PL179149B1 - Szczepionka do wywolywania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcje Helicobacter PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Szczepionka do wywolywania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcje Helicobacter na bazie ureazy zawierajaca odpowiedni antygen i adjuwant sluzówkowy, znamienna tym, ze zawiera od 10 µg do 100 miligramów ureazy Helicobacter pylori lub Helicobacter felis, lub polipeptyd zawierajacy jej podjednostke i jako adjuwant sluzówko- wy od 5 do 50 µg termicznie labilnej toksyny Escherichia coli lub polipeptyd obejmujacy jej podjednostki lub fragmenty na dawke jednostkowa w dopuszczalnym farmaceutycznie nosniku lub rozcienczalniku. P L 179149 B 1 PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka do wywoływania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcje Helicobacter na bazie ureazy zawierająca odpowiedni antygen i adjuwant śluzówkowy, charakteryzująca się tym, że zawiera od 10 pg do 100 miligramów ureazy Helicobacter pylori lub Helicobacter felis, lub polipeptyd zawierający jej podjednostkę i jako adjuwant śluzówkowy od 5 do 50 pg termicznie labilnej toksyny Escherichia coli lub polipeptyd obejmujący jej podjednostki lub fragmenty na dawkę jednostkową w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku lub rozcieńczalniku. Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera podjednostkę B termicznie labilnej toksyny Escherichia coli.

Pragniemy podkreślić, że przedmiot wynalazku jest użyteczny dla zwiększenia odporności ssaków na działanie peptydów ureazy Helicobacter, zarówno w celu profilaktycznym jak i terapeutycznym. Immunizacja zwierząt za pomocą peptydów ureazy Helicobacter zapobiega zakażeniu szczepami Helicobacter oraz zwalcza zakażenia uprzednio nabyte przez zwierzęta. Taka metoda oraz kompozycje zawierające szczepionki są użyteczne do zapobiegania i zwalczania chorób żołądka i dwunastnicy towarzyszących zakażeniom Helicobacter.

Stwierdziliśmy, że można wywołać odporność w organizmach ssaków wrażliwych na żołądkowo-jelitowe zakażenia Helicobacter przez wykorzystanie epitopów ureazy, wystawionych na lub obok powierzchni mikroorganizmów Helicobacter i zastosowanie ich jako celu szczepionki. Odporność można indukować za pomocą immunizacji naturalną ureazą, lecz można również w tym celu wykorzystać rekombinowaną podjednostkę ureazy, wytworzoną jako enzymatycznie nieaktywną, tym samym w nietoksycznej postaci.

Stosowanie szczepionki według wynalazku jest metodą indukowania odporności na zakażenia Helicobacter za pomocą podawania na powierzchnie błony śluzowej ssaków, poliaminokwasowych preparatów, to znaczy, mieszaniny peptydów i/lub białek łącznie z odpowiednim dodatkiem. Takie poliaminokwasowe preparaty prezentują wiele epitopów charakteryzujących i wydzielanych przez endogenny enzym ureazę do organizmu zakażonego szczepem Helicobacter. Preparat poliaminokwasowy można podawać doustnie.

Aktywny składnik preparatu może obejmować naturalne lub biosyntetyczne epitopy i może przyjmować różne formy. Nie wyczerpująca lista możliwych preparatów obejmuje preparaty oczyszczone, naturalnego pochodzenia lub wytwarzane za pomocą rekombinacji

179 149 preparaty ureazowe, pochodzenia bakteryjnego lub z innego źródła naturalnego, produkty trawienia ureazy, fuzje białek obejmujące epitopy ureazy, skrócone postacie enzymu ureazy, lub homologiczne peptydy z sekwencją aminokwasową ureazy. Ponieważ rozwój odporności zależy od indukowania ogólnoustrojowych i/lub komórkowych reakcji immunologicznych, które związane są z zakażającym organizmem Helicobacter, korzystne są takie preparaty szczepionki, które w największym stopniu kopiują epitopy endogennej ureazy zakażającego drobnoustroju. Na przykład, preparaty szczepionki zawierające epitopy ureazy Helicobacter pylori podaje się ludziom wrażliwym na Helicobacter pylori, zaś preparaty zawierające epitopy ureazy Helicobacter felis podaje się ludziom wrażliwym na Helicobacter felis. Jednak, zgodnie z ważnym aspektem odnoszącym się do stosowania niniejszego wynalazku, stwierdziliśmy, że można stosować ureazę uzyskaną ze szczepów heterologicznych. Na przykład, stwierdziliśmy że zakażeniu szczepem Helicobacter felis u myszy można zapobiegać za pomocą podawania ureazy ze szczepu Helicobacter pylori. Tak więc, ureazę H. pylori można zastosować do ochrony przed H. pylori jak również do ochrony przed H. felis. H. felis jest okazjonalnym czynnikiem zakażającym i chorobotwórczym u ludzi (W.Wegman i inni., Schweig. Med. Wochenschr. tom 121,245-54 (1991)).

Stosowanie szczepionki według wynalazku wywołuje reakcję immunologiczną w organizmie ssaka, chroniącą przed zakażeniem Helicobacter. Sposób ten obejmuje podanie na powierzchnię błony śluzowej ssaka, w tym ludzi, immunologicznie skutecznej ilości antygenu ureazy, korzystnie ureazy Helicobacter pylori, zdolnej do wywołania takiej ochraniającej reakcji immunologicznej. Określenie „obejmowanie” stosowane w niniejszym opisie zgodne jest z przyjętym do stosowania w tej dziedzinie.

Metoda ta może też obejmować etap podania jako antygenu, na powierzchnię błony śluzowej ssaka, immunologicznie skutecznej ilości rekombinowanej, enzymatycznie nieaktywnej podjednostki B ureazy, korzystnie rekombinowanej podjednostki B ureazy Helicobacter pylori, zdolnej do wywołania takiej chroniącej reakcji immunologicznej.

Można zatem, stosując w powyżej opisany sposób szczepionkę według wynalazku, leczyć i stosować w profilaktyce w odniesieniu do ssaków, w tym i ludzi, przeciwko zakażeniom Helicobacter, w których immunologicznie skuteczną ilość ureazy lub jej podjednostki, zdolną do wywołania immunologicznej reakcji ochronnej przeciw zakażeniom Helicobacter, podaje się na powierzchnię błony śluzowej pacjenta. Jako ureazę stosuje się ureazę Helicobacter pylori lub podjednostkę B ureazy Helicobacter pylori i ureazę korzystnie podaje się w szczególnej postaci w połączeniu z hydroksylowanym fosforanem wapniowym, na przykład z hydroksyapatytem. Ponadto, ureazę Helicobacter pylori można podawać w połączeniu z dodatkami dodawanymi do środków stosowanych na błony śluzowe, takimi jak, podjednostka toksyny cholery, dipeptyd muramylu i inne dodatki tego typu.

W oparciu o szczepionkę według wynalazku można utworzyć kompozycję zawierającą szczepionkę, odpowiednią do zapobiegania zakażeniom Helicobacter, zawierającą skuteczną ilość antygenu ureazy, korzystnie ureazy Helicobacter pylori lub podjednostki B ureazy Helicobacter pylori lub rekombinowanych podjednostek ureazy Helicobacter pylori, zdolną do wywołania w organizmie ssaka immunologicznej reakcji chroniącej przed zakażeniem Helicobacter, w połączeniu z nośnikiem lub rozcieńczalnikiem dopuszczonym do stosowania w farmacji. Odpowiednie nośniki i rozcieńczalniki będą oczywiste dla specjalistów i można je znaleźć, na przykład, w Remington's Pharmaceutical Sciences (18-te wydanie, 1990).

Szczepionki według niniejszego wynalazku podaje się w ilościach ściśle określonych przez specjalistów w tej dziedzinie. Tak więc, dla dorosłych odpowiednie dawkowanie waha się w zakresie od 10 pg do 100 mg, na przykład od 50 pg do 50 mg. Odpowiednie dawkowanie dla dorosłych może również wahać się od 5 pg do 500 mg. Podobny zakres dawkowania będzie odpowiedni dla dzieci. Układy nośników w formach przeznaczonych dla ludzi mogą obejmować kapsułki uwalniane w jelitach i chroniące antygen przed kwaśnym środowiskiem w żołądku oraz mogą obejmować antygen ureazowy w nierozpuszczalnej postaci jako białka fuzyjne. Szczepionkę można podawać jako pierwszorzędowy czynnik profilaktyczny dla dorosłych lub dla dzieci, jako drugorzędowy czynnik profilaktyczny po wtargnięciu Helicobacter pylori do zakażonego organizmu lub jako środek terapeutyczny w celu pomocy w indukowaniu immunologicznej reakcji w organizmie zakażonego, wrażliwego na działanie Helicobacter pylori.

179 149

Jak stwierdzono powyżej, jako adjuwant śluzówkowy stosuje się toksynę cholery. Ponadto można stosować inne, nietoksyczne pochodne toksyny cholery, obejmujące jej podjednostkę B i/lub konjugaty lub uzyskane metodami inżynierii genetycznej fuzje antygenu ureazy z toksyną cholery lub jej podjednostką B. Inne odpowiednie metody uwalniania obejmują biodegradowalne mikrokapsułki lub immunostymulujące kompleksy (ISCOM) lub lipozomy, metodami inżynierii genetycznej zmniejszone żywe wektory, takie jak, wirusy lub bakterie, rekombinowane (chimeryczne) cząstki wirusopodobne, na przykład, ang. bluetongue. Ilość adjuwantu śluzówkowego zależy od zastosowanego typu. Na przykład, jeśli jako adjuwant śluzówkowy stosuje się toksynę cholery, to odpowiednio stosuje się go w ilości od 5 pg do 50 pg, na przykład od 10 pg do 36 pg. Jeśli jako postać szczepionki wybiera się mikrokapsułki, wówczas stosowana ilość zależy od ilości wprowadzonej do matryc mikrokapsułek w celu osiągnięcia pożądanego dawkowania. Określenie takiej ilości należy do specjalisty w tej dziedzinie.

Odpowiednimi nośnikami dla szczepionek według niniejszego wynalazku są dojelitowe kapsułki powlekane i mikrokapsułki polilaktydowo-glikolidowe. Odpowiednimi rozcieńczalnikami są 0,2 normalny roztwór wodorowęglanu sodowego i/lub sól fizjologiczna.

Zwłaszcza hydroksylowany fosforan wapniowy (HCP) jest szczególnie użyteczny jako nośnik dla ureazy Helicobacter pylori do stosowania na powierzchnie błon śluzowych. Przypuszcza się, że konjugat ureazy Helicobacter pylori i hydroksylowanego fosforanu wapniowego ulega transportowi poprzez nabłonek, gdzie wywołuje reakcję immunologiczną poli Ig. Korzystnie hydroksylowany fosforan wapniowy stosuje się w postaci mikrocząstek, odpowiednich do transportu przez nabłonek, zwłaszcza przez komórki wyspecjalizowane dla tych celów (komórki M). Jako hydroksylowany fosforan wapniowy korzystnie stosuje się hydroksyapatyt, dostępny w handlu krystaliczny hydroksylowany fosforan wapniowy CaioiPOT/OHb.

Dostępny w handlu hydroksyapatyt zwykle zawiera podobne do płytek kryształy, które chemicznie i fizycznie przypominają nieorganiczny hydroksyapatyt w normalnej tkance kości. Przyjmowanie hydroksyapatytu tym samym uznaje się za bezpieczne, gdyż występuje on w naturalnych składnikach kości (wapń/fosfór). Handlowy, dobrze rozpuszczalny hydroksyapatyt (z firmy CalBiochem) zawiera kryształy o różnej wielkości. Kryształy o długości powyżej 1 pm nie są zdolne do przechodzenia przez komórki M. Tym samym, w celu zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem, kryształy handlowego hydroksyapatytu rozbija się na mniejsze, odpowiednio jednorodne, krystaliczne fragmenty, na przykład, przy użyciu ultradźwięków. Korzystnie zasadnicza część hydroksyapatytu występuje w postaci fragmentów około 0,01-1,0 pm. Fragmentacje mierzy się za pomocą mikroskopu elektronowego lub załamywania światła, przy pomocy standardowych metod.

Korzystnie antygen ureazy Helicobacter pylori podaje się doustnie, donosowo, doodbytniczo lub doocznie. Po podawaniu doustnie uwalnianie można uzyskiwać w innych błonach śluzowych drogi żołądkow-O-jelitowej w tym w błonie śluzowej jelit.

Szczepionkę według niniejszego wynalazku można podawać na powierzchnie błon śluzowych w postaci aerozoli, zawiesin, kapsułek i/lub czopków. Sposób podawania zależy od oceny specjalisty w tej dziedzinie i można go znaleźć na przykład w Remington's Pharmaceutical Sciences (18-te wydanie, 1990).

Szczepionkę według wynalazku można wprowadzać do organizmu ssaka w celu pasywnej ochrony przed zakażeniem Helicobacter, obejmującej podawanie na powierzchnie błony śluzowej ssaka, immunologicznie skutecznej ilości ureazo-specyficznego przeciwciała wytworzonego w organizmie immunizowanym ureazą, korzystnie ureazą Helicobacter pylori lub podjednostką B ureazy Helicobacter pylori, zdolną do wywołania immunologicznej reakcji chroniącej przed zakażeniem Helicobacter.

Podanie w taki sposób szczepionki według wynalazku wywołuje pasywną immunizację ssaków, w tym ludzi, przeciwko zakażeniom Helicobacter. Uzyskuje się to za pomocą podawania na powierzchnię błony śluzowej pacjenta skutecznej ilości specyficznego dla ureazy przeciwciała, korzystnie skutecznej ilości monoklonalnego IgA przeciwciała specyficznego wobec ureazy Helicobacter pylori.

Ponieważ ureaza Helicobacter pylori prezentuje antygen zdolny do wywołania ochronnej odporności, ureazę Helicobacter pylori stosuje się jako odczynnik diagnostyczny do mierzenia

179 149 reakcji immunologicznych u osób, które mają otrzymywać szczepionkę opartą na ureazie lub w celu określenia czy pacjent jest osobą odporną lub wrażliwą (tym samym czy koniecznym jest podawanie szczepionki). Można także stosować ureazę i specyficzne dla ureazy przeciwciało do prób i zestawów diagnostycznych do badania odporności na Helicobacter, określania wrażliwości Helicobacter oraz oznaczania immunologicznych reakcji na szczepionki.

Najważniejszym wykorzystaniem szczepionki według wynalazku jest leczenie chorób żołądka i dwunastnicy u ssaków. Sposób leczenia obejmuje etap podawania terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji obejmującej peptydy ureazy Helicobacter. Choroby żołądka i dwunastnicy, to nieżyt żołądka, choroby wrzodów trawiennych, obejmujące wrzody żołądka i wrzody dwunastnicy, nowotwór żołądka, przewlekłą niestrawność z poważnymi erozywnymi nieżytami żołądka i dwunastnicy, niewrażliwe na leczenie wrzody związane z nieżytami, metaplazję jelit, niskiego stopnia MALT chłoniak, zakażenie Helicobacter, zakażenie Helicobacter pylori, zakażenie Helicobacter felis. Określenie „peptydy ureazy” oznacza, lecz nie ogranicza się do jakiejkolwiek ureazy lub podjednostki ureazy, zarówno pochodzenia naturalnego jak i otrzymane metodami rekombinacji DNA, jak również pochodzące z trawienia ich fragmenty i peptydy, fuzje białek zawierające całe ureazy, podjednostki lub ich fragmenty, lub skrócone konstrukcje ureazy. W określeniu „peptydy ureazy” zawarte są również białka i peptydy, które wystawiają epitopy dostatecznie homologiczne dla epitopów wystawianych przez ureazę Helicobacter tak, że przeciwciała rozpoznające epitopy wystawiane przez ureazę Helicobacter będą rozpoznawać epitopy wystawiane przez wymienione peptydy i białka.

Leczenie chorób żołądka i dwunastnicy wywołanych przez zakażenia Helicobacter, obejmuje też podawanie peptydów ureazy Helicobacter na powierzchnię błony śluzowej. Bez ograniczania typu powierzchni błony śluzowej zaangażowanej do podawania, jako powierzchnie błony śluzowej można wykorzystać powierzchnię jamy ustnej, nosa, odbytu i oka.

Kompozycja do podawania zawierająca szczepionkę według wynalazku obejmuje peptydy ureazy Helicobacter w połączeniu z adjuwantami śluzówkowymi. Adjuwanty śluzówkowe można wybierać z grupy obejmującej, lecz nie ograniczonej tylko do toksyny cholery, procholeragenoidu, podjednostki B toksyny cholery, polisacharydu obejmującego, lecz nie ograniczonego tylko do takich jak: schizophyllan, dipeptyd muramylu, pochodne dipeptydu muranylu, estry forbolu, mikrokapsułki, lizaty bakteryjne nie-Helicobacter pylori, labilne toksyny Escherichia coli, polimery blokowe, saponiny i ISCOM. Inne adjuwanty można znaleźć, na przykład, w I.Azuma, „Synthetic Immunoadjuvants: Application to Non-Specific Host Stimulation and Potentiation of Vaccine Immunogenicity” Vaccine, tom 10, 1000 (1992); A.G.Pockley i P.C.Montgomery, „In vivo Adjuwant Effect of Interleukins 5 and 6 on Rat Tear IgA Antibody Responses” Immunology, tom 73, 12-23, (1991); A.Adam i E.Lederer, „Muramyl peptides as Immunomodulators” ISI Atlas of Science 205, (1988); J.D.Clements i współpracownicy, „Adjuvant Activity of Escherichia coli Heatlabile Enterotoxin and Effect on the Induction of Oral Tolerance in Mice to Unrelated Protein Antigens” Vaccine, tom 6, 269, (1988); E.T.S. Ben Ahmeida i współpracownicy „Immunopotentiation of Local and Systemic Humoral Immune Responses by ISCOMs, Liposomes and FCA: Role in Protection Against Influenza A in Mice” Vaccine, tom 11, 1302, (1993); oraz R.K. Gupta i współpracownicy „Adjuvants - A Balance Between Toxicity and Adjuvanticity” Vaccine, tom 11,290-308, (1993).

Adjuwanty śluzówkowe można także genetycznie lub chemicznie wiązać z peptydami ureazy. Przykłady tego typu fuzji peptydów są znane specjalistom i można je znaleźć w opracowaniu Czerkinsky'ego i jego współpracowników, „Oral Administration of a Streptococcal Antigen Coupled to Cholera Toxin B Subunit Evokes Antibody Responses in Salivary Glands and Extramucosal Tissues” Infect. Immun., tom 57, 1072-77 (1989); Nashar i jego współpracownicy „Current Progress in the Development of the B Subunits of Cholera Toxin and Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin as Carriers for the Oral Delivery of Heterologous Antigens and Epitopes” Vaccine, tom 11, 235-40 (1993); oraz Dertzbaugh i Elson, „Comparative Effectiveness of the Cholera Toxin B Subunit and Alkaline Phosphatase as Carriers for Oral Vaccines”, Infect. Immun, tom 61, 48-55 (1993). Na przykład, podjednostkę B ureazy można poddawać ekspresji jako chimeryczne białko, które jest wiązane genetycznie z podjednostką B toksyny cholery, przy użyciu wektora ekspresji

179 149

DNA, zawierającego sekwencję nukleotydową ure B powiązaną z nukleotydową sekwencją podjednostki B toksyny cholery.

Kompozycję zawierająca peptydy ureazy Helicobacter można podawać w szczególnej postaci, na przykład, łącznie z nośnikiem. Jako nośnik można stosować hydroksylowany fosforan wapniowy, na przykład, hydroksyapatyt. Określenie „hydroksyapatyt” oznacza lecz nie ogranicza się tylko do, co jest oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie, trójzasadowy fosforan wapniowy, znany również jest hydroksylowany fosforan wapniowy lub hydroksyfosforan wapniowy. Związek ten podaje się tylko jako przykład i nie ogranicza on typu nośnika możliwego do zastosowania.

Podawane dawki kompozycji zawierającej peptydy ureazy Helicobacter mogą wahać się w zakresie od 100 pg do 1 g, na przykład, 0,14 mg na 1 kg masy ciała. Specjaliści w tej dziedzinie będą wiedzieć, że optymalna dawka może być większa lub mniejsza w zależności od masy ciała pacjenta, choroby, drogi podania i innych czynników. Wielkość dawki określa się standardowymi metodami. Ilość dawek zależy od choroby, postaci leku, skuteczności określonej w próbach klinicznych. Na przykład, lek można podawać w 3 do 8 dawkach w celu wstępnej immunizacji w czasie 1 miesiąca.

Kompozycje zawierające szczepionkę według wynalazku podaje się w połączeniu z mikrokapsułkami. Taki mikrokapsułkowy nośnik może na przykład, lecz nie wyłącznie, oznaczać polilaktydo-koglikolidowy biodegradowalny nośnik mikrokapsułkowy.

Kompozycje zawierające szczepionkę według wynalazku mogą obejmować rekombinowany żywy wektor, w którym-zachodzi ekspresja peptydu ureazy Helicobacter. Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie zrozumiałym, że taki żywy wektor może być, na przykład, wektorem bakteryjnym lub wirusowym. Taki żywy wektor można wybrać z grupy obejmującej Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, BCC, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Campylobacter, drożdże, Herpes virus, Adenovirus, Poliovirus,Vaccinia i Ανΐροχ. Ponadto jako układ nośnikowy, w którym ekspresjonuje się peptyd ureazy Helicobacter można wykorzystać cząstki wirusopodobne, takie jak Bluetongue, cząstki podobne do Rotawirusa, oraz cząstki Ty. Żywy wektor lub układ nośnikowy można podawać na powierzchnię błony śluzowej.

Szczepionką wedbig wynalazku można leczyć zakażenia szczepem Helicobacter pylori u ludzi, obejmujący doustne podawanie terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji zawierającej podjednostkę ure B ureazy Helicobacter pylori w połączeniu z dodatkiem do podawania na błony śluzowe, wybranym z grupy obejmującej toksynę cholery, procholeragenoid, podjednostkę B toksyny cholery, polisacharydy grzybowe, obejmujące schizophyllan, dipeptyd muramylu, pochodne dipeptydu muramylu, estry forbolu, lipozomy, mikrokapsułki, lizaty bakteryjne nie-Helicobacter pylori, labilne toksyny Escherichia coli, polimery blokowe, saponiny i ISCOM, przy czym kompozycje podaje się w szczególnej postaci w połączeniu z hydroksyapatytem, Kompozycję można również podawać w konkurencyjnej postaci doustnej, jako 1,0 g tabletki do żucia z wodorowęglanem sodowym. Dla celów niniejszego wynalazku, określenie „w połączeniu z” oznacza jakikolwiek typ połączenia, zawierający lecz nie ograniczony do połączenia chemicznego lub genetycznego, jakie występuje z fuzji białek.

Szczepionką według wynalazku można też leczyć choroby żołądka i dwunastnicy u ssaków, przez podawanie terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji, zawierającej przeciwciała, które rozpoznają ureazę Helicobacter. Przeciwciała wytwarzane w immunizowanych ssakach izoluje się i podaje leczonym ssakom. Wytwarzanie przeciwciał, które rozpoznają dane antygeny, takie jak w omówionej powyżej kompozycji, jest procesem znanym specjalistom w tej dziedzinie. Na przykład, poliklonalne i monoklonalne przeciwciała można wytwarzać według E. Harlowa i D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manuał (1988). Podawanym przeciwciałem może być monoklonalne przeciwciało. Wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał jest znane specjalistom w tej dziedzinie. Przeciwciałem może być IgA przeciwciało, zarówno poliklonalne jak i monoklonalne przeciwciało IgA. Wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał IgA jest znane specjalistom w tej dziedzinie i można je znaleźć, na przykład, w pracy L. Winnera i współpracowników „New Model for Analysis of Mucosal Immunity: Intestinal Secretion of Specific Monoclonal Immunoglobulin A from Hybridoma Tumors

179 149

Protects Against Vibrio Cholerae Infection” Infect. and Immun. tom 59, 977-982 (1991); oraz R. Weltzina i współpracowników „Binding and Transepithelial Transport of Immunoglobulins by Intestinal M Cells: Demonstration Using Monoclonal IgA Antibodies Against Enteric Viral Proteins” J. Cell Biol., tom, 108,1673-1685 (1989).

Określenie „przeciwciało” oznacza, lecz nie ogranicza się do, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne, oraz przeciwciała antyidiotypowe. Przeciwciała takie można sposobem naturalnym uzyskać z jakichkolwiek zwierząt, syntetyzować w bakteriach lub w jakichkolwiek niezwierzęcych źródłach oraz syntetyzować chemicznie lub genetycznie.

Można zatem, w oparciu o szczepionkę według wynalazku, leczyć ludzi zakażonych Helicobacter pylori i sposób leczenia może obejmować podawanie terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji zawierającej monoklonalne przeciwciało IgA, które rozpoznaje podjednostkę ure B ureazy Helicobacter pylori.

Kompozycja użyteczna do terapeutycznego zwalczania chorób żołądka i dwunastnicy zawiera szczepionkę według wynalazku.

Kompozycja ta obejmuje peptydy ureazy Helicobacter i dodatki do podawania na błony śluzowe. Kompozycja taka może być przygotowywana w szczególnej postaci. Kompozycja może występować w szczególnej postaci w połączeniu z nośnikiem. Nośnikiem może być, na przykład, hydroksyapatyt, jak wspomina się powyżej. Kompozycja może też występować w szczególnej postaci, jako ciekła zawiesina.

Kompozycja może także zawierać szczepionkę według wynalazku w połączeniu z nośnikiem mikrokapsułkowym. Takim mikrokapsułkowym nośnikiem, może być, na przykład, lecz nie wyłącznie, polilaktydo-koglikolidowy, biodegradowalny nośnik mikrokapsułkowy. Peptydy ureazy mogą być zakapsułkowane w biodegradowalne mikrokapsułki. Polilaktydokoglikolidowe mikrokapsułki powoli hydrolizują w obecności wody i stają się rozpuszczalne w wodzie, tym samym uwalniają peptydy, które są umieszczone w mikrokapsułkach.

Peptydy ureazy Helicobacter, występujące w szczepionce według wynalazku, występują jako żywe wektory, które ekspresjonują peptyd ureazy Helicobacter. Taki żywy wektor może być, na przykład, wektorem bakteryjnym lub wirusowym, i można go wybrać z grupy obejmującej Salmonella, typhimurium, Salmonella typhi, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Campylobacter, drożdże, Herpes virus, Adenovirus, Poliovirus, Vaccinia i Avipox. Ponadto jako układ nośnikowy, który ekspresjonuje peptyd ureazy Helicobacter można wykorzystać cząstki wirusopodobne, takie jak Bluetongue, cząstki podobne do Rotawirusa, oraz cząstki Ty.

Przy pomocy szczepionki według wynalazku można leczyć ludzkie zakażenia szczepem Helicobacter pylori, przez doustne podawanie terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji zawierającej podjednostkę ure B ureazy Helicobacter pylori w połączeniu z dodatkiem do podawania na błony śluzowe, wybranym z grupy obejmującej toksynę cholery, procholeragenoid, podjednostkę B toksyny cholery, polisacharydy grzybowe, obejmujące schizophyllan, dipeptyd muramylu, pochodne dipeptydu muramylu, estry forbolu, lipozomy, mikrokapsułki, lizaty bakteryjne nie-Helicobacter pylori, labilne toksyny Escherichia coli, polimery blokowe, saponiny i ISCOM, oraz ponadto zawiera hydroksyapatyt, przy czym kompozycję stosuje się w szczególnej postaci jako ciekłą zawiesinę. Określenie „w połączeniu z” posiada powyżej podane znaczenia.

Na bazie szczepionki według wynalazku można utworzyć kompozycję użyteczną do leczenia chorób żołądka i dwunastnicy zawierającą przeciwciała, które rozpoznają ureazę Helicobacter.

Taka kompozycja jak wspomniano powyżej, która jest użyteczna do leczenia chorób żołądka i dwunastnicy, zawiera monoklonalne przeciwciało IgA, które rozpoznaje podjednostkę ure B ureazy Helicobacter pylori.

Jakkolwiek nie ma to umocowania w jakiejkolwiek teorii, twórcy wynalazku przypuszczają, że podawanie antygenu ureazy lub jego podjednostki B na powierzchnię błony śluzowej stymuluje zwykły system immunologiczny błony śluzowej i być może pobudzać lokalne miejsca w błonie śluzowej żołądka do reakcji immunologicznej, polegającej na pojawieniu się specyficznych dla Helicobacter pylori przeciwciał IgA w wydzielinach żołądka, co zapobiega zakażeniu Helicobacter. Ponieważ jest to przypuszczenie, dlatego określenia „immunizacja”

179 149 i „szczepionka” stosowane w niniejszym opisie mają znaczenia zwykle stosowane przez specjalistów w tej dziedzinie, a ponadto wskazują na metody i kompozycje stosowane dla leczenia zakażeń Helicobacter.

Ponieważ zgodnie z rutynowym sposobem przeprowadzania prób przedklinicznych nad proponowanymi szczepionkami dla ludzi, stosuje się badania na modelach zwierzęcych zakłada się, że metodologia niniejszego wynalazku jest skuteczna w odniesieniu do ludzi, zwłaszcza w odniesieniu do zapobiegania i leczenia wrzodów trawiennych, nieżytu żołądka, złośliwych wrzodów żołądka i innych przypadków powstałych w wyniku obecności Helicobacter pylori i/lub Helicobacter felis.

W oparciu o dawkowanie i sposób leczenia, który skutecznie zwalczył zakażenie u myszy, korzystne dawki wynoszą od 100 pg do 10 g peptydów ureazy Helicobacter. Specjaliści w tej dziedzinie rozpoznają odpowiedni poziom dawkowania na podstawie badań przedstawionych dla innych szczepionek, takich jak, na przykład, badania przeprowadzone z lizatem Escherichia coli (6 mg dawka dzienna aż do łącznej dawki 540 mg) oraz z enterotoksygenowym oczyszczonym antygenem Escherichia coli (4 dawki 1 mg). (Schulman i współpracownicy, „Oral Immunotherapy of Recurrent Urinary Tract Infections: A Double-Blind Placebo-Controlled Multicenter Study”, J. Urol. tom 150, 917-921 (1993); Boedeker i współpracownicy, „Safety, Immunogenicity and Efficacy in Human Volunteers of Biodegradable, Bicompatible Microspheres Containing Colonization Factor Antigen/Π (CFA/II) as an Enteral Vaccine Against Enterotoxigenic E. coli (ETEC)”, American Gastroenterological Assoc., tom 999, A-222 (1993)). Bez wprowadzania jakichkolwiek ograniczeń w czasie leczenia, lek podaje się w 3 do 8 dawkach w pierwszym okresie immunizacji w czasie 1 miesiąca. (Boedeker, American Gastroenterological Assoc., tom 888, A-222 (1993)).

Polecana metoda immunizacji obejmuje podawanie kompozycji z peptydem ureazy Helicobacter w postaci cieczy lub zawiesiny zawierającej wodorowęglan sodowy lub podobną substancję w celu czasowego zobojętnienia soku żołądkowego. Substancję zobojętniającą można również podawać oddzielnie w czasie podawania kompozycji z peptydem, tak jak w postaci tabletek do żucia zawierających wodorowęglan sodowy. Sposobem alternatywnym kompozycje można podawać w postaci entero-powleczonych kapsułek. Takie metody pozwalają na unikanie problemów z rozkładem kompozycji ureazowej w czasie przechodzenia przez górne odcinki drogi pokarmowej. Metody takie zestawiono, na przykład w pracy Levine i Noriega, „Vaccines to Prevent Enteric Infections”, Ballieres Clin. Gastro., tom 7, 501-517 (1993).

Jakkolwiek wysokie dawki toksyny cholery nie są korzystne do stosowania dla ludzi jako dodatki do podawania na błony śluzowe, to inne dodatki do podawania na błony śluzowe znane specjalistom w tej dziedzinie i wymienione powyżej mogą być użyteczne do leczenia ludzi.

Krótki opis rysunków

Wynalazek zilustrowano na rysunkach, na których fig. 1 do fig. 8b przedstawiają graficznie wyniki podane w tabelach 1 do 9.

Figura 1 przedstawia graficznie wyniki prób na obecność przeciwciał w surowicy krwi (IgG) i wydzielanie jelitowe (IgA) u myszy, które nie były zabezpieczone po immunizacji ureazą, podane w tabeli 1.

Figura 2 przedstawia graficznie wyniki prób na obecność przeciwciał w surowicy krwi (IgG) i wydzielanie jelitowe (IgA) u myszy, które były zabezpieczone po immunizacji ureazą, podane w tabeli 2.

Figura 3 przedstawia graficznie wyniki prób na obecność przeciwciał w surowicy krwi (IgG) i wydzielanie jelitowe (IgA) u myszy, które nie były zabezpieczone po immunizacji sonikatem Helicobacter pylori, podane w tabeli 1.

Figura 4 przedstawia graficznie wyniki prób na obecność przeciwciał w surowicy krwi (IgG) i widzielanie jelitowe (IgA) u myszy, które były zabezpieczone po immunizacji sonikatem Helicobacter pylori, podane w tabeli 1.

Figura 5 przedstawia graficznie wyniki prób porównujących poziom zabezpieczenia uzyskany z Helicobacter pylori w porównaniu z wynikami uzyskanymi dla sonikatu Helicobacter pylori i toksyny cholery, przedstawione w tabeli 2.

179 149

Figury 6A i 6B przedstawiają graficznie wyniki prób podane w tabelach 5 i 6, przedstawiających oznaczenia aktywności ureazy u myszy prowokowanych, po doustnym zaszczepieniu, podjednostkami A i B rekombinantowej ureazy.

Figura 7 przedstawia graficzne wyniki prób podane w tabeli 8, przedstawiających oznaczenia aktywności ureazy tkanki żołądka jako odzwierciedlenie zainfekowania Helicobacter u myszy, traktowanych następnie podjednostką ure B Helicobacter pylori, lub tylko toksyną cholery i hydroksyapatytem. (pozornie immunizowanych), lub nie poddanych takiemu traktowaniu.

Figura 8A i 8B przedstawia graficznie wyniki prób podane w tabeli 9, przedstawiających oznaczenia aktywności ureazy tkanki żołądka jako odzwierciedlenie zainfekowania Helicobacter u myszy, traktowanych następnie podjednostką ure B Helicobacter pylori, lub tylko toksyną cholery i hydroksyapatytem (pozornie immunizowanych). W przypadku wyników przedstawionych na fig. 8B, myszy uśmiercano i próby ureazowe prowadzono 8 tygodni po ostatnim zaszczepieniu.

Twórcy stwierdzili, że doustne podawanie myszom preparatów poliaminokwasowych wykazujących epitopy ureazy Helicobacter pylori zwiększa immunologiczną reakcję ochronną wobec H. felis u myszy, zwierzęcia będącego cennym ogólnie przyjętym modelem do badania reakcji immunologicznych na zakażenie Helicobacter (Lee, A et al., „A Small Animal Model of Human Helicobacter pylori Active Chronic Gastritis” Gastroenterology, vol. 99,1315-1323 (1990) i uznanym patogenom, powodującym nieżyt żołądka u ludzi (Wegman, W et al., Schweig, Med. Wochenschr., vol. 121, 245-254 (1991)). Działanie immunologicznej reakcji ochronnej jest takie, że immunizowane zwierzęta, po prowokacji patogenem, mają znacznie zmniejszoną podatność na zainfekowanie w porównaniu ze zwierzętami, które nie były immunizowane. Ponadto, twórcy stwierdzili, że doustna immunizacja myszy za pomocą podjednostki B ureazy Helicobacter pylori, wytworzonej jako enzymatycznie nieaktywne białko rekombinantowe, zwiększa immunologiczną reakcję ochronną myszy na H. felis. Wpływ immunologicznej reakcji ochronnej jest taki, że immunizowane zwierzę, prowokowane patogenem, ma również znacznie zmniejszoną zapadalność na infekcję w porównaniu ze zwierzętami nieimmunizowanymi, które zostają zainfekowane.

Twórcy stwierdzili, że doustne podawanie białek ureazy Helicobacter myszom zainfekowanym H. felis powoduje ustępowanie infekcji. Wyniki wskazują, że doustne podawanie białek ureazy Helicobacter stanowi skuteczną terapię w leczeniu zakażeń Helicobacter u zwierząt. Doustne podawanie podjednostki B ureazy Helicobacter pylori, wytwarzanej jako enzymatycznie nieaktywne białko rekombinantowe znacznie zmniejsza poziom infekcji H. felis u zainfekowanych myszy w porównaniu z grupą kontrolną zainfekowanych myszy.

A. Kultury bakteryjne i oczyszczanie ureazy

Szczep Helicobacter pylori stosowany do badań pochodził od pacjenta z wrzodem dwunastnicy i prowadzono jego podhodowlę na płytkach z agaoząBHI do homogeniczności. Helicobacter pylori hodowano w odpowiedniej pożywce, zwykle na pożywce BHI (Brain-Heart Infusion), zawierającej 0,25% ekstraktu drożdży i 10% cielęcej surowicy płodowej i uzupełnionej 0,4% Camphylobacter jako selektywnym dopełniaczem (dopełniacz Skirrowa; Oxoid 69). Bakterie inkubowano w warunkach mikro-aerofilowych w temperaturze 37°C w butlach, które szczelnie zamykano i wytrząsano w ciągu 2 do 3 dni w temperaturze 37°C, tworząc ciekłą kulturę. Kulturę można także wytwarzać na płytkach agarowych zawierających BHI z 0,25% ekstraktu drożdży i 5% krwi owczej, w warunkach mikroaerofilowych w temperaturze 37°C w ciągu 3 dni. Ilość bakterii oznaczano za pomocą oznaczania gęstości optycznej roztworu BHI przy 660 nm, przy czym jedna jednostka gęstości optycznej odpowiadała 10⁸ bakterii. Kultury na płytkach agarowych przeprowadzano najpierw ponownie w stan zawiesiny w 154 mM NaCl.

Obecnie jednym z korzystnych źródeł wykazującym obecność epitopów ureazy jest oczyszczona ureaza, np. ureaza Helicobacter pylori, otrzymywana następującą ogólną metodą Dunn et al., J. Biol. Chem. 265, 9464-9469, zmodyfikowana jak opisano niżej. Po wyhodowaniu, zbiera się Helicobacter pylori w wodzie, wiruje, odwirowywuje i wiruje ponownie, aby wytworzyć supernatant. Roztwór wykazujący aktywność ureazy Helicobacter pylori (zbadany szybką próbą ureazową, patrz niżej) poddaje się następnie chromatografii na kolumnie CL-6B

179 149 i frakcje wykazujące silną aktywność ureazy zbiera się i dializuje w ciągu nocy a następnie ponownie poddaje chromatografii na aminowej żywicy jonowymiennej. Frakcje te eluuje się buforem NaCl o wzrastającym stężeniu a zebrane frakcje o silnej aktywności ureazy indywidualnie podaje się na żel SDS i zabarwia metodą Coomassie. Dwa oddzielne pasma odpowiadające masie cząsteczkowej około 63 i około 28 kDa identyfikowano jako ureazę. Frakcje zawierające ureazę zebrano, otrzymując oczyszczoną ureazę Helicobacter pylori o czystości rzędu 95-99%.

B. Immunizowanie doustnie oczy^s^^-z.oną ureazą Helicobacter pylori

Chociaż korzystnie jest stosować jako materiał antygeniczny oczyszczoną ureazę Helicobacter pylori otrzymaną jak opisano wyżej, zrozumiałe jest, że można także stosować jako materiał antygeniczny dowolną ureazę lub podjednostkę ureazy, zarówno występującą w naturze jak i otrzymaną technikami rekombinacji DNA, a także ich trawione fragmenty, białka otrzymane przez fuzję, zawierające fragmenty ureazy lub pełną ureazę, obcięte prostopadle do powierzchni konstrukty ureazy, lub inne białko lub preparaty białkowe wykazujące obecność epitopów ureazy, zdolne do wywoływania ochronnej reakcji immunologicznej na zainfekowanie Helicobacter (patrz niżej). Tak więc, można stosować ureazę zasadniczo homologiczną z ureazą Helicobacter pylori, i skutecznie zwiększającą wzrost krzyżowej ochronnej reakcji immunologicznej wobec Helicobacter. Przykładową taką ureazą jest ureaza fasoli (jack bean), o homologiczności około 70% z ureazą Helicobacter pylori. Chociaż już ustalono, że ureaza fasoli jack bean byłaby skutecznym antygenem do zapobiegania infekcjom Helicobacter pylori, nie uważa się jednak, aby było to prawdziwe, (patrz Chen, M. et al., „Failure of Immunization Against Helicobacter using Jack Bean Urease”, Acta gastroenterol. Belg., vol. 56, 94 (1993)). W szczepione według wynalazku można stosować nienaruszoną ureazę i dowolny preparatu poliaminokwasowego, wykazujący epitopy ureazy wystarczająco homologiczne z ureazą Helicobacter pylori aby wywoływać ochronna, reakcję immunologiczną gospodarza na infekcję Helicobacter. Odpowiednia ureaza musi mieć dostateczną homologiczność z ureazą H. pylori aby wywoływać ochronną reakcję immunologiczną przeciw zakażeniom Helicobacter. Zwykle, jako antygen ureazowy, można stosować ureazę o homologii większej niż 70%, np. 80 - 90%, w stosunku do ureazy Helicobacter pylori.

Nieograniczająca wynalazku lista źródeł potencjalnie użytecznych preparatów ureazowych obejmuje endogeniczne enzymy ureazy różnych szczepów Helicobacter, ureazę z innych bakterii, takich jak Klebsiella pneumoniae lub Proteus mirabilis, i przez analogię, każdą inną ureazę pod warunkiem, że ureazy te mają epitopy reagujące krzyżowo z ureazą z Helicobacter pylori. Geny ureazy wszystkich wspomnianych wyżej organizmów stanowią potencjalne narzędzie do ekspresji rekombinantowych produktów ureazowych jako pełne białko lub jako jego części.

Nieograniczająca wynalazku lista źródeł potencjalnie użytecznych preparatów ureazowych obejmuje peptydy wytwarzane z oczyszczonej ureazy (źródła wspomnianego poprzednio), przy użyciu procedur fizycznego i/lub chemicznego odszczepiania (np. CnBr) i/lub odszczepiania proteolitycznego (przy użyciu proteazy, np. V8-proteazy, trypsyny lub innych); lub peptydy syntetyzowane chemicznie i zachowujące krzyżowo reaktywne epitopy z ureazą.

Inne źródła potencjalnie użytecznych epitopów obejmują epitopy identyfikowane ze względu na ich krzyżową reaktywność z ureazą, jak wynik skriningu z przeciwciałami przeciw ureazie. Peptydy te mogą być peptydami występującymi w naturze lub peptydami powstałymi w wyniku syntezy chemicznej. Co więcej, takie peptydy mogą powstawać w wyniku ekspresji rekombinantowych statystycznych oligonukleotydów.

Inne źródło potencjalnie przydatnych epitopów obejmuje epitopy podobne do ureazy, będące wynikiem tworzenia antyidiotypowych przeciwciał dla ureazy. Takie antyidiotypiczne przeciwciała, wytwarzane w dowolnym kompetentnym immunologicznie gospodarzu, otrzymuje się przez immunizowanie tych gospodarzy przeciwciałami przeciw ureazie, w celu wytwarzania przeciwciał ukierunkowanych przeciw przeciwciałom antyureazowym, o wspólnej z ureazą homologii strukturalnej.

Dyskusję skupiono tu na stosowaniu ureazy wytwarzanej naturalnie przez Helicobacter pylori (sekcja B). Należy jednak przyznać, że wspomniane wyżej ureaza lub jej podjednostki

177)149 bądź konstrukty, zdolne do wywoływania pożądanej ochronnej reakcji immunologicznej, mogą być wytwarzane technikami rekombinacji DNA, dobrze znanymi w technice. Skuteczność konkretnych preparatów można oznaczać przez rutynowe podawanie przy użyciu modeli zwierzęcych, doustne podawanie kandydatom szczepionki, i prowokowanie patogenem, stosując protokół postępowania zasadniczo podobny lub identyczny ze sposobem postępowania opisanym niżej.

Fachowcy przyznają, że do podawania peptydów ureazy Helicobacter można stosować inne metody. Np. peptydy ureazy można podawać jako część preparatu z nośnikiem w postaci mikrokulek. Bez ograniczania rodzaju nośnika stosowanego w postaci mikrokulek, jednym z przykładów byłoby podawanie peptydów ureazy jako składnika preparatu zawierającego jako nośnik polilaktydowe-koglikolidowe mikrokapsułki, ulegające biodegradacji.

Innym sposobem podawania peptydów ureazy Helicobacter byłaby ekspresja peptydów ureazy w postaci rekombinantowej w żywym wektorze bakteryjnym lub wirusowym. Aby skonstruować taki żywy wektor, należy włączyć do materiału genetycznego żywego wektora sekwencje nukloeotydowe kodujące peptydy ureazy. Taki żywy wektor podawano by osobnikowi w' celu zapobieżenia infekcjom Helicobacter a także w t^^lu traktowania osobnika zainfekowanego przez Helicobacter. Fachowcy wiedzą, że do odpowiednich żywych wektorów należą Salomonella typhimurium, Salomonella typhi, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, BCG, Eschericha coli, Vibrio cholerae, Campylobacter, drożdże, wirus Herpes, Adenovirus, Poliovirus, Vaccina i Aviopox. Ponadto, aby zapewnić peptyd ureazę, można stosować rekombinantowy układ nośnikowy, powodujący ekspresję ureazy Helicobacter, taki jak wirusopodobne cząstki Bluetongue, wirusopodobne cząstki Rotavirus lub cząstki Ty. Podana lista nie stanowi ograniczenia wynalazku. Żywy wektor lub układ nośnikowy można także podawać śluzówkowo tak, że peptydy rekombinantowej ureazy, których ekspresję powodowałby żywy wektor, byłyby podawane na powierzchnię śluzówki.

W tabelach 1 i 2 niżej oraz fig. 1-5 podają wyniki uzyskane, gdy myszy doustnie immunizowano oczyszczoną ureazą Helicobacter pylori. W pierwszej próbie, podawanie antygenu Helicobacter pylori prowadzono przez doustne podawanie myszom ureazy Helicobacter pylori oczyszczonej jak opisano w punkcie A, sprzężonej z kryształami hydroksyapatytu, stosowanymi jako nośnik, aby zwiększyć wychwytywanie i wiązanie komórek M. Toksynę cholery (Sigma) podawano jako mukozalny adjuwant. W próbie tej, grupy żeńskich osobników sześciotygodniowych myszy SPF BALB/c immunizowano doustnie 30 pg oczyszczonej ureazy Helicobacter pylori sprzężonej z 1 mg hydroksyapatytu plus 10 pg adjuwanta stanowiącego toksynę cholery w dniu 0, 7, 14 i 21 próby. Następnie myszy dwukrotnie prowokowano 10* H. felis, w 28 i 30 dniu próby. Dla celów porównawczych, podobne żeńskie osobniki sześciotygodniowych myszy SPF BALB/c immunizowano doustnie pełnym lizatem (sonikat) Helicobacter pylori i 10 pg adjuwanta stanowiącego toksynę cholery, w dniu 0, 7, 14 i 21 próby. Następnie myszy dwukrotnie prowokowano 10⁸ H. felis, w 28 i 30 dniu próby. Sonikat Helicobacter pylori sporządzono, zbierając Helicobacter pylori z hodowli komórkowej, tabletkując przez odwirowanie i ponownie przeprowadzając tabletkę w zawiesinę w 0,9% roztworze chlorku sodu, i następnie poddając zawiesinę sonifikacji.

Jako grupę kontrolną, żeńskie osobniki sześciotygodniowych myszy SPF BALB/c pozornie immunizowano doustnie 10 pg toksyny cholery i 1 mg hydroksyapatytu w dniu 0, 7, 14 i 21 próby. Następnie myszy dwukrotnie prowokowano H. felis, w 28 i 30 dniu próby. Wszystkie myszy przechowywano i immunizowano równolegle. Wszystkie myszy poddane próbie uśmiercano w 35 dniu próby.

C. Doustna immunizacja rekombinowanymi podjednostkami ureazy Helicobacter pylori.

Geny kodujące strukturalne podjednostki A i B ureazy Helicobacter pylori uzyskuje się za pomocą polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), klonując zgodnie ze standardowymi procedurami, w oparciu o poprzednio wymienione sekwencje. (C.L. Clayton i jego współpracownicy „Nucleotide Sequence of Two Genes from Helicobacter pylori Encoding for Urease Subunits” Nucleic Acid Res., tom 18, 362 (1990). Geny te poddaje się insercji do wektora (zwanego pEV40), polecanego ze względu na wysoką ekspresję i łatwość oczyszczania od obcych genów w E. coli. Krótko, te obce geny są insertowane w dolnym strumieniu

179 149 termorepresyjnego promotora i w strukturze sekwencji kodującej powtarzają sześć histydyn. Gen ampR jest obecny w tym wektorze dla wybrania transformantów. W odpowiednich warunkach temperaturowych uzyskuje się rekombinowane białko zaopatrzone w części N-terminalnej w sześć histydyn, co pozwala wjednym etapie przeprowadzić oczyszczanie na kolumnie niklowej. Obydwie rekombinowane podjednostki A i B ureazy Helicobacter pylori, ulegają oddzielnej ekspresji do E. coli i oczyszczanie na niklowej kolumnie zapewnia czystość wyższą niż 95%.

Jakkolwiek korzystnie, jako antygenowy materiał stosuje się rekombinowaną ureazę Helicobacter pylori uzyskaną sposobem opisanym powyżej, to zrozumiałym jest, że możliwym jest zastosowanie jakiejkolwiek ureazy lub podjednostki ureazy uzyskanej technikami rekombinacji (na przykład, metodą fuzji białek), przy ekspresji antygenowych miejsc ureazy, które są zdolne do wywołania ochronnej reakcji immunologicznej w odniesieniu do zakażenia Helicobacter. Tak więc, możliwym jest zastosowanie w strukturze genu ureazy wykazującego zasadniczą homologię w odniesieniu do ureazy Helicobacter pylori i który jest skuteczny w wywołaniu krzyżowoochronnej immunologicznej reakcji w stosunku do Helicobacter. Przykładami takich ureaz są ureaza fasoli (ang. jack bean), która wykazuje około 70% homologii z ureazą Helicobacter pylori lub ureazą H. felis, która wykazuje około 88% homologii z ureazą Helicobacter pylori. Wynalazek nie ogranicza się do stosowania genów ureazy Helicobacter pylori i ich produktów genowych i proponuje wykorzystanie jakichkolwiek rekombinowanych ureaz lub ich podjednostek, które są dostatecznie zamknięte antygenicznie dla wytworzenia ochronnej reakcji immunologicznej w organizmie zakażonym Helicobacter. W zakresie wynalazku znajduje się zastosowanie jakiejkolwiek ureazy lub podjednostki ureazy, zarówno pochodzenia naturalnego jak i otrzymanej w wyniku zastosowania technik rekombinacji DNA, oraz trawionych ich fragmentów lub peptydów, fuzji białek zawierających całe ureazy, ich podjednostki lub fragmenty, lub ścięte konstrukcje ureazy, które skutecznie zmniejszają poziom zakażenia Helicobacter w zakażonych ssakach. Zwykle rekombinowane ureazy wykazujące 70-95% homologii, na przykład, 80-90% homologii w odniesieniu do ureazy Helicobacter pylori można stosować jako antygeny rekombinowanej ureazy stosowane w szczepionce według niniejszego wynalazku.

Niniejsza dyskusja skupia się na wykorzystaniu rekombinowanych podjednostek A i B ureazy Helicobacter pylori wytwarzanych przez E. coli (sekcja C). Jednak docenić należy, że rekombinowane ureazy i podjednostki lub ich konstrukcje wymienione powyżej, zdolne do wywołania pożądanej ochronnej reakcji immunologicznej, można wytwarzać przy użyciu różnych technik rekombinacji DNA i innych eukariotycznych lub prokariotycznych ekspresyjnych wektorów, dobrze znanych w tej dziedzinie.

Tabele 3,4 i 5 oraz rysunek figura 6, opisane poniżej, przedstawiają wyniki uzyskane po doustnym immunizowaniu myszy rekombinowanymi podjednostkami ureazy Helicobacter pylori wytwarzanymi w E. coli. W doświadczeniu tym, antygen Helicobacter pylori doustnie podawano myszy w postaci rekombinowanych podjednostek A i B ureazy Helicobacter pylori wytwarzanych w E. coli i oczyszczanych sposobem opisanym powyżej. Antygen podawano w połączeniu z kryształami hydroksyapatytu stosowanymi jako nośnik ułatwiający wiązanie w komórce M i przechodzenie. Jako dodatek do podawania na błony śluzowe stosuje się toksynę cholery (Sigma). W doświadczeniu tym, grupy samic myszy rasy SPF BALB/c w wieku 6 tygodni, poddaje się immunizacji za pomocą 30 pg rekombinowanej podjednostki A ureazy Helicobacter pylori, w połączeniu z 1 mg hydroksyapatytu i 10 pg dodatku - toksyny cholery w dniu 0, 8, 14 i 21. Następnie myszy zakaża się dawką 10⁸ H. felis w dniu 32, 34 i 36. Dla porównania podobne samice myszy rasy SPF BALB/c w wieku 6 tygodni doustnie immunizuje się 30 pg rekombinowanej podjednostki B ureazy Helicobacter pylori w połączeniu z hydroksyapatyten i 10 pg toksyny cholery w dniu 0, 8, 14 i 21. Myszy te zakaża się trzykrotnie w dniu 32, 34 i 36 szczepem H. felis. W celu kontroli, samice rasy SPF BALB/c w wieku 6 tygodni doustnie fikcyjnie immunizuje się 10 pg toksyny cholery i 1 mg hydroksyapatytu w dniu 0, 8, 14 i 21. Myszy zakaża się w dniu 32, 34 i 36 przy użyciu H. felis. Wszystkie myszy poddawane badaniom immunizuje się i zakaża równolegle. Zwierzęta zabija się w 48 dniu (12 dni po zakażeniu) lub 10 tygodni po zakażeniu.

179 149

D. Analiza biopsji żołądka, krwi i wydzielin jelitowych.

Biopsje wykonuje się z żołądka, a krew pobiera się z serca. Jelita usuwa się i przemywa 1 milimolowym PMST (Boeringher) w buforze PB5, w celu uzyskania jelitowych wydzielin dla analizy ELISA.

W celu określenia ochrony przed rozwojem H. felis, żołądkowe biopsje z każdego zwierzęcia poddaje się przesiewaniu na obecność H. felis, poprzez szybkie określenie aktywności ureazy w teście Jatrox HP (Rohm Pharma), zgodnie z przepisem dostawcy. Krótko, biopsje żołądkowe zanurza się w 0,5 ml dostarczonej mieszaniny mocznika i czerwieni fenolowej, stosowanych jako wskaźnik pH. Nie handlowa wersja mieszaniny mocznika i czerwieni fenolowej, znana dla specjalistów w tej dziedzinie może zawierać, na przykład, ekstrakt drożdży Bacto (0,1g), fosforan jednopotasowy (0,091 g), fosforan dipotasowy (0,095 g), mocznik (20 g), i czerwień fenolową bacto (0,01 g), co daje końcową wartość pH 6,9 w temperaturze 25°C. Aktywna ureaza wytwarza amoniak i dwuwęglan z mocznika, co powoduje kolorymetryczną zmianę roztworu w kierunku wyższej absorbancji 550 nm. Aktywność ureazy ilościowo mierzy się metodami analizy spektrofotometrycznej. Inne metody oznaczania aktywności ureazy znane są specjalistom i można je znaleźć, na przykład, w pracy H.L.T. Mobleya i R.P. Hausingera, „Microbial Ureases: Significance, Regulation, and Molecular Characterization”, Microb. Reviews, tom 53, 85-108 (1989).

Biopsje z żołądka każdego zwierzęcia objętego doświadczeniem opisanym w sekcji B poddaje się hodowli na BHI agarowych płytkach, przygotowanych jak opisano powyżej, w celu oznaczenia szczepu H. felis. Po inkubowaniu w czasie 3 do 10 dni w warunkach mikroaerofilowych, obecność H. felis potwierdza się poprzez barwienie odczynnikiem Grama i oznaczenie aktywności ureazy. Bardzo znacząca korelacja charakteryzowała wyniki uzyskane dla oznaczania H. felis w biopsjach z żołądka w testach ureazowych i w hodowlach H. felis w czasie pierwszej serii doświadczeń (patrz tabela 3). Dlatego tylko ureazowe testy przeprowadzono na biopsjach z żołądka przeprowadzonych w celu wykrycia H. felis i opisanych w sekcji C. Oznaczenia H. felis potwierdzono mikroskopowo przez dwóch niezależnych badaczy przy użyciu dwóch różnych wybarwień (oranż akrydynowy i fiolet krezylowy).

Próbki krwi pozostawiano do skrzepnięcia w czasie 3 godzin w temperaturze pokojowej, zbierano surowicę i zamrażano w temperaturze -20°C do przeprowadzenia dalszej analizy. Wydzieliny jelitowe mieszano w czasie 5 minut w temperaturze 4°C w celu usunięcia grudek i zamrażono w temperaturze -20°C. Surowicę i próbki wydzieliny jelitowej każdego ze zwierząt analizuje się metodą ELISA w celu określenia aktywności anty-Helicobacter, zgodnie ze standardową procedurą. Krótko, 96 płytek powleka się sonikatem Helicobacter pylori i następnie nasyca 5% mlekiem odtłuszczonym. Próbki kolejno rozcieńcza się od 1:1 do 1:1000 i inkubuje w czasie nocy w temperaturze 4°C na płytkach ELISA. W celu określenia poziomu przeciwciał stosuje się biotynylowane anty-mysie IgG (surowica) i anty-mysie IgA, a następnie streptawidynę z peroksydazą chrzanową.

Wyniki zakażenia H. felis po immunizacji oczyszczoną ureazą Helicobacter pylori umieszcza się w tabelach 1 - 3 i na rysunkach fig. 1-4, zaś wyniki zakażenia H. felis po immunizacji rekombinowanymi podjednostkami A i B ureazy Helicobacter pylori zamieszcza się w tabelach 4 - 6 i na rysunkach fig. 5 i 6.

Tabela 1

nr myszy	Immunizacja	test ureazowy	Hodowla Gram	Immunoglobuliny
Surowica	Wydzielina jelitowa
1	2	3	4	5	6	7	8
		12 h		Ig	IgG	Ig	IgA
1	Ureaza + HF	+	H. felis	27	0	25	258
2	Ureaza + HF	0	0	264	273	221	246

179 149

c.d. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7 ί	8
3	Ureaza + HF	0	0	84	44	318	354
4	Ureaza + HF	+	H. felis	81	42	12	5
5	Ureaza + HF	0	0	98	137	126	234
6	Ureaza + HP	0	0	968	2093	31	22
7	Ureaza + HF	0	0	98	0	96	34
8	Ureaza + Hr	0	0	247	1010	214	128
9	Ureaza + HF	0	0	N.D.	N.D.	48	23
10	Ureaza + HF	0	0	50	0	124	99
11	Ureaza	0	0	319	205	44	53
12	Ureaza	0	0	14	0	96	87
13	Ureaza	0	0	0	0	0	0
14	Ureaza	0	0	0	0	43	61
15	Ureaza	0	0	58	0	110	127
16	Ureaza	0	0	140	63	21	37
17	Ureaza	0	0	84	240	114	280
18	Ureaza	0	0	N.D.	N.D.	93	148
19	Ureaza	0	0	45	0	135	216
20	Ureaza	0	0	261	197	161	261
21	CT+HF	0	0	0	0	0	2
22	CT+HF	+	H.felis	63	0	310	303
23	CT+HF	+	H.felis	90	0	N.D.	N.D.
24	CT+HF	+	H.felis	31	0	150	192
25	CT+HF	+	H.felis	197	250	250	440
26	CT+HF	+	H.felis	105	135	214	138
27	CT+HF	+	H.felis	140	47	109	55
28	CT+HF	+	0	0	0	16	15
29	CT+HF	+	H.felis	0	0	0	0
30	CT+HF	+	H.felis	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
31	sonikat HF+HF	+	H.felis	0	0	76	103
32	sonikat HF+HF	+	H.felis	77	0	11	33
33	sonikat HF+HF	+	H.felis	549	748	57	36
34	sonikat HF+HF	0	0	660	153	180	286
35	sonikat HF+HF	+	H.felis	730	192	0	5
36	sonikat HF+HF	+	H.felis	32	0	5	64

179 149

c.d. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8
37	sonikat HF+HF	0	0	400	400	312	1149
38	sonikat HF+HF	+	H.felis	1007	1360	149	26
39	sonikat HF+HF	0	0	220	186	133	122
40	sonikat HF	0	0	873	1016	352	514
41	sonikat HF	0	0	727	899	126	191
42	sonikat HF	0	0	109	68	44	83
43	sonikat HF	0	0	147	949	167	97
44	sonikat HF	0	0	845	1094	246	64
45	sonikat HF	0	0	1217	1198	210	157
46	sonikat HF	0	0	81	0	256	218
47	sonikat HF	0	0	329	210	241	276
48	sonikat HF	0	0	1049	737	197	211

W tabeli 1, która dotyczy doświadczenia opisanego w sekcji B „h” oznacza godziny, „Ig” oznacza immunoglobulinę, „ND” oznacza „nie oznaczano”, „ureaza + HF” oznacza, że myszy immunizowano ureazą (sprzężoną z hydroksyapatytem, z toksyną cholery), z prowokacją H. felis, „ureaza” oznacza, że myszy immunizowano ureazą (sprzężoną z hydroksyapatytem, z toksyną cholery) bez prowokowania, „CT+HF” oznacza, że myszy fałszywie immunizowano toksyną cholery i prowokowano H. felis, „sonikat HP + HF” oznacza, że myszy immunizowano sonikatem Helicobacter pylori z toksyną cholery i prowokowano H. felis, a „sonikat HP” oznacza, że myszy immunizowano sonikatem Helicobacter pylori z toksyną cholery i nie prowokowano. W tabeli 1 wyniki ilości przeciwciał podano jako miarę absorbancji przy 595 nm pomnożoną przez 1000. Miarę tła w nieobecności przeciwciał odejmowano.

Wyniki doświadczenia opisanego w sekcji B, uzyskane na podstawie testów ureazowych biopsji żołądkowych i barwienia Grama hodowli H. felis zestawiono w tabeli 2. Infekcję określano u myszy z jednym lub więcej markerami kolonizacji przez H. felis, obejmującymi ureazę lub barwienie Grama hodowli.

Tabela 2

Immunizacja	Prowokacja	% zainfekowany	% chroniony
Ureaza	H. felis	3/10 (30%)	7/10 (70%)*
Sonikat	H. felis	6/9 (66%)	3/9 (33%)**
CT	H felis	9/10 (90%)	1/10(10%)

* p = 0,0198 (dwudrożny dokładny test Fishera) w porównaniu z kontrolną CT ** P = 0,303 (dwudrożny dokładny test Fishera) w porównaniu z kontrolną CT

Jak to można stwierdzić na podstawie wyników zamieszczonych w tabelach 1 i 2, statystycznie znaczącą ochronę przed prowokacją H. felis uzyskuje się przy doustnym immunizowaniu z zastosowaniem ureazy Helicobacter pylori w porównaniu zastosowaniem sonikatu (produktu obróbki ultradźwiękami) Helicobacter pylori lub toksyny cholery. Z tabeli 2 wynika, że spośród 10 immunizowanych myszy tylko 3 zostały zainfekowane w porównaniu z 6 zwierzętami immunizowanymi sonikatem Helicobacter pylori i 9 zwierzętami immunizowanymi toksyną cholery. Z tabeli 2 wynika, że 70% zwierząt była chroniona przed prowokacją H. felis w porównaniu z 33% zwierząt immunizowanych sonikatem Helicobacter pylori

17?) 149 i 10% zwierząt immunizowanych toksyną cholery, z wykonaną następnie prowokacją H. felis. Innymi słowy 90% kontrolnych myszy wystawionych na działanie H. felis została zainfekowana przez ten patogen, podczas gdy w przypadku myszy immunizowanych ureazą Helicobacter pylori na 28 dni przed prowokacją H. felis stopień infekcji wynosił jedynie 30%.

Stanowi to znaczące obniżenie infekcji (p = 0,0198 w dwudrożnym dokładnym teście Fishera w porównaniu z myszami kontrolnymi). Gdy myszy immunizowano doustnie sonikatem Helicobacter pylori, stopień infekcji wynosił 67% (nieznaczący statystycznie w porównaniu z myszami kontrolnymi). Ochrona zapewniana przez ureazę Helicobacter pylori jest nieoczekiwana i nie można jej było przewidzieć na podstawie wyników uzyskanych przy zastosowaniu sonikatu Helicobacter pylori.

W odniesieniu do fig. 1 - 4 na fig. 1 przedstawiono graficznie wyniki testów dla przeciwciał w surowicy (IgG) i wydzielinie jelitowej (IgA) myszy nie chronionych po immunizacji ureazą Są to myszy o numerach 1, 4 i 6 z tabeli 1, stanowiące grupę A. Na fig. 2 pokazano reakcję na przeciwciała u myszy chronionych po immunizacji ureazą (grupa B), czyli myszy 2,3, 5 i 7-10.

Na fig. 3 i 4 przedstawiono wyniki uzyskane dla myszy nr 31-39. Na fig. 3 (grupa C) przedstawiono reakcję na przeciwciała u myszy nie chronionych po immunizacji sonikatem Helicobacter pylori (myszy nr 31, 32, 33, 35, 36 i 38), a na fig. 4 (grupa D) przedstawiono reakcję na przeciwciała u myszy chronionych po immunizacji sonikatem Helicobacter pylori (myszy nr 34, 37 i 39). W odniesieniu do fig. 3 i 4 należy podkreślić, że reakcja na przeciwciała IgA (ale nie na IgG) jest silniejsza u myszy chronionych niż u myszy nie chronionych, co sugeruje występowanie korelacji między ochroną i reakcją ma IgA. W przypadku reakcji na IgG w surowicy korelacja nie występuje. Wiadomo, że IgA błony śluzowej (ale nie IgG surowicy) odgrywa rolę w ochronie przed infekcjami bakteryjnymi w jelicie (McGhee J.R. i Kyono H. „New Perspectives in Vaccine Development; Mucasal Immunity to Infections” Infect Agents Dis., vol. 2, 55-73 (1993)).

Wyniki korelacji między wykrywaniem H. felis w biopsjach żołądkowych i testami ureazowymi i z wykorzystaniem hodowli przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

	Test ureazowy +	Test ureazowy -	Łącznie
H. felis hodowla (+)	16	0	16
H. felis hodowla (-)	2	30	32
Łącznie	18	30	48

dwudrożny dokładny test Fishera: p < 0,00001

Z tabeli 3 wynika, że występuje bardzo znacząca korelacja między wynikami testów ureazowych przeprowadzonych na biopsjach żołądkowych i identyfikacją H. felis na podstawie hodowli. Wszystkie zwierzęta z tabeli 3, dla których uzyskano wynik dodatni w teście ureazowym, były również H. felis-dodatnie histopatologicznie. W związku z tym, że w hodowlach wykrywa się rzadziej infekcję H. felis niż w testach ureazowych, testy ureazowe preferowano w diagnozowaniu infekcji H. felis u myszy w późniejszych doświadczeniach, z uwagi na ich wyższą czułość. Takie rozwiązanie umożliwiło powtórzenie testów ureazowych na większych fragmentach żołądka każdej myszy, co jeszcze zwiększyło czułość testu ureazowego. Ponadto zastosowanie metody o większej czułości zapobiega przecenianiu ochrony uzyskiwanej przez badaną szczepionkę. Przy zastosowaniu dodatniej hodowli jako wzorca dla infekcji ochrona wywołana po immunizacji ureazą w doświadczeniu z sekcji B była tak samo znacząca jak przy kombinowanym zastosowaniu testu ureazowego i hodowli (odpowiednio p=0,021 i p=0,019).

Wyniki doświadczeń opisanych w części C (podjednostki zrekombinowanej ureazy), uzyskane na podstawie testów ureazowych na biopsjach żołądkowych, przedstawiono w tabelach 4, 5 i 6 oraz na fig. 6.

179 149

Tabela 4

179 149

c.d. tabeli 4

1	2	3	4
ure A + HAP + CT Uśmiercono w 10 tygodni po prowokowaniu ure B + HAP + CT Uśmiercono w 10 tygodni po prowokowaniu	68	0,00	-
69	0,07	-
70	0,42	+
71	0,00	-
72	0,00	-
73	0,37	+
74	0,00	-
75	0,37	+
76	0,00	-
77	0,00	-
78	0,00	-
79	0,39	+
80	0,00	-
81	0,37	+
82	0,00	-

W tabeli 4 „CT” oznacza toksynę cholery; „Ure A” oznacza podjednostkę A zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori, „Ure B” oznacza podjednostkę B zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori, a „HAP” oznacza kryształy hydroksyapatytu. Myszy 20-54 uśmiercono w 12 dni po prowokacji, a myszy 68-82 w 10 tygodni (106 dni) po prowokacji. Wyniki testu ureazowego przeprowadzonego na biopsjach żołądka każdego zwierzęcia przedstawiono jako wielkości gęstości optycznej (O.D.) przy 550 nm. Wielkość O.D. dla samego roztworu testowego (0,075) odejmowano jako tło do wielkości O.D. uzyskanej dla każdej myszy. Znaki „+” i oznaczają stan infekcji u poszczególnych zwierząt, zgodnie z dodatnim lub ujemnym wynikiem testu ureazowego na wykrywanie H. felis. Wynik dodatni: O.D.550 > 0,2. Wielkość 0,2 przyjęto jako oznakę dodatniej infekcji, gdyż przy tej wielkości można było zaobserwować gołym okiem zmianę zabarwienia pod wpływem roztworu Jatrox.

Tabela 5

Ochrona oznaczona w 12 dni po prowokacji

Immunizacja	Prowokacja	% infekcji	% ochrony
Podjednostka A ureazy	H. felis	10/10(100%)	0/10 (0%)
Podjednostka B ureazy	H. felis	3/10(30%)	7/10 (70%)*
CT	H. felis	10/10(100%)	0/10(0%)

*p = 0,0031 (dwudrożny dokładny test Fishera) w porównaniu z kontrolną CT

179 149

Tabela 6

Ochrona oznaczona w 10 tygodni po prowokacji

Immunizacja	Prowokacja	% infekcji	% ochrony
Podjednostka A ureazy	H. felis	1/5 (20%)	4/5 (80%)*
Podjednostka B ureazy	H. felis	4/10(40%)	6/10 (60%)**

*p = 0,003 (dwudrożny dokładny test Fishera) w porównaniu z kontrolną CT **p = 0,01 (dwudrożny dokładny test Fishera) w porównaniu z kontrolną CT

Na podstawie wyników zamieszczonych w tabelach 4, 5 i 6 można stwierdzić, że statystycznie znaczącą ochronę przed prowokacją H. felis uzyskuje się przy doustnej immunizacji z zastosowaniem podjednostki B ureazy zrekombinowanego Helicobacter pylori w porównaniu z ochroną zapewnianą przez podjednostkę A zrekombinowanego Helicobacter pylori i toksynę cholery. Z tabeli 4 wynika, że w 12 dni po prowokacji z 10 immunizowanych zwierząt tylko u 3 stwierdzono infekcję w grupie z podjednostką B ureazy w porównaniu ze wszystkimi 10 zwierzętami immunizowanymi podjednostką A ureazy Helicobacter pylori i 10 spośród 10 zwierząt immunizowanych toksyną cholery. Z tabeli 4 wynika, że 70% zwierząt chronionych było przed prowokacja. H. felis w porównaniu z 0% zwierząt immunizowanych podjednostką. A ureazy Helicobacter pylori i 0% zwierząt immunizowanych toksyną cholery, a następnie poddanych prowokacji H. felis. Innymi słowy 100% myszy kontrolnych zostało zainfekowanych po prowokacji H. felis, podczas gdy w przypadku zwierząt immunizowanych podjednostką B ureazy zrekombinowanego Helicobacter pylori stopień infekcji wyniósł zaledwie 30%. Oznacza to znaczące zmniejszenie infekcji (p=0,0031 w dokładnym teście Fishera) w porównaniu z myszami kontrolnymi. Faktu, że ochrona zaobserwowana w przypadku ureazy Helicobacter pylori została w całości odtworzona w wyniku immunizowania podjednostką A ureazy, a podjednostką B nie wykazywała tego działania, nie można było przewidzieć na podstawie doświadczeń z oczyszczoną ureazą. Z tego względu określenie znaczenia 2 strukturalnych podjednostek ureazy w rozwijaniu się ochronnej reakcji odpornościowej stanowi nowość. Ochrona uzyskiwana przy zastosowaniu zrekombinowanych podjednostek ureazy, które są enzymatycznie nieaktywne, wykazuje również, że nietoksyczne formy ureazy można wykorzystać jako doustną szczepionkę przed infekcją Helicobacter. Ponadto wyniki te wyraźnie sugerują, że rozpoznawanie miejsca aktywnego nie jest konieczne dla ochrony, gdyż jest mało prawdopodobne, aby nieaktywna podjednostką B ureazy indukowała przeciwciała, które mogłyby rozpoznawać i inhibitować miejsca katalityczne natywnej ureazy.

Z tabeli 6 wynika, że gdy 20 myszy uśmiercono w 10 tygodni po infekcji, 60% (6 myszy z 10) zwierząt immunizowanych podjednostką B ureazy i 80% (4 myszy z 5) zwierząt immunizowanych podjednostką A ureazy Helicobacter pylori było chronionych przed infekcją H. felis. Faktu, że ochrona uzyskiwana w wyniku immunizowania podjednostką B ureazy będzie zachowywana w czasie, oraz że immunizowanie ureazą A wywołuje ochronę opóźnioną w stosunku do wywoływanej przez podjednostkę B ureazy, nie można było przewidzieć na podstawie doświadczeń z oczyszczoną ureazą oraz na podstawie innego doświadczenia przeprowadzonego wcześniej. Fakt, że immunizowanie podjednostką A ureazy zapewnia ochronę definitywnie potwierdza, że rozpoznawanie miejsca aktywnego nie jest konieczne dla ochrony.

Na fig. 6 zestawiono wyniki uzyskane po doustnym immunizowaniu podjednostkami A i B zrekombinowanej ureazy (przedstawione w tabeli 5 i 6).

Drugą grupę myszy immunizowano i zbadano pod względem infekcji Helicobacter felis w 1O tygodni po prowokacji, zgodnie z procedurą opisaną w sekcji C. W przykładzie tym 12 myszy fałszywie immunizowano samą toksyną cholery, 12 myszy immunizowano zrekombinowaną podjednostką ure A a 10 myszy immunizowano zrekombinowaną podjednostką ure B. Średni poziom aktywności ureazowej w próbkach żołądka myszy immunizowanych ure B, ale nie zainfekowanych (nie zainfekowane myszy kontrolne) wynosił 0,045 i tą wielkość odejmowano jako tło od każdej uzyskanej wielkości O.D.. Myszy uznawano

179 149 za zainfekowane, gdy wielkość O.D. przewyższała ponad dwukrotnie odchylenie standardowe wielkości uzyskanej dla nie zainfekowanych myszy kontrolnych; odchylenie standardowe wynosiło 0,022. Wyniki uzyskane w tym doświadczeniu przedstawiono w tabeli 7.

Tabela 7

Immunizacja	Nr myszy	Test ureazowy	Infekcja
1	2	3	4
CT Uśmiercone w 10 tygodni po prowokacji ure A + HAP + CT Uśmiercone w 10 tygodni po prowokacji	20	0,49	+
135	0,40	+
136	0,28	+
137	0,25	+
138	0,10	+
139	0,10	+
140	0,34	+
141	0,41	+
142	0,36	+
143	0,46	+
144	0,40	+
145	0,40	+
146	0,51	+
161	0,12	+
162	0,47	+
193	0,00	-
164	0,00	-
165	0,02	-
166	0,01	-
167	0,01	-
168	0,37	+
169	0,00	-
170	0,39	+
171	0,47	+
172	0,00	-

179 149

c.d. tabeli 7

1	2	3	4
ure B + HAP + CT Uśmiercone w 10 tygodni po prowokacji	151	0,00	-
152	0,00	-
153	0,00	-
154	0,03	-
155	0,00	-
156	0,00	-
157	0,02	-
158	0,00	-
159	0,01	-
160	0,00

Wykorzystując wariantową metodę analizy wyniki przedstawione w tabeli 4 poddano ponownie analizie wraz z danymi z tabeli 7. Zamiast odejmowania wielkości O.D. tła uzyskanej dla samego testowego roztworu ureazy (O.D. 0,075), jako poziom tła przyjęto średni poziom ureazy uzyskany dla nie zainfekowanych myszy kontrolnych.

Średni poziom ureazy w przypadku nie zainfekowanych myszy uśmierconych po 12 dniach wyniósł 0,089. Myszy nr 20-54 uznawano za zainfekowane, gdy wielkość O.D. przewyższała ponad dwukrotnie odchylenie standardowe wielkości uzyskanej dla nie zainfekowanych myszy kontrolnych; odchylenie standardowe wynosiło 0,008. Poziom tła odejmowany od wielkości O.D. dla myszy uśmierconych po 10 tygodniach wynosił 0,045, a myszy uznawano za zainfekowane, gdy wielkość O.D. była wyższa od 0,044.

Przy zastosowaniu tej wariantowej metody analizy nie zaobserwowano żadnego efektu po fałszywym immunizowaniu lub po immunizowaniu podjednostką ure A. Natomiast tylko niski poziom infekcji (wielkość O.D. < 0,22) zaobserwowano u 70% zwierząt immunizowanych podjednostką ure B (p < 0,22, U-test Manna-Whitney'a w porównaniu do fałszywie immunizowanych myszy kontrolnych). Gdy myszy uśmiercano w 10 tygodni po prowokacji, 59% (10/17) myszy immunizowanych podjednostką ure A było chronionych przed infekcja H. felis (p = 0,0019, dwudrożny dokładny test Fishera, przy porównywaniu z fałszywie immunizowanymi myszami). Ponadto 80% (16/20) myszy immunizowanych podjednostką ure B było chronionych przed infekcją H. felis (p = 0,00002, dwudrożny dokładny test Fishera, przy porównywaniu z fałszywie immunizowanymi myszami). Przy takiej wariantowej analizie podjednostka ure A również wywołuje ochronną odporność. W przypadku obydwu metod analizy uzyskane wyniki wykazują, że immunizacja podjednostkami zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori wywołuje ochronną odporność na infekcję Helicobacter.

Przykłady

Wynalazek zostanie dokładniej opisany przy pomocy poniższych przykładów:

a) Szczepy bakteryjne

H. felis zostały dostarczone przez J. Foxa (Division of Comparative Medicine, Mass. Institute of Technology, Boston, USA). Helicobacter pylori wydzielono od pacjentów z chorobą wrzodową (CHUV, Lozanna, Szwajcaria).

b) Hodowle bakteryjne

Hodowla ciekła - Bakterie hodowano na ciekłej pożywce BHI (Brain-Heart Infusion, BioMerieux) zawierającej 0,25% ekstraktu drożdżowego (Difco) i 10% płodowej surowicy bydlęcej (Inatech), uzupełnionej 0,4% selektywnego składnika uzupełniającego Campylobacter (Oxoid). Bakterie inkubowano w warunkach mikroaerofilowych w 37°C i wytrząsano przez 2 - 3 dni w 37°C.

179 149

Hodowla zamrożona - Bakterie hodowano na ciekłej pożywce, po czym oznaczano aktywność ureazową i oceniano morfologicznie przez barwienie Grama, a także mikroskopowo pod względem ruchliwości. Następnie bakterie odwirowywano i zawieszano w stężeniu odpowiadającym O.D. 30/ml w BHI z dodatkiem 20% gliceryny, po czym zamrażano w -80°C. Tuż przed użyciem zamrożone porcje rozmrażano w lodzie, przemywano 20 ml BHI, odwirowywano i zawieszano w stężeniu odpowiadającym od O.D. 1 do O.D 1,5 w 200 μΐ 5 mM NaHCO?,.

Hodowla na płytkach agarozowych - Bakterie hodowano na płytce agarozowej zawierającej BHI z 0,25% ekstraktu drożdżowego i 5% owczej krwi w warunkach mikroaerofilowych w 37°C przez 3 dni.

Oznaczanie ilościowe - Ilość bakterii określano na podstawie gęstości optycznej roztworu BHI przy 660 nm (1 jednostka gęstości optycznej (O.D.) odpowiada 10⁸ bakterii). Liczbę żywych bakterii oznaczano na szeregu jednostkach tworzących kolonie.

c) Wytwarzanie sonikatów

Helicobacter pylori zbierano z 31 płytek agarowych z krwią w 0,15 M NaCl i odwirowywano przez 5 minut przy 1400 g w 4°C. Osad zawieszano w 3 ml NaCl i poddawano obróbce ultradźwiękami przez 4 minuty. Ilość białka oznaczano w teście Bradforda (zestaw BioRad, zgodnie z zaleceniami producenta).

d) Sprzęganie immunogenu z hydroksyapatytem

Immunogen (ureazę lub jej podjednostkę) inkubowano przez 1 godzinę w 4°C z hydroksyapatytem. Stosowano 1,0 mg hydroksyapatytu z 30 pg immunogenu/mysz. Pod koniec inkubacji dodawano 10 pg toksyny cholery w ostatecznej objętości 200 μΐ PBS.

e) Prowokowanie Helicobacter felis

Myszy łagodnie znieczulono przed dożołądkową prowokacją Helicobacter felis. H. felis w łącznej objętości 200 pl wprowadzano do żołądków odpowiednich myszy stosując rurkę silikonową przyłączoną do strzykawki podskórnej.

Przykład 1. a) Ekstrakcja

Helicobacter pylori z 30 płytek agarowych z krwią zebrano w 0,15 M NaCl w lodzie. Roztwór odwirowywano przez 5 minut przy 4400 g w 4°C. Osad zawieszano w 20 ml wody i miksowano przez 45 s (maksymalna prędkość). Ekstrakt odwirowywano przez 20 minut przy 6700 g w 4°C. Supematant oddzielano i oznaczano w nim ilość białka (patrz „oznaczanie ilościowe” powyżej), a następnie wytrącano 70% siarczanem amonu.

b) Oczyszczanie ureazy

Roztwór chromatografowano w kolumnie Sepharose C1-6B (Pharmacia) z PBS (roztwór soli buforowany fosforanem) jako fazą ruchomą. 22 zebrane frakcje wykazujące silną aktywność ureazową połączono i dializowano przez noc w 4°C względem 3 litrów PEB (20 mM bufor fosforanowy, pH 7), a następnie chromatografowano na Q Sepharose z szybkim przepływem (Pharmacia) z PEB jako fazą ruchomą. Frakcje eluowano z gradientem 0 - 500 mM NaCl. 10 zebranych frakcji wykazujących silną aktywność ureazową poddano osobno SDA na żelu, po czym wykonano barwienie Coomassie. 6 frakcji wykazujących różne pasma odpowiadające ciężarowi cząsteczkowemu 63 i 28 kDa zebrano i uznano za oczyszczoną ureazę.

Przykład 2 (patrztakże sekcjaB)

Myszy zastosowane do badań immunizacyjnych łagodnie znieczulono eterem przed immumzacją dożołądkową. Następnie preparat sonikatu lub oczyszczona ureazę, hydroksyapatyt i toksynę cholery zawieszano w PBS i porcję 200 μΐ wprowadzano do żołądka odpowiedniej myszy rurką polietylenową przyłączoną do strzykawki podskórnej. Procedura taka będzie określana jako immunizacja doustna.

Oceniono 3 procedury immunizacji doustnej. Opisano je poniżej.

Procedura B1 - Szczepienie oczyszczoną ureazą tygodniowe samice myszy BALB/c (20) immunizowano doustnie 30 pg oczyszczonej ureazy Helicobacter pylori i 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg toksyny cholery w dniach 0, 7, 14 i 21. 10 myszy prowokowano w dniach 28 i 30 5 x 10⁷ i 10 H. felis z ciekłej hodowli.

Procedura b2 - Szczepienie sonikatami Helicobacter tygodniowe samice myszy BALB/c (20) immunizowano doustnie 2 mg sonikatu Helicobacter pylori w dniach 0,7,14 i 21.10 myszy prowokowano w dniach 28 i 30 5 x 1Q7i 108h. felis.

179 149

Procedura B3 - kontrolna tygodniowe samice myszy BALB/c immunizowano doustnie 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg toksyny cholery w dniach 0, 7, 14 i 21. 10 myszy prowokowano w dniach 28 i 30 5x 10⁷ i 10⁸H. felis. ....

W dniu 35 myszy uśmiercano i pobierano biopsję z żołądka, a także wydzielinę jelitową i krew.

Ochrona i ocena

W celu ocenienia ochrony biopsje selekcjonowano pod względem aktywności ureazowej wykonując test Jatrox HP (Rohm Pharma), zgodnie z instrukcjami dostawcy. Ureazę oznaczano ilościowo wykonując pomiar spektrofotometryczny przy 550 nm. Prowadzono także hodowle biopsji i obecność H. felis oznaczano przez barwienie Grama. Biopsje z jamy żołądka homogenizowano i rozcieńczono (1:10 i 1:1000) w 0,15 M NaCl, po czym wykonywano posiew na płytkach agarowych z krwią i inkubowano w warunkach mikroaerofilowych w 37°C przez 4 -10 dni.

ELISA

Wydzieliny jelitowe i krew analizowano metodą ELISA w celu ustalenia miana przeciwciała. Test ELISA przeprowadzano w sposób następujący. Płytki polistyrenowe (96 studzienek) powlekano oczyszczoną ureazą w ilości 1 pg/studzienkę w 37°C na 2 godziny. Miejsca wiązania niespecyficznego blokowano 5% mlekiem w proszku w PBS z dodatkiem 0,1% Tween w 37°C przez 30 minut. Płytki przemywano raz PBS z 0,1% Tween. Próbki krwi badano w rozcieńczeniu 1:1000, a wydzieliny jelitowe w rozcieńczeniu 1:1. 100 p l próbki dodawano na płytki powleczone antygenem. Po 2 godzinach inkubowania płytki przemywano 3 razy PBS zawierającym 0,1% Tween. Przeciw-mysie biotynylowane pełne przeciwciało od kozy oraz przeciw-mysie biotynylowane IgA, IgG i IgM (Amersham) dodawano (100 pl) w rozcieńczeniu 1:500, z wyjątkiem IgA (1:250) i prowadzono inkubację w 37°C przez 1 godzinę. Płytki przemywano 3 razy PBS z 0,1% Tween i dodawano 100 pl streptawidyny/peroksydazy chrzanowej w rozcieńczeniu 1:1000 w PBS zawierającym 0,1% Tween, po czym prowadzono inkubację w 37°C przez 30 minut. Płytki przemywano 3 razy i dodawano 50 pl rozcieńczonej 1:50 o-fenylodiaminy w buforze cytiynianowym o pH 5,0, z 1 pl/ml 30% H2O2, po czym prowadzono inkubację w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dla każdej studzienki mierzono absorbancję przy 495 nm.

Przykład 3 (patrz również sekcja C)

Myszy zastosowane do badań immunizacyjnych łagodnie znieczulono eterem przed immunizacją dożołądkową. Następnie 30 pg podjednostek zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori uzyskanych w E. coli, związanych z hydroksyapatytem i uzupełnionych toksyną cholery zawieszano w PBS i porcję 200 pl wprowadzano do żołądka odpowiedniej myszy rurką polietylenową przyłączoną do strzykawki podskórnej. Procedura taka będzie określana jest immunizacja doustna.

Oceniono 3 procedury immunizacji doustnej. Opisano je poniżej.

Procedura Cl - Szczepienie podjednostką A zrekombinowanej ureazy tygodniowe samice myszy BALB/c (10) immunizowano doustnie 30 pg oczyszczonej podjednostki A zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori i 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg toksyny cholery w dniach 0, 8, 14 i 21. 10 myszy prowokowano w dniach 32, 34 i 36 10⁸ H. felis z ciekłej hodowli.

Procedura C2 - Szczepienie podjednostkąB zrekombinowanej ureazy tygodniowe samicy myszy BALB/c (10) immunizowano doustnie 30 pg oczyszczonej podjednostki B zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori i 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg toksyny cholery w dniach 0, 8, 14 i 21. 10 myszy prowokowano w dniach 32, 34 i 36 10*⁸ H. felis z ciekłej hodowli.

Procedura C3 - kontrolna tygodniowe samice myszy BALB/c immunizowano doustnie 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg toksyny cholery w dniach 0, 8, 14 i 21. Myszy prowokowano w dniach 32, 34 i 36 108 H. felis.

179 149

W dniu 42 lub w dniu 106 myszy uśmiercano i pobierano wielokrotnie biopsje z żołądka.

Ochrona i ocena

W celu ocenienia działania białek biopsje z korpusu i jamy żołądka selekcjonowano pod względem aktywności ureazowej wykonując test Jatrox HP (Rohm Pharma), zgodnie z instrukcjami dostawcy. Wielkości O.D. dla korpusu i jamy dodawano uzyskując ostateczną wielkość O.D. dla każdej myszy.

Przykład 4.

W celu zbadania, czy immunizacja peptydami ureazowymi może być skuteczna w leczeniu infekcji Helicobacter u zwierząt, najpierw przeprowadzono u myszy prowokację H. felis, a następnie immunizację podjednostką ure B Helicobacter pylori. Przydatność immunizacji podjednostką ure B Helicobacter pylori w leczeniu infekcji Helicobacter wykazano w przykładach 4 i 5.

a) Infekowanie myszy za pomocą H. felis

Prowokację 6-8 tygodniowe samice myszy BALB/c za pomocą H. felis przeprowadzono w dniach 1 i 3 za pomocą 1 O.D. zamrożonej hodowli. Myszy prowokowano w dniu 5 za pomocą 1,53 O.D. ciekłej hodowli H. felis.

b) Szczepienie podjednostką B zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori myszy zainfekowanych H. felis immunizowano doustnie 30 pg podjednostki B zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori, 1 mg hydroksyapatytu i 10 pm toksyny cholery (holoenzym otrzymany z Calbiochem) w dniach 23, 30, 37 i 44.

c) Próby kontrolne myszy zainfekowanych H. felis immunizowano doustnie 1 mg hydroksyapatytu i 10 pm toksyny cholery w dniach 23, 30, 37 i 44. Myszy te określano jako immunizowane „fałszywie”. 7 myszy zainfekowanych H. felis nie poddawano immunizacji.

Uśmiercanie i ocena

W dniu 70 wszystkie myszy uśmiercono. Żołądki usunięto i rozcięto wzdłużnie na pół. W celu dokonania oceny działania ochronnego połowę żołądka każdej myszy (zarówno korpus jak i jamę) poddano selekcjonowaniu względem aktywności ureazowej wykonując test Jarox HP (Rohm Pharma), zgodnie z instrukcjami dostawcy. Ureazę oznaczano ilościowo wykonując pomiar spektrofotometryczny przy 550 nm. 10 czystych (nie zainfekowanych) myszy BALB/c użyto jako myszy kontrolne. Te 10 myszy uśmiercono w dniu 70 i próbki ich żołądków oceniono pod względem aktywności ureazowej w celu ustalenia tła aktywności ureazowej. Średnią wielkość tła, 0,033 O.D. odejmowano od wielkości O.D. dla każdej myszy. Odchylenie standardowe aktywności ureazowej dla myszy czystych wynosiło 0,025 O.D.. Wyniki testów ureazowych przedstawiono w tabeli 8 i na fig. 7. Na fig. 7 linią kreskowaną zaznaczono wielkość O.D. stanowiącą podwojone odchylenie standardowe aktywności ureazowej dla myszy czystych.

Tabela 8

Traktowanie	Mysz nr	Test ureazowy	Infekcja
1	2	3	4
Nie traktowane	1	0,42	+
2	0,36	+
3	0,41	+
4	0,33	+
5	0,38	+
6	0,52	+
7	0,48	+

179 149

c.d. tabeli 8

1	2	3	4
Fałszywe (tylko HAP + CT) Ure B + HAP + CT	8	0,51	+
9	0,48	+
10	0,61	+
11	0,44	+
12	0,51	+
13	0,48	+
14	0,44	+
15	0,58
16	0,48	+
17	0,53	+
18	0,36	4
19	0,01	-
20	0,43	+
21	0,07	+/-
22	0,39	+
23	0,10	+/-
24	0,38	+
25	0,06	+/-

W tabeli 8 „ure B” oznacza podjednostkę B zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori, określoną powyżej; „CT” oznacza toksynę cholery; „HAP” oznacza kryształy hydroksyapatytu; a „nie traktowane” oznacza myszy, które prowokowano H. felis, ale u których nie wykonano następnie immunizacji. Wyniki testu ureazowego przeprowadzonego na biopsjach żołądka każdego zwierzęcia wyrażano jako wielkości O.D. przy 550 nm. Wielkość tła odejmowana od wielkości O.D. dla każdej myszy wynosiła 0,033. Infekcję oceniano jako dodatnią (co oznaczano jako „+”), gdy wielkość O.D. przy 550 nm była ponad dwukrotnie wyższa od odchylenia standardowego stwierdzonego u myszy czystych (0,05 O.D.). „+/-” oznacza wielkości wyższe od O.D. tła, ale niższe od 0,08, oraz że wielkość ta jest niższa w porównaniu z myszami kontrolnymi fałszywie immunizowanymi.

Na podstawie wyników podanych w tabeli 7 i na fig. 7 można stwierdzić, że podawanie podjednostki ure B Helicobacter pylori myszom zainfekowanym H. felis wywołało klirens infekcji u jednej spośród 8 myszy. Zgodnie z inną, mniej zachowawczą interpretacją tych wyników, zgodnie z którą za dodatni uważa się wynik powyżej 0,2, 4 spośród 8 myszy (nr 2, 4, 6 i 8), którym podano ure B, można uznać za chronione przed infekcją. Jednakże w przypadku obydwu definicji dodatniego wyniku u myszy tych występowała zmniejszona aktywność ureazowa w porównaniu z myszami nie traktowanymi i fałszywie immunizowanymi. Przyjmując wielkość 0,05 jako oznakę infekcji poziom infekcji u myszy immunizowanych ure B w porównaniu z fałszywie immunizowanymi myszami był znacząco niższy (wielkość p poniżej 0,004). Tak więc wyniki z przykładu 4 wskazują, że podawanie ure B myszom zainfekowanym H. felis powoduje zmniejszenie poziomu infekcji.

179 149

Przykład 5.

a) Infekowanie myszy za pomocą H. felis

Prowokację 5-8 tygodniowe samice myszy BALB/c za pomocą H. felis przeprowadzono w dniach 1 i 3 za pomocą 1 O.D. ciekłej hodowli. Myszy prowokowano w dniu 3 za pomocą 0,8 O.D. H. felis hodowanego na płytkach agarozowych. Myszy prowokowano w dniu 5 za pomocą 1 O.D. H. felis hodowanego na płytkach agarozowych.

b) Szczepienie podjednostką B zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori

Myszy zainfekowane H. felis immunizowano doustnie 30 pg podjednostki B zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori, 1 mg hydroksyapatytu i 10 pm toksyny cholery (holoenzym otrzymany z Calbiochem) w dniach 23, 30, 37 i 44. Myszy te określono jako „immunizowane”.

c) Próby kontrolne

Myszy zainfekowane H. felis immunizowano doustnie 1 mg hydroksyapatytu i 10 pm toksyny cholery w dniach 23,30,37 i 44. Myszy te określano jako immunizowane „fałszywie”.

Uśmiercanie i ocena

W dniu 62 10 myszy immunizowanych i 6 myszy fałszywie immunizowanych uśmiercono. W 8 tygodni po ostatniej immunizacji 10 immunizowanych i 8 fałszywie immunizowanych myszy uśmiercono. Żołądki poddano selekcjonowaniu względem aktywności ureazowej w sposób opisany w przykładzie 4. Średnia wielkość tła dla 29 czystych myszy BALB/c uśmiercanych w różnych momentach wynosiła 0,04 O.D.. Poziom ten przyjęto jak pomiar tła i odejmowano od wielkości O.D. dla każdej myszy. Odchylenie standardowe aktywności ureazowej dla myszy czystych wynosiło 0,02 O.D.. Wyniki testów ureazowych przedstawiono w tabeli 9 i na fig. 8. Na fig. 8 linią kreskowaną zaznaczono wielkość O.D. stanowiącą podwojone odchylenie standardowe aktywności ureazowej dla myszy czystych.

e) Analiza krwi i próbek kału

Zbieranie próbek krwi

Próbki krwi pozostawiono na 3 godziny do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej, po czym surowicę zebrano i zamrożono w -20°C, aby później wykonać analizę.

Zbieranie bobków kału

Świeże bobki kału (3-8) zbierano w 1,5 ml probówkach Eppendorfa zawierających 500 pl PBS + 5% chudego mleka w proszku + inhibitory proteazowe (AEBSF 0,2 mM, Aprotynina 1 pg/ml, Leupeptyna 10 pM, Bestatyna 3,25 pM). Próbki zamrożono w -20°C do późniejszego użycia. Następnie odmrożono je w lodzie, wymieszano i odwirowano przy 10 000 g przez 10 minut w 4°C uzyskując wolny od osadu supematant o barwie żółtawo-brunatnej.

ELISA

Próbki surowicy i bobków kału od każdego zwierzęcia analizowano metodą ELISA w celu ustalenia aktywności przeciwureazowej, zgodnie ze standardową procedurą.

Próbki surowicy i bobków kału od każdego zwierzęcia analizowano metodą ELISA w celu ustalenia miana przeciwciał. Płytki polistyrenowe (96 studzienek) powlekano oczyszczoną zrekombinowaną ureazą w ilości 0,5 pg/studzienkę w 37°C na 2 godziny. Miejsca wiązania niespecyficznego blokowano 5% mlekiem w proszku w PBS z dodatkiem 0,1% Tween w 37°C przez 30 minut. Płytki przemywano raz PBS z 0,1% Tween. Próbki krwi badano w rozcieńczeniu 1:1000, a bobki kału w rozcieńczeniu 1:1. 100 pl próbki dodawano na płytki powleczone antygenem. Po 2 godzinach inkubowania płytki przemywano 3 razy PBS zawierającym 0,1% Tween. Przeciw-mysie biotynylowane pełne przeciwciało od kozy oraz przeciw-mysie biotynylowane IgA sprzężone z peroksydazą chrzanową (Serotec) dodawano (100 pl) w rozcieńczeniu 1:500 i prowadzono inkubację w 37°C przez 1 godzinę. Płytki przemywano 3 razy PBS z 0,1% Tween i, tylko w przypadku próbek krwi, dodawano 100 pl streptawidyny/peroksydazy chrzanowej w rozcieńczeniu 1:500 w PBS zawierającym 0,1% Tween, po czym prowadzono inkubację w 37°C przez 30 minut. Płytki przemywano 3 razy i dodawano 50 pl rozcieńczonej 1:50 o-fenylodiaminy w buforze cytrynianowym o pH 5,0, z 1 pl/ml 30% H2O2, po czym prowadzono inkubację w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dla każdej studzienki mierzono absorbancję przy 495 nm.

179 149

Aby oznaczyć całość IgA w bobkach kału test ELISA przeprowadzono w sposób opisany powyżej, z tym że płytki powlekano 1 pg/ml koziego, przeciw-mysiego IgA (SIGMA), a supernatant kału badano w rozcieńczeniu 1:200.

Tabela 9

Uśmiercanie	Traktowanie	Mysz nr	Test ureazowy	Infekcja
1	2	3	4	5
2,5 tygodnia	Fałszywe (tylko HAP + CT)	1	0,58	+
		2	0,51	+
		3	0,50	+
		4	0,54	+
		5	0,47	+
		6	0,36	+
	Ure B + HAP + CT	7	0,02	-
		8	0,06	+
		9	0,01	-
		10	0,00	-
		11	0,02	-
		12	0,02	-
		13	0,02	-
		14	0,44	+
		15	0,00	-
		16	0,03	-
8 tygodni	Fałszywe (tylko HAP + CT)	17	0,30	+
		18	0,27	+
		19	0,29	+
		20	0,20	+
		21	0,27	+
		22	0,27	+
		23	0,37	+
		24	0,31	+

179 149

c.d. tabeli 9

1	2	3	4	5
	Ure B + HAP + CT	25	0,26	+
26	0,30	+
27	0,00	-
28	0,17	+
29	N.D.
30	0,00	-
31	0,00	-
32	0,00	-
33	0,00	-
34	0,00	-

Tabela 10

Uśmiercanie	Traktowanie	% wyklarowania
2,5 tygodnia	ure B	8/10 (80%)*
fałszywe	0/6
8 tygodni	ure B	6/9 (67%)**
fałszywe	0/9

* p = 0,007 (dwudrożny dokładny test Fishera) w porównaniu z fałszywą kontrolną ** p = 0,014 (dwudrożny dokładny test Fishera) w porównaniu z fałszywą kontrolną

W tabelach 9 i 10 „ure B” oznacza podjednostkę zrekombinowanej ureazy B Helicobacter pylori, określoną powyżej, „CT” oznacza toksynę cholery; a „HAP” oznacza kryształy hydroksyapatytu. „Uśmiercanie” oznacza datę uśmiercania mierzoną od ostatniej immunizacji w dniu 44. „N.D.” oznacza brak dostępnych danych. Wyniki testu ureazowego przeprowadzonego na biopsjach żołądka każdego zwierzęcia wyrażano jako wielkości O.D. przy 550 nm. Infekcję oceniano jako dodatnią (co oznaczano jako „+”), gdy wielkość O.D. przy 550 nm była ponad dwukrotnie wyższa od odchylenia standardowego stwierdzonego u myszy czystych (0,04 O.D.). Wielkość tła odejmowana od wielkości O.D. dla każdej myszy wynosiła 0,04. W tabeli 10 „% wyklarowania” oznacza klirens infekcji oznaczony w teście ureazowym.

Jak to można stwierdzić na podstawie wyników podanych w tabelach 9 i 10 oraz na fig. 8, podawanie podjednostek ure B Helicobacter pylori myszom zainfekowanym H. felis powoduje klirens infekcji u 8 spośród 10 myszy, ocenianej po uśmierceniu myszy w 2,5 tygodnia po ostatniej immunizacji. Gdy test przeprowadzano w przypadku myszy uśmiercanych po 8 tygodniach po ostatniej immunizacji, wyklarowanie infekcji stwierdzono u 6 spośród 10 myszy. Gdy wyższą wielkość, 0,2, przyjmuje się do określenia stanu infekcji, co przedstawiono w omówieniu tabeli 8, to przy takiej interpretacji traktowanie podjednostką ure B spowoduje klirens infekcji u 9 spośród 10 myszy uśmierconych po 2,5 tygodniach.

W tabeli 10 wykazano, że statystycznie znaczące leczenie infekcji H. felis osiąga się przy doustnej immunizacji z zastosowaniem podjednostki B zrekombinowanej ureazy Helicobacter pylori w porównaniu z efektem uzyskanym przy fałszywej immunizacji toksyną cholery i hydroksyapatytem. Z tabeli 10 wynika, że przy pomiarach wykonywanych w 2,5 tygodnia po ostatniej immunizacji u 80% zainfekowanych myszy następuje wyklarowanie infekcji. Przy pomiarach wykonywanych w 8 tygodni po immunizacji u 67% zainfekowanych myszy następuje wyklarowanie infekcji. U żadnej z fałszywie immunizowanych myszy nie nastąpiło wyklarowanie infekcji przy pomiarach wykonywanych w 2,5 lub 8 tygodni po ostatniej immuni34

179 149 zacji. Znaczenie zmniejszenia stopnia myszy z wyklarowaną infekcją po 8 tygodniach w porównaniu z 2,5 tygodniami po ostatniej immunizacji nie jest jasne.

Tabela 11

Mysz nr	Test ureazowy	Całkowite antyureB Ig we krwi	Całkowite IgA w kale	AgA ureB w kale	IgA ureB w kale/całkowite IgA w kale
1	2	3	4	5	6
Przykład 4 8	0,51	0,27	0,77	0,05	0,06
9	0,48	0,23	0,65	0,02	0,03
10	0,61	0,25	0,43	0,08	0,18
11	0,44	0,36	0,69	0,03	0,04
12	0,51	0,31	0,58	0,00	0,00
13	0,48	0,32	0,67	0,11	0,17
14	0,44	0,27	0,51	0,03	0,05
15	0,58	0,29	0,82	0,07	0,08
16	0,48	0,30	0,77	0,18	0,23
17	0,53	0,30	0,53	0,09	0,18
18	0,36	0,22	0,51	0,00	0,00
19	0,01	0,47	0,62	0,47	0,75
20	0,43	0,35	0,57	0,15	0,26
21	0,07	0,25	0,64	0,11	0,17
22	0,39	0,27	0,50	0,15	0,30
23	0,10	0,27	1,08	ND	ND
24	0,38	0,28	0,66	ND	ND
25	0,06	0,28	0,53	ND	ND
Przykład 5 7	0,02	0,11	0,61	0,06	0,11
8	0,06	0,13	0,62	0,02	0,03
9	0,01	0,15	0,62	0,04	0,07
10	0,00	0,15	0,59	0,03	0,05
11	0,02	0,19	0,60	0,15	0,24
12	0,02	0,16	0,60	0,00	-0,01
13	0,02	0,19	0,66	0,07	0,11
14	0,44	0,18	0,62	0,00	0,00
15	0,00	0,10	0,64	0,08	0,12
16	0,03	0,14	0,62	0,29	0,46

179 149

c.d. tabeli 11

1	2	3	4	5	6
25	0,26	0,35	0,98	0,07	0,07
26	0,30	0,38	1,12	0,04	0,03
27	0,00	0,39	1,15	0,01	0,01
28	0,17	0,33	0,97	0,02	0,02
29	ND*	0,38	1,00	0,08	0,08
30	0,00	0,34	0,69	0,04	0,06
31	0,00	0,38	0,76	0,08	0,10
32	0,00	0,37	0,58	0,02	0,04
33	0,00	0,38	1,07	0,22	0,21
34	0,00	0,35	0,64	0,06	0,09

W tabeli 11 u myszy, którym podano ure B, z przykładów 4 i 5, oznaczono zawartość przeciwciał we krwi i w kale. Numery myszy odpowiadają liczbom podanym w tabelach 8 i 9. Wyniki testów ureazowych odpowiadają wynikom podanym w tabelach 8 i 9. „ND*” oznacza, że brak jest dostępnych danych, gdyż jeden z żołądków, od myszy o numerach 18-21, zagubiono. Nie udało się ustalić, który z zestawów danych dotyczących myszy 18 - 21, jest niepełny. Z tego względu „ND” nie oznacza, że jest on konkretnie przypisany myszy nr 21.

W teście dla myszy z przykładu 4 oraz dla myszy 1-10 z przykładu 5 wystąpiły trudności w uzyskaniu próbek do analizy.

Klirens infekcji H. felis w wyniku doustnego podania podjednostki ure B Helicobacter pylori nie był oczekiwany i w związku z tym stanowi nowość. Wyniki przedstawione powyżej wskazują ponadto, że podjednostkę ure B można zastosować do leczenia infekcji Helicobacter.

Dla specjalisty łatwo zrozumiałe jest, że wynalazek umożliwia realizację celów oraz uzyskanie efektów i korzyści wspomnianych, jak również tkwiących w nim. Peptydy ureazowe, dodatki z błon śluzowych, nośniki i przeciwciała, a także sposoby, procedury, traktowania i testy podano jedynie przykłady, tak że nie stanowią one ograniczeń wynalazku.

179 149

Grupa C: Myszy me zabezpieczone po immunizacji sonikatem H.p.

3000 ° IgG ° IgA

2000

Ig (OD 495nm x 1000)

1000 o

FIG. 1

Grupa ,D: Myszy zabezpieczone po immunizacji sonikatem H.p.

FIG. 2

179 149

Grupa C: Myszy nie zabezpieczone po immunizacji sonikatem H.p.

F8G. 3

Grupa D: Myszy zabezpieczone po immunizacji sonikatem H.p.

RG. 4

179 149

immunizacja:	H. pylori sonikat	ii. pylori ureaza	grupa kontrolna
zabezpieczone:	3/9	7/10	1/10

Dwuogonowa Próba Fishera

FIG

179 149 próba ureazowa

O.D. (550nm)

czas po zainfekowaniu 12 dni tygodni

FIG. 6A

O.D. (550 nm)

myszy 10 10 czas po zainfekowaniu 12 dni tygodni

Próba Fishera p= 0.003 p= 0.01

FIG. 6B

179 149 próba

O.D.

ureazowa (550nm)

0.7

0.6 0.5

0.4

0.3

0.2

0.1 0.0 zainfekowani immunizowana UreB

i-1---1---1-1-1-.- O o o o 0 o o	° o °o °o o° o o	Δ A Δ Δ I
-
		. Δ
		Δ Δ

Pozornie

FI próba ureazowa

OD (550nm) próba ureazowa

OD (550nm)

FIG. 8

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Szczepionka do wywoływania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter na bazie ureazy zawierająca odpowiedni antygen i adjuwant śluzówkowy, znamienna tym, że zawiera od 10 pg do 100 miligramów ureazy Helicobacter pylori lub Helicobacter felis, lub polipeptyd zawierający jej podjednostkę i jako adjuwant śluzówkowy od 5 do 50 pg termicznie labilnej toksyny Escherichia coli lub polipeptyd obejmujący jej podjednostki lub fragmenty na dawkę jednostkową w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku lub rozcieńczalniku.
2. 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera podjednostkę B termicznie labilnej toksyny Escherichia coli.

   Wynalazek dotyczy szczepionki do wywoływania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter. Szczepionka służy do zapobiegania i leczenia infekcji żołądkowych u ssaków, w tym u ludzi. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy szczepionki odpowiedniej do stosowania w zapobieganiu i leczeniu infekcji spowodowanej Helicobacter u ssaków, w tym u ludzi. Szczepionkami podobnymi do opisanych można leczyć ludzi cierpiących na infekcje żołądkowe, których konsekwencjami są przewlekłe nieżyty żołądkowe lub wrzód trawienny, i zapobieganie rakowi żołądka.

   Infekcje ludzkiego nabłonka żołądkowego wywołane Helicobacter powodują nieżyty żołądkowe. Są one głównym czynnikiem w rozwoju wrzodów żołądka i chłoniaków żołądka, a także mogą być czynnikiem ryzyka rozwoju raka żołądka. (Blaser, M., J., „Gastric Campylobacter-like Organisms, Gastritis and Peptic Ulcer Disease” Gastroenterology, vol. 93, 371 - 383 (1987); Graham, D.Y. „Campylobacter pylori and Peptic Ulcer Disease” Gastroenterology, vol. 196, 615 - 625 (1989); Parsonnet, J. i in. Helicobacter pylori Infection in Intestinal and Diffuse-Type Gastric Adenocarcinomas” J. Natl. Cancer Inst., vol. 93, 640 - 643 (1001); Wotherspoon, A.C. i in. „Regression od Primary Low-Grade B-Cell Gastric Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Type After Eradication of Helicobacter pylori, Lancet, vol. 342, 575 - 577 (1993). Najczęstszym czynnikiem infekcji jest Helicobacter pylori, a za nim rzadziej występujący Helicobacter heilmanii. Helicobacter pylori jest niewielkim o kształcie S gram ujemnym mikroorganizmem, który zwykle uzyskuje się z biopsji żołądka dorosłych i dzieci z histologicznie udokumentowanym nieżytem żołądka i wrzodu trawiennego. Dowody na powstawanie współzależności pomiędzy Helicobacter pylori i chorobami żołądkowodwunastniczymi oparte są na badaniach ochotników pacjentów z wrzodami i rakiem żołądka, izolowanych świń i wyjałowionych gryzoni. Jeśli chodzi o etiologię, postulaty Kocha zostały spełnione przez wytworzenie histologicznie potwierdzonych nieżytów żołądka we wcześniej niezainfekowanych osobnikach poprzedzonych konsumpcją żywotnych mikroorganizmów. (Marshall, B.J. i in. „Atemt to Fulfill Koch’s Postulate for pyloric Campylobacter” Med. J. Aust., vol. 142 436 - 439 (1985); Morris. A. i in. „Ingestion of Campylobacter pvloritis Causes Gastritis and Raised Fasting Gastric pH” Am. J. Gastroenterol., vol 82, 192 - 199 (1987); Engstrand, L. i in. „Inoculation of Barrier-Born Pigs With Helicobacter pylori; A Useful Animal Model for Gastritis Type B; Infect. Immun., vol 53, 1763 - 1768 (1980); Fox. J.G. i in. „Gastric Colonization by Campylobacter pylori Subsp. Mustelae in Ferrets” Infect. Immun., vol. 56,2994 - 2996 (1988); Fox, J.G. i in. „Helicobacter mustelae - Associated Gastritis in Ferrets; An Animal Model of Helicobacter pylori Gastritis in Humans” Gastroenterology, vol. 99, 352 - 361 (1990); Lee, A. i in. „A Small Animal Model of Human Helicobacter pylori Active Chronic

   179 149

   Gastritis” Gastroenterology, vol. 99, 1315 - 1323 (1990); Fox, J.G. i in. „Helicobacter Felis Gastritis in Gnotobiotic Rats; An Animal Model of Helicobacter pylori Gastritis” Infect. Immun., vol. 59, 785 - 791 (1991); Eaton, K.A. i in. „Campylobacter pylori Virulence Factors in Gnotobiotic Piglets” Infect. Immun., vol. 57, 1119 - 1125 (1989), i przez leczenie nie niszczące Helicobacter pylori, z wchłonięciem nieżytu i u pacjentów z chorobami wrzodotrawiennymi, spadkiem stopnia nawrotu. (Peterson, W.L. „Helicobacter pylori and peptic Ulcer Disesase” N. Engl. J. Med., vol. 324,1043 - 1048 (1991).

   Uważa się, że do żołądkowo-dwunastniczych chorób związanych z infekcją wywołaną Helicobacter należą ostre, przewlekłe i zanikowe nieżyty żołądkowe, wrzody trawienne, włączając do nich zarówno wrzody żołądkowe jak i dwunastnicze, rak żołądka, przewlekła niestrawność z ciężkimi nadżerkami żołądkowo-dwunastniczymi, oporna niewrzodowa niestrawność, jelitowa metaplazja i niskostopniowy chłoniak MALT. Infekcja wywołana Helicobacter jest również główną przyczyną,bezobjawowego nieżytu żołądka.

   Niezależnie od podatności in vitro na wiele przeciwmikrobiologicznych środków, wyniszczenie in vivo infekcji wywołanej Helicobacter pylori przy pomocy środków przeciwmikrobiologicznych jest często trudne do osiągnięcia. (Czinn, S.J. i Nedrud, J.G. „Oral Immunization Against Helicobacter pylori” Infect. Immun., vol. 59, 2359 - 2363 (1991)). Mikroorganizm znaleziono w błonie śluzowej otaczającej nabłonek żołądka i w dołku w śluzówce żołądka. Są to miejsca, które nie wydają się zezwalać na osiągnięcie odpowiedniego antymikrobiologicznego poziomu nawet, jeśli antybiotyk podaje się doustnie w wysokich dawkach. Obecnie wiele autorytetów zaleca „terapię potrójną”, mianowicie sól bizmutu w połączeniu z lekami takimi jak tetracyklina i metronidazol w ciągu 2-4 tygodni. Jednakże, skuteczność takiego lub innego leczenia chemoterapeutycznego pozostaje suboptymalna.

   Ostatnio, eksperci medycyny National Institutes of Health zalecają potrójną terapię bizmutem, tetracykliną i metronidazolem, podawanym w ciągu dwóch tygodni, do leczenia wrzodów trawiennych (Cimons, M., „Drug Combination Found Effective on Peptic Ulcers,” L.A. Times at A14 (10 luty, 1994)). Jednakże takie leczenie związane jest zwykle z biegunką i może powodować poważną szkodliwą uboczną reakcję, (patrz, Dick-hegedus, E. i Lee, A., „Use of a Mouse Model to Examine Anti- Helicobacter pylori Agents,” Scand. J. Gastroenterol., vol 26, 909-915 (1991)). Leczenie antybiotykami może również nie rozwiązywać problemu ponownej infekcji, a są dowody na podstawie niektórych badań na wysoką zapadalność na ponowną infekcję (Coelho L.G. i in., „Duodenal Ulcer and Eradication of H. pylori in a Developing Country: An 18-month Follow-Up Study,” Scand. J. Gastroenterol, vol. 27, 36266 (1992)). Stąd istnieje olbrzymie zapotrzebowanie na szczepionkę, która może być stosowana do leczenia infekcji i zapobiegania przyszłym infekcjom.

   Obecnie niewiele wiadomo na temat roli systemu odpornościowego błony śluzowej w żołądku. Rozmieszczenie komórek wytwarzających immunoglobulinę (Ig) w jamie żołądkowej wykazuje, że komórki IgA osocza stanowią do 80% całkowitej komórkowej populacji osocza. Ponadto, liczba komórek IgA osocza obecnych w jamie żołądkowej jest porównywalna do innych błon śluzowych. (Brandtzaeg, P. „Role of J Chain and Secretory Component in Receptor-Medicated Glandural and Hepatic Transport of Immunoglobulins in Man” Scand. J. Immunol., vol. 22, 111-146 (1985)); Brandtzaeg, P. i in. „Production and Secretion of Immunoglobulins in the Gastrointestinal Tract” Ann. Allergy, vol. 59, 21-39 (Listopad., 1987)). Liczne badania ludzi (Wyatt, J.I. i in. „Local Immune Response to Gastritis Campylobacter in Nonulcer Dyspepsia”, J. Clin. Path., vol. 39, 863-870 (1986)), i w modelach zwierząt (Fox, J.G. i in. „Helicobacter mustelae - Associated Gastritis in Ferrets: An Animal Model of Helicobacter pylori Gastritis in Humans” Gastroenterology, vol. 99, 352-361 (1990); Fox, J.G. i in. „Helicobacter felis Gastriotis in Gnotobiotic Rats: An Animal Model of Helicobacter pylori Gastritis” Infect. Immun., vol. 59, 785-791 (1991); Fox. J.G. i in. „Local and Systemic Immune Response in Murine Helicobacter felis Active Chronic Gastritis,” Infect, and Immun. vol. 61, 2309-15 (1993)), wykazywały specyficzne odpowiedzi IgG i IgA w surowicy i wydzielanie żołądkowe w odpowiedzi na infekcję wywołaną Helicobacter. Jednakże, obserwacja, że infekcja wywołana Helicobacter pylori utrzymuje się jako przewlekła infekcja przez lata, pomimo indukowania miejscowej systemowej odpowiedzi immunologicznej, nie zachęca do rozwoju strategii immunizacyjnej.

   179 149

   Lee i in. donieśli o możliwości zainfekowania wyjałowionych gryzoni przez Helicobacter felis, bakterii które są bliskie Helicobacter pylori, i o dającym się odtworzyć dokumencie histologicznym nieżytu. (Lee, A. i in. „A Smali Animal Model of Humań Helicobacter pylori Active Chronić Gastritis” Gastroenterology, vol. 99, 1316-1323 (1990)); Fox, J.G. i in. „Helicobacter felis Gastriotis in Gnotobiotic Rats: An Animal Model of Helicobacter pylori Gastritis” Infect. Immun., vol. 59, 785-791 (1991)). Od tej pory ten układ pary: żywicielbakteria został zaakceptowany jako dobry model do badania nieżytu wywołanego Helicobacter i jego czynników inicjujących. (Lee, A. i in. „Pathogenicity of Helicobacter pylori: A Perspective” Infect. Immun., vol. 61, 1601-1610 (1993)). Zainfekowanie myszy H. felis wywołuje podobną do znalezionej u zainfekowanych ludzi, odpowiedź patologiczną H. pylori; oba typy infekcji dają przewlekły nieżyt żołądka. (Lee i in. Gastroenterology, vol. 99 str. 1315-1323 (1990)). Badania wykazały, że Helicobacter felis mają taką samą podatność na terapię antymikrobiologiczną jak Helicobacter pylori, i H. felis/model myszy został zastosowany do rozwoju nowych sposobów, leczenia infekcji H. pylori. ((Dick-Hegedus, E. i Lee, A., „Use of a Mouse Model to Examine Anti Helicobacter pylori Agents,” Scand. j. Gastroenterol., vol. 26, 909-915 (1991); Chen i in., Immunization Against Gastric Helicobacter Infection in a Mouse/ Helicobacter felis Model,” Lancet, vol. 339, str. 1120 (1992)). Czinn i in. wykazują, że powtarzalna doustna immunizacja surowym lizatem Helicobacter pylori plus adjuwant toksyny cholery indukuje silną odpowiedź jelito wożołądkową w postaci IgA przeciwko Helicobacter pylori. (Czinn, S.J. i Nedrud, J.G. „Orał Immunization Against Helicobacter pylori” Infect. Immun., vol. 59, 2359-2363 (1991)). Ponadto, Chen i in. i Czinn i in. donieśli ostatnio, że doustna immunizacja surowym lizatem H. felis indukuje ochronę przed infekcją wywołaną H. felis u myszy. (Che i in. „Immunization Against Gastric Helicobacter Infection in a Mouse/ Helicobacter felis Model,” (list) Lancet, vol. 339, 1120-1121 (1992); Czinn, S. i in. „Orał Immunization Protects Germ-Free Mice Against Infection from Helicobacter felis Proceedings of the DDW, American Gastroenterological Association, 1321, A-331 (10-13 maja, 1992); Czinn i in. Vaccine, vol. 11, 637-642 (1993)). Jednakże, dokładna natura antygenowej odpowiedzi na indukcję tej ochrony nie została określona, i żadne informacje sugerujące, że antygeny ochronne H. felis, które indukują ochronę przed tym zarazkiem, mogłyby indukować skrzyżowaną ochronę rozciągającą się w stosunku do innych gatunków Helicobacter.

   Po raz pierwszy wykazaliśmy, że Helicobacter pylori i H. felis mają wspólne determinanty antygenowe uzyskując monoklonalne przeciwciała po doustnej immunizacji myszy sonikatami albo Helicobacter pylori albo H. felis i pokazując, że niektóre z tych przeciwciał, skierowane przeciwko Helicobacter pylori mogą reagować krzyżowo z H. felis i na odwrót, (Michetti, P. i in. „Specificity of Mucosal IgA Response in Balb/C Mice Following H. felis or Helicobacter pylori Callenges” proceedings of the Ddw, American Gastroenterological Association, 1001, A-251 (10-13 maja, 1992); Davin, C. i in. „Helicobacter pylori Urease Elicitis Protection Against H. felis Infection in Mice” Procedings of the DDW, American Gastroenterological Association, 1213, A-304 (16-19 maja 1993)), ale nieznane są zasady tej krzyżowej reaktywności.

   Opierając się na homologii pomiędzy różnymi znanymi sekwencjami aminokwasowymi ureazy, zaproponowano, że ureaza fasoli (jack bean) mogłaby być stosowana jako szczepionka przeciw Helicobacter pylori. (Pallen, M.J. i Clayton, C.L. „Vaccination Against Helicobacter pylori Urease” Lancet, vol. 336, 186-7 (1990)). Niemniej, pomimo homologii wśród różnych sekwencji ureazy, krzyżowa reaktywność nie jest regułą. Guo i Liu wykazali przed laty, że ureazy Proteus mirabilis, Proteus yulgaris i Providencia rettgeri wykazują względem siebie krzyżową reaktywność, podczas gdy ureazy jack bean i Morganella morganii sa różne immunologicznie od trzech poprzednich ureaz. (Guo, M. i Liu, P.V. „Serological Specifities of Ureases of Proteus Species” J. Gen. Microbiol., vol. 136, 1995-2000 (1965). Tak więc, nawetjeśli antygenowa krzyżowa reaktywność ureazy Helicobacter pylori z inna ureaza Helicobacter była uzasadnionym postulatem, nie istniały dane wykazujące, że rzeczywiście tak jest do czasu, aż wykazaliśmy, że niektóre monoklonalne przeciwciała krzyżowo przereagowały z ureazą Helicobacter pylori. (Davin, C. i in. „Helicobacter pylori Urease Elicits Protection Against H. felis Infection in Mice” Proceedings of the DDW, American Gastroenterological Assiciation 1213, A-304 (16-19 maja, 1993)). J. Pappo wykazał dalej, że mysz, która została

   179 149 zainfekowana H. felis wytwarza przeciwciała, które krzyżowo reagują z ureazą Helicobacter pylori ale nie z ureazą/jack bean. (J. Pappo, dane niepublikowane, 1993). Fakt, że ureaza jack bean nie należy do tej samej kategorii co ureaza Helicobacter sugeruje, że ureaza jack bean może nie być użyteczna do immunizacji przeciwko infekcjom wywołanym Helicobacter, w sposób wykonany dla jelitowych bakterii. (Pimental, J.L. i Cook, M.E. „Improved Growth in the Progeny of Hens Immunizcd with Jackbean Urease” Poultry Sci,. vol. 64, 434-439 (1988). Ponadto, wysiłki, aby uodpornić mysz przeciwko infekcji wywołanej H. felis poprzez doustne lub wewnątrzotrzewne podawanie ureazy jack bean powodowały wytwarzanie przeciwciał przeciw ureazie jack bean, ale nie chroniły myszy przed infekcją. (Chen, M. i in. „Failure of Immunization Against Helicobacter Using Jack Bean Urease”, Acta Gastroenterol. Belg., vol. 56,94(1993)).

   Stosowanie antygenu, to jest produktu reakcji ureazy i aldehydu glutarowego, opisane jest w opisie patentowym stanów Zjednoczonych Ameryki nr 483 7017, „Urease Antigen Product and Process”, udzielonym 6 czerwca, 1989 na rzecz LeVeen i in. W opisie patentowym opisane jest zastosowanie antygenu do zmniejszania toksyczności amoniaku powodowanej przez organizmy rozszczepiające mocznik. LeVeen i in., ujawnili iniekcje do krwioobiegu potraktowanej aldehydem glutarowym ureazy jack bean. Opis patentowy LeVeen nie ujawnia podawania antygenu ureazy na powierzchnię śluzówki ssaków w celu stymulowania wytwarzania przeciwciał poprzez miejscowy układ odpornościowy. Ponadto, nie ma dowodów w opisie, że iniekcje antygenu ureazy jack bean leczą żołądkowodwunastnicze infekcje wywołane Helicobacter.

   Eaton i in. wykazali, że mutanty kultur H. pylori ze słabą aktywnością ureazy nie są w stanie zainfekować jałowych prosiaków. (Eaton i in., „Essential Role of Urease in the Pathogenesis of Gastritis Induced by Helicobacter pylori in Gnotobiotic Piglets,” Gastroenterology; vol. 98, A654 (1990)). Eaton nie opisuje stosowania antygenu ureazy jako szczepionki chroniącej przed infekcją wywołaną Helicobacter lub sposobu leczenia infekcji spowodowanej Helicobacter.

   Stosowanie ureazy Helicobacter pylori lub odpowiedniej ureazy jako szczepionki przeciw infekcji wywołanej Helicobacter pylori było wcześniej proponowane przez A. Labigne i wprowadzone do zastrzeżeń patentowych patentu złożonego 6 października 1988 przez Pasteur Institute, Paryż, Francja. (Labigne, A. „Sequences of Nucleotides coding for Protein Having an Urease Activity”. Europejskie zgłoszenie patentowe/EPO 367 644 Al, 1989. Międzynarodowa publikacja WO 90/04030, 1990). Jednakże, opis tego dokumentu nie zawiera żadnego dowodu na zaszczepienie jakiegokolwiek ssaka przeciw infekcji spowodowanej ureazą Helicobacter. Tak więc ta część patentu Pasteur Institute nie została praktycznie zrealizowana, a odpowiednie zastrzeżenia (zastrzeżenia 27 i 28, str. 16) nie mogą być uznane za ważne. Ponadto, zastrzeżenia z tego dokumentu odnoszą się do białka przedstawiającego aktywność ureazy i należy rozumieć z doświadczeń później opisanych, że aktywność szczepionki opartej na ureazie nie jest konieczna do wywołania ochrony po doustnym uodpornieniu.

   Co więcej, chociaż homologia sekwencji do innej bakteryjnej ureazy może potwierdzać stosowanie ureazy jako szczepionki kandydującej przeciw infekcji wywołanej przez Helicobacter pylori, to bieżąca wiedza o infekcji wywołanej Helicobacter pylori u ludzi nie potwierdza takiej możliwości. Po pierwsze, nienależnie od faktu, że zainfekowane osobniki często wykazują silną odpowiedź przeciwciała na ureazę, to anty-ureazowa odpornościowa odpowiedź przeciwciała na ureazę nie daje uwolnienia lub kontroli infekcji. Po drugie, Helicobacter pylori może odtransportować ureazę z komórki i wydalać ją z jej powierzchni, (Evans, D.J. i in. „Urease Associated Heat Shock Protein of Helicobacter pylori” Infect. Immun., vol. 60, 2125-2127 (1992), Ferreo, R.L. i Lee, A., „ The Importance of Urease in Acid Protection for the Gastric-Colonizing Bacteria Helicobacter pylori i Helicobacter felis sp. nov...” Microb. Ecol. Health Dis., vol. 4, 121-134 (1991)), tak więc ureaza nie przedstawia odpowiedniego celu dla rozwoju ochrony odpowiedzi śluzówkowej. Rzeczywiście, uważa się, że ochrona odporności śluzówki jest głównie pośrednia poprzez wydzielnicze IgA, której działanie aglutynujące może być utrudnione, gdy rozpoznawany antygen może być wydalany przez docelowy zarazek. Po trzecie, ureaza wydaje się być toksyczna dla komórek nabłonkowych w hodowli i jak podejrzewa się, odgrywa rolę w degradacji i śluzu i w peptydowym owrzodzeniu in vivo (Megraud. F. i in. „Furtber Evidence of the Toxic Effect of Ammonia Produced by

   179 149

   Helicobacter pylori Urease on Human Epithelial Cells.” Infect, and Immun., vol. 60, 1858-63 (1992); Murakami, M. i in. „Gastric Ammonia has a Potent Ulerogenic Action on the Rat Stomach,” Gastroenterology 1993 vol. 105, 1710-15, tak więc stosowanie jej jako antygenu może być toksyczne. Niemniej, uzasadniamy, że ten antygen może być potencjalnie skuteczną szczepionką, jeśli:

   - po pierwsze, może być dostarczona doustnie w wystarczająco dużej dawce, aby osiągnąć silniejszą odpowiedź odpornościową niż zachodzi to w warunkach naturalnych;

   - po drugie, ilość wytworzonych przeciwciał będzie wystarczająca, aby związać całą ureazę, wydaloną lub niewydaloną;

   - po trzecie, można by zastosować podjednostki ureazy lub gatunki o takiej budowie molekularnej, które są nietoksyczne.

   Inny aspekt wynalazku opisuje stosowanie przeciwciał skierowanych przeciw ureazie do zapobiegania i leczenia infekcji spowodowanej Helicobacter. Europejski opis zgłoszeniowy nr 91310049.1 złożony przez Kunic Ando 31 października 1991 r. z zastrzeżeniem pierwszeństwa z japońskiego zgłoszenia patentowego nr 296609/90 zgłoszonego 1 listopada 1990 r. zatytułowany „A Method for Producing a new Medicine for Both Treating and Preventing Peptic Ulcer Disesaes and Gastris and Thus Formulated Medicines” opisuje doustne podawanie poliklonalnych przeciwciał, uzyskanych z bydlęcej siary i surowicy bydlęcej, pacjentom z aktywnym przewlekłym nieżytem żołądka typu B i pacjentom z owrzodzeniem dwunastnicy. Zgłoszenie Ando opisuje stosowanie preparatu przeciwciała skierowanego przeciwko wielu antygenom, włączając Helicobacter pylori i nie ujawnia stosowania przeciwciała przeciw ureazie do leczenia i zapobiegania infekcji wywołanej Helicobacter pylori. Stosowanie przeciwciał do leczenia chorób żołądka u jałowych prosiaków zostało opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5258178 i nr 5260057 udzielonych na rzecz Cordle i Schaller zatytułowanym „Method and Product for the Treatment of Gastric Disease”. Patent Cordle i Schaller opisuje stosowanie preparatu przeciwciała, który nie zawiera wyłącznie przeciwciał skierowanych przeciwko Helicobacter pylori, i nie ujawnia stosowania przeciwciała skierowanego przeciw ureazie do leczenia i zapobiegania infekcji wywołanej Helicobacter pylori. Nagata i in. opisuje wytwarzanie monoklonalnego przeciwciała skierowanego przeciw Helicobacter pylori, który inhibituje działanie ureazy. (Nagata, K., i in., „Monoclonal Antibodies Against the Native Urease of Helicobacter pylori. Synergistic Inhibiton of Urease Activity by Monoclonal Antibody Combinations,” Infect, and Immun., vol. 60, 4826 (1992)). Nagata i in. nie opisuje stosowania monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw ureazie do zapobiegania czy leczenia infekcji wywołanej Helicobacter pylori.

   W literaturze dostępnych jest niewiele przykładów szczepionek terapeutycznych. Większość z nich dotyczy jelitowego uodporniania skierowanego na stymulację układu odpornościowego żywiciela przeciw złośliwym guzom, modulowania układu odpornościowego w autoimmunizacji chorób takich jak reumatoidalne zapalenie stawów lub odczulania stanów alergicznych. Wykonane są również procedury związane z terapeutycznymi szczepionkami przeciw różnym infekcjom, większość z nich metodą pozajelitowej immunizacji. Objęte są nimi immunizatory przeciw trądowi u ludzi (Zaheer S.A. i in. „Combined Multidrug and Mycobacterium w Vaccine Therapy in Patients with Multibacillary Leprosy” J. Infect Dis., vol. 167, 401410 (1939), Mukherjee A. i in., „Histopathological Monitoring of an Immunotherapeutic Trial with Mycobacterium w” Int. J. Lepr. Other Mycobat. Dis., vol. 60, 28-35 (1992) w komplementacji terapii antybiotykowej, szczepionka przeciw Phythiosis isidiori. infekcjom grzybicznym, u koni (Mendoza L. i in. „Evaluation of Two Vaccines for the Treatment of Phythiosis isidiori in Horses” Mycopathologia, vol. 119, 8995 (1992)), niekontrolowane badania stosowania autoszczepionki w przewlekłym zapaleniu szpiku (Sologub V.V. „Experience in Using an Autovaccine in Treating Patients with Chronic Osteomylitis” Vrach, Delo, 122-125 (1992)) i systemowa immunizacja przeciw infekcji spowodowanej Campylobacter fetus u samic bydła (Schuring, G.G.D., i in., „Bovine Veneral Vibriosis: Cure of Genital Infection in Females by Systemie Immunization,” Infect and Immun., vol. 11, 245-51 (1975)). Jak dotąd, wykonano tylko jedno badanie doustnej immunoterapii skierowane na stymulację układu immunologicznego śluzówki w celu leczenia (i zapobiegania nawrotom)

   179 149 infekcji śluzówki, dotyczące infekcji dróg moczowych (Schulman C.C. i in. „Oral Immunotherapy for Recurrent Urinary Tract Infections: A Double-Blind Placebo-Controlled Multicenter Study” J. Urol., vol: 150, 917-921 (1993)). W tym badaniu Schulman i in. stosowali lizat wybranych szczepów E. coli, razem z towarzyszącym leczeniem antybiotykowym, chemoterapię lub dezynfekcję dróg moczowych, do leczenia ostrej infekcji jako wyjściowej w badaniu. Tak więc, nie zostały przedstawione badania dotyczące skuteczności terapeutycznej szczepionki, stosowanej jako monoterapia, podawanej do układu immunologicznego śluzówki, przeciw chorobom pochodzenia bakteryjnego.

   Nowość terapeutycznej szczepionki przeciw infekcjom spowodowanym Helicobacter, wynika także z obserwacji, że H. pylori, utrzymuje się jako przewlekła infekcja w jamie żołądka przez lata, pomimo indukowania silnej miejscowej i systemowej odpowiedzi immunologicznej. Już ta obserwacja była przeszkodą w rozwoju profilaktycznej szczepionki przeciw infekcji spowodowanej Helicobacter, ale w jeszcze większym stopniu była przeszkodą w rozwoju terapeutycznej immunizacji.

   Podsumowując, pozostaje potrzeba skutecznego leczenia i zapobiegania infekcjom żołądka u ludzi powodowanym przez Helicobacter pylori. Ostatnie dane sugerują możliwość wytworzenia szczepionki przeciwko takiej infekcji, ale nie dostarczają jasnej identyfikacji określonego antygenu(ów), wspólnego dla wszystkich szczepów Helicobacter pylori, które mogłyby być wprowadzone do bezpiecznej i skutecznej szczepionki.

   W niniejszym wynalazku, zidentyfikowano antygen ureazy Helicobacter pylori jako kandydata szczepionki i przedstawiono jej skuteczność na modelu zwierzęcym. Przedstawiono również stosowanie antygenu ureazy Helicobacter pylori do leczenia i zniszczenia infekcji spowodowanej Helicobacter. Dalej przedstawiono, że sama podjednostka B ureazy (ure B) jest skuteczna jako szczepionka do zapobiegania i leczenia infekcji spowodowanej Helicobacter. Wyniki te są nieoczekiwane w świetle naturalnej historii infekcji spowodowanej Helicobacter.