NH-) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃) δ 11.4 (CH₃CH₂-); 27.1 (CH₃CH₂-); 41.5 (C6&C10); 45.8 (CH₃N-); 49.0 (C2); 52.7 i 52.9 (C7&C9); 63.7 (C5); 175.5 (C3) ppm.

MS m/e 214 (M⁴); 181; 140; 71; 57.

Chlorowodorek związku AF267 miał temp, topnienia 267-269°C (rozkład).

Jako produkt uboczny otrzymano l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-etylo-4-metylo-l', 4'-tiazolidyn-3'-on) AF272 w postaci lepkiego oleju.

Ή-NMR (CDC1₃) δ 1.00 (t, J = 7.4 Hz, CH₃CH-); 1.67 (m, 2H); 1.58-1.78 (m) and 2.13 (m) (CH₃CH₂-); 2.20-2.42 (m, 4H); 2,32 (s, CH₃N); 2.89 (s, CH₃NCO-); 2.90 (m, 2H); 3.76 (dd, J1 = 3.6 Hz, J2 = 9.0 Hz, CH₃CH₂CH-) ppm.

MS m/e 228 (M⁺); 195; 170; 138; 125; 96; 71; 70; 57.

Przykład 45:1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(r-sulfbksy-4'-aza-2'-metyl-3'-on) AF262

Mieszaninę l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-r, 4'-tiazolidyn-3'-onu) (AF261) (48,4 mg, 0,24 mmola) w 2,0 ml kwasu octowego i 0,5 ml wodnego roztworu nadtlenku wodoru (32%) mieszano w temperaturze 25°C przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną zakwaszono nadmiarem kwasu solnego i rozcieńczono 20 ml mieszaniny eter naftowy/eter 4/1. Osad rozpuszczono w wodnym roztworze węglanu sodu i roztwór ekstrahowano chloroformem. Ekstrakty w chloroformie wysuszono, odparowano i wytworzoną substancję poddano chromatografii na płytce preparaty wnej z żelem krzemionkowym (mieszanina chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku 80/20/1) i otrzymano 3,3 mg oleju, który wytrącono z eteru za pomocą kwasu szczawiowego, uzyskując izomer (>90% czystość) stałej substancji krystalicznej.

Ή-NMR (CDC1₃, wolna zasada) δ 1.52 (d, 3H, J = 6 Hz)) CH₃CH-; 1,85-2.7[m, 8H]; 2.36 (s, 3H) CH₃-N; 3.55 (q, J = 6 Hz) CH₃CH-); 7.0 (bs, 1H) ppm.

MS m/e 216 (M⁺); 199; 167; 149; 125; 111.

Przykład 46: Piperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-l', 4'-tiazolidyn-3'-on) AF263

Mieszaninę l-metylopiperydyno-4-spiro-5-(2'-metylo-l', 4'-tiazolidyn-3'-onu) (AF261) (250 mg, 1,25 mmola) i chloromrówczanua-chloroetylu (0,15 ml, 1,4 mmola) ogrzewano w 5 ml dichloroetanu w 60°C przez 90 minut. Dichlorometan usunięto pod strumieniem azotu, a olejową pozostałość rozpuszczono w metanolu i ogrzewano w 60°C przez 1 godzinę. Metanol odparowano, pozostałość rozpuszczono w wodnym roztworze węglanu sodu, ekstrahowano chloroformem i oddzielono na preparatywnej płytce z żelem krzemionkowym (mieszanina chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku 80/20/1) i otrzymano 20 mg wolnej zasady, która wytrąciła się w postaci krystalicznej soli kwasu szczawiowego.

Ή NMR (D₂O, szczawian)δ 1.51 (d, 3H, J=6 Hz, CH₃CH-); 2.2-2.35 (m, 4H); 3.1 -3.6 (m, 4H); 4.1 (q, J = 6 Hz, CH₃CH-) ppm.

MS m/e 186 (M⁺); 153; 126; 57.

Przykład 47:1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylo-l',4'-oksatiolan-2'-on) AF265

Roztwór 1-metylopiperydonu (11,3 g, 0,1 mola), kwasu tiomlekowego (15 ml) i kwasu p-toluenosulfonowego w acetonitrylu ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 24 godziny i śledzono metodą TLC (Krzemionka-20% metanol w chloroformie). Następnie roztwór odparowano, rozpuszczono w chloroformie i przemyto roztworem wodorowęglanu sodu, a potem wodą. Fazę organiczną wy suszono nad siarczanem sodu i odparowano. Produkt oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (Merck 60). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform/metanol/amoniak uzyskano 10,27 g oleju, który wykrystalizował po odstaniu w temperaturze pokojowej. Zidentyfikowano go jako l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylo-r, 4'-oksatiolan-2'-on) (AF265), temp. topn. 92°C.

Ή-NMR (CDC1₃) δ 11.6 (d, 3H)), 1.98-2.12 (m, 2H), 2.13-2.3 (m, 2H), 2.34-2.55 (m, 2H), 2.55-2.72 (m, 2H), 2.30 (s, 2H), 4.06 (2q, 1H) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃)δ 18 (CH₃CH, quartet), 39 (C6 and CIO, jeden triplet), 40 (CH₃CH, doublet), 45.5 (CH₃-N, ąuartet), 51.8 i 52 (C7 i C9 dwa różne triplety), 87 (C5, singlet), 175 (C = 0) ppm.

178 931

MS m/e 201 (M⁺). .

Związek AF265 (wolną zasadę) rozpuszczono w acetonie i dodano kwasu szczawiowego (jeden mol na dwa mole wolnej zasady). Po kilku sekundach wytrąciła się biała substancja stała. Przesączono ją, przemyto acetonem, chloroformem i eterem i wysuszono w eksykatorze. Zidentyfikowano ją jako sól kwasu szczawiowego związku AF265. Trwałość tej soli jest ciągle przedmiotem badań. Część tej soli rozkłada się w wodzie, prawdopodobnie przez hydrolizę laktonu i sygnały, uzyskane dzięki produktowi otrzymanemu przez otwarcie pierścienia mogą być widoczne w widmie ¹³C-NMR, które zapisano w D₂O przez co najmniej 3 godziny akumulacji skaningowej. W widmie Ή-NMR mierzonym natychmiast po rozpuszczeniu widoczny jest jedynie związek spiranowy. Stwierdzono, że roztwór związku AF265 w wodzie po upływie jednego tygodnia wykazuje około jednej trzeciej otwarcia pierścienia. Temp. topn. 120°C.

1H-NMR (D₂O)Ó 1.55 (d, 3H), 2.3-2.6 (m, 4H), 2.9 (s, 3H), 3.2-3.4 (m, 2H), 3,4-3.7 (m, 2H), 4.4 (q, 1H) ppm.

¹³C-NMR(D₂O)Ó 17.5 (CH₃CH), 36 i 36.5 (C6 i CIO), 41.5 (CH₃CH), 43 (CH₃-N), 51 (C7 i C9), 84 (C5), 167 (CO kwasu szczawiowego), 177 (C=O) ppm.

Przykład 48: Piperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylo-l', 4'-oksatilan-2'-on) AF269.

Związek wyjściowy, l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3^/-metylo-l', 4'-oksatiolan-2'-on) (AF265) (80 mg) rozpuszczono w benzenie i roztwór odparowano do suchości, aby wyeliminować obecność wilgoci. W atmosferze azotu dodano dichlorometanu wysuszonego na sitach molekularnych (około 4 ml), a następnie chloromrówczanu 1-chloroetylu (56 mg). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do 100°C przez około 1 godzinę, po czym odparowano. Dodano chloroformu i odsączono białą substancję stałą przemyto chloroformem i tetrachlorkiem węgla, po czym wysuszono. Produkt zidentyfikowano jako chlorowodorek piperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylo-l', 4' -oksatiolan-2'-onu) AF269.

Ή-NMR (D₂O) δ 1,55 (d, CH₃CH), 2,25-2,55 (m, 4H), 3,3-3,42 (m, 4H), 4,4 (q, CH₃CH) ppm.

MS m/e 187 (M⁺).

Przykład 49: l-metylopiperydyno-4-spiro-2'-(5'-metylo-l', 3'-oksazolidyna) AF264 Mieszaninę 1-metyło-4-piperydonu (11,30 g, 0,10 mola) i DL-l-amino-2-propanolu (9,75 g, 0,13 mola) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną destylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Po usunięciu frakcji, która destylowała w 30-110°C (18 mm Hg) i zawierała wodę, nadmiar aminoalkoholu i produkt, czysty produkt, l-metylopiperydyno-4-spiro-2'-(5'-metylo-l', 3'-oksazolidyna) (AF264), destylował w 110-115°C (18 mm Hg, 10,70 g).

Ή-NMR (CDC1₃) δ 1.22 (d, J = 6Hz, CH₃CHO-); 1.75 (m, 4H); 2.30 (s, CH₃N-); 2.49 (m, 4H); 2.70 (dd) i 3.27 (dd) (J1 = 6.6 Hz, J2 = 12 Hz, - CH₂NH-); 4.04 (m, J 1 = 6.6 Hz, j2 = 6 Hz, CH₃CHO-) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃) δ 20.3 (CH₃CHO-); 35.3 i 36.7 (C6&C10); 45.5 (CH₃N-); 51.7 (-CH₂NH-); 52.8 (C7&C9); 71.8 (CH₃CHO-); 93.3 (C5) ppm.

MS m/e 170 (M⁺); 169 (M⁺-l); 123; 112; 85; 83(100%); 71: 70; 58.

Przykład 50: l-metylopiperydyno-4-spiro-2'-(4'-etylo-l', 3'-oksazolidyna) AF268

Mieszaninę l-metylo-4-piperydonu (5,65 g, 0,05 mola) i DL-2-amino-l-butanolu (6,24 g, 0,07 mola) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 3 godziny. Mieszaninę reakcyjną destylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Po usunięciu frakcji, która destylowała w 30-128°C (19 mm Hg, 5,65 g) i zawierała głównie produkt i mniejszą ilość wody i reagentów, czysty produkt, l-metylopiperydyno-4-spiro-2'-(4^/-etylo-l^/, 3'-oksazolidyna) (AF268), destylowała w 129-130°C (19 mm Hg, 4,5 g).

Ή-NMR (CDC1₃) δ 0.97 (t, J = 7.5 Hz, CH₃CH₂-); 1.45 1.69 (m, CH₃CH₂-); 1.70-1.89 (m, 4H); 2.30 (s, CH₃N-); 2.32-2.62 (m, 4H); 3.25 and 3.96 (m, -CH₂O-); 3.29 (m, -CHCH₂CH₃) ppm.

^I3C-NMR(CDC1₃)Ó 10.7 (CH₃CH₂-); 26.1 (CH₃CH₇-); 34.9 36.3 (C6&C10); 45.3 (CH₃N-); 52.5 52.7 (C7&C9); 58.5 (C3); 69.5 (C2); 93.1 (C5) ppm.

178 931

Przykład51:l -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo- Γ, 4'-oksatiolan-2'-on) (AF271).

Roztwór 1-metylopiperydonu (1,921 g, 0,017 mola), kwasu 2-merkaptomasłowego (2 g, 0,0167 mola) i kwasu p-toluenosulfonowego (300 mg) w acetonitrylu ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 36 godzin. Następnie roztwór odparowano, rozpuszczono w metanolu i produkt oddzielono na kolumnie z żelem krzemionkowym, stosując jako eluent mieszaninę chloroform/metanol/amoniak (97:2,5:0,5). Prowadzono dalsze oczyszczanie na kolumnie z żelem krzemionkowym z mieszaniną chloroform/metanol (95:5) jako eluentem.

Ή-NMR (CDC1₃) δ 1,0 (t, CH₃CH₂), 1,6 (m, 3H), 2,1 (m, 1H, CH₃CH₂), 2,25-2,4 (m, 4H), 2,3 (s, 3H), 2,8-2,95 (m, 2H), 3,75 (dd, CH₂CH) ppm.

MS m/e 215 (M⁺).

Przykład 52: Syntezapiperydyno-4-spiro-5'-(3'-propargilohydantoiny) (AF186)

Związek AF185 poddano demetylowaniu, zgodnie z procedurą opisaną dla związku AF160 (Des) (patrz Przykład 3) i następnie oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce (mieszanina chloroform/metanol/amoniak 80:19:1). Wytrąciła się wolna zasada w postaci białego niehigroskopijnego chlorowodorku.

Ή-NMR (D₂O, sól HC1) 02.0-2.15 (m, 2H); 2.2-2.35 (m, 2H); 2.68 (t, 1H J = 3.5 Hz); 2.91 (s, CH₃N-); 3.25-335 (m, 2H); 3.55-3.65 (m, 2H), 4.3 (d, 2H, J = 3.5 Hz) ppm.

MS m/e 207 (M⁺, podstawowy pik); 179; 151; 113.

Przykład 53: Synteza l-metylopiperydyno-4-spiro-5^/-[3^/-(2-butynylo)hydantoiny] (AF199).

Związek AF199 syntetyzowano zgodnie ze sposobem opisanym dla związku AF185 (patrz Przykład 50), po czym oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na krzemionce (mieszanina chloroform/metanol/amoniak 80:19:1). Wytrąciła się wolna zasada w postaci białego niehigroskopijnego chlorowodorku.

Ή-NMR (CDC1₃, wolna zasada) δ 1.65-1.8 (m, 2H); 1.78 (t, 3H,J = 1.7 Hz); 1.9-2.25 (m, 4H); 2.33 (s, CH₃N-); 2.8-2.95 (m, 2H); 4.22 (q, 2H, J - 1.7 Hz); 6.7 (bs, 1H) ppm.

MS m/e 235 (M⁺); 165; 154; 71 (podstawowy pik). ’

Przykład 54: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'- (Ź^metylo-l⁷,4'-tiazolidyn-3'on) AF261 i jego izomery optyczne, (+) AF261 i (-)AF261

Związek AF261 w postaci wolnej zasady (3,23 g, 16 mmoli) i kwas di-p-toluoilo-D-winowy (5,8 g, 15 mmoli) umieszczono w 250 ml kolbie i dodano 28 g alkoholu izoamylowego i 130 g toluenu i mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicązwrotnąprzez 5 minut. Klarowny roztwór częściowo odparowano pod chłodnicą zwrotną za pomocą strumienia N₂, aż powstało lekkie zmętnienie i pozostawiono do odstania przez noc. Wytworzony osad odsączono i rekrystalizowano kilkakrotnie z mieszaniny alkohol izoamylowy-toluen, aż osiągnięto czystość enancjomeryczną powyżej 98% (określonąmetodąGC i NMR). Stały produkt zalkalizowano i wytrącono w postaci chlorowodorku, uzyskując 207 mg białej niehigroskopijnej substancji stałej [a]_D ²⁵ = -54,8° (chlorowodorek w metanolu).

Roztwór macierzysty odparowano, zalkalizowano i potraktowano kwasem di-p-toluoilo-L-winowym. Krystalizowano cztery razy, aż osiągnięto czystość enancjomeryczną powyżej 98% (określonąmetodąGC i NMR). Stały produkt zalkalizowano i wytrącono w postaci chlorowodorku, uzyskując 207 mg białej niehigroskopijnej substancji stałej [cc]_D ²⁵ = +55,7° (chlorowodorek w metanolu).

Czystość optyczną wyznaczono za pomocą NMR, stosując (R) -(-)-2,2,2-trifluoro-l-(9-antrylo)etanoljako czynnik rozszczepiający. 7,5 mg tego czynnika w przeliczeniu na 2,5 mg każdego enancjomeru w C6D6 wykazało obecność pojedynczego enancjomeru. Widmo NMR dla chlorowodorku było identyczne z widmem dla związku (±) AF261.

Czystość każdego enancjomeru określono metodą GC, stosując kolumnę kapilarną Chrompack XE-60-S-Val-S-a-PEA, WCOT wypełnioną50 m krzemionki, id 0,26 mm, od 0,35 mm, przepływ 0,9 ml N₂, temperatura pieca 175°C, czas retencji 64 minuty i 65 minut.

Widmo NMR dla chlorowodorku było identyczne z widmem dla związku (±) AF269.

178 931

Przykład 55: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-etylo-l', 4'-tiazolidyn-3'-on) AF267 i jego izomery optyczne, (+) AF267 i (-) AF267

Związek A267 w postaci wolnej zasady i kwas di-p-toluoilo-D-winowy poddawano obróbce zgodnie ze sposobem opisanym dla związku AF261 (patrz przykład 53), aż uzyskano czystość enąncjomerycznąpowyżej 90% (określonąmetodąGC). Stały produkt zalkalizowano i wytrącono w postaci chlorowodorku, uzyskując 207 mg białej niehigroskopijnej substancji stałej [a]_D ²³ = -67,0° (chlorowodorek w metanolu, > 90% czystości optycznej). Roztwór macierzysty odparowano, zalkalizowano i w ten sam sposób potraktowano kwasem di-p-toluoilo-L-winowym. Po czterech rekrystalizacjach wytworzony produkt (>90% ee) zalkalizowano i wytrącono w postaci chlorowodorku [a]_D ²⁵ = +70,8° (chlorowodorek w metanolu, >95% czystość optyczna).

Czystość każdego enancjomeru określono metodą GC, stosując kolumnę kapilarnąChrompack XE-60-S-Val-S-a-PEA, WCOT prażona krzemionka 50 m, id 0,26 mm, od 0,35 mm, przepływ 0,9 m!N₂, temperatura pieca 175°C, czas retencji 83 minuty i 88 minut.

Widmo NMR dla chlorowodorku było identyczne z widmem dla związku (±) AF267.

Przykład 56: Synteza l-metylopiperydyno-4-spiro-2'-(5'-metylo-l', 3'-dioksolan-4'-onu) AF274.

Kwas mlekowy (8 ml) poddano suszeniu azeotropowemu z benzenem. Do suchego i jeszcze gorącego kwasu dodano więcej suchego benzenu, a następnie kwasu p-toluenosulfonowego (300 mg) i 1-metylopiperydonu (5,00 g, 0,027 mola). Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną aż przestała wydzielać się woda. Następnie roztwór odparowano, a pozostałość rozpuszczono w chloroformie i przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (25 ml). Fazę wodnąprzemyto chloroformem (25 ml), a połączone fazy organiczne przemyto ponownie wodą (2x10 cm³). F azę organiczną wysuszono na siarczanie sodu zmieszanym z węglem drzewnym, przesączono i odparowano, uzyskując 8,7 g surowego olejowego produktu. Po rożtarciu z heksanem, eterem i eterem naftowym (40-60), pozostały olej rozpuszczono w acetonie, po czym dodano kwasu szczawiowego (1 równoważnik). Po chwili wytrąciła się biała substancja stała, którą zidentyfikowano jako sól kwasu szczawiowego l-metylopiperydyno-4-spiro-2'-(5'-metylo-1', 3'-dioksolan-4'-onu) AF274.

¹ H-NMR (szczawian, CDC1₃+DMSO-d6) δ 1,5 (d, 3H, J = 7 Hz), 2,15 (m, 4H), 2,63 (s, 3H), 2,9 (m, 2H), 3,05 (m, 2H), 4,55 (q, 1H, J = 7 Hz) ppm.

Ή-NMR (wolna zasada, CDC1₃)61,5 (d, 3H, J = 7 Hz), 1,95 (m, 4H), 2,32 (m, 3H), 2,5 (m, 2H), 2,6 (m, 2H), 4,5 (q, 1H, J = 7 Hz) ppm.

Widmo mas m/e 185 (M⁺).

Przykład 57: 2-metylo-l,4-tiazolidyn-3-ono-spiro[5.3']-chinuklidyna AF273.

Mieszaninę 3-chinuklidynonu (2,50 g, 20,0 mmoli), kwasu tiomlekowego (2,55 g, 24,0 mmole) i węglanu amonu (2,9 g) w toluenie (100 ml) umieszczono w zamkniętym reaktorze ciśnieniowym ze stali nierdzewnej i ogrzewano mieszając w 108° przez 28 godzin. Z mieszaniny reakcyjnej wydzielił się olej, który usunięto, a pozostały toluenowy roztwór odparowano, uzyskując pozostałość (2,5 g). Po krystalizacji z acetonu otrzymano krystaliczną substancję stałą (0,460 g), złożoną głównie z j ednej pary enancjomerów związku AF273. Substancję tę ponownie krystalizowano z acetonitrylu, a potem z dichlorometanu i otrzymano jedną czystą parę enancjomerów (±) związku AF273A (0,210 g), temp. topn. 201-202°C.

Ή-NMR (CDC1₃) δ 1.53 (d, J = 7.2 Hz, CH₃CH-); 1.65 (m, 2H); 1.92 (m, 2H); 2.03 (m, 1H); 2.83 (m, 4H); 3.18 i 3.32 (dd, J - 15 Hz, - NCH₂CNH-); 3.89 (q, J = 7.2 Hz, CH₃CH-); 8.58 (bs, -ΝΉ-) ppm.

MS m/e 212 CM⁺); 155; 142 (M⁺-70); 123, 96; 71; 70 (100%); 58.

Roztwór macierzysty z pierwszej krystalizacji, który był wzbogacony w innąparę enancjomerów, poddano chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym (Merck 60). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform/metanol/wodny roztwór amoniaku 96:3:1, otrzymano najpierw drugąparę czystych enancjomerów (±) związku AF273B (0,106 g), temp. topn. 181-182°C (z acetonitrylu).

178 931 ‘H-NMR (CDC1₃) δ 1.52 (d, J = 7Hz, CH₃CH-); 1.64 (m, 2H); 1.93 (m, 2H); 2.03 (s, 1H); 2.70-2.98 (m, 4H); 3.19 (s, -NCH₂CNH-); 3.85 (q, J = 7 Hz, CH₃CH-); 8,60 (bs, -NH-) ppm.

MS takie jak dla (±) AF273A.

Następnie otrzymano mieszaninę wszystkich izomerów, a w końcu inną parę czystych enancjomerów (±) związku AF273A.

Przykład 58: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-l', 4'-tiazolidyno-3'-tion) (AF275)

Zawiesinę l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-r, 4'-tiazolidyn-3'-onu) (AF261) (1,00 g, 5,00 mmoli) i odczynnika Lawessona (1,40 g, 3,46 mmola) w suchym toluenie (25 ml) mieszano i ogrzewano do 100°C przez 3 godziny. Z mieszaniny reakcyjnej usunięto rozpuszczalnik, a pozostałość oddzielono na suchej kolumnie z żelem krzemionkowym (Merck 60, 0,040-0,065). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform, metanol, wodorotlenek amonu 96:3:1 (obj./obj) otrzymano czysty l-metylopiperydyno-4-spiro-5^,-(2^/-metylo-l', 4'-tiazolidyno-3'-tion) (AF275) (0,81 g) w postaci igiełek z acetonu, temp. topn. 171-172°C (rozkład).

‘H-NMR (CDC1₃) 1.69 (d, J = 7.1 Hz, CH₃CH-); 2.00 (m, 2H); 2.00 -2.35 (m, 4H); 2.30 (s, CH₃N-); 2.80 (m, 2H); 4.26 (q, J = 7.1 Hz, CH₃CH-); 8,74 (bs, -NH-) ppm.

MS m/e 216 (M⁺); 156; 98; 97; 96 (100%); 70.

Przykład 59: l-mctylopiperydyno-4-spiro-4'(5')-(2^/-metylotio-2^,-imidazolin-5'(4')-on) (AF187) (a) Do roztworu wodorotlenku sodu (0,36 g, 9,00 moli) w metanolu (30 ml) dodano podczas mieszania chlorowodorku l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiohydantoiny) (AF195) (1,00 g, 4,25 mmola). Wytworzył się osad (NaCl). W temperaturze pokojowej do powyższej mieszaniny dodano jodku metylu (0,664 g, 4,68 mmola) i mieszano dalej przez 1,3 godziny. Mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość ekstrahowano gorącym dichlorometanem. Po usunięciu dichlorometanu otrzymano pozostałość (0,58 g), którą oddzielono na kolumnie z żelem krzemionkowym (Merck 60, 0,040-0,065). Po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform, metanol, wodorotlenek amonu 89:10:1 (obj./obj) otrzymano 1-metylopiperydyno-4-spiro-4' (5^Z) - (2'-metylotio-2'-imidazolin-5' (49-on) (AF187) (0,23 g); temp. topn. 176-177°C (z acetonu).

‘H-NMR (CDC1₃) 1.57 (m, 2H); 2.00 (m, 2H); 2.35 (s, CH₃N-); 2.52 (m, 2H); 2.56 (s, CH₃S-); 2.84 (m, 2H); 6.73 (bs, -NH-) ppm.

¹³C-NMR (CDC1₃) 12.6 (CH₃S-); 32.7 (C₃); 45.8 (CH₃N-); 50.8 (C₂); 68.3 (C₄); 163.8 (-C-SCH₃); 188.1 (-C=O)ppm.

MS m/e 213 (M⁺); 198(M⁺-CH₃); 143 (M⁺-70); 71.

UV (EtOH) lambda_max 236 nm (ε 7800); 255 nm (ramie 8ε 4300).

(b) Roztwór 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2'-metylotio-5'-aminometylo-4'H-imidazolu) AF193 (30 mg) w wodnym roztworze kwasu solnego (0,5 ml, 16%) pozostawiono w temperaturze pokojowej na 3 dni. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość zalkalizowano stężonym wodnym roztworem wodorotlenku sodu, po czym ekstrahowano mieszaniną dichlorometan-metanol. Ekstrakt wysuszono (Na₂SO₄), a rozpuszczalnik usunięto, otrzymując pozostałość, którą oddzielono na płytce z grubą warstwą żelu krzemionkowego (Merck kieselgel 60, F₂₅₄), rozwijając chloroformem, metanolem i wodnym roztworem amoniaku 79:20:1 (obj./obj.). Otrzymano AF187 (8 mg), identyczny z autentyczną próbką.

Przykład 60: l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(l'-etylo-2'-etylotio-2'-imidazolin-5'-on) (AF188). ·

Do zawiesiny chlorowodorku l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiohydantoiny) (AF195) (4,04 g, 0,0172 mola) i wodorotlenku potasu (3,85 g, 0,0686 mola) w etanolu (100 ml) dodano bromku etylu (5,60 g, 0,0514 mola) i mieszaninę, mieszając, ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po ogrzewaniu przez 2 godziny, główny produkt stanowiła nadal pochodna monoetylowa, tak więc do mieszaniny reakcyjnej dodano jeszcze wodorotlenku potasu (0,95 g, 0,0169 mola) i bromku etylu (2,00 g, 0,0184 mola) i ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną jesz

178 931 cze przez 3 godziny. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, do pozostałości dodano wody (20 ml) i ekstrahowano eterem. Ekstrakt wysuszono (Na^C^), a rozpuszczalnik usunięto, otrzymując pozostałość (0,973 g), którą krystalizowano z eteru naftowego i otrzymano czysty l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(l'-etylo-2'-etylotio-2-imidazolin-5'-on) (AF188) (0,513 g), temp. topn. 95-96°C. Po usunięciu rozpuszczalnika i chromatografii roztworu macierzystego na suchej kolumnie z żelem krzemionkowym (20 g, Merck 60,0,040-0,065) i po eluowaniu mieszaniną rozpuszczalników chloroform, metanol, wodny roztwór amoniaku 84:5:1, otrzymano dodatkową ilość czystego produktu AF188 (0,310 g).

'H-NMRiCDCy 1.19(t,J = 7.2Hz,CH₃CH₂N-); 1.40(t, J=7.2Hz,CH₃CH₂S-); 1.43(m, 2H); 1.99 (m, 2H); 2.36 (s, CH₃N-); 2.51 (m, 2H); 2.77 (m, 2H); 3.18 (q, J = 7.2 Hz, CH₃CH₂S-); 3,49 (q, J = 7.2 Hz, CH₃CH₂N-) ppm.

^,3C-NMR(CDC1₃) 14.1 (2CH₃CH₂-); 24.4 (CH₃CH₂S-); 33.0 (C₆); 35.1 (CH₃CH₂N-);46.2 (CH₃N-); 51,0 (C₇); 68.6 (C₅); 158.8 (-N=C-); 183.9 (-O0) ppm.

MS m/e 255(M⁺); 226 (M⁺-Et); 185 (M⁺-70); 71; 70.

Przykład61:l -metylopiperydyno-4-spiro-4'-( r-etylo-2'-imidazolin-5'-on) (AF220).

Do roztworu 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'-( l'-etylo-2'-etylotio-2'-imidazolin-5'-onu) (AF188) (0,214 g) w etanolu (10 ml) dodano niklu Raneya (0,30 g) i mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny. Ponieważ reakcja nie skończyła się, dodano jeszcze niklu Raneya (0,30 g) i ogrzewano dalej do wrzenia pod chłodnicą zwrotną jeszcze przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną przesączono, a katalizator przemyto metanolem i dichlorometanem. Przesącz i przemywki połączono i odparowano, otrzymując l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(l'-etylo-2'- imidazolin-5'-on) (AF220) (0,160 g) w postaci oleju.

Ή-NMR (CDC1₃) 1.27 (t, J = 7.3 Hz, CH₃CH₂-); 1.46 (m, 2H); 2.03 (m, 2H); 2.36 (s, CH₃N-); 2.48 (m, 2H); 2.82 (m, 2H); 3,53 (q, J = 7.3 Hz, CH₃CH₂-); 7.72 (s, -CH=N-) ppm.

¹³C-NMR(CDC1₃) 13.9 (CH₃CH₂-); 32.2 (C₆); 35.3 (CH₃CH₂-); 45.7 (CH₃N-); 50.5 (C₇);

68.2 (C₅); 151.6 (-N=CH-); 183.9 (-C=O)ppm.

Próba oczyszczenia produktu metodą chromatografii na kolumnie z suchym żelem krzemionkowym (20 g, Merck 60,0,040-0,065) z eluowaniem mieszaniną rozpuszczalników chloroform, eter, metanol, wodny roztwór amoniaku (25:17:3:1) dała jako główny produkt produkt hydrolizy o otwartym pierścieniu, l-metylopiperydyno-4-formyloamino-4-N-etylokarboksyamid (AF221) krystalizowany z mieszaniny eter-dichlorometan, temp. topn. 108-109°C.

Ή-NMR (CDC1₃) 1.13 (t, J - 7.2 Hz, CH₃CH₂-); 2.04-2.32 (m, 6H); 2.28 (s, CH₃N-); 2.65 (m, 2H); 3.28 (dq, CH₃CH₂-); 5.73 (s, HCONH-); 6.97 (bs, EtNHCO-); 8.18 (s, HCON-) ppm.

MSm/e213(M⁺); 195 (M⁺-H2O); 168 (M⁺-EtNH2); 141 (M⁺-EtNHCO); 98; 97; 96; 71; 70.

Przez ogrzewanie (150°C) produktu hydrolizy AF221 pod próżnią, można otrzymać AF220 o zamkniętym pierścieniu.

Związki według wynalazku wykazują aktywność farmakologiczną, tak więc są użyteczne jako środki farmaceutyczne, np. w leczeniu. Zwłaszcza związki spiranowe opracowane w niniejszym wynalazku mają ośrodkowe i obwodowe (lub obydwa) działanie na układ nerwowy. Wspólną charakterystyczną cechą aktywności tych związków, jest działanie na układ cholinergiczny, w którym związki te sąligandami (np. agonistami lub antagonistami) względem receptorów muskarynowych.

Agonistyczny i antagonistyczny profil związków oceniono w licznych testach obejmujących prowadzone komputerowo badanie cząsteczkowe, testy biologiczne in vitro i in vivo.

Komputerowe badanie cząsteczkowe

Do oceny aktywności agonistycznej względem receptora muskarynowego skonstruowano model farmakoforyczny opracowany na podstawie badania rozmaitych agonistów. W modelu określono te części w strukturze agonistów, które sązasadnicze dla ich aktywności, ich wzajemną orientację przestrzenną i w pewnym stopniu maksymalną objętość, które pozwalają ligandowi być agonistą.

178 931

Ogólny Przykłady

W powyższych wzorach, punkt r jest ładunkiem ujemnym współdziałającym z kationową podstawą agonisty. W modelu określono jego pozycję w stosunku do azotu. Istotne odległości (D) są następujące: D(r-N*) = 3,0; D(r-X*) = 6,50; D(r-Q*) = 8,70; D(x*-Q*) = 2,45. Optymalny kąt dwuścienny r-x*-Q*-z* = -85. Odchylenia od tych optymalnych parametrów modelu w obrębie pewnych granic nie znoszą aktywności.

Niektóre ważne cechy tego modelu wymieniono poniżej:

1. Model umożliwia różnicowanie pomiędzy pełnym i częściowym agonistą względem receptora muskarynowego. Zróżnicowanie to opiera się na korelacji pomiędzy odległością r-X* i skutecznością agonisty.

2. Rodzaj atomu w pozycji 4, odpowiadającej karboksylowanemu atomowi tlenu w acetylocholinie, jak również kąt dwuścienny r-x*-Q*-z^ł, mogą zmieniać się znacznie w obrębie klasy agonistów muskarynowych.

3. Gdy odległość r-Q* staje się zbyt duża dla aktywności agonistycznej, uzyskuje się słabo wiążących antagonistów.

Na podstawie tego modelu przewidzieć można specyficzność agonisty muskarynowego wobec podtypu receptora, w oparciu o sztywność struktury agonisty, charakter Z i parametry modelu.

Model farmakoforyczny stosować można w badaniu skriningowym nowych związków pod kątem ich aktywności względem receptora muskarynowego w następujący sposób a: optymalizuje się nową strukturę aby określić jej konformery o niskiej energii, b: bada się te konformery na właściwe rozmieszczenie elementów farmakoforycznych. Alternatywnie, w nowej strukturze można wymusić konformację farmakoforyczną stosując jeden z indukowanych sposobów dopasowania. Otrzymaną konformację porównuje się następnie z konformacją o niskiej energii tej samej struktury. Stosowanie tych procedur daje wiarygodną odpowiedź we wszystkich badanych przypadkach (tabela 1). Aczkolwiek nie ma sposobu przewidzenia czy aktywność muskarynową wykazują tylko związki konfonnujące do tego modelu, te jednak związki, które dopasowują się są aktywne jako agoniści.

Na podstawie tych eksperymentów typu „docking” pokrewnych struktur wnioskuje się o ograniczeniu objętości kationowej części agonistów muskarynowych do modelu cząsteczkowego tranmembranowej domeny receptora muskarynowego ml. Związki większe niż pochodne chinuklidyny nie mogą zmieścić się w molekularnym miejscu wiążącym.

Związki wymienione w tabeli 1 podzielono na cztery grupy. Pierwsza grupa obejmuje niektórych dobrze znanych agonistów muskarynowych. Ich budowę określają optymalne parametry farmakologiczne. Druga grupa obejmuje agonistów, którzy wykazująmniej niż optymalne wzorce farmakoforyczne i tak więc w dużej mierze sączęściowymi agonistami. Struktury związków z trzeciej grupy odbiegają od wzorca farmakoforycznego dla aktywności wobec receptorów mu

178 931 skarynowych, określonej dla poprzednich grup. Związki te są albo antagonistami albo pozbawione są aktywności wobec receptorów muskarynowych. W grupie czwartej wymieniono niektórycch potencjalnych agonistów względem receptorów muskarynowych w oparciu o ich farmakoforyczne parametry.

Tabela 1: Farmakoforyczne parametry agonistów muskarynowych

Agon i sta	Selektywność	r-X* (A)	r-Q* (A)	X-Q* (A)	r-X*-Q-Z’
1	2	3	4	5	6
(Grupa 1)
ACh	M2>M1	6.40	8.44	2.40	-86
Dioxolan	M2>M1	6.51	8.71	2.42	-85
Muskaryna	M2>M1	6.50	8.53	2.44	-75
Methylfurmo	M1>M2	6.40	8.54	2.43	-59
Oxatolan	M1>M2	6.55	8.90	2.43	-25
(Grupa 2)
AF102B	M1>M2	5.93	8.24	2.45	-173
AF150	M1>M2	5.78	7.91	2.45	-118
AF15L	M1>M2	5.82	8.20	2.45	-170
AF150(S)	M1>M2	5.72	8.35	2.81	-84
AF151(S)	M1>M2	5.88	8.15	2.38	-177
AF160	M1>M2	5.80	8.26	2.72	-96
AF160 (Des)	M1>M2	5.78	8.26	2.70	-95
(Grupa 3)
AF133		5.98	8.33	2.96	34
AF134		6.00	8.58	2.62	9
AF168		6.69	9.10	2.72	-44
AF172		5.71	9.64	4.00	-101
(Grupa 4)
AF170		6.07	8.62	3.01	-60
AF181		5.92	8.35	2.75	-88
AF184		5.93	8.44	2.65	-87
AF185		5.96	8.21	3.13	-105
AF196		5.92	8.40	2.73	-87
AF202		5.78	8.10	2.42	-170
AF210		5.89	8.20	2.43	-170
AF215		5.94	7.93	2.44	-108
AF216		5.72	8.32	2.84	-96
AF260		5.75	8.02	2.45	-132
AF261		5.91	7.80	2.37	-107
AF264		5.77	8.07	2.46	-128

178 931 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6
AF265		5.82	7.72	2.38	-94
AF267		5.91	7.84	3.25	-105
AF270		5.79	8.27	2.73	-93

❖ metylofurmetyd

Badanie biologiczne

Badanie Nr 1. Preparat izolowanego jelita świnki morskiej.

Związki według wynalazku badane były na swoje działanie agonistyczne i antagonistyczne na preparacie jelita świnki morskiej (sposobem opisanym przez Fisher i in., J. Pharm. Exp. Tberap. 257: 392-403 (1991)). Tabela 2 podsumowuje wyniki uzyskane z użyciem niektórych związków.

T a b e 1 a 2: Wpływ na preparat jelita świnki morskiej

Związek	ECSO (μΜ)	Uwagi
1	2	3
AF102B*	3.5	częściowy agonista
AF134v		antagonista w stęż. 6 μΜ
AF151 (S)	7.3	pełny agonista
AF160	3.2	pełny agonista
AF 160 (Des)		częściowy agonista w stęż. 0.1 mM skurcz maksymalny w 80% karbacholu
AF177		słaby antagonista w stęż. 0.25 mM
AF178	100	częściowy agonista (80% ACh)
AF179	100	częściowy agonista (80% ACh)
AF180	100	częściowy agonista (80% ACh)
AF182		antagonista w stęż. 0.1 mM; pełny antagonista w stęż. 0.2 mM

cis-2-metylospiro(l,3-oksatiolano-5,3')chinuklidyna(US 4,855,290); słaby antagonista skurczu wywołanego Ach

V zachowuje się jak antagonista muskarynowy w preparacie jęli ta świnki morskiej; nieoczekiwanie, hamował skurcze wywołane przez AF102B lepiej niż skurcze wywołane przez ACh. Stąd, skurcze wywołane przez AF102B w tym preparacie wywołane są działaniem przez receptor M3. AF134 wydaje się być w tym preparacie wybiórczym ntagonistąM3.

Badanie Nr 2. Wiązanie z receptorami muskarynowymi w mózgu; współzawodnictwo z [³H]QNB, [³H]NMS i [³H]OXO-M w błonach uzyskanych z kory i móżdżku szczura.

Preparaty błon kory mózgu i móżdżku szczura oraz ligandy [³H]NMS, [³H]pirenzepina i [³H]oksotremoryna-M zastosowane zostały do badania nowych związków (tabela 3 i 4).

178 931 . . 3 3

Tabela 3: Współzawodnictwo badanych związków z, odpowiednio, [ H]PZ, [ H]QNB albo [ H]NMS (kora szczura), i [ H]QNB albo [ H]NMS (móżdżek)

Kora

Związek	[3H]	PZ	[3H] qnb	[Ή] NMS
KH μΜ (%)	Κ,μΜ	KH μΜ (%)	KL μΜ	KH μΜ (%)	KL μΜ
Karbachol	0.06 (38)	18.6	6.8 (18)	980	0.1 (41)	11
Oksotremoryna				2.4
McN-A-343				7.9
AF102B		1		7.1		1.1, 1.5
AF133		2.7
AF134		0.13
AF151 (S)	0.75 (11)	20	24 (44)	459
AF160	1.4(34)	19		58	0.45 (31)	12
AF160 (Des)	1.3 (36)	9		40		7
AF178	17(58)	90
AF180		5.4
AF177	0.06 (10)	7			0.1 (14)	13
AF182	0.06 (27)	8.3			0.12(23)	9.2
AF183			0.06 (14)	100		260
AF185				4.8		9

Kora

Tab e la 3. (ciągdalszy)

Zwią zek	[3H]	PZ	[3H] NMS
Kh μΜ(%)	ΚΕμΜ	KH μΜ(%)	ΚΕμΜ
1	2	3	4	5
AF181		3.6
AF184		0.64
AF196		>1000
AF 197		48
AF213		5.7
AF264		294
AF260	0.2 (36)	16	0.014(12)	32
AF261	0.03 (26)	25	8.6 (33)	100
AF261A		18		20
AF261B	0.13 (34)	6.7	0.032 (31)	4.2
AF263	0.33 (14)	10	0.19(23)	13
AF265	0.93 (12)	49	0.18(27)	39
AF267*		2.8*		5.88

178 931 cd. tabeli 3

1	2	3	4	5
AF267A				10.9
AF267B				4.3

* 2+ 3 . ....

po traktowaniu Cu test współzawodnictwa z [ H]PZodsłonił dwa miejscawiązania dla AF267 (Kh = 22 nM (18%); Kł = 2.5 μΜ). Obserwacja ta wskazuje, że AF267 wiąże się z receptorem muskarynowym w korze mózgowej szczura jako agonista (Fisher i in., J. Pharmacol. Exptl. Therap. 257:392-403 (1991)).

Tabela 3 (ciąg dalszy)

Móżdżek

Związek	[Ή] QNB	[3H] nms
KH gM(%)	KL μΜ	KH μΜ(%)	ΚΕμΜ
1	2	3	4	5
Karbachol	1.5 (54)	52	0.02 (56)	6
Oksotremoryna		0.8
McN-A-343		24.4
AF102B		18.1		1.4, 0.4
AF133		5.1
AF134		3.8
AF151 (S)		45
AF160		61	0.56 (46)	19
AF160 (Des)	5(36)	86		2.4
AF178		200
AF180		350
AF177				20
AF182				21
AF183				310
AF185				7
AF181				5
AF184				2.9
AF197				18
AF260			0.46 (58)	87
AF261			0.83 (45)	23
AF261A				18
AF261B			0.29 (53)	24
AF267*				2.3
AF267A				6,9
AF267B			0.15 (26)	3.2

Obliczone stosunki Ki^PZ/Ki^NMS albo Ki^pz/Ki^QNB (tabela 3) są powszechnie stosowanymi wskaźnikami wybiórczości w stosunku do Ml ligandów muskarynowych, wartości niższe wska

178 931 zująna większą wybiórczość w stosunku do Ml. Dodatkowo, stosunki Ki^pz/Ki^QNB z preparatów kory mózgowej w stosunku do móżdżku szczura również wskazują na wybiórczość w stosunku do Ml ligandów muskarynowych, przy czym stosunek mniejszy niż 1 wskazuje na wybiórczość w stosunku do Ml (Fisheriin., J. Pharmacoł. Exptl. Therap. 257: 392-403 (1991)). Stosując te testy można było wykazać, że niektóre ze związków według wynalazku wykazywały względnie wysokąpreferencj ę do receptorów muskarynowych Μ1. Były to: AF 133, AF 134, AF 160, AF 160 (Des), AF177, AF178, AF181-AF185, AF261, AF265 i AF267.

AF185, przykładowo, wykazywał trzykrotnie wyższe powinowactwo we współzawodnictwie z [³H]PZ w porównaniu z jego współzawodnictwem o miejsca wiązania [³H] NMS (odpowiednio, Ki = 1.4 ± 0.15 μΜ w stosunku do 5 ± 1 μΜ, tabela 3). Stoi to w jaskrawym przeciwieństwie do AF102B (Patent USA), wykazującym niemal podobne powinowactwa we współzawodnictwie z oboma ligandami (odpowiednio, Ki = 1.43 ± 0.2 μΜ w stosunku do 1.86 ± 0.43 μΜ; tabela 3). Ponieważ, jak się uważa, [³H] PZ wiąże się swoiście z Ml AChR w błonach szczurzej kory mózgowej, powyższe dane mogą wskazywać, że AF185 jest ligandem bardziej Ml-selektywnym niż AF102B.

Krzywe wiązania [³H] NMS kilku nowych związków w błonach kory mózgowej wskazują na oddziaływanie z dwoma miejscami: około ćwierć miejsc wiązania wykazuje wysokie powinowactwo w stosunku do tych związków. Może to oznaczać wysoką aktywność agonistyczną w tych preparatach. Są to związki: AF260, AF261, AF263 i AF265.

Nieoczekiwanie, niektóre spośród nowych związków wykazują krzywe współzawodnictwa o dwa miejsca wiązania z [³H] PZ w korze mózgowej szczura (tabela 3). Są to: AF160, AF160 (Des), AF260, AF261, AF265. Krzywe współzawodnictwa o dwa miejsca tych związków z [³H] PZ przekształcone zostały do pojedynczych krzywych działania mas, w obecności stabilnego analogu GTP, GppNHp (dane nie pokazane). Podobne obserwacje dotyczące wrażliwości na GppNHp poczyniono w przypadku współzawodnictwa z [³H] NMS. Wskazuje to, że związki te zachowują się jak efektywni agoniści receptorów Ml w korze mózgowej szczura. Stoi to w sprzeczności z testami współzawodnictwa związku AF 102B, które zwykle dająkrzywe działania mas. Obserwacj e te mogą sugerować pewne różnice pomiędzy rozpoznawaniem receptorów Μ1 kory szczura przez AF102B i nowe związki.

AF267 wykazywał krzywą współzawodnictwo o jedno miejsce wiązania z zarówno [³H] NMS jak i [³H] PZ w błonach kory mózgowej szczura. Badanie hydrolizy fosfoinozytoli (PI) i uwalniania kwasu arachidonowego opisane niżej wskazują, że związek ten jest częściowym agonistą. Wzorzec wiązania typu działania mas był więc podobny do wiązania Μ1 -selektywnego agonisty AF102B z receptorami muskarynowymi tego preparatu.

Wykazano uprzednio, że działanie na błony kory mózgowej szczura przy użyciu 0.1 mM CuSO₄ może odsłonić ukryte własności agonistyczne AF102B (Fisher i in., JPET 257: 392-403, 1991; opublikowane dane dotyczą współzawodnictwa AF 102B z [³H] QNB, ale podobne obserwacje poczyniono przy użyciu [³H] NMS i [³H] PZ). Tak więc, działanie także może zwiększyć ilość miejsc wysokiego powinowactwa do pewnych agonistów, którzy wykazują takie powinowactwo bez działania Cu²⁺ (np. AF160).

Następnie badano zdolność wiązania AF267 po działaniu Cu²⁺. Działanie takie, poprzedzające badanie współzawodnictwa z użyciem [³H]PZ odsłaniało 18% miejsc wiązania o wysokim, powinowactwie do AF267 (K_H = 22 nM, tzn. ok. 100-krotnie większe powinowactwo w porównaniu z K_L = 2.5 μΜ) bez istotnej zmiany miejsc o niskim powinowactwie. Obserwacja ta sugeruje, że AF267 może wiązać się z receptorami muskarynowymi w korze mózgowej szczura podobnie do AF 102B. Zdolność do uj awniania miej sc wysokiego powinowactwa przez działanie Cu²⁺ dla poszczególnych częściowych agonistów może być związana ze stabilizacją interakcji receptor/białko G przez koordynację kompleksów jonów metali z kluczowymi grupami sulfhydrylowymi tych cząsteczek (Gurwitz i in., BBRC, 1984,120: 271-277). W błonach kontrolnych oddziaływanie to nie jest prawdopodobnie faworyzowane w obecności częściowych agonistów, a więc nie ujawniają one miejsc o wysokim powinowactwie w testach współzawodnictwa ze znakowanymi antagonistami.

178 931

Zdolność związków do znoszenia wiązania [³H] oksotremoryny -M pozwoliła określić wielkość powinowactwa do receptorów w stanie wysokiego powinowactwa do agonisty. Stosunek wartości Ki dla usuwania [³H] NMS albo [³H] QNB i [³H] ΟΧΟ-Μ używany jest w literaturze dla przewidzenia efektywności. Stosunki większe niż 100 dotyczą pełnych agonistów; antagoniści dająstosunki bliskie jedności, zaś wyniki pośrednie wskazują częściowych agonistów (Orlek i in., J. Med. Chem., 34: 2726, 1991).

Nowe związki badano w teście współzawodnictwa ze znakowanymi, niewybiórczymi agonistami muskarynowymi, [³H] 0Χ0-Μ, z użyciem błon kory mózgowej szczura; silny charakter agonistyczny AF 179 i AF 160 dotyczy ich względnie dużych wartości Ki^NMS/Ki^0X0‘^M (tabela 4).

Tabela 4

Współzawodnictwo pochodnych AF160 i kontrolnych agonistów muskarynowych z [ Η] ΟΧΟ-Μ na modelu preparatu kory mózgowej szczura

Związek	Κί(μΜ)	Ki^S/Ki0*0 M
A. Krzywe działania3:
CCh	0.06 ± 0,005 (3)	380
Pilokarpina	0.1
AF102B	0.6 ± 0.2 (3)	2.1
AF160	1.8 ±0.2 (3)	9.4
AF177	11	1.4
AF179	1.3 ±0.3	31
AF182	14	1
AF183	>100	-1

cd. tabeli 4

Związek		KH (μΜ)	%H	KL (μΜ)	j£iNMS/KiOXO-M
B. Krzywa współzawodnictwa o dwa miejsca :
AF160 (Des)	Dośw. 1	0.05	36	2.2
	Dośw. 2	0.03	58	1.8
	Dośw.3	0.02	42	2.1
	śr. (1-3)	0.033 ± 0.007	45 ±6	2.0 ±0.1	3.5
		(3)
AF185	Dośw. 1	0.04	53	49	0.18
	Dośw. 2	0.01	18	3	3

Uwaga: Badanie wiązania wykonano przy użyciu błon kory mózgu szczura płukanych buforem TRIS/Mn²⁺ pjzez 0.5 godz. w 25°C; dane dotyczą leków wykazujących krzywe współzawodnictwa o dwa miejsca wiązania z [ Η] ΟΧΟ-Μ; z AF 160 (Des) i AF 185, w niektórych doświadczeniach obserwowano krzywe typu działania mas.

Nieoczekiwanie, AF160 (Des) i AF185 były jedynymi spośród badanych leków, których krzywe współzawodnictwa (badane przy użyciu [³H] ΟΧΟ-Μ i błon kory mózgowej szczura) nie wykazywały krzywych typu działania mas współzawodnictwa o jedno miejsce (tabela 4). Niezwykle silne współzawodnictwo tych leków z frakcją receptorów znakowanych [³H] ΟΧΟ-Μ w błonach kory mózgowej szczura może wskazywać, że leki te są wysoce swoiste dla podtypu.

178 931

Stąd, obliczone stosunki Ki^NMS/KH^0X0'^M (tabela 4) mogą wskazywać, że AF160 (Des) jest silnym agonistądlapodtypu receptorów muskarynowych kory mózgowej szczura, w porównaniu z innymi pochodnymi grupy AF160 i z samym AF102B. Jednakże, nie obserwowano tego: krzywe współzawodnictwa zarówno AF160 (Des) jak i AF185 z [³H] NMS w sposób stały wykazywały prostą zależność działania mas. W rzeczywistości, tylko AF160, który wykazywał krzywą współzawodnictwa o dwa miejsca z [³H] NMS, we współzawodnictwie z [³H] ΟΧΟ-Μ wykazywał zwykłą krzywą działania mas. Stąd, wyjaśnienie heterogenności podtypów receptora, który wykrywany był wyłącznie wiązaniem [³H] 0Χ0-Μ, ale nie w teście wiązania [³H] NMS nie wydaje się atrakcyjne.

Inne wyjaśnienie może dotyczyć prawdopodobnego oddziaływania z miejscami allosterycznymi receptorów muskarynowych, które nie sąwykrywane w stanie, w jakim znajdująsię receptory wiążąc antagonistów jak [³H] NMS, ale są odsłaniane przy użyciu agonisty [³H]OXO-M. Innym prawdopodobnym wyjaśnieniem płaskich krzywych współzawodnictwa w teście wiązania [³H] 0Χ0-Μ jest nie osiągnięcie równowagi przez układ. W testach współzawodnictwa z użyciem AF160 (Des) albo AF 185, równowaga nie została osiągnięta po 30 minutach, ponieważ dane dotyczące wiązania w 30 minucie różniły się od danych uzyskanych w 60 minucie w 25°C. Gdy testy przerywano w 30 minucie, płaskie krzywe współzawodnictwa z [³H] 0Χ0-Μ obserwowano dla, zarówno AF 160 (Des) jak i dla AF 185. Prawdopodobnym wytłumaczeniem jest, że AF160 (Des) i AF185 wykazują względnie wolną kinetykę (wolne tempo wiązania i wolne tempo dysocjacji) w porównaniu z AF 102B. Może to powodować bardzo wolne osiąganie równowagi w testach współzawodnictwa, powodując obserwowane wykrywanie izoterm wiązania z dwoma miejscami w warunkach nierównowagi. Jest rozsądnym stwierdzenie, że zarówno tempo wiązania jak i tempo dysocjacji są względnie wolne: jeżeli tylko tempa wiązania AF160 (Des) i AF 185 byłyby wolne w porównaniu z AF 102B, wykazywałyby one znacznie niższe powinowactwo od AF102B. Z drugiej strony, jeżeli ich tempa dysocjacji byłyby niższe, ich powinowactwa powinny być znacznie wyższe niż AF102B.

Móżdżek szczura jest względnie jednorodny pod względem ekspresjonowanych podtypów m AChR (głównie M2). AF 102B wykazywał podobną siłę we współzawodniczeniu z wiązaniem [³H] ΟΧΟ-Μ w zarówno korze szczura jak i móżdżku. W przeciwieństwie do powyższego, AF 160 (Des) i AF 185 wykazywały większą siłę w korze w porównaniu z błonami móżdżku; odwzierciedlały to krzywe współzawodnictwa o dwa miejsca w błonach kory (patrz również dane dotyczące kory w tabeli 4). Ponownie, może to wskazywać na odmienną kinetykę tych związków w korze w porównaniu z móżdżkiem.

Badanie Nr 2. Aktywacja wtórnego przekaźnika w skrawkach mózgu i hodowli komórkowej.

Do procedury mierzenia efektywności badanych związków jako agonistów receptorów muskarynowych Ml, przygotowano skrawki mózgu z kory szczurów (kostki 200 μΜ). Do badania obrotu fosfatydyloinozytoli (PI) skrawki te ładowano [³H] inozytolem (4 pCi/ml) przez inkubowanie ich w zbuforowanym roztworze soli Krebsa, zawierającym znakowany ligand, przez godzinę w temp. 37°C natleniając. Po odpłukaniu, porcje po 50 μΐ dodano do probówek zawierających 10 mM LiCl w świeżym roztworze Krebsa z lub bez badanego związku. Po inkubacji przez 20 minut w 37°C reakcję przerywano zaś znakowane produkty rozdzielano na kolumnach AG-l-X8jaktoopisanowBerridge (Biochem. J. 258,849-858,1983). Częściowi agoniści, w odniesieniu do badanych związków, wytwarzali mniej niż 80% poziomu aktywacji hydrolizy PI w porównaniu z CCh (pełnym agonistą). Stąd, przykładowo, AF160 powodował znaczne podwyższenie poziomu IP₃ (1.6 krotnie). W porównaniu z CCh, AF160 był częściowym agonistąo efektywności równej 50% związku stanowiącego punkt odniesienia. AF160(des) był również aktywny, jednakże w mniejszym stopniu niż AF160. AF102B jako inny agonista Ml był mniej aktywny niż AF160, podczas gdy AF178 nie był aktywny w ogóle w tym teście.

Hodowle komórkowe wzbogacone o jedną z subpopulacji receptorów muskarynowych użyto do badania aktywacji wtórnego przekaźnika przez badane związki. Do badania obrotu PI zastosowano metodę Berridge'a (Biochem. J. 258: 849-858, 1983); do badania uruchomienia kwasu arachidonowego komórki znakowano przez 16 godzin przy użyciu 0.2 pCi/ml trytowane

178 931 go kwasu arachidonowego w pożywce hodowlanej. Przed badaniem komórki odpłukano sześciokrotnie bezsurowiczą pożywką DME uzupełnioną o HEPES (20 mM) i albuminę surowicy wołowej (1 mg/ml). Po etapie płukania, dodano 0.5 ml tej samej pożywki z odpowiednim dodatkiem badanych ligandów. Badanie przerywano przez przeniesienie pożywki do probówek Eppendorf i odwirowanie przez 10 minut przy 6000 g. Radioaktywność nadsączu była mierzona i przedstawiona jako dpm trytowanego kwasu arachidonowego na studzienkę. Akumulację cyklicznego AMP w całych komórkach określano według metody Pinkas-Kramarski i in., Neurosci. Lett. 108: 335-340, 1990, podczas gdy aktywność cyklazy adenylowej w izolowanych błonach oznaczana była według Johnson i Salomon (Methods in Enzymology vol 195, R. A. Johnson i J.D. Corbin, wyd. Academic Press, str. 3-21, 1991).

Korzystne są związki o wzorach od I do IX o minimalnym tempie obrotu PI i/lub uruchomieniu kwasu arachidonowego (ale bez znaczącego pobudzenia cyklazy adenylowej) większym niż 25%. Kilka przykładów takiej aktywności można znaleźć w AF160, AF160(Des), AF178, AF179, AF180, AF260, AF261, AF263, AF265, AF266, AF267. Związki te są zdolne do aktywacji receptorów muskarynowych Ml.

W przeciwieństwie do acetylocholiny, CCh, oksotremoryny-M i innych klasycznych pełnych agonistów, związki te wywołują wybiórcze pobudzenie różnych dróg pobudzenia przez receptory muskarynowe Ml (albo M3). W szczególności, wybiórcze pobudzenie przez agonistów muskarynowych hydrolizy PI bez (lub z minimalnym) pobudzeniem gromadzenia cAMP, stanowi ogólny wzorzec aktywności nowych związków. Obserwacje te mogą oznaczać indukcję wiązania się receptorów muskarynowych Ml z różnymi białkami G, przez te wybiórcze ligandy muskarynowe. Stąd, dodatkowo do aktywacji receptorów Ml, związki te są również selektywne na poziomie różnych wtórnych przekaźników.

Koncepcja wybiórczej aktywacji różnych białek G przez ten sam receptor muskarynowy przy użyciu różnych selektywnych ligandów muskarynowych została niedawno opisana pod wpływem przekaźnictwa sygnału swoistego dla ligandu w komórkach CHO transfekowanych szczurzymmlAChR(Fisheriin.,Bioorganic&MedicinalChem.Lett. 2:839-844,1992)i wlinii komórkowej typu neuronalnego, tzn. linii komórkowej PC12M1 (Soc. Neurosci. Abs. Nov. 1993). Prawdopodobna istotność tego szlaku przekaźnictwa sygnału w opracowaniu cholinergicznej terapii zastępczej w chorobie Alzheimera (AD) jest oczywista w świetle odkrycia podwyższonego poziomu Gs w mózgach pacjentów z AD i osób w podeszłym wieku (Charrison i in.. Mol. BrainRes., 10:71,1991; Youngiin.,Dev. BrainRes.,61:243,1991).Stąd, związki według niniejszego wynalazku mogą być istotne w leczeniu choroby Alzheimera.

Niektóre ze związków są pełnymi agonistami, podczas gdy inne są agonistami częściowymi, w porównaniu z CCh, w pobudzaniu hydrolizy PI w hodowlach komórkowych transfekowanych ml AChR. Częściowymi agonistami są: AF160, AF160 (Des), AF178, AF180, AF181, AF265, AF267, AF260, AF261, AF263 i AF266, które posiadały pełną aktywność agonistyczną w tym teście. Krzywe odpowiedzi na stężenie dla AF260 i AF261 wskazywały, że aktywności maksymalne osiągnięte zostały przy, odpowiednio, 10 μΜ i 100 μΜ. AF265 i AF267 zachowywały się jak częściowi agoniści, z maksymalnymi aktywnościami rzędu, odpowiednio, 75% i 66%, w odpowiedzi na 1 μΜ CCh. AF181 wykazywał w tym teście aktywność słabego częściowego agonisty. Tak więc, w stężeniu 1 mM częściowo aktywował hydrolizę PI ale osłabiał wywołaną przez CCh hydrolizę PI, jak oczekiwano od częściowego agonisty. AF213 i AF184 wykazywały aktywność antagonistyczną przez blokowanie sygnału CCh czyli hydrolizy PI. Wśród enancjomerów AF267 najbardziej aktywny był AF267B, enancjomer (-); związek ten aktywował hydrolizę PI w komórkach transfekowanych receptorami Ml nawet w stężeniu 10 μΜ (40% CCh) i 100 μΜ (80% CCh).

Badano siłę nowych związków w wywoływaniu odczulenia sygnału hydrolizy PI zależnego od CCh. AF261 wywoływał mniejszą odpowiedź odczulającą w porównaniu z CCh: po 24 godzinnej ekspozycji na 100 μΜ albo 1 mM AF261, odpowiedź hydrolizy PI na pobudzenie przez 1 mM CCh zmniejszona była do 45% w porównaniu do zmniejszenia 60% po preinkubacji z ImM CCh. AF267, związek wykazujący aktywność częściowego agonisty w wywoływaniu hydrolizy PI, był

178 931 w mniejszym stopniu zdolny do wywoływania odczulenia. Tak więc, po całonocnej inkubacji z ImM AF267, pierwotna odpowiedź PI zależna od CCh zmniejszona była do 29%.

Badano również nowe związki na ich zdolność do wywoływania hydrolizy PI w komórkach przejściowo transfekowanych ludzkim ml AChR, m3AChR albo m5AChR w doświadczeniach równoległych jak to opisano w Pittel i Wess (Mol. Pharmacol. 45: 61-64,1994). AF267 wykazywał największą wybiórczość w stosunku do podtypu ml AChR, będąc 100 krotnie bardziej czynnym w stosunku do ml AChR w porównaniu z komórkami transfekowanymi m3AChR (wartości ED₅₀ wynosiły odpowiednio 1.5 i 150 μΜ). Jest to tym bardziej ewidentne w porównaniu z sygnałem wywołanym przez 10 μΜ AF267, który jest największy w komórkach transfekowanych ml AChR, ale stanowi tylko 15% maksymalnego sygnału CCh w komórkach transfekowanych m3AChR. AF267 był nieco silniejszy i bardziej efektywny w komórkach transfekowanych mlAChR niż w komórkach transfekowanych m3AChR i dużo mniej aktywny w transfekowanych m5AChR. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu AF267, a w szczególności z jego bardziej aktywnym enancjomerem (-), w hodowlach komórkowych stabilnie transfekowanych, odpowiednio, ml AChR i m3 AChR.

Uwalnianie kwasu arachidonowego (AA) w innym szlaku biochemicznym pobudzane jest przez agonistów mlAChR. Ponieważ ten szlak biochemiczny może być związany z ml AChR białkami G innymi niż w hydrolizie PI, badano również nowe związki w tym teście, z użyciem linii komórkowych stabilnie transfekowanych szczurzym mlAChR. W teście tym, AF263, AF265, AF266 i AF267 (w stężeniu ImM) wykazywały aktywności częściowych agonistów. Wśród enancjomerów A267, aktywnym enancjomerem był AF267B, enancjomer (-), będący pełnym agonistą uwalniania AA w stężeniach 0.1 i 1 mM. AF260 i AF261 wykazywały aktywności pełnych agonistów w porównaniu z 1 mM CCh, na podstawie obserwacji hydrolizy PI w tej samej linii komórkowej. Obserwowano tendencję tych agonistów do wywoływania większego uwalniania AA w porównaniu z 1 mM CCh. Może to wskazywać, że sygnał zależny od CCh podlega odczuleniu w trakcie trwania testu (20 minut w temp. 37°C). Jest możliwe, że odczulenie to jest mniejsze przy zastosowaniu badanych związków. Alternatywnie, pewne związki mogą być bardziej efektywne niż CCh jak agoniści Μ1, tzn. mogąbyć “super-agonistami”. W tym przypadku, nie jest jasne dlaczego ta własność nie była obserwowana w teście hydrolizy PI z użyciem AF260iAF261.

Preinkubacja hodowli komórkowych transfekowanych ml AChR z 1 mM CCh przez 3 godziny, a następnie intensywne wypłukiwanie ligandu (6x1 ml) zmniejszała uwalnianie AA w znacznym stopniu. Podstawowe uwalnianie AA było zakłócone w minimalnym stopniu, co wskazuje, że nie było pozostałości CCh po wypłukiwaniu. Przez porównanie, w tym samym doświadczeniu preinkubacja z 1 mM AF265 i AF 102B zmniejszała odpowiedź uwalniania AA do 1 mM CCh tylko do około połowy oryginalnej odpowiedzi. Przy dłuższych okresach inkubacji, stosowano stężenia rzędu 100 μΜ, ponieważ stężenie 1 mM nie ma fizjologicznego znaczenia dla długotrwałego leczenia. Po preinkubacji ze 100 mM CCh przez 24 godziny odpowiedź AA była niemal całkowicie zniesiona. Porównano zdolność nowych związków do odczulenia sygnału uwalniania AA zależnego od CCh. Nieoczekiwanie, preinkubacja w 100 μΜ AF 265 przez 24 godziny nie powodowała zmniejszenia odpowiedzi AA. Zasługuje to na szczególne podkreślenie w odniesieniu do odkrycia, że w tym teście związek ten jest częściowym agonistą. W przeciwieństwie do powyższego, pobudzenie AF260, AF261 i AF263 (100 μΜ przez 24 godziny) znacząco zmniejszało sygnał uwalniania AA zależny od CCh. Podobnie, preinkubacja z AF102B albo AF267 powodowała względnie małe zakłócenia w następującym po niej sygnale uwalniania AA zależnym od CCh, ponownie wskazując na podobieństwo tych dwóch związków.

Badanie Nr 4: Wpływ neurotroficznopodobny w hodowlach komórkowych.

Aktywacja receptorów Ml przez agonistów może prowadzić do efektów synergicznych z nerwowym czynnikiem wzrostowym (NGF) w pewnych hodowlach komórkowych bogatych w receptor ml, np. PC12 (komórki pheochromocytomy szczurzej) transfekowanej szczurzym m 1 AChR (komórki PC 121Μ1) (Pinkas-Kramarski i in., J. Neurochem. 59:2158-2166,1992).

178 931

Odkryto, że, zgodnie z innym aspektem wynalazku, związki o wzorach Ι-ΙΧ o maksymalnym tempie obrotu PI większym niż 25% mogą synergizować rozrost neurytów powodowany przez NGF. Wśród związków w/g wynalazku można wyróżnić dwie klasy: 1) związki j ak AF260, AF261 i AF263, które pod nieobecność NGF wywołują rozrost neurytów podobny do powodowanego przez CCh; i 2) związki, które w wyraźnym przeciwieństwie do oksotremoryny nie wywohijąrozrostu neurytów albo wywołujątylko minimalne zmiany morfologiczne pod nieobecność NGF. Obie klasy są ważne w leczeniu AD. W drugiej klasie, wzrost aksonów nie zachodziłby w sposób niekontrolowany. Stąd, pożądany kandydat na środek do leczenia AD, przykładowo, wywoływałby neurytogenezę tylko pod ścisłą kontrolą wytwarzanych i uwalnianych miejscowo czynników wzrostowych, jak NGF, mózgowo pochodny czynnik nerwów (BDNF), NT-3 itp. Parę przykładów takiej unikalnej aktywności można odnaleźć w związkach jak AF 160, AF160 (Des), AF185, które są co najmniej tak silne jak AF102B w synergizowaniu wywoływanego przez NGF rozrostu neurytów. Neuryty, szerzące się po połączonym działaniu NGF i nowych związków, były stabilne przez długi okres hodowli. Tak więc, można przypuszczać, że szlak(i) przekaźnictwa sygnału wykorzystywany(e) przez te związki do wywoływania rozrostu neurytów nie sągwałtownie odczulane. Jest to działanie przypominające działanie NGF, który wywiera bardzo stabilny i długotrwały wpływ, wspomagający tworzenie neurytów, na komórki PC 12, jak również w pierwotnych hodowlach neuronów współczulnych.

Należy wspomnieć, jednak, że stare nie traktowane hodowle badanych komórek ulegały spaczeniu i zawierały wiele martwych komórek, które odklejały się od podłoża. Co ciekawe, zjawiska śmierci komórek występowały słabiej w hodowlach uprzednio traktowanych połączeniem nowych związków i NGF. Wiadomo, żeNGF ratuje komórki PC 12 od zaprogramowanej śmierci komórkowej (np. Ruckenstein i in., J. Neurosience, 11: 2552-2563, 1991). Stąd, obserwacje te pokazują, że w podobnych odpowiedziach promujących przeżycie pośredniczą związki według niniejszego wynalazku. Wszystkie te własności dostarczają tym związkom dodatkowych wartości w odniesieniu do leczenia pacjentów z chorobą Alzheimera.

Aktywność neurotroficznopodobna tych agonistów w komórkach nerwowych, która zależna jest również od obecności NGF, wskazuje prawdopodobnie, że związki te wywierają aktywności neurotroficzne w połączeniu z pewnymi sygnałami zależnymi od receptorów NGF. Jednąz możliwości jest, że wpływ ten nie jest bezpośrednio zależny od wywoływanego przez ml AChR zwiększenia uwalniania białek prekursorowych amyloidu (APP), patrz niżej. Jak wiadomo, endogenne APP są niezbędne do normalnego wzrostu komórek fibroblastoidalnych zaś egzogenne APP pobudzają proliferację tych komórek (Saitoh i in., Celi, 58: 615,1989; Mattson i in., TINS 16: 409-414, 1993). Co interesujące, wydzielane postaci APP, wśród innych aktywności, znane sąz regulującego wpływu na rozrost neurytów i promującego wpływu przeżywalność neuronów (Mattson i in., TENS 16: 409-414, 1993). Śmierć komórkowa neuronów w AD prawdopodobnie związana jest ze zmniejszonąprodukcjąi/lub dostępnością neurotrofin, co z kolei hamuje wzrost neuronów cholinergicznych. Jeżeli neurotrofowopodobne zjawiska wywoływane przez agonistów Μ1 zachodząrównież w mózgu może to mieć największe znaczenie kliniczne i w ten sposób może wskazywać na konieczność nowego podejście/a leczniczego w AD.

Badanie Nr 5: Wydzielanie białka prekursorowego amyloidu (APP) w skrawkach mózgu i hodowlach komórkowych.

Wzrasta liczba dowodów, że β-amyloid odpowiada za procesy patologiczne prowadzące do AD. W oparciu o “hipotezę kaskady amyloidowej”, AD powstaje ze spaczonego metabolizmu białek prekursorowych amyloidu (APP) (Mattson i in., TINS 16: 409-414, 1993). Pobudzenie mAChR, zaś w szczególności podtypu m 1, zwiększa wydzielanie APP in vitro (Nitsch i in., Science 258: 304, 1992; Buxbaum i in., PNAS USA 89: 10075, 1992; Lahiri i in., Biochem. Int. 28: 853, 1992). Stąd, zgodnie z innym aspektem wynalazku, związki o wzorach Ι-ΙΧ, zaś w szczególności wykazujące wybiórczą aktywność agonistyczną i zwiększone uwalnianie APP, mogą działać korzystnie nie tylko w leczeniu AD ale również opóźniać postęp a nawet zapobiegać AD.

Sposobem stosowanym do określania wydzielania APP jest technika immunoblotu metoda Western (Nitsch i in., PNAS 90: 5191-5193,1993). Używano przeciwciała monoklonalnego

178 931

22C11 skierowanego przeciwko APP, powszechnie stosowanego do wykrywania APP. Przeciwciało to skierowane jest przeciwko regionowi końca aminowego APP i wykrywa wszystkie dotąd opisane izoformy APP. Nie wykrywa amyloidu ani fragmentów c-końcowych APP wytwarzanych po wydzieleniu APP. Do określania wpływu nowych związków na uwalnianie APP, linie komórkowe transfekowane receptorami ml hodowano w płytkach 12 studzienko wy ch (w niektórych doświadczeniach w płytkach 6 studzienkowych) jak to opisano przez Pinkas-Kramarski i in., (J. Neurochem. 59: 2158,1992). W trakcie trwania testu, ligandów dodawano w postaci roztworów wyjściowych x 100. Doświadczenia przerywano przez przepłukanie płytek dwukrotnie pożywkąbezsurowiczą. Komórki zdrapywano z płytek w zimnym buforze fosforanowym soli fizjologicznej (pH = 7.4; PBS). Po odwirowaniu (10 min. 10000 g) nadsączausuwano, zaś peletkę zawieszano w 0.1 ml zimnego buforu do lizy zawierającego mieszaninę inhibitorów proteaz (50 mM TRIS :HC1 (pH = 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100,0.1 mM PMSF, 5 jednostek/ml aprotyniny, 5 pg/ml pepstatyny A, 5 pg/ml leupeptyny). Peletkę sonikowano przez 5 sekund na minimalnym ustawieniu (sonikator Branson, model 130) i ponownie odwirowywano. Nadsącza (ekstrakty błon komórkowych) przenoszono do czystych probówek. Pobierano próbki do oznaczania białka metodą Lowr/ego.

Do testu APP równe ilości białka (zwykle 100 pg/ścieżkę) rozcieńczano w buforze do próbek zawierającym 0.6% SDS i 1% 2-merkaptoetanolu, i nakładano na 10% miniżel akryloamidowo/SDS (Hoeffer Scientific). Uprzednio zabarwione standardy masy (Sigma) nałożono na żel. Próbki rozdzielono na żelu przy stałym prądzie 25 mAmp/żel w 4°C. Przeniesienie na błonę nitrocelulozową wykonano przy prądzie 100 mAmp przez 16-18 godzin w 4°C. Poniższe etapy wykonano w temperaturze otoczenia. Błony blokowano przez zanurzenie na 1 godzinę w PBS zawierającym 10% odtłuszczonego mleka. Następnie następował etap 3x5 minut w PBS zawierającym 0.5% Tween-20 i 0.1% BSA (PBST). Przeciwciało monoklonalne przeciwko APP, klon nr 22C11 z Boehringer Mannheim (Nr kat. 1285-262) dodano w rozcieńczeniu 1:200(0.25 pg/ml IgG) w buforze PBST na 2 godziny w temperaturze pokojowej lub na 18 godzin w 4°C. W niektórych doświadczeniach, podobne błony próbkowano kontrolnym mysim IgG w podobnym stężeniu. Po tym etapie następowały 3 etapy po 5 minut płukania w PBST. Wtórne owcze przeciwciało przeciw-mysie sprzężone z peroksydazą chrzanową (Jackson Immunochemicals; Nr kat. 115-035-003) zastosowano w rozcieńczeniu 1:2000 w PBST przez 1 godzinę, po czym odpłukano jak wyżej. Barwienie błon wykonano w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut przy użyciu świeżego roztworu 4-chloronaftolu (0.2 mg/ml w TBS zawierającym 16% etanol) i H202 (0.01%). Zabarwione błony fotografowano (film negatywowy Kodak ΤΜΑΧ) i skanowano w skanerze laserowym LKB UltroScan nastawionym na odstępy pionowe 40 mm i szerokość przesuwu poziomego 2.4 mm. Każda ścieżka skanowana była trzykrotnie w nieco innych położeniach; uzyskane dane były średnią z wartości gęstości optycznej.

Metodą tą mierzono ilość APP pozostałego we frakcji błon komórkowych po inkubacji (zwykle przez 24 godziny) z badanymi związkami. Najniższe poziomy APP pozostałego w błonach po inkubacji z agonistami interpretowano jako większą ilość APP wydzielonego przez komórki. Ten typ pomiaru jest właściwy gdy rozważana jest zdolność agonistów muskarynowych do zmniej szania gromadzenia beta-amyloidu w chorobie Alzheimera, ponieważ tylko APP związane z błonami, w przeciwieństwie do wydzielanych postaci APP, mogąpowodować wzrost ilości beta-amyloidu. Do zmierzenia APP wydzielanego do pożywki hodowlanej (“pożywka uwarunkowana”) stężono pożywkę uwarunkowaną, przy użyciu błony do ultrafiltracji Amicon (zatrzymującej cząstki powyżej 30 kDa). Po etapie stężania ilość białka w próbkach badano metodą Bradforda (zestaw Bio-Rad nr 500-0006) z użyciem γ-globuliny wołowej jako standardu. Równe ilości białka nakładano na żel poliakrylamidowy i rozdzielano elektroforetycznie (PAGE). Ilość APP w próbkach analizowano metodą immunoblotu z użyciem przeciwciała monoklonalnego 22C11 przeciwko APP, jak opisano wyżej. Masy cząsteczkowe określono na podstawie zabarwionych standardów (Sigma) na każdym żelu. ..

Korzystne są związki o wzorach Ι-ΙΧ o maksymalnym tempie wydzielania APP w hodowlach komórkowych wyższych niż 125% (ponad poziom podstawowy uznany za 100%).

178 931

Przykłady takiej aktywności mogą być znalezione w AF160 (Des), AF179, AF185, AF263, AF265, AF267.

W celu umożliwienia analizy licznych próbek równocześnie, niektóre badania wykonywano z użyciem techniki dot-blot (umożliwiającej analizę do 96 próbek na jednej błonie). W tej technice, pożywka uwarunkowana z pobudzanych komórek PCI2M1 nakładana jest bezpośrednio na błony nitrocelulozowe pod wpływem podciśnienia (bez uprzedniego stężania). Błony próbkowane sąpodobnie jak w protokole immunoblotu. Szczegółowe badania dotyczące odpowiedzi na stężenie i zależności od czasu analizowano przez rozdział wydzielanego APP przez PAGE. Wyniki tych badań i wyniki uzyskane z badań z zastosowaniem dot-blot pokrywały się. Badania wydzielania APP przez komórki transfekowane ml AChR wykonywano z użyciem nowych związków stosując technikę dot-blot i godzinną inkubację. Niektóre związki jak AF261, AF263 i AF267 są pełnymi agonistami w tym teście.

Odczulanie wydzielania APP zależnego od ml AChR jest silniejsze podczas przedłużonej inkubacji z CCh w porównaniu z częściowymi agonistami będącymi przedmiotem wynalazku. Wyjaśnienie to jest szczególnie atrakcyjne w odniesieniu do danych dotyczących sygnału uwalniania kwasu arachidonowego (AA) w połączeniu z ostatnimi sugestiami wysuniętymi przez Emmerling i in. (BBRC 197: 292-297, 1993), że uwalnianie AA jest związane z pobudzaniem wydzielania APP. Dane wskazują że niektóre z nowych związków mogą być korzystniejsze od bardzo wydajnych agonistów stosowanych klinicznie zmniejszając poziomy APP związanego z komórkąprzez czas dłuższy. Związkami wykazującymi minimalne odczulanie w teście uwalniania AA są AF265 i AF267. Pomiary APP związanego z komórką po inkubacji z AF265 albo AF267 przez 24 godziny (w 100 μΜ) wskazywały zmniejszone poziomy APP, które były wyższe niż z użyciem AF267 i prawie identyczne z wpływem CCh, podczas gdy AF265 wywierał słabszy efekt.

Dane dotyczące wydzielania APP przez komórki stabilnie transfekowane ml AChR jasno wskazują że niektóre z nowych związków mogąpobudzać wydzielanie APP i mogąprzyczyniać się w ten sposób do zmniejszenia akumulacji amyloidu in vivo. Jednakże, by umożliwić ekstrapolację danych z hodowli tkankowych na zjawiska in vivo, powinno być korzystnie wykazane, że związki mogą również pobudzać wydzielanie APP w mózgu. W tym celu badano wydzielanie APP w skrawkach kory mózgu szczurzego. W typowym doświadczeniu skrawki kory mózgu szczura izolowano ze świeżo pobranej tkanki, cięto w dwóch kierunkach przy użyciu Mcllwain Tissue Chopper (300 x 300 μ) i płukano trzykrotnie w nasyconym tlenem buforze Krebsa. Płukane skrawki buforowano w tym roztworze przez 50 minut w 37°C. Po etapie buforowania (niezbędnym w celu usunięcia resztek komórkowych powstałych w wyniku cięcia) bufor zmieniano na bufor Krebsa zawierający 50 μg/ml BSA (jako nośnik białek) i mieszaninę inhibitorów białek (0.1 mM PMSF i 5 μg/ml leupeptyny, pepstatyny i aprotyniny-A). Skrawki rozdzielono do plastikowych probówek i pobudzano przez godzinę w 37°C (dwie godziny w jednym z doświadczeń) przy użyciu określonego stężenia badanego związku. Pod koniec okresu inkubacji, próbki buforu pobierano przez odwirowanie, analizowano na zawartość białka i rozdzielano równe ilości białka i poddawano immunoblotowi z użyciem przeciwciała monoklonalnego 22C11 przeciwko APP, stosując PAGE podobnie jak w doświadczeniach z komórkami hodowanymi. Wydzielane APP pojawiało się jako podwójny prążek, posiadając masę cząsteczkową rzędu 117 kDa (prążek większy) i 90 kDa (prążek mniejszy). Prążki te mogą odpowiadać wydzielanym postaciom APP751 i APP695 (postaciom APP: zawierającej fragment Kunitza i nie zawierającej tego fragmentu).

Alternatywnie, mogą one odpowiadać dojrzałej i niedojrzałej (nie glikozylowanej) postaci wydzielniczej APP751. Obecnie, nie istnieją wystarczające dane dla rozróżnienia między tymi możliwościami, ponieważ używane w tych badaniach przeciwciało monoklonalne 22C11 identyfikuje wszystkie postaci wydzielanego APP. Zarówno CCh jak i AF267, przykładowo (w stężeniu 0.1 mM) zwiększały wydzielanie APP przez skrawki kory mózgu szczura 2-3 krotnie w porównaniu z wydzielaniem APP kontrolnym. Było to wyraźne dla prążków o masie zarówno 117 kDa jak i 90 kDa.

178 931

Obserwacje dotyczące wydzielania APP przez skrawki kory mózgu sąunikalne. Jak dotąd, jedynym opublikowanym przykładem pokazania wydzielania APP przez skrawki kory mózgu in vitro jest praca Nitscha i in. (PNAS USA 90:5191-5193, 1993), donosząca, że pobudzanie elektryczne skrawków hipokampa szczura zwiększa wydzielanie APP. Warte odnotowania jest, że badania te nie obejmują pobudzania agonistami receptora. Niniejsze obserwacje stanowią nowość i innowację, ponieważ sąpierwszym wykazaniem regulacji wydzielania APP w tkance mózgu przez jakiś ligand receptora zaś w szczególności agonistę Ml jak AF267. Za związki te mogą być uważani wszyscy agoniści według wynalazku zdolni do pobudzania wtórnych przekaźników w stopniu PI > 25% kontroli. Owe unikalne obserwacje mogą wskazywać siłę niektórych związków w opóźnianiu składowania peptydów amyloidu A4 w mózgach pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera.

Badanie Nr 6: Fosforylacja białka tau w hodowlach komórkowych transfekowanych ml AChR i w skrawkach kory szczura.

Tau (τ) jest swoistym dla neuronów, związanym z mikrotubulami białkiem powszechnym w aksonach. Tau jest reprezentowane przez kilka izoform, z których wszystkie uzyskane są drogą alternatywnego cięcia i składania pojedynczego genu (ludzkie tau posiada 6 izoform, zawierających od 3 52 do 441 aminokwasów). Działa jako stabilizator mikrotubul aksonów neuronów; jego wiązanie z mikrotubulami regulowane jest przez jego fosforylację w odrębnych miejscach. (Mandelkow i Mandelkow, TIBS 18:480-483,1993). Wiązanie to, z kolei, reguluje wzrost i stabilność aksonów (Baas i in., J. Celi Biol. 115: 1333-1344, 1991; Mattson in., Brain Res, 582: 107-118,1992). Jednym z kluczowych objawów choroby Alzheimera, dodatkowo do odkładania amyloidu w płytkach, jest akumulacja tau i jego pochodnych w kłębuszkach neurofiblamych (NFT). Kłębuszki te stanowiąprawdopodobnie produkt końcowy programowanej śmierci komórek neuronalnych, w pociętej tkance nerwowej. Wiele badań udokumentowało zmiany w fosforylacji białka Tau w tych próbkach mózgu (Vincent i Davies, PNAS 87 : 4840-4844, 1990; Vincent i Davies, Brain Res. 531:127-135,1990). Było więc sugerowane, że zmiany w delikatnej równowadze pomiędzy swoistymi dla tau kinazami/fosfatazami mogą być związane z procesem śmierci komórki neuronalnej w AD, i stąd korekcja prawdopodobnej nierównowagi może mieć potencjalną leczniczą wartość.

Nawiązując, badano poziom fosforylacji białek tau w hodowlach komórkowych stabilnie transfekowanych m 1 AChR po stymulacji CCh lub badanym związkiem. Wykonano to przy użyciu przeciwciała monoklonalnego tau-1, które jak wykazano, rozpoznaje wyłącznie defosforylowaną ale nie fosforylowaną izoformę białka tau (Mandelkow i Mandelkow, TIBS 18: 480-483, 1993). Po inkubacji komórek albo skrawków kory szczura z agonistami przez różne okresy czasu, komórki lub skrawki płukano trzykrotnie w PBS, zdrapywano w PBS zawierającym 0.2 mM EDTA i odwirowywano przez 5 minut przy 10000 g. Peletkę błon badano na zawartość białka i równe ilości białka nakładano na PAGE w celu wykonania immunoblotu z przeciwciałem tau-1. Pomiar immunoreaktywności wykonywano podobnie jak w badaniach nad APP ( z użyciem video-densytometrii), z tym wyjątkiem, że wtórne przeciwciało sprzężone z peroksydazą wykrywane było przy użyciu techniki Enhanced Chemi-Luminiscence (ECL) (zestaw RPN-2109; Amersham, UK).

Warte odnotowania jest, że zarówno CCh jak i badane związki zwiększały immunoreaktywność z tau-1 a zwiększenie to było całkowicie blokowane przez atropinę. Uderzające zwiększenie immunoreaktywności z tau-1 zależne od CCh obserwowano w komórkach hodowanych z NGF (50 ng/ml) przez trzy dni przed stymulacją Ugandami muskarynowymi. Podobne doświadczenia z użyciem różnych stężeń CCh łub badanych agonistów wskazywały, że zwiększenie immunoreaktywności z tau-1 wymagało względnie wysokiego stężenia ligandów (10-100 pm).

Mierzono również fosforylację tau w skrawkach kory mózgowej szczura po stymulacji CCh w porównaniu z badanymi związkami. Nieoczekiwanie, ponownie agoniści muskarynowi zdolni byli do zmniejszenia fosforylacji tau.

Tak więc, agoniści muskarynowi zdolni są do zmniejszania fosforylacji tau przez aktywację transfekowanych ml AChR w hodowlach komórkowych i, co bardziej istotne, w skrawkach

178 931 mózgu. Również wpływ tych agonistów wydawał się być długotrwały, będąc ewidentny nawet po inkubacji komórek z ligandem w stężeniu 100 μΜ przez przynajmniej trzy dni. Obserwacje te mogą wskazywać, że wybiórczy agoniści Ml zdolni są do zmniejszania fosforylacji tau.

Obserwacje te stanowią nowość, ponieważ według najlepszej wiedzy, nie wykazano dotąd związku między niedoborem cholinergicznym w chorobie Alzheimera i akumulacją fosforylowanych izoform białka tau w kłębkach neurofibrylamych charakterystycznych dla chorego mózgu. Powyższe obserwacje mogąmieć znaczenie w spowolnieniu postępów choroby Alzheimera z użyciem agonistów Ml.

Agoniści Ml mogą wykazywać szereg efektów. Tak więc, nieoczekiwanie, mechanizm działania agonistów ml jestbardziej złożony niż pierwotnie zakładano. Wykazano związek poniższych aktywności z agonistami ml in vitro (a prawdopodobnie in vivo):

1. Wiązanie z receptorami ml i ich aktywacją;

2. Wybiórcza aktywacja pewnych białek G (tzn. Gq ale nie Gs);

3. Wpływ neurotroficznopodobny i synergistyczny z NGF;

4. Wydzielanie białka prekursorowego amyloidu (APP) i zmniejszenie β-amyloidu;

5. Zwiększenie proporcji defosforylowanych białek τ;

6. Wpływ NGF-podobny.

Wszystkie te efekty mogą być wzajemnie powiązane modelem, w którym aktywacja ml AChR prowadzi do uruchomienia kaskady pokrewnych zjawisk. Ten złożony mechanizm, leżący u podstaw aktywności agonistycznej ml, może być powiązany w ogólny scenariusz wyjaśniający niewłaściwą obróbkę APP, niedobór aktywności NGF-podobnej i deficyt cholinergiczny w SDAT i AD. W konsekwencji, agoniści ml, jak opisani w niniejszym wynalazku, mogą mieć wartość w zapobieganiu tworzenia amyloidu przez wybiórcze i pozytywne promowanie szlaku sekretazy i mogą ułatwiać działanie neurotrofin w AD dzięki swemu synergistycznemu działaniu z NGF. Stąd, agoniści ml mogą być użyteczni w strategii substytucji cholinergicznej i opóźnianiu postępów AD. Związki te, będąc agonistami m 1 są (w przeciwieństwie do peptydów) cząsteczkami względnie małymi, wykazującymi wpływ neurotroficznopodobny i promująuwaInianie i prawidłową obróbkę APP, oraz zwiększają ilość defosforylowanego (albo zmniejszają ilość fosforylowanego) białka tau. Stąd, traktowanie komórek agonistami ml może prawdopodobnie zmienić obróbkę APP z amyloidogennego szlaku lizosomalnego na normalny szlak wy dzielni czy, a w konsekwencji terapia cholinergiczna AD może mieć dłuższy wpływ na odkładanie β-amyloidu (patrz również, Lahiri i in., Biochem. Int. 28: 853-860, 1992).

Ponadto, ponieważ niektórzy z agonistów, według wynalazku, wykazują wpływ NGF-podobny w sposób kontrolowany a zwłaszcza w obecności NGF, związki te mogą posiadać istotną wartość w dalszym leczeniu AD/SDAT. W ten sposób rozrost neurytów może być lepiej kontrolowany. Ponadto, związki te wykazują długotrwały dobroczynny wpływ na rozrost neurytów w obecności NGF. Można więc uważać, że możliwe w przyszłości leczenie pacj entów z AD/SDAT przy użyciu czynników wzrostowych jak NGF może wymagać rzadszego podawania czynnika wzrostowego, gdy podawany będzie z agonistąml. Warte wspomnienia jest, że podawanie NGF do mózgu stanowi najpoważniejszy problem ponieważ nie przekracza on bariery krew/mózg. Jeżeli problem ten zostanie rozwiązany (np. przy użyciu specjalnych układów doprowadzających), substancja NGF-podobna wciąż wymagać będzie powtarzanego podawania. W odniesieniu do powyższego, agoniści ml mogą zmniejszać liczbę podań NGF, ponieważ przedłużają wpływ NGF (przynajmniej in vitro). Co ciekawe, próby kliniczne z NGF (i.cv.) u dwóch pacjentów z AD wykazały poważne efekty niepożądane (silny ból, dezorientacja, zmniejszenie stopnia sprawności intelektualnej) (3rd Springfield Symposium on Alzheimefs Disease, Maj 11-15,1994, Springfield, II., USA). Zastosowanie agonistów Ml, jak opisane w wynalazku, którzy synergizująz NGF może mieć olbrzymie znaczenie w zmniejszaniu efektów ubocznych związanych ze stosowaniem NGF u ludzi, ponieważ umożliwia zmniejszenie stosowanych dawek NGF.

Badanie Nr 7: Profile farmakologiczne i toksykologiczne.

178 931

Badanie przeprowadzono obserwując zwierzęta po podaniu dożylnym (i.v.) lub doustnym (myszy) albo doustnym (dożołądkowo szczurom) 3-6 dawek o różnej wielkości każdej z substancji. Wyniki podsumowano w tabeli 5.

W różnych przedziałach czasu po podaniu (10,20,30,45,60,120,240 minut i 24 godziny) zwierzęta poddawano szczegółowej obserwacji zmian zachowania, odruchów i efektów autonomicznych. Śmiertelność rejestrowano 24 godziny po podaniu badanych związków. Temperaturę ciała mierzono szczurom przy użyciu urządzenia Tele-Thermometer (model 46 TUC). Parametry farmakologiczne i toksykologiczne obejmowały: ślinienie, zaczerwienienie naokoło pyska i nosa, chromodakriorea, uspokojenie polekowe, niezborność, sinica, drżenia, drgawki, hipotermia, tężec tylny, duszność, biegunka, kąsanie, stroszenie wąsów, śmiertelność, zmiana średnicy źrenicy, zachowanie na karuzeli, obniżona lub nadmierna aktywność i wydawanie dźwięków. Niektóre z badanych związków nie były toksyczne do 500 mg/kg (p.o. myszy i szczury).

Tabela 5. Farmakologiczne i toksokologiczne profile dla myszy lub szczurów

Zw. AF-

Dawka *

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 '

12

13

14

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

133

50v

0/5

myszy

100v

3/5

200 v

5/5

400

1/5

134

10v

0/5

myszy

25 v

0/5

50v

0/5

100v

4/5

2/5

3/5

100

0/5

200

1/5

0/5

151 (S)

50

4/4

4/4

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

100

4/4

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

3/4

0/4

0/4

0/4

200

4/4

4/4

4/4

2/4

1/4

1/4

0/4

0/4

1/4

4/4

0/4

0/4

1/4

500

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

0/4

2/4

4/4

0/4

0/4

2/4

160

8

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

NT

0/4

0/4

NT

NT

0/4

myszy

16

0/4

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

' 0/4

1/4

0/4

31

2/4

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

63

4/4

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

125

3/4

4/4

4/4

0/4

0/4

1/4

0/4

0/4

2/4

0/4

250

4/4

4/4

4/4

4/4

0/4

4/4

0/4

0/4

3/4

0/4

500

4/4

4/4

4/4

4/4

0/4

4/4

0/4

0/4

3/4

0/4

szczury

10

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

25

0/4

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

0/4

4/4

0/4

0/4

50

4/4

4/4

0/4

1/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

4/4

. 4/4

0/4

0/4

100

4/4

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

1/4'·

4/4

4/4

0/4

0/4

200

4/4

4/4

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

4/4

2/4

4/4

4/4

2/4

0/4

500

4/4

4/4

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

4/4

4/4

4/4

0/4

178 931 cd, tabeli 5

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

160(Des)

63

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

szczury

125

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

1/4

0/4

0/4

0/4

250

2/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

1/4

0/4

0/4

0/4

500

3/4

0/4

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

3/4

0/4

1/4

0/4

myszy

120

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

240

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

1/4

0/4

500

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

2/4

0/4

1000

2/4

0/4

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

3/4

0/4

3/4

0/4

* mg/kg, podawane doustnie, jeśli nie stwierdzono inaczej V podawane dożylnie

T a b e la 5 (cd.)

Zw. AF-

Dawka *

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

163

25

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

NT

0/4

0/4

0/4

NT

NT

0/4

myszy

50

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

100

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

200

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

400

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

szczury

50

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

NT

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

100

2/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

200

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

400

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

177

31

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

4/4

0/4

0/4

0/4

NT

NT

0/4

myszy

62

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

4/4

0/4

0/4

0/4

1/4

125

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

4/4

2/4

0/4

0/4

0/4

4/4

250

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

4/4

1/4

0/4

0/4

0/4

4/4

500

4/4

0/4

4/4

4/4

0/4

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

4/4

178

30

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

NT

0/4

0/4

0/4

NT

NT

0/4

myszy

60

1/4

2/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

144

3/4

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

3/4

0/4

288

4/4

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

3/4

2/4

0/4

500

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

2/4

0/4

4/4

0/4

szczury

63

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

NT

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

125

4/4

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

3/4

0/4

4/4

4/4

0/4

0/4

250

3/4

3/4

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

3/4

0/4

4/4

3/4

0/4

0/4

500

4/4

3/4

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

1/4

4/4

4/4

0/4

0/4

180

63

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

NT

0/4

0/4

0/4

NT

NT

0/4

myszy

125

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

2/4

0/4

0/4

0/4

250

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

3/4.

0/4

0/4

0/4

500

4/4

3/4

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

0/4

0/4

178 931 cd. tabeli 5

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

szczury

31

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

NT

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

62

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

125

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

250

2/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

Tabela 5 (cd.)

Zw. AF-

Dawka *

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

185

31.3

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

myszy

62.5

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

3//4

0/4

0/4

0/4

125

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

2/4

4/4

0/4

0/4

0/4

250

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

0/4

0/4

500

3/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

szczury

62.5

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

125

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

250

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

500

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

261

3.75

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

szczury

7.52

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

15.6

3/4

4/4

4/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

3/4

0/4

0/4

0/4

62.5

4/4

4/4

4/4

0/4

4/4

0/4

4/4

0/4

3/4

3/4

3/4

0/4

250

4/4

4/4

4/4

0/4

4/4

4/4

4/4

0/4

1/4

4/4

4/4

4/4

265

125

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

szczu-ry

250

1/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

2/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

500

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

my-

125

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

szy

250

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

2/4

2/4

0/4

0/4

0/4

500

2/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

4/4

4/4

0/4

4/4

0/4

Klucz do tabeli 5:

= ślinienie = chromodakriorea (szczury) lub łzawienie (myszy) = uspokojenie = niezborność = sinica = drżenia = drgawki = hipotermia = rozszerzenie źrenic = duszność = biegunka = kąsanie = straszenie wąsów = śmiertelność

Dyskusja

AF160

AF 160 jest względnie silnym agonistąmuskarynowym o działaniu raczej ośrodkowym niż obwodowym (np. hipotermia a ślinienie), i pięciokrotnie mniej toksycznym w porównaniu z

178 931

AF102B. Znaczącym odkryciem jest, że związek ten nie wywoływał drżeń u szczurów nawet w najwyższej badanej dawce (500 mg/kg p.o.) i niewielkie drżenie u myszy w dawce większej niż 125 mg/kg, p.o. Podobny wzorzec obserwowany był z użyciem metylowego analogu AF160 AF178, gdzie nie obserwowano drżeń zarówno u myszy jak i u szczurów w dawkach do 500 mg/kg p.o. Myszy były wrażliwsze na ten związek niż szczury, ponieważ ośrodkowe i obwodowe efekty uboczne występowały u nich przy niższych dawkach.

Jak stwierdzono, dla szczurów AF160 był bardzo silnym agonistą. Oznaki tego obserwowano już w dawkach 25 mg/kg. Dla parametrów hipotermii i kąsania uzyskano wartości ED₅₀. Nasilenie i ciężkość objawów była zależna od dawki. Efekt hipotermiczny był długotrwały, dłuższy niż 4 godziny.

Dla AF 160 charakterystyczne były cztery cechy:

1. Prawdopodobnie związek jest bardziej aktywny w ośrodkowym układzie nerwowym niż w obwodowym układzie nerwowym (np. hipotermia występowała w niższych dawkach niż ślinienie).

2. Nie obserwowano wybiórczości w stosunku do ośrodkowego układu nerwowego ponieważ nie wszystkie objawy ze strony OUN były obserwowane (np. hipotermia a brak drżeń).

3. Czas trwania obserwowanych objawów był długi.

4. Nie obserwowano śmiertelności u myszy i szczurów w najwyższej dawce 500 mg/kg.

AF169 (Des)

U szczurów ślinienie, hipotermia i biegunka obserwowane były u jednego spośród czterech zwierząt w 45 minut po podaniu dawki 125 mg/kg. Po zwiększeniu dawki do 500 mg/kg liczba zwierząt na grupę przejawiających powyższe objawy zwiększyła się i wyraźne stało się stroszenie wąsów i uspokojenie polekowe. Efekt hipotermiczny nie był zależny od dawki. Związek ten nie powodował innych efektów ośrodkowych ani autonomicznych. Związek jest względnie nieaktywny pod względem cholinergicznych efektów ubocznych. W przypadku AF160 (Des) efekty uboczne uzyskano u szczurów przy dawce >246 mg/kg, p.o.

U myszy łzawienie, biegunka i rozszerzenie źrenic obserwowane były po podaniu 240 mg/kg AF160 (Des). W wyższych dawkach do 1000 mg/kg pojawiały się dodatkowo ślinienie, uspokojenie i hipotermia. Nasilenie i ciężkość większości objawów (z wyjątkiem łzawienia) były zależne od dawki. Nie obserwowano śmiertelności nawet w najwyższej dawce 1000 mg/kg. Miejscowe podanie 1 mg (ilość progowa) AF160 (Des) do oka powodowało rozszerzenie źrenicy po 15 minutach. W przeciwieństwie, atropina zastosowana jako lek odniesienia, z powodu jej znanego miejscowego działania midriatycznego, powodowała rozszerzenie źrenicy po 45 minutach w dawce 40 pg. Ten wynik pokazuje jasno że rozszerzenie źrenic wywołane przez AF160 (Des) ma charakter ośrodkowy.

AF163

U szczurów w dawkach między 50 a 400 mg/kg jedynymi efektami wywoływanymi przez ten związek były ślinienie i zaczerwienienie wokół nosa i pyska. Efekty te występowały wcześnie (10 minut) i były krótkotrwałe (20 minut). Podczas gdy liczba zwierząt wykazujących ślinienie była zależna od dawki, zaczerwienienie wokół nosa stwierdzono tylko u jednego zwierzęcia w dawce 100 mg/kg. Podsumowując, po podawaniu tego związku szczurom obserwowano wyłącznie efekty autonomiczne.

U myszy, poza wokalizacjąobserwowanąujednego zwierzęcia po najwyższej badanej dawce (400 mg/kg), związek ten pozbawiony był jakichkolwiek objawów niepożądanych. Nie stwierdzono efektów ubocznych ośrodkowych i obwodowych związanych z użyciem AF 163 u myszy, aż do najwyższych badanych dawek (400 mg/kg p.o.). AF 163 może być uważany za prolek AF 160 w podobny sposób jak analog ditio-RS86 (patrz Bolliger i in., w: Alzheimeis and Parkinson^ Disease; Strategies in R&D, wyd. Fischer i in., Plenum Press, str. 585, 1986).

AF177

U myszy, w 10 minut po podaniu 31 mg/kg obserwowano hipotermię, obniżoną aktywność i drżenia. Po zwiększeniu dawki do 62 mg/kg liczba objawów zwiększyła się. Uspokojenie, prężenie ogona i spadanie z karuzeli obserwowano w 20 minut po podaniu u wszystkich myszy w

178 931 grupie. Jedna z myszy padła po 30 minutach od podania. Wraz ze wzrostem dawki do 125,250 i 500 mg/kg obserwowano ślinienie, drgawki i śmierć u wszystkich myszy w grupie, ale wystąpienie i trwanie objawów stawało się coraz cięższe. Wyliczone wartości ED₅₀ wskazywały, że AF177 wywiera głównie wpływ ośrodkowy. AF177 może być uważany za prolek dla silnych i działających ośrodkowo agonistów muskarynowych.

AF178

U myszy obserwowano do godziny od podania 60 mg/kg zmniejszenie aktywności ruchowej, ślinienie, łzawienie i biegunkę. Zwiększenie dawki do 500 mg/kg powodowało dodatkowe objawy jak duszność, spadek wydolności na karuzeli, drżenia i rozszerzenie źrenic. Nasilenie i ciężkość większości efektów było zależne od dawki. Generalnie, zwiększanie dawki przedłużało czas działania. Przykładowo, biegunka, drżenia, rozszerzenie źrenic itd. trwały około 4 godzin. Warto nadmienić, że w dawce 500 mg/kg jedno ze zwierząt przejawiało palpitacje w 20 minut po podaniu trwającą 10 minut. Nawet w dawce 500 mg/ml wywołującej silne efekty toksykologiczne nie obserwowano śmiertelności. Stąd, oceniana LD₅₀ była w dawce wyższej niż 500 mg/kg.

U szczurów, ślinienie było jedynym objawem niepożądanym po podaniu 62.5 mg/kg AF178. Zwiększanie dawki do 125 mg/kg spowodowało więcej objawówjak chromodakriorea, hipotermia, biegunka i kąsanie. Nasilenie i ciężkość tych objawów zwiększała się ze wzrostem dawki. Duszność obserwowano tylko u jednego zwierzęcia w dawce 500 mg/kg, 5 minut po wstrzyknięciu. Związek może mieć względnie szeroki margines bezpieczeństwa.

AF180

U szczurów, ślinienie było jedynym objawem wywołanym podaniem dawki 125 mg/kg AF 180. Stało się ono widoczne w 20 minut po podaniu i trwało 40 minut. Dalsze zwiększanie dawki do 500 mg/kg przedłużało czas trwania ślinienia do 230 minut. W tej dawce u trzech zwierząt obserwowano hipotermię w 15 do 20 minut po podaniu. Nie obserwowano innych objawów ośrodkowych czy autonomicznych.

U myszy, hipotermię i rozszerzenie źrenic obserwowano 20 minut po podaniu 125 mg/kg. Po zwiększeniu dawki do 500 mg/kg liczba zwierząt w grupie wykazujących te objawy zwiększyła się i dołączyło się ślinienie, łzawienie i uspokojenie. Ponadto, czas trwania objawów był dłuższy niż 1.5 godziny po podaniu 500 mg/kg. Nie obserwowano innych objawów ośrodkowych i autonomicznych wywoływanych przez ten związek.

AF185

U myszy, rozszerzenie źrenic obserwowano po podaniu 62· 5 mg/kg AF 185. W dawkach do 500 mg/kg pojawiły się dodatkowe objawy jak ślinienie i hipotermia. Nie obserwowano śmiertelności nawet w najwyższych dawkach (500 mg/kg).

U szczurów, z wyjątkiem zaczerwienienia dookoła nosa i pyska, obserwowanego u jednego zwierzęcia w najwyższej dawce (500 mg/kg) związek ten pozbawiony był innych efektów niekorzystnych. Uważa się, że AF185 jest bardzo bezpiecznym związkiem.

AF261

U szczurów, jednym objawem powodowanym przez podanie 7.5 mg/kg AF261 była hipotermia (typowy efekt ze strony ośrodkowego układu nerwowego). Stał się on widoczny w 1G minut po podaniu i trwało 50 minut. Po zwiększeniu dawki do 15.6 mg/kg po 10 minutach poj awiły się dodatkowe objawy jak ślinienie, chromakriorea, obniżona aktywność, niezborność i biegunka. W dawkach wyższych do 250 mg/kg pojawiły się dodatkowe objawy jak zaczerwienienie wokół nosa i pyska, drżenia, drgawki, tężec tylny, kąsanie i stroszenie wąsów. Objawy te były widoczne 5-10 minut po podaniu. Ciężkość i nasilenie większości objawów były zależne od dawki. Cztery spośród czterech szczurów padło w 45 minut po podaniu najwyższej badanej dawki (250 mg/kg).

AF265

U szczurów, jedynym objawem wywołanym przez podanie dawki 250 mg/kg AF265 była hipotermia (typowy efekt ze strony ośrodkowego układu nerwowego). Stał się on widoczny w 10 minut po podaniu i trwał 110 minut. Nie obserwowano innych efektów ośrodkowych i autonomicznych po podaniu tego związku. Stąd związek ten jest wart odnotowania ze względu na swe wyłącznie ośrodkowe działanie.

178 931

Badanie Nr 8: Wpływ AF 134 na szczury naiwne.

Badano wpływ AF134 na pamięć i zdolność do uczenia się szczurów naiwnych w teście biernego unikania. Zasada behawioralna i sprzęt opisane zostały w Fischer i in., Neurosci. Lett. 102: 325 (1989). Czterem grupom (20 szczurów w grupie) naiwnych samców szczepu Sprague-Dawley, 200-300 g, w wieku 3-4 miesięcy (Charles River Breeding, UK) podawano jedną z następujących dawek AF 134: 1,5, 10 mg/kg dootrzewnowe (i.p.) oraz roztwór fizjologiczny soli (1 ml/kg, i.p.).

U szczurów którym podawano AF134 nie zaobserwowano znaczących różnic pomiędzy zachowaniem latencji u szczurów, którym podawano lek na 30 minut przed wstrząsem a szczurami, którym lek podawano w 60 minut po wstrząsie.

W innym doświadczeniu porównywano wpływ AF134 ze skopolaminą (związkiem antyrnuskarynowym) w teście z użyciem radialnego labiryntu o ośmiu korytarzach (zasada behawioralna i sprzęt opisano w Fischer i in., Neurosci. Lett. 102:325 (1989)). Grupie 14 naiwnych szczurów podawano skopolaminę (0.2 mg/kg, i.p.) lub sól fizjologiczną (1 ml/kg, i.p.) 20 minut przed wpuszczeniem do labiryntu. We wszystkich odnogach labiryntu znajdowała się nagroda. Każdy ze szczurów otrzymywał leczenie z trzydniowymi odstępami pomiędzy podaniami. (Dziesięć dni uczenia poprzedzało dziesięć dni badania). Ten sam eksperyment na tych samych szczurach powtórzono z użyciem AF134 (5 mg/kg i.p.) i roztworu fizjologicznego soli (1 ml/kg i.p.). Skopolamina wykazała, jak oczekiwano, typowy antycholinergiczny efekt “amnestyczny” w zastosowanej dawce. Jednakże AF134 nie wpłynął na zachowanie szczurów.

AF134, który wykazuje działanie antagonistyczne w stosunku do receptorów muskarynowych Ml (w oparciu o badanie wiązania) i M3 (w oparciu o badanie na preparacie jelita świnki morskiej) nie powodował zaburzeń w procesie poznawczym, więc może być użyteczny w leczeniu zaburzeń napędu, choroby Parkinsona, mieszanej choroby Parkinsona i Alzheimera, stanów maniakalnodepresyjnych, urazów głowy u ludzi oraz całej gamy innych chorób obwodowych jak leczenie ostrego kataru, wrzodów trawiennych i astmy.

Badanie Nr 9: Badanie behawioralne na modelach zwierzęcych

AF160 i AF102B - Labirynt o korytarzach radialnych.

Badano potencjalny dobroczynny wpływ dawek AF 160 (3 i 5 mg/kg, p.o.) i AF 102B (3 mg/kg, p.o.) w odwracaniu ubytków pamięci u szczurów traktowanych AF64A (1.5 nmol/2 μΐ/stronę). Ten model zwierzęcy imituje do pewnego stopnia niedoczynność cholinergicznąw SDAT. (Fischer i in., J. Pharmacol. Expl. Therap. 257: 392-403, 1991). Do badania użyto 80 samców szczurów SpragueDawley, 4-6-miesięcznych (340-580 g). Odstęp czasu pomiędzy operacją a badaniem behawioralnym wynosił 2-3 miesiące. Tydzień przed rozpoczęciem badania behawioralnego szczury przeniesiono do pojedynczych klatek i ograniczano pożywienie dopóki nie osiągnęły ok. 85% swej zwykłej wagi. Następnie szczury otrzymywały 5-6 sztuk Altromin (15 g) dziennie w celu utrzymania wagi na stałym poziomie. Szczury miały nieograniczony dostęp do wody. Pomieszczenie oświetlano 12 godzin dziennie (6:00-18:00) zaś badania behawioralne przeprowadzano rano.

Badanie Behawioralne szczurów, którym podano AF64A i 40, którym podano sól, podzielono losowo na podgrupy, które otrzymywały AF160 3 mg/kg, AF160 5 mg/kg, ĄF102B 3 mg/kg (10 ml/kg p.o.) i DDW. Podczas dwóch pierwszych dni badania szczury uczono według procedury wyboru 8 spośród 8 korytarzy z przynętą, w celu oswojenia ich z labiryntem i tabletkami stanowiącymi przynętę (dokładność 45 mg). Na tym etapie, szczury umieszczano w centralnym punkcie labiryntu i umożliwiano swobodny dostęp do wszystkich odnóg, w których znajdowały się nagrody. Każdą sesję przerywano po zebraniu wszystkich ośmiu tabletek lub po upływie 15 minut. Podczas trzeciego i czwartego dnia treningu tabletki umieszczano wyłącznie na końcu odnogi. Pozostałe procedury były takie same jak w treningu wstępnym. Badanie przeprowadzono w drugim tygodniu doświadczenia. W tym czasie AF160, AF102B i DDW (jako kontrola) podawane były raz dziennie, przez pięć dni, 60 minut przed badaniem.

178 931

Analiza danych

Rejestrowany był każdy ruch w labiryncie, czas trwania jak również prawidłowe i błędne odpowiedzi. W celu określenia wpływu AF160 czy AF102B w trakcie badania w porównaniu z okresem uczenia uznanymjako wydolność podstawowa, zastosowano 3-odnogowy test ANO VA (2x4x2) z powtórzoną zmienną (bloki dni uczenia albo badania) i nie powtarzanymi zmiennymi wstrzknięcie AF64A/soli fizjologicznej albo DDW) i leczenie różnymi dawkami AF160 i AF102B albo DDW). Porównanie post-hoc wykonano przy użyciu prostych funkcji wzmacniających.

Wyniki

Stwierdzono istotną zależność, w odniesieniu do prawidłowego wyboru spośród 8 korytarzy odwiedzanych, w układzie grupa x leczenie x tydzień [F(2/48)=3.95; P <0.025], Bardziej szczegółowo, podczas obu okresów uczenia i podawania leków szczury, którym podano AF64A dokonywały znacząco mniej prawidłowych wyborów w porównaniu ze szczurami, którym podano sól (P <0.001). Oba leki, AF102B (3 mg/kg) i AF 160 (3 mg/kg) polepszały wydajność szczurów, którym podawano AF64A podczas drugiego tygodnia w porównaniu z dniami uczenia (odpowiednio, P<0,001). W trakcie drugiego tygodnia obie grupy, AF160 (3 mg/kg) i AF102B (3 mg/kg) osiągnęły ten sam poziom wydajności, który był znacząco wyższy niż szczurów, które otrzymały AF64A i leczone były wodą (P <0.05). AF160 5 mg/kg nie wywierał istotnego wpływu na ten parametr. W porównaniu ze szczurami otrzymującymi sól, wydajność szczurów, którym podawano wodę poprawiła się (5%) podczas drugiego tygodnia w porównaniu z pierwszym tygodniem (P<0.01). Podobnie poprawę 7,5% stwierdzono u szczurów leczonych AF 160 (3 mg/kg) (P <0.001). AF102B (3 mg/kg) nie miał wpływu na ten parametr u szczurów którym podano sól fizjologiczną

Pod względem całkowitej ilości błędów stwierdzono istotną zależność w układzie grupa x leczenie x tydzień [F(3/64)=3.49; P<0.025], W obu tygodniach liczba błędów u szczurów, które otrzymały AF64A była znacząco wyższa niż u szczurów, które otrzymały sól (P <0.001). Liczba błędów we wszystkich czterech grupach szczurów po AF64A, znacząco się zmniejszyła w drugim tygodniu w porównaniu z pierwszym: AF64A+woda - 20% (P < 0.01), AF64A+AF160 3 mg/kg -16% (P<0.001), AF64A+AF160 5 mg/kg -15% (P<0.02) i AF64A+AF102B 3 mg/kg 16% (P <0.001). Jakkolwiek, wszystkie cztery grupy poprawiły wydajność tylko grupa otrzymująca AF102B 3 mg/kg miała wydajność wyższą niż grupa AF64A+woda. Wśród szczurów, które otrzymały sól fizjologiczną grupy AF 160 3 i 5 mg/kg poprawiły swą wydajność w drugim tygodniu w porównaniu z pierwszym (odpowiednio P<0.01iP<0.001.AFl 02B 3 mg/kg zmniej szył wydajność i grupa ta popełniała więcej błędów w drugim tygodniu w porównaniu z pierwszym (P< 0.001).

Pod względem całkowitego czasu, znaleziono znaczącą zależność w układzie grupa x leczenie x tydzień [F(2/48) = 3.29; P<0.05]. Stwierdzono poprawę w podgrupach, które otrzymały AF64Azwyjątkiem AF64A+AF160 5 mg/kg: AF64A+woda - 31% (P<0.01), AF64A+ AF160 3 mg/kg - 47% (P < 0.001) i AF64A+AF102B 3 mg/kg - 21% (P<0.01). Wśród szczurów, które otrzymały sól fizjologiczną znaczący wpływ stwierdzono w grupach sól+woda - 54% (P <0.001) i SÓ1+AF160 3 mg/kg -37% (P<0.001). AF102B nie miał wpływu na szczury, którym podano sól, być może z powodu “efektu nock-out”. AF 160 5 mg/kg nie wpływał znacząco na szczury, którym podano sól fizjologicznąjakkolwiek obserwowano tendencję do poprawy.

Wnioski

1. Szczury, którym podano AF64A (1.5 nmol/2 μΐ/stronę) wykazywały znaczne upośledzenie w parametrze trafnego wyboru, liczby błędów i całkowitego czasu w porównaniu ze szczurami, którym podano sól fizjologiczną.

2. AF160 (3 mg/kg) znacząco poprawiał wydajność szczurów, którym podano AF64A (w porównaniu z leczeniem placebo) pod względem parametrów trafnego wyboru i czasu. Dawka wyższa (5 mg/kg) była efektywna tylko w odniesieniu do parametru liczby błędów w porównaniu z poziomem podstawowym (ale nie z placebo).

AF160 (Des) - zadanie labiryntu Morris Water (MWM)

178 931

Celem badania było określenie zdolności badanego związku AF160(Des) do odwrócenia upośledzenia funkcji poznawczych szczurów, którym podano AF64A w zadaniu MWM według metody opisanej przez Fischer i in., J. Pharmacol. Exptl. Therap. 257: 392-403,1991 AFlóO(Des) badano w dwóch dawkach 1 i 3 mg/kg p.o. 38 szczurów, którym podano AF64A (3 nmol/2 μΐ/stronę) i 402 szczury nastrzyknięte soląpodzielono losowo do 4 podgrup otrzymujących różne dawki AF160(Des) (1 i 3 mg/kg p.o.) labo DDW (10 ml/kg p.o.). Lek podawano raz dziennie przez 5 dni, 60 minut przed badaniem.

Nie obserwowano żadnych stałych objawów ubocznych podczas badania behawioralnego. Uzyskano następujące wyniki:

1. Wstrzyknięcie AF64A (3 nmole/2 μΐ/stronę) powodowało znaczące upośledzenie wydajności, na co wskazywały parametry opóźnienia i długości drogi.

2. AF160(Des) 3 mg/kg poprawiał wydajność u zarówno nastrzykniętych AF64A jak i nastrzykniętych solą w trzecim bloku uczenia.

Pozytywny wpływ sugeruje zastosowanie różnych dawek tego związku w przyszłości, w celu zbadania możliwego dobroczynnego wpływu na uczenie się i ubytki pamięci.

AF185 - Bierne unikanie (PA)

AF64A wstrzyknięto obustronnie (3 nmole/2 μΐ/stronę, i.cv.) w celu stworzenia modelu zwierzęcego (Fischer i in., J. Pharmacol. ExptL Therap. 257:392-403,1991). Cztery tygodnie po operacji szczury, którym wstrzyknięto AF64 A albo sól fizjologiczną podzielono losowo do czterech podgrup po 10-11 szczurów; trzy grupy otrzymywały leczenie różnymi dawkami AF185 (1, 5 i 10 mg/kg, p.o.) i jedna grupa otrzymywała DDW (10 ml/kg). AF185 podawano bezpośrednio po wstrząsie i badano szczury w 72 godziny później. Szczegóły doświadczenia można znaleźć w Fischer i in., J. Pharmacol. Exptl. Therap. 257: 392-403, 1991.

Wyniki

Pomiary latencji początkowej i zachowanej analizowano osobno dwuodnogowym testem ANOVA (2x4); AF64A/sól fizjologiczna w stosunku do dawek AF185 albo wody.

W odniesieniu do latencji początkowej nie stwierdzono znaczących różnic między grupami.

Pod względem latencji zachowanej znaleziono zależność pomiędzy grupami a leczeniem [F(3/75)=22.31; P < 0.001). Proste funkcje wzmocnienia wykazały, że latencja zachowania szczurów, które otrzymały AF64A otrzymujących DDW była znacząco krótsza, w porównaniu ze szczurami, które nastrzyknięto soląi które otrzymywały wodę (P<0.001). Latencja zachowania szczurów, które otrzymały AF64A otrzymujących AF 185 1,5 i 10 mg/kg była istotnie dłuższa w porównaniu ze szczurami AF64A+DDW (P < 0.001). Nie znaleziono innych różnic istotnych statystycznie.

Wnioski

1. Szczury nastrzyknięte AF64A wykazywały znaczne upośledzenie w latencji zachowanej w porównaniu ze szczurami, które otrzymały sól fizjologiczną.

2. Szczury, które otrzymały AF64A, leczone AF185 (1, 5 i 10 mg/kg) wykazywały zdolności zachowania podobne do zwierząt kontrolnych.

3. AF185 może być potencjalnym związkiem do leczenia zaburzeń pamięci jak obserwowane w chorobie Alzheimera.

Zgodnie z systematyczną nomenklaturą IUPAC dla konkretnych związków według wynalazku opracowano następującą korelację ze stosowanymi dla nich numerami kodowymi:

2,8-dimetylo-l-okso-l-tia-4,8-diaza-spiro[4.5]dekan-3-on (AF262);

3-etylo-8-metylo-l-oksa-4,8-diaza-spiro[4.5]dekan (AF268);

2,8-dimetylo- l-oksa-4,8-diaza-spiro[4.5]dekan (AF264);

3,8-dimetylo-l,4-dioksa-8-aza-spiro[4.5]dekan-2-on (AF274);

2-etylo-4,8-dimetylo-l-tia-4,8-diaza-spiro[4.5]dekan-3-on (AF272);

3-metylo-l-oksa-4-tia-8-aza-spiro[4.5]dekan-2-on (AF269);

3-etylo-8-metylo-l-oksa-4-tia-8-aza-spiro[4.5]dekan-2-on (AF271);

2-metylo-l-tia-4,8-diaza-spiro[4.5]dekan -3-on (AF263);

3,8- dimetylo-1 -oksa-4-tia-8-aza-spiro[4.5]dekan-2-on (AF265);

178 931

2,8-dimetylo-l-oksa-4,8-diaza-spiro[4.5]dekan-3-on (AF260);

2,4,8-trimetylo-l-tia-4,8-diaza-spiro[4.5]dekan-3-on (AF266);

2-etylo-8-metylo-l-tia-4,8-diaza-spiro[4.5]-dekan-3-on (AF267);

2,8-dimetylo-l-tia-4,8-diaza-spiro[4.5]dekan-3-on (AF261);

2,8-dimetylo-l-oksa-3,8-diaza-spiro[4.5]dec-2-en-4-on (AF238);

2,8-dimetylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dec-l-en-4-on (AF230);

3-etylo-8-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dec-l-en-4-on (AF220);

l-etylo-8-metylo-3-oksa-l,8-diaza-spiro[4.5]dekan-2-on (AF174);

8-metylo-l-oksa-3,8-diaza-spiro[4.5]dekano-2-tion (AF165);

3-etylo-8-metylo-l-oksa-3,8-diaza-spiro[4.5]dekan-2-on (AF172);

8-metylo-l-oksa-3,8-diaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF169);

3-etylo-8-metylo-l-oksa-3,8-diaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF180);

4-butyloimino-8-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2-tion (AF189);

8,N,N^/-trimetylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]deka-l,3-dieno-2,4-diamina (AF194);

metylo-(8-metylo-2-metylosulfanylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]deka-l,3-dien-4-ylo)amina (AF193);

8-metylo-2-metylosulfanylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]-deka-l,3-dien-4-yloamina (AF192);

4-metoksy-8-metylo-2-metylosulfanylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]deka-l,3-dien (AF191);

2,8- dimetylo-1,3,8-triaza-spiro[4.5]dec-1 -en (AF 190);

3-etylo-2-etylosulfanylo-8-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dec-l-eno-4-tion (AF170);

3-etylo-2-etylosulfanylo-8-metylo-1,3,8-triaza-spiro[4.5]dec-1 -en-4-on (AF 188);

8-metylo-2-metylosulfanylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dec-l-en-4-on (AF187);

8-metylo-2,4-bis-metylosulfanylo-1,3,8-triaza-spiro[4.5]deka-1,3-dien (AF177);

8-metylo-4-metylosulfanylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dec-3-eno-2-tion (AF183);

4-etylosulfanylo-8-metylo-l,3-8-triaza- spiro[4.5]dec-3-eno-2-tion (AF176);

3-etylo-8-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dition (AF163);

8-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dition (AF173);

-acetylo-8-metylo-1,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF 164);.

3-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF179);

3,8- dimetylo-1,3, 8-triaza-spiro[4. 5] dekano-2,4-dion (AF 178);

3-etylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF160 Des);

3-etylo-8-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF160);

3-etylo-8-metylo-4-tiokso-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekan-2-on (AF182);

8-metylo-3-(4-pirolidyn-l-ylo-but-2-ynylo)-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF197);

3-prop-2-ynylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF186);

3-tert-butylo-8-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF213);

8-metylo-3-prop-2-ynylo-1,3,8-triaza-spiró[4.5]dekano-2,4-dion (AF 185);

3-tert-butylo-8-metylo-2-tiokso-1,3,8-triaza-spiro[4.5]dekan-4-on (AF 184);

3-etylo-8-metylo-2-tiokso-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekan-4-on (AF181);

3-etylo-8-prop-2-ynylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF196);

5-(l-metylo-piperydyn-4-ylo)-2-tiokso-imidazolidyn-4-on (AF195);

5-metylo-2-(l-metylo-piperydyn-4-ylo)-tiazolidyno-4-tion (AF275);

3-but-2-ynylo-8-metylo-l,3,8-triaza-spiro[4.5]dekano-2,4-dion (AF199).

Aczkolwiek niniejszy wynalazek został tutaj szczegółowo opisany, a zwłaszcza w odniesieniu do przedstawionych konkretnych rozwiązań, dla specjalisty oczywiste będzie, że możliwe sąrównież zmiany i modyfikacje. Zgodnie z tym, wynalazek nie jest opracowany w ograniczeniu tylko do konkretnie opisanych wykonań, a jego sens, zakres i istota są zrozumiałe w świetle następujących zastrzeżeń.

Claims (12)

1. Spirozwiązki i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, enancjomery i racematy oraz związki czwartorzędowe, pochodzące od tych związków, które zawierają trzeciorzędowy atom azotu, które to spirozwiązki zawierająpięcioczłonowąresztę, w której połączenie spiro występuje przy jej atomie węgla i równocześnie przy atomie węgla nasyconego układu pierścieniowego zawierającego jeden atom azotu i charakteryzują się tym, że wymieniona pięcioczłonową reszta jest wybrana z grupy obejmującej 3-etylohydantoinę, 1-acetylohydantoinę, 3-metylo-hydantoinę, 3-propargilohydantoinę, 2,4-ditiohydantoinę, 2-tiohydantoinę, oksazolidyno-2-tion, 3-etylooksazolidyn-2-on, oksazolidyno-2,4-dion, 3-etylo-oksazolidyno -2,4-dion, 2-metylo-l,4-oksazolidyn-3-on, 2-metylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 2,4-dimetylo -l,4-tiazolidyn-3-on, 2-etylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 2-etylo-4-metylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 3-metylo-l,4-oksatiolan-2-on, 2-etylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 5-metylo-l,3-oksazolidynę, 4-etylo- 1,3-oksazolidynę, 3-etylo-l,4-oksatiolan-2-on, 5-metylo-l,3-dioksolan-4-on, N-metylosukcynimid, N-etylosukcynimid, 3-t-butylohydantoinę, 3-(4-pirolidyno-2-butynylo) hydantoinę, 3- (2-butynylo)-hydantoinę, 2,5-bis- (metylotio)-4H-imidazol, 3-etylo-4-tiohydantoinę, 4-metylotioimidazolino-2-tion, 3- etylo-2,4-ditiohydantoinę, 4-etylotio, -3-imidazolino -2-tion, l-etylo-2-etylotio-2-imidazolino-5-tion, 2,5-bis(aminometylo)-4H-imidazol, 2-metylo-2-tiazolinę, 2-metylo-2-imidazolinę, 2-metylo-2-oksazolin-4-on, 2-metylo-4H(5H)-imidazol-5(4)-on, 2-metyłotio- 5-metoksy-4H-imidazol, 2-metylotio -5-amino -4H-imidazol, 2-metylotio-5-amino metylo- 4H-imidazol, 2-tiono-3-etylohydantoinę, 2-tiono-3-t-butylohydantoinę, 2-metylotio- 2-imidazolin-5(4)-on, l-etylo-2-etylotio-2-imidazolin-5-on i 1-etylo -2-imidazolin-5-on, a nasycony układ pierścieniowy zawierający jeden atom azotu określony jest wzorem K:

CH₂CH

CH_2z(CH₂)m)c^/

N-CH (K) przy czym układ ten jest niepodstawiony lub jest podstawiony 1-3 podstawnikami wybranymi spośród 0^6 alkilu i hydroksylu, a mostek w strukturze Kjest przyłączony jednym końcem do pozycji 1, a drugim do pozycji 4 łub 5, a m oznacza 1, 2 lub 3.

2. Spirozwiązek według zastrz. 1, znamienny tym, że nasycony układ pierścieniowy zawierający jeden atom azotu jest wybrany z grupy obejmującej piperydynę, 1-metylopiperydynę, 1-propargilopiperydynę, N-metylonortropan i chinuklidynę.

3. Spirozwiązek według zastrz. 1 albo 2, który jest wybrany spośród następujących: 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2', 5'-bis(metylotio)-4Ή-imidazol); l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-4'-tiohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(4'-metylotio-3'-imidazolino -2^/tion); l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-2,'4'-ditiohydantoina); l-metylopiperydyno-4-spiro- 5'- (4^/-etylotio-3'-imidazolino-2^/-tion); l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2', 5-bis- (aminometylo)-4^/H-imidazol); 1 -metylo-piperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylooksazolidyn-2'-on); 1 -metylopipe-

178 931 rydyno-4-spiro-4'-(2'-metylo-2^/-tiazolina); l-metylopiperydyno-4-spiro-4'(5')-(2'-metylo-2^/-imidazolina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5^/-(2^,-metylo-2'-oksazolin-4'-on); 1 -metylopipery dyno-4spiro-4'(55-[2^/-metylo-4H(5'H)-imidazol-5'(4^/)-on]; l-metylopiperydyno-4-spiro-4^/- (2^/-metylotio-5'-metoksy-4H-imidazol); i l-metylo-piperydyno-4-spiro- 4^/-(2'-metylotio-5'-aminometylo-4'H-imidazol).

4. Spirozwiązek według zastrz. 1 albo 2, który jest wybrany spośród następujących: l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoina); 1 -metylopipery dyno^-spiro-S^fb-acetylohydantoina); piperydyno-4-spiro-5'-(3'-etylohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'(3'-metylohydantoina); piperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(3'-propargilohydantoina); N-metylonortropano-3-spiro-5'-hydantoina; N-metylonortropano-3-spiro-5'-(3'-metylohydantoina); N-metylonortropano-3-spiro-5'-(3'-etylohydantoina); 1 -metylopiperydyno -4-spiro-5'-(2'4'-ditiohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-tiohydantoina); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(oksazolidyno-3'-tion); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'-(3'-etylooksazolidyn-2'-on); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(oksazolidyno-2',4^,-dion); 1 -metylopiperydyno -4-spiro-5'- (3'-etylooksazolidyno-2'4'-dion); 1 -metylopipery dyno-4-spiro-5'-(2'-metylo- Γ, 4'-oksazolidyn-3'-on); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-1', 4'-tiazolidyn-3'-on); l-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2', 4'-dimetylo-r, 4'-tiazolidyn-3'-on); 1-metylo-piperydyno -4-spiro-5'-(2'-etylo-4-metylo-r, 4'-tiazolidyn-3'-on); piperydyno-4-spiro-5'-(3'-metylo-r, 4'-oksatiolan-2'-on); piperydyno-4-spiro-5^/-(2'-metylo-r, 4'-tiazolidyn-3'-on); 1-metylopiperydyno-4-spiro-5'-(l'-tlenek 2'-metylo-3'-okso-r, 4'-tiazolidyny); l-metylopiperydyno-4-spiro-2'-(4'-etylo-Γ, 3'-oksazolidyna); 1 -metylopipery dyno-4-spiro-5'-(3'-etylo-r, 4'-oksatiolan-2'-on); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo- Γ, 4^z-tiazolidyn-3'-on); 1 -metylopiperydyno-4-spiro-2'-(5'-metylo-r, 3'-dioksolan-4'-on); 2-N-metylospiro-(l,3-sukcynimido-4, 3) chinuklidyna; oraz 2-N-etylospiro-(l,2-sukcynimido-4, 3j chinuklidyna.

5. Spirozwiązek według zastrz. 1 albo 2, który jest wybrany spośród nastujących:l-metylopiperydyno-4-spiro-5^z- (3'- (4-pirolidyno-2-butynylo) hydantoina; 1-metylopiperydyno- 4 -spiro-5'- (3'- t -butylohydantoina); l-propargilopiperydyno-4-spi ro-5'- (3'-etylohydantoina); l-metylopiperydyno-4-spro-5'- [3'- (2-butynylo) hydantoina]; piperydyno-4-spiro-5'- (3'-propargilohydantoina); oraz 2-metylo-l,4-tiazolidyn -3-ono-spiro [5,3'] -chinuklidyna.

6. Spirozwiązek według zastrz. 1 albo 2, który jest wybrany spośród następujących: l-metylopiperydyno-4-spiro-5' - (2'-tiono-3'-etylohydantoina); 1-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(2'-tiono-3^,-t-butylohydantoina); l-metylopiperydyno-4-spiro-4'(5^/)-(2'-metylotio-2'-imidazolin-5' (4^z)-on); l-metylopiperydyno-4-spiro-4'-(r-etylo-2'-etyłotio-2'-imidazolin-5'-on); oraz 1 -metylopiperydyno-4-spiro-4'-( r-etylo-2'-imidazolin-5'-on).

7. Spirozwiązek według zastrz. 1 albo 2, który jest wybrany spośród następujących: enancjomerycznie czysty d- i 1-1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-metylo-1,4'-tiazolidyn-3'-on) i d- i 1-1 -metylopiperydyno-4-spiro-5'-(2'-etylo-1,4'-tiazolidyn-3'-on).

8. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden spirozwiązek wybrany z grupy obejmującej spirozwiązki lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, enancjomery i racematy oraz związki czwartorzędowe, pochodzące od tych związków, które zawierają trzeciorzędowy atom azotu, które to spirozwiązki zawierają pięcioczłonową resztę, w której połączenie spiro występuje przy jej atomie węgla i równocześnie przy atomie węgla nasyconego układu pierścieniowego zawierającego jeden atom azotu i charakteryzują się tym, że wymieniona pięcioczłonowa reszta jest wybrana z grupy obejmującej 3-etylohydantoinę, 1-acetylohydantoinę, 3-metylo-hydantoinę, 3-propargilohydantoinę, 2,4-ditiohydantoinę, 2-tiohydantoinę, oksazolidyno-2-tion, 3-etylooksazolidyn-2-on, oksazolidyno-2,4-dion, 3-etylooksazolidyno-2,4-dion, 2-metylo-l,4-oksazolidyn-3-on, 2-metylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 2,4-dimetylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 2-etylo-l,4-tiazolidyn-3-on, 2-etylo-4-metylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 3-metylo-1,4-oksatiolan-2-on, 2-etylo-1,4-tiazolidyn-3-on, 5-metylo-l,3-oksazolidynę, 4-etylo-l,3-oksazolidynę, 3-etylo-l,4-oksa-tiolan-2-on, 5-metylo-l,3-dioksolan-4-on, N-metylosukcynimid, N-etylosukcynimid, 3-t-butylohydantoinę,

178 931

3-(4-pirolidyno-2-butynylo)hydantoinę, 3-(2-butynylo)hydantoinę, 2,5-bis-(metylotio)-4H-imidazol, 3-etylo-4-tiohydantoinę, 4-metylo-tioimidazolino-2-tion, 3-etylo-2,4-ditiohydantoinę, 4-etylotio-3-imidazolino-2-tion, l-etylo-2-etylotio-2-imidazolino-5-tion, 2,5-bis(aminometylo)-4H-imidazol, 2-metylo-2-tiazolinę, 2-metylo-2-imidazolinę, 2-metylo-2-oksazolin-4-on, 2-metylo-4H(5H)-imidazol-5(4)-on, 2-metylotio-5-metoksy-4H-imidazol, 2-metylotio-5-amino-4H-imidazol, 2-metylotio-5-ammometylo-4H-imidazol, 2-tiono-3-etylohydantoinę, 2-tiono-3-t-butylo-hydantoinę, 2-metylotio-2-imidazolin-5(4)-on, 1 -etylo-2-etylotio-2-imidazolin-5-on i l-etylo-2-imidazolin-5-on, a nasycony układ pierścieniowy zawierający jeden atom azotu określony jest wzorem K:

CH₂CH

CH_2z(CH₂)_mV

N-CH ¹(K) przy czym układ ten jest niepodstawiony lub jest podstawiony 1-3 podstawnikami wybranymi spośród C]_₆ alkilu i hydroksylu, a mostek w strukturze K jest przyłączony jednym końcem do pozycji 1, a drugim do pozycji 4 lub 5, a m oznacza 1,2 lub 3, oraz co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, nośnik lub substancję pomocniczą.

9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera ponadto co najmniej jeden inny związek farmakologicznie czynny wybrany z grupy obejmującej fizostygminę, tetrahydroaminoakrydynę, cholinę, lecytynę, piracetam, aniracetam, pramiracetam, oksiracetam, 4-aminopirydynę, 3,4-diaminopirydynę, somatostatynę, pirenzepinę, N-metyloatropinę, N-butyloskopolaminę, skopolaminę, klonidynę, kwanfamycynę, propantelinę, metantelinę, glikopirolan, tropencylium, nortryptylinę, amitryptylinę, imipraminę, minaprynę, sekowerynę, AFDX-116, nikotynę, alaproklat, zymelidynę, deprenyl i Czynnik Wzrostowy Nerwu, przy czym substancje czynne stanowią od około 0,5% do około 90% wagowych kompozycji, a stosunek spiro związku do dodatkowej substancji czynnej wynosi od około 99% wagowych do około 1% wagowych.

10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, nośnik lub substancję pomocniczą oraz Czynnik Wzrostowy Nerwu jako inny związek farmakologicznie czynny, przy czym spirozwiązekjest obecny w ilości, która promuje aktywność wzrostowąnerwu Czynnika Wzrostowego Nerwu.

11. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jest w postaci odpowiedniej do podawania doustnego, doodbytniczego, pozajelitowego, przezskómego lub w formie nadającej się do podawania przez wdmuchiwanie lub rozpylanie do nosa.

12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jest w postaci odpowiedniej do podawania przezskómego i zawiera ponadto kwas tłuszczowy o niskim ciężarze cząsteczkowym.