PL183819B1

PL183819B1 - Sposób analizy DNA, para primerów i zestaw do wykrywania allelu Ep

Info

Publication number: PL183819B1
Application number: PL96323178A
Authority: PL
Inventors: Claudine Laurent; Jacques Mallet; Rolando Meloni
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 1997-11-03
Publication date: 2002-07-31
Also published as: NO974974D0; SK147997A3; KR19990008221A; SI0826068T1; AU5767896A; OA10534A; DK0826068T3; CA2217332A1; AU715264B2; EA001037B1; HUP9802918A2; PT826068E; PL323178A1; FR2733766B1; EP0826068A1; CZ346797A3; GR3033592T3; EA199700355A1; CZ291234B6; NZ308132A

Abstract

1. SPOSÓB ANALIZY DNA OSOBNIKA DO DIAGNOZOWANIA SCHIZOFRENII, ZNAMIENNY TYM, ZE POBIERA SIE PRÓBKE DNA, WYKRYWA SIE IN VITRO OBECNOSC ALLELU EP MIKROSATELITY HUMTH01 W GENIE TH, PRZY CZYM WYKRYWANIE ALLELU EP ODBYWA SIE DROGASEKWENCJONOWANIA I EWEN- TUALNIE ROZDZIELANIA NA ZELU I EWENTUALNIE DROGA SSCP. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są: sposób analizy DNA, para primerów i zestaw do wykrywania allelu Ep. Sposób ten jest przeznaczony do diagnozowania schizofrenii, a zwłaszcza do wykrywania zmian w powtarzającej się sekwencji DNA obecnej w genie TH, którego niektóre postacie wydają się być specyficzne u schizofreników. Przedmiotem wynalazku są również primery użyteczne przy wykrywaniu związanych ze schizofrenią specyficznych alleli tej powtarzającej się sekwencji.

Obecność mutacji we wszystkich klasach powtarzających się sekwencji DNA jest zjawiskiem znanym, natomiast znaczenie funkcji tych mutacji nie jest określone. W ten sposób mikrosatelity stanowią obszerną klasę powtarzających się sekwencji DNA, które stanowią wielki polimorfizm związany z zmianami liczby powtarzających się motywów (odnośnik 1) i ewentualnie sekwencji tych motywów. Takie mikrosatelity zostały z tego powodu wykorzystane jako znaczniki genetyczne dla zestawiania map genetycznych oraz dla identyfikacji centrów związanych z patologiami (odnośnik 2). Wielkość różnych alleli mikrosatelity zależy od zmian liczby powtarzających się motywów. Doświadczenia z sekwencj onowaniem powtarzających się dimerów pozwalają na wykazanie jakiejś zmiany liczby powtarzających się motywów i ich sekwencji.

183 819

Zmiany te mogą odpowiadać mianowicie “doskonałym” powtórzeniom, to jest bez przerwy w sekwencji zasad, lub “niedoskonałym” powtórzeniom, zawierającym jedną lub więcej niż jednąprzerwę w sekwencjach motywów, które dotycządelecji lub insercji (odnośnik 3). W taki sam sposób zmiany długości i ewentualnie sekwencji zaobserwowano w powtarzających się motywach trymetrycznych i tetrametrycznych. Podobnie zmiany tego typu zaobserwowano w mikrosatelitach HUMHPRTB (odnośnik 4) i HUMTH01 (odnośnik 5).

Przedmiotem analiz były zwłaszcza badaniem zmian genetycznych związanych ze schizofrenią. W związku z tym przeprowadzono badania związku pomiędzy genem hydroksylazy tyrozynowej (TH) i schizofrenią, skierowane zwłaszcza na mikrosatelitę HUMTH01. Hydroksylaza tyrozynowajest enzymem ograniczającym drogę biosyntezy katecholamin. Różne badania genetyczne patologii psychiatrycznych i neurologicznych wykonano wykorzystując znaczniki zlokalizowane w genie TH (odnośnik 6 i 7). Jednakże aż do chwili obecnej nie ma w literaturze żadnego dowodu związku genetycznego ze schizofrenią.

Mikrosatelita HUMTHO1 zlokalizowany jest w pierwszym intronie genu hydrolazy tyrozynowej. Ten mikrosatelita utworzony jest z powtarzających się motywów tetrametrycznych TCAT. Stanowi on pewien polimorfizm, przy czym opisano różne allele mające pewne liczby powtarzających się zmiennych motywów. Najczęściej spotykany allel zawiera 10 powtarzających się motywów orazjednądelecję pary zasad w piątym powtarzającym się motywie, zawierającym sekwencję CAT.

Zbadano także związek genu TH ze schizofrenią, badając obecność zmian sekwencji i długości w mikrosatelicie HUMTH01. Uzyskane wyniki pozwoliły wykazać, że allel doskonały jest bardzo rzadki i występuję tylko u schizofreników. Wyniki te odtworzono na populacjach pacjentów różnego pochodzenia etnicznego. W ten sposób w populacji francuskiej 239 osobników, w tym 94 schizofreników, wykryto 6 różnych alleli, oznaczonych literami A, B, C, D, Ei i Ep. Allele te różnią się między sobą 4 parami zasad (1 motyw całkowity), z wyjątkiem dwóch dłuższych, które różnią się tylko jedną parą zasad. Sekwencjonowanie tych różnych alleli pozwoliło wykazać, że powtarzający się motywmikrosatelity HUMTH01 o sekwencji TCAT doskonale powtarza się w allelach A, B, C i D, zawierających odpowiednio 6,7,8 i 9 powtarzających się motywów. Natomiast allel E, który zawiera 10 powtarzających się motywów, zawiera w większości tych przypadków tę samą delecję tymidyny w piątym powtarzającym się motywie. Delecja ta prowadzi do niedoskonałego allelu o sekwencji (TCAT)4(CAT)(TCAT)5, oznaczonego jako Ei (niedoskonały). Allel Ei jest najczęstszym allelem w populacji kaukazkiej (odnośnik 5). I odwrotnie, doskonały allel E o sekwencji (TCAT) 10 (oznaczonyjako Ep)jest bardzo rzadki. W ten sposób w całej badanej populacji schizofreników tylko 6 pacjentów miało allel doskonały. Uzyskane wyniki wskazują w sposób nieoczekiwany, że wszystkie podmioty mające allel Ep sąschizofrenikami, podczas gdy allel ten niejest obecny u 145 osobników zdrowych (patrz tabela 1). Wyniki te wskazująna wysoko znaczący związek pomiędzy obecnościąallelu Ep i schizofrenią. Poza tym 5 schizofreników nosicieli allelu Ep - są sporadycznymi przypadkami schizofrenii, której podtyp kliniczny jest schizofrenią paranoidową w jednym przypadku, schizofrenią indyferentną w trzech przypadkach i schizofrenią zdezorganizowaną w jednym przypadku.

Badania te rozszerzono te badania na inną populację o różnym pochodzeniu etnicznym. W ten sposób podjęto podobne badania na populacji 90 Tunezyjczyków. Uzyskane wyniki wskazują że częstość różnych alleli A-E występujących w badanej populacji tunezyjskiej różni się znacznie od częstości występowania obserwowanej w populacji francuskiej (patrz tabela 1). Tymczasem tylko 4 osobniki sprawdziły się jako nosiciele allelu doskonałego Ep, przy czym wszyscy byli schizofrenikami (1 schizofrenia paranoidowa i 3 schizofrenie indyferentne), przy czym postacie schizofrenii były także postaciami sporadycznymi.

Wyniki te stanowią pierwszy dowód związku pomiędzy TH i schizofrenią. Wskazują one wyraźnie, że allel doskonały Ep mikrosatelity HUMTH01 o sekwencji (TCAT) 10 może być związany w sposób znaczący ze schizofremąi dzięki temu stanowi narzędzie genetyczne dla śledzenia patologii tego typu.

183 819

Specyfika związku tego allelu ze schizofrenią została poza tym potwierdzona przez badania na populacji 100 pacjentów cierpiących na sporadyczną psychozę maniakalno-depresyjną. Obecność allelu Ep nie została wykryta u żadnego z tych pacjentów.

Stwierdzenie związku pomiędzy tym allelem i schizofrenią otwiera możliwość licznych zastosowań w dziedzinie diagnostyki i terapeutyki. W ten sposób niniejszy wynalazek otwiera po raz pierwszy możliwość diagnozowania schizofrenii drogą testu biologicznego in vitro, a nie tylko na podstawie objawów klinicznych.

Przedmiotem niniejszego wynalazkujest sposób analizy DNA osobnika do diagnozowania schizofrenii polegający na wykrywaniu obecności allelu Ep mikrosatelity HUMTH01 w genie TH. Sposób ten nadaje się również do diagnostyki patologii całego spektrum schizofrenii, takich jak mianowicie schizotypia, indywidua schizoidowe i tym podobne. Wynalazek umożliwia również uściślenie kryteriów diagnostycznych tych patologii, które dzisiaj sątylko natury klinicznej. Ponadto wynalazek umożliwia również ujawnienie predyspozycji do tego typu zaburzeń psychiatrycznych przez identyfikację podatności genetycznej w rodzinie pacjenta-nosiciela tego allelu Ep. Z punktu widzenia terapeutycznego wynalazek umożliwia korzystnie ustalenie bardziej właściwego leczenia w zależności od typu schizofrenii. Potwierdzając hipotezę związku z drogą katecholamin, wynalazek pozwala na korzystanie z terapii bardziej ukierunkowanych. Ponadto, jeżeli związki funkcyjne obecności allelu Ep nie sądefmitywnie ustalone, to należy mieć na uwadze, że mikrosatelita HUMTH01 jest zlokalizowany w pierwszym intronie genu TH, obszarze, w którym wykazano alternatywne splatanie prowadzące do 4 izoform TH (odnośnik 8). Zatem możliwe jest, że zmiany genetyczne w tym obszarze mająwpływ na regulację ekspresji genu TH oraz że byłoby to związane z pojawieniem się schizofrenii.

Zgodnie z pierwszym aspektem przedmiotem wynalazkujest sposób analizy DNA osobnika do diagnozowania schizofrenii, polegający na tym, że pobiera się próbkę DNA, wykrywa się in vitro obecność allelu Ep mikrosatelity HUMTH01 w genie TH, przy czym wykrywanie allelu Ep odbywa się drogą sekwencjonowania i ewentualnie rozdzielania na żelu i ewentualnie drogą SSCP.

Ujawnienie tego allelu o sekwencji (TCAT)10 jest charakterystyczne dla niektórych schizofrenii. Brak tego allelu nie wyklucza istnienia schizofrenii, przy czym allel ten spotyka się w około 5% przypadków. Sposób według wynalazku nadaje się również do charakterystyki genetycznej schizofrenii oraz do ustalania podtypów schizofrenii. Jak już wskazano uprzednio, allel Ep wydaje się być obecny tylko w schizofreniach sporadycznych. Sposób według wynalazku nadaje się również do ujawniania skłonności do schizofrenii.

W sposobie według wynalazku wykrywanie allelu Ep można zrealizować różnymi technikami. Spośród użytecznych technik można korzystnie wymienić sekwencjonowanie, rozdzielanie na żelu oraz technikę SSCP. Co się tyczy sekwencjonowania, to użyteczna jest każda technika znana specjalistom. Korzystne jest mianowicie wykorzystanie automatycznego sekwenatora DNA. Sekwencjonowanie prowadzi się korzystnie na matrycach dwuniciowych sposobem zakończania łańcuchów wykorzystując primery fluorescencyjne. Odpowiednim instrumentem do tego celu jest instrument do sekwencjonowania Tag Dye Primer Kit dostępny w Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster CityCA). Sekwencjonowanie mikrosatelity HUMTH01, lub dokładniej wyizolowanego fragmentu zawierającego tego mikrosatelitę, umożliwia bezpośrednie rozpoznanie allelu obecnego u pacjenta, jak również ujawnienie obecności lub braku allelu Ep o sekwencji (TCAT) 10. Wyniki uzyskane przez sekwencjonowanie przedstawiono przykładowo na fig. 2.

Korzystnątechnikąujawniania allelu Epjest rozdzielanie na żelu. Technika ta daje korzyść polegającą na dyskryminacji pomiędzy różnymi allelami w zależności od ich wielkości, bez konieczności sekwencjonowania fragmentów DNA. Technika ta opiera się na migracji, w warunkach denaturacj i, poddanych denaturacj i fragmentów DNA w żelu akryloamidowym (korzystnie w żelu 6%-owym). Wywołanie prążków można dokonać każdym sposobem znanym specjalistom, w oparciu przykładowo o wykorzystanie primerów znaczonych (mianowicie promienie gamma na fosforze), wprowadzenie a-dCTP do badanych fragmentów, wykorzystanie promieni

183 819 alfa zimnych sond, wywołanie bromkiem etydyny lub wreszcie przez hybrydyzację (odcisk) sondą znaczoną promieniotwórcze. Dokładny protokół rozdzielania na żelu podany jest tytułem ilustracji w przykładach. Jak przedstawiono na fig. 3, ta technika umożliwia szybkie i bez sekwencjonowania rozróżnienie pomiędzy allelami A, B, C, D, Ei i Ep mikrosatelity.

Co się tyczy techniki identyfikacji za pomocąSSCP, to również chodzi tu o sposób rozdzielania na żelu akryloamidowym, lecz nie w warunkach denaturacji. Technika ta umożliwia dyskryminację różnych fragmentów w zależności od ich konformacji (patrz Przykłady).

Sposób według wynalazku realizuje się na próbce DNA pacjenta. Próbka powinna zawierać przynajmniej mikrosatelitę HUMTH01, który zawiera korzystnie całość lub część pierwszego intronu genu TH. Jeszcze korzystniej zawiera on fragment genu TH zawierającego mikrosatelitę HUMTH01 ograniczonego sekwencjami oskrzydlającymi. Próbkę DNA do badań można uzyskać z komórek pobranych od pacjenta. Korzystnie chodzi o komórki krwi (na przykład komórki jednojądrowe), które uzyskuje się łatwo przez proste pobranie krwi. Można wykorzystać także i inne typy komórek, takie jak fibroblasty, komórki śródbłonkowe, keratynocyty i tym podobne. Następnie DNA ekstrahuje się z komórek i wykorzystuje do wykrywania allelu Ep. W tym celu genomiczny uzyskany DNA można trawić za pomocąenzymów restrykcyjnych, klonować w odpowiednie wektory, selekcjonować na przykład pod względem TH albo przez hybrydyzację sondą odpowiadającą pierwszemu intronowi TH, a na koniec poddać analizie, jak opisano wyżej. Najkorzystniej, gdy wyesktrahowany DNA podda się uprzednio jednej lub kilku reakcjom powielania w celu uzyskania większej ilości materiału odpowiadającego obszarowi zawierającemu mikrosatelitę HUMTH01. Powielanie można przeprowadzić każdątechniką znaną specjalistom, a mianowicie techniką zwanąPCR (Reakcja łańcuchowa katalizowana polimerazą, Saiki R.K. etal. Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350). Pod tym względem powielanie można przeprowadzić korzystając z urządzenia “DNA thermal cycler) (Perkin Elmer Cetus) zgodnie z instrukcją producenta. Warunki temperaturowe oraz środowiskowe stosowane przy powielaniu są w ogólności warunkami opisanymi przykładowo przez Maniatisa et al., 1989. W przykładach podane sąrównież warunki specyficzne. Przy korzystaniu z niniejszego wynalazku korzystne jest wykorzystanie fragmentu DnA zawierającego mikrosatelitę HUMTH01 dostatecznie małego. Pozwala to korzystnie na dyskryminację pomiędzy allelami bez konieczności odwołania się do sekwencjonowania. Poza tym, jeżeli przeprowadzane są doświadczenia kontrolne sekwencjonowania, to korzystne jest również sekwencjonowanie tylko fragmentów o ograniczonej wielkości. Korzystnie jest, gdy wykorzystywany fragment DNA jest fragmentem powielonym zawierającym mniej niż 300 par zasad. Taki fragment zawiera mikrosatelitę HUMTH01 oraz sekwencje oskrzydlające genu TH, takie jak przedstawiono na fig. 1. Jeszcze korzystniej, gdy powielony fragment zawiera mniej niż 200 par zasad. Szczególnie znaczące wyniki uzyskano z powielonymi fragmentami zawierającymi mniej niż 160 par zasad, a zwłaszcza mniej niż 100 par zasad.

Przedmiotem wynalazku jest także para primerów składająca się z pary A zawierająca primery SEQ ID nr 1i 2, pary B zawierającej primery SEQ ID nr 3 i 4 oraz pary C zawierającej primery SEQ IN nr 5, umożliwiająca powielanie fragmentu zawierającego mniej niż 200 par zasad i przynajmniej mikrosatelitę HUMTH01 oraz obszar oskrzydlający.

Niniejszy wynalazek opisuje również specyficzne primery umożliwiające powielanie małych fragmentów DNA, zawierający mikrosatelitę HUMTH01. Wynalazek opisuje zwłaszcza 3 pary primerów umożliwiających odpowiednio powielanie fragmentów zawierających 192,156 i 77 par zasad. Sekwencja tych primerów, jak również sekwencja i położenie w genie TH powielonego fragmentu, podanajest w przykładach. Każdy inny primer umożliwiający powielenie fragmentu zawierającego mniej niż 300 par zasad i przynajmniej mikrosatelitę HUMTH01 i obszar oskrzydlający, pochodzący od sekwencji przedstawionej na fig. 1, stanowi również część niniejszego wynalazku. Korzystnie, gdy primery według wynalazku mają długość od 10 do 40 merów, a zwłaszcza od 15 do 30 merów. Sekwencję tych primerów można określić wychodząc z sekwencji przedstawionej na fig. 1, w zależności od wielkości powielonego fragmentu, jego lokalizacji wokół mikrosatelity oraz wybranej długości primerów.

183 819

Primery według wynalazku można zsyntetyzować jakimkolwiek sposobem znanym specjalistom, a mianowicie korzystając z chemii fosfoamidynianów, ewentualnie zabezpieczonych w położeniu β przez ugrupowanie cyjanoetylowe (Sinha et al., 1984, Giles 1985), za pomocą automatycznego syntezatora DNA, takiego jak syntezator Applied Biosystem, model 394 (Apllied Biosystem, Foster City CA), zgodnie z zaleceniami producenta. Primery można również znakować jakąkolwiek techniką znaną specjalistom.

Próbka DNA do badań może być DNA genomowym, DNAc oraz również RNA. Korzystnie chodzi o produkt powielenia DNA genomowego powielonego za pomocą primerów specyficznych, takich jak opisanych wyżej.

Innym przedmiotem wynalazkujest zestaw do wykrywania allelu Ep, zawierający parę primerów, takich jak określono wyżej. Taki zestawjest wykorzystywany jest w procesie diagnostycznym schizofrenii.

Jak wskazano uprzednio, niniejszy wynalazek podaje po raz pierwszy genetyczny sposób wykrywania i charakterystyki genetycznej chorób schizofrenicznych. Poza podanymi zastosowaniami diagnostycznymi sposób według wynalazku daje również ważne potencjalne możliwości terapeutyczne związane mianowicie z lepszym ustawieniem leczenia w zależności od dolegliwości.

Niniejszy wynalazek będzie opisany bardziej szczegółowo w następujących przykładach, które mają tylko charakter ilustracyjny, a nie ograniczający.

Wynalazek został zilustrowany następującymi rysunkami:

Figura 1: Sekwencja części pierwszego intronu genu TH zawierającego mikrosatelitę HUMTH01. Wskazano położenie primerów powielania.

Figura 2: Ujawnienie drogą sekwencjonowania allelu Ep mikrosatelity HUMTH01.

Figura 3: Ujawnienie przez rozdzielenie na żelu allelu Ep mikrosatelity HUMTH01.

Tabela 1: Rozkład allelów mikrosatelity HUMTH01 w badanych populacjach, dotkniętych lub niedotkniętych schizofrenią.

Przykłady

1. Przygotowanie DNA

Próbki krwi pobrano do heparyny i wydzielono komórki jednojądrowe na gradiencie Ficoll hypaąue (Pharmacia, Upsala, Szwecja), a następnie techniką standardową wyekstrahowano DNA. Do bezpośredniej ekstrakcji DNA wykorzystano następujący protokół:

Zebraną krew umieszczono w probówkach 50 ml i dodano roztwarzający roztwór buforowy w celu rozkładu czerwonych ciałek krwi (= 40 ml TRIS 1N HCl, pH 7,5, + 20 ml 0,5M EDTA + +H₂O milliQ qsp 21); objętość końcowa: 50 ml. Zawiesinę wirowano następnie w temperaturze 4°C w ciągu 15 minut z prędkością 2500 obrotów na minutę. Ciecz klarowną odrzucono, a do pastylki dodano 50 ml roztwarzającego roztworu buforowego. Tę samą operację (wirowanie, usunięcie klarownej cieczy, potraktowanie pastylki roztwarzającym roztworem buforowym) powtórzono dwukrotnie, odzyskując pastylkę pod koniec trzeciego wirowania. Następnie dodaje się:

ml roztwarzającego roztworu buforowego (na 5 ml krwi wyjściowej),

125 pl 20% laurylosarkozylu, pl proteinazy K (20 ng/ml)

Otrzymany roztwór wymieszano i umieszczono na odpowiednio dobranej łaźni mieszając w temperaturze 55C w ciągu nocy.

Na następny dzień z rana dodaje się 2 objętości 95% etanolu (jeżeli 5 ml, to razem 15 ml), po czym roztwór poddaje się strącaniu przez inwersję, aż do utworzenia się kłaczków. Wtedy DNA przenosi się do 5 ml probówki za pomocą pipety P1000 (z końcówką w kształcie stożka ściętego). Następnie dodaje się 80% etanol i umieszcza mieszaninę w chłodziarce. Na następny dzień rano etanol wymienia się, a wieczorem alkohol odciąga się pozostawiając kłaczki do wyschnięcia (odwróconą probówkę stawia się na bibule celulozowej).

DNA podejmuje się następnie za pomocąTE IX; w zależności od wielkości kłaczków ilość TE zmienia się od 200 pl do 1 ml. Z kolei całość pozostawia się na noc na maszynie rotacyjnej w temperaturze 37°C, a stężenia DNA mierzy się spektrometrycznie.

183 819

2. Populacja francuska:

Badano 94 pacjentów różnego pochodzenia, dotkniętych chroniczną schizofrenią(62 mężczyzn i 32 kobiety, średni wiek 42+/-12,3), włącznie z 21 przypadkami rodzinnymi. Diagnozę postawiono według kryterium DSM III (odnośnik 9) korzystając z danych pochodzących bezpośrednio z tablic medycznych i wywiadu według tłumaczenia francuskiego Tableau des Desordres Affectifs et de l’Anxiete Schizophrenigue (SADS-LA, odnośnik 10). Każdego pacjenta przydzielono do podtypu klinicznego zgodnie z opisanym postępowaniem. Zbadano 145 świadków niewidocznych (84 mężczyzn i 61 kobiet, średni wiek 48+/-8,3), nie wykazujących żadnego schorzenia psychiatrycznego.

3. Populacja tunezyjska:

Badano 44 pacjentów różnego pochodzenia, dotkniętych chroniczną schizofrenią(33 mężczyzn i 11 kobiet, średni wiek 37+/-8,2), włącznie z 13 przypadkami rodzinnymi. Diagnozę postawiono według kryterium DSM III (odnośnik 11) korzystając z danych pochodzących bezpośrednio z tablic medycznych. Pacjentów tych porównano z 44 pacjentami kontrolnymi, bez żadnych związków między nimi (37 mężczyzn i 7 kobiet, średni wiek 35+/-5,9), nie wykazującymi żadnego schorzenia psychiatrycznego.

4. Primery wykorzystywane do reakcji powielania

Ukierunkowana matryca dla reakcji powielania złożona jest z allelu Ep mikrosatelity HUMTH01, którego sekwencja jest (TCAT)4TCA(TCAT)5. Mikrosatelita jest zlokalizowany w położeniu 1070 sekwencji genu TH, jak opublikowano i jest dostępne w Banku Genów (nr D00269).

Do powielania drogą PCR wykorzystano różne pary primerów. Pary te oraz wielkość powielonego fragmentu podane są niżej. Położenie tych primerów w sekwencji genu TH przedstawione jest na Fig. 1 (patrz również SEQ ID nr 1).

Para A:

15’ GGC AAATAG GGG GCA AAA 3’ (sens) (SEQ ID nr 1) oraz

2) 5’ TTA TTCAACCCG GCC CAC 3 ’ (imtysens) ) SEQIDnr 2 )

Przewidywana długość powielenia wynosi 192 pary zasad.

ParaB:

3) 5’ GC AAA TAG GGG GCA AAA 3’ (sensowny) (SEG ID nr 3) oraz

4) 5’ GGC TTC CGA GTG CAG GTC 3’ (antysensowny) (SEQ ID nr 4).

Przewidywana długość powielenia wynosi 156 par zasad,

Para C:

5) 5’ GTT CCT CCC TTA TTT CCC 3’ (sensowny) (SEQ ID nr 5) oraz

6) 5’ AGG GAA CAC AGA CTC CAT 3’ (antysensowny) (SEQ ID nr 6).

Przewidywana długość powielenia wynosi 77 par zasad.

5. Protokół reakcji powielania

Mieszanina stosowana do reakcji PCR zawiera: 40 ng genomowego DNA przygotowanego według przykładu 1,200 mM każdego z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 18 pikomoli (100 ng) każdego z primerów, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1,5 mM MgCl₂ i 1,0 mCi (a-³²P)dCTP (Amersham, UK) o objętości końcowej 15 ml.

Po początkowej 3-minutowej denaturacji w temperaturze 96°C dodano w temperaturze 92°C do każdej próbki (DNA + mieszanina) 0,75 jednostki,polimerazy Tag, po czym po tym etapie następowało 30 cykli obejmujących hybrydyzację w ciągu 30 w temperaturze 56°C, wydłużenie w ciągu 30 w temperaturze 72°C i denaturację w ciągu 30 w temperaturze 92°C.

6. Rozdzielanie na żelu

Trzy mikrolitry produktu z reakcji PCR zmieszano z 3 mikrolitrami “roztworu przerywającego” (0,025 błękitu bromofenolowego i 0,025 ksylenocyjanolu, 0,95 odjonizowanego formamidu) i umieszczono w żelu denaturującym (6% akryloamid/bisakryloamid, 19:1). Po migracji elektroforetycznej (2500 woltów, 55 mA) żel wyjmuje się i suszy. Następnie wkłada się go do kasety (bez ekranu powielającego) z błoną XOMAT (Kodak) dla wykonania zdjęcia autoradiograficznego i naświetla w ciągu nocy w temperaturze otoczenia.

183 819

7. Protokół dla reakcji PCR-SSCP

Reakcję tę przeprowadzono w kilku etapach według następującego protokołu:

- Powielanie drogą PCR (reakcja łańcuchowa polimeryzacji) sekwencji docelowej DNA (150-200 par zasad) ze znakowaniem promieniotwórczym dwóch nici (wykorzystanie a³²P-ATP) lub tylko jednej nici (kinacja jednego z primerów za pomocą y^P-ATP).

Jeden ml produktu reakcji PCR miesza się z 2,5 ml roztworu buforowego (80% odjonizowanego formamidu, 50 mM TBE, 1 mM EDTA, 0,5% ksylenocyjanolu, 0,5% błękitu bromofenolowego).

- Denaturacja DNA w temperaturze 96°C w ciągu 3-5 minut.

- Szybkie ochłodzenie próbek w topniejącym lodzie.

- Szybkie umieszczenie w niedenaturującym żelu poliakryloamidowym (6%o akryloamid/bisakryloamid, 37,5:1, 0,5X TBE) .

- Migracja elektroforetyczna w temperaturze 4°C przy mocy 50 W lub w temperaturze otoczenia i przy mocy 10 W (z 10% gliceryny w żelu).

- Autoradiografia suchego żelu.

Tabela 1

	Francja	Tunezja
Allele	Kontrole¹	Schizofrenicy^b	Kontrole’	Schizofrenicy^b
A (tcat) 6	54 (18,6%)	40 (21,3%)	20 (22,7%)	18(20,5%)
B (teat) 7	54(18,6%)	43 (22,9%)	20 (22,7%)	20 (22,7%)
C (teat) 8	38(131J%)	18(9,6%)	14(15,9%)	8 (9,1%)
D (teat) 9	52 (17,9%)	23 (12,2%)	21(23,9%)	26 (29,5%)
Ei (teat) 4 cat (teat) 5	92(31,8%)	58 (30,8%)	13(14,8%)	12 (13,6%)
Ep (teat) 10	0 (0%)	6** (03,2%)	0 (0%)	0 (0%)

Spis odnośników

1. Weber i wsp.,., Am.J.Hum.Genet. 44 (1989) 388

2. Heame i wsp.,., Trends Genet. 8 (1992) 288

3. Weber i wsp.,., Genomics 7 (1990) 524

4. Edwards i wsp.,., Genomics 12 (1992) 241

5. Puers i wsp.,., Am.J.Hum.Genet. 53 (1993) 953

6. Craddock i wsp.,., Ann. of Medicine 25 (1993) 317

7. Leboyer i wsp.,.. Lancet 335 (1990) 1219

8. Grima i wsp.,.. Naturę 326 (1987) 707

9. American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manuał of mental disorders (3-wydanie) - Washington, DC = APA (1980)

10. Fyer i wsp.,., Anxiety Disorders clinic, New York:

New-York State Psychiatric Institute (1985)

11. American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual of mental disorders (3-wydanie) - Washington, DC = APA (1987)

183 819

Lista sekwencji (1) Informacje ogóine (i) Wnioskodawca:

(A) Nazwa: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) Uiica: 20, Avenue Raymond Aron (C) Miasto: Antony (E) Kraj: Francj a (f) Kod pocztowy: 92165 (ii) Tytuł wynaiazku: Sposób diagnozowania schizofrenii (iii) Liczba sekwencji: 7 (iv) Sposób odczytywania na komputerze:

(A) Rodzaj nośnika: taśma (B) Komputer: kompatybiiny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentin Reiease #1,0, wersja #1.30 (OEB) (2) Informacje dia SEQ ID nr: 1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: nukieotydowy (C) Liczba nici: dwie (D) Konfiguracja: iiniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensywny: nie (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr : 1

GGCAAATAGG GGGCAAAA 18 (2) Informacje dia SEQ ID nr: 2 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: nukieotydowy (C) Liczba nici: dwie (D) Konfiguracja: iiniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensywny: nie (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr : 2

TTATCCAGCC TGGCCCAC 18 (2) Informacje dia SEQ ID nr: 3 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (b) Typ: nukieotydowy (C) Liczba nici: dwie (D) Konfiguracja: iiniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensywny: nie (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr : 3

GGCAAATAGG GGGCAAAA 18

183 819 (2) Informacje dla SEQ ID nr: 4 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: nukleotydowy (C) Liczba nici: dwie (D) Konfiguracja: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensywny: nie (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr : 4

GGCTTCCGAG TGCAGGTC (2) Informacje dla SEQ ID nr: 5 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: nukleotydowy (C) Liczba nici: dwie (D) Konfiguracja: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensywny: nie (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr : 5

GTTCCTCCCT TATTTCCC (2) Informacje dla SEQ ID nr: 6 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 18 par zasad (B) Typ: nukleotydowy (C) Liczba nici: dwie (D) Konfiguracja: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensywny: nie (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr : 6

AGGGAACACA GACTCCAT (2) Informacje dla SEQ ID nr: 7 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 636 par zasad (B) Typ: nukleotydowy (C) Liczba nici: dwie (D) Konfiguracja: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczny: nie (iv) Antysensywny: nie (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr : 7

CTTGAATCTT AACGATCGGA ATGTGGAAAC AAATCCATCC ACACACTCCA

AGATGGCCAG

AGGTCCCCGG CTGCTGCACC CAGCCCCCAC CCTACTCCCA CCTGCCCCTG

CCTCCCTCTG

120

183 819

CCCCAGCTGC	CCTAGTCAGC	ACCCCAACCA	GCCTGCCTGC	TTGGGGAGGC
AGCCCCAAGG		180
CCCTTCCCCG	GCTCTAGCAG	CAGCTCATGG	TGGGGGGTCC	TGGGCAAATA
GGGGGCAAAA		240
TTCCCCGGGT	ATCTGGGCTC	TGGGGTGATT	CCCATTGGCC	TGTTCCTCCC
TTCTTTCCCT		300
CAT T CAT T CA	TTCATTCATT	CAT T CAT T CA	TTCATTCACC	ATGGAGTCTG
TGTTCCCTGT		360
GACCTGCACT	CGGAAGCCCT	GTGTACAGGG	GACTGTGTGG	GCCAGGCTGG
ATCATCGGGC		420
GCTTTTCAGC	CCACAGGAGG	GGTCTTCGGT	GCCTCCTTGG	GCACTCAGAA
CCTTGGGCTC		480
CCTGGCACAT	TTAAAATGGG	TTTTTATTTA	TGGACCTTGA	TTGAAATGTG
GTGTGAGTTG		540
TAGCAGTGTC	ATTTCCAGGT	ACCTTCTCAG	GGACACAGGG	CGCCCTCCCC
CGTCCTCCCC		600

CGCCCTCCCC TACCCTCCCC CACCAGGCTC CCCATC

6

183 819

CTTGAATCTT AACGATCGGA ATGTGGAAAC AAATCCATCC AAAAAATCCA AGATGGCCAG AGGTCCCCGG CTGCTGCACC CAGCCCCCAC CCTACTCCCA CCTGCCCCTG CCTCCCTCTG CCCCAGCTGC CCTAGTCAGC ACCCCAACCA GCCTGCCTGC TTGGGGAGGC AGCCCCAAGG CCCTTCCCAG GCTCTAGCAG CAGCTCATGG TGGGGGGTCC TG¹ ' ³GGCAAATA GGGGGCAAAA TTCAAAGGGT ATCTGGGCTC TGGGGTGATT CCCATTGGCC T⁵GTTCCTCCC TTATTTCCCT

CATTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATTCAcc

ATGGAGTCTG TGTTCCCT⁶GT GACCTGCACT CGGAAGCC⁴CT

GTGTACAGGG GACTGTGTGG GCCAGGCTGG ATAA²TCGGGA GCTTTTCAGC CCACAGGAGG GGTCTTCGGT GCCTCCTTGG GCACTCAGAA CCTTGGGCTC CCTGGCACAT TTAAAATGGG TTTTTATTTA TGGACCTTGA TTGAAATGTG GTGTGAGTTG TAGCAGTGTC ATTTCCAGGT ACCTTCTCAG GGACACAGGG CGCCCTCCCC CGTCCTCCCC CGCCCTCCCC TACCCTCCCC CACCAGGCTC CCCATC

Fig· 1

183 819

ACGT A C G T

Η Π > Η Η Π > Η Η Ω > H t Ll L 11 1 1 1

E_r allele E_P allele

Fig- 2

183 819 _ΕΡ

-B

Fig. 3

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób analizy DNA osobnika do diagnozowania schizofrenii, znamienny tym, że pobiera się próbkę DNA, wykrywa się in vitro obecność allelu Ep mikrosatelity HUMTH01 w genie TH, przy czym wykrywanie allelu Ep odbywa się drogą sekwencjonowania i ewentualnie rozdzielania na żelu i ewentualnie drogą SSCP.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykrywanie allelu Ep przeprowadza się na żelu.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA pobiera się z komórek jednojądrowych.
4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że przed wykrywaniem DNA powiela się.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że powielony DNA zawiera całość lub część intronu genu TH.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że powielony DNA jest fragmentem mającym mniej niż 300 par 25 zasad i zawierającym mikrosatelitę HUMTH01 oraz sekwencje oskrzydlające.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że powielony DNA jest fragmentem zawierającym mniej niż 200 par zasad, a zwłaszcza mniej niż 160 par zasad.
8. Para primerów składająca się z pary A zawierająca primery SEQ ID nr 1i 2, pary B zawierającej primery SEQ ID nr 3 i 4 oraz pary C zawierającej primery SEQ IN nr 5, umożliwiająca powielanie fragmentu zawierającego mniej niż 200 par zasad i przynajmniej mikrosatelitę HUMTH01 oraz obszar oskrzydlający.
9. Para primerów według zastrz. 8, znamienna tym, że primery mają długość od 10 do 40 merów, a zwłaszcza od 15 do 30 merów'.
10. Zestaw do wykrywania allelu Ep mikrosatelity HUMTH01 w procesie diagnozowania schizofrenii, znamienny tym, że zawiera parę primerów składającą się z pary A zawierająca primery SEQ ID nr 1i 2, pary B zawierającej primery SEQ ID nr 3 i 4 oraz pary C zawierającej primery SEQ IN nr 5, umożliwiającą powielanie fragmentu zawierającego mniej niż 200 par zasad i przynajmniej mikrosatelitę HUMTH01 oraz obszar oskrzydlający.