PL181776B1 - Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych - Google Patents
Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowychInfo
- Publication number
- PL181776B1 PL181776B1 PL31501096A PL31501096A PL181776B1 PL 181776 B1 PL181776 B1 PL 181776B1 PL 31501096 A PL31501096 A PL 31501096A PL 31501096 A PL31501096 A PL 31501096A PL 181776 B1 PL181776 B1 PL 181776B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- amino acid
- acid ester
- protected
- mixture
- enzyme
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 12
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 title claims abstract description 9
- -1 amino acid ester Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims abstract 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Natural products OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 4
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 4
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 claims description 3
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 3
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 3
- ZFTFAPZRGNKQPU-UHFFFAOYSA-N dicarbonic acid Chemical compound OC(=O)OC(O)=O ZFTFAPZRGNKQPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000032050 esterification Effects 0.000 claims description 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 abstract description 4
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- JZKXXXDKRQWDET-UHFFFAOYSA-N meta-tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(O)=C1 JZKXXXDKRQWDET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 3
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKDLSKDKUGSB-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-(2-methylphenyl)propanoate Chemical compound CC1=CC=CC=C1CC(N)C(O)=O NHBKDLSKDKUGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZDMECBNNHZAIL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-(3-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(O)(C)C1=CC=CC(O)=C1 VZDMECBNNHZAIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIIAUOZUUGXERI-UHFFFAOYSA-N 3-fluorotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(F)=C1 VIIAUOZUUGXERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOXXWSYKYCBWHO-UHFFFAOYSA-N 3-phenyllactic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC1=CC=CC=C1 VOXXWSYKYCBWHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFYIUBWVKZQDOG-UHFFFAOYSA-N 4-[[2-[[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C=1C=C([N+]([O-])=O)C=CC=1NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CCC(=O)O)CC1=CC=CC=C1 CFYIUBWVKZQDOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N Fenclonine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZKXXXDKRQWDET-QMMMGPOBSA-N L-m-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(O)=C1 JZKXXXDKRQWDET-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Chemical compound CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910000000 metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004692 metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002993 phenylalanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- OLFIPJSNVBGZDM-UHFFFAOYSA-N tert-butyl carboxyoxycarbonyl carbonate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(O)=O OLFIPJSNVBGZDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych, znamienny tym, że mieszaninę racemiczną aminokwasu poddaje się estryfikacji a otrzymany ester aminokwasu poddaje się reakcji ze związkami organicznymi zawierającymi grupę blokującą azot α-aminowy estru aminokwasu, korzystnie grupę tertbu- tyloksykarbonylową, 9-fluorenykmietokss'Tarbonylowąlub benzyloksykarbonylową, następnie prowadzi się selektywną hydrolizę estru L-aminokwasu N-chronionego z mieszaniny racemicznej estru przy użyciu enzymu, w mieszaninie wody i rozpuszczalnika organicznego przy pH 4-10, w temperaturze 10-50°C, rozdziela się powstałą mieszaninę L-aminokwasu N-chronionego oraz estru D-aminokwasu N-chronionego zaś ester D-aminokwasu N-chronionego poddaje się hydrolizie w środowisku kwaśnym lub zasadowym.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych, zwłaszcza pochodnych aminokwasów aromatycznych przez hydrolizę enzymatyczną ich estrów. Enancjomery te stosuje się do syntezy peptydów.
Optycznie czyste pochodne aminokwasów aromatycznych są poszukiwanym surowcem farmaceutycznym wykorzystywanym bądź jako leki (3,4-dihydroksyfenyloalanina, 3-hydroksyfenyloalanina), bądź do syntez aktywnych biologicznie analogów peptydowych. Okazuje się, że wprowadzanie takich nienaturalnych pochodnych aminokwasowych do struktury peptydu może powodować podwyższenie jego aktywności biologicznej i/lub wydłużać czas działania i/lub umożliwiać podanie doustne leku poprzez zmniejszenie podatności na enzymatyczną hydrolizę.
181 776
Ogromny postęp w badaniach podstawowych i aplikacyjnych peptydów spowodował wzrost zapotrzebowania na enancjomery pochodnych aminokwasowych, które mogą być zastosowane w syntezie peptydów. W chwili obecnej najczęściej stosowanymi pochodnymi w syntezie peptydów są pochodne aminokwasów z chronioną grupą aminową przy pomocy grup tertbutyloksykarbonylowej (Boc), 9-fluorenylometoksykarbonylowej (Fmoc) lub benzyloksykarbonylowej (Cbz).
Większość nienaturalnych aminokwasów można otrzymywać tanimi i dogodnymi metodami w postaci mieszanin racemicznych. Czyste enancjomery otrzymywać można przez rozdział takich mieszanin. Jedną z metod rozdziału racematów jest zastosowanie enzymów, które dzięki stereospecyficzności przekształcają tylko jeden z izomerów obecnych w mieszaninie umożliwiając jej rozdział. Dotychczas znane z polskich opisów patentowych nr 104 294 i 122 795, z niemieckiego opisu patentowego nr 2215853 oraz z europejskiego opisu patentowego nr 0171862 enzymatyczne metody rozdziału mieszanin racemicznych polegały na selektywnej hydrolizie estrów aminokwasów z wolną grupą aminową lub selektywnej deacylacji acyloaminokwasów. W wyniku tego procesu otrzymywano L-aminokwas oraz ester lub pochodną acylową D-aminokwasu. Zastosowanie takich enancjomerów do syntezy peptydów wymaga przeprowadzenia szeregu następnych pracochłonnych i kosztownych reakcji prowadzących do blokowania grupy α-aminowej.
Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest otrzymywanie przy użyciu enzymów, enancjomerów pochodnych aminokwasowych z zablokowaną grupą aminową.
Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych z zabezpieczoną grupą α-aminową według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje:
1) syntezę estrów racemicznych aminokwasów,
2) wprowadzenie grupy blokującej azot α-aminowy estru aminokwasu, korzystnie grupy Fmoc, Boc lub Cbz,
3) enzymatyczną hydrolizę estru L-aminokwasu N-chronionego, której końcowym produktem jest łatwa do rozdzielenia znanymi metodami mieszanina L-aminokwasu N-chronionego oraz estru D-aminokwasu N-chronionego,
4) hydrolizę w obecności roztworu kwasu lub zasady estrów D-aminokwasów N-chronionych.
Syntezę estrów racemicznych pochodnych aminokwasów przeprowadza się znanymi metodami, korzystnie przy użyciu alkoholi alifatycznych zawierających od 1 do 6 atomów węgla w cząsteczce, korzystnie od 1 do 2 atomów węgla. Grupę blokującą azotu wprowadza się znanymi metodami stosując związki organiczne zawierające grupy blokujące azot α-aminowy estru aminokwasu, korzystnie zawierające grupy Fmoc, Boc lub Cbz, najkorzystniej pirowęglan ditertbutylu, chlorek 9-fluorenylometoksykarbonylu lub chlorek benzyloksykarbonylu. Hydrolizę enzymatyczną odpowiednich estrów prowadzi się w środowisku będącym mieszaniną wody i rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą takich jak np. dimetyloformamid i acetonitryl lub nie mieszających się z wodą takich jak np. octan etylu i dichlorometan. Zawartość wody w mieszaninie wynosi od 5 do 95%. pH mieszaniny reakcyjnej utrzymuje się w zakresie od 4 do 10, korzystnie od 7 do 10, przy pomocy roztworów buforowych lub roztworów wodorotlenków metali lub roztworów kwasów. Hydrolizę enzymatyczną prowadzi się w temperaturze od 10 do 50°C przy użyciu enzymów, korzystnie enzymów proteolitycznych pochodzenia zwierzęcego, korzystnie chymotrypsyny lub pankreatyny lub enzymów proteolitycznych wytwarzanych przez mikroorganizmy korzystnie proteazy Pronase E (Streptomyces griseus).Enzym rozpuszcza się w mieszaninie reakcyjnej lub stosuje się enzym immobilizowany na nośniku o rozwiniętej powierzchni. Po enzymatycznej hydrolizie mieszaniny racemicznej aminokwasów z chronioną grupą α-aminową wydziela się znanymi metodami, np. ekstrakcyjnie nie zhydrolizowany enzymatycznie ester D-aminokwasu N-chronionego, a następnie wydziela się pozostały w mieszaninie reakcyjnej L-aminokwas N-chroniony. Ester D-aminokwasu N-chronionego poddaje się hydrolizie w obecności
181 776 roztworów wodorotlenków np. wodorotlenku sodowego lub kwasów np. kwasu solnego w celu otrzymania D-aminokwasu N-chronionego.
Sposób według wynalazku pozwala na otrzymywanie optycznie czystych aminokwasów, w których azot α-aminowy jest chroniony grupami blokującym Fmoc, Boc lub Cbz, mających zastosowanie do syntez peptydów bez dalszych operacji blokowania. Zmniejsza to niebezpieczeństwo racemizacji produktu i zapewnia dostępność czystych enancjomerów aminokwasów niebiałkowych z chronioną grupąα-aminową do syntezy analogów peptydowych.
Sposobem według wynalazku można otrzymywać zwłaszcza enancjomery L i D aminokwasów aromatycznych N-chronionych, a zwłaszcza pochodnych fenyloalaniny modyfikowanych przez podstawienie pierścienia aromatycznego grupami hydroksylowymi, metoksylowymi, metylowymi, aminowymi, nitrowymi, cyjanowymi, halogenowymi jak np. chloro-, bromo-, fluoro-, jodo-, jak też α-metylowych pochodnych aminokwasów aromatycznych oraz ich analogów takich jak np. kwas 3- fenylomlekowy, 3-hydroksyfenylomlekowy itp.
Przykład 1. Przeprowadzono estryfikację D,L-meta-tyrozyny metanolem pod wpływem chlorku tionylu. Otrzymany chlorowodorek estru metylowego D,L-meta-tyrozyny rozpuszczano w octanie etylu, dodawano trietyloaminę, mieszaninę schładzano na łaźni z lodem i wkraplano pirowęglan ditertbutylu [(Boc)2O] w celu zablokowania grupy α-aminowej, po czym pozostawiono na 10 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie przepłukiwano mieszaninę reakcyjną wodą, warstwę organiczną osuszano nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowywano rozpuszczalnik. Powstały produkt rekrystalizowano z n-heksanu. Otrzymany ester metylowy tertbutyloksykarbonylo-D,L-meta-tyrozyny (10 mmoli, 2,95 g) rozpuszczano w 30 ml mieszaniny wody z acetonitrylem (20% acetonitrylu) o pH 8,2, dodawano α-chymotrypsynę (2 mg). Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C przez 1 godz. utrzymując pH na poziomie 8,2 przy pomocy 0,1 N NaOH. Następnie ekstrahowano ester metylowy tertbutyloksykarbonylo-D-meta-tyrozyny octanem etylu. Otrzymany ester hydrolizowano roztworem wodorotlenku sodowego uzyskując czystą tertbutyloksykarbonylo-D-meta-tyrozynę z 94% wydajnością (czystość 98,6%).
Pozostałość po reakcji zawierającą tertbutyloksykarbonylo-L-meta-tyrozynę zakwaszano przy użyciu 10% roztworu kwasu solnego i ponownie ekstrahowano octanem etylu. Uzyskany ekstrakt przemywano wodą i odparowywano. Do pozostałości dodawano n-heksan i pozostawiano na 12 godzin w temperaturze 4°C. Wytrącony osad odsączano, przemywano n-heksanem, w wyniku czego otrzymywano tertbutyloksykarbonylo-L-meta-tyrozynę z wydajnością 96% (czystość 99,2%).
Przykład 2. D,L-para-chlorofenyloalaninę przeprowadzono w ester metylowy analogicznie jak w przykładzie 1, następnie blokowano grupę α-aminową w reakcji z chlorkiem 9-fluorenylometoksykarbonylowym (Fmoc-Cl) w następujący sposób: chlorowodorek estru aminokwasu otrzymany po reakcji estryfikacji rozpuszczano w octanie etylu, dodawano 10% roztwór wodorowęglanu sodowego do uzyskania pH ok. 9, a następnie wkraplano roztwór Fmoc-Cl w octanie etylu. Reakcję prowadzono aż do całkowitego podstawienia grupy α-aminowej (brak niebieskiego zabarwienia w próbie ninhydrynowej). Następnie przepłukiwano mieszaninę reakcyjną roztworem HCl i wodą, warstwę organiczną osuszano nad bezwodnym siarczanem solu i odparowywano rozpuszczalnik. Powstały produkt rekrystalizowano z n-heksanu. Następnie 10 mmoli produktu rozpuszczano w 30 ml mieszaniny wody z acetonitrylem (30% acetonitrylu) o pH 8,5, dodawano a-chymotrypsynę zawieszoną na żelu krzemionkowym (2 g) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godz. utrzymując pH na poziomie 8,5 przy pomocy 0,1 N NaOH. Po 1,5 godz. reakcji odsączono enzym zawieszony na żelu, a z mieszaniny reakcyjnej ekstrahowano ester metylowy fluorenylometoksykarbonylo-D-para-chlorofenyloalaniny octanem etylu. Otrzymany ester hydrolizowano roztworem kwasu solnego uzyskując czystą fluorenylometoksykarbonylo-D-para-chlorofenyloalaninę z 96% wydajnością (czystość 96,9%).
181 776
Pozostałość po reakcji zawierającą fłuorenyłometoksykarbonylo-L-para chlorofenyloalaninę zakwaszano, i ponownie ekstrahowano octanem etylu. Uzyskany ekstrakt przemywano wodą i odparowywano. Do pozostałości dodawano n-heksan i pozostawiano na noc w lodówce. Wytrącony osad odsączano, przemywano n-heksanem, w wyniku czego otrzymywano fluorenylometoksykarbonylo-L-parachlorofenyloalaninę z wydajnością 97% (czystość 99%).
Przykład 3. D,L-orto-metylofenyloalaninę przeprowadzono w ester etylowy i zabezpieczono grupę α-aminową analogicznie jak w przykładzie 1, z tym, że do estryfikacji stosowano zamiast metanolu bezwodny alkohol etylowy. 5 mmoli otrzymanego estru etylowego tertbutyloksykarbonylo-D,L-orto-metylofenyloalaniny rozpuszczono w 15 ml octanu etylu i mieszano z 15 ml roztworu 5 mg proteazy Pronase E (Streptomyces griseus) w buforze fosforanowym o pH 8,5 w temperaturze pokojowej. Po 20 godz. reakcji rozdzielano warstwę organiczną i wodną. Z warstwy organicznej odparowywano rozpuszczalnik, a otrzymany ester pochodnej D-aminokwasu hydrolizowano roztworem wodorotlenku sodowego, uzyskując terbutyloksykarbonylo-D-orto-metylofenyloalaninę z wydajnością 92% (czystość 98%). Warstwę wodną po reakcji zakwaszano i ekstrahowano octanem etylu. Po odparowaniu rozpuszczalnika i rekrystalizacji otrzymywano tertbutyloksykarbonylo-L-orto-metylofenyloalaninę z 95% wydajnością (czystość 99%).
Przykład 4. D,L-meta-fluorotyrozynę przeprowadzono w ester metylowy analogicznie jak w przykładzie 1, następnie zabezpieczono grupę α-aminową analogicznie jak w przykładzie 1, z tym, że zamiast pirowęglanu tertbutyloksykarbonylu stosowano chlorek benzyloksykarbonylu. 5 mmoli otrzymanego estru etylowego benzyloksykarbonylo-D,L-meta fluorotyrozyny rozpuszczono w 15 ml octanu etylu i mieszano z 15 ml rotworu 15 mg pankreatyny w buforze fosforanowym o pH 8,9 w temperaturze pokojowej. Po 24 godz. reakcji rozdzielano warstwę organiczną, i wodną. Z warstwy organicznej odparowywano rozpuszczalnik, a otrzymany ester pochodnej D-aminokwasu hydrolizowano roztworem wodorotlenku sodowego, uzyskując benzyloksykarbonylo-D-meta-fluorotyrozynę z wydajnością 94% (czystość 98%). Warstwę wodną po reakcji zakwaszano i ekstrahowano octanem etylu. Po odparowaniu rozpuszczalnika i rekrystalizacji otrzymywano benzyloksykarbonyło-L-meta-fluorotyrozynę z 93% wydajnością (czystość 99%).
Przykład 5. D,L-leucynę przeprowadzano w ester metylowy i wprowadzano grupę blokującą analogicznie ja w przykładzie 2. Następnie 10 mmoli produktu rozpuszczano w 30 ml mieszaniny wody z acetonitrylem (40% acetonitrylu) o pH 8,5, dodawano α-chymotrypsynę zawieszoną na żelu krzemieniowym (5 g) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 godz. utrzymując pH na poziomie 8,8 przy pomocy 0,1 N NaOH. Po 1,5 godz. reakcji odsączano enzym zawieszony na żelu, a z mieszaniny reakcyjnej ekstrahowano ester metylowy fluorenylometoksykarbonylo-D-leucyny octanem etylu. Otrzymany ester hydrolizowano roztworem kwasu solnego uzyskując czystą fluorenylometoksykarbonylo-D-leucynę z 93% wydajnością (czystość 98,5%). Pozostałość po reakcji zawierającą fluorenylometoksykarbonylo-L-leucynę zakwaszano, i ponownie ekstrahowano octanem etylu. Uzyskany ekstrakt przemywano wodą i odparowywano. Po rekrystalizacji otrzymywano fluorenylometoksykarbonylo-L-leucynę z wydajnością 90% (czystość 99%).
181 776
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.
Cena 2,00 zł.
Claims (11)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych, znamienny tym, że mieszaninę racemiczną aminokwasu poddaje się estryfikacji a otrzymany ester aminokwasu poddaje się reakcji ze związkami organicznymi zawierającymi grupę blokującą azot α-aminowy estru aminokwasu, korzystnie grupę tertbutyloksykarbonylową, 9-fluorenylometoksykarbonylową lub benzyloksykarbonylową, następnie prowadzi się selektywną hydrolizę estru L-aminokwasu N-chronionego z mieszaniny racemicznej estru przy użyciu enzymu, w mieszaninie wody i rozpuszczalnika organicznego przy pH 4-10, w temperaturze 10-50°C, rozdziela się powstałą mieszaninę L-aminokwasu N-chronionego oraz estru D-aminokwasu N-chronionego zaś ester D-aminokwasu N-chronionego poddaje się hydrolizie w środowisku kwaśnym lub zasadowym.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do estryfikacji mieszaniny racemicznej aminokwasu stosuje się alkohole alifatyczne zawierające do 6 atomów węgla, zwłaszcza alkohol metylowy i etylowy.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ester aminokwasu poddaje się reakcji z pirowęglanem ditertbutylu.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ester aminokwasu poddaje się reakcji z chlorkiem 9-fluorenylometoksykarbonylu.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ester aminokwasu poddaje się reakcji z chlorkiem benzyloksykarbonylu.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako enzym stosuje się proteazy zwierzęce, korzystnie α-chymotrypsynę lub pankreatynę.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako enzym stosuje się proteazy pochodzenia mikrobiologicznego, korzystnie proteazę Pronase E (Streptomyces griseus).
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się enzym rozpuszczony w mieszaninie reakcyjnej.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się enzym immobilizowany na nośniku o rozwiniętej powierzchni.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się acetonitryl, dimetyloformamid, chlorek metylenu, octan etylu.
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH środowiska reakcji utrzymuje się w zakresie 7-10.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL31501096A PL181776B1 (pl) | 1996-06-28 | 1996-06-28 | Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL31501096A PL181776B1 (pl) | 1996-06-28 | 1996-06-28 | Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL315010A1 PL315010A1 (en) | 1998-01-05 |
| PL181776B1 true PL181776B1 (pl) | 2001-09-28 |
Family
ID=20067860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL31501096A PL181776B1 (pl) | 1996-06-28 | 1996-06-28 | Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL181776B1 (pl) |
-
1996
- 1996-06-28 PL PL31501096A patent/PL181776B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL315010A1 (en) | 1998-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2579323B2 (ja) | ジアミン類の選択的アミジン化 | |
| JPS6051199A (ja) | ２‐アザビシクロ〔３．１．０〕ヘキサン‐３‐カルボン酸の誘導体およびそれらの製法 | |
| IE60128B1 (en) | Hydroxylamine derivatives,their preparation and use as medicaments | |
| IE921941A1 (en) | Inhibitors of picornavirus proteases | |
| US4237047A (en) | Peptide derivative | |
| US5013723A (en) | New thymopentin retro-inverso analogs and fragments thereof, a process of preparation of the new compounds and the intermediates obtained therein | |
| EP0149594A2 (en) | Enzymatic coupling of n-formyl amino acids and/or peptide residues | |
| Okonya et al. | Synthesis of the peptide fragment of pseudobactin | |
| PL181776B1 (pl) | Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych | |
| CN1087349C (zh) | N－乙酰基－(L)－4－氰基苯丙氨酸Ac-(L)-Phe(4－CN)－OH与N－乙酰基－(L)－对脒基苯丙氨酸－环己基甘氨酸－β－（3－N－甲基吡啶鎓）－丙氨酸AC－（L）－PAPh－chg－PaIMe(3)-NH2的新颖的制备方法 | |
| EP0324659B1 (en) | Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process | |
| CN105392891B (zh) | 具有硫醇基的d-型或l-型氨基酸衍生物的制造方法 | |
| US5789541A (en) | Compounds for inhibition of proteolysis | |
| Chen et al. | Chemo-enzymatic synthesis of Fmoc-Peptide Fragments | |
| JP3704719B2 (ja) | 光学活性３−アミノブタン酸の製造法及びそのエステル中間体 | |
| JPH01165397A (ja) | 非タンパク原性アミノ酸を有するペプチドの酵素的合成 | |
| US4569907A (en) | Thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase | |
| Ohno et al. | Partial enzymic deprotection in the synthesis of a protected octapeptide bearing a free terminal carboxyl group | |
| JP2000154198A (ja) | 環状デプシペプチドの固相合成方法及びその中間体 | |
| EP0279832A1 (en) | Enzymatic process | |
| Bentley et al. | 1176. Polypeptides. Part I. The synthesis of peptides related to eledoisin | |
| JP4856184B2 (ja) | オリゴペプチドアミドからオリゴペプチドアルキルエステルへの酵素転化 | |
| WO2004101494A1 (es) | Inhibidores de calpaina | |
| Inami et al. | Synthesis of. ALPHA.-Aminophosphonic Octapeptide, Phe-Gly-Ser-Leu-AlaP-Phl-Leu-Pro, an Analog with Partial Sequence of erb B-2 Gene Product. | |
| US5200506A (en) | Process for preparing new thymopentin retro-inverso analogs and fragments thereof and the intermediates obtained therein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050628 |