PL183703B1 - Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegający na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usuwaniu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych frakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu, znamienny tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthestrifoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodąi rozcieńczonym roztworemalkalicznym, natomiastsurowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, znajdujący zastosowanie w produkcji preparatów działających na układ odpornościowy człowieka.

Z artykułu A.Sendl, N.Mulinacci, F.F.Vincieri, H.Wagner pt. „Anti Inflammatory and Immunologically Active polysaccharides of Sedum telephium”, opublikowanego w czasopiśmie „Phytochemistry”, 34(5), s. 1357-1362,1993, znany jest sposób wytwarzania immunologicznie aktywnych polisacharydów z surowca roślinnego w postaci Sedum telephium. Zamrożone, liofilizowane i sproszkowane liście Sedum telephium ekstrahuje się eterem naftowym i metanolem, a oczyszczone ziele poddaje się ekstrakcji wodnej. Wodny ekstrakt przesącza się, oddziela przesącz i przy użyciu etanolu wytrąca się dwie surowe frakcje polisacharydowe. Jedną z nich oczyszcza się, otrzymując w efekcie żądany produkt końcowy, natomiast pozostałe po ekstrakcji wodnej ziele ekstrahuje się 0,5 M roztworem wodorotlenku sodowego, maceruje, odsącza i do roztworu wkrapla etanol. Wytrącony osad odwirowuje się, rozpuszcza w wodzie i usuwa z niego białka. Po odzieleniu białek wy trąca się przy użyciu 0,5 objętości etanolu surową frakcję polisacharydową, która po oczyszczeniu daje drugi produkt końcowy. Wytworzone znanym sposobem preparaty wykazują aktywność immunologiczną i mają właściwości przeciwzapalne. Pierwszy z preparatów przy stężeniu 1-10² mg/cm³ powoduje podwyższenie stopnia fagocytozy o około 80%, w dawce 10 mg/kg powoduje znaczne zwiększenie szybkości eliminacji cząstek węgla z osocza krwi, a przy stężeniu 10 i 3 mg/kg wykazuje bardzo silne działanie przeciwzapalne. Oba preparaty stymulująaktywność makrofagów, powodując wzrost wydzielania czynnika nekrotycznego guzów (TNF-alfa) o 4000 jednostek.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegającego na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usunięciu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych frakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu. Istota wynalazku polega na tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthes trifoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodą i rozcieńczonym roztworem alkalicznym, natomiast surowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem.

Nowy surowiec użyty do wytwarzania immunomodulatorajest znacznie bogatszy w związki polisacharydowe niż surowiec znany. Surowe frakcje polisacharydowe w sposobie według wynalazku stanow ią3,2% suchej masy, to jest ponad trzykrotnie więcej niż w sposobie znanym. Surowiec w postaci Menyanthes trifoliata nie wymaga liofilizacji, jest stosowany w postaci wysuszonego na powietrzu ziela i spełnia warunki farmakopealne. Ekstrakcja surowca metanolem jest mniej skomplikowana niż ekstrakcja dwoma rozpuszczalnikami, eterem naftowym i metanolem. Wytrącanie polisacharydów z roztworów wodnych przy użyciu acetonu jest tańsze niż używanie do tego celu etanolu. Ekstrakcja rozcieńczonym roztworem alkalicznym pozwoliła na wytworzenie preparatów o działaniu immunostymulującym, natomiast w sposobie znanym, przy ekstrakcji 0,5 M roztworem otrzymuje się preparaty o działaniu immunosupresorowym.

183 703

Wynalazek jest objaśniony w przykładzie realizacji sposobu wytwarzania immunomodulatora z rośliny Menyanthes trifoliata.

Przykład. 1000 g suchego ziela Menyanthes trifoliata zalewa się 2,5 dm³ metanolu i pozostawia w temperaturze pokojowej na około 24 godziny. Następnie roztwór metanolowy dekantaje się, a ziele zalewa ponownie metanolem w ten sam sposób jak uprzednio, powtarzając tę czynność dwukrotnie. Połączone wyciągi metanolowe odparowuje się, a odmyte metanolem ziele zalewa 1,5 dm³ destylowanej wody o temperaturze 70°C i pozostawia na sześć godzin w temperaturze pokojowej, dokładnie mieszając co pewien czas. Operację powyższą powtarza się trzykrotnie.

Połączone wyciągi wodne w ilości 4,5 dm3 zagęszcza się pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości około 0,7 dm3, uzyskując ekstrakt wodny, a pozostałe po ekstrakcji wodnej ziele zadaje się 1,5 dm3 0,1 M roztworu wodorotlenku sodowego, przetrzymując całość przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając. Operację powtarza się czterokrotnie, uzyskując około 6 dm3 słabo alkalicznego wyciągu. Wyciąg zagęszcza się pod zmiejszonym ciśnieniem, w temperaturze nie przekraczającej 45°C, do objętości około 2 dm3. Otrzymany ekstrakt zadaje się 0,15 dm3 roztworu kwasu trichlorooctowego o stężeniu 15% i odwirowuje w celu usunięcia wytrąconych białek, a do roztworu dodaje 0,9 dm³ acetonu, odsącza osad, ponownie rozpuszcza w wodzie i wytrąca acetonem. Uzyskuje się 32,2 g surowej frakcji, którą poddaje się dializie, używając worka dializacyjnego oddzielającego substancje o masie cząsteczkowej 3500. Pozostały wewnątrz worka dializacyjnego roztwór odparowuje się, uzyskując 1,8 g preparatu, który rozdziela się na kolumnie chromatograficznej z wypełnieniem Biogel P-10 na dwa produkty końcowe, wykazujące właściwości immunomodulujące. Jeden produkt, nazwany umownie produktem B-4, badany metodą chromatografii kolumnowej na żelu Sephadex G-50 wykazuje pik odpowiadający m.cz.: 1,2 · 10⁴ D, a drugi produkt, zwany umownie B-5, wykazuje pik odpowiadający m.cz.: 0,68 · 104D. Po hydrolizie produktu za pomocą kwasu solnego i zobojętnieniu wykonano analizę chromatograficzną cienkowarstwową i bibułową. Wskazuje ona, że w skład badanych frakcji B-4 i B-5 wchodzą następujące cukry: glukoza, galaktoza, arabinoza, sorboza i kwas uranowy. Wyniki analizy elementarnej są zgodne z przewidywanymi dla frakcji polisacharydowych, zawierających grupy aminowe i siarczanowe. Widmo IR wskazuje na charakter cukrowy preparatu oraz na obecność ugrupowań COO, CONH i S=O. Za pomocą analizy spektrofotometrycznej określono ilościowo zawartość cukrów obojętnych (~ 30%), aminocukrów (~ 2%) i kwasów uranowych (~ 7%).

Badania aktywności biologicznej wytworzonych preparatów przeprowadzono oceniając ich wpływ na proliferację ludzkich limfocytów w hodowlach in vitro oraz na ekspresję wybranych antygenów na powierzchni limfocytów ludzkich. Preparaty powodująobniżenie potencjału proliferacyjnego hodowli ludzkich limfocytów o około 40% przy dawce 100 pg/cm3 pożywki. Wskazuje to na znaczne właściwości immunosupresyjne preparatów. Preparaty powodują wzrost ekspresji antygenów zróżnicowania powierzchni ludzkich limfocytów stymulowanych za pomocą PHA w porównaniu z hodowlą zawierającą PHA ale bez preparatów polisacharydowych.

Wyniki te świadczą o wpływie badanych preparatów na niektóre funkcje odpornościowe układu limfocytów. Preparat B-5 w dawce 100 ^ig/cnr’ podwyższa ekspresję antygenów CD4 o około 30% w porównaniu z hodowlą kontrolną, a preparat B-4 w dawce 150 pg/cm3 podwyższa ekspresję antygenów CD22 o około 25% w porównaniu z hodowląkontrolną. Oba preparaty podwyższają również o około 20% ekspresję na powierzchni limfocytów. Uzyskane wyniki w pełni wskazująna to, że preparaty B-4, B-5 zawierają składniki, które hamują proliferację ludzkich limfocytów in vitro indukowanych standardowym mitogenem PHA i równocześnie podwyższają różnicowanie limfocytów T, B i NK oraz powodują wzrost ekspresji receptorów dla interleukiny-2. Preparat B-5 powoduje prawie trzykrotny wzrost liczby komórek wykrywanych przez przeciwciała rozpoznające limfocyty NK. PreparatB-5 wzmaga o blisko 50% aktywność wolnorodnikową ludzkich granulocytów in vitro w aspekcie generowania i uwalniania obronnych rodników ponadtlenkowych.

Preparaty o takich właściwościach mogąbyć przydatne w immunologii przeciwnowotworowej.

183 703

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegający na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usuwaniu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych frakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu, znamienny tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthes trifoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodą i rozcieńczonym roztworem alkalicznym, natomiast surowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem.