PL210412B1 - Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania - Google Patents

Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania

Info

Publication number
PL210412B1
PL210412B1 PL373886A PL37388603A PL210412B1 PL 210412 B1 PL210412 B1 PL 210412B1 PL 373886 A PL373886 A PL 373886A PL 37388603 A PL37388603 A PL 37388603A PL 210412 B1 PL210412 B1 PL 210412B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
amino acids
antibody
igfr1
light chain
Prior art date
Application number
PL373886A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373886A1 (pl
Inventor
Yan Wang
Robert Greenberg
Leonard Presta
Jonathan A. Pachter
Judith Hailey
Peter Brams
Denise Williams
Mohan Srinivasan
Mary Diane Feingersh
Original Assignee
Schering Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Corp filed Critical Schering Corp
Publication of PL373886A1 publication Critical patent/PL373886A1/pl
Publication of PL210412B1 publication Critical patent/PL210412B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest izolowane przeciwciało przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania. Niniejszy wynalazek dotyczy w ogólności w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiemu receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGFR1, ang. Insulin-like Growth Factor Receptor-I), jak również ich zastosowania i sposobów ich wytwarzania.
Zgłoszenie to czerpie pierwszeństwo z następujących zgłoszeń dokonanych w Stanach Zjednoczonych nr 60/383,459 z 24 maja 2002; nr 60/393,214 z 2 lipca 2002 i nr 60/436,254 z 23 grudnia 2002.
Stan techniki
Insulinopodobne czynniki wzrostu, znane również jako somatomedyny, obejmują insulinopodobny czynnik wzrostu I (IGF-I) i insulinopodobny czynnik wzrostu II (IGF-II) (Klapper i wsp., (1983) Endocrinol. 112: 2215 oraz Rinderknecht i wsp., (1978) Febs. Lett. 89: 283). Te czynniki wzrostu wykazują aktywność mitotyczną wobec różnych typów komórek, włączając w to komórki nowotworowe (Macaulay, (1992) Br. J. Cancer 65: 311), przez wiązanie się do wspólnego receptora zwanego receptorem insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGFR1) (Sepp-Lorenzino, (1998) Breast Cancer Research and Treatment 47: 235). Oddziaływanie IGF z IGFR1 aktywuje receptor przez zapoczątkowanie autofosforylacji receptora na resztach tyrozyny (Butler i wsp., (1998) Comparative Biochemistry and Physiology 121: 19). Po aktywacji, IGFR1, z kolei, fosforyzuje elementy wewnątrzkomórkowe, w celu aktywowania komórkowych szlaków przekazywania sygnałów. Ta aktywacja receptora jest istotna dla stymulacji wzrostu i przeżycia komórek nowotworowych. A zatem zahamowanie aktywności IGFR1 reprezentuje potencjalnie wartościową metodę leczenia albo zapobiegania wzrostowi ludzkich nowotworów i innych chorób proliferacyjnych.
Kilka przesłanek wskazuje, że IGF-I, IGF-II i ich receptor IGFR1 są ważnymi pośrednikami fenotypu nowotworu złośliwego. Stwierdzono, że poziomy IGF-I w surowicy są najsilniejszymi prognostykami ryzyka raka prostaty (Chan i wsp., (1998) Science 279: 563), a podobne badania epidemiologiczne mocno wiążą poziomy IGF-I w osoczu z ryzykiem raka sutka, okrężnicy i płuc.
Nadekspresję insulinopodobnego czynnika wzrostu I wykazano również w kilku liniach raka i tkankach nowotworowych. IGFR1 ulega nadekspresji w 40% wszystkich linii raka sutka (Pandini i wsp., (1999) Cancer Res. 5: 1935) i w 15% linii raka płuc. W tkance guza nowotworowego sutka IGFR1 ulega nadekspresji 6-14 razy, a IGFR1 wykazuje 2-4-krotnie wyższą aktywność kinazy w porównaniu z tkanką prawidłową (Webster i wsp., (1996) Cancer Res. 56: 2781 oraz Pekonen i wsp., (1998) Cancer Res. 48: 1343). Dziewięćdziesiąt procent biopsji tkanki raka okrężnicy i odbytnicy wykazuje zwiększone poziomy IGFR1, przy czym zakres ekspresji IGFR1 koreluje z ostrością choroby. Analiza pierwotnych hodowli komórek raka szyjki macicy i linii komórek raka szyjki macicy wykazało, odpowiednio, 3- i 5-krotną nadekspresję IGFR1, w porównaniu z prawidłowymi komórkami nabłonka szyjki macicy (Steller i wsp., (1996) Cancer Res. 56: 1762). Ekspresja IGFR1 w komórkach maziówczaka również koreluje z agresywnym fenotypem (tj. przerzutowaniem i wysokim poziomem proliferacji; Xie i wsp., (1999) Cancer Res. 59: 3588).
Akromegalia, wolno rozwijająca się choroba, jest powodowana przez hipersekrecję hormonu wzrostu i IGF-I (Ben-Schlomo i wsp., (2001) Endocrin. Metab. Clin. North. Am. 30: 565-583). Antagonizm funkcji IGFR1 może być przydatny w leczeniu choroby.
Istnieje kilka przeciwciał, które są znane w tej dziedzinie, które hamują aktywność IGFR1. Jednakże mają one stosunkowo małą wartość terapeutyczną. Przykładowo, a-IR3 (Kull i WSP., (1983)
J. Biol. Chem. 258: 6561), 1H7 (Li i wsp., (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 196. 92-98 i Xiong i wsp., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 5356-5360; Santa Cruz biotechnology, Inc.; Santa Cruz, CA) oraz MAB391 (R & D Systems; Minneapolis, MN) to mysie przeciwciała monoklonalne, które oddziałują z IGFR1 i hamują jego aktywność. Ponieważ są to przeciwciała mysie, ich przydatność terapeutyczna u ludzi jest ograniczona. Kiedy immunokompetentnym osobom podaje się dawkę mysich przeciwciał, osoby te wytwarzają przeciwciała przeciw mysim sekwencjom immunoglobulinowym.
Te ludzkie przeciwciała anty-mysie (HAMA, ang. human anti-mouse antibodies) neutralizują przeciwciała terapeutyczne i mogą indukować ostrą toksyczność (tj. odpowiedź HAMA).
Jedna z metod, dzięki której można uniknąć odpowiedzi HAMA to zastosowanie w pełni ludzkich przeciwciał, w których brakuje obcych (np. mysich) sekwencji aminokwasowych. Mimo, że zastosowanie przeciwciał w pełni ludzkich jest skuteczną metodą zmniejszania albo przeciwdziałania odPL 210 412 B1 rzucaniu przeciwciała terapeutycznego przez układ immunologiczny gospodarza-człowieka, może nastąpić odrzucenie przeciwciała w pełni ludzkiego. Odrzucenie u człowieka ludzkich przeciwciał można określić jako ludzką odpowiedź anty-ludzkie przeciwciało (odpowiedź HAHA od ang. human anti-human antibody). W odpowiedzi HAHA mogą pośredniczyć takie czynniki, jak obecność w przeciwciałach ludzkich rzadkich, występujących na niskim poziomie, sekwencji aminokwasowych. Z tego powodu przeciwciała terapeutyczne można optymalizować przez włączenie nieimmunogennych albo jedynie słabo immunogennych sekwencji zrębowych przeciwciał ludzkich. Korzystne jest, jeżeli sekwencje występują często w innych przeciwciałach ludzkich.
Streszczenie wynalazku
Niniejszy wynalazek dostarcza nowych, w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko ludzkiemu IGFR1, które, korzystnie, nie będą indukować odpowiedzi HAMA lub HAHA, kiedy są podawane ludziom i będą przydatne do leczenia lub zapobiegania chorobom, przebiegających za pośrednictwem IGFR1 (np. o charakterze nowotworowym).
Według wynalazku izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, które wiąże się z IGFR1 obejmuje CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 znajdują ce się w regionie zmiennym ł a ń cucha lekkiego immunoglobuliny zawierającego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 78, oraz CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 znajdujące się w regionie zmiennym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierającego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 45. Korzystnie izolowane przeciwciało według wynalazku obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierający aminokwasy 20-137 SEK NR ID: 45 oraz region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuliny zawierający aminokwasy 20-128 SEK NR ID: 78.
Korzystnie przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, a korzystniej przeciwciało monoklonalne lub rekombinowane.
Również korzystnie przeciwciało według wynalazku wiąże się swoiście z ludzkim IGFR1 i wykazuje właściwość wybraną z grupy składającej się z następujących:
(a) wiąże się z IGFR1 z Kd wynoszącą około 86 x 10-11 M lub mniej;
(b) ma szybkość dysocjacji (Koff) dla IGFR1 wynoszącą około 6,50 x 10-11 sekundy-1 lub mniejszą;
(c) ma szybkość asocjacji (Kon) dla IGFR1 wynoszącą około 0,7 x 105 M-1 sekundy-1 lub większą;
(d) współzawodniczy z IGFl o wiązanie się z IGFR1;
(e) hamuje autofosforylację IGFR1; i (f) hamuje niezależny od zakotwiczenia wzrost komórek wyrażających IGFR1. Najkorzystniej przeciwciało według wynalazku wykazuje wszystkie z powyższych właściwości.
W korzystnej postaci wykonania izolowane przeciwciał o lub jego fragment wiążący antygen wiąże się z IGFR1 i obejmuje sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego immunoglobuliny, która zawiera CDR-L1 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 8, CDR-L2 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 9 i CDR-L3 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 10; oraz sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, która zawiera CDR-H1 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 14 lub SEK NR ID: 17, CDR-H2 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 15 i CDR-H3 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 16.
Ponadto korzystnie izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według według wynalazku obejmuje CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 znajdujące się w łańcuchu ciężkim immunoglobuliny kodowane przez polinukleotyd w plazmidzie HCA 15H12/19D12 (gamma-1), który jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5220; oraz CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 znajdujące się w łańcuchu lekkim immunoglobuliny kodowane przez polinukleotyd w plazmidzie LCF 15H12/19D12 (kappa), który jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5216.
W innej postaci wykonania wynalazku izolowane przeciwciał o lub jego fragment wiążący antygen wiąże się z IGFR1 i obejmuje (1) polipeptyd zawierający aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45 i element wybrany z grupy składającej się z:
(a) polipeptydu obejmującego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 72;
(b) polipeptydu obejmującego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 74;
(c) polipeptydu obejmującego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 76 oraz (d) polipeptydu obejmującego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78; lub
PL 210 412 B1 (2) polipeptyd zawierający aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 2 i polipeptyd zawierający aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 4.
Ponadto korzystnie przeciwciało monoklonalne według wynalazku charakteryzuje się tym, że region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny jest połączony do regionu stałego łańcucha ciężkiego gamma-1 immunoglobuliny oraz region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuliny jest połączony do regionu stałego łańcucha lekkiego kappa immunoglobuliny.
Przeciwciało według wynalazku korzystnie obejmuje dojrzały łańcuch ciężki immunoglobuliny kodowany przez polinukleotyd w plazmidzie HCA 15H12/19D12 (gamma-1), który jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5220; oraz dojrzał y ł a ń cuch lekki immunoglobuliny kodowany przez polinukleotyd w plazmidzie LCF 15H12/19D12 (kappa), który jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5216.
W korzystnej postaci wykonania wynalazek obejmuje również przeciwciało wedł ug wynalazku opisane powyżej, które znajduje się w pożywce hodowlanej komórki gospodarza.
Przeciwciało według wynalazku jest korzystnie znakowane.
Przedmiotem wynalazku jest również kompleks obejmujący przeciwciało lub fragment według wynalazku związany z IGFR1.
Dostarczone są również przez niniejszy wynalazek kompozycje farmaceutyczne zawierające przeciwciało lub jego fragment według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, przy czym nośnik jest korzystnie wybrany spośród cukru, wody i buforu.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja obejmująca (1) przeciwciało według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik; oraz (2) jeden lub więcej dodatkowych czynników terapeutycznych i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik; przy czym przeciwciało i jeden lub więcej czynników terapeutycznych są przygotowane w postaci pojedynczej kompozycji lub oddzielnych kompozycji. Korzystnie dodatkowy czynnik terapeutyczny stanowi jeden lub więcej elementów wybranych z grupy składającej się z czynników alkilujących, antymetabolitów, antybiotyków przeciwnowotworowych, inhibitorów mitotycznych, inhibitorów funkcji chromatyny, czynników przeciw angiogenezie, antyestrogenów, antyandrogenów, terapeutycznych przeciwciał lub immunomodulatorów. W korzystnej postaci wykonania dodatkowy czynnik terapeutyczny w kompozycji według wynalazku stanowi jeden lub więcej elementów wybranych z grupy składającej się z mechloretaminy, cyklofosfamidu, ifosfamidu, iperytu fenyloalaninowego, melfalenu, chlorambukolu, iperytu uracylowego, estramustyny, tiotepy, busulfanu, lomustyny, karmustyny, streptozocyny, dakarbazyny, cis-platyny, karboplatyny, altretaminy, metotreksatu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, 5-fluorodeoksyurydyny, kapecytabiny, fludarabiny, arabinozydu cytozyny, 6-merkaptopuryny, 6-tioguaniny, gemcytabiny, kladrybiny, deoksykoformycny, pentostatyny, doksorubicyny, daunorubicyny, idarubicyny, walrubicyny, mitoksantronu, daktynomycyny, mitramycyny, plikamycyny, mitomycyny C, bleomycyny, prokarbazyny, paklitakselu, docetakselu, winblasyny, winkrystyny, winorelbiny, topotekanu, irynotekanu, etopozydu, tenipozydu, razoksyny, marimastatu, COL-3, neovastatu, BMS-275291, talidomidu, skwalaminy, endostatyny, SU5416, SU6668, interferonu-alfa, EMD121974, interleukiny-12, IM862, angiostatyny, witaksyny, tamoksyfenu, toremifenu, raloksyfenu, droloksyfenu, iodoksyfenu, anastrozolu, letrozolu, eksemestanu, flutamidu, nilutamidu, bikalutamidu, spironolaktonu, octanu cyproteronu, finasterydu, cimetydyny, trastuzumabu, rituksimabu, diftitoksu denileukiny, interferonu i interleukiny-2 oraz lewamisolu w połączeniu z 5-fluorouracylem, a korzystniej stanowi irynotekan, docetaksel, paklitaksel, cyklofosfamid, tamoksyfen lub anastrozol.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:
(a) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 2;
(b) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 72;
(c) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 74;
(d) aminokwasów 20-137 z SEK NR ID: 4;
(e) aminokwasów 20-137 z SEK NR ID: 45;
(f) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 76;
(g) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 78;
(h) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 2;
(i) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 72;
(j) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 74;
(k) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 4;
(l) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 45;
PL 210 412 B1 (m) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 76; i (n) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 78.
Korzystnie kwas nukleinowy według wynalazku wybrany jest z grupy składającej się z:
(a) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 1;
(b) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 71;
(c) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 73;
(d) nukleotydów 58-411 z SEK NR ID: 3;
(e) nukleotydów 58-411 z SEK NR ID: 44;
(f) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 75;
(g) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 77;
(h) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 1;
(i) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 71;
(i) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 73;
(k) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 3;
(l) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 44;
(m) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 75; i (n) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 77.
Niniejszy wynalazek dostarcza również zrekombinowanego wektora zawierającego dowolny z powyższych polinukleotydów razem z komórką gospodarza zawierającą wektor. Korzystnie komórką gospodarza jest komórka jajnika chomika chińskiego (CHO), a wektor jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5216, PTA-5217, PTA-5218, PTA-5219 lub PTA-5220.
Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd obejmujący element wybrany z grupy składającej się z:
(a) aminokwasów 20-137 z SEK NR ID: 45, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;
(b) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 2, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
(c) aminokwasów 20-137 z SEK NR ID: 4, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;
(d) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 72, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
(e) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 74, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
(f) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 76, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
(g) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 78, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
(h) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 45, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;
(i) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 2, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
(j) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 4, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;
(k) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 72, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
(l) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 74, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
(m) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 76, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny; oraz (n) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 78, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny.
Korzystnie polipeptyd według wynalazku obejmuje aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego kappa immunoglobuliny.
Również korzystnie polipeptyd według wynalazku obejmuje aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego gamma-1 immunoglobuliny.
PL 210 412 B1
Przedmiotem wynalazku jest ponadto izolowana komórka gospodarza, która obejmuje polipeptyd zawierający aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78, przy czym jest on połączony z regionem stałym łańcucha lekkiego kappa immunoglobuliny; lub polipeptyd zawierający aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45, przy czym jest on połączony z regionem stałym łańcucha ciężkiego gamma-1 immunoglobuliny.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania polipeptydu zawierającego aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45, lub polipeptydu zawierającego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78, który to sposób obejmuje wprowadzenie polinukleotydu kodującego ten polipeptyd do komórki gospodarza w warunkach, w których polipeptyd ten jest wytwarzany w komórce gospodarza. Korzystnie komórka gospodarza w sposobie według wynalazku jest komórką eukariotyczną, komórką jajnika chomika chińskiego lub komórką grzybów.
Korzystnie w sposobie według wynalazku polipeptyd jest izolowany z komórki gospodarza, polinukleotyd kodujący polipeptyd jest funkcjonalnie połączony z promotorem CMV oraz polinukleotyd jest w wektorze, który korzystnie obejmuje gen DHFR, przy czym najkorzystniej gen DHFR jest funkcjonalnie połączony z długimi, końcowymi powtórzeniami mysiego wirusa guza gruczołu mlecznego.
W korzystnej postaci wykonania wektor w sposobie wedł ug wynalazku obejmuje gen higromycyny B, a korzystniej gen ten jest funkcjonalnie połączony z promotorem TK.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45, lub polipeptydu zawierającego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78, który to sposób obejmuje wprowadzenie wektora zawierającego polinukleotyd kodujący ten polipeptyd funkcjonalnie połączony z promotorem CMV, do komórki jajnika chomika chińskiego w warunkach, w których polipeptyd ten jest wytwarzany w komórce gospodarza oraz izolowanie tego polipeptydu.
Niniejszym opisano również sposoby leczenia albo zapobiegania stanowi medycznemu u pacjenta, w którym pośredniczy zwiększona ekspresja lub aktywność receptora insulinopodobnego czynnika wzrostu I albo zwiększona ekspresja jednego albo większej liczby jego ligandów (np. IGF-I lub IGF-II), obejmujące podawanie osobnikowi kompozycji wiążącej według wynalazku (np. przeciwciała lub fragmentu wiążącego antygen według wynalazku).
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała lub fragmentu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia chorób o charakterze nowotworowym u pacjenta będącego ssakiem, przy czym choroba o charakterze nowotworowym jest chorobą której pośredniczy podwyższony poziom lub aktywność receptora 1 insulinopodobnego czynnika wzrostu. Korzystnie choroba o charakterze nowotworowym jest wybrana z grupy składającej się z raka pęcherza, raka Wilma, raka jajnika, raka trzustki, raka sutka, raka prostaty, raka kości, raka płuc, raka okrężnicy i odbytnicy, raka szyjki macicy i maziówczaka, a przeciwciało lub fragment jest izolowanym przeciwciałem zawierającym region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierający aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45 oraz region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuliny zawierający aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78. Korzystnie zgodnie z zastosowaniem według wynalazku przeciwciało jest spreparowane z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i jest w kombinacji z jednym lub więcej czynnikami terapeutycznymi opisanymi powyżej.
Niniejszy wynalazek obejmuje dowolny plazmid wybrany z grupy obejmującej:
(i) promotor CMV -15H12/19D12 HCA (γ4)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 HCA (γ4);
Nr dostępu ATCC: PTA-5214;
(ii) promotor CMV -15H12/19D12 HCB (γ4)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 HCB (γ4);
Nr dostępu ATCC: PTA-5215;
(iii) promotor CMV -15H12/19D12 HCA (γ1)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 HCA (γ1);
Nr dostępu ATCC: PTA-5216;
(iv) promotor CMV -15H12/19D12 LCC (κ)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 LCC (κ);
Nr dostępu ATCC: PTA-5217;
(v) promotor CMV -15H12/19D12 LCD (κ)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 LCD (κ);
Nr dostępu ATCC: PTA-5218;
(vi) promotor CMV -15H12/19D12 LCE (κ)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 LCE (κ);
PL 210 412 B1
Nr dostępu ATCC: PTA-5219; oraz (vii) promotor CMV -15H12/19D12 LCF (κ)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 LCF (κ);
Nr dostępu ATCC: PTA-5220;
jak również wstawki kwasu nukleinowego dowolnego z powyższych plazmidów. Objęte są tym również części kwasu nukleinowego wstawek kodujących regiony zmienne immunoglobulin zawarte we wstawkach plazmidu zawierających ewentualnie region stały immunoglobuliny (tj. z wyłączeniem sekwencji sygnałowej). Objęte są tym również dowolne polipeptydy zakodowane przez kwasy nukleinowe dowolnej ze wstawek z powyższych plazmidów, jak również polipeptydy kodujące regiony zmienne immunoglobulin zawarte we wstawkach plazmidu zawierające ewentualnie region stały immunoglobuliny (tj. z wyłączeniem sekwencji sygnałowej).
Zidentyfikowane powyżej plazmidy są zdeponowane zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim w American Type Culture Collection (ATCC); 10801 University Boulevard; Manassas, Virginia 20110-2209. Wszystkie ograniczenia dostępu do plazmidów zdeponowanych w ATCC będą usunięte po przyznaniu patentu.
Szczegółowy opis
Korzystne wykonania niniejszego wynalazku obejmują w pełni ludzkie przeciwciało monoklonalne albo jego fragment wiążący antygen, które rozpoznaje swoiście i wiąże się z receptorem insulinopodobnego czynnika wzrostu I, korzystnie aminokwasy 30-902 z SEK NR ID: 19. Korzystnie przeciwciałem albo jego fragmentem wiążącym antygen jest 1H3, 15H12, 19D12, 15H12/19D12 LCA,
15H12/19D12 LCB, 15H12/19D12 LCC, 15H12/19D12 LCD, 15H12/19D12 LCE, 15H12/19D12 LCF, 15H12/19D12 HCA lub 15H12/19D12 HCB.
Kompozycja albo czynnik wiążący dotyczy cząsteczki, która wiąże się swoiście z IGFR1, np. w sposób typu ligand-receptor albo jako oddziaływanie przeciwciało-antygen, np, białek, które łączą się swoiście z IGFR1, np. w naturalnym, fizjologicznie istotnym oddziaływaniu białko-białko, kowalencyjnym bądź niekowalencyjnym. Termin „kompozycja wiążąca to korzystnie polipeptyd, taki jak pełne przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen według niniejszego wynalazku (np. 15H12/19D12 LCA, 15H12/19D12 LCB, 15H12/19D12 LCC, 15H12/19D12 LCD, 15H12/19D12 LCE, 15H12/19D12 LCF, 15H12/19D12 HCA lub 15H12/19D12 HCB albo dowolny peptyd przedstawiony poniżej w Tabeli 1).
Przeciwciała albo jego fragmenty wiążące antygen według wynalazku można zastosować do hamowania wzrostu komórek, korzystnie komórek nowotworowych, zarówno in vitro, jak i in vivo. Bez przywiązywania się do jednej teorii, przeciwciała albo jego fragmenty wiążące antygen według wynalazku mogą hamować wzrost komórek przez hamowanie oddziaływania pomiędzy IGFR1 i ligandem receptora, takim jak insulinopodobny czynnik wzrostu I (IGF-I) lub insulinopodobny czynnik wzrostu II (IGF-II). Przeciwciała albo jego fragmenty wiążące antygen mogą również hamować autofosforylację IGFR1, hamować niezależny od zakotwiczenia wzrost komórek (np. komórek nowotworowych) wyrażających IGFR1 i hamować aktywację kinazy AKT poprzez indukowanie degradacji IGFR1. Korzystnie przeciwciała albo jego fragmenty wiążące antygen według wynalazku neutralizują aktywność IGFR1 i/lub obniżają poziom IGFR1. Przeciwciała i jego fragmenty wiążące antygen można zastosować do leczenia albo zapobiegania chorobom, w których pośredniczy IGFR1. Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania przeciwciał i fragmentów wiążących antygen według wynalazku.
Termin „cząsteczka przeciwciała dotyczy całych przeciwciał (np. IgG, korzystnie, IgG1 lub IgG4) i ich fragmentów, korzystnie fragmentów wiążących antygen. Fragmenty przeciwciał obejmują fragmenty Fab przeciwciał, fragmenty F(ab)2 przeciwciał, fragmenty Fv przeciwciał, jednołańcuchowe fragmenty Fv przeciwciał i fragmenty dsFv przeciwciał.
Terminy „IGFR1, „receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu I i „receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu, typu 1 są dobrze znane w tej dziedzinie. Mimo że IGFR1 może być z dowolnego organizmu, korzystnie jest on ze zwierzęcia, korzystniej ssaka (np. myszy, szczura, królika, owcy lub psa), a najkorzystniej z człowieka. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa typowego ludzkiego prekursora IGFR1 ma nr dostępu Genbank X04434 lub NM_000875 (SEK NR ID: 19). Cięcie prekursora (np. pomiędzy aminokwasami 710 i 711) prowadzi do powstania podjednostki α i podjednostki β, które łączą się z wytworzeniem dojrzałego receptora. W korzystnych wykonaniach wynalazku, aminokwasy 30-902, z polipeptydu IGFR1 pełnej długości są stosowane jako antygen do wytwarzania przeciwciał anty-IGFR1.
Terminy „IGF-I, „insulinopodobny czynnik wzrostu I i „insulinopodobny czynnik wzrostu, typu 1 są również dobrze znane w tej dziedzinie. Terminy „IGF-II, „insulinopodobny czynnik wzrostu-II
PL 210 412 B1 i „insulinopodobny czynnik wzrostu, typu II są również dobrze znane w tej dziedzinie. Jakkolwiek IGF-I lub IGF-II mogą być z dowolnego organizmu, korzystnie jeżeli są one ze zwierzęcia, korzystniej ze ssaka (np. myszy, szczura, królika, owcy lub psa), a najkorzystniej z człowieka. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa typowego ludzkiego IGF-I i IGF-II ma nr dostępu Genbank, odpowiednio, XM_052648 (SEK NR ID: 20) i NM_000612 (SEK NR ID: 21). Termin „sIGFR1 lub „rozpuszczalny IGFR1 obejmuje dowolny rozpuszczalny fragment IGFR1 (np. ludzki IGFR1), korzystnie fragment, z którego region transbłonowy receptora został usunięty, korzystniej aminokwasy 30-902 z SEK NR ID: 19.
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego korzystnego w pełni ludzkiego przeciwciała monoklonalngo anty-IGFR1 według wynalazku (np. 1H3, 15H12 i 19D12) razem z sekwencjami nukleotydowymi kwasów nukleinowych, które kodują te regiony są zebrane w Tabeli 1. Niniejszy wynalazek obejmuje dowolny kwas nukleinowy albo polipeptyd (np. przeciwciało), który zawiera jeden albo większa liczbę (np. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub 8) dowolnego spośród kwasów nukleinowych albo polipeptydów (włączając w to ich dojrzałe fragmenty) przedstawione poniżej w Tabeli 1. Tabela 1 obejmuje również zestawienie sekwencji aminokwasowych i nukleotydowych odpowiadających regionom CDR przeciwciał. Sekwencje aminokwasowe i nukleotydowe odpowiadające regionowi zmiennemu 15H12 i 19D12 są identyczne; z tego powodu pokazano jedynie pojedynczą sekwencję dla każdego regionu zmiennego lub CDR.
T a b e l a 1
Zestawienie sekwencji aminokwasowych i nukleotydowych według wynalazku.
Sekwencja Identyfikator sekwencji
1 2
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zmienny 15H12 i 19D12 łańcucha lekkiego, łącznie z peptydem sygnałowym (LC 15H12/19D12) SEK NR ID: 1
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego 15H12 i 19D12, łącznie z peptydem sygnałowym SEK NR ID: 2
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zmienny łańcucha ciężkiego 15H12 i 19D12, łącznie z peptydem sygnałowym (HC 15Hl2/19D12) SEK NR ID: 3
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 15H12 i 19D12, łącznie z peptydem sygnałowym SEK NR ID: 4
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-L1 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 5
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-L2 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 6
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-L3 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 7
Sekwencja aminokwasowa CDR-L1 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 8
Sekwencja aminokwasowa CDR-L2 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 9
Sekwencja aminokwasowa CDR-L3 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 10
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-H1 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 11
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-H2 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 12
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-H3 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 13
Sekwencja aminokwasowa CDR-H1 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 14
Sekwencja aminokwasowa CDR-H2 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 15
Sekwencja aminokwasowa CDR-H3 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 16
Sekwencja aminokwasowa alternatywnego CDR-H1 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 17
Sekwencja nukleotydowa kodująca alternatywny CDR-H1 15H12 i 19D12 SEK NR ID: 18
Sekwencja aminokwasowa receptora insulinopodobnego czynnika wzrostu-I (IGFR1) SEK NR ID: 19
Sekwencja aminokwasowa insulinopodobnego czynnika wzrostu-I (IGF1) SEK NR ID: 20
Sekwencja aminokwasowa insulinopodobnego czynnika wzrostu-II (IGF2) SEK NR ID: 21
PL 210 412 B1 cd. tabeli 1
1 2
Sekwencja nukleotydowa startera do PCR SEK NR ID: 22
Sekwencja nukleotydowa startera do PCR SEK NR ID: 23
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zmienny łańcucha lekkiego 1H3, łącznie z peptydem sygnałowym (LC 1H3) SEK NR ID: 24
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha lekkiego 1H3, łącznie z peptydem sygnałowym SEK NR ID: 25
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zmienny łańcucha ciężkiego 1H3, łącznie z peptydem sygnałowym (HC 1H3) SEK NR ID: 26
Sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 1H3, łącznie z peptydem sygnałowym SEK NR ID: 27
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-L1 1H3 SEK NR ID: 28
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-L2 1H3 SEK NR ID: 29
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-L3 1H3 SEK NR ID: 30
Sekwencja aminokwasowa CDR-L1 1H3 SEK NR ID: 31
Sekwencja aminokwasowa CDR-L2 1H3 SEK NR ID: 32
Sekwencja aminokwasowa CDR-L3 1H3 SEK NR ID: 33
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-H1 1H3 SEK NR ID: 34
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-H2 1H3 SEK NR ID: 35
Sekwencja nukleotydowa kodująca CDR-H3 1H3 SEK NR ID: 36
Sekwencja aminokwasowa CDR-H1 1H3 SEK NR ID: 37
Sekwencja aminokwasowa CDR-H2 1H3 SEK NR ID: 38
Sekwencja aminokwasowa CDR-H3 1H3 SEK NR ID: 39
Sekwencja nukleotydowa kodująca łańcuch lekki A (LCA) 15H12/19D12 SEK NR ID: 40
Sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 41
Sekwencja nukleotydowa kodująca łańcuch lekki B (LCB) 15H12/19D12 SEK NR ID: 42
Sekwencja aminokwasowa łańcuch lekki B 15H12/19D12 SEK NR ID: 43
Sekwencja nukleotydowa kodująca łańcuch ciężki A (HCA) 15H12/19D12 SEK NR ID: 44
Sekwencja aminokwasowa łańcuch ciężki A 15H12/19D12 SEK NR ID: 45
Sekwencja nukleotydowa kodująca regionu zrębowego 1 łańcucha lekkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 46
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 1 łańcucha lekkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 47
Sekwencja nukleotydowa kodująca regionu zrębowego 2 łańcucha lekkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 48
Sekwencja aminokwasowa 15H12/19D12 regionu zrębowego 2 łańcucha lekkiego A SEK NR ID: 49
Sekwencja nukleotydowa kodująca regionu zrębowego 3 łańcucha lekkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 50
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 3 łańcucha lekkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 51
Sekwencja nukleotydowa kodująca regionu zrębowego 4 łańcucha lekkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 52
PL 210 412 B1 cd. tabeli 1
1 2
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 4 łańcucha lekkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 53
Sekwencja nukleotydowa kodująca regionu zrębowego 1 łańcucha lekkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 54
Sekwencj a aminokwasowa regionu zrębowego 1 łańcucha lekkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 55
Sekwencja nukleotydowa kodująca regionu zrębowego 2 łańcucha lekkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 56
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 2 łańcucha lekkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 57
Sekwencja nukleotydowa kodująca regionu zrębowego 3 łańcucha lekkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 58
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 3 łańcucha lekkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 59
Sekwencja nukleotydowa kodująca regionu zrębowego 4 łańcucha lekkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 60
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 4 łańcucha lekkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 61
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy A łańcucha ciężkiego1 15H12/19D12 SEK NR ID: 62
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego łańcucha ciężkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 63
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 2 łańcucha ciężkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 64
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 2 łańcucha ciężkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 65
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 3 łańcucha ciężkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 66
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 3 łańcucha ciężkiego A 15H12/19D12 SEK NR ID: 67
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy A łańcucha ciężkiego 4 15H12/19D12 SEK NR ID: 68
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego A łańcucha ciężkiego 4 15H12/19D12 SEK NR ID: 69
Sekwencja aminokwasowa alternatywnego CDR-H1 1H3 SEK NR ID: 70
Sekwencja nukleotydowa kodująca łańcucha lekkiego C (LCC) 15H12/19D12 SEK NR ID: 71
Sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 72
Sekwencja nukleotydowa kodująca łańcuch lekki D (LCD) 15H12/19D12 SEK NR ID: 73
Sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 74
Sekwencja nukleotydowa kodująca łańcuch lekki E (LCE) 15H12/19D12 SEK NR ID: 75
Sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 76
Sekwencja nukleotydowa kodująca 15H12/19D12 łańcucha lekkiego F (LCF) SEK NR ID: 77
Sekwencja aminokwasowa 15H12/19D12 łańcucha lekkiego F SEK NR ID: 78
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 1 łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 79
PL 210 412 B1
cd. tabeli 1
1 2
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 1 łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 80
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 2 łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 81
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 2 łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 82
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 3 łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 83
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 3 łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 84
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 4 łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 85
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 4 łańcucha lekkiego C 15H12/19D12 SEK NR ID: 86
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 1 łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 87
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 1 łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 88
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 2 łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 89
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 2 łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 90
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 3 łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 91
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 3 łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 92
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 4 łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 93
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 4 łańcucha lekkiego D 15H12/19D12 SEK NR ID: 94
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 1 łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 95
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 1 łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 96
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 2 łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 97
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 2 łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 98
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 3 łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 99
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 3 łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 100
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 4 łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 101
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 4 łańcucha lekkiego E 15H12/19D12 SEK NR ID: 102
PL 210 412 B1 cd. tabeli 1
1 2
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 1 łańcucha lekkiego F 15H12/19D121 SEK NR ID: 103
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 1 łańcucha lekkiego F 15H12/19D121 SEK NR ID: 104
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 2 łańcucha lekkiego F 15H12/19D12 SEK NR ID: 105
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 2 łańcucha lekkiego F 15H12/19D12 SEK NR ID: 106
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 3 łańcucha lekkiego F 15H12/19D123 SEK NR ID: 107
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 3 łańcucha lekkiego F 15H12/19D123 SEK NR ID: 108
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 4 łańcucha lekkiego F 15H12/19D124 SEK NR ID: 109
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 4 łańcucha lekkiego F 15H12/19D124 SEK NR ID: 110
Sekwencja nukleotydowa kodująca łańcuch ciężki B (HCB) 15H12/19D12 SEK NR ID: 111
Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 112
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 1 łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 113
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 1 łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 114
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 2 łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 115
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 2 łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 116
Sekwencja Identyfikator sekwencji
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 3 łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 117
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 3 łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 118
Sekwencja nukleotydowa kodująca region zrębowy 4 łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 119
Sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego 4 łańcucha ciężkiego B 15H12/19D12 SEK NR ID: 120
CDR-L1 to pierwszy region determinujący dopasowanie (CDR, ang. complementarity determining region), który występuje w łańcuchu lekkim, CDR-L2 to drugi CDR, który występuje w łańcuchu lekkim, a CDR-L3 to trzeci CDR, który występuje w łańcuchu lekkim.
Podobnie, CDR-H1 to pierwszy CDR, który występuje w łańcuchu ciężkim, CDR-H2 to drugi CDR, który występuje w łańcuchu ciężkim, a CDR-H3 to trzeci CDR, który występuje w łańcuchu ciężkim,
FR-L1 to pierwszy region zrębowy łańcucha lekkiego, FR-L2 to drugi region zrębowy łańcucha lekkiego, FR-L3 to trzeci region zrębowy łańcucha lekkiego, FR-L4 to czwarty region zrębowy łańcucha lekkiego, FR-H1 to pierwszy region zrębowy łańcucha ciężkiego, FR-H2 to drugi region zrębowy łańcucha ciężkiego, FR-H3 to trzeci region zrębowy łańcucha ciężkiego a FR-H4 to czwarty region zrębowy łańcucha ciężkiego. Te terminy i ułożenie CDR i FR łańcucha immunoglobuliny są dobrze znane w tej dziedzinie.
Region zmienny dojrzałego łańcucha lekkiego według wynalazku, któremu brak jest peptydu sygnałowego (tj. pierwszych 19 lub 20 reszt), to aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 2, 41, 43, 72, 74, 76
PL 210 412 B1 lub 78, które są zakodowane przez nukleotydy 58-384 z SEK NR ID: 1, 40, 42, 71, 73, 75 lub 77 albo aminokwasy 21-130 z SEK NR ID: 25, które są zakodowane przez nukleotydy 61-390 z SEK NR ID: 24.
Region zmienny dojrzałego łańcucha ciężkiego według wynalazku, któremu brak jest peptydu sygnałowego (tj. pierwszych 19 reszt), to aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 4, 45 lub 112, które są zakodowane przez nukleotydy 58-411 z SEK NR ID: 3, 44 lub 111 albo aminokwasy 20-140 z SEK NR ID: 27, które są zakodowane przez nukleotydy 58-420 z SEK NR ID: 26.
W niektórych wykonaniach CDR-H1 15H12 i 19D12 to GFTFSSFAMH (SEK NR ID: 17), które są zakodowane przez sekwencję nukleotydowa SEK NR ID: 18. W niektórych wykonaniach 1H3 CDR-H1 to NYAMH (SEK NR ID: 70).
Niniejszy wynalazek obejmuje również przeciwciała i fragmenty wiążące antygen, które obejmują regiony zrębowe przeciwciał i fragmenty wiążące antygen według wynalazku. Korzystnie FR-L1 to aminokwasy 20-42 z SEK NR ID: 2 lub aminokwasy 21-43 z SEK NR ID: 25; FR-L2 to aminokwasy 54-68 z SEK NR ID: 2 lub aminokwasy 55-69 z SEK NR ID: 25; FR-L3 to aminokwasy 76-107 z SEK NR ID: 2 lub aminokwasy 77-108 z SEK NR ID: 25; FR-L4 to aminokwasy 117-128 z SEK NR ID: 2 lub aminokwasy 128-130 z SEK NR ID: 25; FR-H1 to aminokwasy 20-44 lub 20-49 z SEK NR ID: 4 albo aminokwasy 20-44 lub 20-49 z SEK NR ID: 27; FR-H2 to aminokwasy 55-68 z SEK NR ID: 4 lub aminokwasy 55-68 z SEK NR ID: 27; FR-H3 to aminokwasy 85-116 z SEK NR ID: 4 lub aminokwasy 85-116 z SEK NR ID: 27 i FR-H4 to aminokwasy 127-137 z SEK NR ID: 4 lub aminokwasy 130-140 z SEK NR ID: 27.
W korzystnych wykonaniach cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmują FR-L1 zdefiniowany przez aminokwasy 20-42 z SEK NR ID: 41 lub 43; FR-L2 zdefiniowany przez aminokwasy 54-68 z SEK NR ID: 41 lub 43; FR-L3 zdefiniowany przez aminokwasy 76-107 z SEK NR ID: 41 lub 43; i FR-L4 zdefiniowany przez aminokwasy 117-128 z SEK NR ID: 41 lub 43. Ponadto, korzystne wykonania obejmują cząsteczki przeciwciał zawierające FR-H1 zdefiniowany przez aminokwasy 20-44 z SEK NR ID: 45; FR-H2 zdefiniowany przez aminokwasy 55-68 z SEK NR ID: 45; FR-H3 zdefiniowany przez aminokwasy 85-116 z SEK NR ID: 45; i FR-H4 zdefiniowany przez aminokwasy 127-137 z SEK NR ID: 45.
Biologia molekularna
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem można zastosować konwencjonalne techniki biologii molekularnej, mikrobiologii i rekombinowania DNA znane w tej dziedzinie. Takie techniki są w pełni wyjaśnione w literaturze. Patrz, np. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wydanie drugie (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (tutaj „Sambrook i wsp., 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, tomy I i II (D. N. Glover wyd. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait wyd. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins wyd. (1985)); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, wyd. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, wyd. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel i wsp. (wyd.), Current Protocols in tolecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
„Polinukleotyd, „kwas nukleinowy lub „cząsteczka kwasu nukleinowego może dotyczyć formy polimerowej estru fosforanowego rybonukleozydów (adenozyny, guanozyny, urydyny lub cytydyny; „cząsteczki RNA) lub deoksyrybonukleozydów (deoksyadenozyny, deoksyguanozyny, deoksytytnidyny lub deoksycytydyny; „cząsteczki DNA), albo ich dowolnych analogów fosfoestrowych, takich jak fosforotioniany i tioestry, w postaci jednoniciowej, dwuniciowej lub innej.
„Sekwencja polinukleotydowa, „sekwencja kwasu nukleinowego lub „sekwencja nukleotydowa to seria zasad nukleotydowych (zwanych również „nukleotydami) w kwasie nukleinowym, takim jak DNA lub RNA i oznacza dowolny łańcuch dwóch lub większej liczby nukleotydów.
„Sekwencja kodująca lub sekwencja „kodująca produkt ekspresji, taki jak RNA, polipeptyd, białko lub enzym, to sekwencja nukleotydowa, która, kiedy ulega ekspresji, prowadzi do wytworzenia produktu.
Termin „gen oznacza sekwencję DNA, która koduje albo odpowiada konkretnej sekwencji rybonukleotydów lub aminokwasów, która obejmuje całą albo część jednej albo większej liczby cząsteczek RNA białek lub enzymów i może, albo nie, obejmować regulacyjne sekwencji DNA, takie jak sekwencje promotorowe, które określają na przykład warunki, w których gen ulega ekspresji. Geny mogą być transkrybowane z DNA do RNA, który może albo nie podlegać translacji do sekwencji aminokwasowej.
PL 210 412 B1
Stosowany tu termin „amplifikacja DNA może oznaczać zastosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do zwiększenia stężenia konkretnej sekwencji DNA w mieszaninie sekwencji DNA. Opisu PCR patrz Saiki i wsp., Science (1988) 239: 487. W konkretnym wykonaniu, niniejszy wynalazek obejmuje kwas nukleinowy, który koduje przeciwciało anty-IGFR1, łańcuch ciężki albo łańcuch lekki przeciwciała anty-IGFR1, region zmienny łańcucha ciężkiego albo łańcucha lekkiego przeciwciała anty-IGFR1, region stały łańcucha ciężkiego albo łańcucha lekkiego przeciwciała anty-IGFR1 albo CDR przeciwciała anty-IGFR1 (np. CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 lub CDR-H3), które mogą być powielane przez PCR.
Stosowany tu termin „oligonukleotyd dotyczy kwasu nukleinowego, generalnie z co najmniej 10 (np. 10, 11, 12, 13 lub 14), korzystnie z co najmniej 15 (np. 15, 16, 17, 18 lub 19), a korzystniej z co najmniej 20 nukleotydów (np. 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 lub 30), korzystnie nie więcej niż 100 nukleotydów (np. 40, 50, 60, 70, 80 lub 90), które mogą hybrydyzować z cząsteczką genomowego DNA, cząsteczką cDNA albo cząsteczką mRNA kodującą gen, mRNA, cDNA albo innym kwasem nukleinowym będącym przedmiotem zainteresowania. Oligonukleotydy można znakować np. przez włączanie nukleotydów-32P, nukleotydów-3H, nukleotydów-14C, nukleotydów-35S lub nukleotydów, do których został dołączony kowalencyjne znacznik, taki jak biotyna. W jednym z wykonań wyznakowany oligonukleotyd można użyć jako sondę do wykrycia obecności kwasu nukleinowego. W innym wykonaniu, oligonukleotydy (z których jeden albo obydwa mogą być wyznakowane) moż na zastosować jako startery do PCR, bądź do klonowania genu pełnej długości lub jego fragmentu, bądź do wykrywania obecności kwasów nukleinowych. W ogólności, oligonukleotydy są wytwarzane syntetycznie, korzystnie w syntetyzatorze kwasów nukleinowych.
Sekwencja dowolnego kwasu nukleinowego (np. kwasu nukleinowego kodującego gen IGFR1 albo kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-IGFR1 albo jego fragment lub część) może być zsekwencjonowana dowolną metodą znaną w dziedzinie (np. przez sekwencjonowanie chemiczne albo sekwencjonowanie enzymatyczne). „Sekwencjonowanie chemiczne DNA może oznaczać metody takie jak Maxama i Gilberta (1977) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560), w których DNA jest losowo cięte przy użyciu pojedynczych specyficznych wobec zasad reakcji. „Sekwencjonowanie enzymatyczne DNA może oznaczać metody takie jak Sangera (Sanger i wsp., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463).
Omawiane tu kwasy nukleinowe mogą być flankowane przez naturalne sekwencje regulacyjne (kontrola ekspresji) albo mogą być związane z sekwencjami heterologicznymi, włączając w to promotory, wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów (IRE, ang. internal ribosome entry sites) i inne sekwencje miejsc wiązania rybosomów, wzmacniacze, elementy odpowiedzi, supresory, sekwencje sygnałowe, sekwencje poliadenylacji, introny, regiony niekodujące 5' i 3' i temu podobne.
„Promotor lub „sekwencja promotorowa to region regulacyjny DNA zdolny do wiązania polimerazy RNA w komórce (np. bezpośrednio albo przez inne białka albo substancje związane z promotorem) i rozpoczynający transkrypcję sekwencji kodującej. Sekwencja promotorowa jest, w ogólności, ograniczona na końcu 3' przez miejsce rozpoczęcia transkrypcji i rozciąga się powyżej (w kierunku 5) obejmując minimalną liczbę zasad lub elementów niezbędnych dla rozpoczęcia transkrypcji na dowolnym poziomie. W obrębie sekwencji promotora może znajdować się miejsce rozpoczęcia transkrypcji (zwykle określone na przykład przez mapowanie nukleazą S1), jak również domeny wiążące białko (sekwencje najwyższej zgodności) odpowiedzialne za wiązanie polimerazy RNA. Promotor może być funkcjonalnie związany z innymi sekwencjami kontrolującymi ekspresję, włączając w to sekwencje wzmacniacza i represora albo z kwasem nukleinowym według wynalazku (np. SEK NR ID: 1, 3, 5-7, 11-13, 18, 22-24, 26, 28-30 lub 34-36). Promotory, które można zastosować do kontrolowania ekspresji genów obejmują miedzy innymi promotor cytomegalowirusa (CMV) (patenty USA nr 5385839 i 5168062), wczesny region promotorowy SV40 (Benoist i wsp., (1981) Nature 290:3 04-310), promotor zawarty w długich końcowych powtórzeniach 3' wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto i wsp., (1980) Cell 22: 787-797), promotor kinazy tymidynowej opryszczki (Wagner i wsp., (1981) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 78: 1441-1445), sekwencje regulacyjne genu metalotioneiny (Brinster i wsp., (1982) Nature
296: 39-42); prokariotyczne wektory ekspresyjne, takie jak promotor β-laktamazy (Villa-Komaroff i wsp., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731) albo promotor tac (DeBoer i wsp., (1983)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25); patrz również „Useful proteins from recombinant bacteria w Scientific American (1980) 242:74-94; oraz elementy promotorowe z drożdży i innych grzybów, takie jak promotor Gal 4, promotor ADC (dehydrogenazy alkoholowej), promotor PGK (kinazy fosfoglicerolowej) albo promotor fosfatazy alkalicznej.
PL 210 412 B1
Sekwencja kodująca jest „pod kontrolą albo „funkcjonalnie związana z albo „operacyjnie związana z transkrypcyjnymi albo translacyjnymi sekwencjami regulacyjnymi w komórce, kiedy sekwencja kieruje transkrypcją, z udziałem polimerazy RNA, sekwencji kodującej do RNA, korzystnie mRNA, który może być następnie poddany składaniu RNA (jeżeli zawiera introny) i, ewentualnie, poddany translacji do białka zakodowanego przez sekwencję kodującą.
Terminy „podlega ekspresji i „ekspresja oznacza umożliwienie lub spowodowanie wyrażenia informacji zawartej w genie, sekwencji RNA lub DNA; na przykład wytworzenie białka przez aktywację funkcji komórkowych uczestniczących w transkrypcji i translacji odpowiedniego genu. Sekwencja DNA ulega ekspresji w albo przez komórkę z wytworzeniem „produktu ekspresji, takiego jak RNA (np. mRNA) lub białko (np. przeciwciało 1H3, 15H12 lub 19D12 albo jego fragment). O samym produkcie ekspresji można również powiedzieć, że jest „wyrażany przez komórkę.
Terminy „wektor, „wektor do klonowania i „wektor ekspresyjny oznaczają przenośnik (np. plazmid), dzięki któremu sekwencja DNA lub RNA może być wprowadzona do komórki gospodarza, tak aby transformować gospodarza i ewentualnie, umożliwić ekspresję i/lub replikację wprowadzonej sekwencji.
Termin „transfekcja lub „transformacja oznacza wprowadzenie kwasu nukleinowego do komórki. Terminy te mogą iotyczyć wprowadzenia kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało antyIGFR1 albo jego fragment do komórki, oprowadzony gen albo sekwencja może być nazwana „klonem. Komórka gospodarza, która otrzymuje wprowadzony DNA albo RNA została „stransformowana i jest „transformantem albo „klonem. DNA lub RNA wprowadzony do komórki gospodarza może pochodzić z dowolnego źródła, włączając w to komórki z tego samego rodzaju albo gatunku co komórka gospodarza albo komórki z tego innego rodzaju albo gatunku.
Termin „komórka gospodarza oznacza dowolną komórkę z dowolnego organizmu, która jest wyselekcjonowana, zmodyfikowana, transfekowana, transformowana, hodowana albo używana albo poddana manipulacjom w dowolny sposób w celu wytworzenia substancji przez komórkę, na przykład ekspresji lub replikacji przez komórkę genu, sekwencji DNA lub RNA, białka albo enzymu.
Termin „system ekspresyjny oznacza komórkę gospodarza i pasujący do niej wektor, który w odpowiednich warunkach może wyrażać białko lub kwas nukleinowy, który jest przenoszony przez wektor i wprowadzony do komórki gospodarza. Powszechne systemy ekspresyjne obejmują komórki gospodarza E. coli i wektory plazmidowe, owadzie komórki gospodarza i wektory bakulowirusowe oraz ssacze komórki gospodarza i wektory. W konkretnym wykonaniu, IGFR1 lub przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen według wynalazku można wyrażać w ludzkich komórkach embrionalnej nerki (HEK293). Inne przydatne linie obejmują komórki CHO (jajnika chomika chińskiego), komórki HeLa i komórki NIH 3T3 oraz komórki NSO (mysia linia komórkowa szpiczaka nie wytwarzająca Ig). Kwasy nukleinowe kodujące przeciwciało lub fragment wiążący antygen według wynalazku, sIGFR1 lub IGFR1, można wyrażać na wysokich poziomach w systemie ekspresji E.coli/7, jak opisano w patentach USA 4952496, 5693489 i 5869320 oraz w Davanloo, P. i wsp., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2035-2039; Studier, F. W. i wsp., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130; Rosenberg, A. H. i wsp., (1987) Gene 56: 125-135; oraz Dunn, J. J. i wsp., (1988) Gene 68: 259, które są tu włączone jako odniesienie.
Niniejszy wynalazek bierze pod uwagę dowolną sztuczną albo niewielką modyfikację sekwencji aminokwasowych lub nukleotydowych, które odpowiadają przeciwciałom albo ich fragmentom wiążącym antygen według wynalazku. Konkretnie, niniejszy wynalazek bierze pod uwagę warianty kwasów nukleinowych o konserwatywnej sekwencji, które kodują przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen według wynalazku. Warianty sekwencji polinukleotydowej o konserwatywnej sekwencji to takie, w których dokonano zmiany jednego albo większej liczby nukleotydów w kodonie, w wyniku czego nie wystąpiły zmiany w aminokwasie w tej pozycji. Warianty konserwatywne względem funkcji są takimi, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych zostały zmienione w białku albo enzymie bez zmiany ogólnej konformacji i funkcji polipeptydu, włączając w to, ale bez żadnych ograniczeń, zastąpienie aminokwasu takim, który ma podobne właściwości. Aminokwasy o podobnych właściwościach są dobrze znane w tej dziedzinie. Przykładowo, aminokwasy polarne/hydrofilowe, które można wzajemnie wymieniać obejmują asparaginę, glutaminę, serynę, cysteinę, treoninę, lizynę, argininę, histydynę, kwas asparaginowy i kwas glutaminowy; aminokwasy niepolarne/hydrofobowe, które można wzajemnie wymieniać obejmują glicynę, alaninę, walinę, leucynę, izoleucynę, prolinę, tyrozynę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę; aminokwasy kwaśne, które można wzajemnie wymieniać obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy, a aminokwasy kwaśne, które można wzajemnie wymieniać obejmują histydynę, lizynę i argininę.
PL 210 412 B1
Niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciała anty-IGFR1 i ich fragmenty, które są kodowane przez kwasy nukleinowe opisane w Tabeli l, jak również kwasy, które z nimi hybrydyzują. Korzystne jest, jeżeli kwasy nukleinowe hybrydyzują w łagodnych warunkach, korzystniej w średnio ostrych warunkach, a najkorzystniej w wysoce ostrych warunkach i korzystnie, jeżeli wykazują aktywność wiązania IGFR1. Cząsteczka kwasu nukleinowego „może hybrydyzować z inną cząsteczką kwasu nukleinowego, taką jak cDNA, DNA genomowy albo RNA, kiedy jednoniciowa postać cząsteczki kwasu nukleinowego może łączyć się z inną cząsteczką kwasu nukleinowego w odpowiednich warunkach temperatury i siły jonowej roztworu (patrz Sambrook i wsp., jak wyżej). Warunki temperatury i siły jonowej określają „ostrość hybrydyzacji. Typowymi łagodnymi warunkami hybrydyzacji może być 55°C, 5X SSC, 0,1% SDS, 0,25% mleko i bez formamidu albo 30% formamid, 5X SSC, 0,5% SDS. Typowe średnio ostre warunki hybrydyzacji są podobne do warunków łagodnych, z tą różnicą że hybrydyzację przeprowadza się w 40% formamidzie, z 5X lub 6X SSC. Ostre warunki hybrydyzacji są podobne do warunków łagodnych, z tą różnicą że hybrydyzację przeprowadza się w 50% formamidzie, 5X lub 6X SSC i, ewentualnie, w wyższej temperaturze (np., 57°C, 59°C, 60°C, 62°C, 63°C, 65°C lub 58°C). Ogólnie, SSC to 0,15 M NaCl i 0,015 M Na-cytrynian. Hybrydyzacja wymaga, aby dwa kwasy nukleinowe zawierały komplementarne sekwencje, jakkolwiek, w zależności od ostrości hybrydyzacji, możliwe są niedopasowania zasad. Odpowiednia ostrość dla hybrydyzacji kwasów nukleinowych zależy od długości kwasów nukleinowych i stopnia komplementarności, zmiennych dobrze znanych w tej dziedzinie. Im większy stopień podobieństwa albo homologii pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi, tym wyższa ostrość warunków, w których kwasy nukleinowe mogą hybrydyzować. Dla hybryd większych niż 100 nukleotydów długości, wyprowadzono równanie do obliczenia temperatury topnienia (patrz Sambrook i wsp., jak wyżej, 9.50-9.51). Dla hybrydyzacji z krótszymi aminokwasami, tj. oligonukleotydami, bardziej ważna staje się pozycja niedopasowania, a długość oligonukleotydu określa jego specyficzność (patrz Sambrook i wsp., jak wyżej, 11.7-11.8).
Niniejszy wynalazek obejmuje również kwasy nukleinowe zawierające sekwencje nukleotydowe i polipeptydy zawierają ce sekwencje aminokwasowe, które są w co najmniej 70% identyczne, korzystnie w co najmniej 80% identyczne, korzystniej w co najmniej 90% identyczne, a najkorzystniej w co najmniej 95% identyczne (np. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) z odnoś nikowymi sekwencjami nukleotydowymi i aminokwasowymi z Tabeli 1, kiedy przeprowadza się porównanie przy zastosowaniu algorytmu BLAST, przy czym parametry algorytmu są wybrane tak, aby dawać największe dopasowanie pomiędzy odpowiednimi sekwencjami na całej długości odpowiednich sekwencji odnośnikowych. Niniejszym wynalazkiem objęte są również polipeptydy zawierające sekwencje aminokwasowe, które są w co najmniej 70% identyczne, korzystnie w co najmniej 80% identyczne, korzystniej w co najmniej 90% identyczne, a najkorzystniej w co najmniej 95% identyczne (np., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) z odnośnikowymi sekwencjami aminokwasowymi z Tabeli 1 (np. SEK NR ID: 2 (np. aminokwasy 20-128), 4 (np. aminokwasy 20-137), 8-10, 14-16, 17, 25 (np., aminokwasy 21-130), 27 (np. aminokwasy 20-140), 31-33 lub 37-39), kiedy przeprowadza się porównanie przy zastosowaniu algorytmu BLAST, gdzie parametry algorytmu są wybrane tak, aby dawać największe dopasowanie pomiędzy odpowiednimi sekwencjami na całej długości odpowiednich sekwencji odnośnikowych.
Identyczność sekwencji dotyczy dokładnego dopasowania pomiędzy nukleotydami albo aminokwasami dwóch sekwencji, które są porównywane. Podobieństwo sekwencji dotyczy dokładnego dopasowania pomiędzy nukleotydami albo aminokwasami dwóch sekwencji, które są porównywane, a dodatkowo dopasowania mię dzy nieidentycznymi, biochemicznie spokrewnionymi aminokwasami. Biochemicznie spokrewnione aminokwasy, które mają podobne właściwości i podlegają wzajemnej wymieniane są dyskutowane powyżej.
Następujące odnośniki dotyczące algorytmu BLAST są tu włączone jako odniesienie: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S. F. i wsp., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. i wsp., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T. L. i wsp., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S. F. i wsp., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. i wsp., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J. C. i wsp., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J. M. i wsp., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10: 67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M. O. i wsp., „A model of evolutionary change in proteins w Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) tom 5, supl. 3. M. O. Dayhoff (wyd.), str. 345-352, Natl. Biomwyd. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R. M. i wsp., „Matrices for detecting distant relationships w Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) tom 5, supl. 3. M. O. Dayhoff (wyd.), str. 353-358, Natl. Biomwyd. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S. F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J. i wsp., (1991) Methods 3: 66-70; Henikoff, S. i wsp., (1992)
PL 210 412 B1
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S. F. i wsp., (1993) J. Mol. Etom 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S. i wsp., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268; Karlin, S. i wsp., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; Dembo, A. i wsp., (1994) Ann. Prob. 22: 2022-2039 oraz Altschul, S.F. „Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments w Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, wyd.), (1997) str. 1-14, Plenum, New York.
Struktura przeciwciał
Ogólnie wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciała obejmuje tetramer. Każdy tetrametr zawiera dwie identyczne pary łańcuchów polipeptydowych, z których każda para ma jeden łańcuch „lekki (około 25 kDa) jeden łańcuch „ciężki (około 50-70 kDa). Część amino-końcowa każdego łańcucha może zawierać region zmienny złożony ze 100 do 110 lub więcej aminokwasów odpowiedzialnych głównie za rozpoznawanie antygenu. Część karboksy-końcowa każdego łańcucha może definiować region stały odpowiedzialny głównie za funkcję efektorową. Zazwyczaj, ludzkie łańcuchy lekkie są klasyfikowane jako łańcuchy lekkie kappa i lambda. Ponadto, ludzkie łańcuchy ciężkie są klasyfikowane jako mu, delta, gamma, alfa lub epsilon i definiują izotyp przeciwciała jako, odpowiednio, IgM, IgD, IgG, Iga i IgE. W obrębie łańcuchów lekkich i ciężkich, zmienne i stałe regiony są połączone przez region „J o długości około 12 lub więcej aminokwasów, z łańcuchem ciężkim obejmującym również region „D o długości około 10 lub więcej aminokwasów. Patrz ogólnie, Fundamental Immunology Rozdz. 7 (Paul, W., wyd., wyd. 2, Raven Press, N.Y. (1989)) (włączone tu w całości jako odniesienie dla wszystkich potrzeb).
Regiony zmienne każdej pary łańcuchów lekki/ciężki mogą tworzyć miejsce wiązania przeciwciała. A zatem, generalnie, nienaruszone przeciwciało IgG ma dwa miejsca wiązania. Z wyjątkiem przeciwciał bifunkcjonalnych lub bispecyficznych, dwa miejsca wiązania są generalnie takie same.
Prawidłowo, wszystkie łańcuchy wykazują taką samą ogólną strukturę stosunkowo konserwowanych regionów zrębowych (FR) połączonych trzema regionami hiperzmiennymi, zwanymi również regionami determinującymi dopasowanie lub CDR. CDR z dwóch łańcuchów z każdej pary zwykle są dopasowywane do siebie poprzez regiony zrębowe, umożliwiając wiązanie się do swoistego epitopu. Ogólnie, od końca N do końca C, obydwa łańcuchy, leki i ciężki, zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przypisanie aminokwasów do każdej domeny jest, w ogólności, zgodne z definicjami w Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, i wsp.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; wyd. 5.; NIH Publ. nr 51-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, L wsp., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, i wsp., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 lub Chothia, i wsp., (1989) Nature 342:878-883. Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciał albo ich fragmentów wiążących antygen według wynalazku zawierających CDR i FR z łańcuchów lekkich i ciężkich 1H3, 15H12 i 19D12 (np. LCA 15H12/19D12, LCB 15H12/19D12, HCA 15H12/19D12, SEK NR ID: 2, 4, 25, 27, 41, 43 i 45) jak zdefiniowano przez Kabat i Chothia (patrz odnośniki powyżej).
Cząsteczki przeciwciał
Termin „cząsteczka przeciwciała obejmuje, ale nie ogranicza się do przeciwciał i jego fragmentów, korzystnie fragmentów wiążących antygen. Termin obejmuje przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała bispecyficzne, fragmenty Fab przeciwciała, fragmenty F(ab)2 przeciwciała, fragmenty Fv przeciwciała (np. VH lub VL), jednołańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała i fragmenty dsFv przeciwciał a. Ponadto, czą steczki przeciwciał a wedł ug wynalazku mogą być przeciwciałami w pełni ludzkimi albo przeciwciałami chimerowymi. Korzystne jest, jeżeli cząsteczki przeciwciała są monoklonalnymi, w pełni ludzkimi przeciwciałami; korzystniej, cząsteczkami przeciwciała 1H3, 15H12 lub 19D12. Korzystnie cząsteczka przeciwciała zawiera jeden albo większą liczbę regionów zmiennych i CDR, których sekwencje aminokwasowe i nukleotydowe są przedstawione w Tabeli 1.
Niniejszy wynalazek obejmuje dowolną cząsteczkę przeciwciała zawierającą CDR wybrany spośród:
RASQSIGSSLH (SEK NR ID: 8) ;
YASQSLS (SEK NR ID: 9) ;
HQSSRLPHT (SEK NR ID: 10) ;
SFAMH (SEK NR ID: 14)
PL 210 412 B1
GFTFSSFAMH (SEK NR ID:17); VIDTRGATYYADSVKG (SEK NR ID: 15) LGNFYYGMDV (SEK NR ID: 16);
RASQSVSSFLA (SEK NR ID: 31)
DASNRAP (SEK NR ID: : 32) ;
QQRSNWPRWT (SEK NR ID: 33) ;
GFTFSNYAMH (SEK NR ID: 37) ;
AIGAGGDTYYADSVKG (SEK NR ID:38); i GRHRNWYYYNKDY (SEK NR ID: 39);
NYAMH (SEK NR ID: 70)
Zakres wynalazku obejmuje regiony zmienne przeciwciała według niniejszego wynalazku (np.
dowolny region zmienny, dojrzały albo nie poddany obróbce, wskazany w Tabeli 1) połączone z dowolnym regionem stałym immunoglobuliny. Jeżeli region zmienny łańcucha lekkiego jest połączony z regionem stałym, korzystne jest, jeżeli jest to łańcuch κ. Jeżeli region zmienny łańcucha lekkiego jest połączony z regionem stałym, korzystne jest, jeżeli jest to region stały γ1, γ2, γ3 lub γ4, korzystniej γ1, γ2 lub γ4, a nawet jeszcze korzystniej γ1 lub γ4.
Korzystnie cząsteczki przeciwciała anty-IGFR1 według niniejszego wynalazku rozpoznają ludzki IGFR1, korzystnie sIGFR1; jednakże niniejszy wynalazek obejmuje cząsteczki przeciwciała, które rozpoznają IGFR1 z różnych gatunków, korzystnie ssaków (np. myszy, szczura, królika, owcy lub psa). Niniejszy wynalazek obejmuje również przeciwciała anty-:GFR1 lub ich fragmenty, które są połączone z IGFR1 lub lowolnym jego fragmentem (np. aminokwasy 30-902 z SEK NR ID: 9) lub dowolną komórkę wyrażającą IGFR1 albo dowolny jego fragment na powierzchni komórki (np. komórki HEK293 stabilnie transformowane ludzkim IGFR1 lub MCF7 (np. linia komórkowa ATCC nr HTB-22)). Takie kompleksy można wytwarzać poprzez doprowadzenie do kontaktu przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z IGFR1 lub fragmentem IGFR1.
W korzystnym wykonaniu, w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko IGFR1 wytwarza się przy zastosowaniu myszy transgenicznej niosącej części ludzkiego układu immunologicznego zamiast układu mysiego. Transgeniczna mysz, która może tu być określana jako mysz „HuMAb zawiera ludzkie miniloci genów immunoglobulinowych, które kodują sekwencje łańcuchów ciężkich (μ i γ) i lekkich κ bez rearanżacji, łącznie z docelowymi mutacjami, które inaktywują endogenne loci łańcucha μ, i κ (Lonberg, N., i wsp., (1994) Nature 368 (6474): 856-859). A zatem myszy wykazują zmniejszoną ekspresję mysiej IgM lub κ i, w odpowiedzi na immunizację, wprowadzone transgeny ludzkich łańcuchów ciężkich i lekkich podlegają zmianie klas i somatycznym mutacjom, z wytworzeniem ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgGK o wysokim powinowactwie (Lonberg, N. i wsp., (1994), jak wyżej; przegląd w Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N., i wsp., (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 oraz Harding, F., i wsp. (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536-546). Wytwarzanie myszy HuMab jest powszechnie znane w tej dziedzinie i jest opisane na przykład w Taylor, L. i wsp., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. i wsp., (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon i wsp., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 37203724; Choi, i wsp., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J., i wsp., (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon, i wsp., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg, i wsp., (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. i wsp., (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N., i wsp., (1995) Intern. Rev. Immunol, tom. 13: 65-93; Harding, P., i wsp, (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D., i wsp., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 and Harding, i wsp., (1995) Annals NY Acad. Sci. 764: 536-546; zawartość ich wszystkich jest tu włączona w całości jako odniesienie. Patrz dalej, patenty USA nr 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; 5770429 i 5545807
PL 210 412 B1 oraz międzynarodowe zgłoszenia patentowe nr WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/12227; WO 92/22645 i WO 92/03918, ujawnienie wszystkich jest tu włączone w całości jako odniesienie.
W celu wytworzenia w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec IGFR1, myszy HuMab można immunizować antygenowym polipeptydem IGFR1, korzystnie aminokwasami 30-902 z SEK NR ID: 19, jak opisano w Lonberg, N. i wsp., (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D., i wsp., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 oraz WO 98/24884. Korzystne jest, jeżeli myszy będą w wieku 6-16 tygodni przy pierwszej immunizacji. Przykładowo, oczyszczony preparat IGFR1 lub sIGFR1 można zastosować do immunizacji myszy HuMab dootrzewnowe. Myszy można również immunizować całymi komórkami HEK293, które są stabilnie transformowane lub transfekowane genem IGFR1. „Antygenowy polipeptyd IGFR1 może dotyczyć polipeptydu IGFR1 albo dowolnego jego fragmentu.
Korzystnie aminokwasów 30-902 z SEK NR ID: 19, które wzbudzają odpowiedź immunologiczną anty-IGFR1, korzystnie u myszy HuMab.
Ogólnie, transgeniczne myszy odpowiadają dobrze, kiedy są wyjściowo immunizowane dootrzewnowe (IP, od ang. intraperitoneally) antygenem w kompletnym adiuwancie Freunda, po czym następują co drugi tydzień immunizacje IP (zwykle w sumie do 6) antygenem w niekompletnym adiutancie Freunda. Myszy można immunizować najpierw komórkami wyrażającymi IGFR1 (stabilnie transformowanymi komórkami HEK293), a następnie rozpuszczalnym fragmentem IGFR1 (np, aminokwasami 30-902 z SEK NR ID: 19), a następnie mogą otrzymywać różne immunizacje dwoma antygenami. Odpowiedź immunologiczną można monitorować w trakcje protokołu immunizacji przy użyciu próbek osocza otrzymanych poprzez skrwawienie zaoczodołowe. Osocze można badać pod kątem obecności przeciwciał anty-IGFR1, na przykład poprzez ELISA, i myszy z wystarczającymi mianami immunoglobulin można użyć do fuzji. Myszom można podawać dożylnie zastrzyk wzmagający z antygenu 3 dni przez uśmierceniem i pobraniem śledziony. Można się spodziewać, że będzie trzeba dokonać 2-3 fuzji dla każdego antygenu. Kilka myszy można immunizować dla każdego antygenu. Przykładowo, w sumie można immunizować dwanaście nyszy HuMAb ze szczepów HC07 i HC012.
Komórki hybrydoma, które wytwarzają monoklonalne, w pełni ludzkie przeciwciała anty-IGFR1 można wytwarzać metodami, które są powszechnie znane w tej dziedzinie. Metody te obejmują między innymi, technikę hybrydoma oryginalnie opracowaną przez Kohler, i wsp., (1975) (Nature 256: 495497), jak również technikę triomy (Hering, i wsp., (1988) Biom wyd. Biochim. Acta. 47: 211-216 i Hagiwara, i wsp., (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4:15), technik ę hybrydoma ludzkich komórek B (Kozbor, i wsp., (1983) Immunology Today 4:72 oraz Cote, i wsp., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) oraz technikę hybrydoma-EBV (Cole, i wsp. w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96, 1985). Korzystne jest, jeżeli mysie splenocyty izoluje się i łączy przy użyciu PEG z linią komórkową mysiego szpiczaka w oparciu o standardowe protokoły. Otrzymane w rezultacie hybrydoma można następnie przeszukiwać pod kątem wytwarzania przeciwciał swoistych wobec antygenu. Przykładowo, zawiesiny pojedynczych komórek limfocytów ze śledziony z immunizowanych myszy można łączyć z jedną szóstą liczby nie wydzielają cych mysich komórek szpiczaka P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) przy użyciu 50% PEG. Komórki można wysiewać przy gęstości około 2 x 105 komórek/ml na płaskodenne płytki do mikromiareczkowania, a następnie przeprowadzić dwutygodniową inkubację w pożywce selekcyjnej zawierającej 20% płodowej surowicy Clone Serum, 18% kondycjonowanej pożywki „653, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutaminę, 1 mM L-glutaminę, 1 mM pirogronian sodowy, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 mg/ml streptomycyny, 50 mg/ml gentamycyny i 1X HAT (Sigma; HAT jest dodawany 24 godziny po fuzji). Po dwóch tygodniach, komórki można hodować w pożywce, w której HAT jest zastąpiony przez HT. Poszczególne studzienki można następnie przeszukiwać poprzez ELISA pod kątem ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG anty-IGFR1. Po tym, jak nastąpi intensywny wzrost hybrydoma, pożywkę można obserwować, zwykle po 10-14 dniach. Hybrydoma wydzielające przeciwciało można jeszcze raz wysiewać, ponownie przeszukiwać i jeżeli są nadal dodatnie pod kątem ludzkich IgG - przeciwciał monoklonalnych anty-IGFR1, można je podklonowac co najmniej dwukrotnie poprzez ograniczające rozcieńczenia. Stabilne podklony można następnie hodować in vitro w celu wytworzenia niewielkich ilości przeciwciała w pożywce do hodowli tkankowej w celu charakteryzacji.
Cząsteczki przeciwciała anty-IGFR według niniejszego wynalazku można również wytwarzać przez rekombinowanie DNA (np. w systemie ekspresji E.coli/T7, jak dyskutowano powyżej). W tym wykonaniu, kwas nukleinowy kodujący cząsteczki przeciwciała według wynalazku (np. VH lub VL) można wstawić do plazmidu w oparciu o pET w systemie E.coli/T7. Istnieje kilka metod wytwarzania zrekorabinowanych przeciwciał znanych w tej dziedzinie. Jeden z przykładów metody wytwarzania przez
PL 210 412 B1 rekombinowanie DNA przeciwciał jest ujawniony w Patencie USA Nr 4816567, który jest tu włączony jako odniesienie. Transformację można wykonać stosując dowolną metodę wprowadzania polinukleotydów do komórki gospodarza. Sposoby wprowadzania heterologicznych polinukleotydów do komórek ssaczych są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują transfekcję za pośrednictwem dekstranu, precypitację za pośrednictwem fosforanu wapniowego, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, fuzję protoplastów, elektoporację, zamknięcie polinukleotydu(ów) w liposomach, wstrzyknięcie balistyczne i bezpośrednie mikrowstrzyknięcie DNA do jąder. Dodatkowo, cząsteczki kwasu nukleinowego można wprowadzać do komórek ssaczych przy zastosowaniu wektorów wirusowych. Sposoby transformowania komórek są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz na przykład patenty USA nr 4399216; 4912040; 4740461 i 4959455.
Ssacze linie komórek gospodarzy dostępne jako gospodarze do ekspresji są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują wiele unieśmiertelnionych linii dostępnych z kolekcji American Type Culture Collection (ATCC). Obejmują one między innymi komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), NSO, komórki SP2, komórki HeLa, komórki nerki małego chomika (BHK), komórki nerki małpy (COS), ludzkie komórki raka wątrobowokomórkowego (np. Hep G2), komórki A549, komórki 3T3 i liczne inne linie komórkowe. Ssacze komórki gospodarza obejmują komórki człowieka, myszy, szczura, psa, małpy, świni, kozy, bydła, konia i chomika. Szczególnie korzystne linie komórkowe są wybierane poprzez określenie, które linie komórkowe mają wysokie poziomy ekspresji. Inne linie komórkowe, które mogą być użyte, to owadzie linie komórkowe, takie jak komórki Sf9, komórki płazów, komórki bakterii, komórki roślin i komórki grzybów. Kiedy zrekombinowane wektory wirusowe kodujące łańcuch ciężki i/lub jego fragment wiążący antygen, łańcuch lekki i/lub jego fragment wiążący antygen wprowadza się do ssaczych komórek gospodarza, przeciwciała są wytwarzane poprzez hodowanie komórek gospodarza przez okres czasu dostateczny dla umożliwienia ekspresji przeciwciała w komórce gospodarza, albo korzystniej, sekrecji przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której komórki gospodarza są hodowane.
Przeciwciała można również odzyskać z pożywki hodowlanej przy zastosowaniu standardowych metod oczyszczania białka. Ponadto, ekspresję przeciwciał według wynalazku (lub innych cząsteczek z nich pochodzących) do wytwarzania linii komórkowych można wzmocnić przy zastosowaniu wieku znanych technik. Przykładowo, system ekspresji genu syntetazy glutaminowej (system GS) jest powszechnie stosowanym podejściem do wzmacniania ekspresji w pewnych warunkach. System GS jest omówiony w całości albo części w powiązaniu z patentami europejskimi Nr 0 216 846, 0 256 055, i 0 323 997 oraz europejskim zgłoszeniem patentowym nr 89303964.4.
Jest prawdopodobne, że przeciwciała wyrażane przez różne linie komórkowe albo w zwierzętach transgenicznych będą różnić się od siebie glikozylacją. Jednakże wszystkie przeciwciała zakodowane przez dostarczone tu cząsteczki kwasów nukleinowych albo zawierające dostarczone tu sekwencje aminokwasowe są częścią niniejszego wynalazku, niezależnie od glikozylacji przeciwciał.
Koff dotyczy stałej szybkości dysocjacji przeciwciała z kompleksu przeciwciało/antygen.
Kon dotyczy szybkości z którą przeciwciało asocjuje z antygenem.
Kd dotyczy stałej dysocjacji dla konkretnego oddziaływania przeciwciało/antygen. Kd = Koff/Kon.
Stosowany tu termin „przeciwciało monoklonalne dotyczy przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała stanowiące populację są identyczne z wyjątkiem możliwych występujących naturalnie mutacji, które mogą być obecne w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce swoiste, będąc skierowanymi przeciw pojedynczemu miejscu antygenowemu. Przeciwciała monoklonalne są korzystne z tego względu, że mogą być syntetyzowane przez hodowle hybrydomy zasadniczo nie zanieczyszczone innymi immunoglobulinami. Określenie „monoklonalny wskazuje na charakter przeciwciała jako będący zasadniczo homogenną populacją przeciwciał i nie ma być traktowany jako wymaganie wytwarzania przeciwciała jakąkolwiek określoną metodą. Jak wspomniano powyżej, przeciwciała monoklonalne do zastosowania w niniejszym wynalazku mogą być wytwarzane metodą hybrydomy opisaną po raz pierwszy przez Kohler, i wsp., (1975) Nature 256: 495.
Przeciwciało poliklonalne to przeciwciało, które było wytwarzane wśród albo w obecności jednego albo większej liczby przeciwciał nieidentycznych. Generalnie przeciwciała poliklonalne są wytwarzane z limfocytów B w obecności kilku innych limfocytów B, które wytwarzają przeciwciała nieidentyczne. Przeciwciała poliklonalne otrzymuje się zwykle bezpośrednio z immunizowanego zwierzęcia.
Przeciwciało bispecyficzne albo bifunkcjonalne to sztuczne przeciwciało hybrydowe mające dwie pary różnych łańcuchów ciężkich/lekkich i dwa różne miejsca wiązania. Przeciwciała bispecyficzne można wytwarzać przy zastosowaniu rozmaitych metod, włączając w to między innymi fuzję hybrydom
PL 210 412 B1 albo łączenie fragmentów Fab'. Patrz np. Songsivilai, i wsp., (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, Kostelny, i wsp., (1992) J. Immunol. 148:1547- 1553. Dodatkowo, przeciwciała bispecyficzne mogą być wytwarzane jako „diciała (Holliger, i wsp., (1993) PNAS USA 90: 6444-6448) lub jako „Janusiny (Traunecker, i wsp., (1991) EMBO J. 10: 3655-3659 i Traunecker, i wsp., (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-52).
Termin „przeciwciało w pełni ludzkie dotyczy przeciwciała, które zawiera jedynie sekwencje białkowe ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciało w pełni ludzkie może zawierać mysie łańcuchy węglowodanowe, jeżeli jest wytwarzane w myszy, mysiej komórce lub hybrydomie pochodzącej z mysiej komórki. Podobnie, „przeciwciało mysie dotyczy przeciwciała, które zawiera jedynie sekwencje mysiej immunoglobuliny.
Niniejszy wynalazek obejmuje „przeciwciała chimerowe - przeciwciało, które zawiera region zmienny według niniejszego wynalazku połączone albo jako chimera z regionem przeciwciała (np. regionem stałym) z innego niż człowiek gatunku (np. myszy, konia, królika, psa, krowy, kury). Przeciwciała te można zastosować do modulowania ekspresji albo aktywności IGFR1 w gatunkach innych niż człowiek.
„Jednołańcuchowe Fv lub fragmenty przeciwciała „sFv nają domeny VH i VL przeciwciała, gdzie domeny te są obecne w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Ogólnie, polipeptyd sFv zawiera ponadto łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami VH i VL który umożliwia sFv utworzenie pożądanej struktury dla wiązania antygenu. Techniki opisane dla wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych (patenty USA nr 5476786; 132405 i 4946778) można przystosować do wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych swoistych wobec IGFR1. Dla przeglądu sFv patrz Pluckthun w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom. 113, Rosenburg i Moore wyd. Springer-Verlag, N. Y., str. 269-315 (1994).
„Fragmenty Fv stabilizowane mostkami dwusiarczkowymi i „dsFv dotyczą cząsteczek przeciwciała zawierających zmienny łańcuch ciężki (VH) i zmienny łańcuch lekki (VL), które są połączone mostkiem dwusiarczkowym.
Fragmenty przeciwciała w zakresie niniejszego wynalazku obejmują również fragmenty F(ab)2, które mogą być wytwarzane poprzez cięcie enzymatyczne IgG przez, na przykład, pepsynę. Fragmenty Fab mogą być wytwarzane na przykład poprzez redukcję F(ab)2 przy zastosowaniu ditiotreitolu lub merkaptoetylaminy. Fragment Fab to łańcuch VL-CL przyłączony do łańcucha VH-CH1 poprzez mostek dwusiarczkowy. Fragment F(ab)2 to dwa fragmenty Fab, które z kolei są połączone przez dwa mostki dwusiarczkowe, Część Fab cząsteczki F(ab)2 obejmuje część regionu Fc pomiędzy którym znajdują się mostki dwusiarczkowe.
Fragment Fv to region VL lub VH
W zależności od sekwencji aminokwasowych domeny stałej łańcuchów ciężkich, immunoglobuliny można przypisać do różnych klas. Istnieje co najmniej pięć głównych klas Immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a kilka z nich można dalej podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG-1, IgG-2, IgG-3 i IgG-4; IgA-1 i IgA-2.
Cząsteczki przeciwciała anty-IGFR1 według wynalazku mogą być również połączone z resztą chemiczną. Resztą chemiczną może być, między innymi polimer, radionuklid albo czynnik toksyczny. Korzystnie resztą chemiczną jest polimer, który zwiększa okres półtrwania cząsteczki przeciwciała w ciele osobnika. Odpowiednie polimery obejmują mię dzy glikol polietylenowy (PEG) (np. PEG o cię żarze cząsteczkowym 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa lub 40 kDa), dekstran i glikol monometoksypolietylenowy (mPEG). Lee i wsp. (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981) ujawniają przeciwciała jednołańcuchowe połączone z PEG. Wen i wsp., (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553) ujawniają przeciwciała połączone z PEG, który jest przyłączony do chelatora radiometalu (kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA)).
Przeciwciała i fragmenty przeciwciał według wynalazku można łączyć ze znacznikami, takimi jak 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125l, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th i 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr oraz 56Fe.
Przeciwciała i fragmenty przeciwciał według wynalazku można łączyć ze znacznikami, takimi jak znaczniki fluorescencyjne lub chemiluminescencyjne, włączając w to fluorofory, takie jak chelaty metali ziem rzadkich, fluoresceina i jej pochodne, rodamina i jej pochodne, izotiocyjanian, fikoerytryna, fikocyjanina, allofikocyjanina, oftalaldehyd, fluorescamina, 152Eu, dansyl, umbelliferon, lucyferyna, znacznik luminalowy, znacznik izoluminalowy, znacznik - aromatyczny ester akrydynowy, znacznik imidazolowy, znacznik - sól akrydymiowa, znacznik - ester szczawianowy, znacznik akwarynowy, 2,3-dihydroftalazynodiony, biotyna/awidyna, znaczniki spinowe i stabilne wolne rodniki.
PL 210 412 B1
Cząsteczki przeciwciała mogą byc również połączone z czynnikiem cytotoksycznym, takim jak toksyna błonicy, łańcuch A egzotoksyny Pseudomonas aeruginosa, łańcuch A rycyny A, łańcuch A abryny, łańcuch A modecyny, alfa-sarcyna, białka i związki Aleurites fordii (np. kwasy tłuszczowe), białka diantyny, białka PAPI, PAPII i PAP-S Phytolacca americana, inhibitor Momordica charantia, kurcyna, krotyna, inhibitor Saponaria officinalis, mitożelina, restryktocyna, fenomycyna i enomycyna.
Można zastosować dowolną metodę znaną w tej dziedzinie do łączenia cząsteczek przeciwciała według wynalazku z różnymi resztami, włączając w to metody opisane przez Hunter, i wsp., (1962) Nature 144:945; David i wsp., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain i wsp., (1981) J. Immunol. Meth.) 40:219 oraz Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Metody łączenia przeciwciał są konwencjonalne i bardzo dobrze znane w tej dziedzinie.
Zmodyfikowane cząsteczki przeciwciał
Niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciała i fragmenty przeciwciał wiążące antygen (np. przeciwciała w pełni ludzkie, SFv, dsFv, Fv, przeciwciała chimerowe) zawierające łańcuch lekki z SEK NR ID: 41, 43, 72, 74, 76 lub 78 (LCA, LCB, LCC, LCD, LCE lub LCF 15H12/19D12); korzystnie aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 41, 43, 72, 74, 76 lub 78 (LCA, LCB, LCC, LCD, LCE lub LCF dojrzałego 15H12/19D12). Niniejszy wynalazek obejmuje również cząsteczki przeciwciał zawierające łańcuch ciężki z SEK NR ID: 45 lub 112 (HCA, HCB 15H12/19D12); korzystnie aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45 lub 112 (HCA, HCB dojrzałego 15H12/19D12).
LCA, LCB, LCC, LCD, LCE i LCF 15H12/19D12 mogą być w dimerze z dowolnym innym łańcuchem ciężkim immunoglobuliny, korzystnie łańcuchem ciężkim immunoglobuliny według niniejszego wynalazku. Podobnie, HCA lub HCB 15H12/19D12 może być w dimerze z dowolnym łańcuchem lekkim, korzystnie łańcuchem lekkim według niniejszego wynalazku. Przykładowo, 15H12/19D12 HCA lub HCB mogą tworzyć dimer z 15H12/19D12 LCC, LCD, LCE lub LCF.
Przeciwciała i fragmenty przeciwciał wiążące antygen zawierające LCA 15H12/19D12, LCB 15H12/19D12, LCC 15H12/19D12, LCD 15H12/19D12, LCE 15H12/19D12, LCF 15H12/19D12, HCA 15H12/19D12 lub HCB 15H12/19D12 albo jego dowolny fragment wykazują minimalną immunogenność u ludzi, co prowadzi do rzadkiego występowania odpowiedzi HAHA, kiedy są podawane ludziom.
Korzystne łańcuchy są pokazane poniżej. Litery podkreślone linią przerywaną kodują peptyd sygnałowy. Litery podkreślone linią ciągłą kodują CDR. Litery nie zaznaczone kodują regiony zrębowe. Najkorzystniej, jeżeli łańcuchy przeciwciał są dojrzałymi fragmentami, w których nie ma peptydu sygnałowego.
Zmodyfikowany łańcuch lekki-C 19D12/15H12 (SEK NR ID: 71)
Zmodyfikowany łańcuch lekki-C 19D12/15H12 (SEK NR ID: 71)
ĄTG TCG.CCA TCA CAA__CTC.ATT GGG.TTT CTG CTG CTC TGG GTT CCA GCC TCC
AGG GGT GAA ATT GTG CTG ACT CAG AGC CCA GAC TCT CTG TCT GTG ACT CCA
GGC GAG AGA GTC ACC ATC ACC TGC CGG GCC AGT CAG AGC ATT GGT AGT AGC
TTA CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGT CAG TCT CCA AAG CTT CTC ATC AAG
TAT GCA TCC CAG TCC CTC TCA GGG GTC CCC TCG AGG TTC AGT GGC AGT GGA
TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AGT AGC CTC GAG GCT GAA GAT GCT
GCA GCG TAT TAC TGT CAT CAG AGT AGT CGT TTA CCT CAC ACT TTC GGC CAA
GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA , CGT ACG
(SEK NR ID: 72)
PL 210 412 B1
Μ R P S ¢) Γ. I G F L L L w V P A s
R G E I V L T Q s P D S L s V T P
G E R V T I T c R A S Q S I G s s
li H W Y Q Q K P G Q S P K L L I K
Y A S Q s L s G V P s R F s G s G
s G T D F T Ł T I s s L E A E D A
A A Y Y c H 0 s s tt Ii P H T F G Q
G Τ K V E ikowany łańcuch I K lekki R T D 19D12/15H12 (SEK NR ID: 73)
ATG TCG CCA TCA CAA CTC ATT GGG TTT CTG CTG CTC TGG GTT CCA GCC TCC
AGG GGT GAA ATT GTG CTG ACT CAG AGC CCA GAC TCT CTG TCT GTG ACT CCA
GGC GAG AGA GTC ACC ATC ACC TGC CGG GCC AGT CAG AGC ATT GGT AGT AGC
TTA CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGT CAG TCT CCA AAG CTT CTC ATC AAG
TAT GCA TCC CAG TCC CTC TCA GGG GTC CCC TCG AGG TTC AGT GGC AGT GGA
TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AGT AGC CTC GAG GCT GAA GAT TTC
GCA GTG TAT TAC TGT CAT CAG AGT AGT CGT TTA CCT CAC ACT TTC GGC CAA
GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGT ACG R ID: 74) MSPSQLIGFL Ł L W V P A S
R G E I V L T Q S P D s L S V T P
G E R V T I T C R A S Q S I G s s
PL 210 412 B1
L H W Y Q Q K P G Q S P K L L I K
Y A s Q S L s G V P s R F s G s G
S G T D F T L T I s s L E A E D F
A V Y Y C H 2 s S R L P H T F G Q
G T K V E I K R T
Zmodyfikowany łańcuch lekki -E : 19D12/15H12 (SEK NR ID: ' 75)
ATG TCG CCA TCA CAA CTC ATT GGG TTT CTG CTG CTC TGG GTT CCA GCC TCC
AGG GGT GAA ATT GTG CTG ACT CAG AGC CCA GGT ACC CTG TCT GTG TCT CCA
GGC GAG AGA GCC ACC CTC TCC TGC CGG GCC AGT CAG AGC ATT GGT AGT AGC
TTA CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGT CAG GCT CCA AGG CTT CTC ATC AAG
TAT GCA TCC CAG TCC CTC TCA GGG ATC CCC GAT AGG TTC AGT GGC AGT GGA
TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AGT AGA CTG GAG CCT GAA GAT GCT
GCA GCG TAT TAC TGT CAT CAG AGT AGT CGT TTA CCT CAC ACT TTC GGC CAA
GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGT ACA
(SEK NR ID: 76)
M S P s Q L I G F L L L W V P A S
R G E I V L T Q S P G T L S V S P
G E R A T L s C R A S Q S I G S S
L H W Y Q Q K P G Q A P R L Ł I K
γ A S G s L 3 G I P D R F S G s G
s G T D . F T Ł T I s R L E P E D A
A A Y Y C H G s s R L P H T F G Q
G T K V E I K R T
PL 210 412 B1
Zmodyfikowany łańcuch lekki-F 19D12/15H12 (SEK NR ID: 77)
AGG GGT GAA ATT GTG CTG ACT CAG AGC CCA GGT ACC CTG TCT GTG TCT CCA
GGC GAG AGA GCC ACC CTC TCC TGC CGG GCC AGT CAG AGC ATT GGT AGT AGC
TTA CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGT CAG GCT CCA AGG CTT CTC ATC AAG
TAT GCA TCC CAG TCC CTC TCA GGG ATC CCC GAT AGG TTC AGT GGC AGT GGA
TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AGT AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTC
GCA GTG TAT TAC TGT CAT CAG AGT AGT CGT TTA CCT CAC ACT TTC GGC CAA
GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGT ACA
TR ID: 78)
M S P s Q L I G F L L L W V P A S
R G E I V L T Q S P G T L S V S P
G E R A T L S C R A S Q s I G S S
L H W Y Q Q K P G Q A P R L L I K
Y A S Q s L s G I P D R F s G S G
S G T D F T L T I S R L E P E D F
A V Y Y C H Q S S R L P H T F G Q
G T K V E I K R T
ikowany łańcuch ciężki-A 19D12/15H12 (SEK NR ID: 44)
ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATS TTA AAA GGT GTC
CAG TGT GAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA AAG CCT GGG
GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TTT
GCT ATG CAC TGG GTT CGC CAG GCT CCA GGA AAA GGT CTG GAG TGG ATA TCA
PL 210 412 B1
GTT ATT GAT ACT CGT GGT GCC ACA TAC TAT GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGA
TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC TCC TTG TAT CTT CAA ATG AAC
AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACT GCT GTG TAT TAC TGT GCA AGA CTG GGG AAC
TTC TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC
TCA (SEK NR ID: 45)
Met Glu Phe Gly. Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly Val
Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser
Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn
Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
Ser
Zmodyfikowany łańcuch ciężki-B 19D12/15H12 (SEK NR ID: 111)
ATG. GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATA TTA AAA GGT GTC
CAG TGT GAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCC GGG
GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TTT
GCT ATG CAC TGG GTT CGC CAG GCT CCA GGA AAA GGT CTG GAG TGG ATA TCA
GTT ATT GAT ACT CGT GGT GCC ACA TAC TAT GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGA
TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC TCC TTG TAT CTT CAA ATG AAC
AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACT GCT GTG TAT TAC TGT GCA AGA CTG GGG AAC
PL 210 412 B1
TTC TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC
TCA (SEK NR ID: 112)
Met Glu Phe Gly Leu Ser £rp Va£ Phe Leu Val Ala £le Leu Lys Gly Val
Gin cy? Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser
Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val ..Lyg Qj-y Arg
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn
Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
Ser
Terapia genowa
Przeciwciała anty-IGFR1 według wynalazku można również podawać osobnikowi przy zastosowaniu terapii genowej. W terapii genowej komórki osobnika transformuje się kwasami nukleinowymi, które kodują przeciwciała według wynalazku. Uprzednio, Alvarez i wsp., (2000) (Clinical Cancer Research 6: 3081-3087) wprowadzali jednołańcuchowe przeciwciała anty-ErbB2 do osobnika stosując terapię genową. Metody ujawnione przez Alvarez i wsp. można łatwo dostosować do wprowadzania do osobnika kwasów nukleinowych kodujących cząsteczkę przeciwciała anty-IGFR1 według wynalazku.
Jakkolwiek do osobnika można wprowadzić kwasy nukleinowe kodujące dowolną cząsteczkę polipeptydu albo przeciwciała według wynalazku, w korzystnych wykonaniach cząsteczką przeciwciała jest w pełni ludzkie przeciwciało jednołańcuchowe.
Kwasy nukleinowe można wprowadzać do komórek osobnika dowolnym sposobem znanym w tej dziedzinie. W korzystnych wykonaniach, kwasy nukleinowe wprowadza się jako część wektora wirusowego. Przykłady korzystnych wirusów, z których mogą pochodzić wektory obejmują lentiwirusy, wirusy opryszczki, adenowirusy, wirusy towarzyszące adenowirusom, wirusa krowianki, bakulowirusa, alfawirusa, wirusa grypy i inne zrekombinowane wirusy o pożądanym tropizmie komórkowym.
Różne firmy wytwarzają wektory wirusowe komercyjnie, włączając w to między innymi Avigen, Inc. (Alameda, CA; wektory AAV), Cell Genesys (Foster City, CA; wektory retrowirusowe, adenowirusowe, AAV oraz wektory lentiwirusowe), Clontech (wektory retrowirusowe i baculowirusowe), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; wektory adenowirusowe i AAV), Genvec (wektory adenowirusowe), IntroGene (Leiden, Netherlands; wektory adenowirusowe), Molecular Medicine (wektory retrowirusowe, adenowirusowe, AAV i z wirusa opryszczki), Norgen (wektory adenowirusowe), Oxford BioMedica (Oxford, United Kingdom; wektory lentiwirusowe) oraz Transgene (Strasbourg, France; wektory adenowirusowe, krowianki, retrowirusowe i lentiwirusowe).
Sposoby konstruowania i stosowania wektorów wirusowych są znane w tej dziedzinie (patrz, np. Miller i wsp., (1992) BioTechniques 7: 980-990). Korzystnie wektory wirusowe są defektywne pod względem replikacji, tj. są niezdolne do autonomicznej replikacji, a zatem nie są zakaźne w docelowej
PL 210 412 B1 komórce. Korzystnie defektywny pod względem replikacji wirus jest wirusem minimalnym, tj. zachowuje jedynie te sekwencje swojego genomu, które są niezbędne do zamknięcia genomu w otoczce w celu wytworzenia czą stek wirusowych. Korzystne są defektywne wirusy, którym cał kowicie albo prawie całkowicie brak genów wirusowych. Zastosowanie defektywnych wektorów wirusowych umożliwia podawanie komórkom w konkretnych, zlokalizowanych miejscach, bez obawy, że wektor może zakażać inne komórki. A zatem specyficzne tkanki mogą być swoistym celem.
Przykłady wektorów zawierających sekwencje DNA atenuowanych lub defektywnych wirusów obejmują miedzy innymi wektor w oparciu o defektywnego wirusa opryszczki (Kanno, i wsp., (1999) Cancer Gen. Ther. 6: 147-154; Kaplitt, i wsp., (1997) J. Neurosci. Meth. 71: 125-132 oraz Kaplitt, i wsp., (1994) J. Neuro One. 19: 137-147).
Adenowirusy to eukariotyczne wirusy DNA, które można modyfikować w celu wydajnego dostarczenia kwasu nukleinowego według wynalazku do różnych typów komórek. W niektórych przypadkach pożądane są atenuowane wektory adenowirusowe, takie jak wektor opisany przez StratfordPerricaudet i wsp. (1992) (J. Glin. Invest. 90: 626-630). Różne defektywne pod względem replikacji minimalne wektory adenowirusowe zostały opisane (publikacje PCT nr WO 94/26914, WO 94/28938, WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697 i WO 96/22378). Defektywne pod względem replikacji zrekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku można wytworzyć dowolną techniką znaną specjaliście w tej dziedzinie (Levrero, i wsp., (1991) Gene 101:195; EP 185573; Graham, (1984) EMBO J. 3:2917; Graham, i wsp., (1977) J. Gen. Virol. 36:59).
Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV, ang. adeno-associated viruses) to wirusy DNA o stosunkowo małych rozmiarach, które mogą włączać się, w stabilny i specyficzny miejscowo sposób, do genomu komórek, które zakażają. Są one zdolne do zakażania szerokiego spektrum komórek bez indukowania jakiegokolwiek efektu na wzrost, morfologię lub różnicowanie komórek i nie wydają się uczestniczyć w patologiach u ludzi. Zastosowanie wektorów pochodzących z AAV do przenoszenia genów in vitro i in vivo zostało opisane (patrz Daly, i wsp., (2001) Gene Ther. 8: 1343-1346, 1245-1315; Larson, i wsp., (2001) Adv. Exp. wyd. Bio. 489: 45-57; publikacje PCT nr WO91/18088 i WO93/09239; patenty USA nr 4797368 i 5139941 i EP 488528B1).
W innym wykonaniu gen moż na wprowadzić na wektorze wirusowym, np. jak opisano w patentach USA nr 5399346, 4650764, 4980289, i 5124263; Mann, i wsp., (1983) Cell 33:153; Markowitz, i wsp., (1988) J. Virol., 62:1120; EP 453242 i EP178220. Retrowirusy to wirusy integracyjne, które zakażają dzielące się komórki.
Wektory lentiwirusowe można stosować jako czynniki do kierowania dostarczaniem i utrzymującą się ekspresją kwasów nukleinowych kodujących cząsteczkę przeciwciała według wynalazku w kilku typach tkanek, włączając w to mózg, siatkówkę, mięśnie, wątrobę i krew. Wektory mogą wydajnie transdukować dzielące się i nie dzielące się komórki w tych tkankach i utrzymywać długotrwałą ekspresję cząsteczki przeciwciała. Dla przeglądu patrz Zufferey i wsp., (1998) J. Virol. 72: 9873-80 oraz Kafri i wsp., (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3:316-326. Lentiwirusowe pakujące linie komórkowe są dostępne i ogólnie znane w tej dziedzinie. Ułatwiają one wytwarzanie wektorów lentiwirusowych o wysokim mianie do terapii genowej. Przykładem jest indukowana tetracykliną linia pakująca lentiwirusa pseudotypu VSV-G, która może wytwarzać cząstki wirusowe o mianach wyższych niż 106 lU/ml przez co najmniej 3 do 4 dni; patrz Kafri i wsp., (1999) (J. Virol. 73: 576-584). Wektor wytwarzany przez indukowalną linię komórkową można zatężyć, jeśli potrzeba, dla wydajnej transdukcji nie dzielących się komórek in vitro i in vivo.
Wirus Sindbis to przedstawiciel alfawirusów i był on intensywnie badany od czasu jego odkrycia w różnych częściach świata począwszy od 1953 r. Transdukcja genów w oparciu o alfawirusa, a w szczególności wirusa Sindbis, została dobrze przebadana in vitro (patrz Straus i wsp., (1994) Microbiol. Rev., 58: 491-562; Bredenbeek i wsp., (1993) J. Virol., 67; 6439-6446 lijima i wsp., (1999) Int. J. Cancer 80: 110-118 oraz Sawai i wsp., (1998) Biochim. Biophyr. Res. Comm. 248:315-323). Wiele właściwości wektorów alfawirusowych czyni z nich pożądaną alternatywę wobec innych opracowanych systemów wektorowych pochodzących od wirusów, włączając w to szybkie wytwarzanie konstruktów ekspresyjnych, wytwarzanie zawiesin cząstek infekcyjnych o wysokich mianach, infekcję nie dzielących się komórek i wysokie poziomy ekspresji (Strauss i wsp., (1994) Microbiol. Rev. 58: 491-562). Zastosowanie wirusa Sindbis do terapii genowej zostało opisane. (Wahlfors i wsp., (2000) Gene. Ther. 7: 472-480 oraz Lundstrom (1999) J. Recep. Sig. Transduct. Res. 19 (1-4): 673-686).
W innym wykonaniu wektor moż na wprowadzić do komórek przez lipofekcję lub przy zastosowaniu innych czynników ułatwiających transfekcję (peptydów, polimerów, itd.). Można zastosować
PL 210 412 B1 syntetyczne kationowe lipidy do wytworzenia liposomów do transfekcji in vivo i in vitro genu kodującego marker (Feigner i wsp., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 oraz Wang i wsp., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851-7855). Przydatne związki i kompozycje lipidowe do przenoszenia kwasów nukleinowych są opisane w publikacjach PCT nr WO 95/18863 i WO96/17823 oraz patencie USA nr 5459127.
Możliwe jest również wprowadzanie wektora in vivo jako nagiego DNA plazmidu. Nagi DNA wektorowy do terapii genowej można wprowadzać do pożądanych komórek gospodarza przy zastosowaniu metod znanych w tej dziedzinie, np. elektroporacji, mikrowstrzyknięcia, fuzji komórek, DEAE dekstranu, precypitacji fosforanem wapniowym, zastosowanie działa albo użycie transportera DNA wektorowego (patrz, np. Wilson i wsp., (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967; Williams i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726-2730). Można również zastosować podejście dostarczania DNA za pośrednictwem receptora (Wu i wsp., (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621-14624). Patenty USA nr 5580859 oraz 5589466 ujawniają dostarczenie ssakowi egzogennych sekwencji DNA, wolnych od czynników ułatwiających transfekcję. Ostatnio, opisano wysoce wydajną technikę transferu DNA in vivo przy zastosowaniu stosunkowo niskiego napięcia zwaną elektrotransferem (Vilquin i wsp., (2001) Gene Ther. 8:1097; Payen i wsp., (2001) Exp. Hematol. 29: 295-300; Mir (2001) Bioelectrochemistry 53: 1-10; Publikacje PCT nr WO 99/01157, WO 99/01158 i WO 99/01175).
Kompozycje farmaceutyczne
Przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen według wynalazku może być włączony do kompozycji farmaceutycznej, razem z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, odpowiednim do dostarczania osobnikowi in vivo. Jakkolwiek zakres wynalazku obejmuje kompozycje farmaceutyczne, które można podawać osobnikowi dowolną drogą (np. doustną, dooczną, miejscową albo dopłucną (inhalacja)), korzystne jest podawanie drogą pozajelitową, taką jak wstrzyknięcie do guza nowotworowego, zastrzyk dożylny, zastrzyk podskórny lub zastrzyk domięśniowy. W korzystnym wykonaniu, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają 1H3, 15H12, 19D12, LCA 15H12/19D12, LCB 15H12/19D12, LCC 15H12/19D12, LCD 15H12/19D12, LCE 15H12/19D12, LCF 15H12/19D12, HCA 15H12/19D12 lub HCB 15H12/19D12 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Ogólne informacje dotyczące kompozycji, patrz, np. Gilman i wsp., (wyd.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, Wyd. 8., Pergamon Press; A. Gennaro (wyd.), Remington's Pharmaceutical Sciences, Wydanie 18, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania.; Avis i wsp., (wyd.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman i wsp., (wyd.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York oraz Lieberman i wsp., (wyd.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (wyd.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), tom 119, Marcel Dekker.
Dopuszczalne farmaceutycznie nośniki są konwencjonalne i dobrze znane w tej dziedzinie. Przykłady obejmują wodne i niewodne nośniki, stabilizatory, przeciwutleniacze, podłoża rozpraszające, powłoki, czynniki przeciwbakteryjne, bufory, białka surowicze, izotoniczne i abspoprpcyjne czynniki opóźniające i temu podobne, które pasują fizjogicznie. Korzystne jest, jeżeli nośnik jest odpowiedni do wstrzyknięcia do ciała osobnika.
Przykłady odpowiednich nośników wodnych i niewodnych, które można zastosować w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy i temu podobne), oraz odpowiednie ich mieszaniny oleje roślinne, takie jak olej z oliwek i wstrzykiwane estry organiczne, takie jak oleinian etylu. Odpowiednia płynność może być utrzymana przy zastosowaniu na przykład materiałów powlekających, takich jak lecytyna, poprzez utrzymanie wymaganego rozmiaru cząstek w przypadku zawiesin i poprzez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych.
Stabilizatory, takie jak dihydrat α, α-trehalozy mogą być włączone w celu stabilizacji cząsteczek przeciwciała według wynalazku przeciwdziałającym efektom rozkładania się przy wysuszaniu lub zamrożeniu i suszeniu.
Przykłady dopuszczalnych farmaceutycznie przeciw-utleniaczy obejmują: rozpuszczalne w wodzie przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, bisiarczan sodowy, metabisiarczyn sodowy, siarczyn sodowy i tym podobne oraz przeciwutleniacze rozpuszczalne w oleju, takie jak palmitynian ascorbylu, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany hydroksytoluen (BHT), lecityna, galan propylu, alfa-tokoferol i tym podobne oraz czynniki chelatujące metale, takie jak kwas
PL 210 412 B1 cytrynowy, kwas etylenodiamino tetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas fosforowy i temu podobne.
Zapobieganie obecności mikroorganizmów można zapewnić zarówno przez procedury jałowienia, jak i włączenie różnych czynników przeciwbakteryjnych, takich EDTA, EGTA, paraben, chlorobutanol, kwas fenolosorbowy i temu podobne.
Odpowiednie bufory, które mogą być włączone do kompozycji farmaceutycznych według wynalazku obejmują bufory w oparciu o L-histydynę, bufory w oparciu o fosforany (np. sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH = 7), bufory w oparciu o sorbinian lub bufory w oparciu o glicynę.
Białka surowicze, które mogą być włączone do kompozycji farmaceutycznych według wynalazku mogą obejmować ludzką surowiczą albuminę.
Roztwory izotoniczne, takie jak cukry, etanol, polialkohole (np. glicerol, glikol propylenowy, płynny glikol polietylenowy, mannitol lub sorbitol), cytrynian sodowy albo chlorek sodowy (np. buforowana sól fizjologiczna) mogą być również włączone do kompozycji farmaceutycznych według wynalazku.
Przedłużoną absorbcję wstrzykiwanych postaci farmaceutycznych można uzyskać przez włączenie czynników, które opóźniają absorpcję, takich jak monostrearynian glinu i/lub żelatynę.
Zawiesiny można również przygotować w glicerolu, płynnych glikolach polietylenowych i ich mieszaninach oraz w olejach.
Dopuszczalne farmaceutycznie nośniki obejmują jałowe roztwory wodne albo zawiesiny i jałowe proszki do przygotowywanych bezpośrednio przed użyciem preparatów jałowych roztworów lub zawiesin do wstrzykiwania. Zastosowanie takich podłoży i czynników do aktywnych farmaceutycznie substancji jest dobrze znany w tej dziedzinie.
Jałowe roztwory do wstrzykiwania można wytworzyć poprzez włączenie przeciwciała albo jego fragmentu wiążącego antygen według wynalazku w wymaganej ilości w odpowiednim rozcieńczalniku, ewentualnie z jednym albo kombinacją wymienionych powyżej składników, zgodnie z wymaganiami, a następnie jałowienie poprzez mikrofiltrację. W ogólności, zawiesiny wytwarza się przez włączenie cząsteczki przeciwciała do jałowego nośnika, który zawiera podstawowe podłoże rozpraszające i inne wymagane składniki spośród tych wymienionych powyżej. W przypadku jałowych proszków do wytwarzania jałowych roztworów, które można wstrzykiwać, korzystnymi sposobami wytwarzania są suszenie pod próżnią i suszenie po zamrożeniu (liofilizacja), które prowadzą do uzyskania proszku składnika aktywnego plus dodatkowy, pożądany składnik z uprzednio przefiltrowanego jego roztworu.
Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku można również podawać doustnie. Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego mogą zawierać, poza kompozycją wiążącą, dodatki, takie jak skrobię (np. skrobię ziemniaczaną lub kukurydzianą albo celulozę), dodatki skrobiowe (np. celulozę mikrokrystaliczną albo krzemionkę), cukry (np. laktozę), talk, stearynian, węglan magnezowy lub fosforan wapniowy. W celu zapewnienia dobrej tolerancji kompozycji doustnej zawierającej przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku przez układ trawienny pacjenta, można włączyć czynniki lub podłoża wytwarzające śluz. Może być również pożądane polepszenie tolerancji przez zamknięcie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen w kapsułce, która jest nierozpuszczalna w sokach żołądkowych. Przykładowe kompozycje farmaceutyczne według tego wynalazku w postaci kapsułek wytwarza się z laktozy, talku i stearynianu magnezowego. Podawanie doustne immunoglobulin zostało opisane (Foster i wsp., (2001) Cochrane Database System rev, 3:CD001816).
Przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen według wynalazku może również być zawarty w kompozycji farmaceutycznej do podawania miejscowego. Kompozycje przydatne do podawania miejscowego obejmują preparaty płynne i półpłynne przydatne penetracji przez skórę do miejsca, gdzie leczenie jest wymagane, takie jak płyny do wcierania, płyny do przemywania, kremy, maści lub pasty, krople odpowiednie do dodawania do oka, ucha lub nosa.
Krople według niniejszego wynalazku mogą zawierać jałowe wodne albo olejowe roztwory lub zawiesiny i mogą być wytwarzane poprzez rozpuszczenie przeciwciała albo fragmentu wiążącego przeciwciało w odpowiednim roztworze wodnym środka bakteriobójczego i/lub grzybobójczego i/lub dowolnego innego środka konserwującego, korzystnie włączając w to czynnik powierzchniowo-czynny. Otrzymany w rezultacie roztwór może być następnie klarowany poprzez filtrację.
Płyny według wynalazku obejmują te odpowiednie do podawania na skórę albo do oka. Płyny oczne mogą zawierać jałowy, wodny roztwór, ewentualnie zawierając środek bakteriobójczy i mogą być wytwarzane sposobami podobnymi to tych dla wytwarzania kropel. Płyny i płyny do wcierania do stosowania na skórę mogą również zawierać środek przyśpieszający wysychanie i chłodzący skórę,
PL 210 412 B1 taki jak alkohol albo aceton i/lub środek nawilżający, taki jak glicerol lub olej, taki jak olej rycynowy lub olej arachidowy.
Kremy, maści i pasty według niniejszego wynalazku to półpłynna kompozycja składników aktywnych do stosowania zewnętrznego. Mogą być one wytwarzane poprzez mieszanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen według niniejszego wynalazku w postaci rozdrobnionej albo proszku, same albo w roztworze lub zawiesinie w wodnym albo niewodnym płynie, przy pomocy odpowiednich urządzeń, z tłustą albo nietłusta podstawą. Podstawa może zawierać węglowodory, takie jak twarda, miękka albo płynna parafina, glicerol, wosk pszczeli, mydło metaliczne; roztwór kleisty, olej pochodzenia naturalnego, taki jak olej migdałowy, kukurydziany, arachidowy, rycynowy lub z oliwek; lanolinę i jej pochodne lub kwasy tłuszczowe, takie jak kwas stearynowy lub olejowy łącznie z alkoholem, takim jak glikol propylenowy i makrożele. Kompozycja może zawierać dowolny odpowiedni środek powierzchniowo-czynny, taki jak anionowy, kationowy lub niejonowy środek powierzchniowo-czynny, taki jak estry sorbitanowe albo ich pochodne polioksyetylenowe. Czynniki zawieszające, takie jak naturalne gumy, pochodne celulozy i materiały nieorganiczne, takie jak krzemionki i inne składniki, takie jak lanolina mogą być również włączone.
Przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen według wynalazku mogą również być podawane poprzez inhalację. Odpowiednie kompozycje farmaceutyczne do inhalacji mogą być w aerozolu. Przykładowe kompozycje farmaceutyczne do inhalacji przeciwciała albo jego fragmentu wiążącego antygen według wynalazku mogą obejmować: pojemnik aerozolowy o pojemności 15-20 ml zawierający przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen według wynalazku, czynnik smarujący, taki jak polisorban 85 lub kwas olejowy, rozproszony w propelencie, takim jak freon, korzystnie w połączeniu z 1,2-dichlorotetrafluoroetanem i difluorochlorometanem. Korzystne jest, jeżeli kompozycja jest w odpowiednim pojemniku aerozolowym przystosowanym do inhalacji donosowej albo doustnej.
W jeszcze innym wykonaniu według niniejszego wynalazku kompozycja może być podawana przez terapię skojarzoną. Przykładowo, terapia skojarzona może obejmować kompozycję według niniejszego wynalazku w połączeniu z jednym albo większą liczbą terapeutycznych czynników przećiwnowotworowych (np. czynników alkilujących, antymetabolitów, antybiotyków przeciwnowotworowych, inhibitorów mitotycznych, inhibitorów funkcji chromatyny, czynników przeciw angiogenezie, antyestrogenów, antyandrogenów, terapii przeciwciałowej lub immunomodulatorów). „Przeciwnowotworowy czynnik terapeutyczny to substancja, która, kiedy jest podawana pacjentowi, leczy albo przeciwdziała rozwojowi nowotworu w ciele pacjenta. Kompozycje według wynalazku można podawać w połączeniu z jedną albo większą liczbą terapeutycznych procedur przeciwnowotworowych (np. radioterapii albo chirurgicznym wycięciem guza nowotworowego). „Terapeutyczna procedura przeciwnowotworowa to proces, zastosowany wobec danego osobnika, który leczy albo zmniejsza występowanie raka u tego osobnika. Kiedy stosuje się terapię łączoną, przeciwciała albo ich fragmenty wiążące antygen według wynalazku albo ich kompozycje farmaceutyczne można wytwarzać jako pojedyncze kompozycje do jednoczesnego dostarczania albo wytwarzać osobno w dwóch albo większej liczbie kompozycji (np. jako zestaw). Ponadto przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen może być podawany osobnikowi w innym czasie niż jest podawany inny czynnik terapeutyczny lub procedura terapeutyczna; przykładowo, każde podawanie można przeprowadzić niejednocześnie w kilku odstępach czasowych na przestrzeni określonego czasu.
„Czynnik alkilujący dotyczy dowolnej substancji, która może wiązać się krzyżowo albo alkilować dowolną cząsteczkę, korzystnie kwas nukleinowy (np. DNA), w komórce. Przykłady czynników alkilujących obejmują mechloretaminę, cyklofosfamid, ifosfamid, iperyt fenyloalaninowy, melfalen, chlorambukol, iperyt uracylowy, estramustynę, tiotepę, busulfan, lomustynę, karmustynę, streptozocynę, dakarbazynę, cis-platynę, karboplatynę i altretaminę.
„Antymetabolit dotyczy substancji, które blokują wzrost i/lub metabolizm komórek przez przeszkadzanie w pewnych aktywnościach, zwykle syntezie DNA. Przykłady „antymetabolitów obejmują metotreksan, 5-fluoruracyl, floksyurydynę, 5-fluorodeoksyurydynę, kapecytabinę, fludarabinę, arabinoszyd cytozyny, 6-merkaptopurynę, 6-tioguaninę, gemcytabinę, cladrybinę, deoxycoformycnę i pentostatynę.
„Antybiotyki przeciwnowotworowe dotyczą związków, które mogą przeciwdziałać albo hamować syntezę DNA, RNA i/lub białka. Przykłady antybiotyków przeciwnowotworowych obejmują doksorubicynę, daunorubicyunę, idarubicynę, walrubicynę, mitoksantron, daktynomycynę, mitramycynę, plikamycynę, mitomycynę C, bleomycynę i prokarbazynę.
PL 210 412 B1 „Inhibitory mitotyczne przeciwdziałają normalnemu przebiegowi cyklu komórkowego i mitozy. Generalnie, inhibitory mikrotubuli, takie jak paklitaksel i docetaksel są zdolne do hamowania mitozy. Alkaloidy Vinca takie jak winblasyna, winkrystyna i winorelbina są również zdolne hamowania mitozy.
„Inhibitory funkcji chromatyny dotyczą substancji, które hamują normalne funkcje białek modelujących chromatynę, takich jak topoizomeraza I lub topoizomeraza II. Przykłady inhibitorów funkcji chromatyny obejmują topotekan, irinotekan, etopozyd i tenipozyd.
„Czynniki przeciw angiogenezie dotyczą dowolnego leku, związku, substancji albo czynnika, który hamuje wzrost naczyń krwionośnych. Przykładowe czynniki przeciw angiogenezie obejmują między innymi razoksynę, marimastat, COL-3, neowastat, BMS-275291, talidomid, skwalaminę, endostatynę, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974, interleukinę-12, IM862, angiostatynę i witaksynę.
„Antyestrogen lub „czynnik antyestrogenowy dotyczą dowolnej substancji, która zmniejsza, antagonizuje albo hamuje działanie estrogenu. Przykładami czynników antyestrogenowych są tamoksifen, toremifen, raloksifen, droloksifen, iodoksifen, anastrozol, letrozol i ekemestan.
„Antyandrogen lub „czynnik antyandrogenowy dotyczą dowolnej substancji, która zmniejsza, antagonizuje albo hamuje działanie androgenu. Przykładami czynników antyandrogenowych są flutaraid, nilutamid, bikalutamid, sprironolakton, octan cyproteronu, finasteryd i cimitydyna.
Terapie przeciwnowotworowe, które można podawać w połączeniu z przeciwciałem albo jego fragmentem wiążącym antygen według wynalazku obejmują trastuzumab (np. herceptin) (patrz, na przykład, Sliwkowski i wsp., (1999) Semin. Oncol. 26 (4 Suppl 12): 60-70), witaksyn i rituksimab.
„Immunomodulatory to substancje, które stymulują układ immunologiczny. Przykłady immunomodulatorów obejmują diftitoks denileukiny, lewamisol w połączeniu z 5-fluorouracylem, interferon i interleukinę-2.
„Radioterapia lub „terapia radiacyjna dotyczy leczenia choroby, takiej jak rak, poprzez podawanie promieniowania jonizującego (przeważnie w miejscu guza nowotworowego). Przykłady promieniowania jonizującego, które można podawać obejmują promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie gamma (np. emitowane przez rad, uran lub kobalt 60) i napromieniowanie strumieniem cząstek (np. protonami, neutronami, pionami lub jonami ciężkimi).
Dawkowanie
Korzystne jest, jeżeli przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen według wynalazku jest podawany osobnikowi w „skutecznej leczniczo dawce, która korzystnie hamuje chorobę albo stan, w którym pośredniczy IGFR1 (np. wzrost guza nowotworowego) w dowolnym stopniu, korzystnie o co najmniej około 20%, korzystniej o co najmniej około 40%, jeszcze korzystniej o co najmniej około 60%, a jeszcze korzystniej o co najmniej około 80%-100% w stosunku do osobników nie traktowanych. Zdolność przeciwciała albo jego fragmentu wiążącego antygen według wynalazku do hamowania raka można ocenić w zwierzęcym systemie modelowym do przewidywania skuteczności wobec ludzkich nowotworów. Alternatywnie, tę właściwość kompozycji można ocenić poprzez badanie zdolności przeciwciała albo jego fragmentu wiążącego antygen według wynalazku do hamowania wzrostu komórek nowotworowych w testach in vitro (patrz poniżej) dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Specjalista w tej dziedzinie będzie umiał określić te ilości w oparciu o takie czynniki, jak rozmiary osobnika, ostrość objawów osobnika i wybór konkretnej kompozycji lub drogi podawania.
Tryb dawkowanie może być dobrany dla uzyskania optimum pożądanej odpowiedzi (np. odpowiedzi terapeutycznej). Przykładowo, można podawać pojedynczy duży zastrzyk, można podawać kilka podzielonych dawek na przestrzeni czasowej albo dawka może być proporcjonalnie zmniejszana albo zwiększana zgodnie z potrzebami danej sytuacji leczniczej. Szczególnie korzystne jest wytwarzanie kompozycji pozajelitowych w postaci jednodawkowej do podawania i jednorodnego dawkowania.
Lekarz albo weterynarz będący specjalistą w tej dziedzinie możne łatwo określić i przepisać skuteczną ilość wymaganej kompozycji farmaceutycznej. Przykładowo, lekarz albo weterynarz może rozpocząć podawanie dawek przeciwciała albo jego fragmentu wiążącego antygen według wynalazku zastosowanego w kompozycji farmaceutycznej na poziomie mniejszym niż wymagany w celu uzyskania pożądanych efektów terapeutycznych i stopniowo zwiększać dawkę aż do uzyskania pożądanego efektu. Generalnie, odpowiednia dzienna dawka przeciwciała albo jego fragmentu wiążącego antygen według wynalazku może być ilością związku, która jest w najniższej dawce skuteczna przy wytwarzaniu efektu terapeutycznego. Taka skuteczna dawka będzie generalnie zależała od czynników opisanych powyżej. Korzystne jest, jeżeli podawanie jest poprzez zastrzyk, korzystnie w pobliżu miejsca docelowego (np. guza nowotworowego). Jeśli to pożądane, skuteczna dzienna dawka kompozycji
PL 210 412 B1 farmaceutycznej może być podawana w dwóch, trzech, czterech, pięciu, sześciu albo większej liczbie subdawek podawanych oddzielnie w odpowiednich odstępach czasu w ciągu dnia.
Metody terapeutyczne i podawanie
Przeciwciała albo jego fragmenty wiążące antygen według wynalazku i kompozycje farmaceutyczne zawierające przeciwciała albo jego fragmenty wiążące antygen według wynalazku można zastosować do leczenia albo zapobiegania dowolnej chorobie albo stanowi u pacjenta, w którym pośredniczy zwiększona ekspresja albo aktywność IGFR1 albo zwiększona ekspresja jego ligandów (np. IGF-I lub IGF-II) i które można leczyć albo zapobiegać poprzez modulację wiązania liganda, aktywności (np. aktywności autofosforylacji) lub ekspresji IGFR1. Korzystne jest, jeżeli chorobą albo stanem jest choroba nowotworowa, korzystniej choroba nowotworowa charakteryzująca się guzem nowotworowym, w którym następuje ekspresja IGFR1, takim jak między innymi rak pęcherza, rak Wilmsa, rak kości, rak prostaty, rak płuc, rak okrężnicy i odbytnicy, raka sutka, rak szyjki macicy, maziówczak, rak jajnika, rak trzustki, łagodny rozrost prostaty (BPH), biegunka związana z przerzutem nowotworowym i nowotwory wydzielające naczynioaktywny peptyd jelitowy (np. VIPoma lub zespół Werner-Morrison). Akromegalię można również leczyć cząsteczkami przeciwciał według wynalazku. Antagonizm IGF-I opisano dla leczenia akromegalii (Drake, i wsp., (2001) Trends Endocrin. Metab. 12: 408-413). Inne nie nowotworowe stany chorobowe, które mogą być również leczone u osobnika poprzez podawanie przeciwciała anty-IGFR1 według wynalazku obejmują gigantyzm, łuszczycę, miażdżycę tętnic, nawrót zawężenia mięśni gładkich naczyń krwionośnych lub nieprawidłową proliferację mikronaczyń, taką jak występująca jako komplikacja cukrzycy, szczególnie w oku.
Termin „osobnik może dotyczyć dowolnego organizmu, korzystnie zwierzęcia, korzystniej ssaka (np. szczura, myszy, psa, kota, królika), a najkorzystniej z człowieka.
W korzystnych wykonaniach przeciwciała i ich fragmenty wiążące antygen według wynalazku oraz ich kompozycje farmaceutyczne według wynalazku podaje się drogą inwazyjną, taką jak poprzez wstrzyknięcie (patrz powyżej). Podawanie drogą nieinwazyjną (patrz powyżej) jest również w zakresie niniejszego wynalazku.
Kompozycje można podawać przy użyciu urządzeń medycznych znanych w tej dziedzinie. Przykładowo, w korzystnym wykonaniu, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można podawać poprzez wstrzyknięcie igłą podskórną.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można również podawać przy użyciu bezigłowego urządzenia do wstrzykiwania podskórnego, takiego jak urządzenia ujawnione w patentach USA nr 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 lub 4596556.
Przykłady dotrze znanych implantów i modułów przydatnych w niniejszym wynalazku obejmują: patent USA nr 4487603, który ujawnia wszczepialną pompkę do mikrowlewu do dostarczania leku w kontrolowanym tempie; patent USA nr 4447233, który ujawnia wszczepialną pompkę do wlewu leku do dostarczania leku przy precyzyjnej szybkości wlewu; patent USA nr 4447224, który ujawnia wszczepialne urządzenie do stałego dostarczania leku; patent USA nr 4439196, który ujawnia ospotyczny system do dostarczania leku mający wielokomorowe przedziały. Wiele innych takich implantów, systemów dostarczania i modułów jest dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie.
Testy
Przeciwciała anty-IGFR1 można również zastosować do wykrywania IGFR1 w próbce biologicznej in vitro lub in vivo (patrz, na przykład, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)). Przeciwciała anty-IGFR1 można również zastosować w konwencjonalnym teście immunologicznym, włączając w to, między innymi ELISA, RIA, FACS, immunohistochemię tkankową, technikę Western lub immunoprecypitację. Przeciwciała anty-IGFR1 według wynalazku można użyć do wykrywania IGFR1 od ludzi. Wynalazek dostarcza sposobu wykrywania IGFR1 w próbce biologicznej obejmującego doprowadzenie do kontaktu próbki biologicznej z przeciwciałem anty-IGFR1 według wynalazku i wykrywanie przeciwciała anty-IGFR1 związanego z IGFR1, co wskazuje na obecność IGFR1 w próbce biologicznej. W jednym z wykonań, przeciwciało anty-IGFR1 jest bezpośrednio wyznakowane wykrywalnym znacznikiem i może być wykrywane bezpośrednio. W innym wykonaniu, przeciwciało anty-IGFR1 (pierwsze przeciwciało) jest niewyznakowane i drugorzędowe przeciwciało lub inna cząsteczka, która może wiązać się z przeciwciałem anty-IGFR1 jest wyznakowana. Co dobrze wiadomo specjaliście w tej dziedzinie drugorzędowe przeciwciało jest dobrane tak, aby było zdolne do swoistego wiązania się z konkretnym gatunkiem i klasą pierwszego przeciwciała. Przykładowo, jeżeli przeciwciałem anty-IGFR1 jest ludzka IgG, wtedy przeciwciałem drugorzędowym może być przeciwciało anty-ludzka IgG. Obecność kompleksu anty-IGFR1/lGFR1
PL 210 412 B1 w próbce biologicznej można wykrywać poprzez wykrywanie obecności wyznakowanego przeciwciała drugorzędowego. Inne cząsteczki, które mogą wiązać się z przeciwciałami (np. przeciwciała antyIGFR1/IGFR1) obejmują miedzy innymi Białko A i Białko G, obydwa dostępne handlowo, np. z Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Odpowiednie znaczniki dla przeciwciała anty-IGFR1 lub przeciwciała drugorzędowego zostały ujawnione, jak wyżej, i obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescyjne, czynniki magnetyczne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę z chrzanu, alkaliczną fosfatazę, β-galaktozydazę lub acetylcholinesterazę;
przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbelliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazinylaminę fluoresceiny, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykład materiału luminescyjnego obejmuje luminal; przykład czynnika magnetycznego obejmuje gadolinium; a przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują 25I, 131I, 35S lub 3H.
W alternatywnym wykonaniu, IGFR1 może być testowany w próbce biologicznej przez test immunologiczny ze współzawodnictwem z zastosowaniem standardów IGFR1 wyznakowanych wykrywalną substancją i niewyznakowanego przeciwciała anty-IGFR1. W tym teście próbka biologiczna, wyznakowane standardy IGFR1 i przeciwciało anty-IGFR1 łączy się i określa się ilość wyznakowanego standardu IGFR1 związanego z niewyznakowanym przeciwciałem. Ilość IGFR1 w próbce biologicznej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wyznakowanego standardu IGFR1 związanego z przeciwciałem anty-IGFR1. Testy immunologiczne ujawnione powyżej można zastosować dla licznych celów. W jednym z wykonań, przeciwciała anty-IGFR1 można zastosować do wykrywania IGFR1 w komórkach w hodowli komórkowej. W korzystnym wykonaniu, przeciwciała anty-IGFR1 można zastosować do określenia poziomu fosforylacji tyrozyn, autofosforylacji tyrozyn IGFR1 i/lub ilości IGFR1 na powierzchni komórki po traktowaniu komórek różnymi związkami. Metodę tą można zastosować do testowania związków, które można zastosować do aktywacji albo hamowania IGFR1. W tej metodzie jedną próbkę komórek traktuje się testowanym związkiem przez pewien okres czasu, podczas gdy drugą próbkę pozostawia się nietraktowaną. Jeżeli ma być mierzona autofosforylacja tyrozyn, komórki lizuje się i fosforylację tyrozyn mierzy się przy zastosowaniu testu immunologicznego, na przykład jak pokazano powyżej.
Korzystnym testem immunologicznym do określania fosforylacji tyrozyn IGFR1 lub pomiaru całkowitego poziomu IGFR1 jest test ELISA albo analiza Western. Jeżeli mają być mierzone tylko poziomy IGFR1 na powierzchni komórki, komórek nie poddaje się lizie i poziomy IGFR1 na powierzchni komórek mierzy się przy zastosowaniu jednego z opisanych powyżej testów immunologicznych. Korzystny test immunologiczny do określania poziomów IGFR1 na powierzchni komórki obejmuje etapy znakowania białek na powierzchni komórki wykrywanym znacznikiem, takim jak biotyna lub 125I, immunoprecypitcja IGFR1 przeciwciałem anty-IGFR1, a następnie wykrywanie wyznakowanego IGFR1. Inny korzystny test immunologiczny do ustalania lokalizacji IGFR1, np. poziomy na powierzchni komórki, to stosowanie immunohistochemii. Sposoby takie jak ELISA, RIA, analiza Western, immunohistochemia, znakowanie integralnych białek błonowych na powierzchni komórki i immunoprecypitacja są dobrze znane w tej dziedzinie. Dodatkowo, można zwiększać skalę testów immunologicznych do przeszukiwania na dużą skalę w celu testowania dużej liczby związków pod kątem bądź aktywacji, bądź hamowania IGFR1.
Przeciwciała anty-IGFR1 według wynalazku można również zastosować do określenia poziomów IGFR1 w tkance albo komórkach pochodzących z tej tkanki. W korzystnym wykonaniu, tkanką jest tkanka chorobowa. W korzystniejszym wykonaniu, tkanką jest nowotwór albo jego biopsja. W korzystnym wykonaniu sposobu, tkanka albo jej biopsja jest wycięta z pacjenta. Tkankę albo biopsję używa się następnie w teście immunologicznym w celu określenia np. poziomów IGFR1, poziomów IGFR1 na powierzchni komórki, poziomów fosforylacji tyrozyn IGFR1 lub lokalizacji IGFR1 przy zastosowaniu metod dyskutowanych powyżej. Metody te można zastosować do określenia, czy nowotwór wyraża IGFR1 na wysokim poziomie.
Opisane powyżej metody diagnostyczne można użyć do określenia, czy nowotwór wyraża wysokie poziomy IGFR1, co może wskazywać, że nowotwór będzie dobrze odpowiadał na traktowanie przeciwciałem anty-IGFR1. Metodę diagnostyczną można również stosować dla ustalenia, czy guz jest potencjalnie złośliwy, jeżeli wykazuje wysokie poziomy ekspresji IGFR1, czy łagodny, jeżeli wykazuje niskie poziomy ekspresji IGFR1. Ponadto, metodę diagnostyczną można również zastosować w celu ustalenia, czy traktowanie przeciwciałem anty-IGFR1 powoduje, że guz wyraża IGFR1 na niżPL 210 412 B1 szym poziomie i/lub wykazuje niższe poziomy autofosforylacji tyrozyn, a zatem może być stosowane do ustalania czy leczenie odnosi skutek. Generalnie, sposób ustalania, czy przeciwciało anty-IGFR1 zmniejsza fosforylację tyrozyn obejmuje etapy pomiaru fosforylacji tyrozyn w komórce albo tkance będącej przedmiotem zainteresowania, inkubowanie komórki albo tkanki z przeciwciałem anty-IGFR1 albo jego fragmentem wiążącym antygen, a następnie ponowny pomiar poziomu fosforylacji tyrozyn w komórce albo tkance. Można mierzyć fosforylację tyrozyn IGFR1 lub innego białka(ek). Metody diagnostyczne można również zastosować do ustalenia, czy tkanka albo komórka nie jest taką, gdzie poziomy ekspresji IGFR1 nie są wystarczające lub poziomy aktywowanego IGFR1 nie są wystarczające wystarczająco wysokie, co może mieć miejsce w przypadku osobników z karłowatością, osteoporozą lub cukrzycą. Postawienie diagnozy, że poziomy IGFR1 lub aktywnego IGFR1 są zbyt niskie można wykorzystać do leczenia aktywującymi przeciwciałami anty-IGFR1, IGF-1, IGF-2 lub innymi czynnikami terapeutycznymi w celu zwiększenia poziomów lub aktywności IGFR1.
Przeciwciała anty-IGFR1 według wynalazku można również zastosować do zlokalizowania in vivo tkanek i narządów, które wyrażają IGFR1. W korzystnym wykonaniu, przeciwciała anty-IGFR1 można zastosować do lokalizacji guzów nowotworowych wyrażających IGFR1. Zaletą przeciwciał anty-IGFR1 według wynalazku jest to, że nie będą one dawały odpowiedzi immunologicznej po podaniu. Sposób obejmuje etapy podawania przeciwciała anty-IGFR1 albo jego kompozycji farmaceutycznej pacjentowi wymagającemu wykonania takiego testu diagnostycznego i poddanie pacjenta analizie obrazowania w celu ustalenia lokalizacji tkanej wyrażających IGFR1. Analiza obrazowania jest dobrze znana w dziedzinie medycyny i obejmuje, między innymi, analizę rentgenowską, rezonans magnetyczny (MRI, od ang. magnetic resonance imaging) lub tomografię komputerową (CT). W innym wykonaniu sposobu, od pacjenta pobiera się biopsję w celu ustalenia, czy tkanka będąca przedmiotem zainteresowania wyraża IGFR1 zamiast poddawania pacjenta analizie poprzez obrazowanie. W korzystnym wykonaniu, przeciwciała anty-IGFR1 można wyznakować wykrywalnym czynnikiem, który można zobaczyć u pacjenta. Przykładowo przeciwciało może być wyznakowane czynnikiem kontrastowym, takim jak bar, który można zastosować do analizy rentgenowskiej albo kontrastowy czynnik magnetyczny, taki jak chelat gadolinium, który można zastosować do MRI lub CE. Inne czynniki do znakowania obejmują między innymi radioizotopy, takie jak 99Tc. W innym wykonaniu przeciwciało anty-IGFR1 może być niewyznakowane i może być uwidocznione przez podawanie przeciwciała drugorzędowego lub innej cząsteczki, którą można wykryć i która może wiązać się z przeciwciałem anty-IGFR1.
Przykłady
Poniższe przykłady są podane, aby szerzej opisać niniejszy wynalazek i nie powinny być uważane za ograniczające w jakikolwiek sposób zakres wynalazku.
P r z y k ł a d 1: Otrzymywanie w pełni ludzkich przeciwciał anty-IGFR1.
1.0. Wprowadzenie.
W pełni ludzkie, monoklonalne przeciwciała swoiste wobec ludzkiego receptora insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGFR1) otrzymano w myszach HuMab o genotypie Hco7 (patrz niżej), immunizowanych komórkami HEK293 transfekowanymi zrekombinowanym sIGFR1 i IGFR1. Dokładny opis myszy Hco7 znajduje się w opisach patentowych USA nr 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016; 5770429; 5789650; 5814318; 5874299 i 5877397 oraz w Harding i wsp., (1995) Ann. NY Acad. Sci. 764: 536-546. Przeciwciała 1H3, 15H12 i 19D12 wyizolowano z myszy HuMab (oznaczone tutaj jako #23716), które poddano selekcji na fuzję na podstawie obecności w surowicy mian IgG swoistych wobec antygenu, którym immunizowano, wynoszących 25600. Stwierdzono, że przeciwciała 1H3, 15H12 i 19D121 wiążą się do IGFR1.
2.0. Materiały i metody oraz wyniki.
2.1. Antygen.
2.1.1. Myszy immunizowano antygenem w dwóch postaciach: (1) żywymi komórkami (komórkami HEK293 transfekowanymi IGFR1) i (2) oczyszczonym białkiem (sIGFR1; rekombinowanym białkiem, wyrażonym w systemie NSO, obejmującym podjednostkę α IGFR1). Biologicznie aktywna wersja tego białka to postać glikożyłowana.
2.1.2. Wykonano trzy immunizacje rozpuszczalnym antygenem IGFR1 oraz końcowe zastrzyki wzmacniające podane do żyły ogonowej, oczyszczonym preparatem IGF1 w stężeniu 2,67 mg/ml. Rozpuszczalny IGFR1 łączono zarówno z kompletnym, jak i niekompletnym adiuwantem Freunda (CFA i IFA) i wstrzyknięto myszy 0,2 cc (centymetrami sześciennymi) preparatu antygenu do jamy otrzewnej. Końcowe immunizacje przez żyłę ogonową zostały wykonane rozpuszczalnym IGFR1 w jałowym PBS (soli fizjologicznej buforowanej fosforanem).
PL 210 412 B1
2.1.3. Immunizacje wykonywano również komórkami HEK293 transfekowanymi DNA IGFR1. Konkretnie, każdą z myszy immunizowano podając zastrzyk do jamy otrzewnej z 0,2 cc jałowej soli fizjologicznej zawierającej 1,0-2,0 x 107 komórek HEK293 wyrażających IGFR1.
2.2. Myszy transgeniczne.
2.2.1 Myszy hodowano w klatkach z filtrami i oceniano, że są w dobrej kondycji fizycznej w momencie immunizacji, w czasie pobierania krwi oraz w dniu, gdy wykonywano fuzje.
2.2.2. Mysz wytwarzająca wyselekcjonowane hybrydoma była samcem (ID myszy #23716) o genotypie (CMD)++; (Hco7) 11952+; (JKD)++; (KCo5) 9272+. Poszczególne oznaczenia transgenów podano w nawiasach, po nich podano numery linii dla losowo włączonych transgenów. Symbole ++ oraz + oznaczają homozygoty lub hemizygoty, jednak, z uwagi na to, że myszy były rutynowo poddane selekcji na podstawie testu opartego na PCR, który nie pozwalał na rozróżnianie pomiędzy heterozygotycznością a hemizygotycznością w przypadku losowo włączonych ludzkich transgenów Ig, oznaczenie + może być przypisane myszom, które są faktycznie homozygotami dla tych składowych.
2.3. Procedura i harmonogram immunizacji.
2.3.1. Harmonogram immunizacji podano w poniższej tabeli.
Tabela 2. Harmonogram immunizacji myszy.
T a b e l a 2
Harmonogram immunizacji myszy.
Dzień Immunizacja: adiuwant, antygen Skrwawnienie i miano1
Dzień 1 1,0 x 107 żywych komórek HEK293 transfekowanych IGFR1, w soli fizjologicznej
Dzień 15 adiuwant CFA, sIGFR1 (20 μg)
Dzień 29 1,0 x 107 żywych komórek HEK293 transfekowanych IGFR1, w soli fizjologicznej
Dzień 37 Zmierzono miano przeciwciał
Dzień 43 adiuwant IFA, sIGFR1 (~40 μg)
Dzień 54 Zmierzono miano przeciwciał
Dzień 57 1,0 x 107 żywych komórek HEK293 transfekowanych IGFR1, w soli fizjologicznej
Dzień 96 1,0 x 107 żywych komórek HEK293 transfekowanych IGFR1, w soli fizjologicznej
Dzień 103 Zmierzono miano przeciwciał
Dzień 112 adiuwant CFA, sIGFR1 (25 μg)
Dzień 126 Zmierzono miano przeciwciał
Dzień 128 i 129 Końcowy zastrzyk wzmacniający z sIGFR1 podany dożylnie do żyły ogonowej
1 Informacje o mianach podano poniż ej.
2 Fuzje wykonano 131 dnia.
T a b e l a 3. Miana przeciwciał swoistych wobec IGFR1 podczas okresu immunizacji opisanego w Tabeli 1 (patrz wyżej) dla myszy 23716.
Dzień Miano
37 100
54 800
103 6400
126 25600
PL 210 412 B1
2.4. Przygotowanie i testy hybrydoma.
2.4.1. Do fuzji wykorzystano linię komórek szpiczaka SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581). Do hodowli dodano i namnażano zawartość oryginalnej probówki ATCC. Z tej hodowli przygotowano wyjściowy zapas zamrożonych probówek. Komórki hodowano przez 6-8 tygodni i pasażowano 2 razy w tygodniu.
2.4.2. Do hodowli komórek szpiczaka wykorzystano pożywkę DMEM o wysokim stężeniu glukozy (High Glucose DMEM) zawierającą 10% FBS, czynnik przeciw bakteryjny i przeciw grzybiczy (Antibiotic-antimycotic) (100X) oraz 0,1% L-glutaminę. Dodatkowe uzupełnienia podłoża dodano do pożywek dla hodowli komórek hybrydom: 5% - czynnika klonowania hybrydom (Origen-Hybridoma Cloning Factor) (Fischer Scientific; Suwanee, GA), 4,5 x 10-4 M pirogronian sodu, HAT 1,0 x 10-4 M, hypoksantynę 4,0 x 10-7 M, aminopterynę 1,6 x 10-5 M, tymidynę lub HT 1,0 x 10-4 M, hypoksantynę 1,6 x 10-5 M, tymidynę oraz scharakteryzowaną wołową surowicę płodową.
2.4.3. Śledziona z myszy o numerze #23716 miała normalne rozmiary i pozwoliła uzyskać 5,73 x 108 żywotnych komórek.
2.4.4. Splenocyty poddano fuzji według następującej procedury:
1. Umieścić około 10 ml DMEM + 10% FBS w 50 ml probówce.
2. Uśmiercić mysz poddaną dożylnemu wzmocnieniu immunizacji.
3. Przenieść mysz pod wyciąg na ręcznik papierowy.
4. Polać mysz alkoholem i ułożyć na jej prawym boku - lewym do góry.
5. Zrobić małe nacięcie nad obszarem śledziony.
6. Odciągnąć skórę obydwoma rękoma.
7. Ponownie polać alkoholem.
8. Aby otworzyć otrzewną użyć jałowych narzędzi.
9. Włożyć końcówki nożyczek pod śledzionę i otworzyć nożyczki tak, aby powstała przestrzeń pozwalająca chwycić śledzionę kleszczami.
10. Usunąć śledzionę i umieścić w probówce zawierającej DMEM + 10% FBS. Przenieść do jałowego pokoju do hodowli komórkowych.
11. Pod jałowym wyciągiem, dodać około 7 ml DMEM bez surowicy do każdej z 2 jałowych 60 mm szalek hodowlanych.
12. Przenieść śledzionę na pierwszą szalkę.
13. Usunąć wszelkie adhezje ze śledziony przy pomocy jałowych narzędzi.
14. Umieścić jałowy homogenizator w statywie dla probówek (jako podstawie).
15. Oczyszczoną śledzionę umieścić w homogenizatorze.
16. Dodać około 5 ml DMEM i homogenizować przez 4 przepuszczenia. Zlać supernatant do jałowej probówki 50 ml.
17. Dodać następne 5-6 ml DMEM i wykonać dodatkowe 3-4 przepuszczenia.
18. Zlać supernatant do tej samej probówki, co powyżej.
19. Wirować komórki przy 1000 rpm przez 10 minut w wirówce.
20. Usunąć supernatant. Zlać zawieszone komórki w DMEM.
21. Określić ilość komórek śledzony.
22. Przenieść odpowiednią ilość komórek SP2/0 (6 komórek śledziony na 1 komórkę SP2/0) do 50 ml probówki wirowniczej. Zanotować objętość.
23. Ustawić objętość komórek śledziony DMEM dla odpowiedniego zrównoważenia do wirowania.
24. Wirować komórki przez 10 minut przy 1000 rpm w wirówce.
25. Usunąć supernatant - zlać i zawiesić osady w 30-40 ml pożywki DMEM do płukania (bez surowicy). Połączyć wszystkie komórki w j ednej probówce.
26. Wirować ponownie jak wyżej.
27. Zlać supernatant i zawiesić ponownie osady.
28. Dodawać około 1,2 ml PEG (glikolu polietylenu) przez około 1 minutę delikatnie mieszając probówką umieszczoną w łaźni wodnej w 37°C.
29. Inkubować probówkę przez 90 sekund, następnie dodać 15 ml DMEM i płukać pożywką przez 3 minuty.
30. Wirować probówki jak wyżej.
31. Zlać supernatant i zawiesić delikatnie osady.
32. Dodać około 10 ml pożywki HAT do probówki.
PL 210 412 B1
33. Pipetować komórki w pełnej objętości pożywki HAT. Pozwolić komórkom pozostać w inkubatorze przed wysianiem na szalki.
34. Wysiać komórki na 96-studzienkowe szalki hodowlane, 200 μl/studzienkę (około 1 x 107 komórek na 96-studzienkową szalkę).
35. Podać komórkom pożywkę HT w 7 dniu, 250 μl/studzienkę (pożywka HT to taka sama pożywka jak HAT, ale bez aminopteryny).
2.4.5. Wstępne przeszukiwanie testem ELISA dla ludzkich przeciwciał IgGK zostało wykonane
7-10 dnia po fuzji według poniższej procedury:
1. Powlekać płytkę przez noc anty-hu-κ, 1 μg/ml lub anty-hu-κ, 1 μg/ml w 1X PBS, 50 μl/studzienkę. Przechowywać w lodówce.
2. Opróżnić płytkę i zablokować płytkę 1X PBST (PBS z Tween) + 5% surowica kurzej, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (100 μl/studzienkę).
3. Opróżnić płytkę i płukać ręcznie w butelce do płukania (3X) lub w urządzeniu do płukania płytek (3X), płucząc 1X PBST. Jeżeli użyto butelki do płukania, odsączyć płytki na ręcznikach papierowych.
4. Przy określaniu poziomów produkcji dla klonów wykorzystuje się preparaty referencyjne (wzorcowe). Należy wykonać rozcieńczenia badanych (1:10 w pierwszej studzience i rozcieńczenia dwukrotne wzdłuż płytki). Wzorce Hu-IgG zaczynają się od 1000 μg/ml i powinny być rozcieńczane dwukrotnie wzdłuż płytki. Zostawić należy kilka studzienek dla kontroli negatywnych (prób ślepych): IX PBST +5% surowica kurza, wykorzystywana do rozcieńczeń, 100 μl/studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Przeszukiwanie fuzji i subklonów wykonuje się rozcieńczając je 1:2 w buforze do blokowania. Można wykorzystać także kontrolę pozytywna podczas przeszukiwania fuzji i subklonów.
5. Powtórzyć etap płukania #3.
6. Rozcieńczyć odczynniki przeciwciała drugorzędowego HRP (peroksydaza chrzanu)-anty-hu IgG-Fc 1:5000 lub HRP-anty-hu-κ w 1X PBST + 5% surowica kurza, dodać po 100 μl/studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz.
7. Powtórzyć etap płukania #3. (X2)
8. Rozwijać płytkę dodając po 10 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego pH 4,0, 80 μl ABTS, 8 μ H2O2 na szalkę.
9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut do 1 godziny. Odczytać OD4i5nm-490nm dla płytki.
Roztwory:
1X PBST = 1X PBS + 0,05% tween-20
Bufor cytrynianowo-fosforanowy = 21 g/l kwasu cytrynowego, 14,2 g/l fosforanu disodowego (bezwodnego); pH 4,0
ABTS = 27,8 mg/ml soli diamonowej kwasu 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolino-6-sulfonowego) w buforze cytrynianowym, roztwór zamrożony w porcjach po 1 ml.
Płytka = 96-studzienkowa płytka do oznaczeń.
Pozytywny sygnał dla testu ELISA wykryto w studzienkach odpowiadających hybrydoma 1H3, 15H12 i 19D12, co wykazało, że te hybrydomy produkują ludzkie przeciwciała IgG. 2.4.6. Supernatant dla hybrydoma odpowiadających studzienkom pozytywnym dla ludzkich przeciwciał IgGK następnie przeszukano na płytkach do testu ELISA pokrytych rozpuszczalnym IGFR1, według poniższej procedury:
1. Powlekać szalkę przez noc IGFR1 (1 μg/ml) w 1X PBS, 50 μl/studzienkę. Przechowywać w lodówce.
2. Opróżnić szalkę i zablokować szalkę 1X PBST + 5% surowica kurza, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (100 μl/studzienkę).
3. Opróżnić szalkę i płukać ręcznie w butelce do płukania (3X) lub w urządzeniu do płukania płytek (3X), płucząc 1X PBST. Jeżeli użyto butelki do płukania, odsączyć szalki na ręcznikach papierowych.
4. Jako rozcieńczalnik wykorzystać bufor blokujący. Sprawdzać surowice, zaczynając od rozcieńczenia 1:50 w górnym rzędzie szalki i rozcieńczać 2-krotnie/rząd, w dół szalki (7X). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dla przeszukiwania subklonów wyjściowym materiałem jest rozcieńczony w buforze do blokowania 1:1 supernatant z hodowli.
5. Powtórzyć etap płukania #3.
PL 210 412 B1
6. Rozcieńczyć odczynnik przeciwciała drugorzędowego HRP-anty-hu specyficznego dla IgG-Fc i/lub HRP-anty-hu-κ 1:2500-5000 w 1X PBST + 5% surowica kurza, dodać po 100 μl/studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz.
7. Powtórzyć etap płukania #3. (X2)
8. Rozwijać płytkę dodając po 10 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego pH 4,0, 80 μl ABTS, 8 μ H2O2 na szalkę.
9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut do 1 godziny. Odczytać OD4i5nra-490 nm dla szalki. Porównać dwukrotnie w stosunku do poziomu miana tła.
W testach, hybrydoma 15H12 i 19D12 dawały pozytywny sygnał ELISA. Dane te pokazują, że hybrydoma wytwarzają przeciwciała, które mogą się wiązać z rozpuszczalnym IGFR1.
Następnie, hybrydoma pozytywne wobec antygenu przeniesiono, na 24-studzienkowe szalki i ewentualnie do butelek do hodowli komórkowych. Aby zapewnić monoklonalność, hybrydomy pozytywne dla antygenu subklonowano metodą rozcieńczeń. Hybrydoma pozytywne wobec antygenu, na kilku etapach były zatrzymywane w procesach rozwojowych poprzez mrożenie komórek w pożywce do mrożenia Origen DMSO (Fischer Scientific; Suwanee, GA).
2.4.7. Izotypy przeciwciał określono według poniższej procedury:
1. Powlekać płytki inkubując przez noc w lodówce z 1 μg/ml rozpuszczalnego IGFR1 w 1X PBS, 50 μl/studzienkę.
2. Dodać 1X PBST + 5% surowica kurza na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (100 μ/studzienkę). Opróżnić szalkę.
3. Jako rozcieńczalnik wykorzystać bufor blokujący, dodać supernatanty lub oczyszczony materiał do testowania do jednej studzienki dla testowanego przeciwciała drugorzędowego - 50 gl/studzienkę. Inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej i opróżnić szalkę.
4. Opróżnić szalkę i płukać ręcznie w butelce do płukania (3X) lub w urządzeniu do płukania płytek (3X), płucząc 1X PBST. Jeżeli użyto butelki do płukania, odsączyć szalki na ręcznikach papierowych.
5. Jako rozcieńczalnik wykorzystać bufor blokujący, dodać przeciwciała drugorzędowe:
HRP-anty-hu-gamma
HRP-anty-hu-kappa
HRP-anty-ludzka IgG1; lub
HRP-anty-ludzka IgG3 rozcieńczone 1:1000. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Opróżnić płytkę.
6. Powtórzyć etap płukania #4 (3X).
7. Rozwijać płytkę dodając po 10 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego pH 4,0, 80 gl ABTS, 8 gl H2O2 na szalkę.
9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut do 1 godziny. Odczytać OD415nm-490nm dla szalki.
Dane z tego testu są podane poniżej, w Tabeli 4.
T a b e l a 4. Wyniki izotypowania testem ELISA*.
γ κ γ1 γ3
1 2 3 4 5 6 7
klon 15H15H12 1,903 1,003 0,064 0,813
*Każda z wartości odpowiada mocy sygnału ELISA obserwowanego dla każdego z przeciwciał drugorzędowych.
Dane te wskazują, że przeciwciało 15H2 jest przeciwciałem IgG3K.
2.4.8. Supernatant hybrydoma (1H3, 15H12 i 19D12) oraz MAB391, sprawdzano także w komórkowym teście ELISA, pod kątem ich zdolności do bezpośredniego wiązania komórek wyrażających IGFR1. W teście, wykorzystano komórki MCF-7 lub HEK293 transfekowane DNA IGFR1. Testy wykonano w następujący sposób:
1. Dodać 50 gl/studzienkę roztworu 20 gq/ml poli-L lizyny w 1X PBS do każdej studzienki na 96-cio studzienkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub przez noc w 4°C. Opróżnić szalkę, aby usunąć poli-L lizynę ze studzienek i przed użyciem pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
PL 210 412 B1
2. Przemyć trzykrotnie żywe komórki 1X PBS, wirować (1000 RPM/5 minut). Ustawić końcowe stężenie komórek na 2 x 106 komórek na studzienkę w 1X PBS. Dodać po 50 μΐ tej zawiesiny komórek na studzienkę.
3. Żwirować komórki 2000 RPM przez 5 minut. Zlać bufor.
4. Dodać po 50 μl na studzienkę zimnego (z lodu) aldehydu glutarowego w 1X PBS. Pozostawić na 15 minut w temperaturze pokojowej, opróżnić szalkę.
5. Dodać po 100 μl/studzienkę 1X PBST + 5% surowica kurza i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Opróżnić szalkę.
6. Przemyć płytkę delikatnie stosując 1X PBST (2x). W celu zapobiegnięcia utraty komórek, etap ten powinien być wykonany ręcznie w pojemniku, bez użycia urządzeń do przemywania płytek.
7. Stosując bufor blokujący jako rozcieńczalnik, testować dodać supernatant z hodowli poprzez dodanie 100 μg rozcieńczenia 1:1. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Powtórzyć etap płukania 6 (3x).
9. Rozcieńczyć odczynniki przeciwciała drugorzędowego HRP-anty-hu IgG-Fc i/lub HRP-anty-hu-κ, 1:2500-5000 w 1X PBST + 5% surowica kurza, dodać po 100 μl/studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz.
10. Powtórzyć etap płukania 6 (3X).
11. Rozwijać płytkę dodając po 10 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego pH 4,0, 80 μl ABTS, 8 μl H2O2 na szalkę.
12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej. Odczytać OD415nm-490nm dla płytki.
Wyniki tych testów pokazały, że hybrydoma 1H3, 15H12 i 19D12 wytwarzały immunoglobulinę, która wiąże się z komórkami HEK293 wyrażającymi IGFR1 i że hybrydomy 1H3, 15H12 i 19D12 wytwarzały immunoglobulinę, która wiąże się z komórkami MCF-7 wyrażającymi endogenny IGFR1. Dodatkowo, wyniki pokazują, że MAB391 wiąże się z komórkami HEK293 i komórkami MCF-7 wyrażającymi IGFR1.
2.4.9. Zdolność supernatantów z hybrydoma (1H3, 15H12 i 19D12) do blokowania wiązania IGFl do IGFR1 oceniano mierząc 1) intensywność barwienia dla supernatantów z komórek HEK293 i komórek MCF7, wyrażających IGFR1 2) zdolność supernatantów do blokowania wiązania IGF1-biotyna do komórek wyrażających IGFR1. Początkowo, biotynylowany IGF1 był miareczkowany na komórkach HEK239 wyrażających IGFR1, aby wyznaczyć odpowiednie stężenie do oceniania blokowania przez przeciwciała według niniejszego wynalazku wiązania się IGF1 do swojego receptora. Wykonano to według następującej procedury:
1. Komórki HEK239, wyrażające IGFR1, zebrano z butelki poklepując butelkę, aby usunąć komórki, które przepipetowano do stożkowych probówek. Komórki następnie wirowano 300 X g przez 5 minut, aby osadzić komórki. Odsączano następnie pożywkę.
2. Komórki płukano 10-20 ml PBS zawierającym 0,02% azydku sodu i zawieszono ponownie w tym samym buforze przy stężeniu około 2,5 x 106 komórek/ml (+ -106 komórek). Komórki rozdzielano na równe objętości, 200 μl/studzienkę na 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania, w tym samym buforze w 4°C. Komórki osadzano i usuwano supernatant.
3. Komórki barwiono dodając 50 μl/studzienkę seryjnie rozcieńczonego IGF1-biotyna w tym samym buforze, rozpoczynając od rozcieńczenia 1:5, a następnie seryjnymi, 4-krotnymi rozcieńczeniami. Pukano w szalkę lub delikatnie mieszano na mieszadle typu worteks, aby zapewnić, że zawiesiny komórek są zawieszone. Komórki następnie inkubowano przez 30 minut w 4°C.
4. Komórki płukano 3X dodając 150 μl buforu do pierwszego płukania a następnie osadzono. Supernatant odsączono i dodano 200 μl buforu. Ponownie, komórki posadzono a supernatant odsączono; ten etap płukania powtórzono jeszcze raz. Dodano streptawidynę-PE (streptawidyna-R-fikoerytryna) i komórki inkubowano przez 30 minut w 4°C.
5. Komórki płukano raz w PBS zawierającym 2% FBS i 0,02% azydek i zawieszono ponownie w tym samym buforze, z tą różnicą, że zawierał dodatkowo 50 μg/ml jodku propidyny, aby wyeliminować martwe komórki.
6. Komórki analizowane są metodą FACS.
Testy blokowania wykonano w następujący sposób:
1. Zebrać komórki MCF7 lub HEK239/IGFR1 z butelki do hodowli tkankowych poklepując w ścianki butelki, aby usunąć komórki. Komórki przepipetować do stożkowych probówek. Komórki następnie wirować 300 X g przez 5 minut, aby osadzić komórki.
PL 210 412 B1
Pożywkę odsączyć.
2. Komórki płukać 10-20 ml PBS zawierającym 2% FBS i 0,02% azydku sodu (PFA) i zawiesić ponownie w tym samym buforze przy stężeniu około 2,5 x 106 komórek/ml (+-106 komórek). Komórki rozdzielić po 200 μl/studzienkę na 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania, w tym samym buforze przy 4°C.
Komórki osadzić i odessać bufor.
3. Komórki barwić każdym z supernatantów z hybrydom IGFR1, dodając po 100 μl/studzienkę, razem z dodaniem pożywki jako kontroli negatywnej i MAB391 jako kontroli pozytywnej. Pukać w szalkę, aby zapewnić, że zawiesiny komórek są zawieszone. Inkubować przez 30 minut w 4°C.
4. Komórki płukać 3 razy w PFA dodając 100 μl buforu do pierwszego płukania, osadzić, odessać supernatany, zawiesić ponownie w 200 μl buforu, podzielić każdą próbę na dwie studzienki i osadzić.
5. Do jednego zestawu studzienek dodać przeciwciała anty-ludzka IgG-FITC rozcieńczone 1:100 w PFA (para-formaldehyd), do próbek z barwionymi supernatantami i pożywką kontrolną, a do próbek barwionych MAB391 dodać anty-mysie IgG FITC w rozcieńczeniu 1:200, ponownie zapewniając rozłożenie komórek (test barwienia). Inkubować przez 30 minut w 4°C.
6. Do drugiego zestawu studzienek dodawać IGFl-biotyna, rozcieńczone 1:500 w PBS zawierającym 0,02% azydku (bez FBS) i inkubować przez 3 0 minut w 4°C. Płukać komórki 3 razy, tak jak opisano w punkcie 4 (bez dzielenia próbek). Barwić te komórki dodając streptawidynę-PE (streptawidyna-R-fikoerytryna) w PFA (test blokowania). Inkubować przez 30 minut w 4°C.
7. Płukać wszystkie próby raz PFA, zawiesić ponownie w tym samym buforze, z tą różnicą, że zawiera on dodatkowo 50 μg/ml jodku propidyny, aby wyeliminować martwe komórki.
8. Przeprowadzić analizę FACS.
Wyniki z tych testów blokowania wykazały, że supernatanty dla hybrydoma 1H3, 15H12 i 19D12 blokują wiązanie biotynylowanego IGF1 do IGFR1, barwią komórki MCF7 wyrażające endogenny IGFR1 i barwią komórki HEK293 wyrażające IGFR1.
2.4.10. Sprawdzono także zdolność oczyszczonych przeciwciał 1H3 i 15H2 do blokowania wiązania biotynylowanego IGF1 do IGFR1 w teście ELISA oraz przeciwciał 1H3, 15H12 i 19D12 do blokowania wiązania biotynylowanego MAB391 do IGFR1 w teście ELISA, według poniższej procedury:
1. Powlekać płytkę przez noc w lodówce rozpuszczalnym IGFR1 (1 μg/ml) w 1X PBS, 50 gl/studzienkę.
2. Dodać 1X PBST + 5% surowica kurza, na 1 godzinę w temperaturze pokojowej - 100 gl/studzienkę. Opróżnić płytkę.
3. Płukać 3X płytkę buforem do płukania (1X PBS + 0,05% tween-20). Osuszyć płytkę.
4. Rozcieńczyć w buforze do blokowania wzdłuż szalki 2 gg/ml przeciwciał 1H3, 15H12 lub 19D12 lub przeciwciała dla kontroli negatywnej i pozytywnej. Płytki inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
5. Płukać płytkę 3X buforem do płukania.
6. Dodać biotyna-IGF1 lub biotyna-MAB3 91 po 50 gl/studzienkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Płukać płytkę 3X.
8. Dodać 100 gl/studzienkę znakowanej streptawidyną alkalicznej fosfatazy lub peroksydazu chrzanu, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
9. Płukać płytkę 3X. Rozwijać reakcję dla odpowiedniego odczynnika w zależności od użytego znacznika.
10. Odczytać po 10-15 minutach.
MAB391 biotynylowano zgodnie z następującą procedurą:
1. Przygotować MAB3 91 w buforze PBS (dializować lub wykorzystać kolumnę do odsalania, aby usunąć niepożądane składniki buforu jak Tris lub glicyna).
2. Tuż przed użyciem, przygotować świeży roztwór wyjściowy buforu Sulfo-NHS-LC-biotyna. Dodać 2,0 mg Sulfo-NHS-LC-biotyny do 200 gl destylowanej wody. Dodać ten odczynnik do MAB391 w 12 razy większym stężeniu molarnym, gdy pracuje się z 10 mg/ml MAB391 lub 20 razy większym stężeniu molarnym, gdy pracuje się z rozcieńczonymi preparatami MAB391 (2 mg/ml).
3. Wyliczenia: mmole MAB391 = mg białka/150000 mmole x 12 lub 20 = mmole dodawanego odczynnika dla biotyny mmole dodawanej biotyny x 556 = mg dodawanego odczynnika dla biotyny
Dla 1 mg/ml:
PL 210 412 B1
1/150000 = 6,6 x 10-6 x 6,6 x 10-6 mmoli = 1/32 x 10-4 NHS-LC-biotyny
1,32 x 10-4 x 556 = 0,073 mg Sulfo-NHS-LC-biotyny
Ze świeżego roztworu wyjściowego buforu Sulfo-NHS-LC-biotyna wykorzystać 10 ąl (100 ąg) roztworu na mg IgG dla 1 lub 2 mg.
4. Inkubować przez 2 godziny na lodzie i przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dializować względem PBS lub wykorzystać kolumnę do odsalania, aby usunąć niewykorzystany odczynnik dla biotyny. Przechowywać w 4°C w PBS z 0,1% azydkiem sodu. Ogólnie, 3-5 biotyn powinno być dodanych na cząsteczkę znakowanego IgG.
Wyniki z tych testów blokowania pokazują, że przeciwciała 1H3 i 15H12 blokują wiązanie biotynylowanych IGF1 do sIGFR1 i że przeciwciała blokują wiązanie biotynylowanego MAB391 do sIGFR1.
2.4.11. Wiązanie pomiędzy IGFR1 a 1H3, 15H12 i 19D12 oceniano w teście rezonansu plazmonów powierzchniowych BIAcore według poniższej procedury:
1. IGFR1 unieruchamiano na układzie CM-5 przez sprzęganie aminowe, na poziomie 350,4 jednostek odpowiedzi dla przepływających komórek. Stężenie IGFR1 wykorzystywanego do unieruchamiania wynosi 2,5 ąg/ml w buforze octanu sodu, a białko unieruchamiano przy pH 3,5.
2. Przeciwciała 1H3, 15H12 i 19D12 oczyszczono z supernatanty hybrydom poprzez kolumnę z białkiem A lub z białkiem G i sprawdzono ich czystość techniką SDS-PAGE (4%-12% Tris-glicyna).
3. Przeciwciała przepuszczono nad powyżej przygotowaną z IGFR1 powierzchnią.
4. Zakres wykorzystanych stężeń przeciwciał to 4, 2, 1, 0,5 i 0,25 ąg/ml. Wykorzystano także próbę ślepą dla odcięcia tła. Próbki przygotowano w buforze HBS,
5. Czas nanoszenia (faza asocjacji) to 10 minut, przy przepływie 20 ąl/minutę, czas dysocjacji (faza dysocjacji) to 1 godzina przy tym samym przepływie,
6. Testy wykonano zarówno w temperaturze 25°C jak i 37°C. Wszystkie doświadczenia wykonano w dwóch powtórzeniach.
7. Analizę danych wykonano programem Bia-Evaluation v.3,0,2 (Biacore, Inc; Piscataway, NJ),
8. Wszystkie doświadczenia wykonano przy pomocy urządzenia do badania rezonansu plazmonów powierzchniowego Biacore 3000 (Biacore, Inc; Piscataway, NJ).
Wyniki tych testów pokazują, że przeciwciała 15H12 i 19D12 wiążą się z IGFR1 w 25°C i 37°C i że przeciwciało 1H3 wiąże się z IGFR1 w 25°C. Wyniki z tych eksperymentów zostały także wykorzystane do obliczenia stałych powinowactwa wiązania 1H3, 15H12 i 19D12 do IGFR1 (patrz Tabela 5, poniżej).
T a b e l a 5
Stałe powinowactwa wiązania 1H3, 15H12 i 19D12 do IGFR1.
Temp. Przeciw- ciało Wielkość próby Czas asocjacji (min.) Czas dysocjacji (min.) kon (1/M-S) kof( (1/s) KD (M) czas półtrwania (min.)#
25°C 15H12 2 10 60 5,0 x 105 2,24 x10-5 4,48 x 10-11 515,73
25°C 19D12 2 10 60 4,0 x 105 2,65 x10-5 5,92 x 10-11 435,94
25°C 1H3 2 10 60 0,7 x 105 6,50 x10-5 86 x 10-11 177,73
37°C 15H12 2 10 60 7,2 x 105 4, 01 x10-5 5,57 x 10-11 288,09
37°C 19D12 2 10 60 6,8 x 105 4,93 x10-5 7,22 x 10-11 234,33
* Wyliczone jako czas półtrwania = ln(2/koff)
P r z y k ł a d 2: Komórkowy test wiązania receptora.
Komórkowy test wiązania receptora wykorzystano do określenia czy przeciwciała 1H3, 15H12 i 19D12 współzawodniczą z IGF1 w wiązaniu do IGFR1.
W teście, namoczono wstępnie 96-studzienkowe płytki filtracyjne (pory 1,2 ąm) buforem 0,5% albumina surowicy wołowej (BSA)/PBS przez 2 godziny w 4°C. Następnie usunięto bufor przy zastosowaniu pompy próżniowej. Do studzienek dodano (25 w różnych stężeniach 6X kontrolne lub testowane przeciwciała (1H3, 15H12 lub 19D12). Następnie dodano ligand [125I] - IGF-1 do studzienek w końcowym stężeniu 0,375 nM w BSA/PBS. Komórki zebrano w roztworze do odklejania komórek, policzono metodą z zastosowaniem błękitu trypanowego i zawieszono w 0,5% BSA/PBS przy ilości komórek 1-3 x 105/ml. Dodano do każdej ze studzienek po 100 ąl komórek (10000-30000). Płytkę
PL 210 412 B1 wytrząsano przez godzinę w 4°C. Następnie płytkę odsączono i przepłukano trzykrotnie zimnym (z lodu) PBS wykorzystując pompę próżniową. Filtry wyjęto i czytano pod licznikiem gamma. Dane analizowano pod kątem współzawodnictwa wiązania.
Wyniki tych testów pokazują, że 1H3, 15H12 i 19D12 są zdolne do współzawodniczenia z IGF1 w wią zaniu się z IGFR1.
P r z y k ł a d 3: Test autofosforylacji IGFR1.
Wyznaczono także zdolność 1H3, 15H12 i 19D12 do hamowania autofosforylacji IGFR1.
Przeciwciała (1H3, 15H12 i 19D12) dodano do komórek niosących na powierzchni IGFR1, na różne okresy czasu. Komórki następnie stymulowano 10 ng/ml IGF-I przez 5 min. w 37°C. Komórki przepłukano dwukrotnie PBS zawierającym 0,1 mM wanadian sodu i lizowano w buforze do lizy (50 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl2, inhibitory proteaz i 2 mM wanadian sodu). Lizaty inkubowano na lodzie przez 30 min. a nastę pnie wirowano 13000 RPM przez 10 min. w 4°C. Stężenie białka w lizatach zmierzono testem kolorymetrycznym Coomassie i poddano immuno-precypitacji i analizie Western.
Wyniki tych testów pokazują, że 1H3, 15H12 i 19D12 są zdolne do hamowania autofosforylacji IGFR1 przy IC50 wynoszącym 0,10 nM.
Przykład 4: Test wzrostu niezależnego od przylegania (miękki agar).
Określono także zdolność przeciwciał 1H3, 15H12, 19D12 i MAB391 do hamowania wzrostu niezależnego od przylegania dla różnych komórek, w tym ludzkiej linii komórek raka sutka MCF7, ludzkich komórek raka okrężnicy HT29 i ludzkich komórek raka prostaty DU145.
W tych doś wiadczeniach 3 ml 0,6% agarozy w pełnej poż ywce MEM dodano do każ dej z 6 studzienek szalki do hodowli tkankowych i poczekano na zestalenie (warstwa denna). 100 mikrolitrów przeciwciał 1H3, 15H12, 19D12 lub MAB391 (przedstawione powyżej), w różnych stężeniach, dodano do probówek hodowlanych. Zebrano komórki. Równe objętości komórek (15000 komórek) dodano do probówek hodowlanych zawierających przeciwciała i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut. Dodano jako warstwę górną 3 ml 0,35% agarozy w podstawowej pożywce pełnej (MEM) do mieszaniny przeciwciała/komórki i następnie wysiano na zestalonej warstwie dennej. Szalki następnie inkubowano przez 3 tygodnie. Następnie dodano MTT (bromek 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazolu) do studzienek i inkubowano przez 1-2 godziny. Płytki zeskanowano i policzono kolonie komórek oraz przeanalizowano programem do liczenia kolonii.
Wyniki tych testów pokazują, że przeciwciała anty-IGFR1 są zdolne do hamowania wzrostu niezależnego od przylegania dla wszystkich trzech linii nowotworowych komórek.
P r z y k ł a d 5: Klonowanie regionów zmiennych przeciwciał z hybrydoma.
Kwasy nukleinowe kodujące regiony zmienne dla 1H3, 15H12 i 19D12 otrzymano z hybrydoma według poniższej procedury.
Wyizolowano RNA informacyjny (mRNA) z 2 x 106 komórek hybrydom, wykorzystując zestaw Micro-Fast Track (Invitrogen; Carlsbad, CA). DNA komórkowy (cDNA) kodujący region zmienny otrzymano zgodnie z procedurą opisaną w zestawie cDNA Cycle (Invitrogen; Carlsbad, CA).
Regiony zmienne przeciwciał powielono poprzez PCR wykorzystując cDNA jako matrycę wykorzystując technikę 5'RACE (Clotech; Palo Alto, CA). Następującą sekwencję zastosowano jako starter 3' do powielenia łańcucha ciężkiego: 5'-TGCCAGGGGGAAGACCGATGG-3' (SEK NR ID: 22), a następującą sekwencję zastosowano jako starter 3' do powielenia łańcucha lekkiego:
5'-CGGGAAGATGAAGACAGATG-3' (SEK NR ID: 23). Dodatkowo wykorzystano startery 5'-RACE PCR (Clotech; Palo Alto, CA) w każdej z reakcji.
Mieszanina reakcyjna PCR zawierała 2,5 jednostki polimerazy Pfu I w odpowiednim dla niej buforze (Stratagene; La Joola, CA), 0,2 mM każdego z dNTP, 750 nM każdego startera 5' i 3' oraz matrycę cDNA. Końcowa objętość reakcji to 50 pl. W termocyklerze wykonano poniższy program cykli PCR:
1X 94°C, 2 min.
10X 94°C, 45 sek. 65°C 45 sek. Minus 1°C na cykl 72°C, 1 min.
25X 94°C, 45 sek. 55°C, 45 sek. 72°C, 1 min.
1X 72°C, 15 min.
PL 210 412 B1
Otrzymane powielone produkty PCR wstawiono do wektora do klonowania Zero Blunt TOPO PCR cloning vector (Invitrogen; Carlsbad, CA). Wstawka była identyfikowana trawieniami enzymami restrykcyjnymi, a następnie w wyniku sekwencjonowania otrzymano sekwencję nukleotydową wstawki.
P r z y k ł a d 6: Rekombinacyjna ekspresja łańcuchów przeciwciał.
W tym przykładzie, kwasy nukleinowe kodujące różne łańcuchy przeciwciał anty-IGFR1 według niniejszego wynalazku wykorzystano do transfekcji ssaczej linii komórkowej dhfr (CHO-DXB11), w której zaszła ekspresja łańcuchów. Przejściowe transfekcje przeprowadzono poprzez kotransfekcję linii komórkowej różnymi kombinacjami plazmidów dla ciężkich łańcuchów (γ1 i γ4) i jednego lekkiego łańcucha (κ), wybranych spośród plazmidów 1-11, wyszczególnionych poniżej.
Konstrukcję stabilnych linii komórkowych przeprowadzono przez transfekcję pojedynczymi plazmidami, bądź 12, bądź 13, wymienionymi poniżej, w następujący sposób: kwas nukleinowy umieszczono w pojedynczym plazmidzie i połączono funkcjonalnie z promotorami cytomegalowirusa (CMV). Plazmidy zawierały także cDNA DHFR funkcjonalnie połączone z długimi, końcowymi powtórzeniami mysiego wirusa guza gruczołu mlecznego (MMTV-LTR), które wykorzystano dla powielania plazmidu. W celu jmożliwienia selekcji w ssaczych komórkach, plazmid zawierał gen higromycyny B połączony funkcjonalnie z promotorem TK.
Poniżej znajduje się opis kasety ekspresyjnej z promotorem w 13 plazmidach, które zostały skonstruowane. Wskazane plazmidy (2-4 i 8-11) były zdeponowane zgodnie z Traktatem Budapesztańskim dnia 21 maja 2003 w American Type Culture Collection (ATCC); 10801 University Boulevard; Kanassas, Virginia 20110-2209 pod wskazanymi nazwami i numerami dostępu:
(1) CMV promotor-15H12/19D12 HC (γ4) sekwencja wstawki: SEK NR ID: 3;
(2) CMV promotor-15H12/19Dl2 HCA (γ4)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 HCA (γ4);
Nr dostępu ATCC: PTA - 5214;
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 44;
(3) CMV promotor-15H12/19D12 HCB (γ4)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 HCB (γ4);
Nr dostępu ATCC: PTA - 5215;
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 111;
(4) CMV promotor-15H12/19D12 HCA (γ1)
Nazwa depozytu: „15H12/19D12 HCA (γ1)”;
Nr dostępu ATCC: PTA - 5216;
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 44;
(5) CMV promotor-15H12/19D12 LC (κ)
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 1;
(6) CMV promotor-15H12/19D12 LCA (κ)
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 40;
(7) CMV promotor-15H12/19D12 LCB (κ)
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 42;
(8) CMV promotor-15H12/19D12 LCC (κ)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 LCC (κ);
Nr dostępu ATCC: PTA - 5217;
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 71;
(9) CMV promotor-15H12/19D12 LCD (κ)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 LCD (κ);
Nr dostępu ATCC: PTA - 5218;
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 73;
(10) CMV promotor-15H12/19D12 LCE (κ)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 LCE (κ);
Nr dostępu ATCC: PTA - 5219
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 75;
(11) CMV promotor-15H12/19D12 LCF (κ)Nazwa depozytu: „15H12/19D12 LCF (κ);
Nr dostępu ATCC: PTA - 5220;
Sekwencja wstawki: SEK NR ID: 77;
PL 210 412 B1 (12) CMV promotor-15H12/19D12 HC (γ4) i CMV promotor-15H12/19D12 LC (κ);
(13) CMV promotor-15H12/19D12 HCA (γ1) i CMV promotor-15H12/19D12 LC (κ).
Wszystkie ograniczenia dostęu do plazmidów zdeponowanych w ATCC będą usunięte po udzieleniu patentu.
Koniec 3' każdej kasety był połączony z sygnałem poli A beta globiny. Łańcuchy zmienne, które wyrażano, były połączone z regionem stałym wskazanym w nawiasach (tj. γ|, γ4 lub κ). Analiza transfekowanych linii komórkowych zawierających każdy plazmid wskazywała, że odpowiednie polipeptydy łańcucha przeciwciał były wyrażane (sekwencje aminokwasowe produktów ekspresji nie potwierdzone).
Każdy z powyżej wymienionych plazmidów stanowi część wynalazku. Ponadto, częścią niniejszego wynalazku jest kwas nukleinowy znajdujący się w każdej kasecie ekspresyjnej, razem z regionem zmiennym immunoglobuliny, razem z jego dojrzałą poddaną obróbce wersją (tj. bez sekwencji sygnałowej), w szczególności, SEK NR ID: 44, dojrzały HCA (nukleotydy 58-411 z SEK NR ID: 44), SEK NR ID: 111, dojrzały HCB (nukleotydy 58-411 z SEK NR ID: 111), SEK NR ID: 71, dojrzały LCC (nukleotydy 58-384 z SEK NR ID: 71), SEK NR ID: 73, dojrzały: LCD (nukleotydy 58-384 z SEK NR ID: 73), SEK NR ID: 75, dojrzały LCE (nukleotydy 58-384 z SEK NR ID: 75), SEK NR ID: 77 lub dojrzały LCF (nukleotydy 58-384 z SEK NR ID: 77), ewentualnie włączając w to region stały immunoglobuliny, razem i dowolnym polipeptydem zakodowanym przez powyższe kwasy nukleinowe, włączając w to dojrzałe lub nie poddane obróbce łańcuchy, włączając w to region stały immunoglobuliny. Ponadto, przeciwciało albo jego fragment wiążący antygen, zawierający jeden z zakodowanych polipeptydów jest częścią niniejszego wynalazku.
Zakres niniejszego wynalazku nie ma być ograniczony przez opisane tu konkretne wykonania. W rzeczywistości, rozmaite modyfikacje wynalazku, poza tymi tutaj opisanymi będą oczywiste dla specjalisty w dziedzinie z powyższego opisu i towarzyszących mu figur. Takie modyfikacje mają wchodzić w zakres dołączonych zastrzeżeń.
Patenty, zgłoszenia patentowe, numery dostępu do Genebank i publikacje są cytowane w tym zgłoszeniu i ich zawartość jest tu włączona w całości jako odniesienie.
PL 210 412 B1
Lista sekwencj i <110> Wang, Yan
Pachter, Jonathan A Hailey, Judith Greenberg, Robert Leonard, Presta Brams, Peter Feingersh, Dianę Williams, Denise Srinivasan, Mohan <120> Ludzkie neutralizujące przeciwciało anty-IGFR <130> OC01533K US <140> 10/443,466 <141> 2003-05-22 <150> 60/383,459 <151> 2002-05-24 <150> 60/393,214 <151> 2002-07-02 <150> 60/436,254 <151> 2002-12-23 <160> 120 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> 1. .384 <223>
<220>
<221> petyd sygnałowy <222> 1..57 <223>
<400> 1 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 15 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag gtt cca gac ttt cag tet gtg
PL 210 412 B1
Ser Arg Gly Glu 20 Ile Val Leu Thr Gin 25 Val Pro Asp Phe Gin 30 Ser Val
act cca aag gag aaa gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag agc att 144
Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile
35 40 45
ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca gat cag tct cca aag 192
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys
50 55 60
ctc ctc atc aag tat gct tcc cag tcc ctc tca ggg gtc ccc tcg agg 240
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc aat agc 288
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser
85 90 95
ctg gaa gct gaa gat gct gca gcg tat tac tgt cat cag agt agt cgt 336
Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg
100 105 110
tta cct cac act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa ega act 384
Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125 <210> 2 <211> 128 <212> PRT
<213> : <400> Homo 2 sapiens
Met 1 Ser Pro Ser Gin 5 Leu Ile Gly Phe Leu 10 Leu Leu Trp Val Pro 15 Ala
Ser Arg Gly Glu 20 Ile Val Leu Thr Gin 25 Val Pro Asp Phe Gin 30 Ser Val
Thr Pro Lys 35 Glu Lys Val Thr Ile 40 Thr Cys Arg Ala Ser 45 Gin Ser Ile
Gly Ser 50 Ser Leu His Trp Tyr 55 Gin Gin Lys Pro Asp 60 Gin Ser Pro Lys
Leu 65 Leu Ile Lys Tyr Ala 70 Ser Gin Ser Leu Ser 75 Gly Val Pro Ser Arg 80
Phe Ser Gly Ser Gly 85 Ser Gly Thr Asp Phe 90 Thr Leu Thr Ile Asn 95 Ser
Leu Glu Ala Glu 100 Asp Ala Ala Ala Tyr 105 Tyr Cys His Gin Ser 110 Ser Arg
PL 210 412 B1
Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210>
<211>
<212>
<213>
411
DNA
Homo sapiens <220>
<221>
<222>
<223>
CDS
1. .411 <220>
<221> peptyd sygnałowy <222> 1..57 <223>
<400> 3 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct ata tta aaa ggt
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cat
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His
25 30 cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
40 45
144 agt agc ttt gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
55 60
192 gag tgg ata tca gtt att gat act cgt ggt gcc aca tac tat gca gac 240
Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 55 70 75 80 tcc gtg aag ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc 288
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
90 95
100
115
120
aga gcc gag gac atg gct gtg tat 336
Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr
105 110
tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc 384
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
125
caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 <210>
<211>
<212>
<213>
137
PRT
Homo sapiens
411 <400>
PL 210 412 B1
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cgggccagtc agagcattgg tagtagctta cac <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tatgcttccc agtccctctc a <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 catcagagta gtcgtttacc tcacact 27 <210> 8
PL 210 412 B1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 15 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Tyr Ala Ser Gin Ser Leu Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
His Gin Ser Ser Arg Leu Pro His Thr 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 agctttgcta tgcac <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gttattgata ctcgtggtgc cacatactat gcagactccg tgaagggc <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ctggggaact tctactacgg tatggacgtc <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Ser Phe Ala Met His
5 <210> 15
PL 210 412 B1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16
Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met His io <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ggattcacct tcagtagctt tgctatgcac <210> 19 <211> 1367 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 io 15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gin Gin Leu Lys Arg 35 40 45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 55 70 75 80
PL 210 412 B1
PL 210 412 B1
PL 210 412 B1
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala 595 600 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser 610 615 620
Ser Gin Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gin Arg Gin Pro Gin Asp Gly Tyr 645 650 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 6Θ5
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gin Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735
Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gin Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750
Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro 755 760 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780
Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800
Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815
Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830
Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 - 845
PL 210 412 B1
Phe Leu 850 Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met
855 860
Tyr 865 Glu Ile Lys Tyr Gly Ser 870 Gin Val Glu Asp Gin Arg 875 Glu Cys Val 880
Ser Arg Gin Glu Tyr 885 Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu 890 Asn Arg Leu 895
Asn Pro Gly Asn 900 Tyr Thr Ala Arg Ile Gin Ala Thr Ser 905 Leu 910 Ser Gly
Asn Gly Ser Trp 915 Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gin 920 925 Ala Lys Thr
Gly Tyr 930 Glu Asn Phe Ile His 935 Leu Ile Ile Ala Leu Pro 940 Val Ala Val
Leu 945 Leu Ile Val Gly Gly Leu 950 Val Ile Met Leu Tyr Val 955 Phe His Arg 960
Lys Arg Asn Asn Ser 965 Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr 970 Ala Ser Val 975
Asn Pro Glu Tyr 980 Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro 985 Asp 990 Glu Trp
Glu val Ala Arg 995 Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gin Gly 1000 1005
Ser Phe 1010 Gly Met Val Tyr Glu 1015 Gly Val Ala Lys Gly 1020 Val Val Lys
Asp Glu 1025 Pro Glu Thr Arg Val 1030 Ala Ile Lys Thr Val 1035 Asn Glu Ala
Ala Ser 1040 Met Arg Glu Arg Ile 1045 Glu Phe Leu Asn Glu 1050 Ala Ser Val
Met Lys 1055 Glu Phe Asn Cys His 1060 His Val Val Arg Leu 1065 Leu Gly Val
Val Ser 1070 Gin Gly Gin Pro Thr 1075 Leu val Ile Met Glu 1080 Leu Met Thr
Arg Gly 1085 Asp Leu Lys Ser Tyr 1090 Leu Arg Ser Leu Arg 1095 Pro Glu Met
PL 210 412 B1
Glu Asn 1100 Asn Pro Val Leu Ala 1105
Gin Met 1115 Ala Gly Glu Ile Ala 1120
Asn Lys 1130 Phe Val His Arg Asp 1135
Ala Glu 1145 Asp Phe Thr Val Lys 1150
Asp Ile 1160 Tyr Glu Thr Asp Tyr 1165
Leu Pro 1175 Val Arg Trp Met Ser 1180
Phe Thr 1190 Thr Tyr Ser Asp Val 1195
Glu Ile 1205 Ala Thr Leu Ala Glu 1210
Glu Gin 1220 Val Leu Arg Phe Val 1225
Pro Asp 1235 Asn Cys Pro Asp Met 1240
Trp Gin 1250 Tyr Asn Pro Lys Met 1255
Ser Ser 1265 Ile Lys Glu Glu Met 1270
Phe Tyr 1280 Tyr Ser Glu Glu Asn 1285
Asp Leu 1295 Glu Pro Glu Asn Met 1300
Ala Ser 1310 Ser Ser Ser Leu Pro 1315
Lys . Ala 1325 Glu . Asn Gly Pro Gly 1330
Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile 1110
Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala 1125
Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val 1140
Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg 1155
Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu 1170
Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val 1185
Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp 1200
Gin Pro Tyr Gin Gly Leu Ser Asn 1215
Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys 1230
Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys 1245
Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile 1260
Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser 1275
Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu 1290
Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser 1305
Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His 1320
Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala 1335
PL 210 412 B1
Ser Phe Asp Glu Arg Gin Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg 1340 1345 1350
Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gin Ser Ser Thr Cys 1355 1360 1365 <210> 20 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro 1 5
Thr Gin Leu Phe Lys Cys Cys Phe 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met 20
His Thr Met Ser Ser Ser His Leu 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu 35 40
Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala 50 55
Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr 65 70
Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin 85
Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg 100
Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 105 no
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser 115 120
Val Arg Ala Gin Arg His Thr Asp 125
Met Pro Lys Thr Gin Lys Tyr Gin 130 135
Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr 140
Lys Ser Gin Arg Arg Lys Gly Trp 145 150
Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu 155 160
Gin Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser 165
Leu Gin Ile Arg Gly Lys Lys Lys 170 175
Glu Gin Arg Arg Glu Ile Gly Ser 180
Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys
185 Igo
PL 210 412 B1
Lys Gly Lys 195
<210> 21
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu
10 15
Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu 20 25 30
Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg 35 40 45
Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg 50 55 60
Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu 65 70 75 80
Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu Arg Asp Val Ser Thr 85 90 95
Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys 100 105 110
Phe Phe Gin Tyr Asp Thr Trp Lys Gin Ser Thr Gin Arg Leu Arg Arg 115 120 125
Gly Leu Pro Ala Leu Leu Arg Ala Arg Arg Gly His Val Leu Ala Lys 130 135 140
Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Ala Lys Arg His Arg Pro Leu Ile Ala 145 150 155 160
Leu Pro Thr Gin Asp Pro Ala His Gly Gly Ala Pro Pro Glu Met Ala 165 170 175
Ser Asn Arg Lys 180 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
PL 210 412 B1 <223> starter PCR <400> 22 tgccaggggg aagaccgatg g <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter PCR <400> 23 cgggaagatg aagacagatg <210> 24 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(390) <223>
<220>
<221> peptyd sygnałowy <222> (1) .. (60) <223>
<400> 24 atg gaa gcc cca gct cag ctt ctc ttc Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe 1 5 gat acc acc gga gaa att gtg ttg aca
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr
25 ttg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
40 gtt agc agt ttc tta gcc tgg tac caa
Val Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gin
55 agg ctc ctc atc tat gat gca tcc aac
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
70 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
ctc ctg eta ctc tgg ctc cca
Leu 10 Leu Leu Leu Trp Leu 15 Pro
cag tct cca gcc acc ctg tct
Gin Ser Pro Ala Thr 30 Leu Ser
tcc tgc agg gcc agt cag agt
Ser Cys Arg Ala 45 Ser Gin Ser
cag aaa cct ggc cag gct ccc
Gin Lys Pro 60 Gly Gin Ala Pro
agg gcc cct ggc atc cca gcc
Arg Ala 75 Pro Gly Ile Pro Ala 80
gac ttc act ctc acc atc agc
Asp 90 Phe Thr Leu Thr Ile 95 Ser
PL 210 412 B1 agc eta gag cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser
100 105 110
336 aac tgg cct cgg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa Asn Trp Pro Arg Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
384 ega act
390
Arg Thr 130 <210> 25 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Pro Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly.Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110
Asn Trp Pro Arg Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125
Arg Thr 130 <2I0> 26 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens
PL 210 412 B1 <220>
<221> CDS <222> (1)..(420) <223>
<220>
<221> peptyd sygnałowy <222> (1) . . (57) <223>
<400> 26
atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc
Met 1 Glu Phe Gly Leu 5 Ser Trp Val Phe
gtc cag tgt gag gtt cag ctg gtg cag
Val Gin Cys Glu 20 Val Gin Leu Val Gin 25
cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys
agt aac tat gct atg cac tgg att cgc
Ser Asn 50 Tyr Ala Met His Trp 55 Ile Arg
gag tgg gtg tca gct att ggt gct ggt
Glu 65 Trp val Ser Ala Ile 70 Gly Ala Gly
tcc gtg aag ggc ega ttc acc atc tcc
Ser val Lys Gly Arg 85 Phe Thr Ile Ser
ttg tat ctt caa atg aac agc ctg aga
Leu Tyr Leu Gin 100 Met Asn Ser Leu Arg 105
tac tgt gca aga ggc cgg cat agg aac
Tyr Cys Ala 115 Arg Gly Arg His Arg 12 0 Asn
tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr
130 135 ctt gtg gct ata tta aaa ggt 48
Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 10 15 tct ggg gga ggc ttg gta ctt 96
Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu gca ggc tct gga ttc acc ttc 144
Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe cag gct cca gga aaa ggt ctg 192
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu ggt gac acg tac tat gca gac 240
Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp
80 aga gac aac gcc aag gac tcc 288
Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser 90 95 gcc gag gac atg gct gtt tat 336
Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr
110 tgg tac tac tac aat aag gac 384
Trp Tyr Tyr Tyr Asn Lys Asp
125
gtc tcc tca 420
Val Ser Ser 140
<210> 27 <211> 140 <212> PRT
< 213 > Homo sapiens
<400> 27
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe
1 5
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin
Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 10 15
Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu
PL 210 412 B1
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Ala Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser 85 go 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Arg His Arg Asn Trp Tyr Tyr Tyr Asn Lys Asp 115 120 125
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
<210> 2B
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
agggccagtc agagtgttag
<210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gatgcatcca acagggcccc t <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cagcagcgta gcaactggcc tcggtggacg
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
PL 210 412 B1
<210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met His 1 5 io
PL 210 412 B1 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38
Ala Ile Gly Ala Gly Gly Asp Thr Tyr 1 5 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
Gly Arg His Arg Asn Trp Tyr Tyr Tyr 1 5 <210> 40 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(384) <223>
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 10 15
Asn Lys Asp Tyr 10 <400> 40
atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt
Met 1 Ser Pro Ser Gin 5 Leu Ile Gly Phe
tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag
Ser Arg Gly Glu 20 Ile Val Leu Thr Gin 25
act cca ggc gag aga gtc acc atc acc
Thr Pro Gly 35 Glu Arg Val Thr Ile 40 Thr
ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag
Gly Ser 50 Ser Leu His Trp Tyr 55 Gin Gin
ctt ctc atc tac tat gct tcc cag tcc
Leu 65 Leu Ile Tyr Tyr Ala 70 Ser Gin Ser
ttc agt ggc agt gga tet ggg aca gat
Phe Ser Gly Ser Gly 85 Ser Gly Thr Asp
ctc gag gct gaa gat ttc gca gtg tat
Leu Glu Ala Glu 100 Asp Phe Ala Val Tyr 105
tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc
Leu Pro His 115 Thr Phe Gly Gin Gly 12 0 Thr
ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48
Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 10 15 agc cca gac tet ctg tet gtg 96
Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val tgc cgg gcc agt cag agc att 144
Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile aaa cca ggt cag tet cca aag 192
Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys ctc tca ggg gtc ccc tcg agg 240
Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg
80 ttc acc ctc acc atc agt agc 288
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 90 95 tac tgt cat cag agt agt cgt 336
Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg
110 aag gtg gag atc aaa cgt acg 384
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
125
PL 210 412 B1 <210> 41 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41
Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly Phe 1 5
Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 10 15
Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin 20 25
Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val 30
Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr 35 40
Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile 45
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin 50 55
Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys 60
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gin Ser 65 70
Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 90 95
Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr 100 105
Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg 110
Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr 115 120 <210> 42 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(384) <223>
<400> 42
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 125
atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt
Met 1 Ser Pro Ser Gin 5 Leu Ile Gly Phe
tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag
Ser Arg Gly Glu 20 Ile Val Leu Thr Gin 25
tct cca ggc gag aga gcc acc ctc tcc
Ser Pro Gly 35 Glu Arg Ala Thr Leu 40 Ser
ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin
ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48
Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 10 15 agc cca ggt acc ctg tct gtg 96
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val tgc cgg gcc agt cag agc att 144
Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile aaa cca ggt cag gct cca agg 192
Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg
PL 210 412 B1
50 55
ctt ctc atc tac tat get tcc cag
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gin
65 70
ttc agt ggc agt gga tct ggg aca
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85
ctg gag cct gaa gat ttc gca gtg
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
100
tta cct cac act ttc ggc caa ggg
Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly
115 120
<210> 43
<211> 128
<212> PRT
<213> : Homo sapiens
<400> 43
Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly
1 5
tcc ctc tca ggg atc ccc gat agg 240
Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg ao gat ttc acc ctc acc atc agt aga 288
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
95
tat Tyr 105 tac Tyr tgt Cys cat His cag Gin agt Ser 110 agt Ser cgt Arg 336
acc aag gtg gag atc aaa cgt aca 384
Thr Lys Val Glu Ile 125 Lys Arg Thr
Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 10 15
Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr 20
Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 35 40
Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile 45
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin 50 55
Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 60
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gin 65 70
Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 85
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 100
Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg 105 no
Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly 115 120
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 125
<210> 44
<211> 411
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
PL 210 412 B1 <222> (1) . . (411) <223>
<400> 44 atg gag ttt ggg ctg age tgg gtt ttc ctt gtt gct ata tta aaa ggt
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
10 15 gtc cag tgt gag gtt cag ctg gtg cag tet ggg gga ggc ttg gta aag
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
25 30 cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gee tet gga ttc acc ttc Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
40 45 agt age ttt gct atg cac tgg gtt ege cag gct cca gga aaa ggt ctg Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
55 60
144
192 gag tgg ata tca gtt att gat act cgt ggt gee aca tac tat gca gac 240
Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 tcc gtg aag ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat gee aag aac tcc 2 88
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
90 95
100
115
120
aga gee gag gac act gct gtg tat 336
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
105 110
tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc 384
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
125
411 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 45
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo
<400> 45
Met Glu Phe
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
PL 210 412 B1
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135
<210> 46
<211> 69
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) .
<223>
<400> 46 gaa att gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg act cca ggc Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15 gag aga gtc acc atc acc tgc Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys
<210> 47
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 48 <211> 45 <212 > DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
PL 210 412 B1 <222> (1)..(45) <223>
<400> 48 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct cca aag ctt ctc atc tac Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 49
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15
<210> 50
<211> 96
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) .
<223>
<400> 50
agt gga tct 999 aca gat ttc acc 48
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
10 15
gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt 96
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
25 30
<210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 51
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
PL 210 412 B1 <222> (1) . . (36) <223>
<400> 52 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 io <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 53
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10
<210> 54
<211> 69
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) .
<223>
<400> 54 gaa att gtg ctg act cag agc cca ggt acc ctg tct gtg tct cca ggc Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15 gag aga gcc acc ctc tcc tgc
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 55
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20
<210> 56
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo
<220>
PL 210 412 B1 <221>
<222>
<223>
CDS (1)..(45) <400> 56 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag gct cca agg ctt ctc atc tac Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 57
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15
<210> 58
<211> 96
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) .
<223>
<400> 58
ggg atc ! ccc
Gly Ile : Pro
agt gga tct ggg aca gat ttc acc 48
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
10 15
gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt 96
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
25 30
<210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 59
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 io 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) ·
<223>
PL 210 412 B1 <400> 60 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt aca Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo
<400> 61
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Homo sapiens <220>
<221>
<222>
<223>
CDS (1) . . (90) <400> 62 gag gtt cag ctg gtg cag tet ggg gga ggc ttg gta aag cct ggg ggg
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gee tet gga ttc acc ttc agt
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
25 30 <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 63
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 io
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(42) <223>
PL 210 412 B1 <400> 64 tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg gag tgg ata tca Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser 1 5 io <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 65
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser 1 5 io
<210> 66
<211> 96
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) .
<223>
<400> 66
ega ttc 1 acc
Arg Phe Thr
gcc aag aac tcc ttg tat ctt
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
10 15
act gct gtg tat tac tgt gca
Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala
25 30
<210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 67
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Homo sapiens <220>
<221>
<222>
<223>
CDS (1) . . (33) <400> 68 tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca
PL 210 412 B1
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 1 5 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val
1
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo
<400> 70
Ser Ser 10
Ser Ser 10
Asn Tyr Ala Met His 1 5 <210> 71 <211> 384 <212 > DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(384) <223>
<400> 71 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly Phe 1 5 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag
Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin
25 act cca ggc gag aga gtc acc atc acc
Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr
40 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin
55 ctt ctc atc aag tat gca tcc cag tcc
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser
70 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp ctc gag gct gaa gat gct gca gcg tat
Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr
100 105
ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48
Leu 10 Leu Leu Trp Val Pro 15 Ala
agc cca gac tct ctg tct gtg 96
Ser Pro Asp Ser Leu 30 Ser Val
tgc cgg gcc agt cag agc att 144
Cys Arg Ala Ser 45 Gin Ser Ile
aaa cca ggt cag tct cca aag 192
Lys Pro Gly 60 Gin Ser Pro Lys
ctc tca ggg gtc ccc tcg agg 240
Leu Ser 75 Gly Val Pro Ser Arg 80
ttc acc ctc acc atc agt agc 288
Phe 90 Thr Leu Thr Ile Ser 95 Ser
tac tgt cat cag agt agt cgt 336
Tyr Cys His Gin Ser 110 Ser Arg
PL 210 412 B1 tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
384
<210> 72
<211> 128
<212> PRT
<213> Homo
<400> 72
Met Ser Pro
Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val 20 25 30
Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile 35 40 45
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys 50 55 60
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95
Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg 100 105 no
Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125
<210> 73
<211> 384
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) ·
<223>
<400> 73
atg tcg cca
Met Ser Pro
ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48
Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala
10 15
cag agc cca gac tet ctg tet gtg 96
Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser val
25 30
PL 210 412 B1
act cca ggc Gly 35 gag aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag Gin agc Ser att Ile
Thr Pro Glu Arg Val Thr Ile 40 Thr Cys Arg Ala Ser 45
ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct cca aag
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys
50 55 60
ctt ctc atc aag tat gca tcc cag tcc ctc tca ggg gtc ccc tcg agg
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc agt agc
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
ctc gag gct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt cat cag agt agt cgt
Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg
100 105 110
tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg
Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
<210> 74
<211> 128
<212> PRT
<213> : Homo sapiens
<400> 74
Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala
1 5 10 15
Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val
20 25 30
Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile
35 40 45
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg
100 105 110
Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
PL 210 412 B1 <210> 75 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(384) <223>
<400> 75
atg teg cca tca caa ctc att ggg ttt
Met 1 Ser Pro Ser Gin 5 Leu Ile Gly Phe
tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag
Ser Arg Gly Glu 20 Ile Val Leu Thr Gin 25
tct cca ggc gag aga gcc acc ctc tcc
Ser Pro Gly 35 Glu Arg Ala Thr Leu 40 Ser
ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag
Gly Ser 50 Ser Leu His Trp Tyr 55 Gin Gin
ctt ctc atc aag tat gca tcc cag tcc
Leu 65 Leu Ile Lys Tyr Ala 70 Ser Gin Ser
ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat
Phe Ser Gly Ser Gly 85 Ser Gly Thr Asp
ctg gag cct gaa gat get gca gcg tat
Leu Glu Pro Glu 100 Asp Ala Ala Ala Tyr 105
tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc
Leu Pro His 115 Thr Phe Gly Gin Gly 12 0 Thr
ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48
Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 10 15 agc cca ggt acc ctg tct gtg 96
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val tgc cgg gcc agt cag agc att 144
Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile aaa cca ggt cag get cca agg 192
Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg ctc tca ggg atc ccc gat agg 240
Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg
80 ttc acc ctc acc atc agt aga 288
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 90 95 tac tgt cat cag agt agt cgt 336
Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg
110 aag gtg gag atc aaa cgt aca 384
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
125
<210> 76
<211> 128
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly Phe
1 5
Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 10 15
Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin
20 25
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
35 40
Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile 45
PL 210 412 B1
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin 50 55
Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 60
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser 65 70
Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Ala Tyr 100 105
Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg 110
Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr
115 120
<210> 77
<211> 384
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (384)
<223>
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 125
<400> 77
atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt
Met 1 Ser Pro Ser Gin 5 Leu Ile Gly Phe
tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag
Ser Arg Gly Glu 20 Ile val Leu Thr Gin 25
tet cca ggc gag aga gcc acc ctc tcc
Ser Pro Gly 35 Glu Arg Ala Thr Leu 40 Ser
ggt agt age tta cac tgg tac cag cag
Gly Ser 50 Ser Leu His Trp Tyr 55 Gin Gin
ctt ctc atc aag tat gca tcc cag tcc
Leu 65 Leu Ile Lys Tyr Ala 70 Ser Gin Ser
ttc agt ggc agt gga tet ggg aca gat
Phe Ser Gly Ser Gly 85 Ser Gly Thr Asp
ctg gag cct gaa gat ttc gca gtg tat
Leu Glu Pro Glu 100 Asp Phe Ala Val Tyr 105
tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc
Leu Pro His 115 Thr Phe Gly Gin Gly 120 Thr
ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48
Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 10 15 age cca ggt acc ctg tet gtg 96
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val tgc cgg gcc agt cag age att 144
Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile aaa cca ggt cag gct cca agg 192
Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg ctc tca ggg atc ccc gat agg 240
Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg
80 ttc acc ctc acc atc agt aga 288
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 90 95 tac tgt cat cag agt agt cgt 336
Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg
110 aag gtg gag atc aaa cgt aca 384
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
125
PL 210 412 B1 <210> 78 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78
Met Ser Pro Ser Gin Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15
Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile 35 40 45
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 50 55 60
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Arg 100 105 110
Leu Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125
<210> 79
<211> 69
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) .
<223>
<400> 79 gaa att gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg act cca ggc Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag aga gtc acc atc acc tgc Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys <210> 80 <211> 23 <212> PRT
PL 210 412 B1 <213> Homo sapiens <400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp 1 5
Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 81 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1) . . (45) <223>
<400> 81 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 1 5 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 1 5 cca aag ctt ctc atc aag 45
Pro Lys Leu Leu Ile Lys 10 15
Pro Lys Leu Leu Ile Lys 10 15
<210> 83
<211> 96
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) .
<223>
<400> 83
ggg Gly 1 gtc Val ccc Pro tcg Ser agg Arg 5 ttc Phe agt Ser ggc Gly agt Ser
ctc Leu acc Thr atc Ile agt Ser agc Ser ctc Leu gag Glu gct Ala gaa Glu
20 25
<210> 84
gga tct ggg Gly Ser Gly 10 aca Thr gat Asp ttc Phe 15 acc Thr 48
gat gct gca gcg tat tac tgt 96
Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys
30
PL 210 412 B1 <211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 84
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 85 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(36) <223>
<400> 85 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 io <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 86
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Homo sapiens <220>
<221>
<222>
<223>
CDS (1) . (69) <400> 87 gaa att gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg act cca ggc Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15 gag aga gtc acc atc acc tgc
PL 210 412 B1
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20
<210> 88
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo
<400> 88
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Homo sapiens <220>
<221>
<222>
<223>
CDS (1) . . (45) <400> 89 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tet cca aag ctt ctc atc aag Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 1 5 io 15 <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 90
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Homo sapiens <220>
<221>
<222>
<223>
CDS (1) . . (96) <400> 91 ggg gtc ccc tcg agg ttc agt ggc agt gga tet ggg aca gat ttc acc Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15
PL 210 412 B1 ctc acc atc agt agc ctc gag gct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
25 30 <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 92
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 93 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(36) <223>
<400> 93 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 15 10 <210>
<211>
<212>
<213>
PRT
Homo sapiens <400> 94
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Homo sapiens <220>
<221>
<222>
<223>
CDS (1) · . (69) <400> 95 gaa att gtg ctg act cag agc cca ggt acc ctg tct gtg tct cca ggc
PL 210 412 B1
PL 210 412 B1 ggg atc ccc gat agg ttc agt ggc agt
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
5 ctc acc atc agt aga ctg gag cct gaa
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
25 <210> 100 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 1 5
gga tct ggg aca gat ttc acc 48
Gly 10 Ser Gly Thr Asp Phe 15 Thr
gat gct gca gcg tat tac tgt 96
Asp Ala Ala Ala Tyr 30 Tyr Cys
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 10 is
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 20 25 <210> 101 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1) . . (36) <223>
Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys 30 <400> 101 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
1
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo
<400> 102
aaa cgt aca 36
Lys Arg Thr 10
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile 1 5 <210> 103 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(69) <223>
Lys Arg Thr 10 <400> 103
PL 210 412 B1
<220>
<221> CDS
PL 210 412 B1 <222> (1) . . (96) <223>
<400> 107 ggg atc ccc gat agg ttc agt ggc agt
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser s
ctc acc atc agt aga ctg gag cct gaa
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
25 <210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 1 5
gga Gly 10 tet Ser ggg aca gat ttc Phe 15 acc Thr 48
Gly Thr Asp
gat ttc gca gtg tat tac tgt 96
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
30
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 20 25 <210> 109 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 30 <220>
<221> CDS <222> (1)..(36) <223>
<400> 109 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile 1 5 aaa cgt aca 36
Lys Arg Thr 10 <210> 110 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile 1 5 <210> 111 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens
Lys Arg Thr 10 <220>
<221> CDS
PL 210 412 B1 <222> (1)..(411) <223>
<400> 111 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct ata tta aaa ggt Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cag Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
25 30 ccc ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
40 45
144 agt agc ttt gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
55 60
192 gag tgg ata tca gtt att gat act cgt ggt gcc aca tac tat gca gac Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80
240 tcc gtg aag ggc ega ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
90 95
288
100
tac tgt gca aga ctg ggg aac ttc
Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe
115 120
caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
130 135
aga gcc gag gac act gct gtg tat 336
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
105 110
tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc 384
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
125
411
<210> 112
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo
<400> 112
Met Glu Phe
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
PL 210 412 B1
Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 no
Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135
<210> 113
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> CDS
<222> (1) .
<223>
<400> 113
gag gtt cag
Glu Val Gin
4Θ tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 114 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 io 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 115 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(42)
PL 210 412 B1 <223>
<400> 115 tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg gag tgg ata tca Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser <210>
<211>
<212>
<213>
116
PRT
Homo sapiens <400> 116
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser 15 10 <210>
<211>
<212>
<213>
117
DNA
Homo sapiens <220>
<221>
<222>
<223>
CDS (1) . . (96) <400> 117
gcc aag aac tcc ttg tat ctt caa 48
Ala Lys Asn. Ser Leu Tyr Leu Gin
10 15
act gct gtg tat tac tgt gca aga 96
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
25 30
<210>
<211>
<212>
<213>
118
PRT
Homo sapiens <400> 118
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210>
<211>
<212>
<213>
119
DNA
Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)..(33)
PL 210 412 B1
<223>
<400> 119
tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
Zastrzeżenia patentowe

Claims (49)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, które wiąże się z IGFR1 i obejmuje CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 znajdujące się w regionie zmiennym łańcucha lekkiego immunoglobuliny zawierającego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 78, oraz CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 znajdujące się w regionie zmiennym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierającego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 45.
  2. 2. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że jest izolowanym przeciwciałem, które obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierający aminokwasy 20-137 SEK NR ID: 45 oraz region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuliny zawierający aminokwasy 20-128 SEK NR ID: 78.
  3. 3. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienny tym, że jest przeciwciałem.
  4. 4. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.
  5. 5. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że jest przeciwciałem rekombinowanym.
  6. 6. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że wiąże się swoiście z ludzkim IGFR1 i wykazuje właściwość wybraną z grupy składającej się z następujących:
    (a) wiąże się z IGFR1 z Kd wynoszącą około 86 x 10-11 M lub mniej;
    (b) ma szybkość dysocjacji (Koff) dla IGFR1 wynoszącą około 6,50 x 10-5 sekundy-1 lub mniejszą;
    (c) ma szybkość asocjacji (Kon) dla IGFR1 wynoszącą około 0,7 x 105 M-1 sekundy-1 lub większą;
    (d) współzawodniczy z IGF1 o wiązanie się z IGFR1;
    (e) hamuje autofosforylację IGFR1; i (f) hamuje niezależny od zakotwiczenia wzrost komórek wyrażających IGFR1.
  7. 7. Przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że zawiera wszystkie z właściwości.
  8. 8. Izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z IGFR1 i obejmuje sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego immunoglobuliny, która zawiera CDR-L1 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 8, CDR-L2 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 9 i CDR-L3 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 10; oraz sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, która zawiera CDR-H1 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 14 lub SEK NR ID: 17, CDR-H2 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 15 i CDR-H3 obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 16.
  9. 9. Izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 znajdujące się w łańcuchu ciężkim immunoglobuliny kodowane przez polinukleotyd w plazmidzie HCA 15H12/19D12 (gamma-1), który jest zdeponowany w American
    PL 210 412 B1
    Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5220; oraz CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 znajdujące się w łańcuchu lekkim immunoglobuliny kodowane przez polinukleotyd w plazmidzie LCF 15H12/-19D12 (kappa), który jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5216.
  10. 10. Izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z IGFR1 i obejmuje (1) polipeptyd zawierający aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45 i element wybrany z grupy składającej się z:
    (a) polipeptydu obejmującego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 72;
    (b) polipeptydu obejmującego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 74;
    (c) polipeptydu obejmującego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 76 oraz (d) polipeptydu obejmującego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78; lub (2) polipeptyd zawierający aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 2 i polipeptyd zawierający aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 4.
  11. 11. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 4, znamienne tym, że region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny jest połączony do regionu stałego łańcucha ciężkiego gamma-1 immunoglobuliny oraz region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuliny jest połączony do regionu stałego łańcucha lekkiego kappa immunoglobuliny.
  12. 12. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 9, który jest przeciwciałem obejmującym dojrzały łańcuch ciężki immunoglobuliny kodowany przez polinukleotyd w plazmidzie HCA 15H12/19D12 (gamma-1), który jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5220; oraz dojrzały łańcuch lekki immunoglobuliny kodowany przez polinukleotyd w plazmidzie LCF 15H12/19D12 (kappa), który jest zdeponowany w American Type Culture Collection pod numerem depozytu PTA-5216.
  13. 13. Przeciwciało według zastrz. 2, które znajduje się w pożywce hodowlanej komórki gospodarza.
  14. 14. Przeciwciało według zastrz. 2, które jest znakowane.
  15. 15. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało lub fragment według zastrz. 1 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
  16. 16. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało lub fragment według zastrz. 2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
  17. 17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że farmaceutycznie dopuszczalny nośnik obejmuje cukier, wodę i bufor.
  18. 18. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje (1) przeciwciało określone w zastrz. 2 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik; oraz (2) jeden lub więcej dodatkowych czynników terapeutycznych i farmaceutycznie dopuszczalny noś nik; przy czym przeciwciało i jeden lub wię cej czynników terapeutycznych są przygotowane w postaci pojedynczej kompozycji lub oddzielnych kompozycji.
  19. 19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że dodatkowy czynnik terapeutyczny stanowi jeden lub więcej elementów wybranych z grupy składającej się z czynników alkilujących, antymetabolitów, antybiotyków przeciwnowotworowych, inhibitorów mitotycznych, inhibitorów funkcji chromatyny, czynników przeciw angiogenezie, antyestrogenów, antyandrogenów, terapeutycznych przeciwciał lub immunomodulatorów.
  20. 20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że dodatkowy czynnik terapeutyczny stanowi jeden lub więcej elementów wybranych z grupy składającej się z mechloretaminy, cyklofosfamidu, ifosfamidu, iperytu fenyloalaninowego, melfalenu, chlorambukolu, iperytu uracylowego, estramustyny, tiotepy, busulfanu, lomustyny, karmustyny, streptozocyny, dakarbazyny, cis-platyny, karboplatyny, altretaminy, metotreksatu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, 5-fluorodeoksyurydyny, kapecytabiny, fludarabiny, arabinozydu cytozyny, 6-merkaptopuryny, 6-tioguaniny, gemcytabiny, kladrybiny, deoksykoformycny, pentostatyny, doksorubicyny, daunorubicyny, idarubicyny, walrubicyny, mitoksantronu, daktynomycyny, mitramycyny, plikamycyny, mitomycyny C, bleomycyny, prokarbazyny, paklitakselu, docetakselu, winblasyny, winkrystyny, winorelbiny, topotekanu, irynotekanu, etopozydu, tenipozydu, razoksyny, marimastatu, COL-3, neovastatu, BMS-275291, talidomidu, skwalaminy, endostatyny, SU5416, SU6668, interferonu-alfa, EMD121974, interleukiny-12, IM862, angiostatyny, witaksyny, tamoksyfenu, toremifenu, raloksyfenu, droloksyfenu, iodoksyfenu, anastrozolu, letrozolu, eksemestanu, flutamidu, nilutamidu, bikalutamidu, spironolaktonu, octanu cyproteronu, finasterydu, cimetydyny, trastuzumabu, rituksimabu, diftitoksu denileukiny, interferonu i interleukiny-2 oraz lewamisolu w połączeniu z 5-fluorouracylem.
    PL 210 412 B1
  21. 21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że dodatkowy czynnik terapeutyczny stanowi irynotekan, docetaksel, paklitaksel, cyklofosfamid, tamoksyfen lub anastrozol.
  22. 22. Zastosowanie terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała lub fragmentu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia chorób o charakterze nowotworowym u pacjenta będącego ssakiem, przy czym choroba o charakterze nowotworowym jest chorobą której pośredniczy podwyższony poziom lub aktywność receptora 1 insulinopodobnego czynnika wzrostu.
  23. 23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że choroba o charakterze nowotworowym jest wybrana z grupy składającej się z raka pęcherza, raka Wilma, raka jajnika, raka trzustki, raka sutka, raka prostaty, raka kości, raka płuc, raka okrężnicy i odbytnicy, raka szyjki macicy i maziówczaka, a przeciwciało lub fragment jest izolowanym przeciwciałem zawierającym region zmienny łańcucha ciężkiego immunoglobuliny zawierający aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45 oraz region zmienny łańcucha lekkiego immunoglobuliny zawierający aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78.
  24. 24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że farmaceutycznie dopuszczalny nośnik obejmuje cukier, wodę i bufor.
  25. 25. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że przeciwciało jest spreparowane z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i jest w kombinacji z jednym lub więcej czynnikami terapeutycznymi wybranymi z grupy składającej się z mechloretaminy, cyklofosfamidu, ifosfamidu, iperytu fenyloalaninowego, melfalenu, chlorambukolu, iperytu uracylowego, estramustyny, tiotepy, busulfanu, lomustyny, karmustyny, streptozocyny, dakarbazyny, cis-platyny, karboplatyny, altretaminy, metotreksatu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, 5-fluorodeoksyurydyny, kapecytabiny, fludarabiny, arabinozydu cytozyny, 6-merkaptopuryny, 6-tioguaniny, gemcytabiny, kladrybiny, deoksykoformycny, pentostatyny, doksorubicyny, daunorubicyny, idarubicyny, walrubicyny, mitoksantronu, daktynomycyny, mitramycyny, plikamycyny, mitomycyny C, bleomycyny, prokarbazyny, paklitakselu, docetakselu, winblasyny, winkrystyny, winorelbiny, topotekanu, irynotekanu, etopozydu, tenipozydu, razoksyny, marimastatu, COL-3, neovastatu, BMS-275291, talidomidu, skwalaminy, endostatyny, SU5416, SU6668, interferonu-alfa, EMD121974, interleukiny-12, IM862, angiostatyny, witaksyny, tamoksyfenu, toremifenu, raloksyfenu, droloksyfenu, iodoksyfenu, anastrozolu, letrozolu, eksemestanu, flutamidu, nilutamidu, bikalutamidu, spironolaktonu, octanu cyproteronu, finasterydu, cimetydyny, trastuzumabu, rituksimabu, diftitoksu denileukiny, interferonu i interleukiny-2 oraz lewamisolu w połączeniu z 5-fluorouracylem spreparowanymi z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikiem, przy czym przeciwciało i jeden lub więcej czynników terapeutycznych jest w pojedynczej kompozycji lub oddzielnych kompozycjach.
  26. 26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że dodatkowy czynnik terapeutyczny stanowi irynotekan, docetaksel, paklitaksel, cyklofosfamid, tamoksyfen lub anastrozol.
  27. 27. Wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:
    (a) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 2;
    (b) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 72;
    (c) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 74;
    (d) aminokwasów 20-137 z SEK NR ID: 4;
    (e) aminokwasów 20-137 z SEK NR ID: 45;
    (f) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 76;
    (g) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 78;
    (h) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 2;
    (i) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 72;
    (j) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 74;
    (k) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 4;
    (l) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 45;
    (m) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 76; i (n) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 78.
  28. 28. Kwas nukleinowy według zastrz. 27, znamienny tym, że wybrany jest z grupy składającej się z:
    (a) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 1;
    (b) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 71;
    (c) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 73;
    (d) nukleotydów 58-411 z SEK NR ID: 3;
    (e) nukleotydów 58-411 z SEK NR ID: 44;
    (f) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 75;
    PL 210 412 B1 (g) nukleotydów 58-384 z SEK NR ID: 77;
    (h) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 1;
    (i) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 71;
    (j) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 73;
    (k) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 3;
    (l) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 44;
    (m) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 75; i (n) nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 77.
  29. 29. Zrekombinowany wektor zawierający kwas nukleinowy określony w zastrz. 27.
  30. 30. Komórka gospodarza zawierająca wektor określony w zastrz. 29.
  31. 31. Komórka gospodarza według zastrz. 30, znamienna tym, że jest komórką jajnika chomika chińskiego.
  32. 32. Kompleks obejmujący przeciwciało lub fragment według zastrz. 1 związany z IGFR1.
  33. 33. Wektor według zastrz. 29, znamienny tym, że jest zdeponowany w American Type Culture CoUection pod numerem depozytu PTA-5216, PTA-5217, PTA-5218, PTA-5219 lub PTA-5220.
  34. 34. Izolowany polipeptyd obejmujący element wybrany z grupy składającej się z:
    (a) aminokwasów 20-137 z SEK NR ID: 45, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;
    (b) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 2, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
    (c) aminokwasów 20-137 z SEK NR ID: 4, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;
    (d) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 72, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
    (e) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 74, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
    (f) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 76, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
    (g) aminokwasów 20-128 z SEK NR ID: 78, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
    (h) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 45, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;
    (i) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 2, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
    (j) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 4, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego immunoglobuliny;
    (k) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 72, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
    (l) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 74, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny;
    (m) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 76, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny; oraz (n) aminokwasów przedstawionych w SEK NR ID: 78, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny.
  35. 35. Polipeptyd według zastrz. 34, znamienny tym, że obejmuje aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego kappa immunoglobuliny.
  36. 36. Polipeptyd według zastrz. 34, znamienny tym, że obejmuje aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego gamma-1 immunoglobuliny.
  37. 37. Izolowana komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje polipeptyd zawierający aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78, które są połączone z regionem stałym łańcucha lekkiego kappa immunoglobuliny; lub polipeptyd zawierający aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45, które są połączone z regionem stałym łańcucha ciężkiego gamma-1 immunoglobuliny.
  38. 38. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45, lub polipeptydu zawierającego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78, który to sposób obejmuje wprowadzenie polinukleotydu kodującego ten polipeptyd do komórki gospodarza w warunkach, w których polipeptyd ten jest wytwarzany w komórce gospodarza.
    PL 210 412 B1
  39. 39. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że komórka gospodarza jest komórką eukariotyczną.
  40. 40. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że komórka gospodarza jest komórką jajnika chomika chińskiego.
  41. 41. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że komórka gospodarza jest komórką grzybów.
  42. 42. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że polipeptyd jest izolowany z komórki gospodarza.
  43. 43. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że polinukleotyd kodujący polipeptyd jest funkcjonalnie połączony z promotorem CMV.
  44. 44. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że polinukleotyd jest w wektorze.
  45. 45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że wektor obejmuje gen DHFR.
  46. 46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że gen DHFR jest funkcjonalnie połączony z długimi, końcowymi powtórzeniami mysiego wirusa guza gruczołu mlecznego.
  47. 47. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że wektor obejmuje gen higromycyny B.
  48. 48. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że gen higromycyny B jest funkcjonalnie połączony z promotorem TK.
  49. 49. Sposób wytwarzania polipeptydu zawierającego aminokwasy 20-137 z SEK NR ID: 45, lub polipeptydu zawierającego aminokwasy 20-128 z SEK NR ID: 78 według zastrz. 38, który to sposób obejmuje wprowadzenie wektora zawierającego polinukleotyd kodujący ten polipeptyd funkcjonalnie połączony z promotorem CMV, do komórki jajnika chomika chińskiego w warunkach, w których polipeptyd ten jest wytwarzany w komórce gospodarza oraz izolowanie tego polipeptydu.
PL373886A 2002-05-24 2003-05-22 Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania PL210412B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38345902P 2002-05-24 2002-05-24
US39321402P 2002-07-02 2002-07-02
US43625402P 2002-12-23 2002-12-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373886A1 PL373886A1 (pl) 2005-09-19
PL210412B1 true PL210412B1 (pl) 2012-01-31

Family

ID=29587698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL373886A PL210412B1 (pl) 2002-05-24 2003-05-22 Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania

Country Status (15)

Country Link
US (5) US7217796B2 (pl)
EP (3) EP2316922B1 (pl)
JP (4) JP4563171B2 (pl)
KR (1) KR101086533B1 (pl)
CN (1) CN100422316C (pl)
AR (2) AR040046A1 (pl)
AU (1) AU2010227116A1 (pl)
CA (1) CA2484000A1 (pl)
IL (1) IL165256A0 (pl)
MX (1) MXPA04011624A (pl)
NO (1) NO20045645L (pl)
NZ (3) NZ554740A (pl)
PE (1) PE20040519A1 (pl)
PL (1) PL210412B1 (pl)
WO (1) WO2003100008A2 (pl)

Families Citing this family (249)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080152649A1 (en) * 2002-03-01 2008-06-26 Xencor, Inc. Optimized igf-1r antibodies and methods of using the same
PL210412B1 (pl) * 2002-05-24 2012-01-31 Schering Corp Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
ES2384379T3 (es) 2002-09-06 2012-07-04 Amgen, Inc. Anticuerpo monoclonal anti-IL-1R1 humano terapéutico
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
JP4473257B2 (ja) 2003-04-02 2010-06-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー インスリン様成長因子ｉ受容体に対する抗体及びその使用
ES2527871T3 (es) * 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
AR046071A1 (es) * 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
ES2351395T3 (es) 2003-08-13 2011-02-04 Pfizer Products Inc. Anticuerpos humanos modificados anti-igf-1r.
WO2005047512A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Shering Corporation Plasmid system for multigene expression
AR046639A1 (es) * 2003-11-21 2005-12-14 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti- igfr1
EP1729804A2 (en) * 2004-03-19 2006-12-13 Amgen Inc. Reducing the risk of human and anti-human antibodies through v gene manipulation
US7625549B2 (en) * 2004-03-19 2009-12-01 Amgen Fremont Inc. Determining the risk of human anti-human antibodies in transgenic mice
WO2006009947A2 (en) 2004-06-21 2006-01-26 Exelixis, Inc. Migfs as modifiers of the igf pathway and methods of use
CA2567982A1 (en) * 2004-06-21 2006-01-26 Exelixis, Inc. P4has as modifiers of the igfr pathway and methods of use
NZ552091A (en) 2004-07-16 2009-09-25 Pfizer Prod Inc Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-IGF-1R antibody
WO2006014899A2 (en) 2004-07-26 2006-02-09 Dow Global Technologies Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
MX2007006640A (es) * 2004-12-03 2007-06-19 Schering Corp Biomarcadores para la preseleccion de pacientes para la terapia con anti-receptor 1 del factor de crecimiento similar a la insulina.
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
AU2006236637B2 (en) * 2005-04-15 2012-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods and compositions for treating or preventing cancer
WO2006114478A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Karyon-Ctt Ltd Diagnostic and therapeutic agents
WO2006138315A2 (en) * 2005-06-15 2006-12-28 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
JP2009501141A (ja) 2005-06-17 2009-01-15 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 転移性骨癌の治療のための受容体アンタゴニスト
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
WO2007035744A1 (en) 2005-09-20 2007-03-29 Osi Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
ES2526079T3 (es) * 2005-12-20 2015-01-05 Sbi Biotech Co., Ltd. Anticuerpo anti-ILT7
EA017265B1 (ru) 2006-02-03 2012-11-30 Имклоун Элэлси Применение антитела imc-a12, которое является ингибитором igf-ir, для лечения рака предстательной железы
AU2007245164A1 (en) * 2006-03-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
WO2007118214A2 (en) * 2006-04-07 2007-10-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibody compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US7846724B2 (en) * 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
US20080014203A1 (en) * 2006-04-11 2008-01-17 Silke Hansen Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
EP2032989B2 (en) * 2006-06-30 2015-10-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Igfbp2 biomarker
US8603465B1 (en) 2006-08-07 2013-12-10 Merck Sharp & Dohme, Corp. Methods for treatment of polyposis
WO2008073425A2 (en) 2006-12-11 2008-06-19 Schering Corporation High-sensitivity proteolysis assay
US20100143340A1 (en) * 2006-12-13 2010-06-10 Schering Corporation Methods and compositions for treating cancer
CN102123712B (zh) * 2006-12-13 2014-03-19 默沙东公司 使用igf1r抑制剂治疗癌症的方法
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
US20080226635A1 (en) * 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
US20100166747A1 (en) * 2007-03-02 2010-07-01 Beltran Pedro J Methods and compositions for treating tumor diseases
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
KR101530395B1 (ko) 2007-04-27 2015-06-19 피페넥스 인크. 향상된 수율 및(또는) 품질로 이종 단백질을 발현하는 특정 균주를 동정하기 위해 미생물 숙주를 신속히 스크리닝하는 방법
EP2559771A3 (en) 2007-05-17 2013-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
US20090304590A1 (en) * 2007-05-29 2009-12-10 Wyeth Therapeutic compositions and methods
WO2008150485A2 (en) * 2007-05-29 2008-12-11 Wyeth Erbb2 binding proteins and use thereof
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
WO2009005673A1 (en) * 2007-06-28 2009-01-08 Schering Corporation Anti-igf1r
US20130084243A1 (en) * 2010-01-27 2013-04-04 Liliane Goetsch Igf-1r specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
US20090092614A1 (en) * 2007-08-28 2009-04-09 Biogen Idec Ma Inc. Anti-IGF-1R Antibodies and Uses Thereof
US20090130105A1 (en) * 2007-08-28 2009-05-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
WO2009029795A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
WO2009043049A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
JP2010540960A (ja) * 2007-10-03 2010-12-24 オーエスアイ・ファーマスーティカルズ・インコーポレーテッド インスリン様成長因子−１受容体キナーゼ阻害剤に対する抗癌反応を予測する生物学的マーカー
EP2208066A2 (en) * 2007-10-03 2010-07-21 OSI Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
ES2962777T3 (es) 2007-11-15 2024-03-21 Amgen Inc Formulación acuosa de anticuerpos estabilizada por antioxidantes para la administración parenteral
WO2009079587A2 (en) * 2007-12-18 2009-06-25 Schering Corporation Biomarkers for sensitivity to anti-igf1r therapy
US20100261216A1 (en) 2007-12-21 2010-10-14 Bianca Eser Stability testing of antibodies
CA2710680C (en) 2007-12-26 2018-10-16 Vaccinex, Inc. Anti-c35 antibody combination therapies and methods
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
WO2009142810A2 (en) * 2008-03-25 2009-11-26 Schering Corporation Methods for treating or preventing colorectal cancer
US20090291088A1 (en) * 2008-04-11 2009-11-26 Biogen Idec Ma Inc. Therapeutic combinations of anti-igf-1r antibodies and other compounds
AU2009241589B2 (en) 2008-04-29 2013-10-10 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2282739A2 (en) * 2008-05-05 2011-02-16 Schering Corporation Sequential administration of chemotherapeutic agents for treatment of cancer
RU2010153580A (ru) 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
UY31861A (es) 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
WO2010006060A2 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
CA2737461A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care, Inc. Solute concentration measurement device and related methods
KR20110060911A (ko) * 2008-09-26 2011-06-08 쉐링 코포레이션 고 역가 항체 생산
MX2011004467A (es) * 2008-10-31 2011-07-28 Biogen Idec Inc Moleculas de objetivo light y usos de las mismas.
US8298533B2 (en) 2008-11-07 2012-10-30 Medimmune Limited Antibodies to IL-1R1
EP2349235A1 (en) * 2008-11-07 2011-08-03 Triact Therapeutics, Inc. Use of catecholic butane derivatives in cancer therapy
US8137933B2 (en) * 2008-11-12 2012-03-20 Schering Corporation Mammalian expression vector pUHAB
JP2012508563A (ja) * 2008-11-12 2012-04-12 シェーリング コーポレイション 抗ＩＧＦ１Ｒ発現の増強のためのβＧｌ−ＩＧＧイントロン
JP2012511033A (ja) * 2008-12-08 2012-05-17 テゴファーム コーポレーション 多価化合物の可逆阻害用マスキングリガンド
AU2009324296B2 (en) 2008-12-12 2016-07-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
US20100196272A1 (en) * 2009-01-30 2010-08-05 Neoprobe Corporation Compositions for radiolabeling diethylenetriaminepentaacetic acid (dtpa)-dextran
EP2400985A2 (en) 2009-02-25 2012-01-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination of an either an anti-igf-1r antibody or an igf binding protein and a small molecule igf-1r kinase inhibitor
US20110171124A1 (en) * 2009-02-26 2011-07-14 Osi Pharmaceuticals, Inc. In situ methods for monitoring the EMT status of tumor cells in vivo
WO2010099138A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
US8465912B2 (en) 2009-02-27 2013-06-18 OSI Pharmaceuticals, LLC Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
JP2012519281A (ja) 2009-02-27 2012-08-23 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー 間葉様腫瘍細胞またはその生成を阻害する薬剤を同定するための方法
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
JP5719347B2 (ja) 2009-04-16 2015-05-20 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 癌治療のための組成物及び方法
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US8926561B2 (en) 2009-07-30 2015-01-06 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
SG178602A1 (en) 2009-09-01 2012-04-27 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US8470297B1 (en) 2009-09-10 2013-06-25 Merck Sharp & Dohme Corp. FDG-pet evaluation of Ewing's sarcoma sensitivity
KR20140015139A (ko) 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
HUE067718T2 (hu) 2009-10-26 2024-11-28 Hoffmann La Roche Eljárás glikozilált immunglobulin elõállítására
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
US20120220594A1 (en) 2009-10-30 2012-08-30 Bristol-Meyers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
WO2011057064A1 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Brian Long Igf1r inhibitor based treatment of prostate cancer
EP2516624B1 (en) 2009-12-23 2020-02-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Cell line 3m
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
US20110200595A1 (en) 2010-02-18 2011-08-18 Roche Glycart TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR
AU2011223643A1 (en) 2010-03-03 2012-06-28 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
EP2542893A2 (en) 2010-03-03 2013-01-09 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
PT2575935E (pt) 2010-06-07 2015-10-20 Amgen Inc Dispositivo de administração de medicamento
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG187938A1 (en) 2010-08-26 2013-04-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20140037642A1 (en) 2011-02-02 2014-02-06 Amgen Inc. Methods and compositions relating to inhibition of igf-1r
WO2012116040A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors in hepatocellular carcinoma
EP2691065B1 (en) 2011-03-31 2017-03-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
US9150644B2 (en) 2011-04-12 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (IGF) I and II
US10092706B2 (en) 2011-04-20 2018-10-09 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
JP2014519813A (ja) 2011-04-25 2014-08-21 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー 癌薬剤発見、診断、および治療におけるｅｍｔ遺伝子シグネチャーの使用
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
WO2013056069A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
PL3045187T3 (pl) 2011-10-14 2019-09-30 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
EP2776042B1 (en) 2011-11-11 2019-03-20 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
CN102618490B (zh) * 2012-03-20 2013-12-25 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种诱导视网膜干细胞分化为感光细胞的方法
WO2013152252A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
PE20151179A1 (es) 2012-11-01 2015-09-12 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual anti-vegf/dll4 y usos de las mismas
US20150259430A1 (en) 2012-11-05 2015-09-17 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
SI3081249T1 (sl) 2012-11-21 2021-03-31 Amgen Inc. Naprava za dajanje zdravila
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
LT2943511T (lt) 2013-01-14 2019-11-11 Xencor Inc Nauji heterodimeriniai baltymai
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
CA2941010A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Triact Therapeutics, Inc. Cancer therapy
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
CA2904661C (en) 2013-03-15 2022-03-15 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
US9062108B2 (en) 2013-03-15 2015-06-23 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 and/or IL-17
US10544187B2 (en) * 2013-03-15 2020-01-28 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
SG11201507417RA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Body contour adaptable autoinjector device
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
TWI580451B (zh) 2013-03-15 2017-05-01 安美基公司 用於注射器之匣盒及使用具有自動注射器及匣盒之自動注射器設備之方法
EP2976117B1 (en) 2013-03-22 2020-12-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US9381246B2 (en) 2013-09-09 2016-07-05 Triact Therapeutics, Inc. Cancer therapy
AU2014340174B2 (en) 2013-10-24 2019-09-12 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
EP3060275B1 (en) 2013-10-24 2019-07-03 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
AU2015237184B2 (en) 2014-03-28 2020-11-26 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
EP3785749B1 (en) 2014-05-07 2026-04-01 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
EP4036924A1 (en) 2014-06-03 2022-08-03 Amgen, Inc Devices and methods for assisting a user of a drug delivery device
US10371321B2 (en) * 2014-07-11 2019-08-06 Kc Lng Tech Co., Ltd. Anchor structure and LNG storage tank including the same
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
KR102689285B1 (ko) 2014-11-26 2024-07-31 젠코어 인코포레이티드 Ｃｄ3 및 종양 항원과 결합하는 이종이량체 항체
MA41019A (fr) 2014-11-26 2021-05-05 Xencor Inc Anticorps hétérodimériques se liant aux antigènes cd3 et cd38
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016133947A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3981450A1 (en) 2015-02-27 2022-04-13 Amgen, Inc Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
WO2017100372A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
WO2017129763A1 (en) 2016-01-28 2017-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of signet ring cell gastric cancer
US11072652B2 (en) 2016-03-10 2021-07-27 Viela Bio, Inc. ILT7 binding molecules and methods of using the same
EP3721922B1 (en) 2016-03-15 2022-05-04 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
KR102838691B1 (ko) 2016-06-14 2025-07-25 젠코어 인코포레이티드 이중특이적 체크포인트 억제제 항체
CN116063545A (zh) 2016-06-28 2023-05-05 Xencor股份有限公司 结合生长抑素受体2的异源二聚抗体
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10550185B2 (en) 2016-10-14 2020-02-04 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing IL-15-IL-15Rα Fc-fusion proteins and PD-1 antibody fragments
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
FR3061716B1 (fr) * 2017-01-06 2019-05-17 Elsalys Biotech Nouveaux composes ciblant le cd160 humain
CA3049780A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
EP3582825A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP7280189B2 (ja) 2017-02-17 2023-05-23 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達装置用の挿入機構
MX2019010544A (es) 2017-03-06 2019-10-21 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con caracteristica de prevencion de la activacion.
KR102627069B1 (ko) 2017-03-07 2024-01-18 암겐 인코포레이티드 과압에 의한 바늘 삽입
KR102893480B1 (ko) 2017-03-09 2025-11-28 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
BR112019020053B1 (pt) 2017-03-28 2023-10-10 Amgen Inc Máquina para acoplar uma haste de êmbolo a um conjunto de seringa e método de utilização da referida máquina
MX2019014615A (es) 2017-06-08 2020-02-07 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos accionado por par de torsion.
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
AU2018290302B2 (en) 2017-06-23 2024-02-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
JP2020529832A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
MA49562A (fr) 2017-07-14 2020-05-20 Amgen Inc Système d'insertion-rétractation d'aiguille présentant un système à ressort en double torsion
EP4292576A3 (en) 2017-07-21 2024-01-17 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
US11077246B2 (en) 2017-08-18 2021-08-03 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019046600A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Amgen Inc. INSULIN-RELATED GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR BINDING PROTEINS (IGF-1R) AND METHODS OF USE
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
EP3703779B1 (en) 2017-11-03 2026-01-28 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
US12053618B2 (en) 2017-11-06 2024-08-06 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50553A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec détection de positionnement et de débit
US11312770B2 (en) 2017-11-08 2022-04-26 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
IL273637B2 (en) 2017-11-10 2025-09-01 Amgen Inc Pistons for drug delivery devices
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
CN111263651B (zh) 2017-11-16 2022-06-17 安进公司 具有停顿和终点检测的自动注射器
IL275426B2 (en) 2017-12-19 2025-03-01 Xencor Inc Engineered il-2 fc fusion proteins
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
WO2019204665A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023444A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
JP2022500095A (ja) 2018-09-24 2022-01-04 アムジエン・インコーポレーテツド インターベンション投薬システム及び方法
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
US12312584B2 (en) 2018-10-02 2025-05-27 Exosome Therapeutics, Inc. cGMP exosome loaded therapeutics for treating sickle cell disease
MA53815A (fr) 2018-10-02 2022-01-05 Amgen Inc Systèmes d'injection pour administration de médicament avec transmission de force interne
JP7612571B2 (ja) 2018-10-03 2025-01-14 ゼンコア インコーポレイテッド Ｉｌ－１２ヘテロ二量体ｆｃ－融合タンパク質
AU2019355979B2 (en) 2018-10-05 2024-12-05 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
TWI846741B (zh) 2018-10-15 2024-07-01 美商安進公司 用於藥物遞送裝置之平台組裝方法
JP7719714B2 (ja) 2018-10-15 2025-08-06 アムジエン・インコーポレーテツド ダンピング機構を有する薬物送達装置
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
ES3010833T3 (en) 2018-11-01 2025-04-04 Amgen Inc Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
WO2020106772A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Exosome Therapeutics, Inc. Exosome loaded therapeutics for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis, diabetes mellitus type 1 and type 2, atherosclerotic cardiovascular disease, and alpha 1 antitrypsin deficiency
BR112021016955A2 (pt) 2019-03-01 2021-11-23 Xencor Inc Composição, composição de ácido nucleico, composição de vetor de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produção de um domínio de ligação de membro de família 3 de pirofosfatase/fosfodiesterase de ectonucleotídeo e de tratamento de um câncer, anticorpo anti-enpp3, e, anticorpo heterodimérico
JP7510952B2 (ja) 2019-04-24 2024-07-04 アムジエン・インコーポレーテツド シリンジ滅菌確認アセンブリ及び方法
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
WO2022081804A1 (en) 2020-10-14 2022-04-21 Viridian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of thyroid eye disease
JP2024511319A (ja) 2021-03-09 2024-03-13 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｃｌｄｎ６に結合するヘテロ二量体抗体
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2023019171A1 (en) 2021-08-10 2023-02-16 Viridian Therapeutics, Inc. Compositions, doses, and methods for treatment of thyroid eye disease
IL314154A (en) * 2022-01-09 2024-09-01 Kriya Therapeutics Inc Vector constructs for delivery of nucleic acids encoding anti-IGF-1R therapeutic antibodies and methods of using them
WO2025151492A1 (en) * 2024-01-09 2025-07-17 Viridian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of thyroid eye disease
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (197)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8642A (en) * 1852-01-06 The nor
US265307A (en) * 1882-10-03 Rein-holder
US372250A (en) * 1887-10-25 Sylvanus f
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US5260291A (en) * 1981-08-24 1993-11-09 Cancer Research Campaign Technology Limited Tetrazine derivatives
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4543439A (en) * 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
JPS6019790A (ja) * 1983-07-14 1985-01-31 Yakult Honsha Co Ltd 新規なカンプトテシン誘導体
GB8327256D0 (en) 1983-10-12 1983-11-16 Ici Plc Steroid derivatives
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5693489A (en) 1984-03-30 1997-12-02 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
DE3431140A1 (de) * 1984-08-24 1986-03-06 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Enhancer fuer eukaryotische expressionssysteme
GB8424757D0 (en) 1984-10-01 1984-11-07 Pasteur Institut Retroviral vector
FR2573436B1 (fr) 1984-11-20 1989-02-17 Pasteur Institut Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5534617A (en) * 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
AU6501390A (en) 1989-09-21 1991-04-18 Synergen, Inc. Method for transporting compositions across the blood brain barrier
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
ATE158615T1 (de) 1990-03-20 1997-10-15 Univ Columbia Chimäre antikörper mit rezeptor-bindenden liganden anstelle ihrer konstanten region
CA2039921A1 (en) 1990-04-16 1991-10-17 Xandra O. Breakefield Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7906691A (en) 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) * 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9022543D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5198340A (en) * 1991-01-17 1993-03-30 Genentech, Inc. Assay for free igf-i, igf-ii, and gh levels in body fluids
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5262308A (en) * 1992-01-28 1993-11-16 Thomas Jefferson University Cell lines which constitutively express IGF-1 and IGF-1 R
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69328430T2 (de) 1992-07-27 2001-01-25 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Zielgerichte liposome zur blut-hirne schranke
US5958708A (en) * 1992-09-25 1999-09-28 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
CA2145641C (en) 1992-12-03 2008-05-27 Richard J. Gregory Pseudo-adenovirus vectors
WO1994023034A2 (en) * 1993-04-06 1994-10-13 Cedars-Sinai Medical Center Variant insulin-like growth factor i receptor subunits and methods for use thereof
JPH08509612A (ja) * 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
NZ269156A (en) 1993-07-13 1996-03-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Defective recombinant adenovirus vector incapable of replicating autonomously in a target cell and its use in gene therapy
US5719148A (en) * 1993-10-15 1998-02-17 Schering Corporation Tricyclic amide and urea compounds useful for inhibition of g-protein function and for treatment of proliferative diseases
JPH08140528A (ja) * 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US20020022023A1 (en) * 1999-01-15 2002-02-21 Axel Ullrich Treatment of diabetes mellitus and insulin receptor signal transduction
US5362718A (en) * 1994-04-18 1994-11-08 American Home Products Corporation Rapamycin hydroxyesters
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
WO1997018241A1 (en) * 1995-11-14 1997-05-22 Thomas Jefferson University Inducing resistance to tumor growth with soluble igf-1 receptor
US6346390B1 (en) * 1996-03-08 2002-02-12 Receptron, Inc. Receptor derived peptides involved in modulation of response to ligand binding
US5958872A (en) * 1996-04-01 1999-09-28 Apoptosis Technology, Inc. Active survival domains of IGF-IR and methods of use
AUPN999096A0 (en) 1996-05-22 1996-06-13 Northstar Biologicals Pty Ltd Peptides, antibodies, vaccines & uses thereof
US20020107187A1 (en) * 1996-05-22 2002-08-08 Kingston David J. Modulating the activity of hormones or their receptors - peptides, antibodies, vaccines and uses thereof
PL332856A1 (en) 1996-10-18 1999-10-25 Canji Methods of and compositions for delivery and expression of nucleic acids as needed by interferon
US20020155095A1 (en) * 1996-10-18 2002-10-24 Tattanahalli L. Nagabhushan Methods and compositions for delivery and expression of interferon-a nucleic acids
WO1998022092A1 (en) 1996-11-22 1998-05-28 The Regents Of The University Of California Transport of liposomes across the blood-brain barrier
US6294330B1 (en) 1997-01-31 2001-09-25 Odyssey Pharmaceuticals Inc. Protein fragment complementation assays for the detection of biological or drug interactions
US6121416A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
WO1998045331A2 (en) 1997-04-07 1998-10-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) * 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
DE19719001C2 (de) 1997-05-06 2001-05-10 Schuetzdeller Angelika Verfahren zum immunologisch-funktionalen Nachweis biologisch aktiver Insulin-Like Growth Factor Binding Proteine oder löslicher Insulin-Like Growth Factor - Rezeptoren im Immunoassay
CN1261807A (zh) 1997-06-30 2000-08-02 罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司 向横纹肌中转移核酸的改进方法和用于实施该方法的组合
CN1261812A (zh) 1997-06-30 2000-08-02 罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司 用于向组织中体内进行核酸载体最佳电转移的装置
AU8444698A (en) 1997-06-30 1999-01-25 Centre National De La Recherche Scientifique Improved method for transferring nucleic acid into multicelled eukaryo tic organism cells and combination therefor
US5997307A (en) * 1997-09-05 1999-12-07 Lejeune, Jr.; Francis E. Training device for myringotomy and middle ear surgery
JPH11109406A (ja) * 1997-09-30 1999-04-23 Sanyo Electric Co Ltd 表示装置とその製造方法
JP2002507544A (ja) 1997-11-14 2002-03-12 ユーロ−セルティーク，エス．エイ． 抗イディオタイプ応答を引き出す能力が増強された改変型の抗体
JP2001525339A (ja) 1997-11-27 2001-12-11 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼーション Ｉｇｆ受容体に対するアゴニストおよびアンタゴニストの設計方法
WO1999042127A2 (en) 1998-02-24 1999-08-26 Receptron, Inc. Receptor derived peptides as modulators of receptor activity
CA2332331A1 (en) 1998-05-15 1999-11-25 Francisco Robert Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases
ZA200007412B (en) * 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
US6875741B2 (en) 1998-09-02 2005-04-05 Renuka Pillutla Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
US20030236190A1 (en) * 1998-09-02 2003-12-25 Renuka Pillutla Isulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
EP1121437B1 (en) 1998-10-15 2008-02-20 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
AU3579200A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Saltech I Goteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic productionof insulin-like growth factor-1
US6316462B1 (en) * 1999-04-09 2001-11-13 Schering Corporation Methods of inducing cancer cell death and tumor regression
WO2000066125A1 (en) * 1999-04-29 2000-11-09 Aventis Pharma S.A. Method for treating cancer using camptothecin derivatives and 5-fluorouracil
WO2000069454A1 (en) 1999-05-17 2000-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Suppression of endogenous igfbp-2 to inhibit cancer
AU6607100A (en) 1999-07-23 2001-02-13 Regents Of The University Of California, The Anti-growth factor receptor avidin fusion proteins as universal vectors for drugdelivery
WO2001030964A2 (en) 1999-10-22 2001-05-03 Lifespan Biosciences, Inc. Anti-cancer nucleic acid and protein targets
WO2001036632A2 (en) 1999-11-17 2001-05-25 Compugen Ltd. Variants of alternative splicing
WO2001044464A1 (en) * 1999-12-15 2001-06-21 Mcgill University Targeting of endosomal growth factor processing as anti-cancer therapy
GB0000313D0 (en) * 2000-01-10 2000-03-01 Astrazeneca Uk Ltd Formulation
WO2001070930A2 (en) 2000-03-21 2001-09-27 University Of South Florida Growth factor binding molecules
JP2003527441A (ja) 2000-03-22 2003-09-16 グラクソ グループ リミテッド 細胞周期を阻止する薬剤及び抗体を含む医薬
TWI310684B (en) * 2000-03-27 2009-06-11 Bristol Myers Squibb Co Synergistic pharmaceutical kits for treating cancer
EP2368902A3 (en) 2000-03-29 2011-12-21 DGI Bio Technologies LLC Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
WO2001075064A2 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Hyseq, Inc. Method and materials relating to insulin-like growth factor binding protein-like polypeptides and polynucleotides
US6372250B1 (en) 2000-04-25 2002-04-16 The Regents Of The University Of California Non-invasive gene targeting to the brain
GB0012233D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Vector constructs
US7329745B2 (en) * 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US20020164333A1 (en) * 2000-07-10 2002-11-07 The Scripps Research Institute Bifunctional molecules and vectors complexed therewith for targeted gene delivery
WO2002004522A2 (en) 2000-07-10 2002-01-17 Novartis Ag Bifunctional molecules and vectors complexed therewith for targeted gene delivery
WO2002007783A2 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Regents Of The University Of Minnesota Radiolabeled immunotoxins
KR100408844B1 (ko) 2000-07-29 2003-12-06 한국산업기술평가원 동물세포 발현벡터
US20030162230A1 (en) 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
US8153121B2 (en) 2000-10-06 2012-04-10 Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor—UCLA Medical Center Diagnosis and therapy of antibody-mediated inflammatory autoimmune disorders
DE10050338A1 (de) 2000-10-11 2002-04-25 Deutsches Krebsforsch Auf dem Nachweis von IGF-IRbeta und IRS-1 beruhendes Diagnose- bzw. Klassifizierungsverfahren für Carcinome
ES2332402T5 (es) 2000-10-12 2018-05-14 Genentech, Inc. Formulaciones de proteína concentradas de viscosidad reducida
JP2004511496A (ja) * 2000-10-12 2004-04-15 アイコス　コーポレイション アロステリック制御部位を有するα／βタンパク質のリガンド結合／酵素活性を調節する物質および方法
WO2002039121A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for detecting the efficacy of anticancer treatments
JP2004517078A (ja) 2000-12-01 2004-06-10 シェーリング　コーポレイション 哺乳動物遺伝子および関連試薬の使用
ATE444488T1 (de) 2000-12-14 2009-10-15 Burnham Inst Non-apoptotische formen des zelltods und verfahren zur modulation
NZ527302A (en) 2001-01-05 2006-10-27 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
US7235576B1 (en) 2001-01-12 2007-06-26 Bayer Pharmaceuticals Corporation Omega-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors
CA2435972C (en) * 2001-01-26 2011-09-13 University Of Lausanne Matrix attachment regions and methods for use thereof
WO2002072780A2 (en) 2001-03-14 2002-09-19 Genentech, Inc. Igf antagonist peptides
FR2824076B1 (fr) 2001-04-27 2003-06-13 Centre Nat Rech Scient Methode de detection de composes activateurs ou inhibiteurs des recepteurs de la famille du recepteur de l'insuline au moyen d'un recepteur chimere isole
WO2002087618A1 (en) 2001-04-27 2002-11-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Preventive/therapeutic method for cancer
WO2002100326A2 (en) 2001-05-01 2002-12-19 The General Hospital Corporation Photoimmunotherapies for cancer using photosensitizer immunoconjugates and combination therapies
TWI238824B (en) 2001-05-14 2005-09-01 Novartis Ag 4-amino-5-phenyl-7-cyclobutyl-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine derivatives
IL159177A0 (en) 2001-06-20 2004-06-01 Prochon Biotech Ltd Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
WO2003000928A2 (en) 2001-06-25 2003-01-03 Buadbo Aps Methods for identification of cancer cell surface molecules and cancer specific promoters, and therapeutic uses thereof
WO2003014696A2 (en) 2001-08-06 2003-02-20 Stil Biotechnologies Ltd. Methods of identifying functional analogs of peptide regulators of biological pathways
AUPR870501A0 (en) 2001-11-07 2001-11-29 Biotech Research Ventures Pte Limited Composition containing a flavonoid glycone and method for using same as anti-proliferative
FR2834991B1 (fr) 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US7553485B2 (en) * 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
FR2834990A1 (fr) 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
EP1461359B1 (fr) 2002-01-18 2007-03-21 Pierre Fabre Medicament Anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834900B1 (fr) 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
US7241444B2 (en) * 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US20060051755A1 (en) 2002-04-15 2006-03-09 Rigel Pharmaceuticals Methods of assaying for cell cycle modulators
US7655397B2 (en) 2002-04-25 2010-02-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selections of genes and methods of using the same for diagnosis and for targeting the therapy of select cancers
US7485314B2 (en) * 2002-05-06 2009-02-03 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Induction of antigen specific immunologic tolerance
PL210412B1 (pl) 2002-05-24 2012-01-31 Schering Corp Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US20040086511A1 (en) * 2002-07-12 2004-05-06 The Johns Hopkins University Neuronal gene expression patterns
US20040142381A1 (en) * 2002-07-31 2004-07-22 Hubbard Stevan R. Methods for designing IGF1 receptor modulators for therapeutics
US20040047835A1 (en) * 2002-09-06 2004-03-11 Cell Therapeutics, Inc. Combinatorial drug therapy using polymer drug conjugates
US20030138430A1 (en) * 2002-09-20 2003-07-24 Stimmel Julie Beth Pharmaceutical comprising an agent that blocks the cell cycle and an antibody
TW200501960A (en) 2002-10-02 2005-01-16 Bristol Myers Squibb Co Synergistic kits and compositions for treating cancer
US20040102360A1 (en) * 2002-10-30 2004-05-27 Barnett Stanley F. Combination therapy
EP1579218A2 (en) 2002-12-20 2005-09-28 Enkam Pharmaceuticals A/S Method of modulation of interaction between receptor and ligand
NZ582210A (en) * 2003-02-13 2011-04-29 Pfizer Prod Inc Uses of anti-insulin-like growth factor I receptor antibodies
EP1603948A1 (en) 2003-03-14 2005-12-14 Pharmacia Corporation Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers
JP4473257B2 (ja) 2003-04-02 2010-06-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー インスリン様成長因子ｉ受容体に対する抗体及びその使用
US20050043233A1 (en) 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis
ES2527871T3 (es) 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
US8088387B2 (en) * 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
PT2644206T (pt) * 2003-05-23 2019-07-10 Nektar Therapeutics Derivados de peg contendo duas cadeias de peg
AR046071A1 (es) 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
ATE417041T1 (de) * 2003-08-07 2008-12-15 Schering Corp Neue farnesylproteintransferaseinhibitoren als antitumormittel
ES2351395T3 (es) 2003-08-13 2011-02-04 Pfizer Products Inc. Anticuerpos humanos modificados anti-igf-1r.
WO2005047512A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Shering Corporation Plasmid system for multigene expression
AR046639A1 (es) 2003-11-21 2005-12-14 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti- igfr1
CA2564538A1 (en) * 2004-04-22 2005-12-01 Oregon Health And Science University Compositions and methods for modulating signaling mediated by igf-1 receptor and erbb receptors
JP2008501677A (ja) * 2004-06-04 2008-01-24 ファイザー・プロダクツ・インク 異常な細胞増殖を治療する方法
NZ552091A (en) * 2004-07-16 2009-09-25 Pfizer Prod Inc Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-IGF-1R antibody
US20060205810A1 (en) * 2004-11-24 2006-09-14 Schering Corporation Platinum therapeutic combinations
MX2007006640A (es) * 2004-12-03 2007-06-19 Schering Corp Biomarcadores para la preseleccion de pacientes para la terapia con anti-receptor 1 del factor de crecimiento similar a la insulina.
AU2006236637B2 (en) * 2005-04-15 2012-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods and compositions for treating or preventing cancer
MX2007012817A (es) * 2005-04-15 2007-12-12 Immunogen Inc Eliminacion de poblacion celular heterogenea o mezclada en tumores.
WO2006138315A2 (en) * 2005-06-15 2006-12-28 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
WO2007093008A1 (en) 2006-02-17 2007-08-23 Adelaide Research & Innovation Pty Ltd Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
EP2032989B2 (en) 2006-06-30 2015-10-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Igfbp2 biomarker

Also Published As

Publication number Publication date
US7667021B2 (en) 2010-02-23
CA2484000A1 (en) 2003-12-04
PE20040519A1 (es) 2004-08-24
US20040018191A1 (en) 2004-01-29
EP1506286A4 (en) 2008-05-28
EP1506286B1 (en) 2014-03-19
EP2316921B1 (en) 2014-05-14
US7851181B2 (en) 2010-12-14
EP2316921A1 (en) 2011-05-04
NZ536475A (en) 2008-06-30
JP4563171B2 (ja) 2010-10-13
WO2003100008A3 (en) 2004-04-08
AR074564A2 (es) 2011-01-26
US20080014197A1 (en) 2008-01-17
NZ571508A (en) 2010-05-28
US20070059305A1 (en) 2007-03-15
JP2011092202A (ja) 2011-05-12
PL373886A1 (pl) 2005-09-19
WO2003100008A2 (en) 2003-12-04
US20110060130A1 (en) 2011-03-10
AU2010227116A1 (en) 2010-11-04
EP2316922A1 (en) 2011-05-04
EP1506286A2 (en) 2005-02-16
JP2010246567A (ja) 2010-11-04
AU2003241590A1 (en) 2003-12-12
MXPA04011624A (es) 2005-03-07
AR040046A1 (es) 2005-03-09
IL165256A0 (en) 2005-12-18
NO20045645L (no) 2004-12-23
KR20040111685A (ko) 2004-12-31
CN100422316C (zh) 2008-10-01
US7847068B2 (en) 2010-12-07
CN1671837A (zh) 2005-09-21
NZ554740A (en) 2009-01-31
JP2006265262A (ja) 2006-10-05
US8173779B2 (en) 2012-05-08
KR101086533B1 (ko) 2011-11-23
US7217796B2 (en) 2007-05-15
US20070059241A1 (en) 2007-03-15
JP2005527222A (ja) 2005-09-15
EP2316922B1 (en) 2013-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1506286B1 (en) Neutralizing human anti-igfr antibody
EP2272873B1 (en) Antibodies against human insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
AU2007200876B2 (en) Neutralizing human anti-IGFR antibody
AU2003241590B2 (en) Neutralizing human anti-IGFR antibody
ZA200409440B (en) Neutralizing human anti-IGFR antibody
HK1154270A (en) Neutralizing human anti-igfr antibody
HK1154271A (en) Neutralizing human anti-igfr antibody
NZ584381A (en) Neutralizing human anti-IGFR antibody
HK1094713B (en) Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof