PL183598B1

PL183598B1 - Buforowy roztwór i sposób ekstrakcji białka

Info

Publication number: PL183598B1
Application number: PL96312543A
Authority: PL
Inventors: Richard Legoux; Paul Maldonado; Marc Salome
Original assignee: Sanofi Synthelabo
Priority date: 1995-01-31
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 2002-06-28
Also published as: SK281946B6; EP0725140B1; BR9600270A; FI960427L; US5700665A; MX9600380A; JPH08242879A; AR000831A1; US5856142A; CA2168382C; CZ286509B6; KR960029343A; KR100401028B1; UA27997C2; EA199600001A2; NO316519B1; PL312543A1; NO960396L; EP0725140A1; HU9600209D0

Abstract

1. Buforowy roztwór do ekstrakcji bialek periplazmatycznych, z n a m i e n n y t y m , ze jako podstawowy czynnik aktywny zawiera arginine. 2. Sposób ekstrakcji bialka periplazmatycznego, z n a m i e n n y ty m , ze hoduje sie orga- nizm prokariotyczny stransformowany wektorem ekspresji zawierajacym gen kodujacy wspomniane bialko i srodki ekspresji w periplazmie tego drobnoustroju, poddaje sie otrzy- mana hodowle wirowaniu lub mikrofiltracji do otrzymania osadu komórek, zawiesza sie otrzymany osad komórek w roztworze buforu zawierajacym jako zasadniczy czynnik aktyw- ny arginine, do wytworzenia zawiesiny, odwirowuje sie uzyskana zawiesine do wytworzenia nadsaczu, i z tak otrzymanego nadsaczu odzyskuje sie poszukiwane bialko. 6. Sposób ekstrakcji bialka periplazmatycznego, z n a m i e n n y t y m , ze hoduje sie orga- nizm prokariotyczny stransformowany wektorem ekspresji zawierajacym gen kodujacy wspomniane bialko i srodkami do jego ekspresji w periplazmie drobnoustroju, poddaje sie otrzymana hodowle wirowaniu lub mikrofiltracji do otrzymania osadu komórek, otrzymany osad komórek poddaje sie lizie a nastepnie wiruje sie lizat do wytworzenia osadu debrytu ko- mórkowego, zawiesza sie osad debrytu komórkowego w buforowym roztworze do ekstrakcji bialek periplazmatycznych, zawierajacym jako podstawowy czynnik aktywny arginine, do wytworzenia zawiesiny, odwirowuje sie otrzymana zawiesine do wytworzenia nadsaczu i od- zyskuje sie poszukiwane bialko z nadsaczu. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest buforowy roztwór do ekstrakcji białek periplazmatycznych, charakteryzujący się tym, że jako podstawowy czynnik aktywny zawiera argininę.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób ekstrakcji białka periplazmatycznego, polegający na tym, że hoduje się organizm prokariotyczny stransformowany wektorem ekspresji zawierającym gen kodujący wspomniane białko i środki ekspresji w periplazmie tego drobnoustroju, poddaje się otrzymaną hodowlę wirowaniu lub mikrofiltracji do otrzymania osadu komórek, zawiesza się otrzymany osad komórek w roztworze buforu zawierającym jako zasadniczy czynnik aktywny argininę, do wytworzenia zawiesiny, odwirowuje się uzyskaną zawiesinę do wytworzenia nadsączu, i z tak otrzymanego nadsączu odzyskuje się poszukiwane białko.

W sposobie tym, korzystnie roztwór buforu, jest wodnym roztworem zasadowym o stężeniu argininy równym co najmniej 0,4 M, a bardziej korzystnie wodny roztwór zasadowy argininy jest pomiędzy 0,4 M a 0,8 M.

W sposobie według wynalazku korzystnym poszukiwanym białkiemj est hGH lub IL-13.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrakcji białka periplazmatycznego, polegający na tym, że hoduje się organizm prokariotyczny stransformowany wektorem ekspresji zawierającym gen kodujący wspomniane białko i środkami do jego ekspresji w periplazmie drobnoustroju, poddaje się otrzymaną hodowlę wirowaniu lub mikrofiltracji do otrzymania osadu komórek, otrzymany osad komórek poddaje się lizie a następnie wiruje się lizat do wytworzenia osadu debrytu komórkowego, zawiesza się osad debrytu komórkowego w buforowym roztworze do ekstrakcji białek periplazmatycznych, zawierającym jako podstawowy czynnik aktywny argininę, do wytworzenia zawiesiny, odwirowuje się otrzymaną zawiesinę do wytworzenia nadsączu i odzyskuje się poszukiwane białko z nadsączu.

183 598

Korzystnie jako roztwór buforu, stosuje się wodny roztwór zasadowy o stężeniu argininy równym co najmniej 0,4 M, a bardziej korzystnie wodny roztwór zasadowy argininy o stężeniu pomiędzy 0,4 M a 0,8 M.

Korzystnym poszukiwanym w sposobie według wynalazku białkiemjest hGH lub IL-13.

Arginina jest α-aminokwasem naturalnym, który zaproponowano jako czynnik pomocniczy przy denaturacji/renaturacji/podstawieniu dwóch łańcuchów Abbokinase® (aktywator moczowy plazminogenu), w których peptyd natywny zastępuje się częściowo peptydem syntetycznym w czasie tej operacji. W tym celu można powołać się na artykuł G.A. Homandberga i T. Wai w Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1038, 209-215.

W sposobie według wynalazku lub jego wariancie nie prowadzi się denaturacji/renaturacji białka i arginina uczestniczyjedynie na poziomie ekstrakcj i białka z osadu komórek lub fragmentów komórek drobnoustrojów. Arginina wywiera znaczny wpływ na ekstrakcję białka tak pod względem wydajności, jak i aktywności biologicznej białka. Istotnie znaleziono, że np. dojrzałą postać IL-13 uzyskuje się sposobem według wynalazku z wydajnością wyższą od 95% całkowicie zachowując jej aktywność biologiczną. Trzeba zaznaczyć, że próby ekstrakcji przez szok osmotyczny przy tym samym systemie ekspresji nie dały porównywalnych wydajności.

Próby porównawcze wykazały, że chlorowodorek guanidyny stosowany w tych samych warunkach pozwala także na uzyskanie białka IL-13 z wydajnością wyższą od 95%; natomiast aktywność biologiczna tak uzyskanego białka pogarsza się bardziej niż przy metodzie z argininą.

Nie chcąc ograniczać się jakąkolwiek teorią, uważa się, że arginina działajak czynnik dezorganizujący łagodny i biologiczny w przeciwieństwie do czynników dezorganizujących silnych i powodujących denaturację w wysokich stężeniach wyższych lub równych 5 M potrzebnych do zapewnienia ekstrakcji, takich jak chlorowodorek guanidyny.

Sposób według wynalazku lub jego wariant mogą stosować wobec tego jakikolwiek sposób hodowli drobnoustroju przekształconego wektorem ekspresji, zawierającym gen kodujący białko poszukiwane i czynniki ekspresji periplazmatycznej wspomnianego białka, takie jak wszystkie potrzebne sygnały regulacji.

Oczywiste jest dla fachowca, że metoda nadaje się do stosowania do bakterii zbliżonych do E. coli, to jest do bakterii, zwanych Gram-ujemnymi, beztlenowych fakultatywnych i tworzących grupę pałeczek jelitowych. W rodzinie pałeczek jelitowych znajdują się gatunki: Escherichia, Salmonella, Erwinia, ale również Shigella, Klebsiella, Serratia, Proteus i Enterobacter.

Co do charakteru dezorganizującego argininy okazuje się również, że arginina może zależnie od przypadku zastępować korzystnie inne czynniki dezorganizujące. Nie mogąc dawać przykładów dla wszystkich rodzin bakterii ze względu na różnorodność żyjących układów, wchodzących w rachubę, fachowiec będzie umiał stosować i adaptować metodę ekstrakcji z argininą do poszczególnych przypadków.

Sposoby hodowli są dobrze znane fachowcowi. Sposoby opisujące hodowlę bakterii Gram-ujemnych w fermentorze podano np. w opisach patentowych EP-360641 i EP-356335, omawiających otrzymanie i zastosowanie szczepów E. coli zwanych SEBR 1250 i TP 2339. Gdy osiąga się żądanąliczbę komórek, hodowlę poddaje się wirowaniu (zwykle) lub mikrofiltracji i otrzymany osad biomasy kontaktuje się z roztworem buforu, zawierającym argininę zgodnie ze sposobem według wynalazku. W większości wypadków działa się w temperaturze zawartej między temperaturą pokojową około 25°C, a 2°C korzystnie 4°C.

Czas zetknięcia osadu komórek z roztworem buforu, zawierającym argininę, powinien być wystarczaj ący, aby umożliwić przej ście białka poszukiwanego do roztworu buforowego. Zazwyczaj, gdy działa się w temperaturze 4°C czas kontaktu wynosi korzystnie około 1 godziny.

Ekstrakcja to jest przejście białka periplazmatycznego do środowiska zachodzi podczas zetknięcia się biomasy i buforu ekstrakcyjnego z argininą. Czas kontaktu, zapewniający całkowitą ekstrakcję lubjuż nie postępującą wynosi od 13 minut do 16 godzin. Doświadczenia pokazują, że zadowalające wydajności ekstrakcji można uzyskać w okresie kilku godzin w temperaturze 4°C.

183 598

Zauważono również, że lekkie mieszanie biomasy w buforze ekstrakcyjnym w celu uniknięcia sedymentacji osadu drobnoustrojów daje lepsze wyniki, tojest wyższy stopień ekstrakcji z zależności od czasu.

Sposób ekstrakcji według wynalazku nadaje się również do ekstrakcji białek hydrofobowych, takich jak np. interleukiny, a szczególnie IL-13 opisanej w dokumencie EP-A1-0506574, jak i białek hydrofitowych, takich jak np. hormon wzrostu (hGH). Sposób według wynalazku upraszcza otrzymanie hGH, które normalnie wymaga do ekstrakcji zastosowania szoku osmotycznego.

Aby wykonać ekstrakcję białka poszukiwanego bezpośrednio z zawiesiny osadu komórek, zaleca się roztwór buforu, zawierający argininę o stężeniu 0,4-0,8 M.

Jeśli chce się wykonać ekstrakcję poszukiwanego białka periplazmatycznego z osadu fragmentów komórek według wariantu sposobu zgodnego z wynalazkiem, postępuje się tak samo, jak według sposobu zgodnego z wynalazkiem do etapu otrzymania osadu komórek, uzyskanego po wirowaniu lub mikrofiltracji, po czym dokonuje się dezintegracji komórek metodami dobrze znanymi fachowcowi. Metody dezintegracji komórek opisali np. C.T. Choma and H. Yamazaki, Can. J. Microbiol., 1981, 27, 547-550; L.O. Ingram, Journal of Bacteriology, 1981, 146. (1)331-336; N.G. Nossal and L.A. Heppel, Journal of Biological Chemistry, 1966, 241. (13)3065-3072; R. Bennett, D.R. Taylor and A. Hurst, Biochem. Biophys. Acta, 18(3). 512-521 (1966) i w pracy zbiorowej „Fermentation and enzyme technology, Chap. 12, 239-309, J. Wiley and Sons Editeurs (1979).

Z osadu fragmentów komórek zebranego w większości wypadków po wirowaniu ponownie sporządza się zawiesinę, po czym styka się go z roztworem buforu, zawierającym argininę. Czas kontaktu zawiesiny fragmentów komórek z roztworem buforowym zawierającym argininę powinien być wystarczający, aby umożliwić przejście poszukiwanego białka do roztworu buforu. Zwykle w temperaturze 4°C czas kontaktu, zapewniający praktycznie całkowitą, ekstrakcję, wynosi 48 godzin. Tak samo zauważono, że lekkie mieszanie biomasy w buforze ekstrakcyjnym, zapobiegające sedymentacji fragmentów komórek daje wyższy stopień ekstrakcji w zależności od czasu.

Ten wariant sposobu ekstrakcji według wynalazku nadaje się szczególnie do ekstrakcji poszukiwanych białek periplazmatycznych, które są silnie związane z błonami komórkowymi, takich jak np. interleukiny.

Dobrze wiadomo fachowcowi, że w skład buforu ekstrakcyjnego, zawierającego argininę, według wynalazku, może również wchodzić pomocniczy detergent, który ma na celu polepszenie wydajności i/lub prędkości ekstrakcji poszukiwanego białka. Spośród pomocniczych detergentów, które można zastosować, fachowiec potrafi wybrać spomiędzy takich, które pozwalają na zabezpieczenie korzyści ze stosowania argininy jako czynnika ekstrakcji, a w szczególności na zachowanie aktywności biologicznej poszukiwanego białka. Spośród łagodnych detergentów pomocniczych, można wymienić np. alkiloglikozydy jak alkilomaltozydy, albo nonylo-α- lub β-D-glukopiranozydy, oktylo-α lub β-D-glukopira-nozydy albo alkilokarbamylometylo-α- lub β-D-glukopiranozydy jak np. Hecameg®, którego bardzo mała toksyczność pozwala brać pod uwagę możliwość znajdowania go w ilościach śladowych w produkcie końcowym w charakterze czynnika preparatywnego.

Do wykonania ekstrakcji poszukiwanego białka z zawiesiny osadu fragmentów komórek zaleca się stosowanie roztworu buforowego zawierającego argininę w stężeniu 0,4-2,5 M, przy czym stężenie argininy, wynoszące 2,5 M, można uzyskać szczególnie w obecności soli.

Ponadto znaleziono, że arginina wywiera godny uwagi korzystny wpływ na wydajności rekombinowanego białka periplazmatycznego wydzielonego, gdy dodaje się w stężeniu zwykle nie stosowanym, a dużo wyższym od tych, które napotyka się w środowiskach hodowli, wytwarzanych z hydrolizatów białek handlowych i które pozwala pokryć zapotrzebowanie na argininę w używanym szczepie.

Znaleziono z drugiej strony, że korzystny wpływ wywierany przez argininę jest szczególnie duży, gdy stężenie argininy dodanej do środowiska hodowli wynosi 2-10 g/l.

183 598

Tak wiec, sposób hodowli drobnoustroju prokatriotycznego przekształconego za pomocą wektora ekspresji, zawierającego gen, kodujący poszukiwane białko, polega na hodowli wspomnianego drobnoustroju w obecności argininy o stężeniu co najmniej równym 2 g/l, a w szczególności w stężeniu 2-10 g/l.

Fachowiec zoptymalizuje to stężenie argininy zależnie od przypadku.

Sposób ten jest szczególnie dostosowany do produkcji białek o aktywności typu cytokinin w szczególności IL-13, takiej jak opisano w dokumencie EP-A1-0506574.

Wynalazek opisze się teraz bardziej szczegółowo za pomocą przykładów podanych poniżej wyłącznie jako objaśniających.

Przykład I. Ekstrakcja IL-13 periplazmatycznej z E. coli w obecności argininy z osadu komórek.

1) Hodowla w fiolce

W przykładzie tym użyto szczepu E. coli RB 791 (Roger Brent, PNAS 78 (1981) p. 4204-4208) przekształconego plazmidem p922 otrzymanym według sposobów analogicznych do określonych w opisach patentowych EP 360641 i 356335 i którego sekwencja DNA jest sekwencją SEQ ID Nr 1.

Różne sekwencje, które tworzą plazmid p922 podano niżej.

Sekwencja promotorowa

Charakterystyczne heksanukleotydy TTGCTT i TATAAT promotorów u E. coli podano drukiem wytłuszczonym.

1	XhoI •CGAGGGGGG·	TGGAG3CCGAG	CACAATTCTG	TGAACGCAGA	AACTAAAAGG
51	ATCTCCACCTG	CAAGGTGCAC	AAATGGCTAT	GGCCGGCAGGC	KAGCCAGCGG
101	ACCTTCTCGCrrA	TGGCTGGGGCA	GGTCCGGAAAT	CACTGCATAA	TTCCGTCGrCGC
151	TCCAGGGCGCA	CTCCCCGGTCT	GGATAATGGGT	'TTTTGCGCCG	MCAGCAl^lAC
201	GGGGC(GGG(ClA	AAAGCTrCTGA	AATGAGCTCGT	TTCGAGCTGA	-35 CTGAACGGTTG

251 CTTATATTAC ATCGATAGCG TATAATGTGT GG

Sekwencja regionu 5 prim nie wyrażająca informacji.

Miejsce związania rybosomu podano wytłuszczonymi literami. Sekwencja CAT, znajdująca się na końcu 3 prim tej sekwencji jest częściąheksanukleotydu rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny Ndel.

RBS

283 AATTGTGAGC GGATAACAAT TTCACACAGT TTTTCGCGAA GAAGGAGATA 333 tacat

Sekwencja kodująca prekursor IL-13

Sekwencja napisana kursywą odpowiada sekwencji IL-13 w pełni rozwiniętej. Sekwencja, której nie podano wytłuszczonymi literami jest sekwencją wiążącą która przyłącza koniec sekwencji kodującej IL-13 do heksanukleotydu rozpoznanego przez enzym restrykcyjny Bam HI

183 598

338 ATGAAAAAGA TCCTGGCGTT AGCTGCGCTG ACTACCGTTG TATTCTCTGC 388 GTCCGCCTTC GCTGGCCCTG TGCCTCCCAG TACTGCCCTC AGGGAGCTCA 438 TTGAGGAGCT GGTCAACATC ACCCAGAACC AGAAGGCTCC GCTCTGCAAT 488 GGCAGCATGG rAATGAGCAT CAACCTGACA GCTGGCATGT ACTGTGCAGC 538 CCTGGAATCC CTGATCAACG TGTCAGGCTG CAGTCCCATC G,^i^/IAGACCC 588 AGAGGATGCT GAGCGGAGTC TGCCCGCACA AGGTCTCAC TGGGCAGTTT 638 TCCAGCTTGC ATGTCCCAGA CACCAAAATC GAGGTGGCCC AGTTTGTAAA 688 GGACCTCCTC TTACATTTAA AGAAACTTTT TCCGCGAGGGA TGGτTTAATT 738 GAAACTTCGA AAGCATCATT ATTTG

Sekwencje terminujące

763 GGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA

813

863

913

963

1013

1063

1113

1163

1213

1254

1304

1354

1404

1454

1504

1554

1604

1654

1704

1754

Czynnik terminujący genu 10 faga T7

CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGC^CTCTAA ACGGGTCTTG

Hindlll

AGłG^tGTTTTT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TCCGGATGTA CCAAGCTTGG CCGGATCAAA GTGTTGTGGT CCTTCCAGGC GTTAGTAAAT CMATGATCTG TATGAGGTTT CTGGCAAGCG TTTCAGCCCG CGGAGAGAGA

Czynnik terminujący faga fd

GGAGGGGCGG CCGGGGGGAC CGCGGGCGGC GG'CCCTCGCC CΊTGΊAAGAC

CCCCGGGGGG GGGGGGΊACCCT: ^TAATCCTATCGGTΠ'ATCA

GC'CGGCTCTC GAΊGΊGCΊGG TC^CCGGACAG CTTGATACCG ATAC^/GCCC CGACGACΊGC AACAACGATG CΊCCAGCΊCT AACCGATATA

ΊGGΊCTGΊCG GGGΊΊGGCCCGG GΊΊCGΊTC’GT GCGGGATGGA TT

Gen kodujący represor operonu laktozy

SacII

CCΊCGΊGGΊC AτACAAGGCΊ GAGΊCTGGGG TGCCTAATGA CTGAGCTAAC GCGCGCCGGC TGCΊΊΊ’GCGCTCAGTGΊCCG CTTTCCAiTrCGGGAAACCTG CCΊGΊCCGΊC TGCAΊGCAATGAAACGΊΊCAA CGCGCGGGGA GAGGCGCGCGT GCΊGGCCΊΊΊ CGCGCGGCTG ΊCCT'TTCTCG TCACCACdGA GACGGGCAAC AΊCGΊGCCΊC ΟσΊΠΑσσαα CTCΊΊCCTCA GAGACΊG?GCA G(^T^/^(^<G(CCG^(C CACΊCTΊΊCC TGCΊCCAGCA GΊΊCAGAAAC CTG^TΓG(CΓGGΓG<ΊΓΊAACG GCΊΊΊGTGTG ACGTGAΊGΊC TCΊC’CGCΊ'CT CGTCCTATCC ΰΑ^ΓΑ^ΑΟ GCGCCCΊCGC CAACGCΊCAG ΊC'CCΊΊGTCG GTAATGGCGC GCATTGCGGC CAGCΊCCGTC τGCΊ'CCTΊ’CG ΊAAGCAGΊAT CGCACTGGGA ACGATGCCCT CGCGCGGCAC TTGCATGCT^’TCTG’GAAAAG CGGACATGGC ACTCCACTAG CCGCCCCΊCC CC^^^TTA^G^ ΊTGΊAG'TTGA TTGCGACTGA GATAΊGCCATG

183 598

CCAGCCAGCC AGACGCAGAC GCGCCGAGAC AGAACTTAAT GGGCCCGCTA ACAGCGCGAT TTGCTGGTGA CCCAATGCGA CCAGATGCTC CACGCCCAGT CGCGTACCGT CTTCATGGGA GAAAAT.AATA CTGTTGATGG GTGTCTGGTC AGAGACATCA AGAAATAACG CCGGAACATT AGTGCAGGCA GCTTCCACAG CAATGGCATC CTGGTCATCC AGCGGATAGT TAATGATCAG CCCACTGACG CGTTGCGCGA GAAGATTGTG CACCGCCGCT TTACAGGCTT CGACGCCGCT TCGTTCTACC ATCGACACCA CCACGCTGGC ACCCAGTTGA TCGGCGCGAG ATTTAATCGC CGCGACAATT TGCGACGGCG CGTGCAGGGC CAGACTGGAG GTGGCAACGC CAATCAGCAA CGACTGTTTG CCCGCCAGTT GTTGTGCCAC GCGGTTGGGA ATGTAATTCA GCTCCGCCAT CGCCGCTTCC ACTTTTTCCC GCGTTTTCGC AGAAACGTGG CTGGCCTGGT TCACCACGCG GGAAACGGTC TGATAAGAGA CACCGGCATA CTCTGCGACA TCGTATAACG TTACTGGTTT CACATTCACC ACCCTGAATT GACTCTCTTC CGGGCGCTAT CATGCCATAC CGCGAAAGGT TTrGCGCCAr TCGATCTACG CCGGACGCAT CGTGGCCGCA AA

Sekwencja pBR 327

Pflml

CCAACCCTTG GCAGAACATA TCCATCGCGT CCGCCATCTC CAGCAGCCGC ACGCGGCGCA TCTCGGGCCG CGTTGCTGGC GTrτrTCCAr AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggat.acctg tccgcctttc TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGCTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA G.AAGGAC.ACGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC

183 598

3406

3456

3506

3556

3606

3656

3706

3756

3806

3856

3906

3956

4006

4056

4106

4156

4206

4256

4306

4356

4406

ATAGTTGCCT

ACCATCTGGC

CTCCAGATTT

AGTGGTCCTG

GGAAGCTAGA

CCATTGCTGC

TTCAGCTCCG

GTGCAAAAAA

AGTTGGCCGC

CTTACTGTCA

AACCAAGTCA

CGGCGTCAAC

CTCATCATTG

GCTGTTGAGA

CAGCATCTTT

CAAAATGCCG

CATACTCTTC

TCATGAGCGG

GTTCCGCGCA

TATTATCATG

GTCCC

C^C^^CGC^C^TG

ATCAGCAATA

CAACTTT?ATC

AGGCAACCTG

CGTCCCAACG

GCGGTTAOT

AGTCTΎATCA

TGCCATCCCGT

AC^C^CT^^C?A^^

GAAAACCT'TC

TCCACnTCGA

TACTTTCACC

CAAAAAAGGG

ΑΤΑΟΑΤΑΤΤΓ

CATTTCTCCT ^C^τΐfCCCTT

TGTTTCTATA

TAATTATACT

AATTCTCCAG

TTCCTCCATC

TTGTTCTTCT

CTTCAGTCGA

TTTTTTTTCT

TTTATTGTTA

CTΓGTCTGCG

CTTTTTTTAC

TTTGTGGCTA

TGTCATTCCC

CGCTΓTTCTG

AATACTTGTT

CTTCTTGAAG

GCATGTATTT

CACATTTCTA

CTAAACATCG

CCTCCTATAT

TTGCGACTCA

CTGGAAGGGC

TATT<CTATTA

TCGTTTGTTC

CTTTGTTTGG

GTTATCTGAT

TTCGATCTTT

TTTTATCCCT

TTTTTTATTT

GTGCTTGAGT

CTAGTCGAAT

CAACTTTCAC

TTTTTTATCT

TGTTAGCAAA

CTATTTACAT

CATTTATCAG

CTAAAAATAA

TTTTACTTTT

TCTΊΆTCATG

GGGTCGGGTT

CTTTCTCCCG

CCGGTCTCCT

ATTCTTGTTG

AACCT'TGTTG

TAACTGTT1C

CCCTCTTGTT

GTCAGTAGTA

GTCTAATTCT

GTGGGTACTC

TGTTCTTGTC ^,ΠTCCACCT'G

GGTTCTTACC ιc^cτcτc:cτ1i ίC{CCC(TTTCC(T(T (rTGMTACT

GCTTATTTTC

ACAMTAGGG !CC(ττcA<cc:ccc:

ACTTTTTTTC (plazmid pBR 327 opisano w Gene, 9, 287-305 (1980)).

Szczep E. coli RB 791 /p922 wprowadzono do wstępnej hodowli na noc w temperaturze 30°C przy mieszaniu 200 obr./minutę w środowisku L (Luria broth opisane w Molecular Cloning, A Laboratory Manual Sambrook, Fritsch Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-gie wydanie 1981) ze 100 mg/l ampicyliny. Z hodowli wstępnej nową fiolkę środowiska L zaszczepiono tak, aby początkowa D. O. (D.O. = gęstość optyczna o 600 nm; D.O. = 1 odpowiada 400-450 mg biomasy/litr) wyniosła 0,6. Po jednej godzinie oczekiwania hodowlę pobudzono 1 mM EPTC (izopropylo-|3-D-1-tiogalaktopiranozyd) i kontynuowano ją przez 3 godziny. Próbki zawiesiny bakterii odwirowano i z tak uzyskanego osadu bakterii sporządzono zawiesinę w buforze ekstrakcyjnym podanym niżej tak, że końcowa D.O. wyniosła 10, co odpowiadało 4,5 g biomasy/litr w chwili ekstrakcji.

Bufory ekstrakcyjne stosowane w tym przykładzie są następujące:

A. 0,8 M Arginina pH 8,0 skorygowane przez HCl w wodzie Milli-Q® (Millipore)

B. 5 M Chlorowodorek guanidyny w wodzie Milli-Q® bez korekty pH.

Ekstrakcję prowadzi się przez 1 godzinę w temperaturze 4°C przy lekkim mieszaniu mieszadłem magnetycznym.

Do pomiaru skuteczności ekstrakcji pobrano próbki równoważne 1 ml zawiesiny hodowli o D.O. wynoszącej 0,2 i odpowiednie osady bakterii otrzymane przez odwirowanie przy 5000 g w ciągu 10 minut osadzono na 16,5% żelu poliakryloamidowym po denaturacji SDS. Zawiesiny bakterii również odwirowano i ich supernatanty pozbawiono soli przez ultrafiltrację (urządzenie do filtracji Ultrafree-MC z progiem separacji 5000 Da Millipore) przed osadzeniem na żelu. Sam

183 598 żel wywołano przez Western biot, przy użyciu przeciwciał anty-IL-13 CHO i skwantyfikowano stosując Phosphorimager® (Molecular Dynamics). Przeciwciała anty-IL-13 CHO (Chinese Hamster Ovary) stosowane w tym przykładzie otrzymano przez immunizację królików'.

Stwierdzono w tym przykładzie, że ekstrakcja w obecności chlorowodorku guanidyny lub też argininy jest prawie całkowita dla postaci w pełni rozwiniętej z wydajnością ekstrakcji wyższą w dwóch przypadkach od 99%. Zauważono też, że w supernatancie wyekstrahowanym w obecności argininy nie pojawia się postać prekursora IL-13 w odróżnieniu od ekstraktu otrzymanego w obecności chlorowodorku guanidyny.

2) Hodowla w fermentorze

Szczep E. coli RB 791/p922 wprowadzono do środowiska L z 100 mg/litr ampicyliny i inkubowano w temperaturze 30°C, mieszając, aby utworzyć hodowlę wstępną. Objętość 100 ml kultury wstępnej służyła jako szczepionka do fermentora o całkowitej objętości 2,5 litra marki MBR. Hodowlę prowadzono w objętości 1,2 litra w środowisku, którego skład podaje się niżej i w warunkach określonych poniżej.

Środowisko fermentora - szczep E. coli RB 791/p922.

Skład podano na objętość końcową 1 litr, objętość szczepionki wyłącza się.

1. Rozpuścić w 700 ml wody Milli-Q®:

Składnik	Masa/litr	Składnik	Masa/litr
EDTA	1 g	KCl	5g
FeSO4,7H2O	45 mg	HY-SOY®	75 g
MgSO4, 7 H₂O	1,5 mg	L-Metionina	1,4 g
K2SO4	0,75 g	Tryptofan	1 g
CaCl2, 2H2O	32 mg	Mikroelementy*	2 ml
NaCl	1,45 g	Wyciąg z drożdży	10 g

Uzupełnić do 800 ml wodąMilli-Q® i wyjaławiać w autoklawie 30 minut w temperaturze 120°C.

2. Przesączyć przez 0,2 gm w 100 ml wody Mill--Q®:

Glicerol	15 g
K2HPO4	7,1 g

Stężenie glicerolu utrzymuje się 10-15 g/litr w czasie hodowli.

3. W chwili indukcji dodać:

IPTG	1 g
Kwas 6-ammo kapronowy	0,65 g
HY-SOY®	40 g
L-cysteina	0,3 g

Objętość tego dodatku nie włącza się do innych obliczeń. *Roztwory mikroelementów Stosuje się je w ilości 1 ml/litr.

Na końcowy 1 litr wody Milli-ę® rozpuścić w 800 ml:

183 598

	masa/litr		masa/litr
H3BO3	3 mg	ZnSO4, 7H₂O	13 mg
NaMoO4, 2H2O	4,8 mg	AlCl3, 6H2O	60 mg
MnSO4, HO	59 mg	KCr(SO4)2, 12H2O	6 mg
COCl2, 6H2O	23,8 mg	KJ (tuż przed użyciem)	60 mg
CuSO4, 5H2O	8,7 mg	NiSO4, 6H2O	2,6 mg

Dodać 100 ml stężonego HCl. Uzupełnić do 1000 ml wodą Milli-Q®.

Jednocześnie z uzyskaniem D.O. wynoszącej 58 wywołuje się ekspresję IL-13 przez dodanie 1 g/l IPTG i kontynuuje w ciągu 5 godzin.

Parametry hodowli w fermetorze były następujące: pH = 7,4 t = 30°C

PO2 = 5,33 kPa (40 mmHg) regulowane przez mieszanie z przepływem powietrza 1-3 litry/minutę.

Stosowane metody ekstrakcji i pomiar aktywności biologicznej są takie same, jak opisane w paragrafie 1 powyżej.

Stwierdzono, że ekstrakcja osadu bakterii otrzymanych w fermentorze a nie tylko w fiolce, w obecności chlorowodorku guanidyny lub też w obecności argininyjest prawie całkowita dla postaci w pełni rozwiniętej IL-13 z wydajnością ekstrakcji wyższą w dwóch przypadkach niż 97%.

Przykład II. Aktywność biologiczna tak wyekstrahowanej IL-13.

Ekstrakty otrzymane w obecności chlorowodorku guanidyny lub argininy w przykładzie I odsolono drogąultrafiltracji jak opisano powyżej. Po rozcieńczeniu uszeregowano je w obecności podklonu IL-13 zależącego od linii komórkowej B9. Aktywność IL-13 rozcieńczonych próbek pobudza wzrost komórek B9 i określono stężenie półproliferacji. Wzrost komórek przerwano po 3 godzinach kontaktu, dodając MTT [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo-2,5-difenylotetrazoliowy)] i mierzono spektrofotometrem absorbcję barwy niebieskiej wywołaną w 565 nm. Aktywność biologiczną IL-13 wyrażono w ng/ml w stosunku do wzorca IL-13 kalibrowanego wobec projektowanego wzorca międzynarodowego uzyskanego z hodowli IL-13 CHO otrzymanej przez immunizację królików według N. Vita. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983, 225, 2, 436-445.

Uzyskane wyniki znajdują się w tabeli II poniżej.

Tabela I

Próba na linii komórkowej B9	IL-13 w ng/ml	Aktywność biologiczna ng/ml	Aktywność biologiczna właściwa
Próbka kontrolna	500	500	100
Arginina	3200	1376	43
Guanidyna	4300	1098	25

Powyższe wyniki pokazują, że aktywność biologiczna właściwa ekstraktu z argininą, przed każdą inną operacją dalszego oczyszczania, jest wyższa niż ekstraktu z chlorowodorkiem guanidyny.

Przykład III. Ekstrakcja hGH periplazmatycznego z E. coli w obecności argininy z osadu komórek.

Szczep SEBR 1250 (EP-360641 i EP-356335) wprowadzono do hodowli wstępnej przez noc w temperaturze 37°C, mieszając przy 200 obrotach/minutę w środowisku L (Luria broth) ze 100 mg/l ampicyliny. Z kultury wstępnej zaszczepiono nową fiolkę środowiska L tak, żeby początkowa D.O. była 0,2. Po jednej godzinie oczekiwania hodowlę pobudzono 1 mM IPTG

183 598 i kontynuowano w ciągu 3 godzin. Próbki zawiesiny bakterii odwirowano i z tak uzyskanych osadów bakteryjnych sporządzono zawiesiny w buforach ekstrakcyjnych tak, aby końcowa D.O. była 10, co odpowiada 4,5 g biomasy/litr w chwili ekstrakcji.

Warunki ekstrakcji były następujące:

Czynnik dezorganizujący	pH	t	Czas trwania
Arginina 0,8 M	8,0	22°C	20 godzin
Arginina 0,8 M	8,0	4°C	20 godzin

Aby zmierzyć skuteczność ekstrakcji pobrano próbki równoważne 1 ml zawiesiny hodowli o D.O., wynoszącej 0,2 i odpowiednie osady bakterii uzyskane przez wirowanie przy 5000 g w ciągu 10 minut osadzono na 16,5% żelu poliakryloamidowym po denaturacji SDS. Zawiesiny bakterii również odwirowano i ich supernatanty osadzono na żelu. Sam żel wywołano przez Western biot przy użyciu przeciwciał anty-hGH i kwantyfikowano stosując Phosphorimager® (Molecular Dynamics). Używane przeciwciała anty-hGH otrzymano przez immunizację królików.

Analiza prążków otrzymanych przez Phosphorimager® pozwala na wniosek, że ekstrakcja periplazmatycznego hGH ludzkiego utworzonego u E. coli w obecności argininy jest skuteczna. W przykładzie tym wydajność ekstrakcji, wynoszącą co najmniej 60%, można osiągnąć w obecności 0,8 M argininy, przy pH 8,0, w temperaturze 22°C i 20 godzinach oczekiwania, a wydajność ekstrakcji wyższą od 80% można osiągnąć w obecności 0,8 M argininy, przy pH 8,0, w temperaturze 4°C i 20 godzinach oczekiwania.

hGH jest białkiem hydrofilowym, można więc wnioskować, że białka rekombinowane o bardzo różnym charakterze zakumulowane w periplazmie E. coli można zwyczajnie ekstrahować w obecności argininy.

Przykład IV. Ekstrakcja IL-13 periplazmatycznej z E. coli z fragmentów komórek w obecności argininy.

1) Hodowla w fermentorze

W przykładzie tym stosowano szczep E. coli TP 2339 (EP 360641 i EP 356335) przekształcony przez plazmid p922 otrzymany sposobami analogicznymijak opisane w przykładzie I.

Szczep E. coli TP 2339/p922 wprowadzono do środowiska L ze 100 mg/litr ampicyliny i inkubowano w temperaturze 30°C, mieszając, aby wytworzyć hodowlę wstępną. Objętość 100 ml tej hodowli wstępnej służyłajako szczepionka do fermentom o objętości całkowitej 2,5 litra marki MBR®. Hodowlę prowadzono w objętości 1,2 litra w środowisku i warunkach podanych niżej.

Środowisko do fermentora - szczep E. coli TP 2339/p922

Obliczone dla końcowej objętości 1,2 litra środowisko hodowli utworzono przez dodanie jednego litra fazy wyjałowionej w autoklawie i 0,1 litra fazy przesączonej, których składy opisano poniżej oraz 0,1 litra hodowli wstępnej określonej wyżej.

1) Faza wyjałowiona w autoklawie (1000 ml):

Rozpuścić w 900 ml wody Mini-Q®:

	masa/litr		masa/litr
Tricine	360 mg	KCl	5g
FeSO4, 7H2O	280 mg	Hy-Case (SF)®	25 g
CaCl2, 2H2O	6,7 mg	Wyciąg z drożdży	18 g
MgCl2, 6H2O	1,27 g	Mikroelementy*	1 ml
K2SO4	8,71 g	L-Arginina	1,5 g
NaCl	500 mg

183 598

Doprowadzić pH do 7,4 roztworem KOH, po czym uzupełnić do 1000 ml wodąMilli-Q®. Wyjaławiać 30 minut w autoklawie w temperaturze 120°C.

2) Faza przesączono (100 ml)

Sączyć sterylnie przez membranę 0,2 pm:

Glukoza	20 g
Glicerol	50 g
K2HPO4	5 g

Podczas hodowli utrzymuje się stężenie glukozy na poziomie 5-15 g/litr.

Jednocześnie z osiągnięciem D.O., wynoszącej 40 (około 16 g suchej masy/litr) wywołuje się ekspresję IL-13, dodając 1 g/l IPGG i kontynuuje się w ciągu 5 godzin.

Parametry hodowli były następujące: pH - 7,4 regulowane przez kOh i 3 N HCl, t = 37°C pO2 = 5 kPa regulowane mieszaniem przy przepływie powietrza 1-3 litrów/minutę.

2) Uzyskiwanie i rozdrabnianie materiału bakteryjnego

Jeden litr zawiesiny hodowli odwirowuje się 20 minut przy około 6400 g. Osad umieszcza się w takiej samej objętości buforu 10 mM Gris, 1 mM EDTA, 1 mg/litr pepstatyny przy pH 8, mieszając mieszadłem śmigłowym.

Rozdrabniania dokonuje się w prasie Manton-Gaulin pod ciśnieniem 70 mega · Pa w ciągu dwóch przejść. Taki materiał rozdrobniony można przechować w temperaturze -80°C do tego przykładu.

3) Ekstrakcja

Po rozmrożeniu pobiera się 5 ml rozdrobnionego materiału o D.O. wynoszącej 75 (30 g suchej masy/litr), po czym odwirowuje się 50 minut przy 23300 g.

Tak otrzymany osad umieszcza się w trzeciej części początkowej objętości 0,1 mM buforu Gris pH 7,0, po czym uzupełnia się do objętości początkowej roztworem, zawierającym argininę ,tak aby końcowe stężenie argininy było 2,5 M, a pH wynosiło 8,0.

W tym przykładzie do argininy dołączono pomocniczy detergent (Mecameg® [6-O-(N-heptylokarbamoilo)metylo-(alfa)-D-glukopiranozyl] o stężeniu końcowym 20 g/litr.

Tak utworzoną zawiesinę fragmentów komórek umieszcza się w temperaturze 4°C w pojemniku z mieszadłem obrotowym o 300 obrotach/minutę na 2 dni.

Zawiesinę następnie odwirowuje się ostatni raz w ciągu 50 minut przy 23300 g, przy czym supernatant stanowi oczekiwany ekstrakt.

4) Analizy biochemiczne i aktywności biologicznej

a) Oznaczenie białek całkowitych prowadzi się metodą „Protein Assay” z Bioradem®.

b) Stosuje się metodę oznaczania rekombinowanej IL-13 jak w przykładzie I.

Wydajność tak wyekstrahowanej IL-13.

Uzyskane wyniki opisano w następującej tabeli:

	W zawiesinie fragmentów komórek przed ekstrakcją	W supernatancie po ekstrakcji
Białka całkowite	324 pg/ml	108 pg/ml
IL-13 zrekombinowana	575 ng/ml	390 ng/ml

Stwierdzono w tym przykładzie, że ekstrakcja fragmentów komórek w obecności 2,5 M argininy i detergentu pomocniczego pozwala uzyskać wydajność ekstrakcji około 70%.

183 598

Przykład V. Ekspresja IL-13 w obecności argininy w środowisku hodowli.

Szczep E. coli RB 791/p922 hodowano w środowisku L ze 100 mg/litr ampicyliny w obecności różnych stężeń argininy. Indukcję wywołano 1 godzinę po zaszczepieniu, dodając 1 mM IPTG i kontynuowano hodowlę w ciągu 3 godzin.

Próbki osadu bakterii równoważne 1 ml zawiesiny hodowli o D.O., wynoszącej 0,2 i odpowiednie próbki supernatantu osadzono na żelu, wywołano i kwantyfikowano jak opisano wyżej. Wyniki podano w tabeli poniżej:

Próbka	Końcowa D.O. hodowli	IL-13 w ng/l D.O. 1
Próbka kontrolna	1,17	388
Arginina 2 g/l	1,24	455
Arginina 4 g/l	1,24	600
Arginina 8 g/l	1	720

Okazuje się, że w warunkach doświadczenia i rozpatrywanym systemie ekspresji:

- arginina zwiększa ekspresję periplazmatyczną IL-13 od 2 g/l, a znacznie od 4 g/l,

- rozwój bakterii jest spowolniony przy stężeniu 8 g/l,

- do tych stężeń arginina nie powoduje ubytku IL-13 w supernatancie.

Zaletą sposobu ekstrakcji z argininą według wynalazku jest umożliwienie stosowania ekstraktów białekjako takich lub przy minimalnej obróbce w testach aktywności biologicznej.

To uproszczenie metody ekstrakcji przynosi korzyści zarówno w produkcji przemysłowej rekombinowanych białek periplazmatycznych jak przy odsiewaniu przez oznaczanie aktywności biologicznej na skalę laboratoryjną odnośnie np. białek zmutowanych.

W odróżnieniu od chlorowodorku guanidyny często stosowanego jako środek do ekstrakcji arginina nie jest agresywna wobec materiałów stosowanych w przemyśle zwłaszcza stali. Z drugiej strony arginina nie jest czynnikiem skażającym, nie wymaga więc kosztownej obróbki ścieków.

Korzyść z ekspresji białka periplazmatycznego w obecności argininy w stężeniu co najmniej równym 2 g/litr, a w szczególności w stężeniach 2-10 g/litr w środowisku hodowli wyraża się zwiększeniem wydajności wydzielanego białka zrekombinowanego otrzymanego in vivo.

183 598

SPIS SEKWENCJI (1) Informacja ogólna:

(i) Składający:

(A) Nazwa: SANOFI (B) Ulica: 32-34 ulica Marbeuf (C) Miasto: Paryż (e) Kraj: Francja (f) Kod pocztowy: 75008 (G) Telefon: 53774131 (H) Telefaks: 53774216 (ii) Tytuł wynalazku: Sposób ekstrakcji białek periplazmatycznych z drobnoustrojów prokariotycznych w obecności argininy (iii) Liczba sekwencji: 1 (iv) Postać czytelna dla komputera (A) Typ nośnika: floppy disk (b) Komputer: IBM PC compatible (c) System operacyjny: PC-DoS/MS-DOS (d) Oprogramowanie: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25 (OEB)

2) Informacja oonośnieSEQ ID NR: t:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 4410 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Liczba nici: pojedyncza (D) Konfiguracja: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomu) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NR: 1:

183 598 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID Ni.: 1:

rCGACTCGGG ΤΤΌΑΟ^ΑΤ CAGACTAGA^G TTAAACGAGA AACTAAAAGG ATGTCGAlTG 60

CACGGGCCAC CAATGCGGCT CCCCGCAGGC hGCGCCAC(^GG AACCCΆΆCCΆ TCCC^^C^C^C^(CC^A 110

CGGCCGAAAG CACTGCATAA TTCGTCTCGC TCCAAGCGCA CC^CC^C^CCTCC ασ^ΤΑΙΤΈΓ 180

ΤΤΤΤΌ^^ ACATCATAAC CCTTCTGCCA AATATTCTGA ΑΛΑΤΑΚ^ TTCGAGCTGA 220 σΤ^Ήϋ^ CTTATATTAC ATCGATAGCΑ TATAATGTGT GGGATTCGOA GCCGGTAACC 330

ATTTCACACA CΓTTTTGGGΑ AAGAAGGAGA TATAACTATG AAAAAAGAGG TGGCCΆTAGC 36O

TGCCGTΑACT ACGGGGCCAT TGTGTGCCTG CGCCTTCGCT GΑCGGCGCGC CTCCCAGTAC 420

TΑGGGTGAΑC GAGCTCATTG AGGAGCTGΆA CAGlACATCA CCAGAACGAG AGGCTCCGCT 480

GTΑCAATΑCG ΚΑΛ^σΤΙΑ GCAGCATCAT CCTCACAGAC GGCATGTAlT GTGGCACCCT 540

CCAA'CGGGTG ATCAlCGAGT GAΑCGTCGAC TGCCATlGAG AATGACCGAG aGATG/TTGA 600 σΟ^ΉσΆσ CCGGACAAGG TGTGAGGTGΑ GCGGAGTTGC A^^CATGCTr TACCGAGAGl 660

GAAAATGΑAG ΆΓGGCCCAΆT ATGrTTAGGT CCTGCTCATACGTTTTTTAG ATATTCTTAC -J20

CGACGCACGC TTCAACTGAA ACTACGTTAG CATlACT'rATτGCCΆTGCCG CCTCTTAACA 78O

AGCCCCATTC GAAGCTGA(Gr TΑΑCTΑGTGC CACCGCTGAG CCAATAACTA CCAGAACCCG

TGG^(^(^TCT ^CO^C^lCr TCAGΑG<CTΓT TTA(^<^'^(^/GTC GCCAΑCAACT ^(0X3^ 9(^0

TACCAKGCTA ΑCCCCΑATCA ^^^GTC GTGGCTCCAGAACGTGAGGA AAGCA'ATTTG 96O

TΑTATGAΑCT TTTGCTAAAC ATCTTAGTTG ACAGmCC?^GC^(C GCTGGGACAT AAΆTCACCTl 1020

AACTAAAGGA ATTGGCAATA ATAATTTTTT CACCCTGAAA ATACACCTTT AlAAAAGGCA 1080

CAATAGCTCC CTTAAATTGT lAC^rTTAAT CAGCCCGACCTACGAGΆGCT TGTACTGAAA ll40

AGCTTGATAC CGATA<GrTGC cGCCTCATTC kCiCAAGCCIC TGCG^^^ AAAAACCGAG 1200

TATTCGGTCG CTGACGCTTG CTCCGAΆACl AAAACCCCΆC ΊTGCCGCC.TA GCTACCCCGC l^^O

AGCAAAATGT GGTAACCCAC GCGTGCCTAA TGAdTGAGCT AAACACACAT AATATCGCT^,T 1320

GGCTCACTGC CCGCAGTCGA GTCGGGAAAC CT(G^(^t^T(^CCC AAGCGGCATT AATCAAACGC l^^^O

CAACCCCCGG CGTCACCGCC ATAGCGTATT GGGCGCCAGG GGAG^rTATC TATTAAlCGl 1140

TGACACGCCG AACAGATGAT TGGCCTTCAC CG<^C^^T(C<^C^C^CC TTGAGAGAGT GGGAGGTACC 150

ΆACCACGCTG GATTGCCCCA GCACCCGATT ATAATCrΠATCACGCΆrGGrr AlGGCCGCGA 11^^0

ATAACATGAG CTGACGTCCG TATCGTCGTA TAAAAATAAAGCACTGTACG CCACGAACGC 1160

CAGCCCGGAC TCGΆAAATGG CGCGCATTGC GCCCAGCGCC AAGCGGAACG TC^^G^AC^^ 1680

CATCCGAGTG GCTACGTTGC CCTCATTCAG CAΓTTCCATσGGGTCΆTGCA ΛΑΙ^^σΑ 1?4θ

GCCl<CACCAG TCGCCTTCCC GTTCCGGTAT CGGCTGAAAT TTClTGCGGA TTGAGATATT l800

ATGCCAGCCA GCCAGACGGA GACGGGGCGA GACAGAGllC AAATGGCCCG CCATAC.TCGC 11^^0

CATGGGGTGG TGACCCAATC CGACCAGATG CTCCACGCCC Λ^Τσ^ΤΑ CCGACTAGAG 1920

GGAGAAAlTA lAACTGATGl TGCGTΆGCAC GTCAAAGACA TGCAAGAAAT AACGCCGGAA 198O

ATTACTCGAG GCAGC^TTCCA CACGAATGCC ATCCTCGGCA TCCAGCGGGT AlGTAAAGGT 2200

CAGCCCA^TG AGGCGTAGCG CGTCAA(ClAT GTGCACCGCC GGCGTAlGAG CCTGGC.lCCC 2200

CGTTCGGTCT lCClTCCACl CGACCACGCT GGCACCCACA TGGTCGCCCC GClCTTTGTT 2160

CCCCCGGACA ATTTGCCTGG CCCCCTCCAG GGCCAGACTG GCACGGCCGA CCCCGATAGA 2220

CAACCA<CACT TACCCCCCCA ΆATΆTACTGC CACGCGCdTG GGCTTGCGAT TACACGGCGC 2220

GATCCCCGCT TCCACTTTAT σσ^ΟσΤΑΤΤ CGCAGAAACG TTGCCACCCC GGGTGGACCA 2340

GGCCGTTTCC GACTCATTTC AGAσισσCCσ ATACTCTGCG AAGTGCGTlA AAGGTAAGGG 2200

ATTCACATTC AGCTCCCTGA ATTGACTCTC TTACCCCCGC TATrACC-GCG Τ-ΑΙΟ^ΑΤΑ 2266

CCTGTTGGGC σATTσCATGT AσcσCCCAσC CATCGTGGCC GCCAAlCCTA CcCTGGCAGC 2520

TCATATGCTT σCCGTσσCGσ ATCTCCAGCA GCCGCACGCG Ο^σίΑσΑσ GGCCGCGCTΆ 2080

GTG^^TTrA TCCATlGCCT CCGCCCCGCT GACGAGAAGA AACAAAATAG AAGGTACACT 22ó^łiO

183 598

CAGAGGTCGA GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTTCCCCC TCCAACCTCC 2700 ATAGTGACAT CTCCTTTTAA GACCCTGCCG CTTACCGGAT AAATTTTCGC CTTTTTTCCT 2760 TACGGAAGAG TGGCGCTTTA TAAATGTTCA CGATCTAGGT AATTCAATTC GCTTTAAGTC 2820 GTTCGATCCA AGCTTTTCTG TCTCAAACGG CCCCCCTCTC AGGCCGGCCC CTCCCGATTA 2880 TACGGTAACT GTAGTCTCGA TCCCAGCCCG TCAACGAGAC AATTATCGCC AGTCGGCGGA 2940 CACGCTCGTA GAAGGATTAG AAGAGAGCGG TCTGTAGGAG GTGCTACAGA GGTCATGMG 3000 TGGTGGAATC GATGAGGATA AGATGGGGGG .AAGGTATTTC GTATCTGCGC TCTGCTGAAG 300^0 AAGTTTGAAT TCGGAAAAAG ACTTGGTGCC TCTTGCTCCG GCA.AAAAA.GA CAGACCTTGT 3120 AGCTTTTTTT TTTTTGTTTG CGAGCGGCGG GTCCCGCGCG GAAAAAAAGC AACTCAAGAA 3^80 GATCCTCTGA TCTTTTTTAA GGCGCCTGGA GCTCAGTGGA ACiGC^i^iAAC^CC ACCTTCCAGGG 3240 ATTTTCGTAA TGAGATTATA AAAAAGGGTC TTCACCTAGA TCCTCTTAAA TTAAAAATGA 31300 AGTTCTGAAT AAATCTAAAG TATATGTGAG TAAGCTTCCT CTGACAGGTA CCMTCGACTA 333^0 GTCAGTGAGG CACCTATATC AGAGATCTGT CTGTTTACTT CATCCATAGT TGCCTGACTC 3420 AAATCCTCCC AGATAACTAA TATAACCGGG GGCTTAAAGT CTGGCCCAGG TGCTGCAATG 3480 ATGCAGTGAG ACACACGCTA AACGGATCCA GATTTGTCGG CAATAAACCA GCCAGCCGGA 3540 AGGGCCGAGC GTAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATACGACT CCATCCAGTC TATTAATTCT 3600 TCCCGGGGAG ATAGAGTAAG TAGTTAGACA CTTAATACTT TGCGCAACCT TTTTGCCATT 3660 TCTGCAGTCA TCCTCGTGTA ACGCCCCTCC TTTGGTATGG CTCCATTAAG CTCCGGTCCC 3720 CAACGATCAA TGTGAGTTAA ATGATACACA ATTCCGTGTA AAAAAGCGCC TAGCTCCTTC 3780 GCTACTCCCA TCCTTGTCAG AACTGACCTG GACGAACTCT TATCACTCAT (GTTCATCCCA 3840 GTACTGAGTA ATTATCTTAA TGTCATGCCG TACCTAAGAT GCTTTTATCT GACTGCTCAG 3900 TAATCAACAA ACCAATTCTG AGAATGCTGT GTCAGCACGC CGACTTGCTC TTGAAAGGCG 3960 TAAAAAAGCC ATAATATCGT GACGAATGCA GGAACTTTAA AACCGCTCAT CATTCGAAAA 4020 ACTTCTCACG GGAGAAAACT ATAAACGATC TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATCCGA 4θ8θ ACCAATCGTC AAAAAAAATG ATATTCAGTC TCTTTTACTT TCACAAGCCT TTATCGCTGA 4l4O GCAAAAACAG GAAGGCAAAA TCAAGCAAAA AAGGGAATAA GGCTGACACG GAAATCTTGA 4200 ATGATCATAA TCCTTCTCTC TCAATATTAT TGAAGCATTT ATAAGGCGTTA TTGTATAATG 4260 AGCCGATAAA TATTTGAATG TATTTGCAAA AATAAACAAA TACGGCGTTCC GCGCAACATT 4320 CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTCTAAGAA ACCATTATTA TCATGACATT AACCTATAAA 4380 AATAGGCGTA TCACGAGGTA CCTTCCTCCC 4410

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Buforowy roztwór do ekstrakcji białek periplazmatycznych, znamienny tym, że jako podstawowy czynnik aktywny zawiera argininę.
2. Sposób ekstrakcji białka periplazmatycznego, znamienny tym, że hoduje się organizm prokariotyczny stransformowany wektorem ekspresji zawierającym gen kodujący wspomniane białko i środki ekspresji w periplazmie tego drobnoustroju, poddaje się otrzymaną hodowlę wirowaniu lub mikrofiltracji do otrzymania osadu komórek, zawiesza się otrzymany osad komórek w roztworze buforu zawierającym jako zasadniczy czynnik aktywny argininę, do wytworzenia zawiesiny, odwirowuje się uzyskaną zawiesinę do wytworzenia nadsączu, i z tak otrzymanego nadsączu odzyskuje się poszukiwane białko.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że roztwór buforu, jest wodnym roztworem zasadowym o stężeniu argininy równym co najmniej 0,4 M.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wodny roztwór zasadowy argininy jest pomiędzy 0,4 M a 0,8 M.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że poszukiwanym białkiem jest hGH lub IL-13.
6. Sposób ekstrakcji białka periplazmatycznego, znamienny tym, że hoduje się organizm prokariotyczny stransformowany wektorem ekspresji zawierającym gen kodujący wspomniane białko i środkami do jego ekspresji w periplazmie drobnoustroju, poddaje się otrzymanąhodowlę wirowaniu lub mikrofiltracji do otrzymania osadu komórek, otrzymany osad komórek poddaje się lizie, a następnie wiruje się lizat do wytworzenia osadu debrytu komórkowego, zawiesza się osad debrytu komórkowego w buforowym roztworze do ekstrakcj i białek periplazmatycznych, zawierającym jako podstawowy czynnik aktywny argininę, do wytworzenia zawiesiny, odwirowuje się otrzymaną zawiesinę do wytworzenia nadsączu i odzyskuje się poszukiwane białko z nadsączu.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że roztwór buforu, jest wodnym roztworem zasadowym o stężeniu argininy równym co najmniej 0,4 M.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wodny roztwór zasadowy argininyjest pomiędzy 0,4 M a 0,8 M.
9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że poszukiwanym białkiem jest hGH lub IL-13.

Niniejszy wynalazek dotyczy buforowego roztworu i sposobu ekstrakcji białka. Wynalazek dotyczy zwłaszcza ekstrakcji białek rekombinowanych wytwarzanych przez drobnoustroje prokariotyczne w szczególności przez E. coli.

Przy produkcji białek poszukiwanych, takichjak np. insulina, interleukiny, hormony wzrostu itd. coraz częściej odwołuje się do metod inżynierii genetycznej.

Zazwyczaj drobnoustroje przekształca się wektorem ekspresji, zawierającym gen kodujący pożądane białko i czynniki potrzebne do jego ekspresji, takiejak sygnały regulacyjne. Następnie drobnoustrój hoduje się we właściwym środowisku i według odpowiednich parametrów hodowli, a po osiągnięciu wystarczającej liczby komórek drobnoustrojów dodanie induktora wywołuje fazę zwaną ekspresją, podczas której poszukiwane białko produkuje się w dużej ilości i akumuluje. W końcu hodowli oddziela się zawiesinę komórek od środowiska hodowli np. na drodze wirowania lub mikrofiltracji, po czym poddaje się procesowi ekstrakcji, który często zaczyna się od operacji dezintegracji ścianek drobnoustrojów.

183 598

Ekspresja genu kodującego białko pożądane w drobnoustrojach prokariotycznych może być cytoplazmatyczna, periplazmatyczna lub wydzielnicza zależnie od charakteru czynników ekspresji stosowanych ze wspomnianym genem (promotor, czynnik terminujący, miejsce związania rybosomów, peptyd sygnałowy itd).

Ekspresja cytoplazmatyczna pozwala otrzymać duże ilości białek. Jednakże przed ekstrakcją białek pożądanych konieczne jest dla białek, zawierających jeden lub kilka mostków disulfidowych wykonanie etapu denaturacji/renaturacji, który jest etapem ciężkim i delikatnym w czasie produkcji na skalę przemysłową. Etap denaturacji/renaturacji prowadzi się według procedur klasycznych dobrze znanych fachowcowi, przy użyciu czynnika denaturacji w obecności środka redukującego i następnie warunków renaturacji obejmujących zwłaszcza kontrolę utleniania redukcji w roztworze. Spośród stosowanych czynników denaturacji trzeba zwłaszcza wymienić chlorowodorek guanidyny, który zaproponowano w sposobie otrzymywania ludzkiej interleukiny. W tym celu można odwołać się np. do dokumentu EP-A2-0145390.

Systemy ekspresji wydzielniczej, w których białko poszukiwane znajduje się w środowisku hodowli w sposób czynny są mało lub nie są wcale stosowane przy bakteriach Gram ujemnych ze względu na ich małą wydajność. Trzeba tu zaznaczyć, że środowisko hodowli bakterii o dużej gęstości w bioreaktorze nie jest idealnym miejscem dla wrażliwych białek rekombinowanych z powodu np. zagrożenia denaturacją międzyfazową.

Ekspresja periplazmatyczna pozwala otrzymać bezpośrednio białka rekombinowane w zasadzie dokładnie sfałdowane w chronionej przestrzeni środowiska i dlatego stanowi rozsądny wybór w celu otrzymania białek, zwłaszcza białek nie glikozylowanych. W tym przypadku nie trzeba więc poddawać białek etapowi denaturacji/renaturacji.

Metodami dezintegracji komórek zwykle stosowanymi w tej dziedzinie sąnp. liza komórek na drodze rozcierania lub nacisku mechanicznego (French Pressure Cell, młyn kulowy), liza chemiczna lub liza enzymatyczna, szok osmotyczny i działanie czynników dezorganizujących lub detergentów. Metody te dezintegrują większość błon komórkowych, wśród nich błony plazmatyczne i błony retikulum endoplazmatycznego, tworząc homogeniczną zawiesinę fragmentów komórek. Charakter osadu fragmentów komórek, który można zebrać zwykle po odwirowaniu (jądra, szkielety komórek, mitochondria, lizosomy, rybosomy, makrocząsteczki itd) zależy w szczególności od czasu i prędkości wirowania (10 minut przy 1000 g do 3 godzin przy 150 000 g).

Trudności napotykane podczas operacji ekstrakcji zmieniają się zależnie od typu ekspresji i użytych metod ekstrakcji i należą do nich zwłaszcza:

- straty wydajności białka rekombinowanego,

- straty aktywności biologicznej białka rekombinowanego,

- degradacja proteolityczna białka rekombinowanego,

- toksyczność czynników ekstrakcyjnych i konieczna kontrola ich usunięcia,

- trudności zastosowania przemysłowego,

- mieszanie białek periplazmatycznych z białkami cytoplazmatycznymi.

Ponadto, gdy produkowane białka poszukiwane są hydrofobowe lub naładowane, mogą się łączyć ze składnikami komórkowymi, które same są hydrofobowe lub naładowane, co czyni ekstrakcję szczególnie trudną.

Produkcja przemysłowa rekombinowanych białek poszukiwanych na drodze inżynierii genetycznej stanowi wielką szansę, ale wymaga dopracowania metod ekstrakcji, nie wykazujących lub minimalizujących powyższe niedogodności.

Istotnie ważne jest nie tylko produkowanie dużych ilości białek poszukiwanych, lecz również trzeba, aby te białka nie były skażone czynnikami ekstrakcji i aby zachowywały całą swoją aktywność biologiczną. Zaproponowano w tym celu różne sposoby szczególnie do ekstrakcji oddzielenia interleukiny-2.

Dokument EP-A2-0145390 opisuje sposób otrzymywania ludzkiej interleukiny-2 (IL-2) nie glikozylowanej o aktywności właściwej wyższej od 104 U/mg, który obejmuje etap rozdzie4

183 598 lania przez chromatografię na kolumnie, aby wyekstrahować IL-2. Sposób ten również zawiera etap denaturacji za pomocą chlorowodorku guanidyny.

Dokument EP-A2-0147819 proponuje sposób otrzymania interleukiny-2 rekombinowanej homogenicznej i czystej. Sposób ten polega na hodowli drobnoustrojów przekształconych za pomocą wektora ekspresji, zawierającego gen kodujący interleukinę-2, na wywołaniu lizy komórek, uzyskaniu fragmentów komórek, ekstrakcji IL-2 przez przemycie fragmentów komórek odpowiednim roztworem myjącym, następnie na oczyszczeniu przez chromatografię roztworu z przemycia. Stosowane roztwory myjące mogą zawierać sól, takąjak chlorek sodu lub chlorowodorek guanidyny lub detergent, tak jak np. produkt znany pod nazwą handlową „Triton XR-100”.

Według zalecanego wariantu należy stosować kolejno trzy roztwory myjące, a mianowicie: roztwór myjący, zawierający chlorek sodu, roztwór myjący, zawierający detergent i roztwór myjący, zawierający chlorowodorek guanidyny.

Dokument EP-A1-0337243 opisuje sposób oczyszczania ludzkiej interleukiny-2, który stosuje układ dwóch kolumn do chromatografii cieczowej z odwróconą fazą. Przed etapem oczyszczania przez chromatografię nierozpuszczalną frakcję lizatu komórek bakteryjnych ekstrahuje się roztworem, zawierającym chlorowodorek guanidyny w celu otrzymania ekstraktu bakterii, który następnie rozcieńcza się buforem bez chlorowodorku guanidyny, po czym chromatografuje się, stosując jako eluent gradient acetonitrylu.

Znany jest też, zjapońskiego opisu patentowego JP 62044198 sposób otrzymywania białka przez hodowlę E. coli w obecności argininy.

Obecnie znaleziono w sposób nieoczekiwany, że ekstrakcję białka poszukiwanego wytworzonego przez drobnoustrój prokariotyczny przekształcony przez wektor ekspresji, obejmujący gen kodujący białko poszukiwane i czynniki tej ekspresji, takie jak sygnały regulacyjne konieczne do jego ekspresji periplazmatycznej, można wykonać, sporządzając zawiesinę osadu komórek lub fragmentów komórek drobnoustroju, pochodzącego z hodowli wymienionego drobnoustroju w roztworze buforu, przy czym wymieniony roztwór zawiera korzystnie argininę, która może występować w postaci L i/lub D.