PL183704B1 - Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegający na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usuwaniu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych frakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu, znamienny tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthes trifoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodą, rozcieńczonym roztworem alkalicznym, roztworem kwasu octowego i 0,5-1,5 M roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego, natomiastsurowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, znajdujący zastosowanie w produkcji preparatów działających na układ odpornościowy człowieka.

Z artykułu A.Sendl, N.Mulinacci, F.F.Vincieri, H.Wagner pt. „Anti Inflammatory and Immunologically Active polysaccharides of Sedum telephium”, opublikowanego w czasopiśmie „Phytochemistry”, 34(5), s. 1357-1362,1993, znany jest sposób wytwarzania immunologicznie aktywnych polisacharydów z surowca roślinnego w postaci Sedum telephium. Zamrożone, liofilizowane i sproszkowane liście Sedum telephium ekstrahuje się eterem naftowym i metanolem, a oczyszczone ziele poddaje się ekstrakcji wodnej. Wodny ekstrakt przesącza się, oddziela przesącz i przy użyciu etanolu wytrąca się dwie surowe trakcje polisacharydowe. Jedną z nich oczyszcza się, otrzymując w efekcie żądany produkt końcowy, natomiast pozostałe po ekstrakcji wodnej ziele ekstrahuje się 0,5 M roztworem wodorotlenku sodowego, maceruje, odsącza i do roztworu wkrapla etanol. Wytrącony osad odwirowuje się, rozpuszcza w wodzie i usuwa z niego białka. Po oddzieleniu białek wytrąca się przy użyciu 0,5 objętości etanolu surową frakcję polisacharydową, która po oczyszczeniu daje drugi produkt końcowy. Wytworzone znanym sposobem preparaty wykazują alktywność immunologiczną i mają właściwości przeciwzapalne.

Pierwszy z preparatów przy stężeniu 1-10²mg/cm³ powoduje podwyższenie stopnia fagocytozy o około 80%, w dawce 10 mg/kg powoduje znaczne zwiększenie szybkości eliminacji cząstek węgla z osocza krwi, a przy stężeniu 10 i 3 mg/kg wykazuje bardzo silne działanie przeciwzapalne. Oba preparaty stymulują alktywność makrofagów, powodując wzrost wydzielania czynnika nekrotycznego guzów (TNF-alfa) o 4000 jednostek.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegającego na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usunięciu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych frakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu. Istota wynalazku polega na tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthes trifoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodą, rozcieńczonym roztworem alkalicznym, roztworem kwasu octowego i 0,5-1,5 M roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego, natomiast surowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem.

Nowy surowiec użyty do wytwarzania immunomodulatorajest znacznie bogatszy w związki polisacharydowe niż surowiec znany. Surowe frakcje polisacharydowe w sposobie według wynalazku stanowią 2,8% suchej masy, natomiast w sposobie znanym me wydziela się frakcji polisacharydowej za pomocą ekstrakcji ~ 1M roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego. Surowiec w postaci Menyanthes trifoliata nie wymaga liofilizacji, jest stosowany w postaci wysuszonego na powietrzu ziela i spełnia warunki farmakopealne. Ekstrakcja surowca metanolem jest mniej skomplikowana niż ekstrakcja dwoma rozpuszczalnikami, eterem naftowym i metanolem.

183 704

Wytrącanie polisacharydów z roztworów wodnych przy użyciu acetonu jest tańsze niż używanie do tego celu etanolu.

Wynalazek jest objaśniony w przykładzie realizacji sposobu wytwarzania immunomodulatora z rośliny Menyanthes trifoliata.

Przykład. 1000 g suchego ziela Menyanthes trifoliata zalewa się 2,5 dm³ metanolu i pozostawia w temperaturze pokojowej na około 24 godziny. Następnie roztwór metanolowy dekantuje się, a ziele zalewa ponownie metanolem w ten sam sposób jak uprzednio, powtarzając tę czynność dwukrotnie. Połączone wyciągi metanolowe odparowuje się, a odmyte metanolem ziele zalewa

1,5 dm3 destylowanej wody o temperaturze 70°C i pozostawia na sześć godzin w temperaturze pokojowej, dokładnie mieszając co pewien czas. Operację powyższą powtarza się trzykrotnie.

Połączone wyciągi wodne w ilości 4,5 dm3 zagęszcza się pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości około 0,7 dm3, uzyskując ekstrakt wodny, a pozostałe po ekstrakcji wodnej ziele zadaje się 1,5 dm3 roztworu 0,1 M wodorotlenku sodowego, przetrzymując całość przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając. Operację powtarza się czterokrotnie, uzyskując około 6 dm3 słabo alkalicznego wyciągu. Wyciąg zagęszcza się pod zmiejszonym ciśnieniem, w temperaturze nie przekraczającej 45°C, do objętości około 2 dm3. Ziele pozostałe po ekstrakcji rozcieńczonym wodorotlenkiem sodowym zadaje się czterokrotnie 1 dm3 wodnego roztworu kwasu octowego, o stężeniu 8%. Połączone wyciągi zagęszcza się do objętości około 0,5 dm3, uzyskując ekstrakt, a pozostałe ziele ekstrahuje się dwukrotnie 0,7 dm31 M wodorotlenku sodowego. Do otrzymanego roztworu dodaje się 7 dm3 acetonu, odsącza osad, ponownie rozpuszcza w wodzie i wytrąca acetonem. Uzyskuje się 33 g frakcji, którąrozpuszcza się w 0,075 dm3 wody 10,075 dm3 30% roztworu kwasu trichlorooctowego, celem usunięcia białek. Po odzieleniu białek do roztworu dodaje się 0,9 dm3 acetonu. Wytrąconą frakcję w postaci 28 g proszkowatego brązowego preparatu poddaje się dializie, używając worka dializacyjnego oddzielającego substancje o masie cząsteczkowej 3500. Pozostały wewnątrz worka dializacyjnego roztwór odparowuje się, uzyskując 0,8 g preparatu, który rozdziela się na kolumnie chromatograficznej z wypełnieniem Biogel P-10 na dwa produkty końcowe, wykazujące własności immunomodulujące. Jeden produkt, w ilości 0,57 g, nazwany umownie produktem D-4, badany metodą chromatografii kolumnowej na żelu Sephadex G-50 wykazuje piki odpowiadające m.cz.: 1,18 10⁴ D, 1,10 10⁴ D, a drugi produkt, w ilości 0,16 g, zwany umownie D-5, wykazuje pik odpowiadający m.cz. :1,18 104 d. Po hydrolizie produktu za pomocą kwasu solnego i zobojętnieniu wykonano analizę chromatograficzną cienkowarstwową i bibułową. Badania chromatograficzne wskazują, że w skład badanych frakcji D-4 i D-5 wchodzą następujące cukry: galaktoza, arabinoza, sorboza, mannoza, glukoza i kwas uronowy. Wyniki analizy elementarnej są zgodne z przewidywanymi dla frakcji polisacharydowych, zawierających grupy aminowe, siarczanowe i fosforanowe. Widmo IR wskazuje na charakter cukrowy preparatów oraz na obecność ugrupowań COO', CONH, S=O i P=O. Za pomocą analizy spektrofotometrycznej określono ilościowo zawartość cukrów obojętnych (~ 20%), aminocukrów (~ 2%), kwasów uronowych (~ 10%).

Badania aktywności biologicznej wytworzonych preparatów przeprowadzono oceniając ich wpływ na proliferację ludzkich limfocytów w hodowlach in vitro oraz na ekspresję wybranych antygenów na powierzchni limfocytów ludzkich. Preparat w dawce 150 pg/cm3 hodowli powoduje obniżenie PUA-indukowanej proliferacji ludzkich limfocytów in vitro o około 30%. Jednocześnie obniża o około 25% liczbę limfocytów CD4, nie powoduje znaczącej zmiany liczby komórek NK, ponadto obniża o ponad 40% ilość rodników ponadtlenkowych uwolnionych przez ludzkie granulocyty in vitro. Preparat o takich właściwościach może być zastosowany w chorobach z komponentąautoagresji immunologicznej, w chorobach reumatoidalnych i ewentualnie do wzmocnienia efektu immunosupresyjnego po przeszczepach narządów w transplantologii.

183 704

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz Cena 2,00 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania immunomodulatora z surowca roślinnego, polegający na wielokrotnej, wieloetapowej ekstrakcji surowca rozpuszczalnikami, a następnie usuwaniu białek z ekstraktu, wytrąceniu surowych trakcji polisacharydowych, ich oczyszczeniu i chromatograficznym rozdzieleniu, znamienny tym, że jako surowiec stosuje się roślinę o nazwie Menyanthes tnfoliata, który korzystnie ekstrahuje się kolejno metanolem, wodą, rozcieńczonym roztworem alkalicznym, roztworem kwasu octowego 10,5-1,5 M roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego, natomiast surowe frakcje polisacharydowe wytrąca się korzystnie acetonem.