ES2227548T3

ES2227548T3 - Analogos peptidicos sinteticos de la proteina de la superficie pulmonar sp-c.

Info

Publication number: ES2227548T3
Application number: ES95920906T
Authority: ES
Inventors: Rudiger Nave; Wolf-Rudiger Ulrich; Ernst Sturm; Uwe Kruger; Dietrich Hafner; Klaus P. Schafer; Klaus Melchers
Original assignee: Altana Pharma AG
Current assignee: Takeda GmbH
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-27
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2015-05-27
Also published as: BG101028A; HK1000891A1; KR100355626B1; NZ287447A; CZ350296A3; JP3359638B2; FI964766A0; NO965052D0; KR970703367A; PL181234B1; HU220191B; HUT76952A; BR9507811B1; NO317149B1; DE59510941D1; DK0764172T3; CY2552B1; UA35636C2; EP0764172A1; FI964766A7

Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS POLIPEPTIDOS DE FORMULA (I), EN DONDE A ES H O PHE, B ES PHE O TRP Y C ES ILE, LEU O SER, QUE TIENEN ACTIVIDAD COMO TENSIOACTIVOS PULMONARES, QUE SE PUEDEN OBTENER EN GRANDES CANTIDADES Y CON UNA PUREZA MUY ELEVADA, Y QUE TIENEN UNA EFECTIVIDAD IGUAL A LOS TENSIOACTIVOS NATURALES PULMONARES. SON APROPIADOS PARA LA OBTENCION DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DEL SINDROME DE DISNEA EN PREMATUROS Y ADULTOS.

Description

Análogos peptídicos sintéticos de la proteína de la superficie pulmonar SP-C.

Campo técnico

La invención se refiere a un polipéptido surfactante pulmonar activo, el procedimiento para su preparación y la composición terapéutica que contiene.

Estado de la técnica

El pulmón de todos los animales vertebrados contiene una mezcla de sustancias que se denomina "surfactante pulmonar". Muestra propiedades de actividad superficial y disminuye la tensión superficial en la zona alveolar de los pulmones hasta que evita un colapso de la zona de las vías respiratorias finales en la expiración. Esta mezcla de sustancias regula la tensión superficial de forma dinámica, de manera que se evita el colapso de los pequeños alvéolos a favor de los mayores esperable según la ley de Laplace mediante el ajuste correspondiente de la tensión superficial. Así, se obtiene como resultado una estructura pulmonar completamente equilibrada, histológica y fisiológicamente estable.

El surfactante pulmonar es segregado por los pneumocitos alveolares de tipo II en forma de corpúsculos laminares (cuerpos laminares). Éstas son unidades compactas de capas dobles de fosfolípidos (bicapas) con una elevada proporción en dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y fosfatidilglicerina (PG). Están contenidos en el surfactante pulmonar como otros componentes esenciales las proteínas denominadas SP-A, SP-B, SP-C. La SP-A es una glicoproteína de elevado peso molecular que juega un papel decisivo en la regulación de la secreción.

En la formación de la película superficial monomolecular (del surfactante en el más estricto sentido) las proteínas SP-C y en menor medida la SP-B desempeñan el papel de "catalizadores termodinámicos". A través de la presencia de estas proteínas se acelera enormemente la cinética de propagación. De este modo, es posible el ajuste sin retraso de la composición de surfactante a las respectivas necesidades de tensión superficial. Estas propiedades se reflejan en el carácter hidrófobo extremo de las proteínas, especialmente de la SP-C.

Mediante la extracción de tejido pulmonar o el lavado de pulmones de animales se pudieron obtener preparaciones de surfactante que, tanto en aparatos de medida físico-químicos, como en modelos animales, como también en la aplicación clínica, muestran la capacidad de compensar una falta de surfactante y con ello son apropiados, por ejemplo, para la terapia del síndrome de disnea respiratoria infantil (IRDS). Sin embargo, estos preparados animales poseen debilidades graves:

La composición del fosfolípido es fuertemente dependiente de la especie animal, la salud y la condición alimenticia del animal y sólo se puede comparar limitado por la adición de compuestos definidos. El contenido en proteínas surfactantes, así como la relación SP-B/SP-C está sujeto a las mismas inseguridades. A esto se añade que la mezcla empleada terapéuticamente también puede contener productos eventuales de descomposición proteolítica de las proteínas o derivados modificados (por ejemplo, por oxidación en la metionina). La cuestión del aporte de sustancias está abierta en una aplicación a más largo plazo o en la aplicación de cantidades mayores de surfactante, como podría ser necesario, por ejemplo, en el síndrome de disnea respiratoria adulta (shock pulmonar, ARDS) o en otros campos de aplicación, como por ejemplo el uso del surfactante como "remolcador" para otras sustancias en una aplicación pulmonar.

Por eso, se ofrece solucionar este problema mediante la preparación de proteínas por vía de la técnica genética. Como las proteínas recombinantes, especialmente mediante el uso de sistemas de expresión bacteriana, se pueden preparar prácticamente en cantidades ilimitadas y es posible la aplicación de procedimientos de análisis modernos y controles de calidad, mediante el uso de fosfolípidos sintéticos se puede preparar un surfactante con composición exactamente definida. Ésta se puede ajustar de forma óptima a los requerimientos terapéuticos.

La proteína SP-C humana (véase fórmula I, con A=H o Phe, B=Cys y C=Met), que es especialmente importante para la cinética de propagación, se compone en su parte central exclusivamente de aminoácidos alifáticos muy hidrófobos, como valina, leucina e isoleucina. La longitud de esta parte central (aminoácidos 12-34) permite la integración del péptido en la película de fosfolípido monomolecular. En la secuencia Pro-Cys-Cys-Pro (posición 3-6), ambos restos Cys están tiotransesterificados mediante ácido palmítico en los grupos SH. El ácido palmítico aumenta más el carácter hidrófobo de las proteínas del conjunto y encierra simultáneamente ambos grupos SH de la cisteína y los protege de la oxidación y la formación de puentes disulfuro. La región central (aminoácidos 13-34) forma una hélice trans-membrana. Esta región está flanqueada en el extremo N por una secuencia polar que contiene aminoácidos cargados positivamente (Lys, 10; Arg, 11).

En el documento WO 91/18015 se describe la preparación de SP-C recombinante y mutantes de SP-C. Allí se recomienda, entre otras cosas, reemplazar ambas cisteínas en posición 4 y 5 por dos serinas. En la preparación esto tiene la ventaja de que evita la palmitoilización técnicamente costosa de ambas cisteínas tras el aislamiento de las proteínas muy hidrófobas.

Descripción de la invención

De forma sorprendente se encontró que los mutantes de SP-C que se diferencian de la SP-C humana por el reemplazo de ambas cisteínas en las posiciones 4 y 5 por fenilalanina o triptófano y el reemplazo de la metionina en la posición 32 por isoleucina, leucina o serina, no presentan ningún tipo de pérdidas funcionales frente a la SP-C natural e incluso superan a ésta en lo referente a estabilidad. La preparación por técnica genética es considerablemente más sencilla y produce rendimientos mayores. Los nuevos polipéptidos con actividad surfactante pulmonar se pueden preparar con pureza muy elevada.

Por eso, son objeto de la invención los polipéptidos con actividad surfactante pulmonar con una secuencia de aminoácidos según la fórmula general I,

1

en la que

A, representa H o Phe,

B, Phe o Trp y

C, Ile, Leu o Ser.

Son objeto preferible de la invención los polipéptidos de fórmula general I, en la que A representa H o Phe, B Phe y C Ile, en la que los significados A = H, B = Phe y C = Ile son especialmente preferibles.

Otro objeto de la invención son las composiciones farmacéuticas que se caracterizan por un contenido de uno o varios polipéptidos según la invención y, en un caso deseado, contienen adicionalmente uno o varios polipéptidos surfactantes pulmonares activos del grupo SP-A y SP-B, preferentemente SP-B.

Los polipéptidos según la invención se pueden preparar mediante los procedimientos conocidos de síntesis peptídica en fase sólida o con ayuda de los correspondientes vectores recombinantes en células huésped. Las técnicas para construir vectores, transformar células, activar la expresión de las proteínas en las células transformadas y aislar y purificar las proteínas expresadas, son conocidas por el experto (por ejemplo, los documentos WO 86/03408, WO 87/06588 y WO 91/18015). La preparación de vectores para la expresión de SP-C en sistemas bacterianos recurre a procedimientos convencionales de la tecnología de ADN recombinante.

La expresión de la proteína SP-C hidrófoba en bacterias sólo es posible en mayor cantidad y sin daños para la célula huésped en forma de proteínas de fusión apropiadas, como por ejemplo, junto con la cloramfenicolacetiltransferasa (CAT). Por ejemplo, codifica el vector pTrpAmpCAT152 para la región N-terminal de CAT y ofrece lugares de corte (5')EcoR1 y (3')Pst1 para la clonación "in frame" de fragmentos de ADN que codifican para SP-C. Además, CAT y SP-C están unidas entre sí sobre el plano de la proteína a través de un lugar de fusión (AsN\downarrowGly) sensible a la hidroxilamina. Tales vectores, como pTrpAmpCAT152::SPC permiten la expresión controlada de las correspondientes proteínas de fusión hasta a escala de producción (fermentación). La expresión de las proteínas de fusión activa la formación de cuerpos de inclusión en la célula huésped. Así, la longitud de la proporción de CAT en la proteína de fusión se puede cambiar de manera que se obtengan elevados rendimientos en cuerpos de inclusión para proporción de SP-C elevada.

La expresión se puede realizar en multitud de sistemas huésped aparte de las bacterias, como por ejemplo, en células de mamíferos, levaduras e insectos. Las construcciones de ADN apropiadas para las diferentes células huésped se sintetizan según los procedimientos conocidos y se insertan de manera habitual con las secuencias control correspondientes en el genoma de células huésped.

Dos oligonucleótidos de ADN se pueden sintetizar según el procedimiento de fosforamidita convencional en un sintetizador de ADN MilliGen/ Biosearch Cyclone.

El primer oligonucleótido de ADN forma la cadena de ADN sentido con una longitud de 118 nucleótidos. Ésta codifica (en dirección 5'\rightarrow3') para un extremo 5' Eco R1 específico para posterior sub-clonación, el lugar de rotura de hidroxilamina Asn/Gly y la SP-C humana que empieza con Gly-25 y acaba con Leu-58 de la secuencia precursora de SP-C, correspondiente a Gly-1 y/o Leu-34 en la fórmula I. Además, la secuencia de aminoácidos conocida de la proteína SP-C humana se transcribe en el ADN según las reglas del código genético. Sin embargo, la secuencia se modifica de manera que las dos cisteínas en posición 28 y 29 de la secuencia precursora de SP-C se reemplazan por fenilalanina o por triptófano y la metionina en posición 56 de la secuencia de la proteína precursora se reemplaza por isoleucina, leucina o serina. Adicionalmente se pueden considerar también de esta manera las frecuencias de uso de codón de las células huésped. Una secuencia de SP-C cambiada que contiene fenilalanina en las posiciones 4 y 5 e isoleucina en la posición 32 (numeración según la fórmula I) se designa con SPC34(FF/I) según el código de mayúsculas habitual para estos dos aminoácidos. Además, la cadena de ADN sentido contiene un codón de parada TAA para terminar la translación ribosómica, así como un extremo 3' Pst 1 específico. El segundo oligonucleótido de ADN representa la cadena complementaria no codificante (anti-sentido), compuesta por 110 nucleótidos.

El fragmento de ADN de SP-C preparado sintéticamente se clona en un vector de expresión apropiado, como por ejemplo pTrpAmpCAT152. Este vector se compone de pKK233 (Pharmacia) que contiene resistencia genética a la ampicilina y es un derivado de pBR322. El promotor trc se puede reemplazar por un promotor trp, como en pTrpAmpCAT152. También se pueden emplear otros promotores inducibles.

Para la sub-clonación del fragmento SP-C en primer lugar se hibridan entre sí los oligonucleótidos de ADN complementarios. La doble cadena de ADN resultante de esto presenta extremos de cadena sencilla sobresalientes (Eco R1/Pst 1).

La inserción en el vector de ADN se realiza de forma habitual por digestión Eco R1/Pst 1 del vector de ADN, purificación de los fragmentos de ADN deseados mediante electroforesis de gel de agarosa y mediante hibridación del ADN de SP-C y del fragmento del vector a través de los extremos cohesivos. A continuación, ambos fragmentos se acoplan covalentemente entre sí por ligación según procedimientos conocidos.

Para la amplificación del ADN y el aislamiento del plásmido se transforma, según protocolos corrientes, por ejemplo en células E.coli MM294 cloruro cálcico-competentes y para la selección de células portadoras del plásmido se siembra sobre placas de agar LB con ampicilina. El plásmido de ADN se aísla de las colonias resistentes a la Amp obtenidas y éste se analiza con combinaciones apropiadas de enzimas de restricción. Se seleccionan los clones con el modelo de fragmento de restricción de ADN esperado. Mediante una secuenciación completa de la secuencia del plásmido se comprueba la inserción correctamente realizada de la secuencia SPC34(FF/I).

Los vectores plasmídicos así obtenidos permiten la expresión de la proteína de fusión CAT::SPC bajo el control del promotor Trp (u otros promotores). La proteína de fusión recombinante penetra en las células huésped por inducción en forma de cuerpos de inclusión.

La proteína de fusión CAT152::SPC34(FF/I) presenta la secuencia de aminoácidos siguiente, representada en el código de mayúsculas habitual:

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Los 34 aminoácidos de SP-C(FF/I) en las posiciones 153 a 186 de la proteína de fusión se marcan mediante subrayado e indicación de las posiciones 1 a 34.

La rotura posterior con hidroxilamina para la separación de CAT y SP-C se realiza entre Asn-152 y Gly-153 (corresponde al primer aminoácido del péptido SP-C). La separación y purificación del péptido SP-C se realiza según los procedimientos habituales en química de proteínas.

Los polipéptidos según la invención se pueden poner a disposición solos o combinados entre sí en composiciones farmacéuticas que son adecuadas a los requerimientos del tratamiento de las vías respiratorias. Las composiciones no sólo son apropiadas para el tratamiento del síndrome de disnea en niños prematuros y adultos, sino también para el tratamiento de neumonías y bronquitis. Además, los polipéptidos según la invención son apropiados como vehículo para medicamentos administrables por inhalación.

Junto a los polipéptidos, las composiciones contienen fosfolípidos, preferiblemente fosfolípidos tales que se encuentran contenidos en composiciones de surfactante pulmonar naturales, como preferiblemente dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), palmitoiloleilfosfatidilglicerol (POPG) y/o fosfatidilglicerol (PG). Para el ajuste de una viscosidad adecuada, las composiciones contienen iones calcio o magnesio, así como cloruro sódico. El especialista se orienta por la medición del tipo y cantidad de componentes individuales de las composiciones, por un lado en la composición conocida de surfactante pulmonar natural y por otro lado en las numerosas propuestas según el estado de la técnica, como por ejemplo, los documentos EP-A 0119056 y EP-A 0406732.

Las composiciones preferibles según la invención contienen 80 a 95% en peso de fosfolípidos, 0,5 a 3,0% en peso de polipéptidos, 4 a 7% en peso de ácidos grasos, preferiblemente ácido palmítico, y 1 a 3% en peso de cloruro cál-
cico.

Ejemplo de preparación

1. Cepa de producción

La cepa de producción E.coli 199 usada deriva de la cepa MM294 de E.coli K12, a las que se puede hacer referencia con el nº 5208 de la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM, Braunschweig).

El vector de expresión pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I) que contiene el gen de la proteína de fusión CAT152::SPC
34(FF/I) derivó de la secuencia de ADN pBR322 de un derivado ColE1 [E.Weber (ed.)(1988), Seguridad biológica, Ministerio de Investigación y Tecnología, Bonn]. En el plásmido pKK233-2 que se puede obtener de Pharmacia se cortó el promotor Trc con Eco R1/Hind 3 y se reemplazó por un promotor Trp sintético (pTrp233). Este se compone de la región del promotor (lugar de unión para la ARN polimerasa), la región operadora (lugar de unión del represor Trp), la secuencia Shine/Da)garno (S/D), así como los lugares de restricción para la clonación. Detrás del promotor Trp se insertó el gen (CAT152) codificante para los 152 aminoácidos del extremo 5' de la cloramfenicol acetiltransferasa bacteriana. En la parte de la secuencia de ADN CAT152 se fusionó un fragmento de gen sintético, que codifica para 34 aminoácidos de la SP-C(FF/I) humana. La unidad de transcripción CAT::SPC(FF/I) funcional se cierra mediante la secuencia bacteriana rrnB terminadora de la transcripción T1T2. La construcción obtenida se designa por pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I).

El vector pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I) presenta los siguientes elementos funcionales:

-: el gen CAT152::SPC34(FF/I) controlado por el promotor Trp y el terminador de transcripción T1T2;

-: región ori y las regiones vecinas a través de las que se controla el número de copias del plásmido;

-: Gen Amp®

Tras la inserción del plásmido en la célula huésped ésta dispone de un elevado número de copias del gen CAT::SPC(FF/I) controlado por el promotor Trp. El represor Trp es aportado por la propia célula huésped.

La ganancia fermentativa de rCAT::SPC se controla mediante la concentración de triptófano en el medio y/o mediante la adición de \beta-IAA (ácido \beta-indolilacrílico).

2. Fermentación del lote

Mediante un tubo de ensayo del Working Cell Bank (cultivo de glicerina) se siembra el medio de cultivo (véase abajo la composición) en un matraz de agitación (1 l de pre-cultivo o cultivo iniciador) y se incuba a 37ºC bajo agitación y fuerte presión selectiva de ampicilina. El crecimiento se sigue mediante la densidad óptica a 578 nm. Cuando el cultivo iniciador E.coli 199 alcanza una densidad óptica mayor de 3, se siembra un fermentador de 10 l con el cultivo y continua el crecimiento de las bacterias bajo menor presión selectiva de ampicilina. Tan pronto como la densidad óptica alcanza un valor entre 5 y 6 se transfiere el cultivo de 10 l a un fermentador de 100 l y se sigue incubando bajo las mismas condiciones. Tras un crecimiento suficiente se induce la unidad de transcripción CAT::SPC(FF/I) controlada por el promotor Trp mediante la adición de, por ejemplo, 40 mg/l \beta-IAA. Tras la inducción se fermenta otras 4-5 horas hasta la recolección de las células.

Durante la fermentación se registran y regulan on-line la presión parcial de oxígeno (pO_{2}), el vapor de pH y la temperatura del caldo del fermentador. El valor de pH se mantiene constante con hidróxido sódico, la presión parcial de oxígeno (pO_{2}) se regula mediante la entrada de oxígeno y el número de revoluciones del agitador. Se determinan sin conexión la densidad óptica a 578 nm y la concentración de la fuente de C en el medio. La formación de espuma se registra con un sensor de espuma, a través del cual dado el caso se dosifica antiespumante para combatir la es-
puma.

En diferentes momentos de tiempo se toman alícuotas del caldo de cultivo. Tras la lisis de las bacterias, las proteínas de E.coli se separan y se tiñen en un gel de poliacrilamida para el control de la expresión. La parte porcentual de proteínas (dominantes) en la totalidad de proteínas de E.coli se determina densiométricamente. Poco después de la inducción del gen recombinante aparece una nueva banda de proteína dominante en (rCAT::SPC). El medio de cultivo presenta la siguiente composición:

27,0 g/l de peptona de soja, 14,0 g/l de autolisado de levadura KAV, 5,0 g/l de NaCl, 6,0 g/l de K_{2}HPO_{4} x 3 H_{2}O, 3,0 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4} x 7 H_{2}O, 30,0 g/l de glicerina (al 99,5%), 0,2 ml/l de antiespumante J673 (Struktol Comp.), 80,0 mg/l de L-triptófano y 20 mg/l de ampicilina para el 1º pre-cultivo y 5 mg/l para el 2º pre-cultivo y el fermentador de 100 L.

Antes del autoclavado y la esterilización del medio alimenticio complejo se ajusta el valor de pH a pH 6,8 con NaOH 2N. Para el pre-cultivo en el fermentador de 10 l se aplica una velocidad de agitación de 750 rpm y una entrada de aire de 10 l/min a 37ºC y para el cultivo principal en el fermentador de 100 l se aplica una velocidad de agitación de 400 rpm y una entrada de aire de 70 l/min a 37ºC. El agente antiespumante se añade según las necesidades con una única inyección a través de un séptum.

Aproximadamente 4 horas después de la inducción las células se separan del caldo de cultivo por filtración y/o centrifugación. La masa de células húmeda se recoge en un recipiente de acero especial y se agita durante la noche en el frigorífico (4ºC y 16 h) con 10 l de tampón de abertura (pH 8,0). La suspensión de células agitada se abre en un homogeneizador de alta presión (\geq700 bar)(temperatura ambiente) y se recoge de nuevo en un recipiente de acero especial. Los cuerpos de inclusión se recolectan inmediatamente a continuación mediante filtración y/o centrifugación (centrífuga Sorvall RC2-B, 27000 g) a 4ºC, se resuspenden en tampón (aprox. 1 L) y se transfieren, por ejemplo en porciones de aprox. 350 ml, a un balón de 1 l y se liofilizan durante aproximadamente 96 horas. De una fermentación de 100 l se obtienen aproximadamente 200 g de cuerpos de inclusión secos con un contenido en proteína de fusión de más del 20%. Los cuerpos de inclusión liofilizados son almacenables durante meses a unos -20ºC.

3. Rotura de la proteína de fusión y purificación del péptido lipófilo SP-C(FF/I)

Se disuelven 100 g de cuerpos de inclusión secos en 1,6 l de disolución 8 molar de hidrocloruro de guanidina (917,1 g) bajo calentamiento ligero. Los restos no disueltos se filtran a través de un filtro de pliegues. Para la rotura de la proteína de fusión en los lugares de unión Asn-Gly se añade a la disolución 167 g de cloruro de hidroxilamonio y el pH de la disolución se ajusta a 9,6 con NaOH 2N. La disolución de rotura se deja entonces durante 3-4 días a temperatura ambiente bajo agitación. Al final del tiempo de reacción precipita SP-C(FF/I) por adición de 6,4 l de tampón Tris (pH 8,0) y cae al fondo con ayuda de una centrífuga (centrífuga Sorvall RC2-B, 20000 g). Se decanta el sobrenadante, el sedimento de SPC se resuspende en 400-500 ml de tampón Tris y se vuelve a centrifugar bajo las mismas condiciones durante 30 minutos.

Se introduce el sedimento de SPC en 3,5 l de mezcla cloroformo/metanol hidroclórica (1,75 l CHCl_{3} + 1,75 l CH_{3}OH + unos 30 ml de HCl 2N). Esta disolución cruda de SP-C se vuelve a purificar mediante HLC preparativa sobre material de fase inversa C8. El extracto de cloroformo/metanol se diluye antes de introducirlo en la columna de HPLC preparativa con metanol al 90% en una relación aproximadamente 1:2. A partir de esta disolución se carga, por ejemplo, una columna (diámetro 5 cm) con aprox. 400 mg de SP-C(FF/I) (por ejemplo, con unos 2 l de extracto crudo diluido). El SP-C(FF/I) se eluye a condiciones ácidas (pH 2-3)con un gradiente agua/i-propanol (véanse las condiciones de separación). Después de aproximadamente 30 minutos de cromatografía se recogen 4-6 fracciones de 200 ml cada una en el intervalo en la que se eluye SP-C (detección UV a 220 nm). Estas fracciones se comprueban con el HPLC analítico y se reúnen correspondientemente. Si las muestras se tiene que almacenar, se conservan congeladas en nitrógeno líquido y en el congelador a -80ºC. El SP-C(FF/I) se obtiene con una pureza del 98,5-99,5%.

Condiciones de separación:

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3

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Gradiente:

4

4. Incorporación de SP-C(FF/I) en una matriz de fosfolípido

El péptido lipófilo SP-C(FF/I) se introduce en una disolución de i-propanol con los componentes de la matriz de fosfolípido y precipita mediante pulverizado en una disolución de sal común diluida (NaCl 0,065% p/p) a temperatura ambiente en mezcla homogénea con los componentes de la matriz de fosfolípido. De la suspensión de surfactante pulmonar se separa la LSF con una centrífuga de vasos, se resuspende en disolución de electrolitos (NaCl, CaCl_{2}) y el valor de pH se ajusta a pH 6,5 con NaOH 0,1 N. Se llenan viales de 20 ml con esta suspensión acuosa y se liofilizan. Los datos de volumen y peso dado en el siguiente ejemplo de realización se refieren a la preparación de 10 g de una preparación de surfactante pulmonar.

Se disuelven 7,00 g de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), 3,08 g de sal amónica de palmitoiloleilfosfatidil-glicerol (POPG x NH_{4}) y 0,25 g de ácido palmítico a 40ºC en 200 ml de i-propanol al 90% y entonces se enfría a temperatura ambiente. La disolución de fosfolípido obtenida se une con 1 l de una disolución que contiene 200 mg de SP-C(FF/I) purificado obtenida a partir de la purificación en HPLC. La "disolución de pulverizado" obtenida se ajusta a pH 4,5 mediante agitación con disolución de bicarbonato (unos 5 ml de disolución de NaHCO_{3} al 5%).

La "disolución de pulverizado" se introduce a temperatura ambiente con una velocidad de pulverizado de 25 ml/min sobre una tobera de un solo material en 9,6 l de disolución de NaCl diluida (0.065% p/p) bajo agitación intensa. Así se forma una disolución opalescente, a partir de la cual precipita tras almacenamiento de dos horas a 4º-8ºC la preparación de surfactante pulmonar mediante pulverizado de una disolución de electrolitos (3,0 g CaCl_{2} x 2 H_{2}O y 61,3 g NaCl en 300 ml H_{2}O). La disolución de surfactante pulmonar (volumen total 10,8-11,0 l) se almacena durante la noche a 4ºC y luego se centrífuga con una centrífuga de vasos Sorvall (RC2-B) a 16000 g respectivamente en 30 minutos. La pasta de centrifugación se resuspende respectivamente en la mitad de volumen de la disolución de sal común al 0,65% para la eliminación del i-propanol residual adherido y se vuelve a centrifugar. Este proceso se repite en total 3-4 veces. La pasta de la última centrifugación se introduce en 400 ml de disolución de NaCl al 0,65%, se ajusta a pH 6,5 con NaOH 0,1 N y se reparte en porciones de 6,2 g en viales de 20 ml. El contenido de los viales se hidrofiliza como sigue: congelar más de 6 horas a -45ºC y presión normal, liofilizar durante 54 horas a 0,16 mbar y -20ºC, después secar intensamente otras 5 horas a -20ºC y 0,02 mbar.

Se obtienen 65-66 viales, que contienen respectivamente 0,150 g de surfactante pulmonar (prep. sin NaCl).

Las muestras de surfactante pulmonar secas se almacenan en el congelador a 4ºC y antes del uso se deben resuspender en agua o disolución fisiológica de sal común (concentración de la suspensión 25 mg/ml).

Cada vial contiene:

5

Claims

1. Polipéptidos con actividad surfactante pulmonar de fórmula general I,

6

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en la que

A representa H o Phe,

B, Phe o Trp y

C, Ile, Leu o Ser.

2. Polipétidos según la reivindicación 1, caracterizados porque

A representa H o Phe,

B, Phe y

C, Ile.

3. Polipétidos según la reivindicación 1, caracterizados porque

A representa Phe,

B, Phe y

C, Ile.

4. Polipétidos según la reivindicación 1, caracterizados porque

A representa H,

B, Phe y

C, Ile.

5. Composición farmacéutica para el tratamiento del síndrome de disnea respiratoria (RDS) en mamíferos, caracterizada por el contenido en un polipéptido surfactante pulmonar activo según una de las reivindicaciones

\hbox{1 a
4.}

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, caracterizada porque contiene al menos otro polipéptido surfactante pulmonar activo del grupo de la proteína surfactante pulmonar SP-A y la proteína surfactante pulmonar SP-B.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, caracterizada porque contiene la proteína surfactante pulmonar SP-B.

8. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizada porque contiene fosfolípidos.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, caracterizada porque contiene dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), palmitoiloleilfosfatidilglicerol (POPG) y/o fosfatidilglicerol (PG).

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, caracterizada porque contiene ácido palmítico y electrolitos.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, caracterizada porque contiene sales de calcio y/o sodio como electrolitos.