PL184354B1 - Sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus - Google Patents

Sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus

Info

Publication number
PL184354B1
PL184354B1 PL96323468A PL32346896A PL184354B1 PL 184354 B1 PL184354 B1 PL 184354B1 PL 96323468 A PL96323468 A PL 96323468A PL 32346896 A PL32346896 A PL 32346896A PL 184354 B1 PL184354 B1 PL 184354B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
uscillus
thuringiensis subsp
bacillus
thuringiensis
subsp
Prior art date
Application number
PL96323468A
Other languages
English (en)
Other versions
PL323468A1 (en
Inventor
Denise C. Manker
William D. Lidster
Susan C. Macintosh
Robert L. Starnes
Original Assignee
Abbott Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Lab filed Critical Abbott Lab
Publication of PL323468A1 publication Critical patent/PL323468A1/xx
Publication of PL184354B1 publication Critical patent/PL184354B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A01N63/23—B. thuringiensis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
    • A01N47/28—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N<
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/04—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C275/06—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic and saturated carbon skeleton
    • C07C275/16—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic and saturated carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Sposób wzmacniania aktywnosci pestycydowej pestycydu zwiazanego z Bacillus obejmujacy hodowle szczepu Bacillus, izolacje czynnika wzmacniajacego z supernatantu ho- dowli i stosowanie czynnika wzmacniajacego lacznie z pestycydem zwiazanym z Bacillus, znamienny tym, ze po hodowli szczepu Bacillus, z supernatantu izoluje sie, a nastepnie sto- suje lacznie z pestycydem zwiazanym z Bacillus, czynnik wzmacniajacy o wzorze i posiadajacy w widmie 1 H NMR przesuniecia przy okolo 8 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43, 3,58, 3,73, 3,98, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35 i w widmie 1 3 C przesuniecia przy okolo 31,6, 37,2, 51,1, 53,3, 54,0, 54,4, 61,5, 61,6, 64,1, 65,6,158,3, 170,7 i 171,3 lub jego sól. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania i identyfikowania czynnika wzmacniającego aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus.
Każdego roku szkodniki powodują ogromne straty w rolnictwie, leśnictwie i w dziedzinie zdrowia publicznego. Do zwalczania takich szkodników stosowano różne strategie.
Jedną ze strategii jest stosowanie pestycydów chemicznych o szerokim zakresie lub spektrum aktywności. Jednakże, stosowanie pestycydów chemicznych ma różne wady. Zwłaszcza, z uwagi na ich szerokie spektrum aktywności, pestycydy te mogą niszczyć organizmy nie-docelowe, takie jak owady pożyteczne i pasożyty szkodników6. Ponadto, pestycydy chemiczne są często toksyczne dla zwierząt i ludzi. Co więcej, u docelowych szkodników często rozwija się oporność, jeśli powtarzalnie poddaje się je działaniu takich substancji.
Inna strategia obejmuje stosowanie biopestycydów do zwalczania plag owadów, grzybów i chwastów. Biopestycydy są naturalnie występującymi patogenami i/lub substancjami wytwarzanymi przez te patogeny. Zaletą stosowania biopestycydów jest to, że, w porównaniu z pestycydami chemicznymi, są one generalnie mniej szkodliwe dla organizmów6, które nie są celem ich działania oraz dla środowiska jako całości.
1. Bacillus thhringiensis
Najpowszechniej stosowanym biopestycydem jest Bacillus thuringiensis. Bacillus thuringiensis jest ruchliwą, Gram-dodatnią bakterią w kształcie pałeczki, która jest szeroko rozpowszechniona w przyrodzie, zwłaszcza w glebie i środowiskach bogatych w owady. Podczas wytwarzania przetrwalników Bacillus thuringiensis wytwarza paraprzetrwalnikowe krystaliczne inkluzje, które są owadobójcze po spożyciu przez podatne larwy owadów z rzędów motyli, muchówek i chrząszczy. Inkluzje mogą różnić się kształtem, liczbą i składem. Składają się one z jednego lub kilku białek zwanych endotoksynami delta, których wielkość może pozostawać w zakresie 27-140 kDa. Owadobójcze endotoksyny delta są na ogół przekształcane przez proteazy w jelicie larwy na skrócone polipeptydy toksyczne, powodujące uszkodzenie jelita środkowego i, ostatecznie, śmierć owada (Hófte i Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255).
Istnieje kilka szczepów Bacillus thuriggiegtit, które są powszechnie stosowane jako biopestycydy w leśnictwie, rolnictwie i w dziedzinie zdrowia publicznego. Bacillus thuringinntis subsp. kurstaki i Bacillus thuringiensis subsp. i aizawai wytwarzają endotoksyny delta specyficzne wobec motyli. Endotoksynę delta specyficzną wobec chrząszczy wytwarza Bacillus thuringiensis subsp. tenebriogis (Krieg i in., 1988, opis patentowy US 4 766 203).
184 354
Ponadto, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis wytwarza endotoksyny delta specyficzne wobec muchówek (Goldberg, 1979, opis patentowy US 4 166 112).
Opisano również inne szczepy Bacillus thuringiensis specyficzne wobec szkodników należących do muchówek. Ujawniono izolat Bacillus thuringiensis, który jest toksyczny wobec muchówek i motyli (Hodgman i in., 1993, FEMS Microbiology Letters 114: 17-22). Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z SDS oczyszczonej krystalicznej endotoksyny delta z tego izolatu ujawniła trzy rodzaje białek, które odpowiadają toksynom CryIA(b), CryIB i CryIIA. Ujawniono również izolat Bacillus thuringiensis, który wytwarza kryształ aktywny wobec muchówek złożony z białek o masach cząsteczkowych 140, 122, 76, 72 i 38 kDa (Payne, 1994, opis patentowy US 5 275 815). W europejskim opisie patentowym nr 480 762 ujawniono pięć szczepów B.t, z których każdy jest aktywny wobec szkodników należących do muchówek; każdy z nich posiada także unikalny wzór endotoksyn delta kryształów.
Opisano kilka szczepów Bacillus thuringiensis, które posiadają aktywność pestycydową wobec szkodników innych niż motyle, chrząszcze i muchówki. Ujawniono pięć szczepów Bacillus thuringiensis, które wytwarzają endotoksyny delta toksyczne dla nicieni (Edwards, Payne i Soares, 1988, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 303 426 B1). Ujawniono również szczep PS81F Bacillus thuringiensis, który można stosować do leczenia ludzi i zwierząt będących żywicielami pasożytniczych pierwotniaków (Thompson i Gaertner, 1991, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 461 799 A2). Ujawniono także kilka izolatów Bacillus thuringiensis o działaniu roztoczobójczym. Izolaty te wytwarzają kryształy składające się z białek o masach cząsteczkowych w zakresie od 35 kDa do 155 kDa (Payne, Cannon i Bagley, 1992, zgłoszenie PCT 92/19106). Ujawniono również szczepy Bacillus thuringiensis aktywne wobec szkodników z rzędu błonkówek (Payne, Kennedy, Randall, Meier i Uick, 1992, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 516 306 A2), aktywne wobec szkodników z rzędu pluskwiaków (Payne i Cannon, 1993, opis patentowy US 5 262 159); aktywne wobec szkodników należących do przywr (Hickle, Sick, Schwab, Narva i Payne, 1993, opis patentowy US 5 262 399) oraz aktywne wobec szkodników z rzędu wszy zwierzęcych (Payne i Hickle, 1993, opis patentowy US 5 273 746). Ponadto, ujawniono, że inny szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, WB3S-16, wyizolowany z wełny po strzyży owiec australijskich, jest toksyczny dla wszy Damalinia ovis, szkodnika z rzędu wszy zwierzęcych (Drummond, Miller i Pinnock, 1992, J Invert. Path. 60: 102-103).
Endotoksyny delta kodowane są przez geny ery (białka krystaliczne), które na ogół zlokalizowane są w plazmidach. Geny cry podzielono w oparciu o względną homologię aminokwasową i specyficzność wobec szkodników na sześć klas i kilka podklas. Główne klasy są specyficzne wobec motyli (cryI); motyli i muchówek (cryII); chrząszczy (cryIII); muchówek (cryIV) (Hofte i Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255); chrząszczy i motyli (określane jako geny cryV przez Taylora i in., 1992, Molecular Microbiology 6: 1211-1217) oraz nicieni (określane jako geny cryVi cryVI) przez Feitelsona i in., 1992, Bio/Technology 10: 271-275).
Endotoksyny delta wytwarzane są metodami rekombinacji DNA. Endotoksyny delta otrzymane metodami rekombinacji DNA mogą ewentualnie być w postaci kryształów.
Wykazano, że niektóre szczepy Bacillus thuringiensis wytwarzają termostabilny pestycydowy analog nukleotydów adenylowych, znany jako egzotoksyna β typu I lub turyngiensyna, która sama ma własności pestycydowe (Sebesta i in., w: H.D. Burges (red.), Microbiol Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, Nowy Jork, 1980, str. 249-281). Egzotoksynę β typu I znaleziono w supematantach niektórych hodowli Bacillus thuringiensis. Posiada ona masę cząsteczkową 701 i składa się z adenozyny, glukozy i kwasu alarynowego (Farkas i in., 1977, Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 42: 909-929; Luthy i in., w: Kurstak (red.) Microbiol and Viral Pesticides, Marcel Dekker, Nowy Jork, 1982, str. 35-72). W zakres ich żywicieli wchodzą między innymi Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster i Tetranychus cinnabarinus. Uważa się, że toksyczność egzotoksyny β typu I powodowana jest hamowaniem zależnej od DNA polimerazy
184 354
DNA poprzez współzawodnictwo z ATP. Wykazano, że egzotoksyna β typu I kodowana jest przez plazmid cry w pięciu szczepach Bacillus thuringiensis (Levinson i in., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Stwierdzono, że egzotoksyna β typu I wytwarzana jest przez Bacillus thuringensis subsp. Thuringiensis serotyp 1, Bacillus thuringensis subsp. tolworthi serotyp 9, Bacillus thuringensis subsp. darmstadiensis serotyp 10.
Opisano również inną egzotoksynę β, sklasyfikowaną jako egzotoksyna β typu II (Levinson i in., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Stwierdzono, że egzotoksyna β typu II wytwarzana jest przez Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotyp 8ab oraz, że jest ona aktywna wobec Leptinotarsa decemlineata. Struktura egzotoksyny β typu II nie jest w pełni znana, ale znacząco różni się ona od struktury egzotoksyny β typu I pod tym względem, że w miejscu adeniny znajduje się reszta pseudourydyny, i w której przyłączenie do pierścienia rybozy znajduje się w pozycji, która w innym wypadku byłaby zajęta przez proton (Levinson, w: Hinckle i Finch (red.), Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Waszyngton, D.C., 1990, str. 114-136). Ponadto, w protonowym widmie NMR występuje tylko jeden sygnał odpowiadający zasadzie nukleozydu (przy 7,95 ppm) i brak jest sygnału anomerycznego protonu typu rybozy (5,78 ppm).
Inne rozpuszczalne w wodzie substancje, które wyizolowano z Bacillus thuringiensis, obejmują egzotoksynę alfa, która jest toksyczna dla larw Musca domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbial. Lett. 8: 1-7), egzotoksyny gamma, które są różnymi enzymami, obejmującymi lecytynazy, chitynazy i proteazy, których działanie toksyczne przejawia się tylko łącznie z egzotoksynami beta i endotoksynami delta (Forsberg i in., 1976, Bacillus thuringiensis: Its effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); egzotoksynę sigma, która posiada strukturę podobną do egzotoksyny beta i która również jest aktywna wobec Leptinotarsa decemlineata (Argauer i in., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206-213; a także anhydroturyngiensynę (Prystas i in., 1975, Coll. Czechosslovak Chem:. Comm. 40: 1775).
2. Zwittermycyna
Zwittermycyna jest substancją wyizolowaną z Bacillus cereus, która hamuje wzrost patogenu roślinnego Phytophora medicaginis i redukuje infekcje lucerny (patrz na przykład opisy patentowe US 4 877 738 i 4 878 936). Nie ujawniono żadnej innej aktywności. Dla zwittermycyny A ustalono następującą strukturę (He i in., Tet. Lett. 35: 2499-2502):
3. Cel wynalazku
W badaniach dążono do uzyskania wyższej śmiercionośności preparatów B.t. Dotychczasowe sposoby obejmowały poszukiwania nowych szczepów o zwiększonej śmiercionośności, próby modyfikowania istniejących szczepów oraz próby zaprojektowania bardziej skutecznych preparatów przez łączenie przetrwalników i kryształów B.t. z nowymi nośnikami pestycydowymi, pestycydami chemicznymi lub czynnikami wzmacniającymi (patrz na przykład opis patentowy US 5 250 515, inhibitor trypsyny). Wynalazek podaje sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydów związanych z Bacillus.
184 354
4. Istota wynalazku
Według wynalazku sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus przez zastosowanie czynnika wzmacniającego, wyodrębnionego z supematantu po hodowli szczepu Bacillus i stosowanie czynnika wzmacniającego łącznie z pestycydem związanym z Bacillus, polega na tym, że po hodowli szczepu Bacillus, z supematantu izoluje się, a następnie stosuje łącznie z pestycydem związanym z Bacillus, czynnik wzmacniający o wzorze Ia
posiadający w widmie *H NMR przesunięcia przy około 8 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43,
3,58, 3,73, 3,98, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35 i w widmie 13C przesunięcia przy około 31,6, 37,2,
51,1, 53,3, 54,0, 54,4, 61,5, 61,6, 64,1, 65,6,158,3, 170,7 i 1171,3 lub jego sól.
Korzystnie szczep Bacillus hoduje się w podłożu fermentacyjnym. Czynnik wzmacniający izoluje się z supematantu hodowli drogą chromatografii kolumnowej.
Jako szczep Bacillus hoduje się szczep Bacillus thuringiensis wybrany z grupy składającej się ze szczepów Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entemocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexcanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. siło, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis i Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis.
Korzystnie jako szczep Bacillus thuringiensis stosuje się szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
Pestycyd związany z Bacillus obejmuje endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.
Endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment wybiera się z grupy składającej się z CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV i CryVI.
Korzystną, endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowo fragmentem jest endotoksyną delta CryIA Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.
184 354
Również korzystną endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowo fragmentem jest endotoksyną delta CryIC Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.
Wymieniony powyżej pestycyd związany z Bacillus obejmuje przetrwalniki Bacillus thuringiensis.
Sposób otrzymywania czynnika wzmacniającego aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus obejmuje:
(a) hodowanie szczepu Bacillus;, (b) odzyskiwanie czynnika wzmacniającego z supematantu hodowli z etapu (a).
W szczególności, szczep Bacillus dobiera się z grupy obejmującej się z Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis i Bacillus thuringiensis. W korzystnym rozwiązaniu, czynnik wzmacniający jest zasadniczo czysty. Czynnik „zasadniczo czysty” oznacza czynnik wzmacniający, który zawiera mniej niż 10% zanieczyszczeń, na przykład, białka endotoksyny delta. Taki zasadniczo czysty czynnik można otrzymać przez wyodrębnienie, na przykład przez chromatografię kolumnową.
Otrzymywany czynnik o wzorze la jest czynnikiem wzmacniającym. Przez „czynnik wzmacniający” należy rozumieć substancję, która nie posiada znaczącej aktywności pestycydowej, np. jej LC50 wynosi powyżej około 3000 mg/g (według oznaczenia w próbie biologicznej przedstawionej poniżej w części 6), ale działa zwiększając aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus o co najmniej około 50% i nie powoduje zahamowania rozwoju larwalnego. Jak stwierdzono w stanie techniki, inne znane w nauce substancje zdolne do wzmacniania aktywności pestycydowej, takie jak inhibitory trypsyny i egzotoksyny, posiadają działanie pestycydowe.
Czynnik wzmacniający jest rozpuszczalny w wodzie. W niniejszym opisie, substancja lub związek jest „rozpuszczalny w wodzie”, oznacza, że co najmniej około 1 mg substancji można rozpuścić w 1 ml wody.
Czynnik Ia może również wzmacniać aktywność pestycydową pestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych, ale w zasadzie przeznaczony jest do wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus.
Przez „pestycyd związany z Bacillus’” należy rozumieć szczep, przetrwalnik lub substancję Bacillus (np. Bacillus thuringiensis lub Bacillus subtilis), np. białko lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki, bądź mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki (np. endotoksynę delta Bacillus thuringiensis) oraz odpowiedni nośnik. Przykłady takich nośników podano poniżej. Szkodnikiem może być, na przykład, owad, nicień, roztocze lub ślimak. Mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment wykazujący aktywność wobec lub zabijający szkodniki zasiedla filosferę (powierzchnię liści roślin) i/lub ryzosferę (glebę otaczającą korzenie roślinne) i/lub środowiska wodne i jest zdolny do efektywnego współzawodniczenia w określonym środowisku (rośliny uprawne i inne naturalne siedliska owadów) z mikroorganizmami typu dzikiego oraz zapewnia stabilne utrzymywanie i ekspresję genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki. Przykłady takich mikroorganizmów obejmują, ale nie ograniczają się do bakterii, np. z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas. Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes i Clostridium; glonów, np. z rodzin Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmakophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae i Chlorophyceae; oraz grzybów, szczególnie drożdży, np. z rodzajów Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula i Aureobasidium.
184 354
Przez „aktywność pestycydową” należy rozumieć skuteczność działania na szkodniki mierzoną poprzez uśmiercanie lub hamowanie wzrostu szkodnika bądź ochronę rośliny przed zarażeniem szkodnikami.
Otrzymanemu czynnikowi wzmacniającemu la można nadawać postać kompozycji zawierającej czynnik Ia i nośnik pestycydowy, jak również czynnik Ia i pestycyd związany z Bacillus, ewentualnie pestycyd chemiczny i/lub wirus o właściwościach pestycydowych. Kompozycje te można stosować do zwalczania szkodników, zmniejszania odporności szkodnika na pestycyd związany z Bacillus poprzez wystawienie szkodnika na działanie kompozycji zawierającej czynnik wzmacniający i pestycydowo dopuszczalny nośnik, lub do wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus.
Wynalazek obejmuje również sposób identyfikowania czynnika wzmacniającego przez:
(a) hodowanie szczepu Bacillus;
(b) odzyskiwanie supematantu hodowli z etapu (a); i (c) oznaczania supematantu (b) pod kątem wzmacniania pestycydu związanego z Bacillus.
5. IKrtki opis rysunków
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia schematycznie ogólną procedurę stosowaną do oczyszczania czynnika wzmacniającego aktywność; fig. 2 przedstawia widmo 13C NMR, a fig. 3 przedstawia widmo protonowe NMR czynnika Ia.
Figura 4 przedstawia wyniki doświadczeń z acetylowaną pochodną czynnika wzmacniającego aktywność pestycydową.
Szczegółowy opis wynalazku
Czynnik wzmacniający aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus może mieć masę cząsteczkową od około 350 do około 1200 lub, zwłaszcza od około 350 do około 700. Wzmacnia on aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus co najmniej około 1,5 krotnie do nawet około 1000 krotnie, korzystnie od około 100 do około 400 krotnie. W szczególności czynnik Ia wzmacnia aktywność pestycydową białka endotoksyny delta Bacillus obejmującej, ale nie ograniczonej do CryI (CryIA, CryIB i CtyIC), CryII,
CryIII, CryIV, CryV lub CryVI w postaci o pełnej długości lub postaci proteolitycznie zmodyfikowanej, skróconej, od około 1,5 do około 1000 razy. W szczególności, czynnik Ia wzmacnia endotoksynę delta B.t. od około 100 do 400 razy. Czynnik Ia może również wzmacniać aktywność pestycydową pestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych.
Czynnik o wzorze Ia charakteryzuje się tym, że może być rozpuszczany w wodzie, jest stabilny w wodzie do temperatury około 100°C przez co najmniej 5 minut, jest stabilny przy poddawaniu bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu co najmniej około 10 godzin i/lub stabilny w pH około 2 w ciągu około 10 dni. Czynnik Ia posiada 13 atomów węgla. Ponadto, czynnik Ia może posiadać w widmie Ή NMR przesunięcia przy około d 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43, 3,58, 3,73, 3,98, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35.
Czynnik wzmacniający przedstawiony jest wzorem Ia
może być w postaci jego soli. Sól powinna być zdolna do wzmacniania aktywności pestycydu związanego z Bacillus.
184 354
6.1 Otrzymywanie czynnika wzmacniającego Ia
Czynnik Ia otrzymuje się ze szczepu Bacillus (na przykład, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis lub Bacillus thuringiensis) w kolbach do wytrząsania lub w fermentorze. W szczególności czynnik la można otrzymać z supematantu hodowli Bacillus thuringiensis, który obejmuje, ale nie ogranicza się do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus. Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi i Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. W korzystnym rozwiązaniu, czynnik la można otrzymać z supematantu Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai lub Bacillus thuringiensis subsp. galleriae lub ich mutantów wykazujących zasadniczo takie same aktywności wzmacniające. W szczególności czynnik la odzyskuje się z mutanta cry spo‘ Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
Bacillus można hodować stosując znane podłoża i techniki fermentacyjne (patrz na przykład, Rogoff i in., 1969, J. Invertebrate Patb. 14: 122-129; Dulmage i in., 1971, J. Invertebrate Path. 18: 353-358; Dulmage i in., w: Microbiol Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges, red., Academic Press, N.Y., 1980). Po zakończeniu cyklu, supernatant można odzyskać przez oddzielenie przetrwalników i kryształów B.t:. od brzeczki hodowlanej (fermentacyjnej) sposobami dobrze znanymi, na przykład przez wirowanie i/lub ultrafiltrację. Czynnik la zawarty jest w supernatancie, który można odzyskać znanymi sposobami, np. przez ultrafiltrację, odparowanie i suszenie rozpyłowe. Procedurę tę opisano bardziej szczegółowo poniżej (w części 7).
Oczyszczanie czynnika Ia można przeprowadzić różnymi technikami np. stosując chromatografię (np. jonowymienną na bazie powinowactwa i sączenia molekularnego), procedur elektroforetycznych, różnicowej rozpuszczalności, ekstrakcji, lub jakąkolwiek inną znaną techniką.
Aktywność czynnika Ia wzmacniającą aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus wobec różnych szkodników można oznaczać stosując znane procedury, takie jak wprowadzenie sztucznej diety dla owadów, pokrywanie sztuczną dietą, malowanie liści, zanurzanie liści i spryskiwanie listowia. Szczegółowe przykłady takich oznaczeń podano poniżej (w części 7).
6.2 Kompozycje zawierające czynnik wzmacniający
Czynnik wzmacniający może być w kompozycji sam do następnego stosowania z pestycydem związanym z Bacillus lub razem z pestycydem związanym z Bacillus, którym zgodnie z powyższą definicją jest szczep Bacillus, przetrwalnik, białko lub jego fragment, lub inna substancja pochodząca z nich aktywna wobec szkodników wraz z dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycję(e) pestycydową(e) można sporządzić w postaci na przykład zawiesiny, roztworu, emulsji, proszku do opylania, granulek dyspergowalnych, proszku zawiesinowego, koncentratu emulgującego, aerozolu lub impregnowanych granulek.
Przykładowe szczepy Bacillus obejm^ą ale nie ograniczają się do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (sprzedawany jako DIPElÓ przez Abbot Laboratories, Inc., JAVELINO przez Sandoz, BIOBiTo przez Novo Nordisk A/S, FORAYÓ przez Novo Nordisk A/S, BIOCOTÓ przez Novo Nordisk A/S,· MVPÓ przez Mycogen, BACTOSPEINEÓ przez Novo Nordisk A/S i THURICIDEO przez Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (sprzedawany jako FLORBACÓ przez Novo Nordisk A/S i XENTARIO przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis suibsp. tenebrionis (spr:,eedawamy jako NOVODORO przez Novo Nordisk A/S, TRIDENTÓ przez Sandoz, M-TrAkó i MONEÓ przez Mycogen); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (sprzedawany jako albo BACTIMOSÓ, albo SKEETALÓ przez Novo Nordisk A/S, TEKNARO przez Sandoz i YECTOBACÓ przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus
184 354 thuringiensis kurstskUtenebrionis (sprzedawany jako FOILÓ przez Ecogen); Uscillus thuringiensis kurstaki/sizswsi (sprzedawany jako CONDORO przez Ecogen i AGREEÓ przez Ciba-Geigy) oraz Uscillus thuringiensis kurstski/kurstski (sprzedawany jako CUTLASSÓ przez Ecogen). Związane z Uscillus białko można wybrać z grupy obejmującej, ale nie ograniczonej do Cryl, CryII, CryIII, CryIV, CryV i CryVI.
W kompozycjach zawierających czynnik la i pestycyd związany z Uscillus, czynnik Ia może występować w ilości co najmniej około 0,1 g/BIU lub 0,05 g czynnika Ia na g endotoksyny delta i przetrwalników Uscillus, ewentualnie do około 300 g/BIU lub 150 g substancji na g endotoksyny delta i przetrwalników Uscillus, korzystnie 2 g/BIU lub 1 g substancji na g endotoksyny delta i przetrwalników Uscillus. W niniejszym opisie „BIU” oznacza miliard jednostek międzynarodowych określonych w oznaczeniu biologicznym, w którym porównuje się próbkę ze standardowym materiałem odniesienia Uscillus. Jako standardowy owad testowy stosuje się Trichoplusis ni lub inny szkodnik. Siłę działania określa się przez podzielenie LC5q materiału odniesienia i następnie pomnożenie przez siłę działania standardu odniesienia.
W innym rozwiązaniu, kompozycja może zawierać czynnik wzmacniający w zasadniczo czystej postaci lub supernatant pochodzący z hodowli Uscillus w postaci suchej, zatężonej lub płynnej wraz z pestycydowo dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycję można stosować oddzielnie na rośliny, np. rośliny transgeniczne. W szczególności, kompozycję można nanosić na roślinę wcześniej zawierającą i eksprymującą gen Uscillus thuringiensis. W innym wykonaniu, kompozycję można nanosić na roślinę uprzednio wystawioną na działanie kompozycji Uscillus thuringiensis. W jeszcze innym wykonaniu, kompozycję można stosować w środowiskach szkodliwych muchówek, np. wodzie lub glebie. Czynnik Ia występuje w kompozycji w stężeniu od około 0,001% do około 60% (w/w).
Kompozycję zawierającą substancję i pestycydowo dopuszczalny nośnik, poza zwalczaniem szkodnika, można również stosować do obniżania odporności szkodnika na pestycyd. Alternatywnie, kompozycję można również stosować do wzmacniania pestycydu związanego z Uscillus. W jednym wykonaniu, kompozycję można stosować w tym samym czasie, co pestycyd, w ilości co najmniej około 2 g substancji/BIU do ewentualnie około 300 g substancji/BIU. W innym wykonaniu, kompozycję można stosować, do około 24 godzin po pestycydzie, jako adiuwant dla zwiększenia skuteczności pozostałego pestycydu.
Takie opisane powyżej kompozycje można otrzymać przez dodanie środka powierzchniowo czynnego, obojętnego nośnika, środka konserwującego, środka pochłaniającego wilgoć, środka pobudzającego żerowanie, środka wabiącego, czynnika kapsułkującego, spoiwa, emulgatora, barwnika, czynnika, zabezpieczającego przed UV, buforu, środka poprawiającego płynność lub innego składnika dla ułatwienia manipulowania i stosowania produktu wobec konkretnych szkodników docelowych.
Odpowiednie środki powierzchniowo czynne obejmują związki anionowe, takie jak sole kwasów karboksylowych, na przykład, sól długołańcuchowego kwasu tłuszczowego z metalem; N-acylosarkozynian; mono- lub diestry kwasu fosforowego z etoksylanami alkoholi tłuszczowych lub sole takich estrów; siarczany alkoholi tłuszczowych, takie jak siarczan sodowy dodecylu, siarczan sodowy oktadecylu lub siarczan sodowy cetylu; siarczany etoksylowanych alkoholi tłuszczowych; siarczany etoksylowanych alkilofenoli; sulfoniany ligniny; sulfoniany naftowe; sulfoniany alkiloarylowe, takie jak sulfonian alkilobenzenowy lub sulfoniany alkilonaftalenu o krótkim łańcuchu alkilowym, np. sulfonian butylonaftalenu; sole sulfonowanych produktów kondensacji naftalenu z formaldehydem; sole sulfonowanych produktów kondensacji fenolu z formaldehydem lub bardziej złożone sulfoniany, takie jak amidosulfoniany, np. sulfonowany produkt kondensacji kwasu oleinowego i N-metylotauryny lub sulfobursztyniany dialkilowe, np. sulfonian sodowy bursztynianu dioktylowego. Środki niejonowe obejmują produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych, alkoholi tłuszczowych, amidów kwasów tłuszczowych lub fenoli podstawionych tłuszczową grupą alkilową lub alkenylową z tlenkiem etylenu, estry kwasów tłuszczowych i polihydroksylowych alkoholoeterów, np. estry kwasów tłuszczowych i sorbitanu, produkty kondensacji takich estrów
184 354 z tlenkiem etylenu, np. estry kwasów tłuszczowych i polioksyetylenosorbitanu, kopolimery blokowe tlenku etylenu i tlenku propylenu, glikole acetylenowe, takie jak 2,4,7,9-tetraetylo-5-decyno-4,7-diol, lub etoksylowane glikole acetylenowe. Przykłady, kationowych środków powierzchniowo czynnych obejmują, na przykład, alifatyczną mono-, di- lub poliaminę, taką jak octan, naftenian lub oleinian; aminę zawierającą tlen, taką jak tlenek aminy polioksyetynylowanej alkiloaminy; aminę z wiązaniem amidowym przygotowaną przez kondensację kwasu karboksylowego z di- lub poliaminą, bądź czwartorzędową sól amonową.
Przykłady obojętnych materiałów obejmują mineralne substancje nieorganiczne, takie jak kaolin, mika, gips, nawóz sztuczny, filokrzemiany, węglany, siarczany lub fosforany; materiały organiczne, takie jak cukier, skrobie lub cyklodekstryny; lub materiały botaniczne, takie jak produkty z drewna, korek, sproszkowane kaczany kukurydzy, łuski ryżu, łupiny orzechów ziemnych i łupiny orzechów włoskich.
Kompozycje mogą mieć postać odpowiednią do bezpośredniego stosowania lub koncentratu bądź pierwotnej kompozycji, która przed zastosowaniem wymaga rozcieńczenia odpowiednią ilością wody lub innego rozcieńczalnika. Stężenie pestycydu będzie różne w zależności od charakteru konkretnej postaci, szczególnie od tego, czy jest ona koncentratem, czy jest przeznaczona do bezpośredniego stosowania. Kompozycja zwykle zawiera 1 do 98% stałego lub płynnego obojętnego nośnika i od 0 do 50%, korzystnie od 0,1 do 50% środka powierzchniowo czynnego. Kompozycje te będą stosowane w ilości określonej dla produktu handlowego, korzystnie od około 0,012 do 6 kg/ha, jeśli są w postaci stałej, i od około 0,014 do 35 l/ha jeśli mająpostać płynną.
W dalszym rozwiązaniu, krystaliczną endotoksynę delta Bacillus thuringiensis i/lub czynnik la można, przed utworzeniem z nich preparatu, poddawać działaniu mającemu na celu wydłużenie aktywności pestycydowej po zastosowaniu w środowisku docelowego, szkodnika, pod warunkiem, że to działanie wstępne nie szkodzi krystalicznej delta-endotoksynie lub czynnikowi la. Takie traktowanie może być przeprowadzone za pomocą środków chemicznych i/lub fizycznych o ile takie traktowanie nie wywiera ujemnego wpływu na właściwości kompozycji. Przykłady reagentów chemicznych obejmują, ale nie ograniczają się do nich chlorowcujących, aldehydów, takich jak formaldehyd i glutaraldehyd; przeciwinfekcyjnych, takich jak chlorek zefiranu; alkoholi, takich jak izopropanol i etanol; oraz utrwalaczy histologicznych, takich jak utrwalacz Bouina i utrwalacz Helly'ego (patrz, na przykład, Humason, Animal Tissue Techniąues, W.H. Freeman and Co., 1967).
Kompozycje można nanosić bezpośrednio na rośliny przez, na przykład, rozpylanie lub opylanie, w czasie, gdy szkodnik zaczyna pojawiać się na roślinie lub zapobiegawczo przed pojawieniem się szkodników. Rośliny, które mogą być chronione według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do zbóż (pszenicy, jęczmienia, żyta, owsa, ryżu, sorgo i zbliżonych roślin uprawnych), buraków (buraka cukrowego i buraka pastewnego), pestkowców, drzew jabłkowatych i owoców miękkich (jabłoni, gruszy, śliw, brzoskwini, migdałowców, wiśni, truskawek, malin, i jeżyn), roślin strączkowych (lucerny, fasoli, soczewicy, grochu, soi), roślin oleistych (rzepiku, gorczycy, maku, oliwek, słoneczników, palm kokosowych, rącznika, kakaowców, orzechów ziemnych), dyniowatych (ogórków, dyni, melonów), roślin włóknistych (bawełny, lnu, konopi, juty), owoców cytrusowych (pomarańczy, cytryn, grejpfrutów, mandarynek), warzyw (szpinaku, sałaty, szparagów, kapusty i innych kapustnych, marchwi, cebuli, pomidorów, ziemniaków), wawrzynowatych (awokado, cynamonowca, kamforowca), drzew liściastych i iglastych (lip, cisów, dębów, olszy, topoli, brzóz, jodeł, modrzewi, sosen) lub takich roślin, jak kukurydza, rośliny darniowe, tytoń, orzechy, kawa, trzcina cukrowa, herbata, winorośl, chmiel, banany i rośliny kauczukowe, jak również rośliny ozdobne. Kompozycje można stosować na liście, do bruzd, w postaci granulek do rozsiewania rzutowego, „bocznicowo” lub przez drenaż gleby. Ogólnie rzecz biorąc ważne jest uzyskanie skutecznego zwalczania szkodników na wczesnych etapach wzrostu roślin, ponieważ jest to czas, w którym rośliny mogą ulec najsilniejszym uszkodzeniom. Jeśli zachodzi taka potrzeba, kompozycja do rozpylania lub opylania może zawierać inny pestycyd.
184 354
Korzystnie kompozycję stosuje się bezpośrednio na roślinę. Kompozycję można również stosować bezpośrednio do stawów, jezior, strumieni, rzek, wód stojących i innych obszarów zagrożonych plagą szkodliwych muchówek, a zwłaszcza szkodnikami mającymi związek ze zdrowiem publicznym. Kompozycję można stosować przez rozpyliinie, opylanie, zraszanie lub podobne.
Kompozycje mogą być skuteczne wobec szkodliwych owadów z rzędu motyli, np. Achroie griseOle, AcOeris gOoverene, Acleris variane, Adoxophyes orana, Agrotis ipsiOon, AOebeme argiOlecee, Alsophile pometerie, AmyeOois trensiteOOe, Anegaste kuehnieOOe, Anersie lineeteOOe, Anisote senetorie, Anthereee pernyi, Anticersie gemmeteOis, Archips sp., Argyroteenie sp., Athetis mindera, Bombyx mori, BeccuOetrix thurberieUe, Cedre cautelle, Choristoneure sp., Cichylis hospes, CoOies eurytheme, Corcyre cepheOonice, Cydia Oatiferreanus, Cydie pomonella, Datana integerrime, DendroOimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphenie hyeOineete, Diaphanie nitideOis, Dietreee grandiosella, Dietreee saccharalis, Ennomos subsignerie, Eoreume Ooftini, Ephestie eOuteOOe, Erannis tiliaria, Estigmene ecree, Eulia salubricole, Eupoeclia embigueda, Euproctis chrysorrhoea, Euxoe messoria, GeOOerie melloneOlaGrephoOite moOesta, Herrisine emericene, HeOicoverpe subflexa, Helicoverpe zea, HeOiothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosome eOecteUum, Hyphentrie cunee, Keiferia Oycopersicella, Lembdine fiscellaria fiscedaria, Lembdine fiscellaria lugubrosa, Leucome salicis, Lobesie botrene, Loxostege sticticalis, Lymentrie disper, Macalla thyrsisalis, MeOecosome sp, Memestre bressicee, Memestre configureta, Menduce quinquemecuOete, Menduce sexte, Meruce testuOeOis, MeOenchre picta, Operophtere brumeka, Orgyia sp, Ostrinie nubilalis, Peleacrite vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypieOOe, Phrygenidie cali/ornica, PhyOOnorycter blencerdella, Pieris nepi, Pieris rapae, POethypene scebra, POetynote flouendana, POetynote sultana, POetyptiOie carduidectyla, POodie interpuncteda, Plutella xyOosleOOa. Pontie protodice, PseudeOetie unipuncte, Pseudoplusia includens, SebuOodes eegrotete, Schizure concinna, Sitotroge cereelella, Spdonote ocellena, Spodoptere sp, Thaurnstopoea pityocempa, TineoOe bisselliella, Trichoplusie ni, Udee rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeute padella; rzędu muchówek,, np. Aedes sp, Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anestrephe suspensa, Anopheles berberi, AnopheOes quadrimaculatus, Armigeres subeObetus, CeUiphore stygien, Celliphora vicina, Ceretitis cepitete, Chironomus tentens, Chrysomye rufifacies, CochOiomyie mecellaria, CuOex sp, Culisete inornete, Dacus oleee, DeOie entiqua, Ddie platura, DeOie redicum, Drosophde melanogaser; Eupeodes corollae, GOossine austeni, GOossine brevipalpis, GOossine fuscipes, GOossine morsitens centralis, GOossine morsitens morsitens, GOossine morsitens submorsitens, GOossine pallidipes, GOossine peOpeOis gembiensis, GOossine peOpeOis peOpeOis, GOossine tachinoides, Heemegogus equinus, Heemetobie irritans, Hypoderme bovis, Hypoderme Oineetum, Leucopis ninee, LuciOOe cuprine, Lucilla sericata, Lutzomyie Oonglpeipis, Lutzom-yie shennoni, LycorieOOe meli, MeyetioOe destructor, Musce aulumnalis, Musce domestice, NeobeOOierie sp, Nephrotoma suturalis, Ophyre eenescens, Pheenicie sericete, PhOebotomus sp, Phormie regina, Sebethes cyeneus, Secrophege bulleta, Scetophege stercoraria, Stomoxys calcitrens, Toxorhynchites emboinensis, Tripteroides bambusa. Jednakże, kompozycje według wynalazku mogą również być aktywne wobec szkodliwych owadów z rzędu chrząszczy, np. Leptinotarse sp, AcenthosceOides obtectus, CeOOosobrunchus chinensis, EpiOachne verivestis, PyrrhaOta Outeola, CyOes formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, SitophiOus sp, CycOocephaOa boreelis, CycOocephaOa immaculata, MecrodactyOus subspinosus, PopiOOie japonica, Rhizotrogus majeOis, AOphitobius diaperinus, PeOorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, TriboOium castaneum, TriboOium confusum, Tribolius destructor; roztoczy, np. OOigonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tckranychus urticae; błonkówek, np. Iridomyrmex humilis, SoOenopsis invicta; termitów, np. ReticuOitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis engusticoOOis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; pcheł, np. Ceratophyllus gaOOinae, CeratophyOOus niger, Nosopsyllus fasciatus, LeptopsyOOa segnis, CtenocepheOides canis, Ctenocephelides felis, Echicnophaga gallinecee, Pulex irritans,
184 354
Xenopsylla cheopis, Xegopsylla vexabilis, Tunga pngntrags oraz nicieni z rodziny węgorkowatych, np. Mnlodidogygn igcoggita, Pratylenchus pngntrags.
Poniższe przykłady przedstawiono w celu zilustrowania wynalazku nie ograniczając jego zakresu.
7. Przykłady
Charakterystykę czynnika wzmacniającego. Jego odzyskiwanie i oczyszczanie przedstawiono szczegółowo poniżej.
7.1. Odzyskiwanie i oczyszczanie czynnika wzmacniającego
Fermentację szczepu EMCC0086 B. thuringiensis subsp. kurstaki (zdeponowanego w NRRL jako B-21147) prowadzono w ciągu 72 godzin w temperaturze 30°C w podłożu zawierającym źródło węgla, takie jak skrobia, hydrolizat skrobiowy lub glukoza i źródło azotu, takie jak białko, hydrolizat białkowy lub namok kukurydziany. Tworzenie się czynnika Ia wykrywano w 13 godzinie fermentacji. Najwyższą aktywność stwierdzano w około 30 godzinie.
Supematant z fermentacji B. thuringiensis subsp. kurstaki odzyskiwano przez wirowanie, a następnie klarowano drogą ultrafiltracji przez membranę MW-CO o przepuszczalności do 30 kDa, stosując w tym celu układ UF Rhone Poulenc. Filtracja przez membrany o przepuszczalności do 30 kDa doprowadziła do usunięcia pozostałych szczątków komórek, krystalicznej delta-endotoksyny, przetrwalników i białek rozpuszczalnych o masie cząsteczkowej wyższej niż 30 kDa. Przesącz zagęszczono 10-krotnie przez odparowanie. Przesącz odwirowano, a następnie przefiltrowano przez membranę o średnicy porów 0,2 m w celu dalszego usunięcia nierozpuszczalnych składników brzeczki, otrzymując klarowną brzeczkę zawierającą czynnik Ia.
Oczyszczanie czynnika Ia do jednorodności uzyskano stosując wieloetapową procedurę oczyszczania przedstawioną schematycznie na fig. 1. W procesie opisanym powyżej, oczyszczanie prowadzono za pomocą ultrafiltracji. Przesącz otrzymany w wyniku ultrafiltracji przez membranę o przepuszczalności do 5 kDa adsorbowano na złożu kationowymiennym Sulphopropyl (SP) i eluowano roztworem octanu amonu. Związek zagęszczono następnie około 30-krotnie przez liofilizację, a sól i inne zanieczyszczenia usunięto stosując kolumnę do sączenia molekularnego P2 BioRad. Połączone frakcje z kolumny P2 rozdzielano na kolumnie SP HPLC do wysokorozdzielczej chromatografii kationowymiennej, co prowadzi do uzyskania homogenicznego związku. Zanieczyszczająca sól usuwa się przez kilkakrotną liofilizację.
Aktywność monitorowano za pomocą mikrooznaczenia biologicznego z wykorzystaniem Spodoptera exigua, a czystość oznaczano za pomocą elektroforezy kapilarnej. Próbki zawierające 50 ml czynnika Ia i 50 ml białka CryIA(c) (15 mg/ml) oczyszczonego z BIOBIT™ FC (100 ml) nanoszono do pojedynczych studzienek w galaretowatej podstawce, zawierających 500 ml zestalonej sztucznej diety dla owada. Podstawki zawierające różne próbki suszono na powietrzu. Do studzienek zawierających wysuszone próbki podano dwa do czterech owadów Spodoptera exigua w fazie drugiej lub wczesnej trzeciej wylinki. Studzienki zamknięto mylarem z otworami i inkubowano w ciągu 2-3 dni w temperaturze 30°C. Następnie zarejestrowano stopień zahamowania rozwoju oraz śmiertelność w procentach. Zazwyczaj prowadzi się 5 powtórzeń identycznych studzienek dla każdej próbki.
7.2. Określenie struktury
Stwierdzono, że aktywny związek jest rozpuszczalny w wodzie, a nierozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych. Jest on dodatnio naładowany i reaguje z ninhydryną, co udowodniono stosując chromatografię cienkowarstwową na krzemionce. NMR 13C i protonowy związku przedstawiono odpowiednio na fig. 2 i 3. Badania 13C NMR wykazały obecność 13 atomów węgla (odnoszące się do kwasu 3-(trimetylosililopropionowego). Doświadczenie DEPT wykazało, że w związku tym występują trzy czwartorzędowe atomy węgla (C), siedem grup metinowych (CH), trzy grupy metylenowe (CH2) i żadnej grupy metylowej (CH3). Stosując odsprzęgania protonów'', takie jak odsprzęganie 1-D i COSY, zidentyfikowano jeden duży układ spinowy zawierający osiem atomów węgla. Ponadto, obecny jest mniejszy układ
184 354 spinowy zawierający dwa atomy węgla. Eksperyment korelacyjny węglowo-protonowy (HMBC) umożliwił wyznaczenie rezonansu każdego protonu w cząsteczce do związanego z nim atomu węgla.
W wyniku traktowania aktywnego związku (13 mg) bezwodnikiem octowym w pirydynie powstaje acetylowana pochodna, która jest znacznie mniej polarna. Pochodną tą oczyszczono przez HPLC, uzyskując 3 mg czystej zacetylowanej pochodnej. Analiza z wykorzystaniem spektroskopii masowej wykazała, że pochodna ta posiada 7 grup acetylowych i masę cząsteczkową 690, co daje masę cząsteczkową aktywnego związku 396 i wskazuje, że obecna jest parzysta liczba atomów azotu. Wykryto również fragmenty zawierające 6 grup acetylowych i 5 grup acetylowych. Dane o wysokiej rozdzielczości dla jonów potomnych zawierających 5 i 6 grup acetylowych wynoszą 645,2594 (6 grup acetylowych) i 607,2519 (5 grup acetylowych), co wskazuje na następujący wzór cząsteczkowy czynnika Ia, C|1H28N6°8.
Działanie na aktywny związek (13 mg) 6 N HCl prowadzi do wytworzenia pochodnej dającej dodatnią reakcję z ninhydryną. Wyniki te wskazują na obecność wiązań amidowych. Pochodna ma taką samą wartość Rf, jaką wyznaczono przez chromatografię cienkowarstwową dla kwasu 2,3-diaminopropionowego. Wyniki te wraz z danymi NMR sugerują obecność kwasu 2,3-diaminopropionowego.
Inną techniką wykorzystaną do analizy czynnika Ia była nOe (jądrowy efekt Overhausera), dzięki której można wyznaczyć wzajemną bliskość protonów w przestrzeni. nOe prowadzono na zacetylowanej pochodnej. W dwukierunkowym doświadczeniu nOe (NOESY), nOe zaobserwowano pomiędzy protonem N-H przy 8,06 ppm i protonem 5,17 (fig. 4).
Ustalono następującą strukturę czynnika Ia:
OH
Związek ten można zaliczyć do ureidoamidów. Jego składniki obejmują 2 grupy amidowe, mocznik, dwie aminy i pięć grup hydroksylowych. Zawiera on siedem centrów chiralnych.
7.3 Właściwości czynnika Ia
Stwierdzono, że wyizolowany czynnik Ia wzmacnia aktywność białek pestycydowych krystalicznej delta-endotoksyny Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki i Bacillus thuringiensis subsp. aizawai wobec Spodoptera exigua bez względu na postać białek pestycydowych. Wzmacniana jest aktywność pestycydowa preparatów B.t.k, wyizolowanych kryształów i białek CrylA, o pełnej długości (masa cząsteczkowa 130 kDa) lub skróconych (masa cząsteczkowa około 65 kDa). Wzmacniana jest również aktywność inkluzji CryII i CryIC. Stwierdzono również wzmacnianie aktywności pojedynczych, skróconych białek CryIA(a), (b) i (c). Nie stwierdzono, aby czas inkubacji czynnika Ia z białkiem Cry miał zasadnicze znaczenie dla aktywności biologicznej. Jednakże, sam czynnik Ia jest nieaktywny. Stwierdzono, że poziom wzmocnienia jest 100-200 krotny dla skróconych białek CryIA oraz inkluzji CryII i CryIC i około 320 krotny dla pełnej długości CryIA(c) (patrz odpowiednio tabela 1 i 2). Szczególnie w przypadku białka o pełnej długości, stężenie 0,75 mg/ml CryIA(c) powodowało taką samą śmiertelność owadów/stopień zahamowania rozwoju, gdy dodano czynnik Ia,
184 354 jak 240 mg/ml samego białka CryIA(c). W przypadku skróconego CryIA(c), przy OD,8q wynoszącym 0,0006 w połączeniu z czynnikiem Ia otrzymano taki sam stopień zahamowania rozwoju, jak dla próbki samego CryIA(c) przy OD28() wynoszącym 0,075. Inkluzje CryII w stężeniu 0,6 mg/ml w połączeniu z czynnikiem Ia dawały taki sam stopień zahamowania rozwoju i podobną śmiertelność jak samo białko CryII w stężeniu 75 mg/ml, co stanowi 125-krotne wzmocnienie. Inkluzje CryIC przy stężeniu 0,3 mg/ml z dodatkiem czynnika Ia dają podobną śmiertelność i stopień zahamowania rozwoju, jak samo białko CryIC w stężeniu 75 mg/ml, co odzwierciedla 250-krotny poziom wzmocnienia. Stężenie białka CryIA, które powodowało zahamowanie rozwoju, po dodaniu czynnika Ia prowadziło do śmierci.
W oznaczeniu biologicznym opisanym w części 7.1, stwierdzono, że czynnik Ia zachowuje stabilność w temperaturze wrzenia w ciągu 5 minut, ale traci całą aktywność podczas autoklawowania (>190°C). Ponadto, jest on stabilny po poddaniu bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu co najmniej 10 godzin. Czynnik Ia jest stabilny w pH 2 w ciągu 3 dni, ale niestabilny w pH 12. Stwierdzono, że traci całą aktywność po wystawieniu na działanie kwasu nadjodowego lub stężonego HCl.
Tabela 1
Wzmacniający wpływ czynnika Ia na oczyszczone skrócone białka Bacillus thuringiensis
Białko Bt Czynnik Spodoptera Exigua
Typ od280 Śmiertelność’ Stopień zahamowania rozwoju1
CryIa(a) 0,055 - 0/5 2,2
0,040 - 0/5 2,2
0,020 - 0/5 2,0
0,020 + 2/5 0,0
0,010 + 0/5 0,2
0,005 + 0/5 0,0
0,0025 + 0/5 0,4
0,0012 + 0/5 1,8
0,0006 + 0/5 1,6
CryIA(c) 0,075 - 0/5 3,4
0,040 - 0/5 2,6
0,020 - 0/5 2,8
0,020 + 1/5 0,0
0,010 + 0/5 0,2
0,005 + 1/5 0,0
0,0025 + 2/5 2,0
0,0012 + 0/5 1,0
0,0006 + 1/5 1,0
Brak + 0/5 4,0
Brak - 0/5 4,0
* ,
Śmiertelność = liczba owadów martwych/liczba wszystkich owadów po 2 dniach.
t Stopień zahamowania rozwoju zdefiniowana jako średnia wielkość żywej larwy owada pod koniec oznaczenia biologicznego: 4,0 = próba kontrolna nietraktowana, 3,0 = 75% wielkości kontroli, 2,0 = 50% wielkości kontroli, 1,0 = 25% wielkości kontroli, 0,0 = brak wzrostu lub wielkość niezmieniona od rozpoczęcia doświadczenia.
184 354
Tabela 2
Wzmacniający wpływ czynnika Ia na białko Bt
Białko Bt Czynnik Spodoptera Exigua
Typ OD280 Śmiertelność* Stopień zahamowania rozwoju t
1 2 3 4 5
CryIA(c) 240 ' - 1/5 0,5
120 - 0/5 2,2
60 - 0/5 2,2
30 - 0/5 4,0
60 + 5/5 —
30 + 5/5 —
15 + 4/5 0,0
3 + 4/5 1,0
0,8 + 2/5 1,6
CryII 300 - 1/5 0,8
150 - 2/5 0,7
75 - 1/5 0,2
38 - 0/5 0,8
19 - 0/5 1,6
9 - 0/5 1,8
5 - 1/5 4,0
38 + 3/5 1,0
19 + 2/5 0,5
9 + 3/5 0,0
5 + 1/5 0,5
2,4 + 1/5 0,0
1,2 + 3/5 0,5
0,6 + 2/5 0,3
CryII 300 - 2/5 0,3
150 - 2/5 0,0
75 - 1/5 0,8
38 - 0/5 3,2
38 + 5,5 —
19 + 5/5 -
9 + 5/5 —
5 + 4/5 0,0
2,4 + 1/5 0,0
1,2 + 5/5 -
184 354 ciąg dalszy tabeli 2
1 2 3 4 5
0,6 + 3/5 1,5
0,3 + 2/5 1,3
Brak - 0/5 4,0
Brak + 0/5 4,0
* ,
Śmiertelność = liczba owadów martwych/liczba wszystkich owadów po 2 dniach.
* Stopień zahamowania rozwoju zdefiniowana jako średnia wielkość żywej larwy owada pod koniec oznaczenia biologicznego: 4,0 = kontrola nietraktowana, 3,0 = 75% wielkości kontroli, 2,0 = 50% wielkości kontroli, 1,0 = 25% wielkości kontroli, 0,0 = brak wzrostu lub wielkość niezmieniona od rozpoczęcia doświadczenia.
7.4 Ocena innych podgatunków Bacillus thuringiensis i innych gatunków Bacilli
Kilka gatunków Bacilli oceniono pod kątem wytwarzania czynnika Ia. Szczepy poddawano fermentacji w ciągu 72 godzin w temperaturze 30°C w podłożu zawierającym źródło węgla, takie jak skrobia, hydrolizat skrobiowy lub glukoza, oraz źródło azotu, takie jak białko, hydrolizat białkowy lub namok kukurydziany. Supematanty testowano pod kątem wytwarzania czynnika Ia stosując opisane powyżej mikrooznaczenie biologiczne z wykorzystaniem Spodoptera exigua. Stwierdzono, że szczepy B. thuringiensis subsp. aizawai EMCC0087 (zdeponowany w NRRL jako NRRL B-21148) i B. thuringiensis subsp. galleriae (zdeponowany w NRRL) wytwarzają czynnik Ia w przybliżeniu w takim samym stężeniu, jak B. thuringiensis subsp. kurstaki.
Według oznaczenia elektroforezą kapilarną, czynnik Ia wytwarzają również B. subtilis, B. cereus, B.t. subsp. alesti, B.t. subsp. canadiensis, B.t. subsp. darmstadiensis, B.t. subsp. dendrolimus, B.t. subsp. entomocidus, B.t:. subsp. finitimus, B.t:. subsp. israelensis, B.t:. subsp. kenyae, B.t. subsp. morrisoni, B.t. subsp. subtoxicus, B.t:. subsp. tenebrionis, B.t. subsp. thuringiensis, B.t:. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subtilis i mutant cry- spo- B. thuringiensis subsp. kurstaki.
Do ilościowego oznaczenia czynnika Ia korzystnie stosuje się urządzenie Beckman P/ACE Capillary Electrophoresis System wyposażone w nieopłaszczoną kapilarę o wymiarach 50 mm x 57 cm, 0,2 M bufor fosforanowy pH 6,8, napięcie 15 KV i detekcję przy długości fali 200 nm. Objętości próbek wynoszą 20 nl, a czas rozdziału 25 minut.
Krzywą standardową tworzy się stosując jako standard oczyszczony czynnik Ia w stężeniach 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml oraz 0,078 mg/ml. Tworzy się liniową krzywą kalibracyjną. Do obliczania stężenia czynnika Ia w każdej próbce stosuje się otrzymane równanie y = mx + b.
Przed każdym rozdzielaniem kapilarę przemywa się buforem do elektroforezy (0,2 M bufor fosforanowy, pH 6,8) w przeciągu trzech minut. Po każdym trwającym 25 minut rozdzielaniu kapilarę przemywa się 1 N NaOH w ciągu 1 minuty, wodą filtrowaną przez HPLC w ciągu 1 minuty, 0,5 M kwasem fosforowym w ciągu 3 minut i wodą filtrowaną przez HPLC w ciągu 1 minuty. Pole powierzchni pod każdym pikiem całkuje się i określa się pole powierzchni piku oraz oblicza się stężenie końcowe na podstawie krzywej standardowej.
7.5. Ocena produktów B.t.
Ilość czynnika Ia obecnego w różnych komercyjnie dostępnych produktach określono przez elektroforezę kapilarną opisaną powyżej. BACTOSPEiNe™, JAVELIN™, NOVODOR™, SPHERIMOS™, BACTIMOS™, FORAY™, FLORBAC™ i BIOBIT™ uzyskano z Novo Nordisk A/S. XENTARI™ i DIPEL™ uzyskano z Abbot Laboratories, AGREE™ uzyskano z Ciba-Geigy: MVP™ uzyskano z Mycogen i CUTLASS™ uzyskano z Ecogen.
Wyniki przedstawione w tabeli 3 wskazują, że czynnik Ia występuje w zróżnicowanych ilościach, w zakresie od mniej niż 0,001 g Ia/BlU do 0,071 g Ia/BIU.
184 354
Tabela 3
Czynnik la w produktach Bacillus thuringiensis
Produkt Typ Numer serii Siła działania Ia g/BIU
JAVELINO WG Btk 9942281 32000 IU/mg 0,071
XENTARIO Bta 58715PG 15000 IU/mg 0,06
agreeó Bta/Btk RA2080 25000 IU/mg 0,033
BIOBITÓ HPWP Btk 5012 48950 U/mgPIA 0,018
biobitó FC Btk AG46669071 8 BIU/L 0,013
FORAYÓ 48B Btk BBN7018 12,6 BIU/L 0,012
DIPELÓ Btk 58739PG 32000 IU/mg 0,011
FORAYÓ 76B Btk 20,0 BIU/L 0,007
BACTOSPEINEÓ Btk BOBOOl 123653 IU/mg 0,003
BACTOSPEINEÓ Btk KX02A 100000 IU/mg 0,003
BACTOSPEINEÓ Btk WP 16000 IU/mg <0,001
NOVODORO Btt 9024 16,3 miliona LTU/qt 9,5x10-9 g/LTU
FLORBACÓ Bta 082-31-1 30000 U/mg E <0,001
spherimosó B. sphr BSN006 brak
mvpó Btk 21193542 brak
cutlassó Btk/Btk brak
BACTIMOSÓ Bti B1B0024 11700 IU/mg brak
7.6 Próby biologiczne wprowadzania do pokarmu
Aktywność B.t.k. oznaczano w próbach biologicznych przez wprowadzania do sztucznego pokarmu larw Spodoptera exigua w stadium trzeciej wylinki, larw Helicoverpa zea w stadium drugiej wylinki, larw Spodoptera frugiperda w stadium trzeciej wylinki, larw Heliothis virescens w stadium drugiej wylinki, larw Trichoplusia ni w stadium trzeciej wylinki, larw Pseudoplusia includens w stadium trzeciej wylinki, larw Plutella xylostella w stadium trzeciej wylinki, larw Spodoptera littoralis w stadium trzeciej wylinki i larw Mamestra brassicae w stadium trzeciej wylinki.
W celu określenia poziomu wzmocnienia w wyniku dodania czynnika Ia do produktów B.t:. i ustalenia zakresu owadów ulegających wpływowi czynnika Ia, przeprowadzono oznaczenia biologiczne przez wprowadzanie do pokarmu. W doświadczeniach z wysokimi stężeniami czynnika Ia wobec Spodoptera exigua (7,4-23,7 g czynnika Ia/BIU), oczyszczony czynnik Ia (70% składnika aktywnego, 30% octanowego jonu o przeciwnym ładunku) stosuje się do wzmocnienia BIOBIT™ FC (FC oznacza koncentrat do uzyskiwania postaci płynnej). Pozostałe dane podane w tabeli 4 przedstawiają wzmocnienie BIOBIT™ HPWP (proszek zawiesinowy o wysokiej sile działania) przez czynnik Ia (0,658% aktywnego czynnika Ia). S. Littoralis i M. Brassicae testowano stosując FLORBAC™ HPWP i czynnik Ia.
Różne produkty B.t:. zważono i dodano czynnik Ia w ilości odpowiadającej 0,1 do 237 g czynnika Ia/BIU. Objętość regulowano za pomocą 0,1% Tween™. Próbki poddano ultradźwiękom w ciągu 1 minuty, a następnie rozcieńczono do objętości końcowej. Przygotowano również próbki samego pestycydu (bez czynnika wzmacniającego) i substancji odniesienia. Substancje odniesienia obejmują B.t.k.. HD-1-S-1980 (otrzymany z NRRL) o oznaczonej sile działania 16 000 jednostek międzynarodowych (IU) na miligram, i .EWELIN'™ WG o oznaczonej sile działania 53 000 jednostek Spodoptera (SU)/mg.
184 354
Standardowy sztuczny pokarm złożony z wody, agaru, cukru, kazeiny, kiełków pszenicy, parabenu metylowego, kwasu sorbinowego, oleju lnianego, celulozy, soli i witamin przygotowano w ogrzewanym kotle o pojemności 20 litrów. Zapewnia to wystarczającą ilość pokarmu do przetestowania 10 do 12 próbek dla siedmiu różnych stężeń każdej testowanej substancji. Roztwory B.t. poddano kolejnym rozcieńczeniom uzyskując próbki o objętości 16 ml. Każdą próbkę dodawano do 184 g płynnego pokarmu. Mieszaninę następnie homogenizowano, a potem wlano do plastikowej płytki zawierającej 40 pojedynczych komór. Dla każdej partii pokarmu przygotowano po trzy płytki kontrolne. Po schłodzeniu i zestaleniu, do każdej komory wprowadzono jednego owada o znanym wieku (stadium 2-3 wylinki) i płytki przykryto arkuszem przejrzystego mylar z otworami. Płytki umieszczono w statywach i inkubowano przez cztery dni w temperaturze 28°C i 65% wilgotności względnej.
Po czterech dniach określono śmiertelność owadów. Każdą płytkę uderzano mocno 0 blat stołu i larwy, które się nie poruszały, zliczono jako martwe. Obliczono % śmiertelności i dane przeanalizowano wykorzystując równoległą analizę probit. Oceniano LC50, LCę0, nachylenie linii regresji, współczynnik wariacji i siły działania. Próbki analizowano minimum trzy razy lub dopóki trzy wartości siły działania nie różniły się o więcej niż 20% od obliczonej średniej dla każdej próbki. W celu obliczenia, wzrostu aktywności związanego z każdym stężeniem czynnika Ia, w LC50 próbki B.t./czynnik Ia uwzględniano poprawkę, tak aby odzwierciedlało ilość B.t:. w próbce. LC50 sparowanych próbek bez czynnika Ia dzielono przez poprawione wartości LC50 otrzymując wielokrotność obniżenia LC50 związaną z czynnikiem Ia.
W oznaczeniu z Lobesia bothrana stosowano następującą procedurę. Winoroślą zaatakowane Lobesia bothrana zbierano z nieopryskiwanych upraw i usuwano larwy. Wykonano szereg rozcieńczeń czynnika Ia (250 mg/ml, 500 mg/ml i 1000 mg/ml) w wodzie. Jedną larwę umieszczano na środku szalki Petri'ego. Po zaobserwowaniu picia przez larwę, przenoszono ją na świeżo ścięte winogrona. Larwy utrzymywano w temperaturze 22°C w ciągu 3-4 dni.
Jak przedstawiono w tabeli 4, obserwowano znaczące obniżenia LC50 dla wszystkich gatunków.
Tabela 4
Oznaczenia biologiczne wprowadzania do pokarmu
Owad Czynnik g/BIU Wzrost aktywności/Wielokrotność obniżenia, LCS0
1 2 3
Spodoptera exigua (BIOBITÓ HPWP) 0,1 1,5
0,2 1,7
2,0 4,3
4,0 7,5
Spodoptera exigua (BIOBITÓ FC) 7,4 13
15 26
30 34
118 59
237 79
Spodopterafrugiperda (BIOBITÓ HPWP) 0,2 2,2
0,8 3,9
2,0 7,2
4,0 11,6
184 354 ciąg dalszy tabeli 4
1 2 3
Trichoplusia ni (BIOBITÓ HPWP) 0,1 1,1
0,2 1,2
2,0 2,0
4,0 3,1
Pseudoplusia includens (BIOBITÓ HPWP) 0,1 0
0,2 1,2
0,8 2,1
2,0 2,4
4,0 3,4
Plutella xylostella (BIOBITÓ HPWP) 0,2 16
0,8 1,3
2,0 1,4
4,0 1,9
Helicoverpa zea (BIOBITÓ HPWP) 3,2 12,6
Heliothis virescens (BIOBITÓ HPWP) 3,2 4,2
Lobesia bothrana (BIOBITÓ HPWP) 2,0 3,0
Spodoptera littoralis (FLORBACO HPWP) 2,0 8,6
Mamestra brassicae (FLORBACO HPWP) 2,0 4,9
Wzmocnienie przez czynnik Ia różnych produktów wobec Spodoptera exigua określano stosując opisane powyżej oznaczenie biologiczne wprowadzania do pokarmu. Ilość dodanego czynnika Ia/BIU produktu przedstawiono w tabeli 5 poniżej. Mieszaninę czynnik Ia/produkt B.t. wprowadzano do pokarmu na bazie agaru zawierającego kiełki pszenicy i kazeinę. Owady umieszczano na pokarmie na cztery dni w temperaturze 28°C. Śmiertelność rejestrowano i analizowano wykorzystując analizę probit. LC50, I.Cyo i siłę działania obliczano przez porównanie z produktem nie zawierającym czynnika Ia. Wyniki przedstawione w tabeli 5 wskazują, że czynnik Ia wzmacnia różne produkty B.t.k.. i B.t.a. uzyskane z różnych źródeł. Szczepy B.t.. zawarte w tych produktach opisano w części 5.2.
Tabela 5
Wzmacnianie produktów B.t. wobec Spodoptera exigua
Produkt g czynnika Ia na BIU Wzrost aktywności/Wielokrotność obniżenia, LC50
1 2 3
BACTOSPEINEÓ WP 0,4 1,04
1,7 2,3
CONDORO 0,4 2,4
1,7 5,1
AGREEÓ 0,4 1,1
1,7 1,6
184 354 ciąg dalszy tabeli 5
1 2 3
CUTLASSÓ 0,4 1,1
1,7 2,5
MVPÓ 0,4 6,0
1,7 7,7
2,0 12,1
FLORBACÓ HPWP 0,2 hi
0,8 2,0
DIPELÓ 2x 0,2 1,2
0,8 2,3
2,0 3,9
JAVELINÓ WG 0,2 0
0,8 1,08
2,0 2,9
XENTARIÓ 0,2 1,2
0,8 1,6
2,0 2,4
7.7 Próby biologiczne na liściach
Próby biologiczne na liściach prowadzono z larwami Spodoptera exiguana w stadium drugiej wylinki na brokułach, stosując BIOBITÓ FC i czynnik Ia. Stosunek czynnika Ia do BIOBITÓ FC jest taki sam, 2 g czynnika Ia/BIU BIOBITO FC. Brokuły traktowano w objętości nośnika 180 l/ha stosując rozpylacz gąsienicowy. Po wyschnięciu rozpylonego środka liście usuwano, a następnie infekowano larwami Spodoptera exigua w stadium drugiej wylinki. Wyniki przedstawiono w tabeli 6. 100% śmiertelności obserwowano przy ilości 8,7 BI U/hektar BIOBITÓ FC + czynnik la, podczas gdy sam BIOBITO FC zabija 92% larw w ilości 58,8 BlU/hektar i 8% w ilości 17,6 BlU/hektar. Traktowane rośliny poddano również bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu ośmiu godzin, po czym liście wycięto i zainfekowano. Po ośmiu godzinach na ś^wii^t-Iie, sam BIOBITÓ FC w ilości 58,8 BIU/hektar powodował 27% śmiertelności, podczas gdy BIOBITÓ FC + czynnik Ia powodują 100% śmiertelności w ilości 8,7 BlU/hektar.
W oznaczeniu na liściach wykonanym z larwami we wczesnym stadium czwartej wylinki stwierdzono 75% śmiertelności dla samego BIOBITÓ FC w ilości 52 BlU/hektar i 100% śmiertelności dla BIOBITÓ FC (FC oznacza koncentrat do uzyskiwania postaci płynnej) + czynnik Ia w ilości 13 BlU/hektar.
Tabela 6
Oznaczenie biologiczne na liściach
Traktowanie BlU/hektar % śmiertelności Wylinka larwalna
1 2 3 4
BIOBITÓ FC 58,8 92% 2
BIOBITÓ FC 17,6 8% 2
BIOBITÓ FC + 1a 8,7 100% 2
184 354 ciąg dalszy tabeli 6
1 2 3 4
BIOBITÓ FC + 8h światła słonecznego 58,8 27% 2
BIOBITÓ FC + Ia + 8h światła słonecznego 8,7 100% 2
BIOBITÓ FC 52 75% 4
BIOBITÓ FC Ia 13 100% 4
7.8. PRÓBY POLOWE
Próby polowe na fasoli odmiany garbonzo (Spodopters exigus) wykazały, że sam BIOB1TÓ FC w ilości 70 BlU/hektar zapewnia 51% zwalczania szkodnika, podczas gdy 2 g czynnika Ia/BIU BIOBITÓ FC w ilości 40 BlU/hektar zapewnia 89% zwalczania (w porównaniu z brakiem traktowania). JAVELINÓ WG w ilości 45 BlU/hektar zapewnia 51% zwalczania.
Próby polowe na kukurydzy cukrowej (Spodopters frugiperds) wykazały, że przy ilości 39,5 BlU/hektar, 2 g czynnik Ia/BIU BIOBITÓ FC zapewnia 84% zwalczania.
7.9. Stosunki oporności
Oznaczeniu biologicznemu poddano wrażliwe i oporne kolonie Plutells xylostells. Próbki opornych ciem zebrano z pól z Florydy gdzie rozwinęła się oporność na U.t, w wyniku intensywΛ Λ nej ekspozycji na JAVELINO WG. BIOBITO HPWP z czynnikiem Ia poddano analizie stosując oznaczenie biologiczne z zanurzaniem liści. Oporność na JAVELINÓ i XENTARIÓ określano bez czynnika Ia. Krążki liści kapusty o średnicy 6 cm zanurzono na 10 sekund w jednym z ośmiu różnych stężeń produktów U. t. lub preparatów U. t./czynnik Ia. Stosowano stężenia w zakresie od 1 do 1000 ppm. Krążki liściowe pozostawiano na dwie godzżny do wysclrnięcia na powietrzu, a następnie umieszczono w plastikowych szalkach Petri'ego z larwami w stadium drugiej wylinki (0,2 do 0,4 mg). 25 owadów/dawkę/dzień podwojono otrzymując 50 owadów/dawkę. Po 72 godzinach w temperaturze 27°C rejestrowano śmiertelność. Regresję zależności dawka-śmiertelność analizowano wykorzystując analizę probit. Stosunki oporności obliczono dzieląc wartości LC50 i LC90 dla wrażliwych ciem. Wyniki przedstawiono w tabeli 7 i wskazująone, że BIOBITÓ HPWP ulega wzmocnieniu dla 2 g czynnika Ia/BIU i 4 g czynnika Ia/BIU. Zwłaszcza dla 4 g czynnika Ia/BIU występuje 2-krotne obniżenie stosunku oporności LC50 i 10-krotne obniżenie stosunku oporności LCM.
Tabela 7
Stosunki oporności Plutells xylostells (opornych na U.t.k.)
Testowany produkt Stosunek oporności LC5o Stosunek oporności LC9)
JAVELINÓ WG 302,6 3829,7
BIOBITÓ HPWP 20,5 98,5
2,0 g Ia/BIU BIOBITO HPWP 23,2 88,0
4,0 g Ia/BIU BIOBITO HPWP 10,4 11,5
XENTARIÓ 9,7 8,2
184 354
8. DEPOZYT MIKROORGANIZMÓW
Następujące szczepu Bacillus thuriggingsis zdeponowano na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego w Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604,USA.
Szczep Numer dostępu Data depozytu
EMCC0086 NRRL B-21147 6 października 1993
Szczepy zdeponowano na warunkach, które zapewniają, że dostęp do kultur podczas trwania postępowania patentowego tego zgłoszenia patentowego będzie możliwy dla osób określonych przez Kierownika Biura Patentowego i Znaków Towarowych, upoważnionego do tego na podstawie 37 C.F.R. §1.14 i 35 U.S.C. §122. Depozyt stanowi zasadniczo czystą kulturę każdego ze zdeponowanych szczepów Depozyt jest dostępny, zgodnie z wymaganiami zagranicznego prawa patentowego w krajach, w których złożono kopie niniejszego zgłoszenia lub jego odpowiedniki.
184 354
Obserwowane nOe
8.2
8.06
5.17
5.17,5.34
(8.06, 5.54) (8.06, 5.17) (8.2, 5.17)
9.
8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 5.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3
Fig. 4
184 354
Fig. 3
184 354
CM
LL
184 354
10-krotnie zatężony supematant po fermentacji Btk NB75
I
Wirowanie
Sączek o średnicy porów 0,2 μιη Nieoczyszczony supernatant po sączeniu przez sączek o średnicy porów 0,2 pm l
Ultrafiltracja przez błonę o przepuszczalności do 5 kDa i
Permeat o przepuszczalności do 5 kDa l
Wymiana kationowa na SP
Zebrane frakcje po SP
Zatężanie przez liofilizację
I
Sączenie molekularne na P2 4/
Zebrane frakcje po P2 1
SP HPLC
Połączone frakcje zebrane po SP HPLC
I
Wielokrotna liofilizacja ł
Czysty związek
Fig. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 4,00 zł.

Claims (11)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wzmacniania aktywnoścć pestycydowej pwstycydu awiązzcego n Bacillus obejmujący hodowlę szczepu Uscillus, izolację czynnika wzmacniającego z supematantu hodowli i stosowanie czynnika wzmacniającego łącznie z pestycydem związanym z Uscillus, znamienny tym, że po hodowli szczepu Uscillus, z supematantu izoluje się, a następnie stosuje łącznie z pestycydem związanym z Uscillus, czynnik wzmacniający o wzorze i posiadający w widmie *H NMR przesunięcia przy około δ 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43,
    3,58, 3,73, 3,9δ, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35 i w widmie 13C przesunięcia przy około 31,6, 37,2,
    51,1, 53,3, 54,0, 54,4, 61,5, 61,6, 64,1, 65,6, 158,3, 170,7 i 171,3 lub jego sól.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep Uscillus hoduje się w podłożu fermentacyjnym.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik wzmacniający izoluje się z supematantu hodowli przez chromatografię kolumnową.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep Uscillus stanowi szczep Uscillus thuringiensis.
  5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że szczep Uscillus thuringiensis wybiera się z grupy składającej się ze szczepów Uscillus thuringiensis subsp. sizswsi, Uscillus thuringiensis subsp. slesti, Uscillus thuringiensis subsp. csnsdiensis, Uscillus thuringiensis subsp. colmeri, Uscillus thuringiensis subsp. coresnensis, Uscillus thuringiensis subsp. dskots, Uscillus thuringiensis subsp. dsrmstsdiensis, Uscillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Uscillus thuringiensis subsp. entemocidus, Uscillus thuringiensis subsp.finitimus, Uscillus thuringiensis subsp. gsllerise, Uscillus thuringiensis subsp. indisns, Uscillus thuringiensis subsp. isrselensis, Uscillus thuringiensis subsp. kenyse, Uscillus thuringiensis subsp. kumsmotoensis, Uscillus thuringiensis subsp. kurstski, Uscillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Uscillus thuringiensis subsp. jsponensis, Uscillus thuringiensis subsp. mexcsnensis, Uscillus thuringiensis subsp. morrisoni, Uscillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Uscillus thuringiensis subsp. nigerise, Uscillus thuringiensis subsp. ostrinise, Uscillus thuringiensis subsp. pskistsni, Uscillus thuringiensis subsp. pondicheriensis. Uscillus thuringiensis subsp. shsndongiensis, Uscillus thuringiensis subsp. siło, Uscillus thuringiensis subsp. sotto, Uscillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Uscillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Uscillus thuringiensis subsp. thompsoni, Uscillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Uscillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Uscillus thuringiensis subsp. tolworthi, Uscillus thuringiensis subsp. toumsnoffi, Uscillus thuringiensis subsp. wuhsnensis i Uscillus thuringiensis subsp. yunnsnensis.
    184 354
  6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że szczepem Bacillus thuringiensis jest szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pestycyd związany z Bacillus obejmuje endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment wybiera się z grupy składającej się z CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV i CryVI.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowo fragmentem jest endotoksyną delta CryIA Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.
  10. 10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowo fragmentem jest endotoksyną delta CryIC Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowo fragment.
  11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pestycyd związany z Bacillus obejmuje przetrwalniki Bacillus thuringiensis.
PL96323468A 1995-06-06 1996-05-30 Sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus PL184354B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47028995A 1995-06-06 1995-06-06
PCT/US1996/007807 WO1996039037A1 (en) 1995-06-06 1996-05-30 Methods for producing a potentiator of bacillus pesticidal activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323468A1 PL323468A1 (en) 1998-03-30
PL184354B1 true PL184354B1 (pl) 2002-10-31

Family

ID=23866995

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96323468A PL184354B1 (pl) 1995-06-06 1996-05-30 Sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0831708A1 (pl)
JP (1) JP3773265B2 (pl)
KR (1) KR19990022529A (pl)
AU (1) AU708302B2 (pl)
CA (1) CA2223034C (pl)
CZ (1) CZ373197A3 (pl)
HU (1) HUP9901114A3 (pl)
PL (1) PL184354B1 (pl)
RU (1) RU2192744C2 (pl)
WO (1) WO1996039037A1 (pl)
ZA (1) ZA963323B (pl)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919447A (en) * 1996-11-18 1999-07-06 Agraquest, Inc. Strain of bacillus for controlling plant disease
US6245551B1 (en) 1999-03-30 2001-06-12 Agraquest, Inc. Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi
HUP0200562A2 (en) 1999-03-30 2002-06-29 Agraquest Inc A strain of baccilus pumilus for controlling plant diseases
RU2452181C2 (ru) * 2010-07-02 2012-06-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный аграрный университет" (ФГБОУВПО КГАУ) Состав для адаптации биопестицидов
US20240245057A1 (en) 2021-06-02 2024-07-25 Sds Biotech K.K Insecticidal composition for agricultural or horticultural use and method of controlling agricultural or horticultural pest

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR24186A (tr) * 1988-04-11 1991-05-30 Monsanto Co Hasere zehirlerinin etkinligini arttirmak icin yoentem
ZA938163B (en) * 1992-11-05 1994-06-06 Novo Nordisk Entotech Inc Potentiator of bacillus pesticidal activity

Also Published As

Publication number Publication date
AU708302B2 (en) 1999-07-29
HUP9901114A2 (hu) 1999-07-28
WO1996039037A1 (en) 1996-12-12
RU2192744C2 (ru) 2002-11-20
CA2223034C (en) 2008-01-08
EP0831708A1 (en) 1998-04-01
JP3773265B2 (ja) 2006-05-10
AU5935896A (en) 1996-12-24
CA2223034A1 (en) 1996-12-12
CZ373197A3 (cs) 1998-05-13
ZA963323B (en) 1997-01-08
HUP9901114A3 (en) 2001-11-28
PL323468A1 (en) 1998-03-30
KR19990022529A (ko) 1999-03-25
JP2001516201A (ja) 2001-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2859963B2 (ja) バシラス菌殺虫活性の増強剤
CA2194658C (en) Novel dipteran-active compound and bacillus thuringiensis strain
DE69531731T2 (de) Neue pestizid-zusammenstellungen und bacillus thuringiensis stämme
PL184354B1 (pl) Sposób wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus
JP4150071B2 (ja) 新規な農薬組成物およびＢａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株
US6268181B1 (en) Methods for producing a potentiator of Bacillus pesticidal activity
US5976564A (en) Pesticidal composition and bacillus thurigiensis strain
US5976563A (en) Pesticidal composition and Bacillus thuringiensis strain
AU717681B2 (en) Mutants which produce a potentiator of bacillus pesticidal activity
US6277624B1 (en) Mutants which produce a potentiator of Bacillus pesticidal activity
US6406691B1 (en) Potentiator of Bacillus pesticidal activity
MXPA97007017A (en) Novedous pesticide composition and bacillus thuringien seed