PL181851B1

PL181851B1 - Proteins capable to efficiently fight against micro-organisms

Info

Publication number: PL181851B1
Application number: PL94313526A
Authority: PL
Inventors: Karsten M Kragh; Jorn D Mikkelsen; Klaus K Nielsen
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1993-10-21
Filing date: 1994-10-20
Publication date: 2001-09-28
Also published as: CA2170506A1; US6300103B1; WO1995011306A1; US6218508B1; DE69433407T2; HU9601040D0; PL313526A1; DK0724641T3; GB9321714D0; RU2158762C2; AU683952B2; HU223367B1; AU8058794A; CZ112296A3; HUT74395A; JPH09504427A; EP0724641A1; EP0724641B1; DE69433407D1; ATE256193T1

Abstract

1. Bialko zwalczajace mikroorganizmy wybrane z grupy bialek majacych sekwencje okreslona w SEK. ID N r 1-3. 2. Kombinacja bialka zwalczajacego mikroorganizmy z co najmniej jednym bialkiem przeciwgrzybowym, w której bialko zwalczajace mikroorganizmy jest wybrane z grupy bialek majacych sekwencje okreslona w SEK. ID N r 1-3, a bialko przeciwgrzybowe jest wybrane z grupy bialek majacych sekwencje okreslona w SEK. ID N r 4-6. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest białko zwalczające mikroorganizmy oraz kombinacja białka zwalczającego mikroorganizmy z co najmniej jednym białkiem przeciwgrzybowym. Białka zwalczające mikroorganizmy według wynalazku mogą być izolowane z buraków cukrowych.

Białko zwalczające mikroorganizmy jest określeniem białka (pojedynczego lub w połączeniu z inną substancją), które jest w dowolnych warunkach toksyczne lub hamuje wzrost dowolnego mikroorganizmu, włączając w to bakterie (w szczególności bakterie Gram dodatnie), wirusy, a przede wszystkim grzyby. Określenie to obejmuje białka, które wykazują aktywność wobec mikroorganizmów w czasie kontaktu z nimi lub takie, których działanie zwalczające mikroorganizmy jest konsekwencją ich asymilacji lub oddychania.

Białka zwalczające mikroorganizmy według wynalazku mają sekwencję określoną w SEK. ID Nr 1-3.

Kombinacja białka zwalczającego mikroorganizmy z co najmniej jednym białkiem przeciwgrzybowym obejmuje, według wynalazku, białko zwalczające mikroorganizmy wybrane z grupy białek mających sekwencję przedstawioną w SEK. ID Nr 1-3 oraz białko przeciwgrzybowe, które jest wybrane z grupy białek mających sekwencję SEK. ID Nr 4-6.

Stosowane dalej określenie „zasadniczo podobne” oznacza czyste białka mające sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 85% podobna do sekwencji białek według wynalazku. Korzystne jest, jeżeli stopień podobieństwa wynosi co najmniej 90%, a jeszcze korzystniejsze, jeżeli stopień podobieństwa wynosi co najmniej 95%.

W kontekście niniejszego wynalazku, dwie sekwencje aminokwasowe o wzajemnym podobieństwie co najmniej 85%, 90% lub 95% mają co najmniej 85%, 90% lub 95% identycznych reszt aminokwasowych lub konserwatywnych podstawień w podobnej pozycji przy optymalnym dopasowaniu, dopuszczającym co najwyżej 2 przerwy, przy założeniu, że każda z przerw obejmuje nie więcej niż 3 reszty aminokwasowe. W przypadku białek przedstawionych w SEK. ID Nr 1 i 2, liczba przerw może być zwiększona do 4, przy założeniu, że każda z przerw obejmuje nie więcej niż 5 reszt aminokwasowych.

Konserwatywne podstawienia mogą być dokonywane między aminokwasami w obrębie następujących grup:

I) seryna i treonina;

II) kwas glutaminowy i kwas asparaginowy;

III) arginina i lizyna;

IV) asparagina i glutamina;

V) izoleucyna, leucyna, walina i metionina;

VI) fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan;

181 851

VII) alanina i glicyna.

Określenie „czyste białka” jest stosowane dalej do określenia białek, które są w co najmniej 90% identyczne z białkami zwalczającymi mikroorganizmy według wynalazku, jak również do określenia białek mających co najmniej 90% ich specyficznej aktywności. Miarą specyficznej aktywności jest stopień hamowania wzrostu lub replikacji wykazywany przez określoną ilość białka dla określonej ilości określonego mikroorganizmu.

Czyste białka mogą występować w kombinacji z co najmniej jednym białkiem, wybranym z grupy złożonej z białek przedstawionych w SEK. ID Nr 4-6. Takie połączenia białkowe mogą być dalej łączone z jednym lub większą liczbą znanych „białek związanych z patogenezą”. Infekcja roślin grzybowymi lub wirusowymi patogenami może wywoływać systemową syntezę około 10 rodzin homologicznych białek związanych z patogenezą (białka PR) w tkankach wegetatywnych. Takie białka PR zostały zaklasyfikowane do 5 grup. Białka PR-2, PR-3 i PR-5 są odpowiednio: beta-1,3-glukanazą, chitynazami i białkami taumatynopodobnymi. Białkom z grup PR-1 i PR-4 nie przypisano dotąd specyficznych funkcji, przy czym białka PR-4 są podobne do C-końcowych domen prohewein i białek WIN ziemniaka, prawdopodobnie indukowanych przez zranienia, ale brak im N-końcowej domeny hewein. Jest korzystne, jeżeli białka według wynalazku są łączone z jednym lub większą liczbą białek, które stanowią odpowiednik białek z grupy PR-4. Jest szczególnie korzystne, jeżeli odpowiednik białka związanego z patogenezą jest białkiem WIN wiążącym chitynę, a w szczególności takim, które jest wytwarzane przez ziarna jęczmienia lub liście jęczmienia poddane stresowi.

Białka zwalczające mikroorganizmy według wynalazku są kodowane przez zrekombinowany DNA, który zawiera sekwencję kodującą białko o sekwencji określonej w SEK. ID Nr 1-3, ewentualnie łącznie z co najmniej jednym z białek, których sekwencja jest określona w SEK. ID Nr 4-6. Zrekombinowany DNA może ponadto kodować białko mające oporność na herbicydy, mające korzystny wpływ na wzrost roślin, własności przeciwgrzybowe, przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i/lub przeciwnicieniowe. W przypadku, kiedy DNA ma być wprowadzane do organizmu heterologicznego, może być modyfikowane poprzez usunięcie znanych motywów powodujących niestabilność mRNA (takich jak regiony bogate w pary AT) i sygnałów poliadenylacji (jeżeli takie są obecne) i/lub użycie kodonów, preferowanych przez organizm, do którego ma być wprowadzony zrekombinowany DNA, tak aby ekspresja tego zmodyfikowanego DNA w tym organizmie prowadziła do powstania białka zasadniczo podobnego do białka otrzymanego poprzez ekspresję nie zmodyfikowanego zrekombinowanego DNA w organizmie, w którym białko zwalczające mikroorganizmy według wynalazku jest endogenne.

Białko według wynalazku może być kodowane przez zrekombinowany DNA, który jest „podobny” do DNA wymienionego powyżej. „Podobny DNA” oznacza sekwencję, która jest komplementarna do sekwencji badanej, która ma zdolność do hybrydyzowania ze zrekombinowaną sekwencją, kodującą białko według wynalazku. Gdy sekwencje: badana i kodująca białko według wynalazku są dwuniciowe, kwas nukleinowy stanowiący sekwencję badaną powinien mieć TM w granicach 20°C w stosunku do sekwencji kodującej białko według wynalazku. W przypadku zmieszania razem tych sekwencji i ich równoczesnej denaturacji, wartości TM sekwencji powinny być w granicach 10°C, jedna w stosunku do drugiej. Korzystnie, jeżeli hybrydyzacja jest prowadzona w warunkach ostrych, przy czym dobrze, jeżeli bądź DNA badany, bądź kodujący białko według wynalazku jest w formie związanej. A zatem, jest korzystne, jeżeli bądź DNA badany, bądź kodujący białko według wynalazku, jest związany z nośnikiem, a hybrydyzacja jest prowadzona przez określony okres czasu w temperaturze pomiędzy 50 i 70°C w dwukrotnie stężonym roztworze soli buforowanym cytrynianem (SSC), zawierającym 0,1% SDS, po czym następuje płukanie nośnika w tej samej temperaturze, ale buforem mającym obniżone stężenie SSC.

W zależności od wymaganego stopnia ostrości warunków, a zatem stopnia podobieństwa sekwencji, takie obniżenie stężenia soli to zwykle: jednokrotnie rozcieńczony SSC zawierający 0,1% SDS, dwukrotnie rozcieńczony SSC zawierający 0,1% SDS i dziesięciokrotnie rozcieńczony SSC zawierający 0,1% SDS. Sekwencjami mającymi największy stopień

181 851 podobieństwa są takie, dla których płukanie w buforach o zmniejszonym stężeniu ma najmniejszy wpływ na hybrydyzację. Najkorzystniej, jeżeli sekwencje badana i kodująca białko według wynalazku są tak podobne, ze na ich hybrydyzację nie ma wpływu płukanie lub inkubacja w dziesięciokrotnie rozcieńczonym roztworze cytrynianu sodu zawierającym 0,1% SDS.

Białka według wynalazku mogą być więc również kodowane przez sekwencję DNA, która jest komplementarna do sekwencji, która hybrydyzuje w ostrych warunkach ze zrekombinowanym DNA określonym wyżej.

Przedstawione powyżej cząsteczki służą do transformowania nimi roślin, z zastosowaniem wektorów, które mogą podlegać ekspresji w roślinach i są połączone odpowiednio z promotorem i terminatorem działającymi w roślinach. Rośliny transformowane takim DNA, potomstwo takich roślin i/oraz nasiona takich roślin i takiego potomstwa zawierają DNA stabilnie włączony i dziedziczony w sposób mendlowski. Transformowane rośliny mogą być otrzymane znanymi metodami, co obejmuje regenerację komórek roślinnych lub protoplastów transformowanych DNA kodującym białka według wynalazku przy zastosowaniu różnorodnych znanych metod (plazmidy Ti i Ri Agrobacterium, elektroporacja, mikro-wstrzykiwanie, strzelanie mikropociskami itd.). Transformowane komórki mogą być w odpowiednich przypadkach regenerowane do całych roślin, w których materiał jądrowy jest stabilnie włączony do genomu. W taki sposób mogą być otrzymane zarówno rośliny jednoliścienne, jak i dwuliścienne. Przykładami tak transformowanych roślin są: owoce, włączając w to pomidory, mango, brzoskwinie, jabłka, gruszki, truskawki, banany i melony; rośliny uprawne, takie jak kanola, słonecznik, tytoń, burak cukrowy, zboża o drobnych ziarnach, takie jak pszenica, jęczmień i ryż, kukurydza i bawełna oraz warzywa, takie jak ziemniak, marchew, sałata, kapusta i cebula. Preferowanymi roślinami są burak cukrowy i kukurydza.

W wyniku ekspresji zrekombinowanego DNA w transformowanych roślinach, omówionych wyżej rodzajów, wytwarzane są białka zwalczające mikroorganizmy. Białka te, pojedynczo lub razem, można stosować w kompozycjach zwalczających mikroorganizmy, a zwłaszcza do zwalczania grzybów przez poddanie ich działaniu tych białek. Białka zwalczające mikroorganizmy wytwarzane są w procesie ekstrakcji z zawierającego je materiału organicznego, przez poddawanie tego materiału organicznego - najkorzystniej w postaci mikroorganizmu - maceracji i ekstrakcji rozpuszczalnikami. Należy zauważyć, że białko zwalczające mikroorganizmy może wykazywać ewentualnie niewielki, ujemny wpływ na mikroorganizm, który jest źródłem materiału organicznego.

Przedmiot wynalazku w przykładach realizacji jest objaśniony poprzez następujący opis, towarzyszące mu rysunki i listę sekwencji.

Na załączonych rysunkach: fig. 1 - pokazuje typowy profil wymywania z kolumny CM-Sepharose płynu po międzykomórkowym przepłukaniu; fig. 2 - pokazuje typowy profil wymywania z kolumny Mono S FLPC frakcji 0,3 M NaCl, przedstawionej na fig. 1; fig. 3 pokazuje typowy profil wymywania z kolumny RP-HPLC białek reprezentowanych przez szczyt 3 na fig. 2; fig. 4 - pokazuje aktywność antygrzybową 10 pg białka reprezentowanego przez szczyty 3.1 i 3.2 na fig. 3 (odpowiednio, SEK. ID Nr 1 i 2); fig. 5 - pokazuje chromatogram sączenia molekularnego w żelu Sephadex G75 frakcji 0,1 M, przedstawionej na fig. 1; fig. 6 - pokazuje typowy profil wymywania z kolumny Mono S FLPC szczytu V (połączonego), przedstawionego na fig. 5; fig. 7 - pokazuje aktywność prz.eciwgrzybową 10 pg białka pokazanego na fig. 6 jako szczyty 1 i 2 (SEK. ID Nr 3); fig. 8A - pokazuje połączoną aktywność przeciwgrzybową 2 pg każdego z białek reprezentowanych przez SEK. ID Nr 2 i 3; fig. 8B - pokazuje połączoną aktywność wobec mikroorganizmów 2 pg każdego z białek reprezentowanych przez SEK. ID Nr 2 i 5; fig. 9A i 9B - pokazują morfologię grzybni C. beticola, rosnącej w nieobecności białek zwalczających mikroorganizmy według wynalazku; fig. 9C i 9D - pokazują grzybnię, wówczas kiedy grzyby są hodowane przez 48 godzin w obecności 2 pg białek mających sekwencje pokazane odpowiednio w SEK. ID Nr 2 i 3. Test jest wykonywany na płytkach do mikromiareczkowania, tak jak pokazano niżej; powiększenie na fig. 9A wynosi 76x; na fig. 9B-9D - 294x.

SEK. ID Nr 1 pokazuje sekwencję aminokwasów białka reprezentowanego przez szczyt 3.1 na fig. 3; SEK. ID Nr 2 pokazuje sekwencję aminokwasów białka reprezentowanego przez

181 851 szczyt 3.2 na fig. 3; SEK. ID Nr 3 pokazuje sekwencję aminokwasów białka reprezentowanego przez szczyty 1 i 2 na fig. 6; SEK. ID Nr 4-6 pokazują sekwencje aminokwasów trzech znanych białek przeciwgrzybowych; SEK. ID Nr 7 pokazuje sekwencję nukleotydów cDNA kodującego białko pokazane w SEK. iD Nr 3; a SEK. ID Nr 8 pokazuje produkt translacji transkryptu kodowanego przez sekwencję cDNA przedstawioną w SEK. ID Nr 7, który to produkt obejmuje odcinki rozciągające się dalej od końców N i C białka pokazanego w SEK. ID Nr 3.

Otrzymywanie płynu po międzykomórkowym przemywaniu (IWF).

IWF otrzymuje się z 500-700 gramów liści buraka cukrowego poprzez zanurzenie ich w 20 mM HAc (pH 4,5). Zanurzone w ten sposób liście wkłada się następnie do eksykatora i filtruje pod próżnią przez 5 min. przy 5,333 χ 10² Pa (maksimum). Po osuszeniu powierzchni liścia na powietrzu, zbiera się iWF poprzez wirowanie przy 500 g przez 15 min. w 500 ml probówkach wirowniczych.

Chromatografia kationowymienna.

Otrzymany w powyższy sposób IWF frakcjonuje się poprzez chromatografię kationowymienną na 10 ml kolumnie CM-Sepharose (Pharmacia LKB), zrównoważonej uprzednio buforem wyjściowym (20 mM HAc (pH 4,5)). Frakcjonowanie jest wykonywane w 4°C przy tempie przepływu 25 ml/godz. Zbiera się 3 ml frakcje. Białka nie związane na kolumnie usuwa się przez intensywne przemywanie kolumny buforem wyjściowym. Związane białka są wymywane poprzez nałożenie na kolumnę dodatkowego buforu wyjściowego zawierającego wzrastające skokowo stężenie soli, a mianowicie 0,1 M NaCl, 0,3 M NaCl i 0,5 M NaCl. Mierzy się absorbcję eluatu przy 280 nm i frakcje ocenione jako zawierające białko testuje się na ich aktywność przeciwgrzybową wobec C. beticola, stosując opisany poprzednio test biologiczny na płytkach do mikromiareczkowania (PCT Patent Application Nr PCT/DK92/00108, PublikacjaNr WO 92/17591, obecnie należące do Sandoz LTD).

Typowy profil wymywania jest pokazany na fig. 1. Eluat otrzymany w wyniku naniesienia na kolumnę buforu wyjściowego zawierającego 0,3 M NaCl i 0,1 M NaCl oczyszcza się dalej tak, jak opisano poniżej.

Oczyszczanie białek przeciwgrzybowych z eluatu 0,3 M NaCl z CM-Sepharose. Chromatografia FLPC.

Frakcję białek z 0,3 M NaCl odsala się poprzez nocną dializę (masa cząst. odcięcia: 3 χ 10³ daltonów) wobec 20 mM HAc (pH 4,5) w 4°C. Do dializowanych w ten sposób białek dodaje się betainę do stężenia 5% (w/v). Cztery ml otrzymanego roztworu frakcjonuje się poprzez ciekłą chromatografię kationowymienną (FLPC) przy użyciu kolumny Mono S HR 5/5 (Pharmacia LKB) zrównoważonej 20 mM HAc (pH 4,5), zawierającym 5% (w/v) betainę (bufor A). Związane białka wymywa się liniowym gradientem soli od 0 do 0,3 M NaCl w 30 ml buforu A, a następnie wykonuje się wymycie 1,0 M NaCl w tym samym buforze. Tempo przepływu wynosi 1 ml/min.

Figura 2 pokazuje, ze frakcje 0,3 M NaCl zawierają liczne odrębne białka, najbardziej znaczące ilościowo są oznaczone jako szczyty 1-5. Rozdział na SDS-PAGE przy zastosowaniu Phast System (Pharmacia LKB), barwionych srebrem 10-15% gradientowych żeli Phast lub żeli High Density (Pharmacia LKB) wykazuje, ze każdy ze szczytów 1-5 zawiera 2-5 prążków białkowych.

HPLC z odwróconymi fazami.

Białkowy szczyt 3 (przedstawiony na fig. 2) z kolumny Mono S jest oczyszczany dalej poprzez HPLC z odwróconymi fazami (RP-) na kolumnach krzemionkowych Vydac C4 (The Separation Group, CA, USA). Zestaw rozpuszczalników jest następujący: A: 0,1% TFA w wodzie i B: 0,1% TFA w acetonitrylu. Białka są wypłukiwane liniowym gradientem od 5 do 45% buforu B nakładanego po upływie 18 min. od nałożenia próbki, a następnie 60% buforem B przez 2 min. Tempo przepływu jest 0,7 ml/min. Białka wykrywa się poprzez pomiar absorbcji eluatu przy 214 i 280 nm. Odrębne szczyty białkowe są zbierane i liofilizowane. Przed analizą czystości 1 aktywności przeciwgrzybowej zliofilizowane w ten sposób białka przemywa się dwukrotnie wodą, ponownie liofilizuje i następnie rozpuszcza w 10 mM TrisHCl (pH 8,0).

181 851

Figura 3 pokazuje, ze szczyt 3 z fig. 2 rozdziela się na kolumnie RP na cztery szczyty (oznaczone jako 3.1-3.4 na fig. 3). SDS-PAGE szczytów 3.1-3.4 pokazuje, że każdy jest złożony z czystych białek mających masę cząsteczkową około 7 x 10^J daltonów (szczyt 3.1, 3.2 i 3.3) i 2,5-3 x 10³ daltonów (3.4).

Oczyszczanie białek przeciwgrzybowych w eluacie 0,1 M NaCl z CM-Sepharose.

Pięć ml z eluatu 0,1 M NaCl z fig. 1 frakcjonuje się poprzez sączenie molekularne na 370 ml kolumnie Sephadex G-75 (Pharmacia LKB), zrównoważonej 50 mM MES (pH 6,0) przy tempie przepływu 20 ml/godzinę. Zbierane są 10 ml frakcje. Frakcje te są następnie łączone w sześć większych frakcji, I-VI, zawierających w przybliżeniu 50 ml każda.

Wymiana kationowa (Mono S).

Pula V (pokazana na fig. 5) z kolumny Sephadex G-75 jest nakładana na kolumnę Mono S FPLC, zrównoważoną buforem A: 50 mM MES (pH 6,0) zawierającym 5% betainę (w/v). Po przemyciu buforem A, związane białka wymywa się przy tempie przepływu 1 ml/min. liniowym gradientem od 0 do 0,5 M NaCl w 30 ml buforu A (fig. 6). Kiedy białko reprezentujące szczyty 1 i 2 poddaje się następnie elektroforezie w żelu SDS w obecności DTT obserwuje się dwa odrębne prążki. Pierwszy prążek ma masę cząsteczkową pomiędzy 2,5 i 3 x 10³ daltonów, a drugi prążek, który reprezentuje nie zredukowany dimer białka z pierwszego prążka, ma masę cząsteczkową około 5 x 103 daltonów.

Identyfikacja białek przeciwgrzybowych.

Aktywność przeciwgrzybowa.

Rysunki 4 i 7-9 pokazują ze białka reprezentowane przez szczyty 3.1 i 3.2 (odpowiednio, SEK. iD Nr 1 i 2) na fig. 3 i szczyty 1 i 2 (SEK. ID Nr 3) na fig. 6 mają znaczną aktywność przeciwgrzybową, między innymi w stosunku do C. beticola. Hamowanie wzrostu grzyba mierzy się na płytkach do mikromiareczkowania o 96 wgłębieniach przy 620 nm, zasadniczo jak opisano w WO 92/17591. Fig. 9 pokazuje, że C. beticola traktowany takim białkiem ma skarłowaciałą grzybnię, która jest cienka i bardziej rozgałęziona (fig. 9C, 9D) w porównaniu z grzybami hodowanymi w nieobecności białek zwalczających mikroorganizmy (fig. 9A, 9B).

Białka, bądź pojedynczo, bądź w kombinacji z WIN N (które jest oczyszczone z ziarna jęczmienia lub liści jęczmienia poddanych stresowi, jak opisano przez Hejgaard i wsp. (FEBS Letters, 307, 389-392 (1992)) i/lub białko mające sekwencję odpowiadającą przynajmniej jednemu z białek przedstawionych w SEK. ID Nr 4-6, inkubuje się sporami C. beticola. Mieszanina testowa (240 μΐ) zawiera 100 μΐ podłoża patato dextrose broth (Difco), 40 μΐ próbki białka (lub buforu kontrolnego w 100 mM Tris i 20 mM NaCl (pH 8,0), jak również w przybliżeniu 400 zarodników w 100 μΐ wody. Płytki do mikromiareczkowania uszczelnia się taśmą celem uniknięcia parowania i zanieczyszczenia, a następnie inkubuje się w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 200 rpm. Absorbcję przy 620 nm mierzy się każdego dnia przez 8 dni i nanosi na wykres względem czasu dla każdego stężenia białka.

Ustalanie sekwencji aminokwasowej.

Oczyszczone białka antygrzybowe odpowiadające szczytom 3.1 i 3.2 na fig. 3 (odpowiednio, SEK. ID Nr 1 i 2), które pochodzą z eluatu 0,3 M NaCl z kolumny CM-Sepharose (fig. 1) i białka odpowiadające szczytom 1 i 2 na fig. 6 (SEK. ID Nr 3), które pochodzą z eluatu 0,1 M NaCl z kolumny CM-Sepharose są karboksymetylowane i poddane RP-HPLC na kolumnie Vydac C4. System rozpuszczalników jest następujący: A: 0,1% TFA w wodzie i B: 0,1% TFA w acetonitrylu. Białka wymywają się jako pojedyncze szczyty z nieznacznie różniącymi się czasami retencji. Sekwencje C-końcowe białek są otrzymywane przez ich odcięcie proteinazą endo-R, a następnie oczyszczenie poprzez RP-HPLC na kolumnie z Vydac CisWytworzenie stransformowanych roślin.

Geny kodujące białka według wynalazku są wprowadzane do roślin. Regiony kodujące genów, w których zakodowane są białka, syntetyzuje się z odpowiadającego im mRNA w oparciu o startery specyficzne dla genów przy użyciu PCR. Po dodaniu sekwencji promotora i terminatora, geny kodujące wzmiankowane białka wprowadza się do wektorów do transformacji roślin. Wektor może ewentualnie zawierać gen kodujący białko WIN, taki jak otrzymany z liści jęczmienia poddanych stresowi lub ziaren jęczmienia i/lub gen kodujący białko opisane w SEK. ID Nr 4, SEK. ID Nr 5 i/lub SEK. ID Nr 6 i/lub gen kodujący chityna181 851 zę i/lub glukanazę. Preferowana chitynaza jest chitynazą 4, opisaną w Zgłoszeniu Patentowym PCT nr PCT/DK92/00108 (Publikacja Nr WO 92/17591). Wektorami tymi może być transformowany na przykład Agrobacterium tumifaciens. Komórki roślin są następnie traktowane takim stransformowanym Agrobacterium i tak stransformowane komórki roślinne są regenerowane do całych roślin, w których nowy materiał jądrowy jest stabilnie włączony do genomu. Będzie jednakże oczywiste, że DNA kodujące białko lub kombinację białek, według wynalazku oraz ewentualnie kodujące dodatkowo inne białka, może być wprowadzany do komórek rośliny innymi znanymi metodami, włączając w to użycie działa z mikropociskami, elektroporacji, elektrotransformacji oraz mikroiniekcji itd. oraz, że regenerację stransformowanych komórek roślinnych wykonuje się zgodnie z metodami znanymi przez specjalistę, włączając w to traktowanie komórek, tam gdzie to niezbędne lub pożądane, cytokinami w celu polepszenia częstości regeneracji.

Co więcej, odpowiednie mikroorganizmy (tj. takie, dla których wytwarzanie białek będących przedmiotem niniejszego wynalazku nie jest zasadniczo toksyczne) mogą być transformowane wektorami obejmującymi gen (lub geny) kodujące białko tak, że stransformowany mikroorganizm wytwarza takie białko. Mikroorganizmy mogą ponadto zawierać geny kodujące inne białka, takie jak białko WIN i/lub białko, którego sekwencję przedstawiono w jednej lub więcej z SEK. ID Nr 4-6. Ponadto, takie inne białka mogą dalej obejmować różne chitynazy i/lub glukanazy. Takim szczególnie korzystnym innym białkiem jest chitynaza 4, opisana w Zgłoszeniu Patentowym PCT nr PCT/DK92/00108 (Publikacja Nr WO 92/17591).

Wytworzone mikroorganizmy mogą być następnie użyte do zwalczania patogenów roślin. Przykładowo, stransformowane mikroorganizmy mogą być suszone i rozpylane na zainfekowane rośliny lub rośliny zagrożone infekcją..

181 851

Zestawienie sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Sandoz Ltd (B) ULICA: Lichtstrasse 35 (C) MIASTO: Bazylea (D) STAN: BS (E) KRAJ: Szwajcaria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CH-4002 (G) TELEFON: 061-324-1111 (H) TELEFAX: 061-322-7532 (I) TELEX: 965-05055 (A) NAZWA: Sandoz Erfindungen Verwaltungsgesellschaft MBH (B) ULICA: Brunnerstrasse 59 (C) MIASTO: Wiedeń (E) KRAJ: Austria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): A-1230 (A) NAZWA: Sandoz-Patent GMBH (B) ULICA: Humboltstrasse 3 (C) MIASTO: Loerrach (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY (ZIP): D-7850 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Białka zwalczające mikroorganizmy (iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 (iv) FORMA CZYTELNA DLA KOMPUTERA!:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patent In Release #1.0, wersja #1.25 (EPO) (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID NR:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 91 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) TYP ŁAŃCUCHA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) ANTI-SENSE: NIE (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris

(xi) OPIS SEKWENCJI: IE

1 NR:

1:

Ile

Thr Cys

Gly

Leu

Val Ala

Ser

Lys

Leu

Ala

Pro

Cys

11«;

Gly

Tyr

1

5

10

15

Leu

Gln Gly

Ala

Pro

Gly Pro

Ser

Ala

Gly

Cys

Gly

IIe

Lys

20

25

30

181 851

Gly Leu Asn

Ser Ala Ala

Ala

Ser 40

Pro Ala Asp

Arg Lys 5Tir 45

Ala

Cys

35

Thr

Cys

Leu

Lys

Ser

Ala

Tir

Ser

Ile

Lys

Gly

Ile

Asn

Tyr

Gly

50

55

60

Lys

Ala

Ser

Leu

Pro

Arg

Gln

Cys

Gly

Val

Ser

Val

Pro

Tyr

Ala

65

70

75

00

Ile

Ser

Pro

Asn

Thr

Asn

Cys

Asn

Ala

Ile

His

90 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) ORGANIZM!: Beta vulgaris (ci) OPIS SEKWENCJI: ID NR: 2:

Ile 1

Thr

Cys

Gly

Leu Val Ala Ser 5

Lys Leu Ala 10

Pro Cys

Ile

Gly 15

Hir

Leu

Gln

Gly

Ala

Pro

Gly

Pro

Ser

Ala

Gly

Cys

Gly

Ute

Lys

20

25

30

Gly

Leu

AAn

Ser

Ala

Ser

Pro

Ala

Asp

Arg

Lys

Thr

Ala

Cys

35

40

45

Thr

Cys

Leu

Lys

Ser

Ala

Thir

Ser

Met

Lys

Gly

Ile

Asn

Tyr

Gly

50

55

60

Lys

Ala

AAa

Ser

Leu

Pro

Ar~g

Gln

Cys

Gly

Val

Ser

Ile

Pro

Tyr

Ala

65

70

75

80

Ile

Ser

Pro

Asn

Thr

Asn

Cys

Asn

Ala

Ile

His

85

90

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) TYP ŁAŃCUCHA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) ANTI-SENSE: NIE (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris

181 851 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID NR: 3:

Ser Gly Glu Cys Asn Met Tyr Gly Arg Cys Pro Pro Gly Tyr Cys Cys 15 10 15

Ser Lys Phe Gly Tyr Cys Gly Val Gly Arg Ala Tyr Cys Gly 20 25 30 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID NR:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 46 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) TYP ŁAŃCUCHA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) ANTI-SENSE: NIE (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (xi) OPIS SEKWENCJI: ID NR: 4:

Ala

Ile

Cys

Lys

Pro

Ser

Lys

Phe

Lys

Gly

Ala

1

5

10

Asp

Ala

Asp

Cys

Glu

Lys

Ala

Cys

Asp

Gin

Glu

Asn

Trp

20

225

Val

Cys

Vvl

Pro

PPh

Leu

Arg

Cys

Glu

Cys

Gin

Arg

Ser

35

40

45

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID NR:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 46 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) TYP ŁAŃCUCHA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) AANI--EESS: NIE (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (xi) OPIS SEKWENCJI: ID UR: 5:

Ala

Thr

Cys

Arg

Lys

Pro

Ser

Met

Tsr Phe

Ser

GSy

Aer

CyG

PS e

Alr

1

5

10

15

Asp

Thr

Asn

Cys

Gln

Lys

Ala

Cys

ssn Arg

Glu

Asp

Trp

PrA

Asn

Gry

20

25

30

Lys

Cys

Leu

Val

Gly

Phe

Lys

Cys

Glu Cys

Gln

Arg

Pro

Cys

35

40

45

(2)

INFORMACJA DLA SEKWENCJI

: ID

NR:6:

(i) CSHARSKTRYSSGKA SSEWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) TYP ŁAŃCUCHA: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: nieznana

181 851 (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) ANTI-SENSE: NIE (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (xi) OPIS SEKWENCJI: ID NR: 6:

Arg Cys Ile Pro Cys Gly Gln Asa Cys Ile Ser eer Arg Asn Cys Cys 15 10 15

Ser Pro Cys Lys Cys Aen Phe AlyPro Pro Val Pro Arg Cys Thr Asn 20 25 30 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID NR:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 550 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP ŁAŃCUCHA: podwójny (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii) Nm-SENSE e ΠΕ (vi) ŹRÓDŁO PIERWOTNE:

(A) ORGANIZM: Beta vulgaris (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 66..293 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID NR: 7:

ACTCAACAAA TTCAGAAAlC AACAGAAGCA AAAAAAGTTT ATTGAAAGAG TAAGTTGAGG 60 TGAAA ATG ATG AAA AGC TTT GTG ATA GTT ATG TTG GTC ATG TCC ATG 107

Met Met Lys Ser Phe Val Ile Val Met Leu Val Met Ser Met 15 10

ATG GTG Met Val 15

GCTACA ACT

TCT ACA CGT GGT GAC TdA ACT ATT TAT (GGT CAG

155

Ala

TTh AeS

ret Ala 20

Ser

Gly

Glu Cys Asn Me^l: Tyr Gly Air

25

30

TGC

CCC

CJCC

GGG

AAT

TTG

ATT

CGC

ACG

TTT

CGC

TCC

TGG

AGT

GTC

(GA

203

Cys

Pro

dy

Ayr

Cci

Ayy

Ser

Lys

Phe

Gly

Tyr

Cys

dl

Val

dy

35

40

45

AGA

GCC

TAT

TTG

AGG

GGC

GCT

GAG

CAG

AlG

GTT

GAC

GAT

CAT

CCA

TCT

251

Arg

Ala

Tjti

Cci

aig

Ais

eil

Glu

Gln

Lys

Val

Glu

Ais

His

(ho

eSr

50

55

66

AAT

GAT

GCT

GAT

GTT

CCT

GAG

TTT

GTTT

GGA

GCT

GGT

dAC

CCA

293

Asn

Asp

Ala

Acs

Val

Pro

Glu

Phe

Vv1

Gly

Ala

Gly

Ala

Ppo

65

70

75

AGATGCTCGA AGCCAUTA* TCGTAATm ATUGTTCAC TAATAAGTAA ACTACTTGTC 353 UTAH^H TlAlTCCTTA TCACCTATCA ATAAlCTCIT ACAGGAGTTG TGTTTTTCTT 413 TTAATTTTGT AATAClGUT TTGACTTTAA TrAATGAGAC CAATGTATAC TTlIATlTCl 473 GATAAATATN ΤΑ^ΤΑΙ^Α ACTCGTATTC GTTTATTATA ACCATCCTlT AAAAAAAAAA 533 AAAAAAAAAA AAAAAAA 550 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI ID NR:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 76 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPLOGGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID NR: 8:

Met Met Lys SSr Phe Val 11e Val Met Llu Val Met VSe Met MeŁ Val

1

5

10

Ala

Thr

Ser

MMe

Alil

Ser

Gly

Glu

Cys

Asn

Met

Gly

Arg

Cys

Pro

20

25

30

Pro

Gly

Tyr

CCy

Cys

Ser

Lys

Phe

Gly

Tyy

Cys

Gly

Val·

Gly

Arg

Ala

35

40

45

Tyr

Cys

Gly

AAs

Ala

Glu

Gln

Lys

Val

Glu

Asp

His

Ppo

Ser

Asn

Asp

50

55

60

Ala

Asp

Val

Ppr

Glu

Phe

Val

Gly

Ala

Gljr

Ala

Ppo

65

70

75

181 851

Czas (min)

FIG.2

FIG.3

181 851

FIG. 4

FIG. 5

181 851

FIG. 6

FIG. 7

181 851

FIG. 8

181 851

FIG. 9

181 851

Białko (280nm)

Wplyw/płukanie

Czas (min)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. 'Białko zwalczające mikroorganizmy wybrane z grupy białek mających sekwencję określoną w SEK. ID Nr 1-3.

2. Kombinacja białka zwalczającego mikroorganizmy z co najmniej jednym białkiem przeciwgrzybowym, w której białko zwalczające mikroorganizmy jest wybrane z grupy białek mających sekwencję określoną w SEK. ID Nr 1-3, a białko przeciwgrzybowe jest wybrane z grupy białek mających sekwencję określoną w SEK. ID Nr 4-6.