PL180281B1

PL180281B1 - Antymikrobiologiczna farmaceutyczna lub kosmetyczna kompozycjaoraz sposób wytwarzania nienasyconych kwasów dikarboksylowych PL PL

Info

Publication number: PL180281B1
Application number: PL93308222A
Authority: PL
Inventors: Nigel Malcolm Lindner; John Casey
Original assignee: Unichema Chemie Bv
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-27
Publication date: 2001-01-31
Also published as: SK281584B6; AU4828993A; HUT70587A; ES2114616T3; ZA937148B; JP3533218B2; DE69317433T2; AU688274B2; MY110734A; ATE163913T1; JPH08502054A; GB9220667D0; DE69317433T3; DE69317433D1; ES2114616T5; SK40595A3; EP0662946B1; KR100221504B1; KR100270595B1; HU9500913D0

Abstract

1. Antymikrobiologiczna farmaceutyczna lub kosmetyczna kompozycja, zwlaszcza przeciw Propionibac- terium acnes i Staphylococcus aureus, równiez do rozjasniania skóry, zawierajaca skladnik aktywny i dermatolo- gicznie dopuszczalny kosmetyczny nosnik, znamienna tym, ze jako skladnik aktywny zawiera od 0,001% do 20% wagowych nienasyconego alifatycznego kwasu dikarboksylowego o 8 do 22 atomach wegla i/lub alkoholo- wej, amidowej lub estrowej pochodnej nienasyconego alifatycznego kwasu dikarboksylowego zawierajacej od 15 do 22 atomów wegla w glównym lancuchu weglowodorowym.. 6. Sposób wytwarzania nienasyconych kwasów dikarboksylowych o 8 do 22 atomach wegla, znamienny tym, ze nienasycony(-e) C1 0 - 2 4 monokarboksylowy(-e) kwas(-y) lub jego(ich) pochodna(-e) w postaci kwasu hydroksykarboksylow ego(-ych), albo C 1 6 - 2 2 nienasycony kw as(-y) tluszczow y(-e), jego(ich) estr(-y), zwlaszcza triglicerydy ewentualnie w postaci olejów, albo C 1 0 -2 4 alken(-y), nienasycony(-e) akanol(-e) o lancuchu dluzszym niz pozadany produkt poddaje sie ograniczonemu beta-utlenianiu, z uzyciem drozdzy roz- mnazajacych sie w pozywce wzrostowej, korzystnie szczepu Candida cloacae 5GLA12, stosujac pH w zakresie 7,1- 7,6, a z brzeczki fermentacyjnej wydziela sie produkt przez zakwaszanie i ekstrakcje eterem dietylowym. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest antymikrobiologiczna farmaceutyczna lub kosmetyczna kompozycja i sposób wytwarzania nienasyconych kwasów dikarboksylowych.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być stosowane na skórę w celach kosmetycznych, takich jak usuwanie trądzika i do rozjaśniania skóry.

Znane jest stosowanie nasyconych kwasów dikarboksylowych (o wzorze ogólnym COOH(CH2)_nCOOH) na skórę w celach medycznych i kosmetycznych. Na przykład patent

180 281

Stanów Zjednoczonych US 4386104 (Nazzaro-Porro) ujawnia nasycone kwasy dikarboksylowe, zawieraj ące 7 do 13 atomów węgla stosowane do leczenia trądzika i innych schorzeń skórnych.

Szczególnie o nasyconym kwasie dikarboksylowym C₉ (kwas azelainowy) o wzorze COOH(CH2)₇COOH często wspomina się jako o skutecznym w leczeniu trądzika i innych schorzeniach skóry jak i w rozjaśnianiu skóry.

Przedmiotem wynalazku jest antymikrobiologiczna farmaceutyczna lub kosmetyczna kompozycja, zwłaszcza przeciw Propionibacterium acnes i Staphylococcus aureus, również do rozjaśniania skóry, zawierająca składnik aktywny i dermatologicznie dopuszczalny kosmetyczny nośnik, charakteryzująca się tym, że jako składnik aktywny zawiera od 0,001% do 20% wagowych nienasyconego alifatycznego kwasu dikarboksylowego o 8 do 22 atomach węgla i/lub alkoholowej, amidowej lub estrowej pochodnej nienasyconego alifatycznego kwasu dikarboksylowego zawierającej od 15 do 22 atomów węgla w głównym łańcuchu węglowodorowym.

Korzystnie kompozycja zawierajeden lub więcej niżjeden nienasycony kwas dikarboksylowy C₁₆ i/lub jego wyżej określonąpochodną, albo jeden lub więcej niżjeden nienasycony kwas dikarboksylowy C₁₈ i/lub jego wyżej określoną pochodną.

Szczególnie korzystną pochodną kwasu dikarboksylowego jest amid lub ester niższego alkilu.

Kompozycja według wynalazku szczególnie korzystnie zawiera 0,01% do 1%o wagowego składnika aktywnego.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nienasyconych kwasów dikarboksylowych o 8 do 22 atomach węgla, charakteryzujący się tym, że nienasycony C₁₀.24 monokarboksylowy(-e) kwas(-y) lub jego(ich) pochodną(-e) w postaci kwasu hydroksykarboksylowego(-ych), albo C^.22 nienasycony kwas(-y) tłuszczowy(-e) jego(ich) ester(-y), zwłaszcza triglicerydy ewentualnie w postaci olejów, alken(-y), nienasycony(-e) alkanol(-e) o łańcuchu dłuższym niż pożądany produkt poddaje się ograniczonemu beta-utlenianiu, z użyciem drożdży rozmnażających się w pożywce wzrostowej, korzystnie szczepu Candida cloacae 5GLA12, stosując pH w zakresie 7,1-7,6; a z brzeczki fermentacyjnej wydziela się produkt przez zakwaszanie i ekstrakcje eterem dietylowym.

W korzystnym sposobie według wynalazku jako substrat stosuje się nienasycony związek C16-22·

Szczególnie korzystnie jako substrat stosuje się kwas oleinowy, kwas linolowy, kwas linolenowy lub kwas arachidowy.

Innym korzystnym substratemjest substrat zawierający trigliceryd nienasyconego kwasu.

W szczególnie korzystnych wykonaniach wynalazku stosuje się substrat zawierający olej z oliwek, olej słonecznikowy lub olej rycynowy.

W sposobie według wynalazku stosuje się drożdże rosnące w warunkach bez ograniczenia azotu.

Jak dotąd nienasycone kwasy dikarboksylowe nie były łatwo dostępne w handlu, chociaż sposób syntezy pewnych nienasyconych kwasów dikarboksylowych ujawniono w Europejskim Patencie EP-0229252. W rzeczywistości część tej klasy związków nie była wcześniej opisana, jakkolwiek wiadomo, że pewne nienasycone kwasy dikarboksylowe, zwłaszcza pewne C6, C₈, C₁₀ i C₁₂ mono-nienasycone mogą być wykryte w moczu pacjentów z umiarkowanym niedoborem łańcucha koenzymu A dehydrogenazy (Jin and Tserng (1989) Journal of Lipid Research 31, 763-771). Pewne inne nienasycone kwasy dikarboksylowe są ujawnione w różnych innych publikacjach.

Europejski Patent EP-0341796 ujawnia mikrobiologiczny sposób wytwarzania nasyconych kwasów dikarboksylowych z nasyconych kwasów tłuszczowych (kwasów monokarboksylowych) o dłuższym łańcuchu lub z triglicerydów z użyciem beta-utleniających mutantów Candidia Cloacae. Obecnie twórcy niniejszego wynalazku, stosując mutanty ujawnione w Europejskim Patencie EP-0341796 wytworzyli pewne nienasycone kwasy dikarboksylowe, z których część jest nowych, a które jak stwierdzono mająnieoczekiwanie lepsze właściwości do stosowania na skórę w celach medycznych i kosmetycznych.

180 281

Sposobem według wynalazku wytwarza się polinienasycone kwasy dikarboksylowe (to znaczy kwasy dikarboksylowe zawierające 2 lub więcej podwójnych wiązań węgiel/węgiel), mające pomiędzy 8 a 22 atomów węgla (włącznie). Są to związki nowe wyłączając grupę związków składającą się z: kwasu 2,5-oktadienodikarboksylowego, kwasu 1,7-oktadienodikarboksylowego; kwasu 2,4,6-oktatriendikarboksylowego; kwasu 1,3,5,7-nonatetraenodikarboksylowego; kwasu 2,5,8-dekatrienodikarboksylowego; kwasu 3,6-dodekadienodikarboksylowego; i kwasu 3,13-heksadekadienodikarboksylowego. Związki wyliczone wyżej jako wyłączone są znane z różnych publikacji ze stanu techniki (na przykład Grundman, 1937 Ber. 70B, 1148-1153).

Wszystkie nowe związki mogąbyć zsyntetyzowane nowąmetodą, przedstawiona w szczegółach poniżej. Jest korzystne, aby związek był kwasem dikarboksylowym o parzystej liczbie określającej długość łańcucha węglowodorowego. Szczególnie korzystne są związki C₁₆.

Innąkorzystna właściwościązwiązkówjest to, aby podwójne wiązania węgiel/węgiel były oddzielone dwoma pojedynczymi wiązaniami węgiel/węgiel (to znaczy podwójne wiązania mogą być korzystnie usytuowane przy atomach węgla 3 i 6 lub 2 i 5 itd.), jako że takie związki najłatwiej wytwarza się nowym sposobem według wynalazku.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że nowe nienasycone kwasy dikarboksylowe, a w zasadzie ogólnie nienasycone kwasy dikarboksylowe (zwłaszcza nienasycone kwasy dikarboksylowe C16 i C₁₈) mają znacznie większą aktywność niż odpowiadające im nasycone dikarboksylowe jako środki antymikrobiologiczne i środki kosmetyczne.

Ze stanu techniki wynika, że do przypadków nadających się do traktowania kwasami dikarboksylowymi należą: trądzik (Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4386104); zmarszczki (Patent Europejski EP-336880); czerniak złośliwy (Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4818768); dermatozy (Patent Europejski EP-229654); dermatozy z przebarwieniem i egzema (Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4292326) trądzik różowaty (Patent Europejski EP-890308); piegi (Patent Japoński JP-91024412), łojotok (Patent Niemiecki DE-3133425) i liszajec.

Podobnie ze stanu techniki wynika, że pewne pochodne kwasów dikarboksylowych są również skuteczne w leczeniu pewnych schorzeń. Do takich związków należą estry i sole (Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4818768) i merkaptopochodne kwasów dikarboksylowych (Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4292326). Inne publikacje literaturowe dotyczące użyteczności pochodnych kwasów dikarboksylowych to na przykład Japoński Patent JP-58170713, Europejski Patent EP-0297436 i Europejski Patent EP-0305407. Niemieckie zgłoszenie patentowe nr DE-4033567 ujawnia między innymi, pochodne monoestrowe kwasów dikarboksylowych C₃-C₁₄ (główny łańcuch węglowodorowy) (które mogą być nasycone lub nienasycone) jako środki przeciw łojotokowe do stosowania w kosmetyce lub w farmacji do nakładania miejscowego na włosy i skórę.

Sposób działania na ludzką skórę w celach medycznych lub kosmetycznych związkami wytwarzanymi sposobem według wynalazku polega na stosowaniu nienasyconych kwasów dikarboksylowych i/lub pochodnych nienasyconych kwasów dikarboksylowych, które to pochodne zawierają 15 lub więcej atomów węgla w głównym łańcuchu węglowodorowym.

Określenie „główny łańcuch węglowodorowy” użyte w odniesieniu do pochodnych kwasów dikarboksylowych jest pomyślany jako określające część cząsteczki usytuowaną pomiędzy atomami tlenku dwóch karboksylowych grup kwasowych (lub ich przekształconych w pochodne reszt). Stąd, na przykład pochodne mające wzór R-OOC-CH^COO-R¹ i R-OOC-CłL-CTh-COO-R¹byłyby opisane jako mające odpowiednio łańcuchy węglowodorowe C₃ i C₄. Pochodnymi mogą być na przykład alkohole, podstawione lub niepodstawione amidy, mono- lub diestry (arylowe lub alkilowe, zwłaszcza niższe estry alkilowe).

Nienasycone kwasy dikarboksylowe stosowane w części wynalazku odnoszącej się do sposobu, korzystnie zawierają8 do 22 atomów węgla, z najkorzystniej 16 lub 18 atomów węgla. Pochodna nienasyconego kwasu dikarboksylowego korzystnie zawiera 16 do 18 atomów węgla w głównym łańcuchu węglowodorowym.

180 281

Stwierdzono, że pewne nienasycone kwasy dikarboksylowe są szczególnie aktywne przeciw Propionibacterium acnes (P. acnes) i Staphylococcus auresu (Staph. aureus), stąd na ogół można również uznać związki wytworzone sposobem według wynalazku jako przydatne do leczenia wszelkich przypadków, gdzie wiadomo, lub podejrzewa się, że P. acnes i/lub Staph. aureus stanowią przyczynę powstawania, trwania lub zaostrzenia schorzenia.

Nienasycone kwasy dikarboksylowe mogąbyć stosowane do leczenia wielu schorzeń skóry, takich jak trądzik itp., omówionych wyżej w stanie techniki. Podobnie pomyślane sąodniesienia do pochodnych takich jak estry i sole omówione w stanie techniki.

Do innych przypadków, jakie mogą być podatne na poprawę stanu przy stosowaniu nienasyconych kwasów dikarboksylowych lub ich pochodnych należą łupież oraz występowanie nadmiernego zapachu ciała. Ponadto twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że nienasycone kwasy dikarboksylowe nieoczekiwanie okazały się skuteczne jako inhibitory tyrozynazy i jako inhibitory syntezy melaniny w hodowanych komórkach w testach służących do oceny aktywności związków jako środków rozjaśniających skórę.

Sposób rozjaśniania skóry za pomocą związków wytworzonych sposobem według wynalazku polega na stosowaniu niensacyconych kwasów dikarboksylowych lub ich pochodnych w postaci farmaceutycznych lub kosmetycznych kompozycji, które zawierają jeden lub więcej nienasycony kwas dikarboksylowy i/lub pochodną nienasyconego kwasu dikarboksylowego, która to pochodna zawiera 15 lub więcej atomów węgla w głównym łańcuchu węglowodorowym. Zazwyczaj takie kompozycje formuje się w postać do miejscowego stosowania na skórę. Nienasycone kwasy dikarboksylowe i ich pochodne łatwo włącza się do takich kompozycji, które na przykład mogą przybierać postać kremów, płynów lub żeli. Odpowiednie preparaty są dobrze znane specjalistom z tej dziedziny i sąujawnione, na przykład w Patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki US-4818768.

Sposób wytwarzania antybakteryjnych lub rozjaśniających skórę kompozycji do stosowania miejscowego na skórę polega na zmieszaniu skutecznej ilości nienasyconego kwasu dikarboksylowego lub jego pochodnej z dermatologicznie dopuszczalnym kosmetycznym lub farmaceutycznym nośnikiem.

Możliwe jest stosowanie nienasyconego kwasu dikarboksylowego i/lub pochodnej nienasyconego kwasu dikarboksylowego, która to pochodna zawiera 15 lub więcej atomów węgla w głównym łańcuchu węglowodorowym, jako aktywnej substancji terapeutycznej. Możliwe jest stosowanie nienasyconego kwasu dikarboksylowego lub jego pochodnej jako środka rozjaśniającego skórę i/lub środka antymikrobiologicznego. Kwasy dikarboksylowe stosowane w takich kompozycjach mogą być wytwarzane niżej opisaną nową metodą. Alternatywnie mogą być one wytwarzane znanymi metodami, na przykład ujawnionymi w Patencie Europejskim EP-029506 albo według Uemura i in. (1988, Proceedings ofWorld Conference on Biotechnology for the Fats and Oil Industry, American Oil Chemists Society), według Buhler i Schindlera (1984 w „Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology, Rehm and Reed (Eds.) 169, Verlag Chemie, Weiheim) lub według Picataggio i in. (1992, Biotechnology 10, 894-898). Pewne nienasycone kwasy dikarboksylowe mogą być dogodnie wytwarzane z nienasyconych materiałów wyjściowych o dłuższym łańcuchu z użyciem mutantów ujawnionych w Europejskim Patencie EP-0341796, które uprzednio były stosowane do wytwarzania związków nasyconych. Dalszym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzania nienasyconych kwasów dikarboksylowych przez ograniczone beta-utlenianie (skrócenie łańcucha) nienasyconych materiałów wyjściowych o dłuższym łańcuchu z użyciem drożdży rozmnażających się w pożywce wzrostowej.

Korzystnie wytwarzane są niensasyone kwasy dikarboksylowe C₈-C₂₂, a najkorzystniej C₁₆ lub Cu. Odpowiednie do tego celu drożdże ujawnione są w Europejskim Patencie EP-0341796 i przez Casey i in., /(1990) Journal of General Microbiology, 136, 1197-1202.

Szczepy takie (na przykład Candida cloacae 5GLA12, w skrócie oznaczane „LA 12”) wykazują ograni czoną lub zmniejszoną aktywność beta-utleniania.

180 281

Drożdże dogodnie wprowadza się do nienasyconych kwasów tłuszczowych występujących w postaci estrów, korzystnie w postaci estrów triglicerydowych takich jak olej. Do szczególnie odpowiednich przykładów należąnienasycone oleje takie jak olej słonecznikowy i olej z oliwek.

Korzystnie oleje użyte jako materiały wyjściowe są triglicerydami, w których dominującym nienasyconym kwasem tłuszczowym o długim łańcuchu jest związek C₁₆-C2₂ albo bardziej korzystnie C₂₀ lub C₁₈. Korzystnie materiał wyjściowy jest głównie polinienasycony. Fermentacja takich materiałów wyjściowych przez szczepy takie jak LA12 może spowodować wytwarzanie mieszanin nienasyconych kwasów dikarboksylowych o skróconych łańcuchach (przeważnie związków C₈-C1₈). Taka mieszanina produktów może być rozdzielona na frakcj ę, na przykład przez różnicową ekstrakcję rozpuszczalnikową.

Jeśli założyć, że podczas beta-utleniania występuje losowe usuwanie jednostek C2 i, że nie zachodzi izomeryzacja produktów, to przy użyciu kwasu oleinowego jako substratu, można przewidzieć tworzenie się następujących produktów: kwas cis-7-heksadecenodikarboksylowy; kwas cis-5-tetradecenodikarboksylowy; kwas cis-7-tetradecenodikarboksylowy; kwas cis-3-dodecenodikarboksylowy; kwas cis-5-dodecenodikarboksylowy; kwas cis-3-decenodikarboksylowy; kwas cis-5-decenodikarboksylowy i kwas cis-3-oktenodikarboksylowy.

Natomiast z kwasu linolowego można oczekiwać następujących produktów: kwas cis-6,9-heksadekadienodikarboksylowy; kwas cis-4,7-heksadekadienodikarboksylowy; kwas cis-5,8-tetradekadienodikarboksylowy; kwas cis-4,7-tetradekadienodikarboksylowy; kwas cis-2,5-tetradekadienodikarboksylowy; kwas cis-3,6-dodekadienodikarboksylowy; kwas cis-4,7-dodekadienodikarboksylowy; kwas cis-2,5-dodekadienodikarboksylowy; kwas cis-3,6-dekadienodikarboksylowy; kwas cis-2,5-dekadienodikarboksylowy; kwas cis-2,5-oktadienodikarboksylowy; kwas cis-4-decenodikarboksylowy i kwas cis-2-oktenodikarboksylowy.

Podobnie, przy użyciu kwasu linolenowego jako materiału wyjściowego przewidywane produkty są następujące: kwas cis-4,7,10-heksadekatrienodikarboksylowy; kwas cis-6,9,12-heksadekatrienodikarboksylowy; kwas cis-2,5,8-tetradekatrienodikarboksylowy; kwas cis-4,7,10-tetradekatrienodikarboksylowy; kwas cis-2,5,8-dodekatrienodikarboksylowy i kwas cis-3,6-dodekadienodikarboksylowy; kwas cis-2,5,8-dekatrienodikarboksyłowy; kwas cis-3,6-dekadienodikarboksylowy; kwas cis-4-decenodikarboksylowy; kwas cis-2,5-oktadienodikarboksylowy; kwas cis-4-oktenodikarboksylowy i kwas cis-2-oktenodikarboksylowy.

We wszystkich przypadkach mieszanina produktów będzie zawierać niewielkie ilości produktów o tej samej długości łańcucha jak związek wyjściowy.

W rzeczywistości, ponieważ korzystnymi substratami są estry nienasyconych kwasów tłuszczowych (zwłaszcza estry kwasów tłuszczowych Cj to produkty fermentacji zależą od wyjściowych substratów. Tak więc przez dobór substratów można wytworzyć cały zakres nienasyconych kwasów dikarboksylowych.

Pewne odpowiednie substraty są zidentyfikowane w Patencie Europejskim EP-0229252 i obejmują one C0-C24 alkeny i inne nienasycone węglowodory takie jak nienasycone alkanole (zwłaszcza C₁₆, C^ i C22 nienasycone alkanole) odpowiadające im kwasy monokarboksylowe lub ich pochodne kwasy hydroksykarboksylowe. Oczywiście, że tam, gdzie związkami wyjściowymi są związki trans-nienasycone, produktami będątrans-nienasycone produkty.

Jest wysoce korzystną właściwością sposobu według wynalazku, ze drożdże zastosowane w procesie nie rozmnażają się w warunkach ograniczonego dostępu azotu. W przeciwieństwie do metody opisanej w Patencie Europejskim EP-0341796, drożdże w sposobie według wynalazku rosną w warunkach, które są wzbogacone azotem, przy czym zmiana wartości pH wpływa na aktywność organizmu prowadzącego beta-utlenianie skracające łańcuch.

Stwierdzono, że profil składu produktu procesu fermentacji może być dogodnie modyfikowany przez zmianę pH środowiska fermentacji podczas wytwarzania nienasyconych kwasów dikarboksylowych. W szczególności możliwe jest na tej drodze zmienianie względnych stężeń cząsteczek kwasów dikarboksylowych o różnych długościach. Na przykład przez zmniejszenie pH z 7,5 do 7,1 podczas fermentacji oleju z oliwek możliwe jest zwiększenie względnej ilości nienasyconego kwasu dikarboksylowego C^. Jest to znaczące, ponieważ pewne frakcje produ180 281 któw fermentacji mogą mieć specjalnie korzystne właściwości do poszczególnych zamierzonych zastosowań. Różne frakcje różnych produktów mogą być otrzymane ze środowiska hodowli przez ekstrakcje eterem dietylowym po skorygowaniu fazy wodnej do różnych kwasowych wartości pH.

Różne aspekty wynalazku staną się bardziej zrozumiałe przez odniesienie do poniższych przykładów ilustrujących i rysunków, z których:

Figura 1 stanowi wykres stężenia kwasu dikarboksylowego (gramów na litr) w czasie, przy zastosowaniu jako substratu oleju słonecznikowego;

Figura 2 stanowi wykres stężenia kwasu dikarboksylowego (gramów na litr) w czasie przy zastosowaniu jako substratu oleju z oliwek;

Figura 3 stanowi wykres stężenia kwasu dikarboksylowego (gramów na litra) w czasie przy zastosowaniu jako substratu oleju z oliwek w warunkach zmiany pH;

Figura 4 stanowi graficzne przedstawienie procentowego zmniejszenia melaniny przez kwasy dikarboksylowe o średniej długości łańcucha, otrzymane z oleju słonecznikowego.

Przykładl . Wytwarzanie przez fermentacje nienasyconych kwasów dikarboksylowych o średniej długości łańcucha Beta-utleniający mutant Candida cloacae wytworzony przy użyciu nitrozoguanidyny (mutant LA12, patrz EP 0341796, jak również Casey i in., J. Gen. Microbiol (1990),136,1197-1202) użyto do produkcj i nienasyconych kwasów dikarboksylowych C₈-C _M z triglicerydów takichjak olej z oliwek i olej słonecznikowy, które zawierają znaczne ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych. Zastosowano chemicznie zdefiniowane środowisko przedstawione niżej:

Sacharoza	20 g/1 Ί
(NH₄)₂HPO₄	ógg (	amoki aw 20 minut
kh₂po₄	64 g/l	^r w temp. 121°C
Nl₂SO4	1,5 ggl
Trigliceryd	10-40 n/l/1 J
(na przykład olej	z oliwek lub olej słonecznikowy)
ZnSO4 -7H2O	20 mg/1
MnSO4 -4H₂O	20 mg/1 \|	Sterylizowane przez sączenie
FeSO4 · 7H2O	20 mg/1	1 dodawane aseptycznie
MgCl2 · 6H2O	2 g/l	Y poochlodzeniu fennentera

Biotyna 100 mg/1

Pantotenat 6 mg/1

Tiamina 8 mg/1

Kwas nikotynowy 30 mg/l

Pirydoksyna 20 mg/l

Warunki fermentera były następujące:

pH wzrostu:	6,8 '	Utaymywome
pH produkcji	7,4-7,5	' przez autodozowanie
Temperatura:	30°C	10nNaOH

Napowietrzanie: 0,1 objlobjim powietrza

Szybkość wirnika: δΟΟΗΟΟΟ obr/min.

Objętość fermentera: 2,5 l

Inokulum: 2%

Typ fermentera: Laminowanylateksem SLL - (Iow solidlatex) z łamaczem piLay

Środowisko (2,51) zaszczepiono 2% (objlobj) 24 godzinnąku/turąmutantL betL-utleaiaaiL Candida clnacae LA 12 wyhodowa^nego w środowisku ekstraktu drożdży (5 gil), sacharozy (10 gil) i peptonu (5 gil). Kultura wzrastała w ciągu 20 godzin przy pH 6,8, po czym dodano 20 mlll oleju, a pH podwyższono do 7,4-7,6 w celu zapoczątkowania produkcji nienasyconych kwasów dikarboksytowych o średniej długości łańcucha. Olejem był zarówno olej słonecznikowy lub oczysz8

180 281 czany na krzemionce olej z oliwek. Podczas produkcji kwasów dikarboksylowych wartość RQ (respiratory quotient - iloraz respiracji) spadła do około 0,6. Każdego dnia z fermentera pobierano próbki (10-20 ml) do analizy lipidów, po czym dodawano dodatkowy olej według potrzeby. Wynik fermentacji zbierano po ustaniu produkcji w 8-12 dniu.

Nienasycone kwasy dikarboksylowe o średniej długości łańcucha izolowano z brzeczki fermentacyjnej przez zakwaszenie do pH 6 przy pomocy HCl i następną ekstrakcję eterem dietylowym, izolując frakcje bogatą w C₁₂-C₁₄.

Brzeczkę zakwaszono następnie HCL do pH około 2,0 po czym ekstrahowano eterem dietylowym, izolując frakcję bogatą w C8-C₁₀.

W celu izolacji mieszaniny kwasów brzeczkę zakwasza się jednorazowo obniżając pH z 7,5 do około 2,0 po czym ekstrahuje się eterem dietylowym.

Rozpuszczalnik usuwano z frakcji kwasów dikarboksylowych w wyparce obrotowej.

Przebieg czasu produkcji nienasyconych kwasów dikarboksylowych o średniej długości łańcucha z oleju słonecznikowego (SFO-Sunflower oil) i z oczyszczonego na krzemionce oleju z oliwek (OO - oliwe oil) przedstawiają odpowiednio figura 1 i 2.

Figura 1 przedstawia wytwarzanie nienasyconych kwasów dikarboksylowych C8-C₁₄indywidualnie i łącznie z użyciem jako substratu oleju słonecznikowego. Szybkość produkcji nienasyconych kwasów dikarboksylowych o średniej długości łańcucha wzrastała gwałtownie pomiędzy 3 i 4 dniem i faktycznie ustała do zera w 8 dniu, kiedy to stężenie kwasów dikarboksylowych stało się mniej więcej stałe.

Figura 2 przedstawia wytwarzanie nienasyconych kwasów dikarboksylowych C8-C₁₄indywidualnie i łącznie z użyciem jako substratu oleju z oliwek. W tym przypadku szybkość produkcji kwasów dikarboksylowych wykazywała mniej gwałtowny wzrost, ale stale wzrastała do 8 dnia.

W obu przypadkach dłuższe kwasy dikarboksylowe (C₁₄, C₁₂) stanowiły procentową większość całości niż kwasy dikarboksylowe o krótszym łańcuchu (C₁₀, C8) jakkolwiek dokładny profil produktu różnił się pomiędzy obydwoma substratami (na przykład stosunkowo więcej produktu C_w uzyskano przy użyciu jako substratu oleju słonecznikowego). Dane te również przedstawiono w postaci tabelarycznej w tabeli 1.

Tabela 1

Czas fermentacji (dni)	Kwas dikarboksylowy g/l
C14	C12	C10	C8	Łącznie C8-C14
SFO	OO	SFO	OO	SFO	OO	SFO	OO	SFO	OO
2	1,7	0,6	0,5	0,2	0,2	-	0,1	-	2,5	0,8
3	2,7	1,5	0,9	0,4	0,6	0,1	0,2	0,1	4,1	2,1
4	5,7	3,0	2,3	0,9	1,8	0,2	0,6	0,2	10,4	4,3
5	7,4	3,9	3,4	1,3	2,6	0,3	0,8	0,2	14,2	5,7
6	8,4	5,1	4,2	3,7	3,2	0,7	1,0	0,4	16,8	8,9
7	8,4	6,8	4,5	3,6	3,5	1,0	1,1	0,6	17,5	12
8	8,7	8,8	4,7	5,1	3,4	1,2	1,3	0,8	18,1	15,9

Przykład II. Zmiana profilu produktu przez zmianę pH

Przy pH produkcji 7,4-7,6 z olejów (na przykład z oleju z oliwek) zawierających nienasycone kwasy tłuszczowe CR dominującym produktem jest nienasycony kwas dikarboksylowy C₁₄. Jednakjeśli pH produkcji obniży się z 7,4-7,6 do około 7,1 dominującym produktem staje się nienasycony kwas dikarboksylowy C^. Fermentację prowadzono jak szczegółowo przedstawiono w powyższych przykładach aż do 8 dnia fermentacji, kiedy to pH obniżyło się do 7,1 powodując zwrot z CR i wzrost produkcji C₁₂. Wyniki te ilustruje figura 3.

180 281

Figura 3 przedstawia wytwarzanie nienasyconych kwasów dikarboksylowych Cg-C^ indywidualnie i łącznie z użyciem jako substratu oleju z oliwek, gdzie w 8 dniu skorygowano pH z 7,5 do 7,1.

Jak wynika z figury 2 łączna produkcja kwasów dikarboksylowych dalej wzrasta po 8 dniu przy użyciu jako substratu oleju z oliwek. Jednak profil produktu jest znacznie zmieniony. Do 8 dnia stężenie kwasu dikarboksylowego C_M stale wzrastało i był on najbardziej stężonym produktem. Jednak po punkcie zmiany warunków pH, stężenie zaczęło zmniejszać się, podczas gdy produkt C12 zaczął wzrastać tak, że po 10 dniu kwas dikarboksylowy C_n reprezentować większość produktu. Dane te są również przedstawione w postaci tabelarycznej w tabeli 2.

Tabela 2

Dzień fermentacji	Kwas dikarboksylowy (g/l)	Łącznie
C,6	C14	C12	C10	C₈	C8“Gi6
1	0,1	0,6	0,1	0	0	0,8
2	0,52	0,7	0,2	0	0	1,42
3	0,9	1,5	0,4	0,1	0,1	3,0
4	1,6	3,0	0,9	0,2	0,1	5,8
5	2,1	4,4	1,3	0,3	0,2	8,3
6	1,5	5,5	2,7	0,7	0,4	10,8
7	0,6	7,1	3,6	1,0	0,6	12,9
8 Zmiana pH z 7,5-7,1	0,6	8,8	5,1	1,4	0,8	16,7
9	0,4	8,2	6,1	1,9	0,9	17,5
10	0,13	8,2	8,0	2,3	1,2	21,0
11	0,25	8,0	9,6	3,1	1,4	22,35
12	0,1	7,5	10,6	3,6	1,5	23,2
13	0,1	6,8	12,2	4,3	1,8	25,2

Doświadczenie to pokazuje, że profil produktu może być w pewnym zakresie kontrolowany przez pH produkcji. Szybkość wytwarzania dikarboksylowych C₈-C₁₍₎ pozostaje w zasadzie liniowa po zmianie pH produkcji.

Przykład III. Próba inhibitowania tyrozynazy

Inhibitowanie aktywności tyrozynazy jest stosowane do identyfikacji potencjalnych środków rozjaśniania skóry. Próbę inhibitowania tyrozynazy przeprowadzono według metody Humada i Mishima (Br. J. Derm. (1972), 86,385-394). Wszystkie roztwory były świeżo przygotowane z użyciem buforu (pH 6,8) 0,1 M fosforanu sodu jako rozcieńczalnika. Były to:

- 40 mM podstawowy roztwór inhibitora, z którego sporządzono serię rozcieńczeń otrzymując następujące stężenia 4,0; 0,4 i 0,04 mM inhibitora.

- Roztwór soli zawierający siarczan miedzi (100 pM) i chlorek magnezu (100 mM);

- Roztwór enzymu: 1 mł grzybowej tyrozynazy (2000-4000 jednostek na mg); oraz

- Roztwór substratu: 48 mg dihydroksyfenyloalaniny (DOPA)/100 ml

Roztwory enzymu i DOPA sporządzano bezpośrednio przed użyciem, ponieważ są one wrażliwe na światło.

Inhibitowanie katalizowanego przez tyrozynazę utleniania DOPA przez kwasy dikarboksylowe śledzono spektrofotometrycznie monitorując formowanie się barwnika „dopachrome” przy długości fali 492 nm. Reakcje prowadzono w 96-krotnych płytkach do mikromiareczkowania

180 281 przez dodanie 30 μΐ inhibitora (lub buforu do kontroli), 50 μΐ buforu i 20 μΐ roztworu soli. DOPA (50 μΐ) dodano celem zapoczątkowania reakcji i każdą płytkę wstrząsano w ciągu 30 sekund. Odczytu absorbancji dokonywano po 10 minutach z użyciem czytnika płytek do mikromiareczko wania (Titertek Multiscan).

Wyniki próby inhibitowania tyrozynazy pokazały, że podobnie jak kwas azelainowy, nienasycone kwasy dikarboksylowe o średniej długości łańcucha okazały się skutecznymi inhibitorami tyrozynazy, w wyniki co najmniej 50% inhibitowania aktywności enzymu przy stężeniu 10 mM. Jest to nieoczekiwane, ponieważ kwas azelainowy jest nasyconym kwasem dikarboksylowym i mającym wyraźnie różne właściwości. Kwas azelainowy w temperaturze pokojowej jest krystalicznym ciałem stałym, podczas gdy nienasycone kwasy dikarboksylowe C₈/C₁₀ są oleistymi substancjami o niskiej temperaturze topnienia.

Możliwe, że enzym reduktazy tioredoksyny jest bardziej znaczącym enzymem niż tyrozynaza w odniesieniu do regulowanego przez kwasy dikarboksylowe inhibitowania pigmentacji skóry. Ostatnie badania (opisane przez Fittońa i Goa w Drugs 41, (5), 780-798(1991)) pokazały, ze kwas azelainowy inhibituje reduktazę tioredoksyny. W świetle ujawnienia w tym opisie specjaliści powinni zatem oczekiwać, że nienasycone kwasy dikarboksylowe powinny być inhibitorami również tego enzymu.

Przykład IV. Inhibitowanie wytwarzania melaniny.

W dalszej próbie uzupełniającej przykład III badano wpływ działania nienasyconych kwasów dikarboksylowych in vitro na kultury melanocytów. Komórki wytwarzające pigment, pochodzące z czerniaka ssaków hodowano w kulturze standardowymi metodami. Korzystne są linie komórek B16 (ujawnione w Patencie Europejskim 0338104), lub komórki S-91 (na przykład ATCC CCL 51.3, klon M-3), jakkolwiek mogąbyć użyte inne linie pierwszorzędowych melanocytów myszy lub ludzkie. Komórki czerniaka hodowano w kompletnym środowisku hodowli komórek (takimjak opisano w Patencie Europejskim 0308919) w przybliżeniu do 1/3 konfluencji. Następnie do środowiska hodowli dodaje się kompozycję przeznaczoną do badania. Komórki hodowano w ciągu następnych 4 dni, a ilość wytworzonej melaniny określano przez pomiar absorbcji przy 540 nm całej melaniny wyekstrahowanej ze środowiska hodowli i z zebranych komórek.

Opisana wyżej metodę stosowano do oceny zdolności kompozycji zawierających nienasycone kwasy dikarboksylowe frakcji (C₁₂-C₁₄), frakcji (C₈.₁₀) lub mieszaninę kwasów w stężeniu 0,1 mM lub 1,0 mM, zmniej szania ilości wytwarzanej melaniny przez hodowle melanocytów, w stosunku do negatywnej hodowli kontrolnej. Jako pozytywnej kontroli użyto kwas kojowy (substancję stosowanąjako środek do rozjaśniania skóry). Wyniki przedstawia figura 4, która stanowi graficzny obraz procentowego zmniejszenia melaniny w hodowlach poddanych działaniu w porównaniu do kontrolnej nie poddanej działaniu. Stwierdzono, że różne frakcje kwasów dikarboksylowych w tym względzie miały w zasadzie podobne działanie.

Przykład V. Określenie aktywności antymikrobiologicznej.

Minimalne stężenie inhibitujące (MIC - Minimum Inhibitory Concentration) każdej z różnych mieszanin nienasyconych kwasów dikarboksylowych określano wrażliwość 32 szczepów Propionobacterium acnes i 32 szczepów różnych rodzajów bakterii aerobowych w obecności lub pod nieobecność 10% Intralipid (Kabi Pharmacia, Inc.), stosując technikę rozcieńczenia agarem.

Stosowano niżej opisaną metodę.

Roztwór podstawowy dla każdego środka sporządzano przez dodanie 10 gramów materiału stanowiącego kwas dikarboksylowy do 200 mililitrów trypsynowej brzeczki sojowej o podwójnej mocy (TSB - Tryptic Soy Broth - Baltimore Biological Laboratories). W każdym roztworze korygowano pH do 7,0±0,2 przy pomocy wodorotlenku sodu.

Dla każdego kwasu organicznego przygotowano dwa zestawy 200 ml kolb numerowanych 1 do 9. Do każdej kolby wprowadzono 50 cm³ TBS o podwójnej mocy. Z 5% roztworu podstawowego 50 cm³ przeniesiono do kolb nr 1 i nr 2. Przeprowadzono szereg przeniesień 50 cm³od kolby nr 2 do kolby nr 8. Kolba nr 9 w każdym zestawie zawierała jedynie 50 cm³ TSB o podwójnej mocy bez jakiegokolwiek kwasu dikarboksylowego. Do każdej z 18 kolb dodano 2 gramy

180 281 granulowanego agaru (BBL). Wszystkie kolby autoklawowano w ciągu 15 minut w temperaturze 121 °C, pod ciśnieniem 15 psi (98,0665 kPa), po czym przetrzymywano w temperaturze 50°C na łaźni wodnej.

Do jednego zestawu kolb nr 1-9 dodano 50 cm³ gorącej, sterylizowanej wody. Kolby obracano w celu wymieszania zawartość i 25 cm3 wylano do każdej z czterech szalek Petriego i pozostawiono do zestalenia się. Do drugiego zestawu kolb dodano 50 cm3 Intralipid (wstępnie ogrzanego do 50°C). Zawartość wymieszano i wylano jak wyżej.

Standardowe inokula organizmów testowanych wytworzono przez wprowadzenie zawiesiny bakteryjnej w 0,85% PSS (physiological saline solution - roztwór soli fizjologicznej) do 0,5 standardu McFarland'a i dziesięciokrotne rozcieńczenie uzyskując 107 CFU (colony forming units - jednostki tworzące kolonię). Inokula były umieszczone w 32 studzienkach replikatora sterującego. Wielokrotnie rozgałęziony inokulator dostarcza od 0,001 do 0,002 cm3, co daje końcowe inokulum wynoszące 104 CFU na miejsce.

Płytki zaszczepiono od najniższego do najwyższego stężenia (celem zmniejszenia efektu „przeniesienia” inokulum) i pozostawiono do wyschnięcia. Płytki następnie odwrócono i inkubowano w temperaturze 35°C w ciągu 24 godzin. Płytki szczepione szczepami Propionibacterium acnes inkubowano w warunkach anaerobowych w temperaturze 35°C w ciągu siedmiu dni. Płytki kontrolne bez środka (nr 9) badano na koniec inkubacji na żywotność i oznaki zanieczyszczeń.

Końcowe wartości MIC określano przez obserwację płytki przy najniższym stężeniu środka, jakie inhibitowało widoczny wzrost mikroorganizmu. Wyniki zestawione w tabeli 3 przedstawiająMIC dla nienasyconych kwasów dikarboksylowych o średniej długości łańcucha (Mieszanina kwasów dikarboksylowych, to znaczy mieszanina dikarboksylowych kwasów C_s-C₁₄), frakcji wzbogaconej w C^ i dla mononienasyconych związków C_{18 H} w porównaniu z kwasem azelainowym wobec szeregu mikroorganizmów. Dane reprezentują wyniki eksperymentów, które zostały w zasadzie przeprowadzone na szeregu różnych szczepów każdego rodzaju (na przykład P. acnes szczep ATCC 6919 i 29399 [ATCC oznacza American Type Culture Collection]; Staph.aureus szczep ATCC 25923; 35556 i 29213; Staph.epidermidis aTcC 35984, 31432 i 14490; Micrococcus sedentarius ATCC 27574; M. luteus AtCc 27141, 9341 i 15957; Brevibacterium epidermidis ATCC 35514; Corynebacterium minutissium ATCC 23347,22348 i 23349).

Obecność lub brak „Intralipidu” nie miały znaczącego wpływu. Nieznaczną różnicę zaobserwowano jedynie dla mononienasyconych związków C_{18 b} gdzie wystąpiła sugestia, że intralipid podwyższa MIC w przypadku Pacnes i M.luteus.

W niniejszym opisie, zgodnie z nomenklaturą kwasów tłuszczowych oznaczenie dikarboksylowy kwas Cj81 oznccza kwas dikarooksykwy oeiemnastowęglowy, prostołańcucliowy o jednym wiąonziu podwójnym, nnnlogiczzie dikarbsksylswy kwas C^ 2 oznacza kwas dikarboksylowy soeszastowęgloww o dwóch wiązaniach podwójnych.

180 281

Pr^óilaa dyfuzji agarowej MIIC dla kwasu azelainowego w stosunku do nienasyconych kwasów dikarboksylowych

Kwas dikarboks. Ci81 kwasu

oleinowego + „Intralipid”

0 02

CM O 0

0.15

rc 0

0.31

1 ιε 0

ιε 0

l£ 0

0 07

0.07

£00

©

0 15

0.15

to ©

CM Λ

>2.5

>25

c/i 7 44 22 F M w C3 C3 £ ΐ G *

z kwasu oleinowego

s ©

0.04

0 07

0 15

031

0.31

0 15

0.15

i/T ©

0.15

0 15

>2 5

</T >2 5

>2 5

Typ kwasu dikarboksylowego (MK %

Mieszane kwayy dikarboks

z oleju słonecznikowego

l£ 0

0 62

1.25

0 62

25

«η CM

25

CM

CM O

0 62

0.62

0 62

0.62

CM kO O

0 62

>2 5

>25

> 2.5

Mononienasycone kwayy dikarb.

wzbogacone C12 z oteju z oliwek

•Zł

0 62

CM

0.62

CM

0.62

CM

tc

V2

ι/Ί

CC 0

m 0

cm

0.3

kO ©

90

©

kO ©

CM Λ

>2.

CM A

Mieszane kwasy dikarboks.

z oljju z oliwek

031

CM

in

«η

V)

in CM

15

CM

0 62

CM

62

CM

>2

V2

CC ©

0 0

CC Ó

CM

1 2

CM

I—·

©

CM

kO ©

0.6

0 6

>2.

CM

>2.

©

5

Kwas azelainowy

1.25

•n CM

ci

1 25

«η CM

>25

>2.5

L ²·⁵

25

>2.5

>2 5

>2.5

> 2.5

•O ci

>2.5

Źródło

ATCC 6919

ATCC 29399

ATCC 25923

ATCC 35556

ATCC 29213

ATCC 35894

ATCC 31432

ATCC 14490

ATCC 27574

ATCC 27141

ATCC 9341

ATCC 15957

ATCC 35514

NCDO 2285

ATCC 23347

ATCC 23348

ATCC 23349

ATCC 27853

ATCC 25922

ATCC 18804

Szczep

Propioniaactesium acnes 1

Propn^iuaaiętesium acnes

Staphylococcus aureus

Staphylo^t^c^^^us aureus

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

S^hylococcus epidermidis

Mlargaoccus sedentnus

Micrococcus luteus j

Micrococcus luteus

1 Brevibactesjum epidermidis

Brevibacteslum epidermidis

Corynebacteslum minutissium

Corynebactesjum minutissium

1 minutissium

Pseudomonas aeruginosa

Esi^łierichia coli

1 Candida albicans

180 281

P. acnes jest głównym czynnikiem sprawczym trądzika, stąd skuteczność przeciw temu organizmowi określa przydatność w zapobieganiu i leczeniu trądzika.

Staphylococcus aureus jest patogennym organizmem gram-dodatnim, związanym z czyrakami i ropieniami.

Candida albicans jest odpornym drożdżem włączonym jako negatywna kontrola.

Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli obydwa są pospolitymi Gram ujemnymi organizmami.

Nieoczekiwanie we wszystkich przypadkach nienasycone kwasy dikarboksylowe (zarówno związki o średniej długości łańcucha jak i C₁₈) okazały się bardziej aktywne niż kwas azelainowy. Związki były szczególnie skuteczne przeciw P.acnes, Staph.aureus i Staph.epidermidis. Szczególnie związki C_u wykazywały aktywność antymikrobiologiczną wielokrotnie większą niż kwas azelainowy.

Podobny eksperyment przeprowadzono, stosują tę sama metodę, w celu porównania stopnia aktywności inhibitowania (dla P.acnes) kwasu azelainowego, kwasu dikarboksylowego (otrzymanego z substratu zawierającego kwas oleinowy), mieszanego kwasu tłuszczowego (monokarboksylowego) C^ j, odpowiednich dikarboksylowych kwasów C^ i i C^ 2 (otrzymanych z substratu zawierającego kwas linolowy) i kwasu dikarboksylowego C₁₆i (otrzymanego z substratu zawierającego kwas oleopalmitynowy).

Wyniki przedstawiono niżej w tabeli 4

MIC dla kwasu azelainowego i dikarboksylowego kwasu C·^ w zasadzie były jak poprzednie, potwierdzające wcześniejsze wyniki. Odpowiedni kwas tłuszczowy miał bardzo małą aktywność.

Tak więc kwas dikarboksylowy C^· miał prawie 100 krotną aktywność kwasu azelainowego, natomiast ekwiwalentny kwas tłuszczowy oleinowy jest mniej aktywny niż kwas azelainowy.

W doświadczeniu 4 stopień inhibitowania kontrolnego kwasu azelainowego, a zatem również próbek badanych był nieco mniejszy niż obserwowany w poprzednich doświadczeniach.

Tabela 4

MIC kwasów dikarboksylowych przeciw P. acnes ATCC 25746 w porównaniu z kontrolnym kwasem azelainowym i kwasem oleinowym

Materiał badany	MIC (%)
Dośw. 1	Dośw. 2	Dośw. 3	Dośw. 4
Kwas azelainowy (kontrola)	5	5	5	>5
Kwas tłuszczowy C18 1 (kontrola)	nd	nd	>5	nd
Kwas dikarboksylowy C181 z kwasu oleinowego	0.04	0.04	0.04	0.08
Kwas dikarboksylowy C18 2/181 z 60% kwasu linolowego	nd	nd	nd	0.08
Kwas dikarboksylowy C161 z kwasu oleopalmitynowego	nd	nd	nd	0.16

W doświadczeniu 4 stopień inhibitowania kontrolnego kwasu azelainowego, a zatem również próbek badanych był nieco mniejszy niż obserwowano uprzednio.

Najprawdopodobniej przyczyną tego był wydłużony okres inkubacji do 18 dni w przeciwieństwie do 7 dni w poprzedniej pracy.

180 281

Przykład IV. Kompozycja kremu.
Składnik	% wagowy
Nienasycony kwas
diOzrboksyloww C8.22	1^,0
Chlorokreool	0,1
Dwutlenek tytanu	1,0
Kwas salicylowy	2,0
Monostea^nian glicerolu	2,0
Alkohol cetylowy	3,0
Tween 80	5,0
Laurylseterosinrcznn sodu	10,0
Etanolonminolauryloeterssiarczzz	1,0
Olej z oliwek	2,0
Witamina C	1,0
Woda destylowana	do 100%

180 281

— C1-4 —ł— C12 CIO

-θ- C8 łącznie C8-CJĄ

Fig. 1

180 281

- C 14 -ł- C12 CIO

-θ- C8 —X—łącznie C8-C14

Fig.2

180 281

- 06 -I- 04

-Θ- CIO C8 —0-łącznie C8-C16

Fig. 3

180 281

Ο,ΙιτιΜ Ε2 l.OmM

Fig. 4

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Antymikrobiologiczna farmaceutyczna lub kosmetyczna kompozycja, zwłaszcza przeciw Propionibacterium acnes i Staphylococcus aureus, również do rozjaśniania skóry, zawierająca składnik aktywny i dermatologicznie dopuszczalny kosmetyczny nośnik, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera od 0,001% do 20% wagowych nienasyconego alifatycznego kwasu dikarboksylowego o 8 do 22 atomach węgla i/lub alkoholowej, amidowej lub estrowej pochodnej nienasyconego alifatycznego kwasu dikarboksylowego zawierającej od 15 do 22 atomów węgla w głównym łańcuchu węglowodorowym.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej niż jeden nienasycony kwas dikarboksylowy C₁₆ i/lub jego wyżej określoną pochodną.
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej niż jeden nienasycony kwas dikarboksylowy C₁₈ i/lub jego wyżej określoną pochodną.
4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że jako pochodną kwasu dikarboksylowego zawiera amid lub ester niższego alkilu.
5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 0,01% do 1%o wagowego składnika aktywnego.
6. Sposób wytwarzania nienasyconych kwasów dikarboksylowych o 8 do 22 atomach węgla, znamienny tym, że nienasycony(-e) C_I0.₂₄ monokarboksylowy(-e) kwas(-y) lub jego(ich) pochodną(-e) w postaci kwasu hydroksykarboksylowego(-ych), albo C]6.₂₂ nienasycony kwas(-y) tłuszczowy (-e), jego(ich) estr(-y), zwłaszcza triglicerydy ewentualnie w postaci olejów, albo C_w.24 alken(-y), nienasycony(-e) akanol(-e) o łańcuchu dłuższym niż pożądany produkt poddaje się ograniczonemu beta-utlenianiu, z użyciem drożdży rozmnażających się w pożywce wzrostowej, korzystnie szczepu Candida cloacae 5GLA12, stosując pH w zakresie 7,1 - 7,6, a z brzeczki fermentacyjnej wydziela się produkt przez zakwaszanie i ekstrakcję eterem dietylowym.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako substrat stosuje się nienasycony związek C^.
8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że jako substrat stosuje się kwas oleinowy, kwas linolowy, kwas linolenowy lub kwas arachidowy.
9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się substrat zawierający trigliceryd nienasyconego kwasu.
10. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się substrat zawierający olej z oliwek, olej słonecznikowy lub olej rycynowy.
11. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się drożdże rosnące w warunkach bez ograniczenia azotu.