【発明の詳細な説明】
ウレアーゼに基づくヘリコバクター感染に対するワクチンおよび治療
本発明は、ヒトを含む哺乳類における胃内感染の防止および治療に関する。よ
り具体的に、本発明は、ヒトを含む哺乳類におけるヘリコバクター感染の防止お
よび治療に用いるのに適したワクチンに関し、また、胃内感染とその結果起きる
慢性胃炎または消化性潰瘍に罹患したヒトを治療する方法、および胃癌を予防す
る方法に関する。
発明の背景
ヒトの胃上皮へのヘリコバクター感染は、胃炎の原因となり、消化性潰瘍およ
び胃リンパ腫を発生させる主な原因であり、また、胃癌を発生させる危険因子で
ある可能性がある(Blaser，M．J．"Gastric Campylobacter-like Organisms,Gas
tritisand Peptic Ulcer Disease"，Gasteroenterology，vol．93，371-383(198
7); Graham，D.Y.”Campylobacter pyliri and Peptic Ulcer Disease”Gastroe
nterology，vol.93，371-383(1987); Graham，D.Y.”Cmpylobacter pylori and
Peptic Ulcer Disease”Gastroenterology，vol．196，615-625(1989); Personn
et，J．et al.”Helicobacter pylori Infection in intestinal and Diffuse-T
ype Gastric Adenocarcinomas”J.Natl．Cancer Inst.，vol．93，640-643(1991
); Wotherspoon，A．C.，etal.,"Regression of Primary Low-Grade B-cell Gas
tric Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Type After Eradicatio
n of Helicobacter pylori,”Lancet，vol．342，575-577(1993))。もっとも感
染が起こりやすい病原体は、ヘリコバクター・ピロリであり、かなり低い頻度で
あるが、次に起こりやすいのは、ヘリコバクター・ヘイルマニ（Helicobacter h
eilmanii）である。ヘリコバクター・ピロリは、細長いS字型のグラム陰性菌で
、組織学的に胃潰瘍や消化性潰瘍の所見をもつ、大人や子供の胃の生体試料から
、必ずと言っていいほど回収される。ヘリコバクター・ピロリと胃十二指腸疾患
に因果関係があるという証拠は、ヒトの任意協力者、胃潰瘍や胃癌の患者、ノト
バイオートのブタ、および、無菌の齧歯類での研究から得られた。病因に関して
は、感染していない個体が生きた細菌を摂取すると胃炎を起こすということが、
組織学的に確認されたことによって、コッホの条件を充たし(Marshall，et al
.”Attempt to Fulfill Koch's Postulate for pyliric Campylobacter,”Med.J
.Aust.，vol．142，436-439(1985); Morris，A．et al.”Ingestion of Campylo
bacter pyloritis Causes Gastritis and Raised Fasting Gastric pH”Am.J．G
astroenterol.，vol．82，192-199(1987); Engstrand，L．et al.”Inoculation
of Barrier-Born Pigs With Helicobacter pylori: A Useful Animal Model fo
r Gastritis Type B”Infect．Immun.，vol．53，1763-1768(1990); Fox，J．G
．et al.”Gastric Colonization by Campylobacter pylori Subsp.Mustelae in
Ferrets”Infect．Immun.，vol．56，2994-2996(1988); Fox，J.G.et al.”Hel
icobacter mustelae-Associated Gastritis in Ferrets: An Animal Model of H
elicobacter pylori Gastritis in Humans,”Gasteroenterology，vol．99，352
-361(1990); Lee，A．et al.”A small Animal Model of Human Helicobacter p
ylori Active Chronic Gastritis,”Gasteroenterology，vol．99，1315-1323(1
990); Fox，J．G．et al.”Helicobacter Felis Gastritis in Gnotobiotic Rat
s: An Animal Model of Helicobacter pylori Gastritis,”Infect．Immun.，vo
l．59，785-791(1991); Eaton，K.A.，et al.”Campylobacter pylori Virulenc
e Factors in Gnotobiotic Piglets”Infect．Immun.，vol．57，1119-1125(198
9))、また、ヘリコバクター・ピロリを根絶する治療によって、胃炎が治癒する
とともに、消化性潰瘍の患者の再発率が減少した(Peterson，W.L.”Helicobacte
r pylori and peptic Ulcer Disease”N.Engl．J.Med.，vol.324，1043-1048(19
91))。
ヘリコバクター感染が関係すると考えられている胃十二指腸疾患には、急性胃
炎、慢性胃炎および萎縮性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含む消化性潰瘍、
胃癌、重度のびらん性胃十二指腸炎を伴う慢性消化不良、難治性非潰瘍性消化不
良、胃上皮化生、および、低級粘膜付属リンパ組織リンパ腫が含まれる。また、
ヘリコバクター感染は、潜在性の慢性胃炎の主な原因になっている。
インビトロでは、多くの抗菌剤に対して感受性を示すのにも関わらず、インビ
ボでは、ヘリコバクター・ピロリ感染が確立すると、抗菌剤によってこれを根治
するのは往々にして困難である(Czinn，S．J．and Nedrud，J．G．”Oral Immun
ization against Helicobacter pylori,”Infect．Immin.，vol．59，2359-2363
(1991))。この細菌は、胃上皮や胃の窪みを覆っている粘膜の中に見られる。こ
の場所は、たとえ抗生物質を大量に経口投与しても、抗菌剤が十分には浸透しな
い部位である。現在のところ、ほとんどの専門家は、「三重治療法」、すなわち
、ビスマス塩にテトラサイクリンやメトロニダゾルなどの薬剤を組み合わせたも
のを2〜4週間投与する方法を勧めている。しかし、この方法や他の化学的療法に
よる養生法の効果は十分だとはいえない。最近、国立衛生研究所（NIH）の医療
専門家のグループが、消化性潰瘍の治療に、ビスマス塩とテトラサイクリン、メ
トロニダゾルの3つ組み合わせた治療薬を2週間投与するように奨めた(Cimons，M
.，”Drug Combination Found effctive on Peptic Ulcers,”L.A．Times at A1
4(1994年2月10日))。しかし、この治療は通常、下痢を伴うので、重度の薬剤有
害作用を起こすかもしれない(Dick-Hegedus，E．and Lee，A.，”Use of a Mous
e Model to Examine Anti-Helicobacter pylori Agents,”Scand.J．Gastroente
rol.，vol．26，909-915(1991)参照)。また、抗生物質による治療は、再感染の
問題の解決にはならず、いくつかの調査で、再感染が高頻度で起こることが証明
されている(Coelho,L．G.，et al.,”Duodenal Ulcer and Eradication of H.py
lori in a Developing Country: An 18-month Follow-Up study，”Scand．J．G
astroenterol.，vol．27，362-66(1992))。したがって、感染治療、および、将
来の感染を予防するために用いることができるワクチンに対する高い需要がある
。
今はまだ、胃の中の粘膜免疫機構の役割についてはほとんど知られていない。
正常な幽門洞における免疫グロブリン(Ig)産生細胞の分布を見ると、IgA形質細
胞が全形質細胞の80％を作っていることがわかる。さらに、幽門洞に存在するIg
A形質細胞の数は、他の粘膜に比べて多い。(Brandtzaeg，P.”Role of J Chain
and Secretory Component in Receptor-Mediated Glandular and Hepatic Trans
port of Immunoglobulins in Man”Scand．J．Immunol.，vol．22，111-146(198
5); Brandtzaeg，P．et al.”Production and Secretion of Immunoglobulins i
n the Gastrointestinal Tract”Ann．Allergy，vol．59，21-39(1987年11月))
。ヒト(Wyatt，J．I．et al”Local Immune Response to Gastritis Campylobac
ter in Non-ulcer Dyspepsia”J．Clin．Path.，vol．39，863-870(1986))や動
物モデル(Fox，J．G．et al.”Helicobacter mustelae-Associated Gastritis i
n
Ferrets: An Animal Model of Helicobacter pylori Gastritis in Humans”Ga
steroenterology，vol．99，352-361(1990); Fox，J．G．et al.”Helicobacter
felis Gastritis in Gnotobiotic Rats: An Animal Modal of Hericobacter py
lori Gastritis”Infect．Immun.，vol．59，785-791(1991); Fox，J．G．et al
.”Local and Systemic Immunne Response in Murine Helicobacter felis Acti
ve Chronic Gastritis”Infect．& Immun．vol．61，2309-15(1993))における多
くの実験から、血清や胃分泌物中でのヘリコバクター感染に対するIgGおよびIgA
の特異的な応答が明らかになった。しかし、ヘリコバクター・ピロリの感染は、
局所的および全身的応答を誘導しながらも、何年間も慢性的に持続するという観
察があるために、免疫治療法の開発が促進されていない。
リー（Lee）らは、ヘリコバクター・ピロリに近い細菌であるヘリコバクター
・フェリスを無菌齧歯類に感染でき、組織学的に胃炎を再現できることを報告し
ている(Lee，A．et al.”A Small Animal Modal of Human Helicobacter pylori
Active Chronic Gastritis”Gasteroenterology，vol．99，1315-1323(1990);
Fox，J．G．et al.”Helicobacter felis Gastritis in Gnotobiotec Rats: An
Animal Modal of Helicobacter pylori Gastritis”Infect．Immun.，vol．59，
785-791(1991))。それ以来、この細菌−宿主の組み合わせが、ヘリコバクターが
媒介する胃炎およびその開始因子を研究するための優れたモデルとして認められ
てきた(Lee,A.et al.”Pathogenicity of Helicobacter pylori: A Perspective
”Infect．Immun.，vol.61，1601-1610(1993))。マウスにヘリコバクター・フェ
リスを感染させると、ヘリコバクター・ピロリに感染したヒトと同様の病理的反
応を示し、どちらのタイプも活発な慢性胃炎を起こす(Lee，A．et al.，Gastero
enterology，vol．99，1315-1323(1990))。研究者たちは、抗菌薬治療に対し、
ヘリコバクター・フェリスがヘリコバクター・ピロリと同じ感受性をもつことを
見出したため、ヘリコバクター・フェリス/マウスのモデル系がヘリコバクター
・ピロリ感染に対する新しい治療法を開発するために用いられている(Dick-Hege
dus，E．and Lee，A.,”Use of a Mouse Model to Examine Anti-Helicobacter
pylori Agents”Scand．J．Gastroenterol.，vol．26，909-915(1991); Chen et
al.,”Immunizaion Against Gastric Helicobacter Infection in a Mouse/Hel
icobacter felis Model”Lancet,vol．339，p.1120(1992))。Czinnらは、ヘリコ
バクター・ピロリの粗溶解物にコレラ毒をアジュバントとして繰り返し経口免疫
すると、マウスおよびケナガイタチ（ferret）で、胃腸IgAの抗ヘリコバクター
・ピロリ応答が強く誘導されることを示した(Czinn，S．J．and Nedrud，J．G.
”Oral Immunization Against Helicobacter pylori”Infect．Immun.，vol．59
，2359-2363(1991))。さらに、チェン（Chen）らおよびチン（Czinn）らは、ヘ
リコバクター・フェリスの粗溶解物で経口免疫すると、マウスにおいてヘリコバ
クター・フェリスの感染を防御することを報告した（Chen et al.,"Immunizatio
n Against Gastric Helicobacter Infection in a Mouse/Helicobacter felis M
odel,”（letter）Lancet，vol．339，p.1120-1121(1992); Czinn，S．et al.”
Oral Immunization Protects Germ-Free Mice Against Infection from Helicob
acter felis”Proceedings of the DDW,American Gastroenterological Associa
tion,1321，A-331(May 10-13，1992)，Czinn et al.，Vaccine，vol．11，637-6
42(1993))。しかし、この防御の誘導に関与する抗原の正確な性質はまだ決定さ
れておらず、ヘリコバクター・フェリスに対する防御を誘導するこの細菌の防御
抗原が、他のヘリコバクター種にも交差反応的防御を誘導することを示す情報は
ない。
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリスの超
音波破砕物でマウスを経口免疫した後のモノクローナル抗体を得、これらの抗体
の中でヘリコバクター・ピロリに対して作られたもののいくつかがヘリコバクタ
ー・フェリスと交差反応を起こし、逆も起こることを示して、最初にヘリコバク
ター・ピロリとヘリコバクター・フェリスが共通のエピトープをもつことを示し
た(Michetti，P．et al.”Specificity of Mucosal IgA Response in Balb/C Mi
ce Following H.Felis or Helicobacter pylori Challenges”Proceedings of t
he DDW,American Gastroenterological Association，1001，A-251（May 10-13,
1992); Davin，C．et al.”Helicobacter pylori Urease Elicits Protection A
gainst H.Felis Infection in Mice”Proceedings of the DDW,American Gastro
enterological Association, 1213，A-304(May 16-19，1993)。しかし、これら
の交差反応性の基礎は分かっていない。
異なった既知のウレアーゼのアミノ酸配列間に存在する相同性に基づいて、タ
チナタマメのウレアーゼをヘリコバクター・ピロリに対するワクチンに用いるこ
とができると提案された(Pallen，M．J．and Clayton，C．L．”Vaccination Ag
ainst Helicobacter pylori Urease”Lancet，vol．336，186-7(1990))。それに
も関わらず、異なったウレアーゼの配列間に相同性があるからといって、交差性
があるとは限らない。グオ（Guo）およびリウ（Liu）は、何年も前にプロテウス
・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulga
ris）およびプロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）のウレアー
ゼが交差反応性を互いに示すことを明らかにしていた。ただし、タチナタマメと
モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）のウレアーゼは、先の３つのウ
レアーゼとは、免疫学的に明らかに区別できる(Guo，M．and Liu，P．V．”Sero
logical Specificities of Urease of Proteus Species”J．Gen．Microbiol.，
vol.136，1995-2000(1965))。したがって、ヘリコバクター・ピロリのウレアー
ゼが他のヘリコバクターのウレアーゼと抗原交差反応するのが、合理的な仮定で
あるとしても、本発明者らが、ヘリコバクター・フェリスのモノクローナル抗体
のいくつかがヘリコバクター・ピロリのウレアーゼと交差反応することを示すま
で、本当にそれが当てはまることを示すデータは存在しなかった(Davin，C．et
al.”Helicobacter pylori Urease Elicits Protection Against H.felis Infec
tion in Mice”Proceedings of the DDW，American Gastroenterological Assoc
iation，1213，A-304(May 16-19，1993))。J.パッポ（J.Pappo）は、さらに、ヘ
リコバクター・フェリスに感染したマウスが、ヘリコバクター・ピロリのウレア
ーゼとは交差反応するが、タチナタマメのウレアーゼとは交差反応しない抗体を
産生することを明らかにした(J．Pappo，未発表データ、1993)。タチナタマメの
ウレアーゼがヘリコバクターのウレアーゼと免疫学的に同じ分類に含まれなかっ
たことは、タチナタマメのウレアーゼが、腸内細菌について行ったような方法で
は、ヘリコバクター感染を免疫する上で有用でないことを示唆する(Pimental，J
．L.and Cook，M．E.”Improved Growth in the Progeny of Hens Immunized wi
th Jackbean Urease”Poultry Sci．，vol．64，434-439(1988))。さらに、タチ
ナタマメのウレアーゼを経口ないし腹膜内経由で輸送してヘリコバクター・フェ
リ
スの感染に対し、マウスを免疫しようという試みたところ、タチナタマメのウレ
アーゼに対する抗体は産生したが、マウスの感染を防御することはできなかった
(Chen M．et al.”Failure of Immunization Against Helicobacter Using Jack
Bean Urease,”Acta Gastroenterol．Belg.，vol.56,94(1993))。
ウレアーゼとグルタルアルデヒドの反応産物を抗原として用いることが、1989
年6月6日、リベーン（LeVeen）らに与えられた米国特許第4,837,017号、「Ureas
e Antigen Product and Process」に開示されている。この特許では、尿素を分
解する細器官によって引き起こされるアンモニア毒性を緩和するために、抗原を
用いることが説明されている。リベーンらは、グルタルアルデヒドで処理された
タチナタマメのウレアーゼを血管に注射することを開示している。リベーンらの
特許は、局所的な免疫系で抗体産生を刺激するために、哺乳動物の粘膜の表面に
ウレアーゼ抗原を投与することを開示していない。さらに、タチナタマメウレア
ーゼ抗原の注射によってヘリコバクター感染を防御でき、ヘリコバクターによる
胃十二指腸感染を治療するために用いることができるということの証拠が明細書
中に示されていない。
イートン（Eaton）らは、弱いウレアーゼ活性をもつヘリコバクター・ピロリ
変異体の培養物が、ノトバイオートの子ブタに感染できないことを示した(Eaton
et al.,”Essential Role of Urease in the Pathogenesis of Gastritis Indu
ced by Helicobacter pylori in Gnotobiotec Piglets,”Gastroenterology，vo
l.98，A654(1990))。イートンらは、ヘリコバクター感染を予防するためのワク
チンとして、あるいは、ヘリコバクター感染を治療する方法として、ウレアーゼ
抗原を用いることについては述べていない。
ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ、またいはそれに関連するウレアーゼを、
ヘリコバクター・ピロリ感染に対するワクチンとして使用することが、以前、A.
ラビン（Labigne）によって提案され、フランス、パリのパスツール研究所が198
8年10月6日に提出した特許の請求の範囲の中に包含されている(Labigne，A.”Se
quences of Nucleotides Coding for a Protein Having an Urease Activity”E
PO patent application #EPO 367 644 A1，1989．International Publication #
WO 90/04030，1990)。しかし、この特許の明細書にはヘリコバクター感染に対
して、ウレアーゼを用いて、何らかの動物をワクチン接種したという証拠が載っ
ていない。したがって、パスツール研究所の特許のこの部分は、まだ実施されて
おらず、関連する請求の範囲(請求の範囲27および28、16ページ)を有効だとみな
すべきではない。さらに、この特許の請求の範囲は、ウレアーゼ活性がある蛋白
質に関連するため、後述の実験から、ウレアーゼに基づいたワクチンの酵素活性
が経口免疫後の防御を誘導するのに必要でないこは明らかであろう。
さらに、他のバクテリアのウレアーゼとの配列相同性が、ウレアーゼをヘリコ
バクター・ピロリ感染に対するワクチンの候補として利用するための根拠になっ
ていたようだが、ヒトのヘリコバクター・ピロリ感染に関する最近の知識は、こ
れに反する。まず、感染した個体は、しばしば、ウレアーゼに対して強い抗体反
応を有するにも拘わらず、この抗ウレアーゼ免疫反応によって、感染を除去した
り、制御するには至らない。第二に、ヘリコバクター・ピロリは、ウレアーゼを
、細胞外へ輸送し、かつ細胞表面から取り込むことができる(Evans，D．J．et a
l.”Urease-Associates Heat Shock Protein of Helicobacter pylori”Infect.
Immun.，vol．60，2125-2127(1992)，Ferrero，R．L．and Lee，A.,”The Impor
tance of Urease in Acid protection for the Gastric-Colonizing Bacteria H
elicobacter pylori and Helicobacter felis sp．nov.”Microb．Ecol．Health
Dis.，vol．4，121-134(1991))。したがって、ウレアーゼは、防御的粘膜免疫
応答を発生させるのに適した標的を代表する存在とはいえない。実際、粘膜免疫
による防御は、おもに分泌IgAに媒介されると考えられており、標的となる病原
体が注入した抗原を認識すると、その凝集活性が損なわれる。第三に、ウレアー
ゼは、培養液中では上皮細胞にとって毒性があり、粘膜の分解およびインビボの
消化性潰瘍に関与すると考えられており(Megraud，F.et al.,”Further Evidenc
e of the Toxic Effect of Ammonia Produced by Helicobacter pylori Urease
on Human Epithelial Cells,”Infect．& Immun.，vol．60，1858-63(1992); Mu
rakami，M．et al.”Gastric Ammonia has a Potent Ulcerogenic Action on th
e Rat Stomach,”Gastoenterology 1993，vol．105，1710-15)、このため、抗原
として利用するとしても毒性がある。
それにも拘わらず、本発明者らは、まず、自然に起こる免疫応答よりも強い免
疫応答を誘導するために充分な高用量を経口的に輸送でき、第二に、産生される
抗体の量が、ウレアーゼが注入されたものであってもなくても、すべてのウレア
ーゼに結合するのに充分な量があり、第三に、ウレアーゼのサブユニット、また
は毒性がない分子種を利用できれば、この抗原が効果的なワクチンになりうるこ
とを見出した。
本発明の別の局面において、ヘリコバクターの感染を防止し、治療するために
、ウレアーゼに対する抗体を用いることが説明される。1991年10月31日に、アン
ドウクニオによって出願された、欧州特許出願番号91310049.1は、1990年11月1
日に出願された日本特許出願番号296609/90に対して優先権を主張しており、「A
Method for Producing a new Medicine for Both Treating and Preventing Pe
ptic Ulcer Diseases and Gastritis and Thus Formulated Medicines」という
標題である。この出願では、ウシの初乳およびウシの血清に由来するポリクロー
ナル抗体を、進行性の慢性B型胃炎の患者、および、十二指腸潰瘍の患者に経口
投与することを説明している。アンドウの出願は、ヘリコバクター・ピロリを含
む、多くの抗原に対する抗体調製物の使用を説明しているが、ヘリコバクター・
ピロリの感染を治療ないし予防するために、ウレアーゼに対する抗体を使用する
ことは開示していない。ノトバイオート子ブタの胃疾患を治療するために抗体を
使用することが、コードルおよびシャラーに付与され、「Method and Product f
or the Treatment of Gastric Disease」という標題の合衆国特許番号5,258,178
と5,260,057で説明されている。コードルおよびシャラーの特許は、ヘリコバク
ター・ピロリに対する抗体だけを含む抗体調製物の説明をしているのではないし
、ヘリコバクター・ピロリの感染を治療ないし予防するために、ウレアーゼに対
する抗体を使用することは開示していない。ナガタらは、ウレアーゼ活性を阻害
するヘリコバクター・ピロリに対するモノクローナル抗体の調製について説明し
ている(Nagata，K．et al.,”Monoclonal Antibodies Against the Native Urea
se of Helicobacter pylori:Synergistic Inhibition of Urease Activity by M
onoclonal Antibody Co,binations,”Infect．and Immun.，Vol．60，4826(1992
))。ナガタらは、ヘリコバクター・ピロリの感染を治療または予防するために、
ウレアーゼに対するモノクローナル抗体を使用することは説明していない。
文献で入手できる治療用ワクチンに関する実施例は、非常に少ない。それらの
殆どは、慢性関節リューマチまたはアレルギー症状の脱感作のような自己免疫疾
患における免疫系を調整するために、悪性腫瘍に対する宿主の免疫系を刺激する
ことを目的とした非経口免疫処置に関する。異なった感染症に対する治療用ワク
チン接種を、殆どの場合非経口経路で投与することも行われた。この処置には、
抗生物質による治療を補足するために、ヒトのらい病(Zaheer S．A．et al.”Co
mbined Multidrug and Mycobacterium wVaccine Therapy in Patients with mul
tibacillary Leplosy”J．Infect Dis.，vol.167，401-410(1993)，Mukherjee A
．et al.,”Histopathological Monitoring of an Immunotherapeutic Trial wi
th Mycobacterium w.”Int．J．Lepr．Other Mycobact．Dis.，vol．60，28-35(
1992))に対する免疫処置を行うこと、ウマにおける菌類感染体であるPhythiosis
insidioriに対する免疫処置(Mendoza，L．et al.，”Evaluation of Twe Vacci
nes for the Treatment of Phythiosis insidiori in Horses”Mycopathologia,
vol．119，89-95(1992))を行うこと、慢性骨髄炎における自家ワクチン療法を用
いることに関する、対照なしの研究(Sologub v．v.”Experience in Using an A
utovaccine in Treating Patients with chronic Osteomyelitis”Vrach，Delo
，122-125(1992))、および、雌ウシのキャンピロバクター・フェツス（Campylob
acter fetus）感染に対する全身免疫処置(Schurig，G．G．D.，et al.，”Bovin
e Venereal Vibriosis: Cure of Genital Infection in Females by Systemic I
mmunization”Infect．& Immun.，Vol．11，245-51(1975))が含まれる。今まで
に、尿管感染による粘膜感染を治療する(および、再発を予防する)ために、粘膜
免疫機構を刺激することを目的とした経口免疫療法を行ったものが一つだけあっ
た(Schulman C.C.，et al.”Oral Immunization of Recurrent urinary Tract I
nfections: A Double-Blind Placebo-Controlled Multicenter Study”J．Urol.
，vol．150，917-921(1993))。この研究でSchulamらは、選りすぐった大腸菌株
の分離物を用いている。その際、抗体を並存させて処理を進めたり、また、化学
療法を同時に行ったり、尿路殺菌を行ったりすることで、この研究の開始時に起
こる急性感染症に対処している。したがって、治療用ワクチンを単独治療として
、粘膜免疫系に投与し細菌による疾患に対抗させた場合のワクチンの効果につい
て明らかにしているような研究はない。
ヘリコバクター感染に対する治療用ワクチンの斬新な点は、H.ピロリが胃の内
腔において局所的な活性化や免疫応答系の誘発を起こしながらも、何年もの間慢
性的感染症として生き残っているという事実からも伺える。この事実は概念上、
ヘリコバクター感染に対する予防用ワクチンを開発する障害に既になっており、
それだけでなく治療用免疫処置剤の開発の障害にもなっている。
簡単に述べると、人体における胃内感染を引き起こすヘリコバクター・ピロリ
に対する有用な治療法、即ち撃退法の必要性は今も残ったままである。最近のデ
ータによると、この感染症に対抗できるワクチンの生成の可能性が示唆されてい
る。しかしそれは、特定の一つ複数の抗原についてもはっきりとした同一性を示
すものではなく、ヘリコバクター・ピロリの全ての菌株に共通なものである。そ
れは安全性が高く有効なワクチンに組み入れることができる。
本発明において本発明者らは、モデル動物でワクチンとなる可能性があり、そ
の有効性が認められるヘリコバクター・ピロリのウレアゼー抗原を同定した。ま
た、本発明者らはヘリコバクター感染症を治療し根絶させるヘリコバクター・ピ
ロリのウレアーゼ抗原の使用法についても開示した。さらに本発明者らは、ウレ
アーゼ固有のBサブユニット（ure B）がヘリコバクター感染症の撃退及び治療に
有効なワクチンとしての効力を持つことを明らかにした。これらの事実について
は、ヘリコバクターの感染症に関するこれまでの自然界の歴史をたどってもその
点は明らかにされていない。
発明の概要
本発明者らは、予防のための処置、および治療のための処置いずれにも有用な
ヘリコバクター ウレアーゼペプチドを用いて動物を免疫獲得させることにした
。ヘリコバクター ウレアーゼペプチドを用いて動物を免疫すると、ヘリコバク
ターによる感染を防止できるとともに、既に感染している動物に対しては、その
感染を根絶させることができる。この方法、即ちワクチン混合剤は、ヘリコバク
ター感染症と関係のある胃十二指腸疾患に対しても対抗しそれを根絶および治療
するのに効果がある。
本発明者らは、ヘリコバクターの表面上その周りに位置しているウレアーゼエ
ピトープを利用して、即ちワクチンターゲットとしてそれらを用いることで胃腸
内ヘリコバクター感染症にかかっている哺乳動物に免疫を獲得させることを見出
した。この免疫性は、天然のウレアーゼを用いて免疫することで獲得させること
ができるが、酵素的に不活性、即ち非毒性の形態になるように組み換えられたウ
レアーゼサブユニットを用いて獲得させることもできる。本発明はまた、哺乳動
物の粘膜表面にポリアミノ酸調製物、即ちペプチドおよび／またはタンパク質の
混合物を適当なアジュバントとともに投与することによって、ヘリコバクター感
染に対し免疫を獲得させる方法を提供するものである。このポリアミノ酸調製物
は、内性のウレアーゼ酵素によって特徴づけられて並んでいる複数個のエピトー
プを、感染しているヘリコバクターに出現させる。
ポリアミノ酸調製物は、経口で投与することができる。
この調製物の活性成分は、天然に存在する生合成されたエピトープから構成さ
れていてもよいし、様々の形態のものであってもよい。全部を網羅しているわけ
ではないが、取りうる調製物のリストには、精製され、自然界で生成されるか組
換えて製造された細菌、ほかの起源からなるウレアーゼ調製物やウレアーゼの消
化物、ウレアーゼエピトープからなる複合タンパク質、ウレアーゼ酵素を切断し
た形態のもの、またはウレアーゼのアミノ酸配列と相同性をもつペプチドが含ま
れている。免疫の成立は、ヘリコバクターに感染している器官に結合するような
体液性免疫反応や細胞性免疫反応が起こることによるものであるため、調製物は
内性的なウレアーゼのエピトープを、感染器官に非常に似ているように複製する
。例えば、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼのエピトープを備えた調製物は
、ヘリコバクター・ピロリの感受性があるヒトに対して投与されるために作られ
たものであり、また、H.フェリスのウレアーゼのエピトープを備えた調製物は、
H.フェリスに感受性のあるヒトに対して投与されるために作られたものである。
しかしながら本発明の重要な観点は、異種の菌株のウレアーゼを用いることが見
出されたことである。例えばネズミのH.フェリス感染症はヘリコバクター・ピロ
リから得られるウレアーゼを投与する事によって排除できることを本発明者らは
明らかにした。このようにヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼは、ヘリコバク
ター・ピロリに対して防御するのと同様にヘリコバクター・フェリスに対しても
防御のために利用することができる。ヘリコバクター・フェリスはヒトの感染症
または疾病を引き起こす原因に時としてなる（「Wegman，W.，et al.，Schweig.
Med．Wochenschr．vol．121，245-54(1991)」参照）。本発明の第１実施例では
、宿主である哺乳動物においてヘリコバクター感染に防御的な免疫反応を引き起
こす方法を提供する。本発明の第２実施例では、ヘリコバクターに感染している
宿主の哺乳動物を治療する方法を提供する。
したがって本発明の第一の目的は、哺乳動物の宿主においてヘリコバクター感
染に対する防御的な免疫応答を引き起こす方法を提供することにある。この方法
はヒトを含む哺乳動物の粘膜表面にウレアーゼ抗原、好ましくはヘリコバクター
・ピロリ ウレアーゼを免疫的に有効な量、即ち防御的免疫反応を引き起こすこ
とのできる量を投与することからなる。この「からなる」という用語は、この分
野で認められている意味で用いている。
本発明の一つの目的は、哺乳動物の宿主においてヘリコバクター感染に対する
防御的な免疫応答を引き起こす方法を提供することにある。ここでは、防御的免
疫応答を引き起こすことができる免疫的に有効な量のウレアーゼ抗原、好ましく
は、ヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼ
Ｂサブユニットが宿主の粘膜表面に投与される。
本発明の第二の目的は、哺乳動物の宿主においてヘリコバクター感染に防御的
な免疫応答を引き起こす方法を提供することにある。この方法はヒトを含む哺乳
動物の粘膜表面に、抗原として作用する組み換え体であって、酵素的に不活性な
ウレアーゼ B サブユニット、好ましくは、組み換えられたヘリコバクター・ピ
ロリ ウレアーゼ B サブユニットを免疫学的に有効な量、即ち防御的免疫反応
を引き起こすことのできる量を投与することからなる。
本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物でヘリコバクター感染に対して治療予防を
行う目的も含んでいる。ここでは、ウレアーゼそのサブユニットが免疫学的に有
効な量、即ちヘリコバクター感染に対して防御的免疫反応を引き起こすことので
きる量だけ患者の粘膜表面に投与する。好ましくは、このウレアーゼはヘリコバ
クター・ピロリウレアーゼ ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ B サブユニッ
トであり、またこのウレアーゼは、例えばハイドロキシルアパタイトなどの水酸
化
リン酸カルシウムと結合させた粒子の形で投与することが望ましい。またヘリコ
バクター・ピロリ ウレアーゼを、粘膜アジュバントやコレラトキシンのB サブ
ユニット、ムラミルジペプチド、他のそのようなアジュバントと結合させて投与
することも好ましい。
本発明のもう一つの目的は、ヘリコバクター感染症の攻撃に適したワクチン製
剤を提供することにある。このワクチン製剤は、ウレアーゼ抗原、好ましくは、
ヘリコバクター・ピロリウレアーゼやヘリコバクター・ピロリウレアーゼ B サ
ブユニット、ヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼ B サブユニットの組み換え
体を有効量、即ち宿主においてヘリコバクター感染に対する防御的免疫反応を引
き起こすことのできる量を、薬剤学的に許容できる担体や希釈剤と組合せたもの
である。好適な担体や希釈剤は当業者に知られているものであり、例えば、「Re
mington's Pharmaceutical Sciences(18th ed.，(1990)」にそれらが記載されて
いるのを見出すことができる。
本発明のワクチンは、当業者により容易に決定される用量で投与される。従っ
て成人の好適な用量は10 μgから100 mgの範囲内である。例えば、50 μg−50 m
gが投与される。成人に対する好ましい用量は5 μg-500 mgの間といえるであろ
う。同じ範囲の用量を小児に対しても適用できる。ヒトの体内での運搬システム
としては、胃酸から抗原を保護する腸溶カプセルを用いて運搬する方法があり、
また複合タンパク質として不溶性の形態でウレアーゼ抗原を運搬する方法もある
。このワクチンは成人でも小児でも一時的な予防薬として投与することができ、
またヘリコバクター・ピロリに感染した宿主においてそのヘリコバクター・ピロ
リをうまく根絶させた後の二次的な排除薬として投与することもできる。更に、
感受性のある宿主において免疫応答を引き起こして、ヘリコバクター・ピロリを
根絶させるための治療薬として投与することもできる。
上述したように好適な粘膜アジュバントとしてはコレラトキシンがある。用い
ることが可能な他のアジュバントには、コレラトキシンを非毒性化した誘導体が
ある。これにはコレラトキシンのB サブユニットや、ウレアーゼ抗原にコレラト
キシンそのB サブユニットを添加した複合体や遺伝子操作された融合体が含まれ
る。他の好適な分配法には、生物分解性のマイクロカプセルや免疫刺激性の複合
体（ISCOMs）リポソームを用いたり、遺伝子的に毒性を減じるように操作された
ウイルスや細菌等のベクターを用いたり、また例えばアオシタトカゲのような組
み換え（キメラ）ウイルス様の粒子を用いたりできる。粘膜アジュバントの使用
量は、用いたアジュバントの種類によって決まってくる。例えば粘膜アジュバン
トがコレラトキシンである場合には、５μg-50μg、例えば10 μg-35 μgの量を
用いることが好ましい。マイクロカプセルの形態で用いる場合には、その用量は
マイクロカプセルの基剤に用いられる量によって異なり、望ましい用量に設定さ
れる。この量の設定は、当業者が行うことのできる技術に属する。
本発明のワクチンに対して好適な担体は、腸溶性被覆の施されたカプセルやポ
リラクチド−グリコライド マイクロスフェアである。また希釈剤として好まし
いのは、0.2 NのNaHCO3および/または食塩水である。
水酸化されたリン酸カルシウム（HCP）の粒子は、ヘリコバクター・ピロリ
ウレアーゼを粘膜表面に付与する担体として非常に有用である。
ヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼ ヒドロキシ化リン酸カルシウム複合体
は、ポリIg免疫反応を起こす箇所の上皮を通過すると考えられる。ヒドロキシ化
リン酸カルシウムは上皮を通過して運搬されるのに好適な微小粒子の形態である
ことが好ましい。それは特にここでの目的で問題とされている細胞（M 細胞）に
よって運搬される。水酸化リン酸カルシウムの好ましい形態は、ハイドロキシア
パタイトや商業的に入手可能な結晶性の水酸化リン酸カルシウムCa10(PO4)6(OH)2
である。
市販のハイドロキシアパタイトは通常、スラブ様(slab-like)の結晶からなり
、それは正常の骨組織における無機のハイドロキシアパタイトに化学的及び物理
的に類似している。したがってハイドロキシアパタイトの接種は安全であるべき
であり、基底骨(ground bone)由来で、経口摂取できるようにデザインされ、栄
養素のカルシウム/リンの存在よりそれは明らかである。市販の高溶解度のハイ
ドロキシアパタイト(CalBiochem社製)は、非常にさまざまな大きさの結晶からな
る。長さ1 μmより大きな結晶はＭ細胞によってうまく採取されない。したがっ
て本発明で用いるためには、市販のハイドロキシアパタイトの結晶を小さく、比
較的均一の結晶フラグメントになるようにソニケーションなどによって破砕する
。ハイド
ロキシアパタイトの実質的な大きさは、約0.01-1.0 μmの破片になっていること
が好ましい。破砕は、標準的な手法を用いた電子顕微鏡法か光散乱法のいずれか
によって測定することができる。
ヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼ抗原を投与するにあたっての好適な経路
は、口からや鼻から、直腸から、目からの経路である。経口投与によれば、腸内
の粘膜など他のG.I．（胃腸内の）粘膜にも供給することができる。
本発明のワクチンは、吸入剤や懸濁剤、カプセルや坐薬の形態で粘膜表面に投
与することができる。投与方法は当業者であれば容易に選択できる。それに関す
る記載は例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences(18th ed.，1990)」
において見いだすことができる。
本発明の更にもう一つの目的によれば、ヘリコバクター感染に対する受動的な
防衛機能を哺乳動物の宿主に授与する方法を提供することにある。この方法は、
免疫的に有効な量、すなわちヘリコバクター感染症に対して防御的免疫応答を引
き起こすことのできる量のウレアーゼ特異性の抗体を宿主の粘膜表面に投与する
ことを含む。なおこの抗体は、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ、好ましく
はヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼＢサブユニットを用いて免疫された宿主
より産生される。
本発明はさらに、ヒトを含む哺乳動物において、ヘリコバクター感染に対する
受動的な免疫法を含む。この免疫は、有効量のウレアーゼ特異的抗体を患者の粘
膜表面に投与することによって、好ましくは有効量のヘリコバクター・ピロリウ
レアーゼ特異的IgAモノクローナル抗体を粘膜表面に投与することによってなさ
れる。
ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼが、防御免疫の誘導と関連する抗原を表
すことがわかっているため、本発明のもう一つの目的はヘリコバクター・ピロリ
ウレアーゼを診断薬として用いることで、ウレアーゼに基づくワクチンを受け
た人の免疫応答を測定したり、ある個人について免疫性があるか感受性があるか
どうかを検出したりすることにある（ワクチン接種の必要性）。本発明はまた、
ヘリコバクター免疫性の診断やヘリコバクター感受性の評価、ワクチンに対する
免疫応答性の検出を行うためのアッセイやキットを構築することのできるウレア
ーゼやウレアーゼ特異的抗体を含んでいる。
本発明の第３番目の目的は、哺乳動物における胃十二指腸疾患を治療する方法
を提供することにある。この方法は、ヘリコバクター ウレアーゼペプチドを含
有する治療上有効な量の組成物を投与することを含む。本発明の範囲に含まれる
胃十二指腸疾患には、胃炎、胃潰瘍と十二指腸潰瘍の両方を含む消化管潰瘍、胃
癌、激しいびらん性の胃十二指腸炎を伴う慢性の消化不良、繰り返し起こる潰瘍
性消化不良、腸の異形成、低グレードのMALTリンパ腫、ヘリコバクター感染、ヘ
リコバクター・ピロリ感染、及びヘリコバクター・フェリス感染が含まれるが、
これらに限られるわけではない。「ウレアーゼペプチド」なる用語は、ウレアー
ゼの消化断片即ちウレアーゼのペプチドや、完全なウレアーゼやサブユニットな
いしその断片からなる融合タンパク質や、先端部分が切断されたウレアーゼ構築
物などと同様、天然で生成するかDNA組み替え法のいずれかによって得られるウ
レアーゼウレアーゼのサブユニットを意味するが、これらに限られるわけではな
い。また「ウレアーゼペプチド」なる用語には、タンパク質やペプチドが含まれ
る。これらのタンパク質やペプチドのエピトープの配置はペプチドヘリコバクタ
ー ウレアーゼによって位置づけられるエピトープの配置と十分な同一性を有す
る。例えばヘリコバクター ウレアーゼによって位置づけられたエピトープを認
識する抗体が、前記のタンパク質やペプチドによって位置づけられたエピトープ
を認識する。
更に特定の観点において、本発明は、ヘリコバクター感染によって引き起こさ
れる胃十二指腸疾患を治療する方法を提供する。このヘリコバクター感染はヘリ
コバクター・ピロリ感染やヘリコバクター・フェリス感染であるが、これらに限
定されるものではない。
更に特定した本発明の目的は、ヘリコバクター感染によって引き起こされる胃
十二指腸疾患を治療する方法を提供することにある。この方法ではヘリコバクタ
ー ウレアーゼペプチドからなる組成物が粘膜表面に投与される。投与に利用さ
れる粘膜表面のタイプは限定的ではなく、粘膜表面は口や鼻、直腸、目のものを
利用することができる。
本発明はまた、粘膜アジュバントと共にヘリコバクター ウレアーゼペプチド
を含有する組成物を投与することを特徴とする。粘膜アジュバントはコレラトキ
シンやプロコレラゲノイド(procholeragenoid)、コレラトキシンのＢサブユニッ
ト、例えばジゾフィランのようなカビ多糖類（なおジゾフィランに限定されるわ
けではない）、ムラミルジペプチド、ムラミルジペプチド誘導体、フォルボール
エステル、マイクロスフェア、非ヘリコバクター・ピロリ細菌の溶菌物、大腸菌
の不安定毒素、阻止ポリマー、サポニン、及びISCOMsから選択することができる
が、これらに限られるわけではない。当業者は他の粘膜アジュバンドについても
認識することができる。それらは次に例示する文献に記載されている。「Azuma,
I.,”Synthetic Immunoadjuvants: Application to Non-Specific Host Stimula
tion and Potentiation of Vaccine Immunogenicity”Vaccine，vol．10，1000(
1992); Pockley，A．G．& Montgomery，P．C.,”In vivo Adjuvant Effect of I
nterleukins 5 and 6 on Rat Tear IgA Antibody Responses”Immunology，vol
．73，19-23(1991); Adam A．& Lederer，E.,”Muramyl peptides as Immunomod
ulators”ISI ATLAS OF SCIENCE 205(1988); Clements，J.，et al.,”Adjuvant
Activity of Escherichia coli Heat-labile Enterotozin and Effect on the
Induction of Oral Tolerance in Mice to Unrelated Protein Antigens”Vacci
ne，vol．6，269(1988); Ben Ahmeida，E．T．S.，et al.,”Immunopotentiatio
n of Local and Systemic Humoral Immune Responses by ISCOMs，Liposomes an
d FCA; Role in Protection Against Influenza A in Mice”Vaccine，vol．11,
1302(1993); Gupta，R．K.，et al.,”Adjuvants--A Balance Between Toxicity
and Adjuvanticity”Vaccine，vol．11，290-308(1993)」を参照。
粘膜アジュバントはまた、遺伝子的に、化学的にウレアーゼペプチドに結合し
てもよい。このタイプの融合ペプチドの例は、当業者にとって既知のものである
。それに関しては次の文献に記載されている。「Czerkinsky et al.，”Oral Ad
ministration of a Streptococcal Antigen Coupled to Cholera Toxin B Subun
it Evokes Strong Antibody Responses in Salivary Glands and Extramucosal
Tissues”Infect．Immun.，vol．57，1072-77(1989); Nashar et al.,”Current
Progress in the Development of the B Subunits of Cholera Toxin and Esch
erichia Coli Heat-labile Enterotoxin as Carriers for the Oral Delivery o
f
Heterologous Antigens and Epitopes”Vaccine，vol．11，235-40(1993); Dert
zbaugh and Elson,”Comparative Effectiveness of the Cholera Toxin B Xubu
nit and Alkaline Phosphatase as Carriers for Oral Vaccines”Infect．Immu
n.，vol．61，48-55(1993)」参照。例えば、ウレアーゼＢサブユニットは、コレ
ラトキシンのＢサブユニットのヌクレオチド配列に結合しているure Bヌクレオ
チド配列を含むDNA発現ベクターを使用することで、コレラトキシンのＢサブユ
ニットに遺伝子的に結合するキメラタンパク質として発現させることができる。
もう一つの関連のある観点からすると、この方法ではヘリコバクター ウレア
ーゼペプチドからなる組成物を粒状物として投与している。この組成物は担体と
共に粒状物の形態で供給してもよい。この担体は水酸化されたリン酸カルシウム
、例えばハイドロキシアパタイトであるとよい。この「ハイドロキシアパタイト
」という用語が、三塩基性のリン酸カルシウム、つまり水酸化リン酸カルシウム
、またはカルシウムヒドロキサイドフォスフェートとしても知られているリン酸
カルシウムを意味することは当業者には明らかであるが、これに限定されるわけ
ではない。これは一例にすぎず、使用可能な担体のタイプをそれに限定するとい
った意味ではない。
もう一つの関連のある観点からすると、ヘリコバクター ウレアーゼペプチド
からなる組成物の投与量は、100μg〜1gの範囲内であり、例えば、体重１kgあた
り0.14mgである。当業者であれば、その最低用量を患者の体重や疾病、投与経路
、そのほかのファクターによって多くしたり少なくしたりできることがわかる。
この用量レベルは、標準的な方法によって簡単に決定することができる。服用の
回数は、疾患や形態、それに臨床試験で得られた効力データによって変わる。例
えば、１ヶ月以上の最初の免疫スケジュールでは、３回以上８回までの用量を一
度に投与することができる。このような治療計画は例示にすぎず、これに限定す
るという意味ではない。
一つの観点では、この方法ではヘリコバクター ウレアーゼペプチドからなる
組成物を、マイクロスフェア担体とともに投与している。このようなマイクロス
フェア担体は、例えばポリラクチド−コグリコライドからなる生物分解可能なマ
イクロスフェア担体を採用することができるが、必ずしもこれに限られるもので
はない。
もう一つの観点では、この方法にはヘリコバクター ウレアーゼペプチドから
なる組成物を投与する工程が含まれている。ここでの組成物は、ヘリコバクター
ウレアーゼペプチドを発現する組み換え生物ベクターからなる。当業者はそのよ
うな生物ベクターとして例えば、細菌性ベクター、ウイルス性ベクターを用いる
ことができることがわかるであろう。例えばこの生物ベクターは、ネズミチフス
菌(Salmonella typhimuriumu)、チフス菌(Salmonella typhi)、赤痢菌(Shigella
)、バシラス(Bacillus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、BCG、大腸菌(Escher
ichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、キャンピロバクター(Campylobacter
)、酵母(yeast)、ヘルペスウイルス(Herpes virus)、アデノウイルス(Adeno vir
us)、ポリオウイルス(Polio virus)、ワクシニア(Vaccinia)、及びアビポックス
(Avipox)からなるグループより選択することができるが、これらに限定されるわ
けではない。更に、ヘリコバクター ウレアーゼペプチドを発現する担体系は、
アオシタトカゲのウイルス様の粒子や、ロタウイルス様の粒子、またTy粒子など
であり、ウレアーゼペプチドを分配するのに用いることができる。一つの好まし
い観点からいうと、生物ベクターや担体システムを粘膜表面に投与することがで
きる。
本発明の好適な実施例は、ヘリコバクター・ピロリに感染しているヒトを治療
する方法からなる。この方法は、ヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼのure B
サブユニットからなる組成物を、コレラトキシンやプロコレラゲノイド(prochol
eragenoid)、コレラトキシンのBサブユニット、例えばシゾフィランのようなカ
ビ多糖、ムラミルジペプチド、ムラミルジペプチド誘導体、フォルボールエステ
ル、リポソーム、マイクロスフェア、ヘリコバクター・ピロリ以外の菌の溶菌物
、大腸菌の不安定毒素、阻止ポリマー、サポニン、およびISCOMsからなる群より
選択される粘膜アジュバントと共に、治療に有効な量を経口投与することからな
る。該組成物は、ハイドロキシアパタイトと共に粒子の形態で投与される。該組
成物はまた、咀嚼可能な1.0gのNaHCO3の錠剤の形態で投与することもできる。本
発明の目的からすると、「とともに」という用語は、融合タンパク質で見られる
ような化学的または遺伝学的に結合する結合型を含むが、これに限られるもので
はな
い。
本発明の第4番目の目的は、哺乳動物が罹患している胃十二指腸疾患を治療す
る方法を提供することである。本方法は、ヘリコバクター ウレアーゼを認識す
る抗体からなる組成物を、治療上有効な量を投与することからなる。本発明の範
囲内含まれる胃十二指腸疾患は、前述の通りである。これらの方法は、ヘリコバ
クター ウレアーゼペプチドを含む前述の組成物を用いることにより、哺乳動物
における抗体反応を引き起こすことができる。免疫された哺乳動物によって産生
された抗体は単離してから対象の哺乳動物に投与される。付与された抗原を認識
する抗体の調製は、当業者が前述したような組成物と同様に行うことができる。
例えばポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、「Harlow,E.&Lane,D.,
Antibodies:A Laboratory Manual(1988)」に記載された方法に従って調製される
。
さらに特定の観点から見ると、投与された抗体はモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体の調製は当業者に周知である。
さらに特定すると、投与された抗体はIgA抗体、すなわちポリクローナルIgA抗
体かモノクローナルIgA抗体のいずれかである。モノクローナルIgA抗体の調製は
当業者に既知であり、それに関しては以下の文献に記載されている。例えば、「
Winner,L.et al.,”New Model for Analysis of Mucosal Immunity; Intestinal
Secretion of Specific Monoclonal Immunoglobulin A from Hybridoma Tumors
Protects Against Vibrio Cholerae Infection”Infect.and Immun.，vol．59,
977-982(1991)」および「Weltzin,R.,et al.,”Binding and Transepithelial T
ransport of Immunoglobulins by Intestinal M Cells: Demonstration Using M
onoclonal IgA Antibodies Against Enteric Viral Proteins”J.Cell Biol,vol
.108,1673-1685(1989)」。
本発明の目的に用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体、および非イディオタイプの抗体の意味を含んで用いられるが、
これらに限られるわけではない。この抗体は何らかの動物から自然に誘導された
ものであってもよいし、細菌や他の非動物性の起源で合成されたものであっても
よいし、また化学的に合成されたものであってもよく、更に遺伝子的に合成され
たものであってもよい。
本発明の好ましい観点では、ヘリコバクター・ピロリに感染しているヒトを治
療する方法を提供する。この方法は、ヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼのur
e Bサブユニットを認識するIgAモノクローナル抗体を含む組成物を、治療効果の
ある量で投与する工程からなる。
本発明の第５番目の目的は、胃十二指腸の疾患を治療処置するのに有用な、ヘ
リコバクター ウレアーゼペプチドからなる組成物を提供することにある。本発
明の範囲に含まれる胃十二指腸の疾患は、本発明の範囲に含まれるヘリコバクタ
ー ウレアーゼペプチド及び粘膜アジュバントと同じであって、前記に記載した
とおりである。一つの見方をすると、この組成物はヘリコバクター ウレアーゼ
ペプチドと粘膜アジュバントとからなる。
他の観点では、この組成物は粒状物の形態になっている。この組成物は、担体
と共に通過するような粒子状の形態をとっていてもよい。この担体は例えば、前
述したようなハイドロキシアパタイトである。これは一例を挙げたにすぎず、用
いることのできる担体のタイプを限定しているわけではない。
更に特定するとこの組成物は、懸濁液に分散された粒子状の形態をとっている
。
また一つの観点では、この組成物はマイクロスフェア担体と結合するヘリコバ
クター ウレアーゼペプチドからなる。このようなマイクロスフェア担体は、例
えばポリラクチド−コグリコライド、生物分解可能なマイクロスフェアであると
よいが、これに限定されるわけではない。ウレアーゼペプチドは、生物分解性の
マイクロスフェア中に包み込まれていてもよい。ポリラクチド−コグリコライド
マイクロスフェアはゆっくりと水の存在下で加水分解し、マイクロスフェア中に
取り込まれているペプチドを放出する。
もう一つの関連する観点ではこの組成物は、ヘリコバクター ウレアーゼペプ
チドを発現する組み換え生物ベクターを含むヘリコバクター ウレアーゼペプチ
ドからなる。当業者には、そのような生物ベクターが例えば細菌性ベクターウイ
ルス性ベクターであるとよいことが分かるであろう。例えばこの生物ベクターは
、ネズミチフス菌(Salmonella typhimuriumu)、チフス菌(Salmonella typhi)、
赤痢菌(Shigella)、バシラス(Bacillus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、BCG
、
大腸菌(Escherichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、キャンピロバクター(
Campylobacter)、酵母(yeast)、ヘルペスウイルス(Herpes virus)、アデノウイ
ルス(Adeno virus)、ポリオウイルス(Polio virus)、ワクシニア(Vaccinia)、及
びアビポックス(Avipox)からなるグループより選択することができるが、これら
に限定されるわけではない。更に、ヘリコバクター ウレアーゼペプチドを発現
する担体系は、アオシタトカゲのウイルス様の粒子や、ロタウイルス様の粒子、
またTy粒子などであり、ウレアーゼペプチドを分配するのに用いることができる
。
好ましい態様において、ヒトのヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有用な組
成物が提供される。該組成物は、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼのure B
サブユニット、コレラトキシン、プロコレラゲノイド(procholeragenoid)、コレ
ラトキシンBサブユニット、カビ多糖を含み、シゾフィラン、ムラミルジペプチ
ド、ムラミルジペプチド誘導体、フォルボールエステル、リポソーム、マイクロ
スフェア、非ヘリコバクター・ピロリ溶菌物、大腸菌の不安定毒素、阻止ポリマ
ー、サポニン、及びISCOMを含み、さらに、本明細書においては懸濁液中で組成
物が粒状をしているヒドロキシアパタイト、を含む。「〜に関して」という語は
、上記の通り定義する。
第６番目の目的は、潰瘍性疾患の治療に有用な組成物を提供することである。
該組成物は、ヘリコバクター ウレアーゼを認識する抗体を含む。本発明の範囲
に含まれる潰瘍性疾患ばかりでなく本発明の範囲に含まれる抗体も上述した。
本発明の好ましい態様において、潰瘍性疾患の治療に有用な組成物が提供され
た。該組成物は、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼのure Bサブユニットを
認識するIgAモノクロナール抗体を含む。
どんな理論にも拘束されない一方で、現在の発明家は、ウレアーゼ抗原、又は
そのBサブユニットの粘膜表面への投与が一般的な粘膜の免疫系及び免疫反応を
誘導する腸粘膜の局部を刺激すると信じている。この免疫反応は、腸管分泌物中
のヘリコバクター・ピロリ特異的なIgA抗体の出現を含む。この抗体は、ヘリコ
バクター感染を阻害する。この信念のために「免疫」および「ワクチン」という
語は、本明細書においては、当業者に認識されている一般的な意味に用いられ、
ヘリコバクター感染の処置に用いる方法および組成物を示すためにも用いられる
が、
これらの意味に限定されず、そして、処置の機構はいかなる理論にも拘束されな
い。
ヒトへの使用のために動物モデルにおいて候補ワクチンのプレ臨床試験を行う
ことはおきまりのことであるので、本発明の方法論は、ヒトにおいて特に消化管
潰瘍、胃炎、胃の悪性腫瘍、及びヘリコバクター・ピロリ及び／又はH.フェリス
の存在の結果生ずる他の状態の予防及び治療に効果的であると信じられている。
マウスモデルにおける感染を効果的に撲滅する処置の投薬量及び操作に基づき
、好適な投与量の範囲は、100μg〜10gのヘリコバクターのウレアーゼペプチド
であろう。当業者は、例えば、大腸菌溶菌物（総量540mgになるまで毎日6mg服用
）及び腸管毒素大腸菌精製抗原（1mgの4服用）で行われた調査のような他の経口
ワクチンで報告された調査から試験のための適当な投与量値を認識するであろう
「Schulmann et al.,”Oral Immunotherapy of Recurrent Urinary Tract Infec
tions: A Double-Blind Placebo-controlled Multicenter Study,”J.Urol.,vol
.150,917-921(1993); Boedeker et al.,”Safety,Immunogencity and Efficacy
in Human Volunteers of Biodegradable Microspheres Containing Colonizatio
n Factor Antigen/II(CFA/II)as an Enteral Vaccine Against Enterrotoxigeni
c E.coli(ETEC)”American Gastroenterological Assoc.,vol.999,A-222(1993)
」。処置の行程になんら限定をするつもりではないが、１ヶ月間にわたる初期免
疫スケジュールに処置は3〜8服用行うことができるであろう（Boedeker,America
n Gastroenterological Assoc.,vol.888,A-222(1993)）。
好ましい免疫の方法はヘリコバクターウレアーゼペプチド組成物を液体のみの
形態で、または一時的に胃酸を中和するためにNa2HCO3、もしくは類似の物質を
含む懸濁液の形態で投与することである。中和物質はまた、ペプチド組成物が投
与される際に、別個に、例えば咀嚼可能なNa2HCO3錠剤の形で投与してもよい。
または、上記組成物を腸溶性の被覆をしたカプセルの形で投与することも出来る
。これらの方法により、ウレアーゼ組成物が上部胃腸管（消化管）を通過する間
に崩壊するという問題は恐らく回避されるであろう。これらの方法は、例えば、
LevineおよびNorlega著、「消化管感染を防御するためのワクチン(Vaccines to
Prevent Enteric Infections)」、Ballieres Clin．Gastro.，7巻、501-517(199
3)に
総説がある。
高用量のコレラトキシンはヒトに用いる粘膜アジュバントとして好適ではない
が、当業者によって認められ、上に参照されているようなその他の粘膜アジュバ
ントはヒトの治療に有用であろう。
当業者には、本明細書に開示されている発明に対し、本発明の範囲と本旨から
逸脱することなく種々の置換および修飾がなされ得ることは容易に明らかとなろ
う。
図面の簡単な説明
以下、添付の図面を参照して、本発明をさらに説明する。この中で、図１か
から８Ｂは、表１から９に示された結果のグラフ表示である。
図１は、ウレアーゼによる免疫後、防御されなかったマウスにおける血清中の
抗体(IgG)および腸分泌物中の抗体(IgA)に対する試験の表１の結果のグラフ表示
である。
図２は、ウレアーゼによる免疫後、防御されたマウスにおける血清中の抗体(I
gG)および腸分泌物中の抗体(IgA)に対する試験の表１の結果のグラフ表示である
。
図３は、ヘリコバクター・ピロリの超音波破砕物で免疫後、防御されなかった
マウスにおける血清中の抗体(IgG)および腸分泌物中の抗体(IgA)に対する試験の
表１からの結果のグラフ表示である。
図４は、ヘリコバクター・ピロリの超音波破砕物で免疫後、防御されたマウス
における血清中の抗体(IgG)および腸分泌物中の抗体(IgA)に対する試験の表１か
らの結果のグラフ表示である。
図５は、表２に示された結果のグラフ表示であり、ヘリコバクター・ピロリウ
レアーゼで得られた防御のレベルを、ヘリコバクター・ピロリの超音波破砕物お
よびコレラトキシンで得られた防御レベルと比較したものである。
図６Aおよび６Bは、表５および６に示された結果のグラフ表示であり、組換え
ウレアーゼのAおよびBサブユニットによる経口免疫後、抗原投与されたマウスに
おけるウレアーゼ活性を測定したものである。
図７は、感染後、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ Bサブユニット、コレ
ラトキシンおよびハイドロキシアパタイトのみ（模擬免疫）で処置されたマウス
、または未処置マウスにおけるヘリコバクター感染の反映として、胃組織におけ
るウレアーゼ活性を測定した表８に示された結果のグラフ表示である。
図８Aおよび８Bは、感染後、ヘリコバクター・ピロリのureBサブユニット、ま
たはコレラトキシンおよびハイドロキシアパタイトのみで（模擬免疫）処置され
たマウスにおけるヘリコバクター感染の反映として、胃組織のウレアーゼ活性を
測定した表９に示された結果のグラフ表示である。図８Aについて、マウスは、
最後の免疫から2.5週間後に屠殺され、ウレアーゼの測定がなされた。図８Bにつ
いては、最後の免疫から８週間後にマウスは屠殺され、ウレアーゼの活性測定が
行われた。
発明の詳細な説明
本発明者等は、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼのエピトープを提示して
いるポリアミノ酸調製物をマウスに経口投与すると、マウスに H．フェリスに対
する防御的な免疫応答を惹起することを発見した。これは、ヘリコバクター感染
に対する免疫応答の研究のための一般に認められた価値ある動物モデルであり(L
ee，A.et al.,”A Small Animal Model of Human Helicobacter ピロリ Active
Chronic Gastritis”Gastroenterology，vol．99，1315-1323(1990))、ヒトに
胃炎を起こす病原体として認められているものの一つである(Wegman，w．ら Sc
hweig, Med．Wochenschr.，vol．121，245-54(1991))。防御的な免疫応答の効
果とは、免疫された動物では、非免疫動物と比較して抗原投与を受けた場合、感
染率が大いに低下するということである。さらに、発明者等は、酵素的には不活
性な組換えタンパク質として生成されたヘリコバクター・ピロリのウレアーゼの
Bサブユニットを用いてマウスを経口免疫すると、H．フェリスに対する防御的免
疫応答を惹起することを発見した。この防御的免疫応答の効果とは、免疫された
動物は、抗原投与を受けた場合、感染してしまう非免疫動物と比較して、感染率
がやはり大いに低下するというものである。
本発明者等は、H．フェリスに感染したマウスに対するヘリコバクター ウレ
アーゼのペプチドの経口投与が結果として感染の解除をもたらすことを発見した
。この結果は、ヘリコバクターのウレアーゼペプチドの経口投与が、哺乳動物に
お
けるヘリコバクター感染の治療のための有効な医療法であることを示唆する。酵
素的には不活性な組換えタンパク質として生成されたヘリコバクター・ピロリの
ウレアーゼ Bサブユニットの経口投与により、感染マウスにおける H．フェリス
の感染率は、対照の感染マウスと比較して有意に低下する。
以下の諸例は、説明のためのものであって、本発明を些かも制限することを意
図しない。
A.細菌の培養およびウレアーゼの精製
本研究に用いられたヘリコバクター・ピロリの株は、十二指腸潰瘍を持つ一患
者に起源し、BHIアガロースプレート上で均一になるまで経代培養されて来た。
ヘリコバクター・ピロリは、適当な培地、典型的には、0.25％の酵母エキスおよ
び10％の仔ウシ胎児血清を含み、0.4％の酵母エキスと10％の仔ウシ胎児血清を
補充し、さらに、0.4％のCampylobacterの選択的補体(Skirrow 補体、oxoid 69)
で増強したBHI(Brain-Heart Infusion)培地で培養される。細菌は、微好気的な
条件下、37℃で密封した瓶中でインキュベートし、37℃で２から３日間、液状培
養を生じるまで振とうする。培養はまた、0.25％の酵母エキスおよび5％ヒツジ
血液を含むBHIからなるアガロースプレート上で、37℃で３日間、微好気的な条
件下で調製してもよい。細菌の量は、660 nmにおけるBHI溶液の光学濃度によっ
て決定され、１光学濃度単位は108個の細菌に相当する。アガロースプレート上
の培養物は、先ず、154 mM NaClに再懸濁される。
ウレアーゼのエピトープを表示するポリアミノ酸の現在好適な供給源は、精製
されたウレアーゼ、例えば、「Dunn et al.,J．Biol．Chem．265，9464-9469」
の一般的方法に従い、以下のように変更して得られるヘリコバクター・ピロリの
ウレアーゼである。培養後、ヘリコバクター・ピロリを水中に採集、遠心、回転
撹拌し、再度遠心して上澄を作る。ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ活性を
含む溶液（急速ウレアーゼ試験で測定、以下参照）をCL-6Bサイズ分離カラム上
でクロマトグラフィーにかけ、強いウレアーゼ活性を示す画分を集め、一晩透析
し、再びアニオン交換ゲル上でクロマトグラフィーを行う。画分は、緩衝液中の
NaCl濃度を漸増して溶出し、強いウレアーゼ活性を持つ集められた画分は、個々
にSDSゲルこかけ、次いでクーマシーで染色する。分子量およそ63および28 kDa
に相当
する２本の明瞭なバンドがウレアーゼと同定された。ウレアーゼを含む画分を集
め、95％から99％の範囲の純度を持つ精製されたヘリコバクター・ピロリのウレ
アーゼが得られた。
B.ヘリコバクター・ピロリから精製されたウレアーゼによる経口免疫
抗原物質として上述の様にして得られた精製されたヘリコバクター・ピロリの
ウレアーゼを用いることが望ましいが、抗原物質として、自然界に存在するまた
は組換えDNA技術によって得られたいかなるウレアーゼまたはウレアーゼのサブ
ユニット、それらの消化断片、その断片またはウレアーゼ全体を含む融合タンパ
ク質、切断されたウレアーゼ構成物、または、ヘリコバクター感染に対して防御
的免疫応答を惹起する能力を持ち、ウレアーゼのエピトープを示す他のペプチド
またはタンパク質調製物を用いることも可能であることは理解されるであろう（
以下参照）。この様にして、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼに関して実質
的相同性を持ち、ヘリコバクターに対して交差防御的免疫応答を惹起する効果を
持つウレアーゼを用いることが可能である。このようなウレアーゼの一例は、タ
チナタマメのウレアーゼであり、これは、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ
と約70％の相同性を持つ。タチナタマメのウレアーゼはかってヘリコバクターに
よる感染を防御するための効果的な抗原と考えられたが、これはもはやそうでは
ないと考えられている(Chen，M.et al．”Failure of Immunization Against He
licobacter Using Jack Bean Uriase,”Acta Gastroenterol．Belg.，Vol．56,9
4(1993)参照)。従って、本発明は完全なウレアーゼの使用に限定されるものでは
なく、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼに対し十分に相同性のあるウレアー
ゼのエピトープを表示し、宿主においてヘリコバクター感染に対して防御的な免
疫学的応答を発生するいかなるポリアミノ酸調製物をも使用することを含む。適
当なウレアーゼは、ヘリコバクター感染に対し防御的免疫応答を引き出すために
、H．ピロリのウレアーゼに対して十分な相同性を持たねばならない。典型的に
は、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼに関して70％より大きな相同性、例え
ば、80〜90％の相同性を持つウレアーゼは、本発明にウレアーゼ抗原として使用
されてもよい。
有用な可能性があるウレアーゼ標品の起源の無制限リストには、別種のヘリコ
バクターの内在性ウレアーゼ酵素、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella p
neumoniae）またはプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）のような他の
細菌からのウレアーゼ、そしておそらく、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ
と交差反応性のエピトープを共有するという条件で、いかなる他のウレアーゼも
包含される。上述のすべての生物のウレアーゼ遺伝子は、全タンパク質、または
その一部として、組換えウレアーゼ産物を発現するための有力な可能性のある手
段である。
潜在的に有用なウレアーゼ製品の無制限リストには、精製ウレアーゼ（起源は
上述）から物理的、および／または化学的開裂生成手段（即ち、BrCN）、および
／またはタンパク分解酵素による開裂（例えば、V8プロテアーゼ、トリプシン、
またはその他のプロテアーゼ）を用いて生成されたペプチド、または、化学的に
合成され、且つ、ウレアーゼと交差反応性のあるエピトープを保持しているペプ
チドが含まれる。
潜在的に有用なエピトープの他の供給源には、抗ウレアーゼ抗体によるスクリ
ーニングの結果として、ウレアーゼとの交差反応性によって同定されたエピトー
プが含まれる。これらのペプチドは、自然発生のペプチド、または化学合成の結
果のペプチドのこともある。さらに、このようなペプチドは、組換えランダムオ
リゴヌクレオチドの発現に起因することもある。
潜在的に有用なエピトープのもう一つの起源には、ウレアーゼに対する抗イデ
ィオタイプ抗体生成の結果としてのウレアーゼに類似のエピトープが含まれる。
いかなる免疫担当宿主にも生成されるこのような抗イディオタイプ抗体は、ウレ
アーゼと構造的相同性を共有する抗ウレアーゼ抗体に対する抗体を生成する目的
で、この宿主を抗ウレアーゼ抗体で免疫することによって得られる。
本明細書の論議は、ヘリコバクター・ピロリによって自然に生成されるウレア
ーゼの使用に焦点を合わせている（B章）。しかしながら、所望の防御的免疫応
答を引き出す能力のある上記のウレアーゼ、またはそのサブユニットまたは構成
物は、業界ではよく知られている組換えDNA技術によって生成され得ることは認
められるであろう。特定の試料の効力は、動物モデル、候補ワクチンの経口投与
、下記の操作に実質的に類似、または同一の手順を用いての抗原投与を用いる通
常の
投与によって決定され得る。
他の方法を用いてヘリコバクターのウレアーゼのペプチドを投与してもよいこ
とは当業者に認識されるであろう。例えば、ウレアーゼのペプチドはマイクロス
フェア担体製剤の一部分として投与されてもよい。使用されるマイクロスフェア
担体のタイプに制限はないが、一例はウレアーゼのペプチドをポリラクチド−共
グリコライドの生分解性マイクロスフェア担体製剤の一部分として投与すること
である。
ヘリコバクターウレアーゼペプチドを投与するもう一つの方法としては、例え
ば細菌ベクターまたはウイルスベクターといった生物ベクターに組み換え体の形
態でウレアーゼペプチドを発現できる。このような生物ベクターを構築するため
には、ウレアーゼペプチドをコードするヌクレオチドの配列が生物ベクターの遺
伝物質に組み込まれる。このような生物ベクターは、ヘリコバクターの感染を予
防するため、またすでにヘリコバクターに感染した個体を治療するために投与さ
れる。当業者は、適当な生物ベクターの例としてネズミチフス菌（Salmonella t
yphimurium）、チフス菌（Salmonella typhi）、赤痢菌（Shigella）、バシラス
（Bacillus）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、BCG、大腸菌（Escherichia
coli）、コレラ菌（Vibrio Cholerae）、キャンピロバクター（Campylobacter）
、酵母（Yeast）、ヘルペスウイルス（Herpes virus）、アデノウイルス（Adeno
virus）、ポリオウイルス（Poliovirus）、ワクシニア（Vaccinia）、およびア
ビポックス（Avipox）が含まれることを理解するであろう。さらにブルータング
ウイルス様の粒子、ロタウイルス様の粒子、またはTy粒子といったヘリコバクタ
ーウレアーゼペプチドを発現する組み換え担体系は、ウレアーゼペプチドを運搬
するのに用いられる。前述の記載は何ら制約を意味するものではない。生物ベク
ター又は担体系は、生物ベクターによって発現された組み換えウレアーゼペプチ
ドを粘膜表面に投与するような粘膜投与が好ましい。
以下の表1および2、ならびに図1〜5は、精製したヘリコバクター・ピロリウレ
アーゼをマウスに経口免疫した際に得られた結果を示している。この最初の実験
において、A章で記述したように精製し、M細胞の結合と取り込みを強化する担体
として使用されるハイドロキシアパタイトの結晶に結合させたヘリコバクター・
ピロリウレアーゼをマウスに経口投与することによって、ヘリコバクター・ピロ
リ抗原の投与が行われた。コレラトキシン（シグマ社）を、粘膜アジュバントと
して使用した。この実験では雌の6週齢SPF BALB/cマウスの群に対して、1mgのハ
イドロキシアパタイト及び10μgのコレラトキシンアジュバントに結合させた精
製ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ30μgを0、7、14、21日目にそれぞれ経口
免疫した。その後、マウスに28及び30日目に108のH.フェリスを2度、投与した。
比較のため、0、7、14、21日目に同様の雌の6週齢SPF BALB/cマウスに、ヘリコ
バクター・ピロリの全溶菌液（超音波破砕物）と10μgのコレラトキシンを経口
免疫した。これらのマウスに28、30日目にH.フェリスを投与した。ヘリコバクタ
ー・ピロリのソンケート物は、細胞培養液からヘリコバクター・ピロリを集菌し
、遠心でペレットにし、ペレットを0.9％の塩化ナトリウム溶液に再懸濁し、続
いて超音波破砕することにより調製した。
対照として、雌の6週齢SPF BALB/cマウスに対して0、7、14、21日目に10μgの
コレラトキシンと1mgのハイドロキシアパタイトを経口的に模擬免疫した。その
後、このマウスに28、30日目にH.フェリスを投与した。全てのマウスは並行して
飼い、免疫した。実験に用いた全てのマウスは35日目に屠殺した。C.ヘリコバクター・ピロリの組み換えウレアーゼサブユニットでの経口免疫
ヘリコバクター・ピロリウレアーゼの構造A及びBサブユニットをコードする遺
伝子は、既に開示されている配列に基づき、標準的な手順に従ってポリメラーゼ
連鎖反応(PCR)により得られた(Clayton,C.L.et al．”Nucleotide Sequence of
two Genes from Helicobacter pylori Encoding for Urease Subunits”Nucleic
Acid Res.,vol.18,362(1990))。これらの遺伝子は、大腸菌において外来遺伝子
を高度に発現し、精製が容易になるよう設計されたベクター(pEV40と命名)に挿
入した。簡単に述べれば、外来遺伝子は温度抑制性プロモーターの下流に、6つ
のヒスチジンを繰り返しコードする配列枠内に挿入する。AmpR遺伝子は形質転換
体の選別のためにこのベクターに存在する。適切な温度条件下で、得られた組み
換えタンパク質に、ニッケルカラムでの一段階アフィニティー精製用にN末端に6
つのヒスチジンを付加する。ヘリコバクター・ピロリ組み換えウレアーゼサブユ
ニットA及びB両方を、大腸菌でそれぞれ発現させ、ニッケルカラムで95％以上の
純度で
精製した。
上記のようにして得られた組み換えヘリコバクター・ピロリウレアーゼを抗原
物質として使用することは好ましいが、ウレアーゼの抗原部位を発現する組み換
え技術（例えば融合タンパク質）によって得られるヘリコバクターの感染に対し
て感染防御の免疫応答を誘発でき、いかなるウレアーゼ、またはウレアーゼサブ
ユニットも、抗原物質として用いられうることが理解されるべきである。したが
って、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼに関して実質的に相同性があり、ヘリ
コバクターに対する交差防御免疫応答を高めるのに有効なウレアーゼ遺伝子の構
築に使用できる。このようなウレアーゼの例には、ヘリコバクター・ピロリウレ
アーゼと約70％の相同性があるタチナタマメウレアーゼや、ヘリコバクター・ピ
ロリウレアーゼと約88％の相同性があるH.フェリスウレアーゼがある。従って、
本発明はヘリコバクター・ピロリウレアーゼ遺伝子及びその遺伝子産物の用途を
制限するものではなく、ヘリコバクター感染に対する宿主の感染防御免疫応答を
生じる抗原として十分に互角であるいかなる、組み換えウレアーゼも、またはそ
れらのサブユニットの使用も含まれる。本発明はその範囲内において、感染した
哺乳動物においてヘリコバクター感染レベルを減ずるのに有効な消化断片もしく
はそのペプチド、全ウレアーゼを含む融合タンパク質、サブユニットもしくはそ
の断片、またはウレアーゼの部分的構築物のみならず、天然の、または組み換え
DNA技術によって得られたいかなるウレアーゼ、またはウレアーゼサブユニット
の使用も含まれる。典型的には70〜95％の相同性を有する組み換えウレアーゼ、
例えばヘリコバクター・ピロリウレアーゼに関して80〜90％の相同性があるもの
は、本発明において組み換えウレアーゼ抗原として使用できる。
本明細書においては、大腸菌によって産生される組み換えヘリコバクター・ピ
ロリウレアーゼA及びBサブユニットの使用の問題に重点を置いている（C章）。
しかし、上述のような、所望の防御免疫応答を誘発できる組み換えウレアーゼも
しくはそれらのサブユニット、またはそれらの構築物は、当分野において周知の
その他の組み換えDNA技術、およびその他の真核性または原核性発現ベクターを
用いて産生できることが理解されよう。
以下の表3、4及び5ならびに図6に、大腸菌で産生された組み換えヘリコバクタ
ー・ピロリウレアーゼサブユニットでマウスに経口免疫した際に得られた結果を
示す。この実験では、上述のように大腸菌で産生させ、精製し、M細胞の結合と
取り込みを強化する担体として使用されるハイドロキシアパタイト結晶に結合さ
せた、組み換えヘリコバクター・ピロリウレアーゼのサブユニットAまたはBをマ
ウスに経口免疫することによって、ヘリコバクター・ピロリ抗原の投与が行われ
た。コレラトキシン（シグマ社）は、粘膜アジュバントとして使用した。この実
験では雌の6週齢SPF BALB/cマウスの群に対して、1mgのハイドロキシアパタイト
及び10μgのコレラトキシンアジュバンドに結合させた、組み換えヘリコバクタ
ー・ピロリウレアーゼAサブユニット30μgを0、8、14、21日目にそれぞれ経口免
疫した。その後、マウスに、32、34、36日目に108のH.フェリスを投与した。比
較のため、0、8、14、21日目に同様の雌の6週齢SPF BALB/cマウスに、水酸化リ
ン酸カルシウム及び10μgのコレラトキシンに結合させた、組み換えヘリコバク
ター・ピロリウレアーゼBサブユニット30μgを経口免疫した。このマウスに、32
、34、36日目にH.フェリスを投与した。
対照として、0、8、14、21日目に10μgのコレラトキシンと1mgのリン酸カルシ
ウムを、雌の6週齢SPF BALB/cマウスにそれぞれ疑似経口免疫した。その後、こ
のマウスに、32、34、36日目にH.フェリスを投与した。研究に用いた全てのマウ
スは並行して免疫し、抗原投与した。実験動物は48日目（免疫投与の12日後）抗
原投与の10週間後に屠殺した。D.胃生検、血液、腸分泌物の分析
生検は胃から採り、血液は心臓から採取した。ELISA解析用に腸の分泌物を得
るため、腸を切除し、1mMのPMSF（ベーリンガー社）を含むPBS緩衝液で洗浄した
。
H.フェリスのコロニー形成に対する感染防御を測定するため、商品説明書に従
い、ヤトロックスHPテスト（ロームファーマ社）によって急速なウレアーゼ活性
を測定することにより、各動物の胃生検をH.フェリスの存在下でスクリーニング
した。すなわち胃生検を、尿素とpH指示薬のフェノールレッドを混合した市販の
溶液0.5mlに浸した。尿素とフェノールレッドを混合した市販用ではない溶液も
当業者によって理解されよう。そのような溶液は25℃、最終pHは6.9で、例えば
バクト酵母抽出物(0.1g)、リン酸一カリウム(0.091g)、リン酸二ナトリウム(0.0
95g)
、尿素(20g)、バクトフェノールレッド(0.01g)を含有する。ウレアーゼ活性は尿
素からアンモニアと二酸化炭素を生じ、550nmでより高い吸光度へと溶液が比色
変化する。ウレアーゼ活性は分光光度分析により定量した。ウレアーゼ活性を測
定する他の方法は当業者によって理解され、例えば、「Mobley,H.L.T.&Hausinge
r,R.P.,”Microbial Ureases: Significance,Regulation,and Molecular Charac
terization”Microb.Reviews,Vol.53,85-108(1989)」に見られる。
B章に記述した実験で使われた各動物の胃生検は、H.フェリス検出のために上
述した市販のBHIアガロースプレートでも培養した。微好気性の状態で3-10日間
培養した後、H.フェリスの存在はグラム染色とウレアーゼ活性の検出で確認した
。胃生検のH.フェリスの検出で、第１組の実験でウレアーゼ試験とH.フェリス培
養物との間にかなりの有意性がある関係が得られ（表3参照）、胃生検ウレアー
ゼ試験のみがC章で述べた実験でH.フェリスの検出が行われた。H.フェリスの検
出は、異なる2つの染色法（アクリジンオレンジとクレシルバイオレット）を用
いて、2人の研究者達が別々に顕微鏡観察によって確認した。
血液試料は室温で3時間凝固させ、血清を集め、次の分析まで-20℃で凍結した
。腸の分泌物はデブリスを除去するため、4℃で5分間遠心し、-20℃で凍結保存
した。各実験動物の血清及び腸サンプルは、抗ヘリコバクター活性を測定するた
め、標準的な手順に従ってELISAにより解析した。すなわち96穴プレートをヘリ
コバクター・ピロリの超音波破砕物でコートし、5％の無脂肪乳で飽和した。試
料は1:1から1:1000まで段階的に希釈し、ELISAプレート上に4℃で一晩インキュ
ベートした。ビオチン化した抗マウスIgG（血清）と抗マウスIgAは西洋ワサビペ
ルオキシダーゼで標識し、抗体のレベル決定に使用した。精製したヘリコバクタ
ー・ピロリウレアーゼで免疫するH.フェリスの投与の結果は、表1〜3及び図1〜4
に示し、組み換えヘリコバクター・ピロリウレアーゼサブユニットA及びBで免疫
するH.フェリスの投与の結果は、表4〜6及び図5、6に示す。
B章で述べた実験に対する表1で、「h」は時間、「Ig」は免疫グロブリン、「N
D」は非検出を意味し、「ウレアーゼ＋HF」はマウスをウレアーゼ（水酸化リン
酸カルシウムとコレラトキシンで結合した）で免疫し、H.フェリスを投与したと
いう意味であり、「ウレアーゼ」はマウスをウレアーゼ（水酸化リン酸カルシウ
ムとコレラトキシンで結合した）で免疫したが抗原投与は実施していないことを
表し、「CT+HF」はマウスをコレラトキシンで模擬免疫し、H.フェリスを投与し
たという意味で、「HP超音波破砕液＋HF」はマウスをヘリコバクター・ピロリ超
音波破砕液とコレラトキシンで免疫し、H.フェリスを投与したことを表し、「HP
超音波破砕液」はマウスをヘリコバクター・ピロリ超音波破砕液とコレラトキシ
ンで免疫したが抗原投与は実施していないことを示す。表1では抗体の効力に対
する数が、1000倍希釈した595nmにおける吸光度の測定値を示す。抗体の不在下
で測定したバックグランド値を差し引いた。
胃生検ウレアーゼ試験とH.フェリス培養物のグラム染色に基づいて得られたB
章に記述の実験結果は、表2に示す。感染したマウスは、ウレアーゼや培養物の
グラム染色といったH.フェリスのコロニー形成に対する1つ以上のマーカーを有
すると定義した。
表1及び2記載の結果から、ヘリコバクター・ピロリ超音波破砕液またはコレラ
トキシンを用いた場合に比べてヘリコバクター・ピロリウレアーゼを用いた経口
免疫の場合、H.フェリスの投与に対して統計学的にも有意性のある感染防御が起
きることが分かる。表2から、ヘリコバクター・ピロリ超音波破砕液で免疫した
動物のうち6匹が感染し、コレラトキシンで免疫した動物のうち9匹が感染したの
に対し、合計10匹の免疫した動物のうち3匹のみが感染したことが分かる。表2は
、
ヘリコバクター・ピロリ超音波破砕液で免疫した動物のうち33％のみが、コレラ
トキシンで免疫しH.フェリスを投与した動物のうち10％のみしか感染防御できた
なかったのに対し、70％の動物がH.フェリスの投与からの感染を防御したことを
示している。換言すると、H.フェリスにさらした90％の対照動物が病原体に感染
したが、H.フェリスにさらす28日前にヘリコバクター・ピロリウレアーゼで免疫
したマウスでは感染率はわずか30％であった。
これは感染率の有意な低下を表している（対照マウスと比較して、フィッシャ
ー確率試験においてP=0.0198）。ヘリコバクター・ピロリ超音波破砕液で経口免
疫したマウスでは、感染率は67％であった（対照と比較して有意性は見られない
）。ヘリコバクター・ピロリウレアーゼを用いて得られた感染防御は意外なもの
であり、ヘリコバクター・ピロリ超音波破砕液を用いて観察された結果からは予
期できなかった。
図1から4を見ていくと、図1はウレアーゼで免疫後に感染防御されていないマ
ウスでの血清(IgG)及び腸分泌物(IgA)中の抗体を調べた結果をグラフで示してい
る。これらのマウス1、4、6番は表1に記載し、A群を構成している。図2はウレア
ーゼで免疫後感染防御したマウス、すなわち2、3、5、7〜10番（B群）の抗体反
応を示す。
図3および4は、31〜39番のマウスから得られた結果に関する。図3（C群）は、
ヘリコバクターピロリ超音波破砕物（31、32、33、35、36、および38番のマウス
）で免疫後、防御されていないマウスの抗体反応を示し、図4（D群）は、ヘリコ
バクターピロリ超音波破砕物（34、37、および39番のマウス）で免疫後、防御さ
れたマウスの抗体反応を示している。図3および4に関して、IgA抗体反応（IgGで
はない）が、防御されていないマウスと比較して、防御を示すマウスにおいて高
かったことは興味深い。このことは、防御とIgAとの相関を示唆している。血清I
gG反応では、相関が見られなかった。血清IgGではなく、粘膜IgAは、胃の細菌感
染に対する防御において役割を果たしていることが知られている（McGhee,J.R.a
nd Kyono,H."New Perspectives in Vaccine Depelopment:Mucosal Immunity to
Infections"Infect Agent Dis.,vol.2,55-73(1993))。
ウレアーゼ試験による胃の生検試料中のH.フェリスの検出と、培養によるもの
との相関の結果を、表3に示した。
表3は、胃の生検試料について行ったウレアーゼ試験の結果と、培養によるH.
フェリスの同定との間に、極めて有意な相関が存在することを示している。ウレ
アーゼ活性陽性であった、表3に示した動物は全て、組織病理学的にH.フェリス
陽性であった。培養は、ウレアーゼ試験よりH.フェリス感染を検出する頻度が低
いため、よりよい感受性を得るため、以下の実験においては、マウスにおけるH.
フェリス感染の診断のためウレアーゼ試験を行った。本方法により、各マウスの
胃のより大きい断片でのウレアーゼ試験を二重に行うことができ、さらにウレア
ーゼ試験の感受性を高めることができた。さらに、最も感受性の高い方法を用い
ることにより、被験ワクチン調製物により得られた防御の過大評価を避けること
ができる。陽性の培養を感染の標準として用いた場合、B章に示した実験におい
て、ウレアーゼによる免疫の後に誘導された防御は、ウレアーゼ試験と培養を組
み合わせて用いた場合と同程度に有意であった（p=0.021対p=0.019）。
胃の生検試料のウレアーゼ試験に基づき得られた、C章（組換えウレアーゼサ
ブユニット）に記載した実験の結果を、表4、5、および6に示し、図6に図示した
。
表4において、「CT」はコレラトキシン、「ureA」は組換えヘリコバクターピ
ロリウレアーゼAサブユニット、「ureB」は組換えヘリコバクターピロリウレア
ーゼBサブユニット、「HAP」はハイドロキシアパタイト結晶を意味する。マウス
20から54は抗原投与から12日後に屠殺し、マウス68から82は抗原投与から10週間
（106日）後に屠殺した。各動物の胃の生検試料で行ったウレアーゼ試験の結果
は、550nmにおけるO.D.値で表す。アッセイ溶液のみのO.D.値(0.075 O.D.)を、
バックグラウンド値として、各マウスで得られたO.D.値から差し引いた。陽性お
よび陰性の記号は、H.フェリスの検出のためのウレアーゼ試験が陽性であるか陰
性であるかによる、各動物の最終的な感染状態を示す。陽性：OD550値＞0.2。こ
の値、Jatrox溶液に対する色の変化は、裸眼で観察することができるため、0.2
という値を陽性感染を定義するために選択した。
表4、5、および6に示した結果から分かるように、組み換えヘリコバクター・
ピロリウレアーゼBサブユニットを用いて行った経口免疫の方が、組み換えヘリ
コバクター・ピロリウレアーゼAサブユニット、またはコレラトキシンを用いた
免疫と比較して、H.フェリスの投与に対して統計学的に有意の防御が獲得された
。表4か
らは、抗原投与後12日目ではウレアーゼBサブユニット群では、免疫した動物全1
0匹中3匹しか感染がみられなかったのに対し、ヘリコバクター・ピロリウレアー
ゼAサブユニットで免疫した動物およびコレラトキシンで免疫した動物では10匹
すべてが感染したことが分かるであろう。表4は、（ヘリコバクター・ピロリウ
レアーゼBサブユニットで免疫した）動物の70％が、H.フェリスによる感染を防
御されたのに対して、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼAサブユニットで免疫
した動物では0％、コレラトキシンで免疫した動物では0％であり、感染しやすい
ことを示している。言い換えると、H.フェリスを投与した対照のマウスでは100
％が感染したのと対照的に、組み換えヘリコバクター・ピロリウレアーゼBサブ
ユニットで免疫したマウスでは感染した割合は30％でしかなかった。このことは
対照のマウスと比較して、感染がかなり抑えられた（p=0.0031、フィッシャー確
率試験）ことを示している。ヘリコバクター・ピロリウレアーゼで観察された防
御が、ウレアーゼのBサブユニットを用いた免疫では完全に与えられたが、Aサブ
ユニットではこのような効果がみられなかったという事実は、精製ウレアーゼを
用いた本発明者らの実験に基づくと、予想外のことであった。防御免疫反応の発
達におけるウレアーゼの２つの構造サブユニットの役割のこの明確化は、それ故
に新規である。酵素的に不活性な組み換えウレアーゼサブユニットを用いて獲得
した防御もまた、ウレアーゼの非毒性形態がヘリコバクター感染に対する経口ワ
クチンとして使用しうることを教えている。さらに、不活性ウレアーゼBサブユ
ニットは、天然ウレアーゼの触媒部位を認識し阻害する抗体を誘導するようには
とても思えないので、この結果は活性部位の認識が防御に不必要であることを強
く提示している。表6で言及しているように、感染後10週目にマウス20匹を屠殺
すると、ウレアーゼBサブユニット免疫した動物の60％（10匹のうち6匹のマウス
）およびヘリコバクター・ピロリウレアーゼAサブユニットで免疫した動物の80
％（5匹のうち4匹のマウス）は、H.フェリス感染に対して防御されていた。ウレ
アーゼBサブユニットでの免疫を通じて獲得した防御が時間外に続き、そしてウ
レアーゼAの免疫がウレアーゼBサブユニットにより誘導されたのと比較して遅れ
た防御を誘導するという事実は、精製ウレアーゼを用いた我々の実験からも、又
初期に行った他の実験からも予期することはできなかった。ウレアーゼAサブユ
ニットの免疫が最終的な
防御を与えるという事実は、活性部位の認識が防御に必要ないという事を証明し
ている。
図6に、組み換えウレアーゼAおよびBサブユニットでの経口免疫後に得られた
結果をまとめた（表5および6に説明した）。
マウスの2つ目のセットは、免疫し、C節で説明したプロトコールに従い、抗原
投与後10週目に、ヘリコバクター・フェリス感染の解析を行った。この実験にお
いて、12匹のマウスはコレラトキシンのみで模擬免疫し、12匹のマウスは組み換
えure Aサブユニットで免疫し、そして10匹のマウスは組み換えure Bサブユニッ
トで免疫した。ure Bで免疫し、感染していないマウスの胃試料（非感染マウス
対照）に見られた平均ウレアーゼ活性値は、0.045であり、この量は、得られた
それぞれのO.D.価からのバックグラウンドとして差し引いた。O.D.価が非感染マ
ウス対照から得られた標準偏差値の2倍よりも大きくなったとき、マウスは感染
したと考えられる。標準偏差は、0.022である。この実験から得られたデータは
、表7に示した。
この別の分析方法を用いて、表4に示したデータを、表7のデータと共に再分析
した。ウレアーゼアッセイ溶液のみを用いて得られたバックグラウンドO.D.値（
0.075 O.D.）を差し引く代わりに、未感染マウス対照から得られた平均ウレアー
ゼ値をバックグラウンドレベルとして用いた。
12日目に屠殺された未感染マウスから得られた平均ウレアーゼレベルは、0.08
9であった。20〜54番のマウスは、O.D.値が未感染マウス対照で得られた値の標
準偏差の2倍より大きい場合に、感染したとみなした。標準偏差は、0.008であっ
た。10週間後に屠殺したマウスのO.D.値から差し引いたバックグラウンドレベル
は0.045であり、マウスは、O.D.値が0.044より大きい場合に感染したと見なした
。
抗原投与の12日後に、この別の分析方法を用いると、模擬免疫、またはureAサ
ブユニットでの免疫後には、効果は見られなかった。しかし、ureBサブユニット
で免疫した動物の70％では、低レベル（0.22より小さいO.D.値）の感染しか観察
されなかった（P＜0.02、マン・ウィットニーU試験(Mann Whitney U-test)、模
擬免疫の対照と比較）。抗原投与から10週間後にマウスを屠殺すると、ureAサブ
ユニットで免疫したマウスの59％（10/17）で、H.フェリス感染が防御された（p
=0.0019、両側フィッシャー確率試験、模擬免疫したマウスと比較）。さらに、u
reBサブユニットで免疫したマウスの80％（16/20）で、H.フェリス感染が防御さ
れた（p=0.00002、両側フィッシャー確率試験、対照マウス、模擬免疫マウスと
比較）。この別の分析法において、ureAサブユニットもまた、防御免疫を誘導し
た。いずれの分析法においても、得られた結果から、組換えヘリコバクター・ピ
ロリウレアーゼサブユニットが、ヘリコバクター感染に対して防御免疫を誘導す
ることが示された。実施例
本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに説明される。実施例は
、本発明を限定するためのものではない。
a)細菌株
H.フェリスは、J.Fox（比較薬課、マサチューセッツ技術研究所、ボストン、U
SA）より供与された。ヘリコバクター・ピロリは、潰瘍病の患者（CHUV、ローザ
ンヌ、スイス）から単離した。
b)細菌培養
液体培養
細菌は、0.25％の酵母抽出物（Difco）、0.4％のキャンピロバクター（Campyl
obacter）選択補充物（Oxoid）で補った10％の胎児ウシ血清（Inotech）を含むB
HI（Brain-Heart Infusion、 BioMerieux）液体培地上で培養した。細菌は、微
好気的条件下、３７℃で培養し、37℃で2〜3日振とうした。
凍結培養
細菌は、液体培地で培養し、それからウレアーゼ活性を測定し、グラム染色に
より形態を評価し、顕微鏡で運動性を評価した。細菌は、それから、遠心し、20
％グリセロールを加えたBHI中に30 O.D./mlの濃度で再懸濁し、-80℃で凍結した
。使用直前に、凍結ストックは、氷上で溶かし、20mlのBHI中で洗浄し、遠心し
、5mlのNaHCO3中で1〜1.5 O.D./200μlの濃度で再懸濁した。
アガロースプレートでの培養
細菌は、0.25％の酵母抽出物および5％の羊血液を伴うBHIからなる寒天プレー
ト上で、微好気的条件下、37℃で3日間培養した。
定量
細菌の量は、660nmにおけるBHI溶液の光学密度により決定した（１光学密度単
位（O.D.）は、108個の細菌に相当する）。可視的な細菌の数は、コロニー形成
単位の数で測定した。
c)超音波破砕物の準備
ヘリコバクター・ピロリは、0.15MのNaCl中で、31の血液寒天プレートから収
集し、4℃で1400gで5分間遠心した。沈殿を3mlのNaCl中で再懸濁し、4分間、超
音波破砕した。タンパク質の量は、ブラッドフォード解析（BioRad Kit、製造業
者による）により評価した。d)免疫原のハイドロキシアパタイトへの結合
免疫原（ウレアーゼまたはそのサブユニット）は、ハイドロキシアパタイトと
共に、4℃で1時間インキュベートした。マウス当たり30μgの免疫原に対して1.0
mgのハイドロキシアパタイトを用いた。培養の最後に、10μgのコレラトキシン
を終量が200μlとなるようPBSに加えた。
e)ヘリコバクター・フェリスの投与
マウスは、ヘリコバクター・フェリスの胃内への投与前に、軽く麻酔した。総
容量200μlのH.フェリスを、皮下注射器に付加したシリコンチューブを用いて各
々のマウスの胃へ輸送した。実施例1
a)抽出
30の血液寒天プレートから、ヘリコバクター・ピロリを、氷上の0.15MのNaCl
の中へ回収した。その溶液を、4℃1400gで5分間遠心した。沈殿を、20mlのH2O中
に再懸濁し、45秒間ボルテックスした（最大速度で）。それから、抽出物を4℃6
700gで20分間遠心した。上清を回収し、タンパク質量を評価し（上記の「定量」
を参照）、70％の硫安で沈殿させた。
b)ウレアーゼの精製
溶液を、液相としてPBS（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて、セファロースCL-
6Bカラム（ファルマシア（Pharmacia））によるクロマトグラフィーにかけた。
強いウレアーゼ活性を示した22の収集画分をプールし、３リットルのPEB（20mM
リン酸緩衝、pH7）に対して4℃で一晩透析し、PEBを液相として、Qセファロー
スファーストフロウ（ファルマシア）によるクロマトグラフィーにかけた。画分
は、0から500mMのNaCl勾配により溶出した。強いウレアーゼ活性を示した10の収
集画分を、個別にSDSゲルにかけ、クーマシー染色した。分子量63および28kDaに
相当する2つの区別できるバンドを示す6画分をプールし、精製ウレアーゼとした
。実施例2（B章も参照）
免疫実験に用いたマウスを、胃内免疫前に軽くエーテル麻酔した。それから、
超音波破砕調製物または精製ウレアーゼ、ハイドロキシアパタイト、およびコレ
ラトキシンを、PBS中に懸濁し、皮下注射器に付加したポリエチレンチューブを
用いて、200μlを各々のマウスの胃へ輸送した。この過程を、経口免疫と呼ぶ。
3つの経口免疫プロトコールが評価された。これらを以下に記載する。プロトコールB1−精製ウレアーセでのワクチン接種
雌の6週齢BALB/cマウス（20）を、0、7、14、および21日目に、30μgの精製ヘ
リコバクター・ピロリウレアーゼ、1mgのハイドロキシアパタイト、および10μ
gのコレラトキシンで経口免疫した。10匹のマウスに、28および30日目に5x107お
よび5x108の液体培養のH.フェリスを投与した。プロトコールB2−ヘリコバクター超音波破砕物でのワクチン接種
雌の6週齢BALB/cマウス（20）を、0、7、14および21日目に、2mgのヘリコバク
ター・ピロリ超音波破砕溶液で経口免疫した。10匹のマウスに、28および30日目
に5x107および5x108の液体培養のH.フェリスを投与した。プロトコールB3−対照
雌の6週齢BALB/cマウスを、0、7、14および21日目に、1mgのハイドロキシアパ
タイト、および10μgのコレラトキシンで経口免疫した。10匹のマウスに、28お
よび30日目に5x107および5x108のH.フェリスを投与した。
35日目に全てのマウスを屠殺し、胃からの生検試料、ならびに腸分泌物および
血液も採取した。防御および評価
防御を評価するために、生検試料を、製造業者の指示によって、Jatrox HP試
験（ローム・ファーマ（Rohm Pharma））によりウレアーゼ活性について試験し
た。ウレアーゼは、550nmで分光測定により定量した。生検試料も、H.フェリス
の存在下で培養し、H.フェリスの存在を、グラム染色により決定した。胃腔の生
検試料を、ホモジナイズし、0.15M NaClで希釈（1:10および1:1000）し、血液寒
天プレート上に撒き、微好気的条件下、37℃で4から10日間培養した。ELISA
腸分泌物および血液を、抗体価の評価のため、ELISAにより解析した。ELISAは
、次のように行った。ポリスチレンプレート（96ウェル）を、37℃で2時間、精
製ウレアーゼでコートした。非特異的結合部位は、37℃で30分、0.1％ ツイーン
（Tween）を含むPBS中の粉乳でブロックした。プレートを、0.1％ ツイーン（Tw
een）を含むPBSで1回洗浄した。血液試料は1:1000希釈で試験をし、腸分泌物は1
:1希釈で試験した。それそれの試料100μlを抗原でコートしたプレートに添加し
た。2時間の培養後、プレートを、0.1％ ツイーン（Tween）を含むPBSで3回洗浄
した。ヤギ由来の抗マウスビオチン化完全抗体およびビオチン化抗マウスIgA、I
gG、およびIgM（アマシャム（Amersham））を1:500希釈（IgAは、1:250倍希釈）
で
加え（100μl）、37℃で1時間インキュベートした。プレートを、0.1％ツイーン
（Tween）を含むPBSで3回洗浄し、0.1％ ツイーン（Tween）を含むPBS中に1:100
0に希釈したストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼ100μlを添加し、3
7℃で30分間培養した。プレートを3回洗浄し、1μl/mlの30％H2O2を含むpH5.0の
クエン酸緩衝液中に1:50希釈のo-フェニルジアミン50μlを添加し、室温で20分
間培養した。495nmの吸光度をそれそれのウェルで測定した。実施例3（C章も参照）
免疫実験に用いたマウスを、胃内免疫前に軽くエーテル麻酔した。それから、
、ハイドロキシアパタイトに結合し、コレラトキシンを補った、30μgの大腸菌
で産生された組み換えヘリコバクター・ピロリウレアーゼAまたはBサブユニット
をPBSに懸濁し、200μlを皮下注射器に付加したポリエチレンチューブを用いて
各々のマウスの胃へ輸送した。この過程を、経口免疫と呼ぶ。
3つの経口免疫プロトコールを評価した。これらを以下に記載する。プロトコールC1-組み換えウレアーゼAサブユニットでのワクチン接種
雌の6週齢BALB/cマウス（10）を、0、8、14および21日目に、30μgの精製組み
換えヘリコバクター・ピロリウレアーゼAサブユニット、1mgのハイドロキシアパ
タイト、および10μgのコレラトキシンで経口免疫した。10匹のマウスに、32、3
4および36日目に液体培養の108のH.フェリスを投与した。プロトコールC2-組み換えウレアーゼBサブユニットでのワクチン接種
雌の6週齢BALB/cマウス（10）を、0、8、14および21日目に、30μgの精製組み
換えヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼBサブユニット、1mgハイドロキシアパ
タイト、および10μgのコレラトキシンで経口免疫した。10匹のマウスに、32、3
4および36日目に液体培養の108のH.フェリスを投与した。プロトコールC3-対照
雌の6週齢BALB/cマウスを、0、8、14および21日目に、1mgのハイドロキシアパ
タイト、および10μgのコレラトキシンで経口免疫した。10匹のマウスに、32、3
4および36日目に液体培養の108のH.フェリスを投与した。
42日目または106日目にマウスを屠殺し、多数の胃の生検試料を採取した。防御および評価
防御を評価するために、胃の体および腔の生検試料を、製造業者の指示によっ
て、Jatrox HP試験（Rohm Pharma）によりウレアーゼ活性についてスクリーニン
グした。ウレアーゼは、550nmで分光測定により定量した。体および腔のOD値の
総量は、それぞれのマウスの最終OD値を得るために加えられた。実施例4
ウレアーゼペプチドによる免疫が、ヘリコバクター感染動物の効果的な処理と
なるかどうか決定するために、マウスにまずH.フェリスを投与し、次いでヘリコ
バクター・ピロリ ureBサブユニットで免疫した。ヘリコバクター感染処理のた
めのヘリコバクター・ピロリ ureBサブユニットによる免疫の利用は、実施例4お
よび実施例5で行われた。
a)H.フェリスによるマウスの感染
雌の6〜8週齢BALB/cマウスに、１および３日目に1 O.D.の凍結培養液のH.フェ
リスを投与した。5日目に、マウスに、1.53 O.D.の液体H.フェリス培養液を投与
した。
b)組み換えウレアーゼBサブユニットでのワクチン接種
H.フェリス感染した8のマウスを23、30、37および44日目に、30μgのヘリコバ
クター・ピロリウレアーゼBサブユニット、1mgハイドロキシアパタイト、および
10μgのコレラトキシン（Calbiochemから得たホロ酵素）で経口免疫した。
c)対照
H.フェリス感染した10のマウスを23、30、37および44日目に、1mgハイドロキ
シアパタイト、および10μgのコレラトキシンで経口免疫した。これらのマウス
は、模擬免疫用に設定した。H.フェリス感染した7匹のマウスは、免疫用に用い
なかった。
d)屠殺および評価
70日目にすべてのマウスを屠殺した。胃を除去し、長軸方向に半分に切断した
。防御を評価するために、それそれのマウスの胃の半分（内体および空洞の断片
）は、製造業者の指示によって、Jatrox HP試験（Rohm Pharma）により、屠殺後
3〜4時間後にウレアーゼ活性を検査した。ウレアーゼは、550nmで分光光度測定
により定量化した。10匹の実験されていない（未処理の）BALB/Cマウスを対照と
し
て用いた。これらのマウスは、70日目に屠殺し、胃試料は、ウレアーゼ活性のバ
ックグラウンド値を決定するためのウレアーゼ活性のために評価した。平均バッ
クグラウンド価である0.033 O.D.を、それぞれのマウスのO.D.価から差し引いた
。未実験マウスでのウレアーゼ活性における標準偏差は、0.025 O.D.であった。
ウレアーゼ解析の結果は、表8に示し、図7に図示した。図7において、破線は、
未実験のマウスでのウレアーゼ活性における標準偏差の2倍のO.D.価を示す。
表8において、「ureB」は、上述のように、組換えヘリコバクター・ピロリウ
レアーゼBサブユニットを意味し、「CT」はコレラトキシン、「HAP」はハイドロ
キシアパタイト結晶、「未処理」は、マウスがH.フェリスの投与は受けたが、そ
の後の免疫を受けていないことを意味する。各動物の胃の生検試料で行ったウレ
アーゼ試験の結果は、550nmにおけるO.D.値で表す。各マウスについてO.D.値か
ら差し引いたバックグラウンド値は、0.033であった。感染は、550nmにおけるO.
D.値が、未処理の対照マウスで見られる標準偏差（0.05 O.D.）の二倍を越える
場合に陽性であると見なす（「＋」で表す）。「＋/−」は、O.D.値がバックグ
ランド値よりは大きいが、0.08より小さく、模擬免疫の対照と比較して減少して
いることを示す。
表7および図7に示した結果から分かるように、H.フェリスに感染したマウスに
ヘリコバクター・ピロリureBサブユニットを投与することにより、8匹のマウス
のうち1匹で感染のクリアランスが起こった。0.2より大きい値を陽性の結果と定
義する、別の、より保守的な判定によりこの結果を見れば、ureBで処理した8匹
のマウスのうち4匹（2、4、6、および8番）で感染の防御が見られた。しかし、
陽性結果についての二つの定義のいずれを用いても、これらのマウスは未処理の
マウス、および模擬感染のマウスと比較して低い活性を示した。感染の定義に0.
05という値を用いると、ureBで免疫したマウスの感染のレベルは、模擬免疫した
マウスと比較して、統計学的に有意に（0.04より小さいp値で）低かった。した
がって、実施例4の結果は、H.フェリスに感染したマウスにureBを投与すること
により、感染のレベルが低下することを示している。実施例5
a)マウスのH.フェリス感染
1日目に、5から8週齢の雌BALB/cマウスに、1 O.D.の培養液のH.フェリスを投
与した。3日目に、マウスに、アガロースプレートで培養した0.8O.D.のH.フェリ
スを投与した。5日後に、マウスに、アガロースプレートで培養した1O.D.のH.フ
ェリスを投与した。
b)組換えヘリコバクター・ピロリウレアーゼBサブユニットでのワクチン接種
23、30、37、および44日目に、H.フェリス感染マウスを、30μgの組換えヘリ
コ
バクター・ピロリウレアーゼBサブユニット、1mgのハイドロキシアパタイト、お
よび10μgのコレラトキシン（カルバイオケム（Calbiochem）から入手したホロ
酵素）で経口免疫した。これらのマウスを「免疫した」という。
c)対照
23、30、37、および44日目に、H.フェリス感染マウスを、1mgのハイドロキシ
アパタイト、および10μgのコレラトキシンで経口免疫した。これらのマウスを
「模擬」免疫したという。
d)屠殺および評価
62日目に、10匹の免疫したマウス、および6匹の模擬免疫したマウスを屠殺し
た。最後の免疫から8週間後に、10匹の免疫したマウス、および8匹の模擬免疫し
たマウスを屠殺した。胃の試料を、実施例4に記載したように、ウレアーゼ活性
についてスクリーニングした。様々な時間に屠殺した29匹の未処理BALB/cマウス
で見られた平均バックグラウンド値は、0.04 O.D.であった。この活性レベルを
バックグラウンド値として用い、各マウスのO.D.値から差し引いた。未処理のマ
ウスのウレアーゼ活性の標準偏差は、0.02 O.D.であった。ウレアーゼアッセイ
の結果を、表9に示し、図8に図示する。図8において、破線は未処理マウスのウ
レアーゼ活性の標準偏差の二倍に当たるO.D.値を示す。
e)血液試料および糞試料の分析
血液試料の採集
血液試料を室温で3時間凝集させ、血清を収集して、さらに分析するまで-20℃
に凍結した。
糞粒の採集
新鮮な糞粒（3〜8個）を、500μlのPBS＋5％無脂肪乾燥乳＋プロテアーゼ阻害
剤（AEBSF 0.2mM、アプロチニン（Aprotinin）1μg/ml、ロイペプチン（Leupept
in）10μM）、ベスタチン（Bestatin）3.25μM）を含む、1.5mlのエッペンドル
フチューブに集めた。試料は、使用時まで-20℃に凍結させておいた。それらを
氷上で解凍し、攪拌して、4℃10,000gで10分間遠心分離して、固形物を含まず、
黄土色に見える上清を得た。ELISA
各動物の血清および糞粒の試料を、標準的な方法に従い、抗ウレアーゼ活性を
評価するため、ELISAで分析した。
糞粒および血液を、抗体力価を評価するために、ELISAで分析した。ポリスチ
レンプレート（96穴）を、0.5μg／ウエルの精製した組換えウレアーゼで、37℃
で2時間コートした。非特異的な結合は、0.1％ツイーン（Tween）を含むPBS中の
5％粉乳で、37℃で30分間ブロックした。プレートを、0.1％ツイーン（Tween）
を含むPBSで1回洗浄した。血液試料は1:200、糞粒は1:1の希釈度で試験した。各
試料を100μl、抗原をコートしたプレートに加えた。2時間インキュベートした
後、プレートを、0.1％ツイーンを含むPBSで3回洗浄した。ヤギの抗マウスビオ
チン化完全抗体（アマシャム（Amersham））および、西洋ワサビペルオキシダー
ゼと結合した抗マウスIgA（セロテック（Serotec））を1:500の希釈度で加え、3
7℃で1時間インキュベートした。プレートを、0.1％ツイーンを含むPBSで3回洗
浄し、血液試料にのみ、0.1％ツイーンを含むPBS中の1:500の希釈度のストレプ
トアビジンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼを100μl加え、37℃で30分間イン
キュベートした。プレートを3回洗浄し、1μl/mlの30％H2O2を含むクエン酸緩衝
液（pH5.0）で1:50に希釈したo-フェニルジアミンを50μl加え、室温で20分間イ
ンキュベートした。各ウエルの495nmにおける吸光度を測定した。
糞粒中の全IgAを評価するため、プレートを1μg/mlのヤギ抗マウスIgA（シグ
マ（SIGMA））でコートし、糞の上清を1:200の希釈度で試験した以外は、上記と
同様にELISAを行った。
表9および10において、「ureB」は、上述のように、組換えヘリコバクター・
ピロリウレアーゼBサブユニットを意味し、「CT」はコレラトキシン、「HAP」は
ハイドロキシアパタイト結晶を意味する。「屠殺」は、44日目の最後の免疫から
屠殺までの日数を意味する。「N.D.」は、データが得られなかったことを示す。
各動物の胃の生検試料で行ったウレアーゼ試験の結果は、550nmにおけるO.D.値
で表す。感染は、550nmにおけるO.D.値が、成熟マウスで見られる標準偏差（0.0
4 O.D.）の二倍を越える場合に陽性であると見なす（「＋」で表す）。各マウス
についてO.D.値から差し引いたバックグラウンド値は、0.04 O.D.であった。表1
0において、「除去（％）」は、ウレアーゼアッセイにより測定した感染の除去
をさす。
表9および10、図8に示した結果から分かるように、H.フェリスに感染したマウ
スにヘリコバクター・ピロリureBサブユニットを投与することにより、マウスを
最後の免疫から2.5週間後に屠殺した場合に、アッセイした10匹のマウスのうち8
匹で感染のクリアランスが起こった。最後の免疫の8週間後にマウスを屠殺した
ときにアッセイを行った場合には、9匹のマウスのうち6匹で感染が除去された。
この判定の方法において、表8の説明で言及したように0.2のより高い値を選択す
れば、ureBサブユニットでの処理により、2.5週間後に屠殺した10匹のマウスの
うち9匹で感染のクリアランスが起こった。
表10は、組換えヘリコバクター・ピロリウレアーゼBサブユニットを用いた経
口免疫で、コレラトキシンおよびハイドロキシアパタイトのみによる模擬免疫と
比較して、統計学的に有意にH.フェリス感染が治療のために処理されることを示
し
ている。表10で、最後の免疫から2.5週間後に測定したとき、感染マウスの80％
で感染が除去されたことが示されている。最後の免疫から8週間後に測定した場
合には、感染マウスの67％で感染が除去された。最後の免疫から2.5週間後に測
定した場合にも、8週間後に測定した場合にも、模擬免疫を受けたマウスでは、
全く感染が除去されなかった。最後の免疫から2.5週間後に測定した場合と比較
して、8週間後に測定した場合に、感染が除去されたマウスのパーセント数が減
少するということの有意性は現在のところ明らかでない。
表11において、実施例4または5で使用した、ureBで処理したマウスについて、
血中および糞中の抗体含量を評価した。使用したマウス番号は、表8および9で使
用した番号と対応している。「ND＊」とは、18〜21番のマウスの胃のうちの一つ
を紛失してしまったために、データが得られなかったことを示す。本発明者らは
、18〜21番のマウスの一連のデータのうちのどれが不完全であるかを決定するこ
とができない。したがって「ND」は、21番のマウスを特別にさすものではない。
実施例4のマウス、および実施例5の1〜10番のマウスのアッセイにおいては、
分析に十分な試料を得ることが困難であった。
ヘリコバクター・ピロリureBサブユニットの経口投与によるH.フェリス感染の
除去は、予想外のものであり、したがって新規である。本明細書に開示された結
果はまた、ureBサブユニットがヘリコバクター感染の治療にも用いられうるとい
うことを示している。
当業者は、本発明が、対象を実施し、上述の目的および利点、ならびに本質的
な目的および利点を得るために適用されうるということを、容易に理解するであ
ろう。ウレアーゼペプチド、粘膜アジュバント、担体、および抗体は、方法、過
程、処理、およびアッセイと共に、例を示すためのものであり、本発明の範囲を
限定するものではない。請求の範囲により定義される本発明の範囲に含まれる、
それらの変更、およびその他の使用は、当業者にとって明らかであろう。
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
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Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ
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ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ
Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ
，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，
ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 コーテシー−セウラッツ イレーン
スイス国 シーエイチ−1011 ローザンヌ
ビーエイチ10−シーエイチユーブイ デ
ィヴィジョン デ ガストロ−エンテロロ
ジー
(72)発明者 ブラム アンドレ
スイス国 シーエイチ−1011 ローザンヌ
ビーエイチ10−シーエイチユーブイ デ
ィヴィジョン デ ガストロ−エンテロロ
ジー
(72)発明者 ダヴィン キャスリーン
スイス国 シーエイチ−1011 ローザンヌ
ビーエイチ10−シーエイチユーブイ デ
ィヴィジョン デ ガストロ−エンテロロ
ジー
(72)発明者 ハーズ レイナー
ドイツ国 ディー−タビンゲン スペマン
ストラッセ 34 マックス プランク イ
ンスティテュト フォー バイオロジー
アテイラング インファクティオンスバイ
オロジー
(72)発明者 クラヘンバル ジーン−ピエレ
スイス国 シーエイチ−1066 エパリンゲ
ス インスティテュト デ バイオキミ
デ ラユニバーサイト デ ローザンヌ
エト アイエスアールイーシー
(72)発明者 サラガ エミリア
スイス国 シーエイチ−1011 ローザンヌ
リュー デュ バグノン 25 インステ
ィテュト ユニバーシタイア デ パソロ
ジー