PL181234B1

PL181234B1 - Polipeptydy o aktywności surfaktanta płucnego i kompozycja farmaceutyczna zawierająca polipeptydy o aktywności surfaktanta płucnego

Info

Publication number: PL181234B1
Application number: PL95317420A
Authority: PL
Inventors: Rüdiger Nave; Wolf-Rüdiger Ulrich; Ernst Sturm; Uwe Krüger; Dietrich Häfner; Klaus P. Schäfer; Klaus Melchers
Original assignee: Byk Gulden Lomberg Chem Fab
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-27
Publication date: 2001-06-29
Also published as: FI118126B; SK282441B6; PT764172E; BR9507811A; NO965052D0; HUT76952A; DE59510941D1; HK1000891A1; KR100355626B1; NO317149B1; US5874406A; JPH10504025A; SI0764172T1; PL317420A1; CY2552B1; KR970703367A; BR9507811B1; EP0764172B1; CN1154117A; CA2191344A1

Abstract

1. Polipeptydy o aktywnosci surfaktanta plucnego o wzorze ogólnym I: w którym A oznacza H lub Phe, B oznacza Phe lub Trp, a C oznacza Ile, Leu lub Ser. 5. Kompozycja farmaceutyczna przeznaczona do leczenia zespolów ostrej niewydolnosci oddechowej (RDS) u ssaków, znamienna tym, ze zawiera polipeptydy o aktywnosci surfaktanta plucnego o wzorze ogólnym I w którym A oznacza H lub Phe, B oznacza Phe lub Trp, a C oznacza Ile, Leu lub Ser. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są polipeptydy o aktywności surfaktanta płucnego, zawierające sekwencję aminokwasów o wzorze ogólnym I:

0123456789 10

(A)	Gly	Ile	Pro	B	B	Pro	Val	His	Leu	Lys
	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
	Arg	Leu	Leu	Ile	Val	Val	Val	Val	Val	Val	(I)
	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
	Leu	Ile	Val	Val	Val	Ile	Val	Gly	Ala	Leu

32 33 34

Leu C Gly Leu w którym A oznacza H lub Phe, B oznacza Phe lub Trp, a C oznacza Ile, Leu lub Ser.

Korzystnym przedmiotem wynalazku sąpolipeptydy o wzorze ogólnym I, w którym A oznacza H lub Phe, B oznacza Phe i C oznacza Ile, przy czym szczególnie korzystnie A = Η, B=Phe i C = Ile.

181 234

Dalszym przedmiotem wynalazku są kompozycje farmaceutyczne, które charakteryzują się zawartością]ednego, lub większej ilości polipeptydów według wynalazku i które, w przypadku, gdy jest to pożądane, zawierajądodatkowo jeden, lub większą ilość polipeptydów o aktywności surfaktanta płucnego z grupy SP-A i SP-B, korzystnie SP-B.

Polipeptydy według wynalazku można wytwarzać albo znanymi metodami syntezy peptydów w fazie stałej albo, z wykorzystaniem odpowiednich wektorów rekombinantowych, w komórkach-gospodarzach. Techniki i wektory służące do konstruowania polipeptydów, komórki do przeprowadzania transformacji, sposoby doprowadzania do ekspresji białek w transformowanych komórkach oraz metody wyodrębniana i oczyszczania białek wytworzonych na drodze ekspresji, znane są, jako takie, fachowcom w tej dziedzinie techniki (na przykład WO 86/03408, WO 87/06588 i WO 91/18015).

Wytwarzanie wektorów, przeznaczonych do zastosowania przy doprowadzaniu do ekspresji SP-C w systemach bakteryjnych, odwołuje się do wykorzystania typowych metod technologii rekombinantowego DNA.

Uzyskanie ekspresji hydrofobowego białka SP-C w bakteriach można osiągnąć, z dużą wydajnością i bez szkodzenia komórkom-gospodarzom, wyłącznie w przypadku wytwarzania właściwego białka sprzężonego, na przykład z udziałem acetylotransferazy chloramfenikolowej (CAT). I tak, na przykład, wektor pTrpAmp=CAT 152 koduje N-końcowy region CAT i dostarcza miejsca cięcia (5'-)Eco Rl i (3')Pst 1 dla klonowania „in frame” fragmentów DNA kodujących SP-C. CAT i SP-C zostająprzy tym związane ze sobąna poziomie białka poprzez wrażliwe na hydroksyloaminę miejsce sprzężenia (AsN 4- Gly). Wektory takie jak pTrpAmpCAT-152: :SPC umożliwiają przeprowadzanie kontrolowanej ekspresji odpowiednich białek sprzężonych aż do skali produkcyjnej (fermentacji). Ekspresja białek sprzężonych powoduje tworzenie się ciałek wtrętowych w komórce-gospodarzu. Przy tym, długość części CAT w białku sprzężonym można zmieniać w taki sposób, że możliwe jest uzyskanie wysokiej wydajności ciałek wtrętowych z jednoczesnym dużym udziałem SP-C.

Ekspresję można uzyskiwać także i w wielu innych, oprócz bakteryjnych, systemach, a mianowicie w takich komórkach-gospodarzach jak, na przykład, komórki ssaków, drożdżaków i owadów. Odpowiednie dla rozmaitych komórek-gospodarzy konstrukty DNA syntetyzuje się z wykorzystaniem metod znanych i wbudowuje w genom komórek gospodarzy z zwykły sposób z udziałem odpowiednich sekwencji regulatorowych.

Dwa oligonukleotydy DNA można zsyntetyzować według typowej metody fosfoamidytowej z zastosowaniem syntezatora MilliGenZ-Biosearch Cyclone DNA-Synthesizer.

Pierwszy z tych oligonukleotydów DNA stanowi kodogenną(sensowną) nić DNA o długości 118 nukleotydów, Koduje ona (w kierunku 5' -> 3^ 5'-koniec Eco R1 -specyficzny dla dalszego subklonowania, miejsce rozszczepiania przez hydroksyloaminę Asn/Gly i ludzkie SP-C, rozpoczynające się od Gly-25 i kończące na Leu-58 sekwencji przejściowej SP-C, odpowiadające Gly 1 względnie Leu-34 we wzorze I. Odbywa się przy tym translacja znanej sekwencji aminokwasów ludzkiego białka SP-C, zgodnie z prawidłami kodu genetycznego, na DNA. Jednakże, sekwencja ta zostaje zmodyfikowana w taki sposób, że obie cysteiny w pozycjach 28 i 29 sekwencji przejściowej SP-C zastąpione są przez fenyloalaninę lub przez tryptofan, a metionina w pozycji 56 sekwencji przejściowej białka prze izoleucynę, leucynę lub serynę. Dodatkowo można przy tym w ten sposób uwzględnić częstotliwość korzystania komórek-gospodarzy z kodonów. Zmodyfikowana sekwencja SP-C, która w pozycji 4 i 5 zawiera fenyloalaninę, a w pozycji 32 izoleucynę (numeracja według wzoru I), określana jest, zgodnie ze zwykle stosowanym kodem jednoliterowym dla obu tych aminokwasów, jako SPC34 (FF/I). Następnie, sensowna nić DNA zawiera kodon stop TAA, do terminacji rybosomalnej translacji, jak również PST1-specyficzny koniec 3'. Drugi oligonukleotyd DNA stanowi komplementarną nić niekodującą (anty sensowną) składającą się ze 110 nukleotydów.

Wytworzony na drodze syntezy fragment DNA SP-C wklonowuje się w stosowny wektor ekspresyjny, taki jak, na przykład, pTrpAmpCATl 52. Wektor ten składa się z pKK233 (Pharmacia), zawierającego gen oporności na ampicylinę i pochodzi od pBR322. Promotor Trc może być

181 234 zastąpiony promotorem Trp, jak ma to miejsce w pTrpAmpCAT152. Można również posłużyć się innymi indukowalnymi promotorami, nadaj ącymi się do zastosowania w danym przypadku.

Dla przeprowadzenia subklonowania fragmentu SP-C, wpierw hybrydyzuje się ze sobą komplementarne oligonukleotydy DNA. Tak utworzona podwójna nić DNA posiada wystające końce nici pojedynczej (Eco Rl/PST 1).

Wbudowanie w DNA wektora następuje w zwykły sposób po strawieniu DNA wektora z udziałem Eco Rl/Pst 1, oczyszczeniu pożądanych fragmentów DNA wektora metodą elektroforezy w żelu agarozowym i hybrydyzacji DNA SP-C i fragmentów wektora poprzez lepkie końce. Na koniec, sprzęga się ze sobą oba fragmenty w znany sposób za pomocą ligowania.

W celu dokonania amplifikacji DNA i izolacji plazmidu, przeprowadza się (zgodnie z powszechnie stosowanymi protokołami) na przykład transformację CaCl₂-kompetentnych komórek E. coli MM294 i dla dokonania selekcji komórek przenoszących plazmid prowadzi się ich hodowlę na płytkach z agarem LB i ampicyliną. Z tak uzyskanych kolonii opornych na ampicylinę wyodrębnia się DNA plazmidu i poddaje analizie z udziałem właściwych kombinacji enzymów restrykcyjnych. Wybiera się klony z oczekiwaną konfiguracją fragmentów restrykcyjnych DNA. Na drodze kompletnego sekwencj onowania sekwencj i plazmidów potwierdza się poprawnie dokonaną insercję sekwencji SPC34 (FF/I).

Tak wytworzone wektory plazmidowe umożliwiają zajście ekspresji białek sprzężonych CAT::SPC pod kontrolą promotora Trp (lub innych promotorów). Rekombinantowe białko sprzężone wytrąca się w komórkach-gospodarzach po indukcji w postaci ciałek wtrętowych.

Białko sprzężone CAT152::SPC34 (FF/I) wykazuje następującą, przedstawioną zwykle stosowanym kodem jednoliterowym, sekwencję aminokwasów:

20 30 4050

MEKKI TGYTT VDISQ WHRKE HFEAF QSVAQ CTYNQ TVQLD ITAFL KTYKK

70 80 90100

NKHKF YPAFI HILAR LMNAH PEERM AMKDG ELVIW DSVHP CYTYF HEQTE

110 120 130 140150

TFSSL WSEYH DDFRQ FLHIY SQDVA CYGEN LAYFP KGFIE NMFFV SANPE

160 170 180186

FNGIP FFPVH LKRLL IWW VVLIV WIVG ALLIG L

10 20 3034

Za pomocą podkreślenia i podania pozycji od 1 do 34 wyróżniono 34 aminokwasy SP-C (FF/I) w pozycjach od 153 do 186 białka sprzężonego.

Późniejsze rozszczepienie z użyciem hydroksyloaminy prowadzące do rozdzielenia CAT i SP-C dokonuje się między Asn-152 i Gly-153 (odpowiada pierwszemu aminokwasowi w peptydzie SP-C). Oddzielenie i oczyszczenie peptydu SP-C odbywa się z wykorzystaniem metod powszechnie stosowanych w chemii białek.

Polipeptydy według wynalazku można formułować (oddzielnie lub w postaci ich kombinacji) i oddawać do dyspozycji jako kompozycje farmaceutyczne dostosowane do wymagań związanych z leczeniem dróg oddechowych. Kompozycje te nadają się nie tylko do leczenia zespołu ostrej niewydolności oddechowej noworodków i osób dorosłych, ale także do leczenia zapalenia płuc i zapalenia oskrzeli. Poza tym, polipeptydy według wynalazku nadają się do wykorzystania jako „holowniki” leków podawanych przez wziewanie.

Omawiane kompozycje zawierają oprócz polipeptydów także i fosfolipidy, korzystnie takie fosfolipidy, które występują w składzie naturalnego surfaktanta płucnego jak, na przykład, dipalmitoilofosfatydylocholina (DPPC), palmitoilooleilofosfatydyloglicerol (POPG) i/lub fosfatydyloglicerol (PG). Dla ustalenia ich lepkości na odpowiednim poziomie, kompozycje te

181 234 zawierająjony wapnia i magnezu, jak również chlorek sodowy. Fachowiec w tej dziedzinie wiedzy, przy wyznaczaniu rodzaju i ilości składników kompozycji będzie zorientowany z jednej strony już poznanym składem j ednego z naturalnych surfaktantów płucnych, a z drugiej licznymi propozycjami z dotychczasowego stanu techniki (na przykład z EP-A 0119056 i EP-A 0406732).

W kompozy cj ach o korzystnym składzie według wynalazku poszczególne substancj e znaj dują się w poniżej podanych ilościach:

Fosfolipidy 80 do 95% wag.

Polipeptydy 0,5 do 3,0% wag.

Kwas tłuszczowy (korzystnie kwas palmitynowy) Chlorek wapniowy Przykład wytwarzania 1. Szczep produkcyjny do 7% wag.

do 3% wag.

Zastosowany szczep produkcyjny E. coli 199 wyprowadzony jest z E. coli K 12 szczep MM294, który można otrzymać z Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM, Brunszwik, RFN).

Wektor ekspresyjny pTrpAmpCATl 52::SPC34 (FF/1), zawierający gen białka sprzężonego CAT152::SPC34 (FF/1) wywodzi się z sekwencji DNA pBR322, pochodnej ColEl [E. Weber (red.): „Biologische Sicherheit”, Bundesministerium fur Forschung und Technologie, Bonn (1988)]. Z dostępnego z firmy Pharmacia plazmidu pKK233-2 wycina się promotora Tre przy użyciu Eco Rl/Hind 3 i zastępuje go syntetycznym promotorem Trp (pTrp233). Składa się on z regionu promotora (miejsce wiązania dla polimerazy RN A), regionu operatora (miejsce wiązania represorów Trp), sekwencji Shine-Dalgamo (sekwencji S/D) i miejsc restrykcyjnych dla klonowania. Za promotorem Trp wbudowuje się gen kodujący 152 aminokwasy części 5'bakteryjnej acetylotransferazy chloramfenikolowej (CAT152). Z częściową sekwencją DNA CATI52 sprzęga się syntetyczny fragment genu, kodujący 34 aminokwasy podobnego do ludzkiego SP-C (FF/I). Funkcyjnąjednostkę transkrypcyjnąCAT::SPC (FF/I) zamyka się bakteryjną rmB sekwencją terminatorową transkrypcji T1T2. Otrzymanemu tak konstruktorowi nadaje się oznaczenie pTRpAmpCAT152::SPC34 (FF/I).

Wektor pTrpAmpCATl52::SPC34 (FF/I) zawiera następujące elementy funkcyjne:

- gen CATTTT152::SPC34 (FF/I), kontrolowany przez promotora Trp i terminatora transkrypcji T1T2,

- region ori i regiony sąsiednie, kontrolujące liczbę kopii plazmidu,

- Gen Amp®.

Po wprowadzeniu plazmidu do komórki-gospodarza, rozporządza ona dużą liczbą kopii kontrolowanego przez promotora Trp genu CAT::SPC (FF/I). Represor Trp dostarczany jest przez samąkomórkę-gospodarza.

Otrzymywanie rCAT::SPC na drodze fermentacyjnej reguluje się ustalaniem odpowiedniego stężenia tryptofanu w podłożu, lub dodawaniem β-ΙΑΑ (kwasu β-indoliloakrylowego).

2. Fermentancja periodyczna

Podłoże hodowlane (o składzie podanym w dalszej części niniejszego opisu) znajdujące się we wstrząsanej kolbie, zaszczepia się zawartością probówki z Working Celi Bank (hodowla glicerynowa) (hodowla wyjściowa lub wstępna-1 litr). Następnie przeprowadza się inkubację przy wytrząsaniu w temperaturze 37°C pod silnym ciśnieniem selekcyjnym amplicyliny. Wzrost śledzi się pomiarem gęstości optycznej przy 578 nm. Po osiągnięciu przez wyjściową hodowlę E. coli 199 gęstości optycznej ponad 3, hodowlą tą zaszczepia się 10-litrowy fermentor i prowadzi się inkubację bakterii pod obniżonym ciśnieniem selekcyjnym ampicyliny. Po osiągnięciu gęstości optycznej 5 do 6,10-litrową hodowlę (hodowlę wstępną) przenosi się do fermentora 100-litrowego i inkubację prowadzi się w takich samych jak wyżej warunkach. Po osiągnięciu wystarczającego poziomu wzrostu bakterii indukuje się, za pomocą wprowadzenia, na przykład, β-ΙΑΑ w ilości 40 mg/litr, tworzenie jednostki transkrypcyjnej CAT::SPC (FF/I) kontrolowanej

181 234 przez promotora Trp. Po indukcji fermentację kontynuuje się w ciągu 4-5 godzin, po czy dokonuje się zbioru komórek.

Podczas fermentacji mierzy się i reguluje w sposób bezpośredni („on-line”) takie parametry procesu, j ak ciśnienie cząstkowe tlenu (pO₂), wartość pH i temperatura brzeczki fermentacyj nej. Wartość pH utrzymuj e się na stałym poziomie za pomocą dodawania NaOH, a regulacj i ciśnienia cząstkowego tlenu (pO₂) dokonuje się za pomocą doprowadzania tlenu i przez zmianę liczby obrotów mieszadła. W sposób pośredni („off-line”) mierzy się gęstość optycznąprzy 578 nm i stężenie źródła węgla w podłożu. Tworzenie się piany wychwytuje się przy użyciu czujnika do piany, poprzez który ewentualnie dozuje się do fermentora środekprzeciwpieniący w celu zgaszenia piany.

Z brzeczki fermentacyjnej, w rozmaitych momentach, pobiera się próbki brzeczki hodowlanej . Po przeprowadzeniu lizy bakterii, białka E. coli (w celu kontrolowania ekspresji) rozdziela się w żelupoliakryloamidowym i barwi. Metodą densytometry czną ustala się procentowy udział (dominującego) białka w całkowitym białku E. coli. W krótkim czasie po indukcji genu rekombinantowego pojawia się nowe dominujące pasmo białka (rCAT::SPC).

Podłoże hodowlane ma skład następujący:

- Pepton sojowy 27,0 g/litr

- Autolizat drożdżowy KAV 14,0 g/litr

- NaCł 5,0 g/litr

- K₂HPO₄-3H₂O 6,0 g/litr

- K₂HPO₄ 3,0 g/litr

- MgSO₄-7H₂O 0,5 g/litr

- Gliceryna (99,5%) 30,0 g/litr

- Środek przeciwpieniący J673 (Struktol Comp.) 0,2 ml/litr

- L-Tryptofan 80,0 mg/litr

- Ampicylina (w przypadku hodowli wyjściowej): 20,0 mg/litr (w przypadku hodowli wstępnej i fermentora 100-litrowego): 5,0 mg/litr

Przed wyjałowieniem w autoklawie całości podłoża, jego pH doprowadza się do wartości 6,8 przy użyciu 2N NaOH. W przypadku prowadzenia hodowli wstępnej w fermentorze 10-litrowym ustala się parametry jak następuje: szybkość obrotów mieszadła 750 obr./min, doprowadzenie powietrza 10 litrów/min, temperatura 37°C. W przypadku prowadzenia głównej hodowli w fermentorze 100-litrowym parametry ustala się jak następuje: szybkość obrotów mieszadła 400 obr./min, doprowadzanie powietrza 70 litrów/min, temperatura 37°C. W razie potrzeby, wprowadza się poprzez przegrodę, przy użyciu strzykawki do jednorazowego użytku, środek przeciwpieniący.

Po upływie około 4 godzin od zaindukowania, wydziela się komórki z brzeczki fermentacyjnej za pomocą sączenia i/lub wirowania. Wilgotną masę komórek zbiera się w zbiorniku ze stali nierdzewnej, dodaje 10 litrów buforu roztwarzającego (pH 8,0) i całość miesza przez noc (16 godzin) w pokoju chłodni, w temperaturze 4°C. Zawiesinę komórek po wymieszaniu poddaje się roztwarzaniu w homogenizatorze wysokociśnieniowym (> 700 barów),w temperaturze pokojowej, po czym ponownie gromadzi w jałowym zbiorniku ze stali nierdzewnej, a następnie bezzwłocznie zbiera się ciałka wtrętowe za pomocą sączenia i/lub wirowania (wirówka Sorvall RC2-B, 27000 x g), w temperaturze 4°C. Następnie osad zawiesza się w około 1 litrze buforu, po czym wprowadza, na przykład w porcjach 350 ml, do 1 -litrowych kolb okrągłodennych i liofilizuje w ciągu 96 godzin. Z jednej fermentacji przeprowadzonej w skali 100 1 uzyskuje się około 200 g suchych ciałek wtrętowych o zawartości ponad 20% wag. białka sprzężonego. Zliofilizowane ciałka wtrętowe zachowujątrwałość przy przechowywaniu w temperaturze -20°C w ciągu miesięcy.

3. Rozszczepianie białek sprzężonych i oczyszczanie lipofilowego peptydu SP-C (FF/I)

W 1,6 litra 8 M roztworu 917,1 g chlorowodorku guanidyny rozpuszcza się, przy lekkim ogrzewaniu, 100 g suchych ciałek wtrętowych. Nierozpuszczonąpozostałość odsącza się na karbowanym sączku. W celu przeprowadzenia rozszczepienia białek sprzężonych w miejscu

181 234 złączenia Asn-Gly, wprowadza się do roztworu 167 g chlorowodorku hydroksyloaminy, po czym pH utworzonego roztworu doprowadza się do wartości 9,6 przy użyciu 2 N NaOH. Roztwór, w którym dokonuje się rozszczepienia, pozostawia się, przy mieszaniu, na 3-4 dni w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji wytrąca się SP-C (FF/I) za pomocą wprowadzenia 6,4 litra buforu Tris (pH 8,0) i osadza przez odwirowanie (wirówka Sorvall RC2-B, 20000 x g). Supematant dekantuje się, a osad SP-C ponownie zadaje się 400-500 ml buforu Tris i w takich samych warunkach wiruje w ciągu 30 minut.

Osad SP-C rozpuszcza się w 3,5 litra zakwaszonej kwasem solnym mieszaniny chloroformu i metanolu o składzie: 1,75 litra CHC1₃ +1,75 litra CH₃OH + około 30 ml 2 N HC1. Tak utworzony roztwór surowego SP-C poddaje się dalszemu oczyszczaniu metodąpreparatywnej HPLC (na materiale do chromatografii z odwróconymi fazami C-8). Ekstrakt chloroformowo-metanolowy rozcieńcza się 90% metanolem w stosunku mniej więcej 1:2, po czym nanosi na kolumnę do preparatywnej HPLC. Przy użyciu tego roztworu daje się obciążyć kolumnę, na przykład o średnicy 5 cm, około 400 mg SP-C (FF/I) (na przykład używając 2 litrów rozcieńczonego ekstraktu surowego). Następnie przeprowadza się elucję SP-C (FF/I) w warunkach kwasowych (pH 2-3), przy użyciu gradientów woda/izopropanol (patrz: warunki przeprowadzania rozdziału). Po upływie około 30 minut chromatografii zbiera się 4-6 200 ml frakcji w przedziale, w którym eluuje się SP-C (detekcja UV przy 220 nm). Frakcje te poddaje się badaniu metodą analitycznej HPLC i odpowiednio do wyników puluje. W przypadku, gdy próbki mają być odłożone na później, zamraża się je w ciekłym azocie i przechowuje w chłodni niskotemperaturowej w temperaturze -80°C. Otrzymuje się SP-C (FF/I) o czystości w zakresie od 98,5 do 99,5%.

Warunki przeprowadzania rozdziału.

Kolumna Kromasil C8 100 A 16 μ 300 mm * 50 mm φ wewn.

Eluent A: HPLC-woda (z urządzenia Millipore)

B: gradient liniowy i-PrOH

C: 60 mmoli/litr HC1 (rozcieńczenie z kwasu solnego dymiącego).

Gradient:	Czas	%A	%B	%C	Przepływ (ml/min)
	0	45	50	5	100
	10	45	50	5	100
	55	0	95	5	100
	65	0	95	5	100
	75	45	50	5	100
	85	45	50	5	100
	90	45	50	5	0,2

4. Wbudowanie SP-C (FF/I) w matrycę fosfolipidówą

Do roztworu lipofilowego peptydu SP-C (FF/I) w izopropanolu wprowadza się składniki matrycy fosfolipidowej i za pomocą wtryskiwania do rozcieńczonego [0,065% (wag./wag)] roztworu chlorku sodowego, w temperaturze pokojowej, wytrąca w jednorodną mieszaninę peptydu i składników matrycy fosfolipidowej. Z zawiesiny surfaktanta płucnego wydziela się LSF z zastosowaniem wirówki probówkowej, po czym zawiesza się go w roztworze elektrolitów (NaCl, CaCIj) i pH doprowadza do wartości 6,5 przy użyciu 0,1 N NaOH. Tak otrzymanym roztworem wodnym napełnia się 20 ml fiolki i przeprowadza liofilizację. Wskazówki podane w następującym przykładzie wytwarzania, odnoszące się do ciężarów i objętości, dotyczą wytwarzania 10 g preparatu surfaktanta płucnego.

W 200 ml 90% izopropanolu rozpuszcza się, w temperaturze 40°C, 7,00 g dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC), 3,08 g soli amoniowej palmitoilooleilofosfatydyloglicerolu (POPG x NH₄) i 0,25 g kwasu pahnitydonowego, po czym tak utworzony roztwór ochładza do temperatury pokoj owej. Otrzymany roztwór fosfolipidu łączy się z 1 litrem roztworu otrzymanego po oczyszczaniu metodąHPLC i zawierającego 200 mg oczyszczonego SP-C (FF/I), po czym pH otrzymanego tak „roztworu wtryskowego” doprowadza się do wartości 4,5 za pomocą dodania, przy mieszaniu, około 5 ml 5% roztworu wodorowęglanu sodowego.

181 234 „Roztwór wtryskowy” wprowadza się, przy energicznym mieszaniu, w temperaturze pokojowej , z szybkością wtryskiwania wynoszącą25 ml/min, poprzez dyszę rozpyłową do 9,6 litra 0,065% (wag./wag.) roztworu NaCl. Powstaje opalizujący roztwór, z którego, po upływie 2 godzin odstawienia w temperaturze 4-8°C, wytrąca się preparat surfaktanta płucnego za pomocą wtryskiwania roztworu elektrolitu (3,0 g CaCl₂ -2 H₂O i 61,3 g NaCl w 300 ml H₂O). Zawiesinę surfaktanta płucnego (całkowita objętość 10,8-11,0 litra) przetrzymuje się przez noc w temperaturze 4°C, po czym wiruje przy użyciu wirówki probówkowej Sorvall (RC2-B) przy 16000 x g, w ciągu mniej więcej 30 minut. W celu usunięcia resztkowych ilości przywartego izopropanolu, osad ponownie zawiesza się w połowie objętości 0,65% roztworu chlorku sodowego i ponownie wiruje. Postępowanie takie powtarza się ogółem 3-4 razy. Osad po ostatnim wirowaniu rozpuszcza się w 400 ml 0,65% roztworu NaCl, po czym pH tak otrzymanego roztworu doprowadza się do wartości 6,5 przy użyciu 0,1N NaOH. Roztwór, w porcjach po 6,2 g, rozdozowuje się do 20 ml fiolek. Zawartość fiolek poddaje się liofilizacji w następujący sposób:

- zamrażanie w ciągu 6 godzin, w temperaturze -45 °C, pod normalnym ciśnieniem,

- suszenie ze stanu zamrożenia w ciągu 54 godzin pod ciśnieniem 0,16 mbara, w temperaturze -20°C,

- intensywne suszenie w ciągu 5 godzin, pod ciśnieniem 0,02 mbara, w temperaturze -20°C.

Otrzymuj e się w ten sposób 65-66 fiolek zawierających po 0,150 g surfaktanta płucnego (w przeliczeniu nie uwzględnia się NaCl).

Wysuszone próbki surfaktanta płucnego przechowuje się w zamrażalce szafkowej, w temperaturze 4°C. Przed użyciem należy je zawiesić w wodzie lub fizjologicznym roztworze chlorku sodowego (stężenie zawiesiny wynosi 25 mg/ml).

Jedna fiolka zawiera następujące ilości składników:

- Dipalmitylofosfatydylocholina 95,6 mg

- Palmitoilooleilofosfatydyloglicerol (sól amoniowa) 42,1 mg

- SP-C (FF/I) 2,7 mg

- Kwas palmitynowy 6,8 mg

- Chlorek wapniowy (bezwodny) 2,9 mg

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Polipeptydy o aktywności surfaktanta płucnego o wzorze ogólnym I:

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (A) Gly Ile Pro B B Pro Val His Leu Lys 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val (I) 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu

31 32 33 34

Leu C Gly Leu w którym A oznacza H lub Phe, B oznacza Phe lub Trp, a C oznacza Ile, Leu lub Ser.
2. Polipeptydy według zastrz. 1, znamienne tym, że A oznacza H lub Phe, B oznacza Phe, a C oznacza Ile.
3. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że A oznacza Phe, B oznacza Phe, a C oznacza Ile.
4. Polipeptydy według zastrz. 1, znamienne tym, że A oznacza Η, B oznacza Phe, a C oznacza Ile.
5. Kompozycja farmaceutyczna przeznaczona do leczenia zespołów ostrej niewydolności oddechowej (RDS) u ssaków, znamienna tym, że zawiera polipeptydy o aktywności surfaktanta płucnego o wzorze ogólnym I

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (A) Gly Ile Pro B B Pro Val His Leu Lys 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val (I) 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu

31 32 33 34

Leu C Gly Leu w którym A oznacza H lub Phe, B oznacza Phe lub Trp, a C oznacza Ile, Leu lub Ser.
6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera plipeptyd o wzorze 1, w którym A oznacza H lub Phe, B oznacza Phe, a C oznacza Ile.
7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera plipeptyd o wzorze 1, w którym A oznacza Phe, B oznacza Phe, a C oznacza Ile.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera plipeptyd o wzorze 1, w którym A oznacza Η, B oznacza Phe, a C oznacza Ile.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera jeszcze co najmniej jeden polipeptyd o aktywności surfaktanta płucnego, pochodzącego z grupy SP-A i SP-B.
10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera SP-B.

181 234
11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5 albo 9, znamienna tym, że zawiera fosfolipidy.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera dipalmitoilofosfatydylocholinę (DPPC), palmitoilooleilofosfatydyloglicerol (POPG) i/lub fosfatydyloglicerol (PG).
13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera kwas palmitynowy i elektrolity.
14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 13, znamienna tym, że jako elektrolity zawiera sole wapniowe i/lub sole sodowe.

* * *

Wynalazek dotyczy polipeptydów o aktywności surfaktanta płucnego i zawierających je kompozycji farmaceutycznych.

Płuco wszystkich kręgowców zawiera mieszaninę substancji określanąjako „surfaktant płucny”. Wykazuje ona właściwości środka powierzchniowo czynnego i obniża napięcie powierzchniowe w obrębie pęcherzyków płucnych tak dalece, że umożliwia uniknięcie zapadania się końcowego obszaru dróg oddechowych przy wydechu. Ta mieszanina substancji reguluje napięcie powierzchniowe w sposób dynamiczny dzięki czemu, zgodnie z prawem Laplace'a, unika się zapadnięcia się małych pęcherzyków płucnych na korzyść większych, dzięki odpowiedniemu dostosowaniu się napięcia powierzchniowego. W rezultacie, powstaje dobrze zrównoważona, histologicznie i fizjologicznie stabilna struktura płuca.

Surfaktant płucny jest wydzielany przez pneumocyty typu II (alveolaren) pęcherzyków płucnych w postaci ciałek blaszkowatych (lamellar bodies). Sąto zwarte jednostki złożone z podwójnych warstw fosfolipidowych (bilayem), z wysokim udziałem dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) i fosfatydyloglicerolu (PG). Dalszymi istotnymi składnikami surfaktanta płucnego są białka, określane jako SP-A, SP-B i SP-C. SP-Ajestto glikoproteina o dużej masie cząsteczkowej, odgrywająca rolę w regulacji wydzielania. Białka SP-C i (w mniejszym zakresie) SP-B przejmują w tworzeniu monomolekułamej błonki powierzchniowej (w ściślejszym sensie surfaktanta) rolę „katalizatorów termodynamicznych”. Dzięki obecności tych białek kinetyka rozkładu ulega ogromnemu przyspieszeniu. Dopiero dzięki temu możliwe jest bezzwłoczne dopasowanie składu surfaktanta do każdorazowych wymogów napięcia powierzchniowego. Właściwości te odzwierciedlają się w nadzwyczaj hydrofobowym charakterze białka, zwłaszcza SP-C.

Za pomocą ekstrakcj i tkanki płucnej lub wypłukania płuc zwierzęcych można uzyskać preparaty surfaktanta, które zarówno w badaniach z użyciem pomiarowej aparatury do oznaczeń fizyko-chemicznych (jak ma to miejsce, na przykład, w przypadku modeli zwierzęcych) jak i w zastosowaniach klinicznych, wykazują zdolność wyrównywania niedoboru surfaktanta, a przez to nadają się, na przykład, do leczenia zespołu ostrej niewydolności oddechowej noworodków (IRDS). Jednakże, tego rodzaju preparaty pochodzenia zwierzęcego odznaczają się poważnymi wadami omówionymi poniżej.

Skład fosfolipidowy w znacznym stopniu zależy od rodzaju, stanu zdrowia i odżywienia danego zwierzęcia i tylko w ograniczonym zakresie może być zrównoważony przez domieszanie określonych komponentów. Zawartość surfaktantowych białek, jak również wzajemny stosunek ilościowy SP-B/SP-C również podlegają wspomnianym niepewnościom. Dochodzi do tego ta możliwość, że w mieszaninie zastosowanej w celach terapeutycznych zawarte będą również, ewentualnie powstałe, produkty roteolitycznego rozkładu białek lub zmodyfikowane pochodne (utworzone, na przykład, w wyniku utlenienia przy metioninie). W przypadku ewentualnie występującej potrzeby leczenia trwającego przez czas dłuższy, albo w przypadku konieczności podawania większych ilości surfaktanta, j ak ma to miej sce, na przykład, w przypadku zespołu ostrej stresowej niewydolności oddechowej dorosłych (płuco wstrząsowe, ERDS), lub w przypadku stosowania w innych dziedzinach jak, na przykład, przy wykorzystywaniu surfaktanta jako „ho

181 234 lownika” innych substancji przy podawaniu do płuc, otwarte pozostaje zagadnienie dostarczania wspomnianych substancji.

Dlatego też, proponuje się rozwiązanie tych problemów na drodze wytworzenia odnośnych białek z wykorzystaniem metod inżynierii genetycznej. Ponieważ białka rekombinantowe, w szczególności przy zastosowaniu bakteryjnych systemów ekspresyjnych, można wytwarzać w praktycznie nieograniczonym zakresie, a obecnie dostępne są także nowoczesne metody analityki i kontroli jakościowej wytwarzanych produktów, możliwe jest, przy zastosowaniu syntetycznego fosfolipidu, wytworzenie surfaktanta o dokładnie zdefiniowanym składzie. Produkt ten można dostosować do wymagań terapeutycznyh w sposób optymalny.

Ludzkie białko SP-C (patrz: wzór I, w którym A = H lub Phe, B = Cys, a C = Met), które jest szczególnie ważne dla kinetyki rozkładu, składa się w swej części środkowej wyłącznie z alifatycznych, bardzo hydrofobowych aminokwasów, takich jak walina, leucyna i izoleucyna. Długość tej części środkowej (aminokwasy 12-34) umożliwia integrację peptydów z monomolekulamąbłonkąfosfolipidową. W sekwencji Pro-Cys-Cys-Pro (pozycja 3-6) obie reszty Cys ulegają zachodzącej z udziałem kwasu palmitynowego tioestryfikacji w grupach SH._: Kwas palmitynowy wzmacniajeszcze hydrofobowy charakter całego białka, blokując równocześnie obie grupy SH cysteiny, co zabezpieczaje przed utlenieniem i tworzeniem mostka disulidowego. Region środkowy (aminokwasy 13-34) wykształca transmembranowy heliks. Region ten jest oflankowany przy N-końcu polarną sekwencją zawierającą dodatnio naładowane aminokwasy (Lys, 10; Arg, 11).

W WO 91/18015 opisano wytwarzanie rekombinantowego SP-C i mutantów SP-C. Zaproponowano tam, między innymi, zastąpienie obu cyStein w pozycjach 4 i 5 dwiema serynami. W przypadku wytwarzania daje to tę korzyść, że po wyodrębnieniu bardzo hydrofobowego białka odpada konieczność dokonania (wymagającego znacznych nakładów technicznych) wprowadzania grupy palmitoilowej do obu cystein.

Obecnie niespodziewanie stwierdzono, że mutanty SP-C różniące się od ludzkiego SP-C tym, że zastąpiono w nich obie cysteiny w pozycjach 4 i 5 fenyloalaniną lub tryptofanem, a metioninę w pozycji 32 izoleucyną leucyną lub seryną w najmniejszym nawet stopniu nie wykazują utraty aktywności w porównaniu z naturalnym ŚP-C, a nawet znacznie przewyższaj ąje pod względem trwałości. Sposób wytwarzania z zastosowaniem inżynierii genetycznej jest znacznie prostszy i zapewnia uzyskanie wyższej wydajności. Sposobem tym można wytwarzać nowe polipeptydy wykazujące aktywność surfaktanta płucnego, a do tego odznaczające się wysokim stopniem czystości.