PL182814B1

PL182814B1 - Zrekombinowany adenowirus i środek farmaceutyczny przeznaczony do przenoszenia leczniczego DNA u człowieka

Info

Publication number: PL182814B1
Application number: PL94311660A
Authority: PL
Inventors: Haddada@Hedi; Klonjkowski@Bernard; Perricaudet@Michel; Vigne@Emmanuelle
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1993-05-18
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 2002-03-29
Also published as: CZ302895A3; CN1067722C; DE69429260T3; NO954466L; FI118538B; ES2167365T5; ES2167365T3; IL109644A; KR100379569B1; EP0698108B2; KR960702525A; CN1124040A; DE69429260D1; ZA943358B; DK0698108T4; FI955552L; IL109644A0; NO320818B1; HUT73465A; JP3995259B2

Abstract

1. Zrekombinowany adenowirus przeznaczony do przenoszenia leczniczego D N A u czlowieka zawierajac heterologiczna sekwencje D N A wybrana z grupy obejmujacej: sekwencje lecznicza, sekwencje promotorowa, umozliwiajaca ekspresje sekwencji leczniczej, oraz sekwencje syg- nalowa umozliwiajaca wydzielanie produktu ekspresji sekwencji leczniczej, znamienny tym, ze jest adenowirusem pochodzenia zwierzecego. 5. Srodek farmaceutyczny wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze ilosc wirusa w dawce jednostkowej wynosi od 104 do 101 4 pfu/ml srodka. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany adenowirus przeznaczony do przenoszenia leczniczego DNA u człowieka zawierający heterologiczną sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej: sekwencję leczniczą, sekwenjcę promotorową, umożliwiającą ekspresję sekwencji leczniczej, oraz sekwencję sygnałową, umożliwiającą wydzielanie produktu ekspresji sekwencji leczniczej charakteryzujący się tym, że jest adenowirusem pochodzenia zwierzęcego.

Korzystnie, zrekombinowany adenowirus według wynalazku jest adenowirusem psim, korzystnie wybranym spośród szczepów adenowirusa CAV2.

Korzystnie, zrekombinowany adenowirus według wynalazku jest pozbawiony sekwencji potrzebnych do replikacji, korzystnie regionów E1A i E1B.

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny do przenoszenia leczniczego DNA u człowieka zawierający cząsteczki wirusa i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik charakteryzujący się tym, że wirus jest zrekombinowanym adenowirusem zawierającym heterologiczną sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej: sekwencję leczniczą, sekwencję promotorowćą umożliwiającą ekspresję sekwencji leczniczej, oraz sekwencję sygnałową umożliwiającą na wydzielanie produktu ekspresji sekwencji leczniczej, przy czym adenowirus jest adenowirusem pochodzenia zwierzęcego.

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że ilość wirusa w dawce jednostkowej wynosi od 10⁴ do 10¹⁴ pfu/ml środka.

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, ze adenowirus jest adenowirusem psim, korzystnie wybranym spośród szczepów adenowirusa CAV2.

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że genom zrekombinowanego adenowirusa jest pozbawiony przynajmniej sekwencji potrzebnych do replikacji, korzystnie regionów E1A i E1B.

Szczegółowe omówienie wynalazku. Niniejszy wynalazek udostępnia w ten sposób wektory wirusów szczególnie przystosowane do przenoszenia i/lub ekspresji u ludzi pożądanych sekwencji DNA.

182 814

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest więc zastosowanie zrekombinowanego wirusa pochodzenia zwierzęcego, zawierającego heterologiczną sekwencję DNA, do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do traktowania leczniczego i/lub chirurgicznego ciała ludzkiego.

Adenowirusy pochodzenia zwierzęcego, nadające się do stosowania w zakresie niniejszego wynalazku mogą mieć różne pochodzenie, z wyłączeniem adenowirusów ludzkich. Adenowirusy ludzkie są to u człowieka z natury rzeczy wirusy zakaźne, zazwyczaj oznaczone przez HAJ lub Ad.

W szczególności adenowirusy pochodzenia zwierzęcego, nadające się do stosowania w ramach niniejszego wynalazku, mogą pochodzić od psa, wołu, myszy (przykład: Mav 1, Beard i in., Virology, 75(1990)81), owcy, świni, ptaków lub też małp (przykład: SAV).

Szczególnie spośród adenowirusów ptasich można wymienić serotypy 1 do 10 dostępne dla ATCC jak np. szczepy Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-11 (ATCC VR-921), lub też szczepy oznaczone jako ATCC VR-831 do 835. Spośród adenowirusów bydlęcych można stosować różne znane serotypy, a zwłaszcza dostępne dla ATCC (typy 1 do 8) oznaczone jako ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 i 769. Można również wymienić adenowirusy mysie FL (ATCC VR-550) i E 20308 (ATCC VR-528), adenowirus owczy typ 5 (ATCC VR-1343), lub typ 6 (ATCC VR-1340); adenowirus świński (5359) lub adenowirusy małpie, takie jak mianowicie adenowirus oznaczony ATCC o numerach VR-591-594, 941-943, 195-303 itd.

Korzystnie w zakresie wynalazku stosuje się adenowirusy pochodzące od psa, a zwłaszcza wszystkie szczepy adenowirusów CAV2 (np. szczep Manhattan lub A26/61 (ATCC VR-800)). Adenowirusy psie były przedmiotem licznych badań strukturalnych. I tak opisano według dotychczasowego stanu wiedzy całkowite mapy restrykcji adenowirusów CAV1 i CAV2 (Spibey i in., J.Gen.Virol., 70 (1989)165), oraz sklonowano i ustalono sekwencje genów Ela. E3, jak również sekwencje ITR (patrz zwłaszcza Spibey i in., Virus Res., 14(1989) 241; Linne, Virus Res, 23(1992)119, W091/11525). Poza tym adenowirusy psie stosowano już do wytwarzania szczepionek przeznaczonych do szczepów psów przeciw wściekliźnie, parwowirusom itp. (WO 91/11525).

Jednakże aż do tej pory przy dotychczasowym stanie wiedzy nigdy nie sugerowano możliwości zastosowania tych adenowirusów do terapii genowej u ludzi. Poza tym nigdy nie rozważano korzyści takiego zastosowania.

Adenowirusy korzystnie stosowane w zakresie wynalazku powinny być defektywne, to jest niezdolne do mnożenia się autonomicznie w organizmie, do którego je wprowadzono. Jak zaznaczono wyżej, Zgłaszający wykazał, że wirusy adenowirusy pochodzenia zwierzęcego są zdolne do zakażania komórek ludzkich, ale nie do mnożenia się w nich. W tym znaczeniu są one z natury defektywne u człowieka i z tego względu w przeciwieństwie do stosowania adenowirusów ludzkich nie wymagają modyfikacji genetycznej. Jednakże defektywny charakter tych adenowirusów można wzmocnić przez modyfikacje genetyczne genomu, a zwłaszcza przez modyfikację sekwencji niezbędnych do replikacji wspomnianego wirusa w komórkach.

Regiony te można albo usunąć (całkowicie lub częściowo) albo uczynić niefunkcjonalnymi lub też zmodyfikować przez insercję innych sekwencji, a zwłaszcza heterologicznej sekwencji DNA.

Zależnie od pochodzenia adenowirusa sekwencje potrzebne do replikacji mogą się trochę zmieniać. Jednakże umiejscawia się je zwykle przy końcach genomu. I tak w wypadku CAV-2 region E1a zidentyfikowano, sklonowano i ustalono sekwencję (Spibey i in., Virus Res., 14(1989) 241). Mieści się on we fragmencie 2kb w lewym końcu genomu adenowirusa.

Można poza tym przeprowadzić w tych adenowirusach inne modyfikacje genetyczne zwłaszcza dla uniknięcia wytwarzania białek wirusowych niepożądanych u człowieka, dla umożliwienia insercji heterologicznych sekwencji DNa o dużych rozmiarach i/lub dla insercji określonych regionów genomu innego adenowirusa pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego (przykład: gen E3).

182 814

W sensie niniejszego wynalazku termin „sekwencja DNA heterologiczna” oznacza każdą sekwencję DNA wprowadzoną do wirusa, której przeniesienia i/lub ekspresja u człowieka jest pożądane.

W szczególności heterologiczna sekwencja DNA może obejmować jeden lub kilka genów leczniczych i/lub jeden lub kilka genów kodujących białka antygenowe.

W specjalnej procedurze użycia wynalazek dotyczy więc szczególniej zastosowania adenowirusa pochodzenia zwierzęcego do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do przekazania genów leczniczych człowiekowi. Genem leczniczym, który można tak przekazać jest każdy gen, którego transkrypcja i ewentualnie transdukcja do komórki docelowej tworzy produkty o działaniu leczniczym.

Chodzi szczególnie o geny kodujące produkty białkowe mające działanie lecznicze. Produkt białkowy tak kodowany może być białkiem, peptydem, aminokwasem itd. Taki produkt białkowy może być homologiczny wobec komórki docelowej (to znaczy produkt, który normalnie wykazuje ekspresję w komórce docelowej, gdy ona nie jest patologiczna). W tym przypadku ekspresja białka pozwala np. na złagodzenie niedostatecznej ekspresji w komórce lub ekspresji białka nieaktywnego lub mało aktywnego z powodu modyfikacji lub też nadekspresji wspomnianego białka. Gen leczniczy może również kodować mutanta białka komórkowego, mającego zwiększoną stabilność, zmodyfikowaną aktywność itd. Produkt białkowy może również być heterologiczny wobec komórki docelowej. W tym wypadku białko dzięki ekspresji może np. uzupełniać lub nadawać niepełną aktywność komórce, co jej pozwala zwalczyć patologię.

Spośród produktów leczniczych w sensie niniejszego wynalazku można przytoczyć szczególnie enzymy, pochodne krwi, hormony, limfokiny, interleukiny, interferony, itd. (FR 9203120), czynniki wzrostu, neuroprzekaźniki lub ich prekursory albo enzymy syntetyczne, czynniki troficzne: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, itd.; apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE itd. (FR 93 05125), dystrofinę lub minidystrofinę (FR 9111947), geny supresorowe nowotworów: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, itd. (FR 9304745), geny kodujące czynniki związane z koagulacją: czynniki VII, VIII, IX itd.

Gen leczniczy może być również genem lub sekwencją nonsensowną, której ekspresja w komórce docelowej pozwala na regulację ekspresji genów lub transkrypcji komórkowych mRNA. Takie sekwencje można np. transkrybować w komórce docelowej na RNA komplementarny wobec mRNA komórkowych i blokować w ten sposób transdukcję do białka metodą opisaną w europejskim opisie patentowym EP 140308.

Jak zaznaczono wyżej, heterologiczna sekwencja DNA może także obejmować jeden lub kilka genów kodujących białko antygenowe zdolne do tworzenia u człowieka odpowiedzi immunologicznej. W specjalnej procedurze użycia wynalazek pozwala więc zrealizować szczepionki, umożliwiające uodpornienie ludzi, zwłaszcza wobec drobnoustrojów lub wirusów. Chodzi tu zwłaszcza o specyficzne peptydy antygenowe wirusa Epsteina i Barra, wirusa zapalenia wątroby B (EP 185573), wirusa pseudowścieklizny lub też nowotworów (EP 259212).

Zwykle heterologiczna sekwencja DNA zawiera również sekwencje pozwalające na ekspresję genu leczniczego i/lub genu kodującego peptyd antygenowy w zakażonej komórce. Chodzi tu o sekwencje, które są w sposób naturalny odpowiedzialne za ekspresję genu rozważanego, gdy są one zdolne do funkcjonowania w zakażonej komórce. Może tu również chodzić o sekwencje różnego pochodzenia (odpowiedzialne za ekspresję innych białek lub nawet syntetyczne). Mianowicie może tu chodzić o sekwencje promotorowe genów eukariotycznych lub wirusowe. Np. może chodzić o sekwencje promotorowe, pochodzące od genomu komórki, którą ma się zarazić. Również może chodzić o sekwencje promotorowe, pochodzące od genomu wirusa, włączając tu użytego adenowirusa. Z tego tytułu można wymienić np. promotory genów E1A, MLP, CMV, RSV itd. Ponadto takie sekwencje ekspresji można zmodyfikować przez dodanie sekwencji aktywacji, regulacji itd. Ponadto, gdy gen wprowadzany nie zawiera sekwencji ekspresji można go wprowadzić do genomu wirusa defektywnego poniżej takiej sekwencji.

182 814

Poza tym heterologiczna sekwencja DNA może również zawierać szczególnie powyżej genu leczniczego, sekwencję sygnałową, kierującą syntetyzowany produkt leczniczy na drogi wydzielania komórki docelowej. Taka sekwencja sygnałowa może być naturalną sekwencją sygnałową produktu leczniczego, ale może również tu chodzić o każdą inną, funkcjonalną sekwencję sygnałową lub sekwencję sygnałową sztuczną.

Defektywne adenowirusy według wynalazku można wytworzyć każdą metodą znaną fachowcowi. W szczególności można je wytworzyć według protokołu opisanego w zgłoszeniu patentowym WO 91/11525. Klasyczna metoda wytwarzania polega na rekombinacji homologicznej między adenowirusem zwierzęcym i plazmidem, zawierającym między innymi heterologiczną sekwencję DNA, którą ma się wprowadzić. Rekombinację homologiczną prowadzi się po kotransfekcji wspomnianych adenowirusa i plazmidu do odpowiedniej linii komórkowej. Korzystnie używana linia komórkowa powinna być zdolna do transformacji wspomnianymi elementami i w wypadku, gdy używa się zmodyfikowanego adenowirusa pochodzenia zwierzęcego, linia komórkowa może, jeśli trzeba, zawierać sekwencje zdolne do komplementacji części genomu adenowirusa defektywnego, korzystnie w postaci zintegrowanej dla uniknięcia ryzyka rekombinacji. Jako przykład linii można wymienić linię komórek nerkowych charta GHK (Flow laboratories) lub linię komórkową MDCK. Warunki hodowli komórek i wytwarzania wirusów lub DNA wirusowego opisano również w literaturze (patrz zwłaszcza Macatney i in., Science, 44(1988)9; Fowlkes i in., J.Mol.Biol., 132 (1979)163).

Następnie wektory, które się namnaża, uzyskuje się i oczyszcza metodami klasycznymi biologii molekularnej.

Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest zrekombinowany adenowirus pochodzenia zwierzęcego, zawierający heterologiczną sekwencję DNA, obejmującą co najmniej jeden gen leczniczy, taki jak określono poprzednio.

Przedmiotem wynalazku jest również każda kompozycja farmaceutyczna, zawierająca zrekombinowany adenowirus pochodzenia zwierzęcego, taki jak określono powyżej. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można sporządzać dla podawania zewnętrznego, doustnego, pozajelitowego, donosowego, dożylnego, domięśniowego, podskórnego, śródocznego itd.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera nośniki farmaceutycznie dopuszczalne dla preparatu nadającego się do wstrzyknięć. Może tu chodzić w szczególności o roztwory soli (fosforan jednosodowy, dwusodowy, chlorek sodu, potasu, wapnia lub magnezu itd. lub mieszaniny tych soli), jałowe, izotoniczne lub o kompozycje suche, zwłaszcza liofilizowane, które przez dodanie zależnie od potrzeby wody sterylnej lub fizjologicznego roztworu soli, tworzą roztwory nadające się do wstrzyknięć.

Dawki wirusów używane do wstrzyknięć można dostosować zależnie od różnych parametrów a zwłaszcza zależnie od stosowanego sposobu podawania, odnośnej choroby, genu do ekspresji lub też ustalonego czasu leczenia. Ogólnie rzecz biorąc, zrekombinowane adenowirusy według wynalazku przygotowuje się i podaje w dawkach od 10⁴ do 10¹⁴ pfu/ml, a korzystnie 10⁶ do 10¹⁰ pfu/ml. Termin pfu/ml („plaque forming unit”) odpowiada zdolności zakażania roztworu wirusów i określa się przez zakażenie odpowiedniej hodowli komórkowej i pomiar zwykle po 5 dniach liczby łysinek zakażonych komórek. Metody oznaczania miana pfu roztworu wirusów dobrze dokumentuje literatura.

Zależnie od wprowadzonej heterologicznej sekwencji DNA adenowirusy według wynalazku można używać do leczenia lub zapobiegania licznych patologii, włączając choroby genetyczne (dystrofia, zwłóknienie torbielowe itd.), choroby neurozwyradniające (Alzheimer, Parkinson, ALS itd.), raki, patologię związane z zaburzeniami koagulacji lub z zaburzeniami zawartości lipoprotein we krwi i patologie związane z zakażeniami wirusowymi (zapalenie wątroby, AIDS itd.) itd.

Niniejszy wynalazek zostaje dokładniej opisany za pomocą następujących przykładów, które należy uważać za objaśniające, ale nie ograniczające.

Legenda figur. Figura 1: Mapa restrykcji adenowirusa CAV2 szczepu Manhattan (według Spibeya i in., wymienionego poprzednio).

182 814

Figura 2: Mapa plazmidów pl, p2 (fig. 2a) i p3 (fig. 2b).

Figura 3: Strategia konstrukcji zrekombinowanego adenowirusa psiego, zawierającego heterologiczną sekwencję DNA.

Metody ogólne biologii molekularnej

Metody klasycznie używane w biologii molekularnej, takie jak ekstrakcja preparatywna plazmidowego DNA, wirowanie plazmidowego DNA w gradiencie chlorku cezu, elektroforeza w żelu agarozowym lub akrylamidowym, oczyszczanie fragmentów DNA przez elektroelucję, ekstrakcję białek fenolem lub mieszaniną fenol-chloroform, wytrącanie DNA w środowisku solnym etanolem lub izopropanolem, transformacja w Escherichia coli itd. są dobrze znane fachowcowi i szeroko opisano je w literaturze [T. Maniatis i in., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; F.M.Ausubel i in., (eds), „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, 1987].

Plazmidy typu pBR322, pUC i fagi serii M13 pochodzą z handlu (Bethesda Research Laboratories).

Dla połączenia fragmenty DNA można wydzielić zależnie od rozmiarów przez elektroforezę w żelu afarozowym lub akrylamidowym, wyekstrahować fenolem lub mieszaniną fenol-chloroform, wytrącić etanolem, po czym inkubować w obecności ligazy DNA faga T4 (Biolabs) zależnie od zaleceń dostawcy.

Wypełnienie wystających końców 5' można przeprowadzić fragmentem Klenowa DNA polimerazy Iz E. coli (Biolabs) zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Destrukcję wystających końców 3' prowadzi się w obecności DNA polimerazy faga T4 (Biolabs), używanej według zaleceń producenta. Zniszczenie wystających końców 5' prowadzi się przez ostrożne traktowanie nukleazą S1.

Mutagenezę sterowaną in vitro syntetycznymi oligodezoksynukleotydami można przeprowadzić metodą opracowaną przez Taylora i in., [Nucleic Acid Res., 13 (1985) 8749-8764], stosując zestaw do zmontowania, którego dystrybutorem jest Amersham.

Amplifikację enzymatyczną fragmentów DNA metodą zwaną PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, R.K.Saiki i in., Science, 230 (1985)1350-1354; K.B.Mullis i F.A.Faloona, Meth.Enzym. 155 (1987)335-350] można przeprowadzić, stosując „DNA thermal cycler” (Perkin Elmer Cetus) według specyfikacji producenta.

Weryfikację sekwencji nekleotydów można wykonać metodą opracowaną przez Sangera i in. [Proc.Natl.Acad. Sci.USA. 74 (1977)5463-5467], stosując zestaw do zmontowania, którego dystrybutorem jest Amersham.

Przykłady

E1. Zakażenie komórek ludzkich adenowirusami, pochodzącymi od psa.

Przykład ten wykazuje zdolność adenowirusów pochodzenia zwierzęcego (psiego) do zakażania komórek ludzkich.

E1.1. Stosowane linie komórkowe

W przykładzie tym stosowano następujące linie komórkowe:

- Linię z nerek embrionu ludzkiego 293 (Graham i in., J.Gen.Virol. 36(1977)59). Linia ta zawiera mianowicie zintegrowaną z jej genomem lewą cześć genomu adenowirusa ludzkiego Ad5 (12%).

- Linię komórek ludzkich KB: linia ta, pochodząca z raka naskórka ludzkiego, jest dostępna dla ATCC (odnośnik CCL17), jak również istnieją warunki pozwalające na jej hodowlę.

- Linia komórek ludzkich Hela: linia ta, pochodząca z raka nabłonka ludzkiego, jest dostępna dla ATCC (odnośnik CCL2), jak również istnieją warunki pozwalające na jej hodowlę.

- Linia komórek psich MDCK: warunki hodowli komórek MDCK opisano mianowicie przez Macataneya i in., Science, 44 (1988)9.

E1.2. Zakażenie

Komórki linii komórkowych wzmiankowanych powyżej zakażono wirusem CAV2 (szczep Manhattan). W tym celu komórki (około 10⁷/pojemnik) inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w obecności 10 pfu/komórkę wirusa. Następnie dodano 5 ml środowiska

182 814 hodowli i kontynuowano hodowlę w temperaturze 37°C w ciągu około 48 godzin. W tym momencie zanalizowano DNA obecny w postaci episomu w zakażonych komórkach: otrzymane wyniki pokazują, że wszystkie te linie komórkowe posiadają DNA CAV2 w swych jądrach, co wykazuje ich zdolność do zakażania adenowirusami psimi.

E2. Brak rozmnażania adenowirusów pochodzących od psów w komórkach ludzkich.

Przykład ten wykazuje, że adenowirusy psie, chociaż zdolne do zakażania komórek ludzkich, nie rozmnażają się w nich.

Po zakażeniu komórek zgodnie z przykładem 1 ilość DNA z CAV2 oznaczono w okresie czasu według następującego protokołu: DNA episomowy obecny w komórkach odzyskano według metody opisanej przez Hirta i in., (J.Virol., 45(1983)91) i oznaczono ilość DNA przez porównanie z serią wzorców. Otrzymane wyniki ukazują, że ilość wirusowego DNA nie wzrasta w komórkach KB i 293, wykazując całkowity brak replikacji CAV2 w tych komórkach. W komórkach MDCK i Hela obserwuje się lekki wzrost ilości wirusowego DNA z CAV2. Jednakże oznaczenie tworzenia cząstek wirusowych ukazuje, że nie zachodzi żadne rozmnażanie CAV2 w komórkach ludzkich 293, KB i Hela, ale jedynie w linii psiej MDCK. Rozmnażanie mierzono przez pobranie zakażonych komórek, uwolnienie ewentualnych wirusów przez zamrożenie/odmrożenie i zakażenie tak otrzymanym supematantem w warunkach opisanych poprzednio. Po 48 godzinach hodowli nieobecność wirusowego DNA w tak zakażonych komórkach MDCK pokazuje, że nie zachodziło żadne rozmnażanie wirusów w komórkach ludzkich.

Wyniki te jasno pokazują, że adenowirusy psie są niezdolne do rozmnażania w komórkach ludzkich.

E3. Wykazanie braku trans-komplementacji adenowirusów psich przez adenowirusy ludzkie.

Przykład ten ukazuje, że przy braku rozmnażania adenowirusów psich w komórkach ludzkich nie zachodzi trans-komplementacja przez obecność adenowirusów ludzkich.

Komórki linii ludzkich 293, KB i Hela oraz linii psiej MDCK zakażono jednocześnie adenowirusem CAV2 i adenowirusem ludzkim Ad5. Obecność wirusowego DNA (psiego i ludzkiego) w komórkach wykazano, jak w przykładzie E1, a ilość DNA jak również rozmnażanie oznaczano w okresie czasu. Otrzymane wyniki wskazują, że ilość DNA z CAV2 nie wzrasta w danym czasie w komórkach KB i 293, a więc, że obecność ludzkiego adeno wirusa Ad5 nie wywołuje przez trans-komplementację replikacji CAV2 w tych komórkach. Nieobecność wirusowego DNA w komórkach MDCK zakażonych ewentualnymi wirusami z komórek KB, 293 i Hela pokazuje tak samo, że w ludzkich liniach komórkowych nie zachodzi namnażanie adenowirusa CAV2 nawet w obecności adenowirusa ludzkiego.

E4. Konstrukcja banku genomowego DNA z CAV2.

Bank plazmidów utworzono z fragmentów, pochodzących z restrykcji genomu adenowirusa CAV2. Bank ten otrzymano przez działanie na CAV2 enzymami SmaI oraz PstI i klonowanie fragmentów SmaI: A,B,C,D,E,F,I i J oraz PstI: A,B,C,D,E,F,G,H (fig. 1) w wektorze pGem3Zf+ (Promega). Plazmid, zawierający fragment Smal C następnie transfekowano do komórek MDCK razem z plazmidem pUC4KIXX (Pharmacia), zawierającym gen odporności na neomycynę dla założenia linii MDCK, w której ma miejsce podstawowa ekspresja genów E1A i E1B z CAV2. Linia ta pozwala na konstrukcję zrekombinowanych wirusów z delecją tych regionów (porównaj E5.2).

E5. Konstrukcja zrekombinowanych wirusów psich, zawierających gen interleukiny-2 pod kontrolą promotora MLP z Ad2.

Opracowano dwie strategie konstrukcji zrekombinowanych wirusów psich, zawierających gen interleukiny-2 pod kontrolą promotora MLP z ludzkiego Ad2.

El. Pierwsza polega na insercji żądanej heterologicznej sekwencji DNA (promotor MLP - gen interleukiny-2) miedzy regionem E4 i prawym ITR całkowitego genomu CAV2 na poziomie miejsca restrykcji SmaI. Konstrukcja takiego rekombinanta zachodzi albo przez ligację albo przez rekombinacje in vivo miedzy plazmidem, zawierającym żądaną heterologiczną

182 814 sekwencję DNA i genomem CAV2. Plazmidy używane do otrzymania zrekombinowanych adenowirusów, zawierających gen interleukiny-2 pod kontrolą promotora MLP konstruuje się w następujący sposób (fig. 2):

- pierwszy plazmid oznaczony przez p1 otrzymuje się przez klonowanie fragmentu SalI B z CAV2 (fig. 1), zawierającego mianowicie ITR prawy, miejsce Smal i gen E4, w plazmidzie pGem 3Zf+ (Promega), miejsce SmaI jest jedynie na pl;

- heterologiczną sekwencję DNA (promotor MLP - gen interleukiny-2) wprowadza się na poziomie miejsca SmaI plazmidu p1, aby utworzyć plazmid p2;

- fragment Pstl-SalI zawarty we fragmencie PstI D z banku genomowego i zawierający część genu E3 następnie klonuje się w odpowiednim miejscu w p2, aby utworzyć plazmid p3 (fig. 2).

Tak otrzymane plazmidy używa się do wytworzenia zrekombinowanych adenowirusów według następujących dwóch protokołów (patrz fig. 3).

a) Ligacja in vitro plazmidu p2 sterowanego przez SalI z fragmentem SalI A z CAV2 i transfekcja produktu ligacji do komórek MDCK (fig. 3a),

b) Rrekombinacja między plazmidem p3 i fragmentem SalI A z CAV2 po kotransfekcji do komórek MDCK (fig. 3b). Otrzymane zrekombinowane wirusy następnie oddziela się i amplifikuje metodami znanymi fachowcowi.

Manipulacje te pozwalają na konstrukcję zrekombinowanych adenowirusów psich, zawierających gen interleukiny-2, nadających się do przenoszenia tego leczniczego genu u człowieka (fig. 3).

E5.2. Druga opracowana strategia polega na zastosowaniu linii komórkowej MDCK, w której ma miejsce podstawowa ekspresja genów E1A i E1B z CAV2 (porównaj przykład E4). Linia ta istotnie umożliwia trans-komplementację adenowirusów psich z delecją tych regionów i w ten sposób konstrukcję zrekombinowanych wirusów, których heterologiczną sekwencję DNA podstawia się w regionie E1. W tym celu konstruuje się plazmid, zawierający lewy koniec (sekwencja ITR i sekwencja, tworząca kapsyd) genomu CAV2 i heterologiczną sekwencję DNA. Dokonuje się kontransfekcji tego plazmidu do komórek MDCK opisanych powyżej w obecności genomu adenowirusa CAV2 z delecją własnego lewego końca. Wytworzone zrekombinowane adenowirusy psie odzyskuje się, ewentualnie amplifikuje się i przechowuje się w celu zastosowania u człowieka.

E6. Przykłady kompozycji farmaceutycznej, zawierającej rekombinowane wirusy, przeznaczonej do wstrzykiwania.

E6. 1 Porcja odpowiadająca dawce jednostkowej liofilizowany zrekombinowany adenowirus fizjologiczny roztwór NaCl w sterylnej Ii₂O	10⁴ pfu 1 ml
E6. 2 Porcja odpowiadająca 10 dawkom liofilizowany zrekombinowany adenowirus fizjologiczny roztwór KCl w sterylnej H2O	1O¹⁰ 10 ml

182 814

Fig. 2a

182 814

Fig. 2b

182 814

ligacja cav2 i p2 sterowanych przez Sali

CAV-2

P2

Transfekcją do MDCK

DNA heterologiczny

ITR

Fig. 3a

182 814

Ρ3rozwinięty

Fragment Pstl D ν , P3 rozwinięty

Sil

CAV2 rozwinięty przez Sali

DNA heterologiczny

ITR

Fig. 3b

182 814

C JK A LU

B D l

Apst

Sal I

C E F GH A

J_L_I_1—U

Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zrekombinowany adenowirus przeznaczony do przenoszenia leczniczego DNA u człowieka zawierając heterologiczną sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej: sekwencję leczniczą, sekwencję promotorową, umożliwiającą ekspresję sekwencji leczniczej, oraz sekwencję sygnałową, umożliwiającą wydzielanie produktu ekspresji sekwencji leczniczej, znamienny tym, że jest adenowirusem pochodzenia zwierzęcego.

'
2. Zrekombinowany adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że adenowirus jest adenowirusem psim, korzystnie wybranym spośród szczepów adenowirusa CAV2.
3. Zrekombinowany adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że jest pozbawiony sekwencji potrzebnych do replikacji, korzystnie regionów E1A i E1B.
4. Środek farmaceutyczny do przenoszenia leczniczego DNA u człowieka zawierający cząsteczki wirusa i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że wirus jest zrekombinowanym adenowirusem zawierającym heterologiczną sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej: sekwencję leczniczą, sekwencję promotorową, umożliwiającą ekspresję sekwencji leczniczej, oraz sekwencję sygnałową umożliwiającą na wydzielanie produktu ekspresji sekwencji leczniczej, przy czym adenowirus adenowirusem pochodzenia zwierzęcego.
5. Środek farmaceutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że ilość wirusa w dawce jednostkowej wynosi od 10⁴ do 10¹⁴ pfu/ml środka.
6. Środek farmaceutyczny według zastrz. 5, znamienny tym, że adenowirus jest adenowirusem psim, korzystnie wybranym spośród szczepów adenowirusa CAV2.
7. Środek farmaceutyczny według zastrz. 5, znamienny tym, ze genom zrekombinowanego adenowirusa jest pozbawiony przynajmniej sekwencji potrzebnych do replikacji, korzystnie regionów E1A i E1B.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowych wektorów wirusów, opisując metody ich wytwarzania i zastosowania ich w terapii genowej. Dotyczy on również środków farmaceutycznych, zawierających wspomniane wektory wirusów: Wynalazek ujawnia zastosowania adenowirusów zrekombinowanych pochodzenia zwierzęcego jako wektorów do terapii genowej.

Terapia genowa polega na poprawianiu niedoboru lub nieprawidłowości (mutacja, nienormalna ekspresja itd.) przez wprowadzenie informacji genetycznej do komórki lub chorego narządu. Taką informację genetyczną można wprowadzić albo in vitro do komórki wyekstrahowanej z narządu, przy czym zmodyfikowaną komórkę wprowadza się znów do organizmu albo bezpośrednio in vivo do odpowiedniej tkanki. W tym drugim wypadku stosuje się rozmaite metody. Wśród nich różne metody transfekcji z udziałem kompleksów DNA i DEAE-dekstran (Pagano i in., J.Virol., 1(1967), 891) DNA i białek jądrowych (Kanada i in., Science, 243(1989) 375), DNA i lipidów (Feigner i in., PNAS,84 (1987)7413), użyciem liposomów (Fraley i in., J.Biol. Chem. 255(1980), 10431) itd. Ostatnio użycie wirusów jako wektorów do przenoszenia genów pojawiło się jako obiecująca alternatywa wobec fizycznych metod transfekcji. Z tego względu przebadano różne wirusy co do ich zdolności zakażania pewnych populacji komórek, a w szczególności retrowirusy (RSV, HMS, MMS itd.), wirus HSV, wirusy towarzyszące adenowirusom i adenowirusy.

Spośród tych wirusów adenowirusy wykazują pewne właściwości interesujące przy zastosowaniu w terapii genowej. Mianowicie mają szeroką gamę biorców, są zdolne do zakażania komórek w spoczynku i nie integrują się z genomem zakażonej komórki. Z tych względów

182 814 używano już adenowirusów do przenoszenia genów in vivo. W tym celu wytworzono różne wektory pochodne adenowirusów, włączając różne geny (β-gal, OTC, a-1AT, cytokiny itd.). Wszystkie opisane wektory pochodne adenowirusów w celu zastosowania w terapii genowej u człowieka według dotychczasowego stanu wiedzy aż dotąd wytwarzano z adenowirusów pochodzenia ludzkiego. Istotnie wydawały się najbardziej odpowiednie do takiego zastosowania. Dla uniknięcia ryzyka powielania i tworzenia cząstek zakaźnych in vivo, używane adenowirusy zwykle modyfikuje się tak, aby uczynić je niezdolnymi do replikacji w zakażonej komórce.

I tak konstrukcje opisane według dotychczasowego stanu wiedzy są adenowirusami z delecją regionów E1 (Ela i/lub Elb) i ewentualnie E3, na poziomie których dokonuje się insercji sekwencji korzystnych (Levrero i in., Gene, 101(1991) 195; Gosh-Choudhury i in., Gene, 50(1986)161). Jednakże poza tym niezbędnym etapem modyfikacji, wektory opisane według dotychczasowego stanu wiedzy wykazują inne niedogodności, które ograniczają ich wykorzystanie w terapii genowej, a mianowicie ryzyko rekombinacji z dzikimi adenowirusami. Niniejszy wynalazek przynosi korzystne rozwiązanie tych problemów.

Niniejszy wynalazek polega na zastosowaniu zrekombinowanych adenowirusów pochodzenia zwierzęcego do terapii genowej u człowieka. Niniejszy wynalazek polega na wykazaniu, że adenowirusy pochodzenia zwierzęcego są zdolne do zakażania komórek ludzkich bardzo skutecznie. Wynalazek opiera się również na wykazaniu, że adenowirusy pochodzenia zwierzęcego są niezdolne do mnożenia się w komórkach ludzkich, w których je testowano. Wynalazek polega w końcu na nieoczekiwanym odkryciu, że adenowirusy pochodzenia zwierzęcego nie ulegają wcale transkomplementacji wirusami pochodzenia ludzkiego, co usuwa wszelkie zagrożenie rekombinacji i mnożenia in vivo w obecności adenowirusa ludzkiego, co mogłoby prowadzić do tworzenia cząstek zakaźnych. Wektory według wynalazku są więc szczególnie korzystne, gdyż usuwa się lub mocno ogranicza naturalne zagrożenia związane z zastosowaniem wirusów jako wektorów w terapii genowej, takie jak chorobotwórczość, transmisja, replikacja, rekombinacja itd.