CZ373197A3

CZ373197A3 - Způsob výroby potenciátoru pesticidní účinnosti kmene Bacillus

Info

Publication number: CZ373197A3
Application number: CZ973731A
Authority: CZ
Inventors: Denise C. Manker; William D. Lidster; Susan C. Macintosh; Rabert L. Starnes
Original assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 1998-05-13
Also published as: CA2223034A1; AU5935896A; EP0831708A1; RU2192744C2; WO1996039037A1; KR19990022529A; HUP9901114A2; CA2223034C; AU708302B2; ZA963323B; PL323468A1; PL184354B1; JP2001516201A; HUP9901114A3; JP3773265B2

Description

Způsob výroby potenciátoru pesticidní účinnosti kmene Bacillus

Tato patentová přihláška je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 08/295,283, podané. .23.,, srpna 1994, která je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 08/146,852, podané 3. listopadu 1993, která je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 08/095,240, podané 20. července 1993, která je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 07/990,202, podané 14. prosince 1992, která je částečnou pokračovací přihláškou patentové přihlášky č. 07/971,786, podané 5. listopadu 1992.

Oblast techniky

Vynález se vztahuje na způsob získání a identifikace faktoru potencujícího pesticidní aktivitu pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi.

Dosavadní stav techniky

Škůdci, působící každoročně škody v zemědělství, lesnictví a na obecnén zdraví, představují ztráty v milionech dolarů. Pro zvládnutí takových škůdců byly využity různé strategie ._________________________—------------^-

Jedna ze strategií .je užívání chemických*pesticidů se I širokým rozsahem nebo spektrem účinnosti. Použití chemických pesticidů však přináší řadu nevýhod. Tyto pesticidy, zejména pro své široké spektrum účinnosti, mohou ničit orgamismy, na které nebyly zamířeny, jako je blahodárný hmyz a paraziti ničivých škůdců. Navíc jsou chemické pesticidy obvykle ♦ ··»

I

toxické pro zvířata a lidi. Dále si škůdci, na které jsou zaměřeny, často vytvářejí resistenci na takové látky, pokud j im j sou opakovaně vystavovány.

Jinou strategii pro ovládání zamoření hmyzem, houbami a plevelem představuj e^. užití, biopesticidů. Biopesticidy^j-jsou * ** ¹ J ^A' přirozeně se vyskytující pathogeny a/nebo substance těmito pathogeny vytvářené. Výhoda použití biopesticidů tkví v tom, že jsou v celkovém srovnání s chemickými pesticidy obyčejně méně škodlivé pro organismy, na které nejsou zaměřeny, a pro okolní prostředí.

1. Bacillus thuringiensis

Nejrozšířenějším biopesticídem thuringiensis. Bacillus thuringiensis tyčinkovitá, gram-positivní bakterie, rozšířená, zejména v půdě a v prostředí Během sporulace formě krystalických inklusí, které insekticidní pro citlivé hmyzí larvy řádu

- Diptexa a Coleoptera. Inkluse se mohou lišit v a složení. Jsou tvořeny jedním delta-endotoxiny, jejichž velikost se až 140 kDa.

vnitřnostech larev přeměňovány proteázami toxické polypeptidy způsobující destrukci a konečně uhynutí hmyzu (Hofte a —MicFobi-oíogÍ-cal—RevťewsS3~2A2~^:-~2'55y-.

w»». Existuje několik kmenů Bacillus thuringiensis, které se

Bačillas pohyblivá, široce je

Je přírodě bohatém na hmyz. vytváří Bacillus thuringiensis inklusí, které jsou hmyzí paraspory ve po požití Lepidoptera, tvaru, počtu nebo více proteiny nazývanými může pohybovat mezi 27 Insekticidní delta-endotoxiny jsou obvykle ve na menší (zkrácené) vyživovacího kanálu Vhiteley, 1989, jako biopesticidy široce užívají v lesnictví, zemědělství

V a oblastech obecného zdraví. Bacillus thuringiensis subsp.

kurstaki a Bacillus thuringiensis subsp. aizawai produkují delta-endotoxiny specifické pro Lepidoptera. Delta-endotoxin specifický pro Coleoptera produkuje Bacillus thuringiensis • 4 444 4

subsp, tenebrionis (Krieg a spol., 1988, U.S. patent č.

.4,766,203). A dále Bacillus thuringiensis subsp. israelensis produkuje delta-endotoxin specifický pro Diptera (Goldberg, 1979, U.S. patent č. 4,166,112).

Pro dvoj křídle škůdce byly popsány i jiné specifické kmeny Bacillus thuringiensis. Byl popsán isolát Bacillus thuringiensis, který je toxický pro Diptera a Lepidoptera (Hodgman a spol. , 1993, FEMS Microbiology Letters 114.Ί7

- 22). Elektroforesa přečištěného krystalu delta-endotoxinu z tohoto isolátu na SDS polyakrylamidovém gelu odhalila tři proteinové species, které souvisejí s toxiny, CrylA(b), CrylB a CrylIA. Byl rovněž popsán isolát Bacillus thuringiensis, který produkuje na Diptera účinnou krystalickou látku složenou z proteinů s molekulovou hmotností 140, 122, 76, 72 a 38 kDa (Payne, 1994, U.S. patent č. 5,275,815). EPO 480,762 uvádí pět kmenů Bacillus thuringensis, z nichž je každý účinný proti dvojkřídlým škůdcům a každý také má jedinečné složení krystalického delta-endotoxinu.

Bylo popsáno také několik kmenů Bacillus thuringiensis,, které vykazují pesticidní účinnost proti jiným škůdcům, než jsou Lepidoptera, Coleoptera a Diptera. Bylo objeveno pět druhů Bacillus thuringiensis produkujících endotoxiny, které jsou toxické vůči hlíštičím (Edwards, Payne a Soares, 1988, Evropská patentová přihláška č. 0 303 426 Bl). Byl také popsán kmen Bacillus thuringiensis, PS81F, který může být používán při ošetřování lidí a zvířat, hostících parazitická ___________p.ro_t.ozoa__(-Thompson—a—Gae-rtner-;--199±; Evropská patentová ‘ .- -i -Přihláška č. 0 461 799 A2) . Bylo popsáno⁷ několik isolátů

Bacillus thuringiensis s účinností proti akariosám. Tyto isoláty produkují krystaly složené z proteinůs molekulovou hmotností v (širokém) rozmezí od 35 kDa do 155 kDa (Payne,

Cannon a Bagley, 1992, PCT přihláška č. VO 92/19106). Byly rovněž popsány kmeny Bacillus thuringiensis s účinností proti • · « · « *

škůdcům patřícím do řádu Hymenoptera (Payne, Kennedy, Randall, Meier a Uick, 1992, Evropská patentová přihláška č. 0 516 306 A2), dále s účinností proti škůdcům řádu Hemiptera (Payne a Cannon, 1993, U.S. patent č. 5,262,159), nebo účinností, proti- škodlivým- motolicím''(Hicklě, Sick Γ SchwatT,** Narva a Payne, 1993, U.S. patent . č. U.S. 5,262,399) a s účinností proti škůdcům řádu Phthiraptera (Payne a Hicle, 1993, U.S. patent č. 5,273,746). 0 jiném kmeni Bacillus thuringiensis supsp. kurstaki, VB3S-16, který byl isolován z vlněné stříže australských ovcí, bylo dále zjištěno, že je toxický pro štípavou veš Damalinia ovis, škůdce Phthiraptera (Drummond, Miller a Pinnock, 1992, J. Invert. Path. 60:102 - 103).

a pesticidní jsou Lepidoptera-speciíická (cry Diptera-specifická (cry II) III) > 1989, Lepidoptera-specifická

V geny Tailorem a spol., 1992, 6:1211-1217) a Nematoda-speciíická

V a cry VI Feitelsonem a spol.,

Delta-endotoxiny jsou kódovány pomocí cry (krystalický protein) genů, které jsou obvykle umístěny v plasmidech. Cry geny byly rozděleny do šesti tříd a několika podtříd založených na relativní homologii aminokyselin specifičnosti. Hlavní třídy I) , Lepidoptera- a Coleoptera-specifická (cry (Hófte a Vhiteley, 53:242-255), Coleoptera- a jako cry Microbiology jako cry V a cry Bio/Technology 10:271-275).

(cry

Diptera-speciíická (cry IV)

Microbiological Reviews (označovaná Molecular (označovaná 1992,

Delta-endotoxiny DNA. Delta-endotoxiny mohou anebo nemusí být

U některých kmenů byly získávány metodami^rekombinantní získané metodami rekombinantní DNA v krystalické formě.

Bacillus thuringiensis se ukázalo, že produkuji tepelně stálý pesticidní analog adenin nukleotidu, známý jako β-exotoxin typu I neboli thuringiensin, který je sám pesticidní (Šebesta a spol., v H.D. Burges [editor], · a ·· *

I *« a

Microbial Control of Pests and Plant diseases, Academie press, New York, 1980, str. 249-281). β-Exotoxin typu I byl nalezen v matečném louhu některých kultur Bacillus thuringiensis. Má molekulovou hmotnost 701 a skládá se

i. adenosinu, __glukosy-a allarové'·kyseliny * (Farkaš^Ja“' spolT,'“

Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 42:909-929; Lúthy a spol., v Kurstak [editor], Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, str. 35-72). Okruh jeho hostitelů zahrnuje, ale není omezen na: Musea domestica, Mamestra configurata Valker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster a Tetranychus cinnabarinus. Má se za to, že toxicitu β-exotoxinu typu I je třeba přičítat inhibici DNA-řízené RNA polymerázy v soutěži s ATP. Bylo prokázáno, že β-exotoxin typu I je kódován cry plasmidem u pěti kmenů Bacillus thuringiensis (Levinson a spol., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Zjistilo se, že β-exotoxin produkuje Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis serotyp 1, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi serotyp 9 a Bacillus thuringiensis supsp. darmstadiensis serotyp 10.

Jiný β-exotoxin byl popsán a klasifikován jako β-exotoxin typu II (Levinson a spol., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Zjistilo se, že β-exotoxin typu II produkuje Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotyp 8ab, a že je účinný proti Leptinotarsa decemlineata. Struktura β-exotoxinu typu II není zcela známá, ale výrazně se liší od struktury β-exotoxinu typu I, protože na místě adeninu je ---------ps^_eudoufíďinová^-část, ve které je připojení ke kruhu ríbosy • ··· ^.........'v' pozici, jež by měla jinak být obsazena protonem (Levinson, v Hickle a Finch [editoři], Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington D.C., 1990, str. 114-136). Dále je tu pouze jeden signál v protonovém NMR spektru odpovídající basi nucleosidu (při 7,95 ppm) a chybí signál protonu anomerů ribosy (5,78 ppm)í

«4 4 · · * • · • · ♦· · • ·

V 4 4 4 ·’

Mezi další ve vodě rozpustné látky, které byly isolovány z Bacillus thuringiensis, patří alf a-exotoxin, který je toxický pro larvy Musea domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7); gamma-exotoxiný, což jsou různé enzymy zahrnující lecithinázy, chitinázy-a proteázy, -jejichž— . .Α’φι... □__,+ ·· ' - —Hfc-···^ ·*··· toxické účinky se projevují pouze ve spojení s beta-endotoxinem nebo delta-endotoxinem (Forsberg a spol., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxin, který má podobnou strukturu jako beta-exotoxin a je také účinný proti Leptinotarsa decemlineata (Argauer a spol., 1991, J. Entomol.. Sci. 26:206-213); a anhydrothuringiensin (Prystaš a spol..,

1975,Coli. Czechoslovak Chem. Comm. 40:1775).

2. Zwittermicin

Z Bacillus cereus byla isolována substance, která inhibuje růst rostlinného pathogenu Phyťhophthora medicaginis a omezuje infekci vojtěšky (viz například: U.S. patenty č. 4,877,738 a 4,878,936). Jiná účinnost popsána nebyla. Pro zwittermicin A byla stanovena následuj ící struktura (He a spol., Tet. Lett. 35:2499-2502):

OH

H₉NCO-NH-CH₉-CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-CH₉-CH-CH-CH₉-OH conh₂

OH

Bylo vyvíjeno úsilí dosáhnout u formulací přípravků s Bacillus thuringiensis vyšší mortality. Prostředky pro to zahrnovaly hledání noých kmenů se zvýšenou mortalitou, pokusy o zdokonalení existujících kmenů a pokusy navrhnout efektivnější formulaci kombinací spor Bacillus thuringiensis s novými pesticidními nosiči, chemickými pesticidy anebo zesilovači (viz například U.S. patent č. 5,250,515, inhibitor trypsinu). Z těchto důvodů je. předmětem ^^^..předkládaného—vynálezu— potencovat pesticidní ' účinnost pesticidů.

Podstata vynálezu

Vynález se vztahuje na způsob získání faktoru, který zesiluje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, zahrnující (a) pěstování kultury kmene Bacillus za vhodných podmínek;

(b) získání faktoru ze supernatantu kultury ze stupně (a) .

V typickém provedení je kmen Bacillus volen ze skupiny sestávající z Bacillus subtilus, Bacillus licheniformis a Bacillus thuringiensis. V preferovaném případě je faktor v podstatně čisté formě. Jak se zde definuje, podstatně čistý faktor představuje faktor, který má méně než 10 % kontaminantů, jako je například protein delta-endotoxinu. Tak podstatně čistý faktor lze získat isolací faktoru například pomocí sloupcové chromatografie.

Získaný faktor je potenciátorem. Jak se zde definuje, potenciátor je substance, která nemá signifikantní pesťicTdní účinnost tak, že by měla například LCg₀ (LC₅q je koncentrace látky nutná k usmrceni 50 % škůdců) více než kolem 3000 pg/g při stanovení bioassayem (viz dále), která zvýšení pesticidní účinnosti pesticidu s druhem Bacillus zhruba alespoň o 50 % zabránění larvárního růstu. Jak bylo zmíněno výše, jiné substance, o nichž je známo, že jsou schopny i

však působí souvisej ícího a nezpůsobuje zvyšovat pesticidní účinnost, jako jsou a exotoxiny, pesticidní účinnost mají.

Ve konkrétním případě je faktor ve inhibitory trypsinu vodě rozpustný. Jak se zde definuje, substance nebo sloučenina je ve vodě rozpustná, pokud se alespoň kolem 1 yng plátky může„rozpustit— ..H*' htUn ^{ř —} v 1 ml vody. Faktor muže také potencovat pesticidní účinnost chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi.

Jak se zde definuje, pesticid související s druhem Bacillus je kmen Bacillus (například Bacillus thuringiensis nebo Bacillus subtilis), spora nebo substance, například protein nebo jeho fragment, které jsou účinné proti, nebo které hubí škůdce, anebo mikroorganismus schopný vytvořit gen, v němž je zakódován protein Bacillus nebo jeho fragment, který je účinný proti, nebo který hubí škůdce (například delta-endotoxin Bacillu thuringiensis') , a přijatelný nosič (příklady takových nosičů viz níže). Škůdcem může být například hmyz, hlístice, roztoč nebo slimák. Mikroorganismus schopný exprimovat gen kódující protein Bacillus nebo jeho fragment, který je účinný proti, nebo hubí škůdce sídlící na povrchu listů rostlin (phylloplane), a/nebo v rhizosféře (půda obklopující kořeny rostlin), a/nebo ve vodném prostředí a je schopný v daném prostředí (úroda a jiné hmyzí lokality) úspěšně soutěžit s divoce se vyskytujícími mikroorgamisny a poskytovat stálé udržování a expresi genu, v němž je zakódován protein druhu Bacillus nebo jeho fragment, který má účinnost proti, anebo zabíjí škůdce. Příklady takových _____ mikroorganismů—předs-t-av-uj-í-r-avšak—nej'sou~cimezeny ná'UakteríěT ' například rodu Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia,

Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium,

Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium* Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc,

Alcaligenes a Clostridium; na řasy, například čeledi Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophycede, Dinophyceae, r

Prymnesiophyceae,

Bacíllariophyceae,

Euglenophyceae,

··	*	4	«4 4444
•	44	4 4	4 · ·
• ···	•	4	4 4 4
• 4 o	β	« 4	4«· »
• ♦	«	4	4 ·
	• 44	«4»	44 *

Chrysophyceae, Raphidophyceae, Crypt ophyceae,

Xanthophyceae,

Eustigmatophyceae,

Prasinophyceae a Chlorophyceae; a na houby, zejména kvasinky, například rodu

Saccharomyces'; Cryptócoccus / Klůy veromyces , Sporobolomyces,

Rhodotorula a Aureobasidium..

Jak se zde definuje, pesticidní účinnost se měří velikostí účinku proti škůdcům při jejich zahubení, nebo při zabránění jejich růstu, anebo při ochraně rostliny před zamořením škůdcem.

Získaný faktor může být formulován do kompozice obsahující faktor a pesticidní nosič, právě tak jako faktor a pesticid související s druhem Bacillus, chemický pesticid a/nebo virus s pesticidními vlastnostmi. Tyto kompozice se mohou užívat k potírání škůdců, snižujíce resistenci škůdce na pesticidy související s druhem Bacillus, což spočívá na vystavení škůdce vůči kompozici, která obsahuje faktor a pesticidně přijatelný nosič, anebo na potenciaci pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem Racillus.

Vynález je také zaměřen na způsob identifikace řečeného faktoru zahrnující (a) kultivaci kmene Bacillus·, (b) odebrání supernatantu kultury ze stupně (a) (c) provedení assayů se supernatantem ze stupně (b) pro potenciaci pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus.

Přehled obrázků na výkresech _

-L. +< '· ·' '

Obrázek 1 ukazuje schematicky obecný postup použitý pro čistění Ia.

Obrázek 2 ukazuje NMR spektrum Ia.

Obrázek 3 ukazuje NMR spektrum Ia.

Obrázek 4 ukazuje výsledky NOE experimentů s i

• · · a* » ·	9	*	• · a ·
• ·	• ·	··	• ·	•
• ·· 9	•	9	• 4	*
• 4 9	«	9	• ·♦ ·	•
a a		9	9	4
	··♦	···		9

acetylderivátem Ia.

Faktor potencuje souvisejícího s. druhem pesticidní aktivitu pesticidu Bacillus a může mít molekulovou hmotnost -od¹ cca “SSO^do' cca 1200 anebo “ν'typickém *přípádě od cca 350 do cca 700.

Faktor znásobuje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus nejméně zhruba 1,5-krát případně až zhruba 1000-krát, výhodně pak zhruba 100-krát až zhruba 400-krát. V typickém případě znásobuje faktor circa 1,5-krát až circa 1000-krát pesticidní účinnost delta-endotoxinu Bacillu thuringiensis, včetně, avšak nikoliv pouze Cryl (včetně, avšak nikoliv pouze CrylA, CrylB a CrylC), CrylI, CrylII, CrylV, CryV, nebo CryVI proteinu v jeho původní délce nebo proteolyticky zpracované zkrácené formě. V nejčastějších případech znásobuje faktor delta-endotoxin Bacillu thuringiensis circa 100-krát až circa 400-krát. Faktor může také násobit pesticidní účinnost chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi,

Faktor může být také ve vodě rozpustný, stálý ve vodě až circa do 100 C nejméně po dobu asi 5 minut, stálý při vystavení přímému slunečnímu světlu nejméně po dobu asi 10 hodin, a/nebo stálý při přibližně pH 2 asi 10 dní. Faktor může mít 13 uhlíků. K tomu dále může mít faktor v ^H NMR spektru chemické posuny kolem δ 1,5; 3,22; 3,29; 3,35; 3,43; 3,58; 3,73; 3,98; 4,07; 4,15; 4,25; 4,35,_______________________

V nejčastějších typických případech má řečený faktor -w-‘ strukturu Ia nebo je jeho solí.

OH NH₀NH

I II

H₀NCO-NH-CH₀-CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-CH₀-CH-CH-CH~-OH

I í I ² 1

C0NH₂ OH OH OH (Ia) φφ *··· *

• Φ

Sůl by měla být schopná potencovat s druhem Baciílus.

pesticid související •Φ «··· * 9 9

Φ Φ ·** »·.

ΦΦ • » * » Φ Φ ·♦ ♦Φ

Φ Φ » *

1. Získávání faktoru

Faktor může být získán z kmene

Baciílus subtilis, Baciílus licheniformis thuringiensis) v třepacích nádobkách nebo V typickém provedení lze získat půdou Bacillu thuringiensis, na Baciílus thuringiensis thuringiensis subsp. aizawai, galleriae, Baciílus Bači Hus

Baciílus (například a Baciílus ve fermentoru. faktor z kapaliny nad živnou což zahrnuje, ale neomezuje se subsp. kurstaki, Baciílus Baciílus thuringiensis subsp. thuringiensis thuringiensis subsp.

thuringiensis subsp. thuringiensis, subsp. alesti, Baciílus thuringiensis Baciílus thuringiensis subsp. thuringiensis subsp. dendrolimus, subsp. finitimus, Baciílus thuringiensis subsp. Baciílus thuringiensis subsp. thuringiensis subsp. subtoxicus, subsp. toumanoffi a Baciílus israelensis. V subsp. entomocidus, tenebrionis, Baciílus Baciílus thuringiensis subsp. canadiensis, darmstadiensis, Baciílus Baciílus thuringiensis kenyae, morrisoni, Baciílus Baciílus thuringiensis thuringiensis subsp.

preferovaném provedeni se ’ faktor získá z kapaliny nad kulturou Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillu thuringiensis subsp. aizawai, nebo Bacillu thuringiensis subsp. galleriae anebo jejich mutantů, které .maj.í__podsXatně—stejnou—potencřační účinností V typickém 'spo-mutantu Bacillu

„.y proveden i se faktor získává z crythuringiensis subsp. kurstaki.

Baciílus může být kultivován a fermentačních technik, které jsou v a spol., 1969, J.

a spol., za použití medií oboru běžné (viz na příklad Rogoff a spol., 1969, J. Intervertebrate Path. 14:122-129; Dulmage a spol., 1971, J. Intervertebrate Path. 18:353-358; Dulmage a spol., v Microbial Control of Pests and !

«· ·«··

Plant Ďiseases, H.D. Burges, editor, Academie Press, N.Y. , 1980). Po dokončení fermentačního cyklu může být kapalina nad kulturou získána po oddělení spor Bacillu thuringiensis a krystalů z fermentační živné směsi v oboru dobře známými prostředky, jako je centr .i f ugování a/nebo _ ultraf iltrace ·;· -— Faktor se nalézá v kapalině nad kulturou a může íbýt získán v oboru dobře známými způsoby, například ultrafiltrací, odpařením nebo sušením rozprašováním. Tento postup je podrobněji popsán v následujícím oddílu.

Čistění faktoru může být provedeno různými v oboru známými procedurami, včetně, nikoliv však pouze, chromatografických (například iontoměniče, afinitní a rozdělovači kolonová chromatografie), elektroforetických procedur, diferenční rozpustnosti, extrakce, anebo jakékoliv standardní techniky známé v oboru.

Potencující účinnost faktoru pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, s virem majícím pesticidní účinnost nebo s chemickým pesticidem proti různým škůdcům může být stanovena v oboru známými postupy jako je přidávání do umělé hmyzí výživy, překrývání umělé výživy, natírání listu, namáčení listu a postřik. Konkrétní příklady takových zkoušek jsou popsány níže.

2. Kompozice obsahující faktor

Faktor získaný z mutantu podle tohoto vynálezu se může formulovat samostatně, nebo s pesticidem souvisejícím s_dr.uhem_ Baci-llus-,—k-terý-;—jak—je^—s vr chu-qlefl no váno, j e kmenem Bacillus, sporou, proteinem nebo fragmentem/‘nebo jinou jeho substancí, s účinností proti, nebo která hubí škůdce nebo chrání rostliny proti škůdci, nebo a/nebo s entomopathogenním do pesticidní kompozice/í, roztok, emulse, prachový pesticidem nosičem, suspense, dále virem což pudr, s chemickým a přijatelným je například dispersibilní «· ♦* · · granule, prach ulpívající po zvlhčení, koncentrát pro emulsi, aerosol nebo obalované granule. Příklady takových druhů

Bacillus zahrnují, avšak nejsou omezeny na Bacillus

TM thuringiensis subsp. kurstaki (na trhu jako DIPEL od Abbott _Laboratories,·- -lne. , JAVELUN^ od‘'Sandoz ,* ΒΙΟΒΙΤ^ od Novo Nordisk A/S, FORAY^ od Novo Nordisk A/S, BIOCOT™ od Novo Nordisk A/S, MVP^ od Mycogen, BACTOSPEINE^ od Novo Nordisk A/S a THURICIDE^ od Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawaí (na trhu jako FLORBAC^ od Novo Nordisk A/S a XENTARI^M _od Abbott Laboratories, lne.); Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (na trhu jako NOVODOR™ od Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ od Sandoz, M-TRAK™ a M-ONE™ od Mycogen a DTERRA od Abbott Laboratories, lne.); Bacillus TM thuringiensis subsp. israelensis (na trhu buď jako BACTIMOS ^Jnebo SKEETAL^M _od Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ od Sandoz, a VECTOBAC^ od Abbott Laboratories, lne.); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (na trhu jako FOIL^ od Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawaí (na trhu jako CONDOR od Ecogen a AGREE^^ od Ciba Geigy); Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (na trhu jako CUTLASS^ od

Ecogen). Protein související vybrán ze skupiny, neomezené CrylII, CrylV, CryV a Cry VI. například regulátor hmyzího karbamát jako thiodicarb a s druhem Bacillus může být však jenom, na Cryl, CrylI, Chemickým pesticidem může být růstu jako diflubenzuron, methomyl, organofosfát jako chlorpyrifos, pyrethroid jako cypermethrin a esfenvalerate. anorganický fluorid jako kryolit a pyrrol^Entomopathogenní virus muže představovat baculovirus, například virus nukleární polyhedrosis (NPV) Autographa californica, NPV Syngrapha falcifera, virus granulosis (GV) Cydia pomonella, NPV Heliothis zea, NPV Limantria dispar, NPV Orgyia pseudotsugata, NPV Spodoptera exigua, NPV Neodiprion lecontei, NPV Neodiprion sertifer, NPV Harrisina brillians ··· ♦ « 44 ···♦ • 4 4 ·* 4* · ♦·

4·4· 9 ·9 9*

4 · 9 4« »«« 9 ά 9. ·· · «··>·«« ··· 444 ·* * a NPV Endopiza viteana Clemens.

Ve směsích, které obsahují substanci a pesticid související s druhem Bacillus, může být substance přítomna v množství nejméně asi 0,1 g/BIU nebo 0,05 g faktoru na g ...delta-endotoxinu nebo spory¹ bacilu,”“volívá sě“ ás*i 300 g/BIÚ nebo 150 g substance na g delta-endotoxinu a spory bacilu, nejlépe pak 2 g/BIU nebo 1 g substance na g delta-endotoxinu nebo spory bacilu. Jak se zde definuje, BIU je miliarda mezinárodních jednotek, jak se určuje bioassayem. Při bioassayi je vzorek srovnáván se standardním referenčním materiálem druhu Bacillus, za použití Trichoplusia ni nebo jiného škůdce jako standardního testovacího hmyzu. Potence se určí vydělením referenčního standardu LC^q a pak násobením potencí referenčního standardu.

V dalším provedení může komposice obsahovat faktor v podstatně čisté formě, nebo faktor z kapaliny nad kulturou bacilu ve vysušené, koncentrované nebo kapalné formě a pesticidně přijatelný nosič, jak je níže na příkladech vyloženo. Tato kompozice může být na rostlinu aplikována odděleně, například na transgenní rostliny. Ve specifickém případě lze kompozici aplikovat na rostlinu již před tím obsahující a exprimující gen Bacillus thuringiensis. V jiném případě je možné kompozici aplikovat na rostlinu, která byla kompozici Bacillus thuringiensis vystavena dříve. Při dalším případě lze kompozici aplikovat v jiných prostředích

I dvojkřídlého škůdce/ů jako například ve vodě nebo v půdě, ~Koncentrace substance v kompozici je asi od 0,001 % do asi % hmotnostních.

Kompozici obsahující substanci a navíc ještě pesticidně přijatelný nosič ke kontrole škůdce lze používat také ke snížení resistence škůdce na pesticid. Alternativně je možné používat kompozici k potencování pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus. V jednom z provedení se kompozice aplikuje

	•		·· ····
	» 3 Φ			« · ·
	• ···	♦	•	♦ · ·
	• · ·	•	♦	♦ ·♦· ·
15	• «	•	©	* ·
	···	♦ ··	·· ·

ve stejném čase jako pesticid v množství alespoň kolem 2 g substance/BIU až do případných cca 300 g substance/BIU. V jiném provedení lze kompozici aplikovat do zhruba 24 hodin po pesticidu jako adjuvans pro rozvinutí působivosti residuálniho-pesticidu .* *—— -·=*· -·—'· - “ *“

Takové, svrchu uváděné kompozice, lze získat po přidání povrchově aktivního činidla, inertního nosiče, ochranného prostředku, zvlhčovadla, chuťového stimulantu, atraktantu, kapsulačního činidla, plnidla, emulsifikátoru, barviva, ochrany proti UV záření, pufru, zkapalňujícího činidla nebo jiných komponent, které usnadňují manipulaci a aplikaci zaměřenou na určité škůdce.

Vhodná povrchově aktivní činidla jsou anionaktivní sloučeniny jako karboxyláty, například kovové soli mastných kyselin o dlouhém řetězci; N-acylsarkosinát; mono- nebo diestery fosforečné kyseliny s ethoxyláty mastných alkoholů či soli takových esterů; sulfáty mastných alkoholů jako dodecylsíran sodný, oktadecylsíran sodný nebo cetylsíran sodný; sulfáty ethoxylovaných mastných alkoholů; sulfáty ethoxylovaných alkylfenolů; ligninsulfonáty; ropné sulfonáty; alkylarylsulfonáty jako alkylbenzensulfonáty, nebo nižší alkylnaftalensulfonáty, například butylnaftalensulfonát; soli sulfonovaných kondensačních produktů naftalenu a formaldehydu; soli sulfonovaných kondensačních produktů fenolu a formaldehydu; nebo složitější sulfonáty jako amidsulfonáty například sulfonovaný kondensační produkt olejové kyseliny a N-methyltaurinu nebo dialkyl '' ^{IJ,lu n}sulfosukcináty, například dioktyl sulfosukcinát sodný. Mezi neionogenními činidly se pak používají kondensační produkty ethylenoxidu a esterů mastných alkoholů, amidů mastných kyselin, nebo alkyl- či alkenylfenolů s mastnými alkyly či alkenyly, dále estery polyhydroxylkoholetherů například estery sorbitolu a mastných kyselin, kondensační produkty ·· ···*

·»··	•
	9'«
» « ··	•
• · ·	•
• <	•
	··>

	• *	«
	« ·	•
♦ ·
	•	♦
		♦

takových esterů a ethylenoxidu, například estery mastných kyselin a polyoxyethylensorbitolu, blokové kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu, acetylenícké glykoly jako 2,4,7,9-tetraethyl-5-decin-4,7-diol, nebo ethoxylované acetylenícké glykoly. Příklady^.kationaktivních«-povrchově“ ,... . - ·· '.....

aktivních činidel představuji například alifatické mono-, dinebo polyaminy ve formě acetátů, naftenátů nebo oleátů, dále kyslík obsahující amin jako aminoxid polyoxyethylenalkylaminu, potom amidovými skupinami seřetězený amin, získaný kondensací karboxylové kyseliny s di- či polyaminem anebo kvarterní amoniová sůl.

Příklady inertních materiály jako kaolin, fylosilikáty, uhličitany, materiálů zahrnuj i anorganické slídu, sádru, umělé hnojivo, sírany nebo fosforečnany, dále i organické materiály jako cukr, škroby anebo botanické materiály jako lesní nebo cyklodextriny, produkty, korek, rozemleté kukuřičné palice, rýžové slupky, slupky burských oříšků a skořápky vlašských ořechů.

Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě vhodné pro přímou aplikaci, nebo jako koncentrát či základní směs, která před aplikací vyžaduje zředění příslušným množstvím vody nebo jiného ředidla. Koncentrace pesticidu se bude měnit v závislosti podle povahy jednotlivé formulace, konkrétně podle toho, zda je to koncentrát, nebo zda je pro přímé použití. Kompozice obsahuje 1 až 98 % pevného nebo kapalného inertního nosiče a 0 až 50 %, nejlépe ______0,-1—až—50—%—povrchově aktivního Činidla. Kompozice se .. L..ri-ΐί-aplikuj i v dávkách určených pro komerční produkt, nejlépe kolem 0,01 až 5,6 kg/ha (0,01 až 5,0 lb/akr), pokud jsou v suchém stavu a kolem 0,0^ až 1/ha (0,01 až 25 pint/akr), pokud jsou kapalné.

Podle dalšího způsobu provedení může být krystalický delta-endotoxin Bacillu thuringiensis a/nebo faktor před

9» *	• ♦·	9999
♦ 9 » »·	·· · 9	•
» ··· «	e 99	•
9 · 9 ·	9 9	'9
• · ··	9 ·	9
17 ...........	*·· '« 9	4

formulací ošetřen tak, aby byla prodloužena pesticidní účinnost při jeho aplikaci v prostředí ničeného škůdce, pokud toto předběžné ošetření neničí krystalický delta-endotoxin nebo substanci. Takové ošetření nuže být uskutečněno ^{k t} 'chemickými¹ a/neho fysikálními prostředky, pokud toto ošetření neovliní zhoubně vlastnosti směsi/í. Mezi příklady chemických činidel patří, ale nejsou omezeny na halogenační činidla, aldehydy jako formaldehyd a glutaraldehyd, činidla proti infekci jako zephiran chlorid, alkoholy jako isopropanol a ethanol a histologické fixativy jako Bouin-ův fixativ a Hclly-ho fixativ (viz například Humason, Animal Tissue Techniqes, V.H. Freeman and Co., 1967).

Kompozice podle vynálezu lze aplikovat přímo na rostlinu například postřikem nebo poprášením v době, kdy se na rostlině začal objevovat škůdce nebo jako ochranné opatření před jeho příchodem. Mezi rostliny, které lze chránit v rozsahu tohoto vynálezu patří, ale nejsou omezeny .jen na ně: obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepy (cukrová řepa, krmná řepa), peckoviny, jádroviny a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny, borůvky), luskoviny (vojtěška, fazole, čočka, hrách, sója), olejňiny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, skočce poskytující ricinový olej, kakaové boby, podzemnice olejná), okurkovité rostliny (okurky, dýně, melouny), vláknité rostliny (bavlna, len, konopí, juta) , citrusové ovoce (poměranč,e_._ci.tronv-.zelí a jiné košřáloviny, mrkve, cibule, rajčata, brambory), vavřínovité rostliny (avokado, skořice, kafr), opadavé listnaté stromy i jehličnany (lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), nebo rostliny jako jsou kukuřice, trávníkové rostliny, tabák, ořechy, káva, třtina cukrová, vinná réva, chmel, banánovníky, kaučukovníky stejně grapefruity, mandarinky), zelenina (špenát, salát, chřest, u18

«1 l»w·	• «	«· «···
♦ · ·		• e.·
• ··♦		•	•	• · ·
•	• ♦	♦j	*	v ··· ·
•	«		e	0 0 ·· ·

tak jako rostliny okrasné. Kompozici lze aplikovat na list, zapravením do země, rozhozem granulí, na poslední chvíli při sklizni nebo nasáknutím do půdy. Zpravidla je důležité získat kontrolu nad škůdcem v raných stadiích vývoje rostliny, „„protože .to-je-doba;— kdy * *může· být ‘poškozena’“ něj vážněji . Pokud se má za to, že je to nutné, může postřik nebo poprašek obsahovat výhodně i jiný pesticid. V preferovaném provedení se kompozice podle vynálezu aplikuje přímo na rostlinu.

Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být také aplikovány přímo do rybníků, jezer, potoků, řek, stojatých vod a dalších míst vystavených zamoření dvojkřídlými škůdci, zvláště škůdci ohrožujícími obecné zdraví. Kompozice může být* aplikována sprejováním, práškováním, postřikem a tak podobně.

Kompozice podle předkládaného vynálezu může být účinná proti škůdcům řádu Lepidoptera, například Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, ALsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp. , Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx moři, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Chořístoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia * * -F

.. —> ·.*--· ^T salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis,

Malacosoma sp: , Mamestra brassicae, Mamestra configurata,

Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis,

• « · · · ·		♦ ♦	♦ ···
19	• · · * ··· • · ♦ « ♦	• « o,	• « • «	• ♦ • · 9*0 •	» ♦
		··«.	·· ·	··	•

Melanchra pieta, Operophtera brumata,. Orgyia^sp:., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes,

Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica,

Phylonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae,

Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sul tana,

Platyptilia xylostella, carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta,

Pseudoplusia includens,

Sabulodes aegrotata,

Schizura concinna,

Sitotroga cerealella,

Spilonota ocellana,

Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa,

Tineola bissel Helia,

Trichoplusia ni, Udea rubigalis,

Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; dále řádu Diptera, například Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vidná, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies,

Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina --pa-l-pa-l-i-s—pa-l-pal-isy- Gl-osstna taclTilwHies, Haemagogus equinus,

1.»......... nn^.Haematobia irritans, Hypoderma bovis,‘ Hypoderma lineatum,

Leucopis ninae, Lucilia čupřina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella malí, Mayetiola destructor, Musea autumnalis, Musea domestica, Neobillieria sp., Nephrotoma suturalis, .Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus,

Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa.

·· ·»«»'	*	4	• 4	MM
	• » ·		• 4	• 4	4
	• ···	•	•	• 4	4
	• 4 4	•		4 44·'	4
20	• 4		0	4	•
	• ♦ ·	444	44	4

Avšak kompozice podle vynálezu mohou být také účinné proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera, například Leptinotarsa sp., Acanthoscelides,.obtectus ·,* Callosobruchus’ chinénsis'? Epi lachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formocarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophylus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor; dále řádu Acari, například Oligonyhus pratensis,

Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; nebo řádu Hymenoptera, například Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; či řádu

Isoptera, například Réti cul i termes hesperus, Réti culitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis,

Neotermes connexus,

Incisitermes minor,

Incisitermes immigrans ;

gallinae, nebo řádu Siphonaptera, například Ceratophyllus

Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus,

Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; anebo řádu

Tylenchida, například Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou uváděny pro ilustraci, nikoliv však aby omezovaly.

Charakterisace Ia

1. Získání a čistění Ia

Kmen Bacillus thuringiensis subsp, kurstaki EMCCOO86 ♦ · *··« (uložený v NRRL jako B-21147) byl fermentován 72 hodin při 30 C v mediu složeném ze zdroje uhlíku jako je škrob, škrobový hydrolysát nebo glukosa a ze zdroje dusíku jako je protein, proteinový hydrolysát nebo výluh z obilí. Tvorba Ia -»_..byla stanovována -po^L-13'^j hodinách ^— během fěrméntáce7Vrchol ' účinnosti byl nalezen zhruba po 30 hodinách.

Supernatant z fermentace Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki byl odcentrifugován a poté vyčeřen ultrafiltací membránou 30 kDa MV-CO s použitím Rhóne Poulenc UF systému. Ultrafiltrací se odstranily jakékoliv zbytky buněk, krystaly delta-endotoxinu, spory a rozpustný protein s větší hmotností než 30 kDa. Filtrát byl odpařením zahuštěn desetinásobně. Filtrát byl poté centrifugován a filtrován membránou 0,2 pm., k dalšímu odstranění nerozpustných částic z živného roztoku <

a získání čistého roztoku obsahujícího Ia.

Vyčistění Ia do homogenity se dosáhlo použitím mnohastupňového čistícího pochodu, který je schematicky uveden na obrázku 1. V návaznosti na postup přípravy popsaný shora, pokračoval čistící proces stupněm ultrafiltrace na 5 kDa. Filtrát po 5 kDa ultraf iltrací byl absorbován na kationtoměnič Sulfopropyl (SP) a eluován roztokem octanu amoného. Látka byla pak přibližně 30x zkoncentrována lyofilisací a sůl a ostatní kontaminanty byly odstraněny pomocí dělící kolony BioRad P2. Podíl z P2 kolony poskytl homogenní sloučeninu po projití kolonou s vysokým rozlišením, obsahující SP HPLC kationtoměnič. Kontaminující sůl byla_________ odstraněna opakovanou lyofilisací.

......^r ' Účinnost byla monitorována pomocí mikrobioassaye se Spodoptera exigua a čistota se určovala kapilární elektroforesou. Vzorek, sestávající z 50 μΐ Ia a 50 μΐ proteinu CrylA(c) (15 pg/nil) , přečištěný z BIOBITu^ FC (100 μΐ), byl přidáván do individuálních nádobek v želatinovém tácku obsahujících 500 μΐ ztužené umělé hmyzí

« · ·		Φ 9	• ·	•
• *♦·	•	•	* «	9
• · ·	•	•		•
• ·	•	9	•	9
	9 ·	99 ·	·«	9

potravy. Tácky obsahující různé vzorky byly vysušeny na vzduchu. Do nádobek obsahujících vysušený vzorek byly přidány dvě až čtyři Spodoptera exigua v druhém nebo časném třetím vývojovém stadiu. Nádobky byly zataveny do plastikového sáčku s dírami a inkubovány při 30 C 2 až 3 dny. Potom byl zaznamenán stupeň zakrnění a úmrtnosti. Pro každý vzorek bylo běžně provedeno 5 replik.

2. Stanoveni struktury

Účinná sloučenina je ve vodě rozpustná a nerozpustná je v organických rozpouštědlech. Má positvní náboj a reaguje s ninhydrinem, jak to bylo prokázáno chromatografií na

1 tenké vrstvě, na silikagelu. C a H NMR spektra sloučeniny

3 jsou na obrázku 2 respektive 3. C NMR experimenty vyjevily přítomnost 13 uhlíků (vztaženo k 3-[trimethylsilyl]propionové kyselině jako standardu). DEPT experiment určil přítomnost tří kvarterních uhlíků (C), sedmi methinových skupin (CH), tři methylenových (CH₂) a nepřítomnost methylové skupiny (CH^). Pomocí couplingu protonů jako je 1-D decoupling a COSY byl identifikován rozsáhlý spinový systém osmi uhlíků. Vedle toho je přítomen menší spinový Systém dvou uhlíků. Korelační experiment uhlík - proton (HMBC) umožnil přiřazení resonance každého protonu v molekule k uhlíku, na který je vázán.

Reakce účinné sloučeniny (13 mg) s acetanhydridem v pyridinu poskytla acetylderivát, který je mnohem méně polární. Tento derivát byl čištěn pomocí HLPC a poskytl 3 mg ________čistého—acexylderivátu.—Hmotnos-tn-í—spek-t-roskopie—ukázaTat—že— _t ,. _Γί. rieri vát má 7 acetylových skupin a -molekulární' hmotnost 690, což pro účinnou sloučeninu dává molekulovou hmotnost 396 a indikuje, že je přítomen sudý počet dusíkových atomů. Byly také detegovány fragmenty se 6 a 5 acetyly. Data z vysokého rozlišení pro dceřinné ionty s 5 a 6 acetyly jsou 645,2594 (6 acetylů) a 607,2519 (5 acetylů), což značí, že molekulový • φ »φφφ

Φ 9 β

	• »44 « · Φ
23	φ 4

«	•	44 *444
		• · 4
•	•	4 4«
•	4	• «4· 4
•		» 4
*«·	··»	ΦΦ 4

vzorec pro Ia je ^C13^H28^N6°8·

Působení 6 N HC1 na aktivní sloučeninu (13 mg) poskytlo derivát, který je positivní na ninhydrin. Tyto výsledky udávají přítomnost amidových vazeb. Tento derivát má stejnou hodnotu jaká* byla^chromatograf ií, na tenké„vrstvě stanovena ......r* pro 2,3-diaminopropionovou kyselinu. To spolu s NMR daty udává přítomnost 2,3-diaminopropionové kyseliny.

Další technika, která byla využita pro analýzu Ia, je NOE (Nucleár-ní Overhauser-ův Efekt), který umožňuje určit jak blízko v prostoru má jeden proton ke druhému. NOE byl proveden na acetylovaném Ia. Ve dvojrozměrném NOE experimentu (NOESY) byl NOE pozorován mezi N-H protonem s δ 8,06 ppm a protonem s δ 5,17 (Obrázek 4).

Pro Ia byla stanovena následující struktura:

OH NH₀ NH_O

I I I h₉nco-nh-ch₀-ch-nhco-ch-ch-ch-ch-ch₉-ch-ch-ch₀-oh i III

CONH₂ OH OH OH

Lze ji označit jako ureidoamid. Jejími konstituenty jsou dvě amidové skupiny, močovina, dvě aminoskupiny a pět hydroxyskupin. Má sedm chirálních center.

3. Vlastnosti Ia

Zjistilo se, že isolovaný Ia znásobuje účinnost pesticidních proteinů krvstalíckého_del-ta^endo-t-QX-i-nu—^qc-í-Z-Z-uthuringiensis subsp. .kurstaki a Bacillu thuringiensis subsp.

W·' aizawai vůči Spodoptera exigua bez ohledu na formu pesticidních proteinů. Pesticidní účinnost se potencuje jak u formulací Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki, tak u isolovaných krystalů i u CrylA proteinů nezkrácených (molekulární hmotnost 130 kDa) či zkrácených (molekulární hmotnost cca 65 kDa). Účinnosti inklusí CrylI a CrylC se • · ·

0 04 * O • o o

♦ *

* *

·* ··

0 rovněž znásobují. Zjistilo se účinnost individuálních zkrácených a (c). Nezjistilo se, že by pro bioaktivitu byla kritická inkubační doba Ia s Cry proteinem. Avšak samotný Ia je inaktivní. Bylo nalezeno, že úroveň potencování je 100 až 200 násobná pro zkrácené CrylA proteiny, CrylI a CrylC inkluse a přibližně 320-ti násobná pro CrylA (c) plné délky (viz Tabulka I respektive II). Konkrétně, jestliže se použije Ia, způsobí 0,75 pg/ml mortalita/zakrnění hmyzu jako 240 pg/ml samotného CrylA (c). V případě zkráceného CrylA v kombinaci s Ia stejné skoré v

Cryla (c) testovaný sám s 0,075 0ϋ₂βθ. Inkluse CrylI při koncentraci 0,6 pg/ml daly v kombinaci s Ia stejné skoré v zakrnění a podobnou mortalitu jako 75 pg/ml samotného CrylI proteinu, což je 125ti násobná potenciace. Inkluse CrylC při 0,3 pg/ml s přidáním Ia vykázaly podobnou mortalitu a skoré zakrnění jako 75 pg/ml CrylC protein samotný, což odpovídá 250ti násobné úrovni potenciace. Koncentrace proteinu CrylA, která způsobovala zakrnění, po přidání Ia vykázala mortalitu·.

stálý při bioassay po 5 minutovém odstavci 1, ale při autoklávování ztrácí. Dále je stálý, je-li hodin přímému slunečnímu světlu. 2, ale nestálý při pH 12. Bylo ztrácí, je-li vystaven

Zjistilo se, že Ia je varu, jak se popisuje v (>190 C) veškerou aktivitu vystaven po dobu nejméně Ia je stálý 3 dny při zjištěno, že veškerou že také, proteinů

J^e

Cryl a potencována (a) , (b)

CrylA (c) stejný poměr (c) 0,0006 θ^280 poskytly zakrnění jako stejný vzorek

Inkluse CrylI

Ia stejné

PH aktivitu působení kyseliny_j.odis.té_nebo—koncen-t-rované—k-yseT-i-ny—solnév

Tabulka I

POTENCIAČNÍ EFEKTY Ia U ČIŠTĚNÉHO ZKRÁCENÉHO PROTEINU B.t.

Protein B.	thuringiensis	Spodoptera exigua
Typ	OD 280	Ia	Mortalita^^- Skoré zakrnění
Cryla (a)	0,055	-	0/5	2,2
	0,040	-	0/5	2,2

·· ···· · • 4 4 44 • 444 ·

4 · 4 • · · • 444 444 444

•	·· ·»·
0« 4	4 4 · ♦ 4 ·
4	• ··· ·
*	0 «
• 44	• 4 ·

0,020	-	0/5	2,0
0,020	+	2/5	0,0
0,010	+	0/5	0,2
0,005	+	0/5	0,0
0,0025	+	0/5	0,4
0,0012	+	0/5	1,8
0,0006	+	0/5	_______1,6

CrylA (c)	0,075		0/5	3,4
	0,040	-	0/5	2,6
	0,020	-	0/5	2,8
	0,020	+	1/5	0,0
	0,010	+	0/5	0,2
	0,005	+	1/5	0,0
	0,0025	+	2/5	2,0
	0,0012		0/5	1,0
Žádný	0,0006	+	1/5	1,0
NA	+	0/5	4,0
Žádný	NA	-	0/5	4,0

^Mortalita = počet mrtvého hmyzu/počet všeho hmyzu po 2 dnech >

Skoré zakrněni je definováno průměrnou velikostí živých hmyzích larev na konci bioassaye: 4,0 = neošetřená kontrola, 3,0 = 75 % velikosti neošetřené kontroly, 2,0 = 50 % velikosti neošetřené kontroly, 1,0 = 25 % velikosti neošetřené kontroly, 0,0 = žádný růst nebo nezměněná velikost od začátku experimentu.

Tabulka II

POTENCIACNí EFEKTY Ia U PROTEINU B. THURINGIENSIS

Protein B.	thuringiensis	Spodoptera	exigua
Typ	pg/ml	Ia	1 Mortalita Skoré zakrnění
Cryla (c)	240	-	l/\ ..	0,5
	120	-	0/5	2,2
	60	-	0/5	2,2
	30	-	0/5	4,0
	60	+	5/5	—
	30	+	5/5	—
	15	+	4/5	0,0
	3	+	4/5	1,0
	0,8	+	2/5	1,6

· a 9 o i

CrylI	300		1/5	0,8
	150		2/5	0.7
	75		1/5	0,2
	38		0/5	0,8
	19		0/5	1,6
	9		0/5	1,8
5	* : •ul**· +	„ . l/5_ 3/5	4 _? 0 °-· ^h 1,0
	19	+	2/5	0,5
	9	+	3/5	0,0
	5	+	1/5	0,5
	2,4	+	1/5	0,0
	1,2	+	3/5	0,5
	0,6	+	2/5	0,3
CrylI	300	-	2/5	0,3
	150	-	2/5	0,0
	75	-	1/5	0,8
	38	-	0/5	3,2
	38	+	5/5	—
	19	+	5/5	, ---
	9	+	5/5	—
	5	4-	4/5	0,0
	2,4	+	1/5	0,0
	1,2	+	5/5	—
	0,6	+	3/5	1,5
	0,3	+	2/5	1,3
Žádný	NA		0/5	4,0
Žádný	NA	+	0/5	4,0

^Mortalita = počet mrtvého hmyzu/počet všeho hmyzu po 2 dnech ^Skore zakrnění je definováno průměrnou velikostí živých hmyzích larev na konci bioassaye: 4,0 = neošetřená kontrola, % velikosti neošetřené kontroly, 2,0 = 50 % neošetřené kontroly, 1,0 = 25 % velikosti

3,0 = 75 velikosti neošetřené kontroly, 0,0 = žádný růst nebo nezměněná velikost od začátku experimentu.

4. Zhodnocení dalších .subspecies Bacillu thuringiensis a dalších species druhu Bacillus

Některé Bacillus species byly hodnoceny z hlediska produkce Ia. Kmeny byly fermentovány 72 hodin při 30 C v prostředí, které obsahovalo zdroj uhlíku jako škrob, Škrobový hydrolysát nebo glukosu a zdroj dusíku jako protein, *· ···« hydrolysát proteinu nebo výluh z obilí. Kapaliny nad živnou půdou byly na tvorbu Ia testovány pomocí mikrobioassaye se Spodoptera exigua, jak je shora popsáno. Bylo zjištěno, že Bacillus thuringiensis subsp. aizawai druh EMCC0087 uložený v NRRL jako NRRL B-21148) a.^Bacillus^ thuringiensis^,^,. subsp. galleriae (uložený v NRRL), produkují Ia přibližně ve stejné koncentraci jako Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki .

Ia produkuje také B. subtilis, B. cereus, B.t. subsp. alesti, B.t. subsp. canadiensis, B.t. subsp. darmstadiensis, B. t. subsp. dendrolimus, B. t. subsp. entomocidus, B. t. subsp. finitimus·, B. t. subsp. israelensis, B. t. subsp. kenyae, B. t. subsp. morrisoni, B. t. subsp. subtoxicus, B. t. subsp. tenebrionis, B. t. subsp. thuringiensis, B t. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subtilis a B. thuringiensis « subsp. kurstaki cr.y- spo- mutant jak bylo stanoveno kapilární elektroforesou.

Pro kvantifikaci hodnot Ia byl použit Beckman P/ACE systém kapilární elektroforesy, opatřený nepotahovanou kapilárou 50 μπι x 57 cm, 0,2 M fosfátový pufr o pH 6,8, pří napětí 15 kV a detekci při 200 nm. Objemy vzorků jsou 20 nl a doba stanovení 25 minut.

Standardní křivka byla vytvořena za použití čištěného Ia jako standardu při hodnotách 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml a 0,078 mg/ml. Vznikla lineární kalibrační křivka. Výsledkem rovnice y = mx + b se určovala koncentrace __Ia v kaž.dém—vzorku——--—-------—----- ~ _ _ . Před každým stanovením se kapilára - po dobu 3 minut proplachovala proudem pufru (0,2 M fosfát, pH 6,8). Po každém minutovém stanovení se kapilára proplachovala 1 minutu

N NaOH, 1 minutu filtrovanou vodou pro HPLC, 3 minuty 0,5

M kyselinou fosforečnou a 1 minutu filtrovanou vodou pro

HLPC. Integrací plochy pod každým peakem byla určena její · ···· « · «· ···· • · · 09 · · ♦ · · velikost a konečná koncentrace byla vypočtena na základě standardní křivky.

5. Hodnocení komerčních produktů B. thuringiensis

Množství Ia přítomného v_ různých komerčně.dostupných produktech B. thuringiensis se určovalo kapilární elektroforesou, která je popsána svrchu v odstavci 4. BACTOSPEINE™, JAVELIN™, NOVODOR™, SPHERIMOS™, BACTIMOS™, FORAY™, FLORBAC^ a BIOBIT™ byly získány od Novo Nordisk A/S. XENTARI™ a DIPEL™ byly získány od Abbott Laboratories. AGREE™ pocházel od Ciba-Geigy, MVP™ dodával Mycogen a CUTLASS™ byl získán od firmy Ecogen.

Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce III a ukazují, že Ia je přítomen v různém množství v rozmezí od méně než 0,001 g la/BIU až do 0,071 g la/BIU.

Tabulka III Ia V KOMERČNÍCH PRODUKTECH BACILLUS THURINGIENSIS
Produkt	Typ	Šarže č.	Potence	Ia g/BIU
JAVELIN™ VG	Btk	99942281	32000 IU/mg	0,071
XENTARI™	Bta	58715PG	15000 IU/mg	0,06
AGREE™	Bta/Btk	RA208004	25000 IU/mg	0,033
BIOBIT™ HPVP	Btk	5012	48950 U/mgPIA	0,018
BIOBIT^Tin FC	Btk	AG46669071	8 BIU/1	0,013
FORAY™ 48B	Btk	BBN7018	12,6 BIU/1	0,012
DIPEL™	Btk	58739PG	32 000 IU/mg	0,011
FORAY™ 76B	Btk		20,0 BIU/1	0,007
BACTOSPEINE™	Btk	B0B001	123653 IU/mg	0,003
BACTOSPEINE™	Btk	KX02A	100 000 IU/mg	0,003

• · 4 4 » ft	•	• ·· ···*
« ♦ ·	• 4	9 4	4 · *
♦ · ··	•	•	4 · 4
• · 4	•	•	• 4 4 4 4
» ·	*	•	• ·
	«44	• 4«	• * 4

BACTOSPEINE™	Btk	VP	16 000 IU/mg	< 0,001
NOVODOR™	Btt	9024	16,3 milionů LTU/qt	9,5 x 10⁹g/LTU
FLORBAC™	Bta	082-31-1	30 000 U/mg E	< 0,001
SPHERIMOS™	B. sphr	BSN006		žádný
MVP™	Btk	21193542		žádný
CUTLASS™	Btk/Btk			žádný
BACTIMOS™	Bti	BIB0024	11 700 IU/mg	žádný

6. Bioassaye s přidávanou výživou

Účinnost B. t. k. se stanovovala bioassayem s přidáváním umělé výživy pro larvy třetího stadia vývoje Spodoptera exigua, druhého stadia larev Helicoverpa zea, třetího stadia larev Spodoptera frugiperda, druhého stadia larev Heliothis virescens, třetího stadia larev Trichoplusia ni, třetího stadia larev Pseudoplusia includens, třetího stadia larev Plutella xylostella, třetího stadia larev Spodoptera littoralis a třetího stadia larev Mamestra brassicae.

Bioassaye s přidávánou výživou se prováděly ke zjištění úrovně potenciace po přidání Ia ke komerčním produktům B. thuringiensis a stanovení rozsahu působeni na hmyz. V experimentech s vysokými koncentracemi Ia vůči Spodoptera exigua (7,4 až 23,7 g Ia/BIU), byl k potenciaci BIOBITu^ FC (FC znamená ztekutelný koncentrát) použit čištěný Ia (7_0__%. aktivní složky, 30 % neutralisačního ,acetátového iontu). Získaná, v tabulce IV uvedená, data ukazují potenciaci BIOBITu^ HPVP (HPVP = smáčítelný prach s vysokou účinností) pomocí Ia (0,658 % aktivní složky). S. littoralis a M. brassicae byly testovány FLORBACem^^M HPVP a Ia.

Byly navazovány různé komerční produkty B, thuringiensis a byl k nim přidán Ia, aby vzniklo 0,1 až 237 g Ia/BIU, Objem ,

<·

byl adjustován s 0,1 % Tween¹ . Vzorky byly na 1 minutu vystaveny ultrazvuku a pak zředěny na konečný objem. Byly připraveny také čisté vzorky (bez Ia) a referenční látky. Referenční látky představují B. t. k. HD-1S-1980 (získaný od NRRRL), u něhož se udává síla 16 000 mezinárodních jednotek ” ₄ TM (IU) na miligram a JAVELIN¹ , jemuž se přisuzuje síla 53 000 Spodoptera jednotek/mg (SU).

Standardní umělá výživa složená z vody, agaru, cukru, kaseinu, pšeničných klíčků, methyl parabenu (= methyl 4-hydroxybenzoát), sorbové kyseliny, lněného oleje, celulosy, solí a vitaminů se připravovala ve 20 1 vyhřívaném kotli. To poskytlo dostatek výživy pro testování 10 až 12 vzorků se sedmi různými koncentracemi pro každou testovanou látku. Roztoky B.t. byly sériově zředěny na alikvotní podíly o 16 ml. Každý alikvot byl přidán ke 184 g roztavené výživy. Následně se směs homogenisovala a nalila na plastikový tác obsahující 40 jednotlivých buněk. Pro každou násadu výživy byly připraveny tři kontrolní tácy. Na to byla potrava ochlazena a ztužena, do každé buňky byl přidán hmyz určitého stáří (druhé až třetí vývojové stadium) a tácy byly pokryty perforovanou folií průhledného plastu. Tácy byly umístěny do polic a čtyři · dny podrobeny inkubaci při 28 C a 65 %-ní relativní vlhkosti.

Po čtyřech dnech byla spočítána mortalita hmyzu. Na vrch každého tácu bylo zamířeno prudké fouknutí a larvy, které se nehýbaly, byly počítány jako mrtvé. Byla vypočtena procenta -mor-tal-i-t-y---a-—data---by-la—ana-lyzována---pomocí paraůnsTních^- .□kontrolních analýz. Byly stanoveny LC^q, LC^q , směrnice regresních přímek, koeficient odchylek a potence. Stanovení vzorků se provádělo nejméně třikrát, nebo dokud tři potence nebyly mezi 20 % kolem vypočteného průměru pro každý vzorek. Pro výpočet vzrůstu aktivity spojené s každou koncentrací Ia, byla provedena korekce LC^q poměru jB.t./Ia ve vzorku tak, aby ¢3 V 0 · 4 • « « « e

, čistých a tak se odpovídal množství B.t. ve vzorku. LC^q párových vzorků se vydělily korigovanými LC^q hodnotami ; získal násobek snížení LC^q spojený s la.

Pro assay na Lobesia bothrana byl použit následující postup. Vinné ^hrozny,., .napadené od - Lobesia - bothrana¹ ‘ byly shromážděny na nepostříkaném poli a odstranily se larvy. Byla připravena serie ředění la ve vodě (250 pg/ml, 500 pg/ml a 1000 pg/ml). Doprostřed petri misky se umístila jedna larva. Jakmile se zpozorovalo, že larva pije, byla přemístěna do petri misky s čerstvě utrženými bobulemi hroznů. Larvy byly uchovávány při 22 C, 3 až 4 dny.

Jak ukazuje tabulka IV, u všech případů bylo zaznamenáno signifikantní snížení LC^q

Tabulka IV BIOESSAYE S PŘIDÁVANOU VÝŽIVOU
Hmyz	g la na BIU	Vzrůst účinnosti, násobek snížení LC^q
Spodoptera exigua	0,1	1.5
(BIOBIT™ HPVP)	0,2	1,7
	2,0	4,3
	4,0	7,5
Spodoptera exigua	7,4	13
(BIOBIT™ FC)	15	26
	30	34
	118	59
	237	79
Spodoptera frugiperda	0,2	2,2
' (BIOBIT™ HPVP) ’	0,8	3,9
	2,0	7,2
	4,0	11,6
Trichoplusia ni	0,1	1,1
(BIOBIT™ HPVP)	0,2	1,2
	2,0	2,0
	4,0	3,1

« · ♦ · · *

		·· ·»·· · • · ♦ II • · 9
	32	9 λ a
Pseudoplusia includens (BIOBIT™ HPVP)	0,1 0,2	0 1.2
	0,8	2,1
	2,0	2,4
	4,0	3,4

Plutella xylostella (BIOBIT™ HPVP)	0,8 2,0 4,0	.. 1,6-- ^{* * * * v} 1.3 1.4 1,9
Helicoveroa zea (BIOBIT™ HPVP)	3,2	12,6
Heliothis v irescens (BIOBIT™ HPVP)	3,2	4,2
Lobesia bothrana (BIOBIT™ HPVP)	2,0	3,0
Spodoptera littoralis (FLORBAC™ HPVP)	2,0	8,6
Mamestra hrassicae (FLORBAC™ HPVP)	2,0	4,9

Potencíace různých komerčních, produktů na Spodoptera exigua pomocí Ia byla určována, jak popsáno svrchu, bioassayem s přidávanou výživou. Množství přidaného Ia na BIU komerčního produktu jsou uvedena níže v tabulce V. Směs Ia/vzorek produktu B.t. byla přidána do výživy obsahující kasein pšeničných klíčků na agaru. Hmyz byl k výživě umístěn na čtyři dny a udržován při 28 C. Mortalita byla __zaznamenávána a_anal.yzována—průběžně-;—a—potence^- , ₍._jrj ,-.bvlv vypočítávány z paralelních 'vzorků, které Ia neobsahovaly. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce V, • ukazují, že Ia potencuje rozdílné produkty B.t.k. a B.t.a.

pocházející z různých zdrojů. Kmeny B. thuringiensis obsažené v těchto vzorcích, jsou popsány svrchu v oddíle 5.2.

«» ««*«

I-----------------------------------------------------------------------------------_n\| Tabulka V \| \| POTENCIACE PRODUKTŮ B. thuringiensis NA Spodoptera exigua ]
Produkt	g Ia na BIU R lAf.' λ f ·¹	Vzrůst účinnosti násobek sníženi LC^q
BACTOSPEINE™ VP	0,4	1,04
	1,7	2,3
CONDOR™	0,4	2,4
	1,7	5,1
AGREE™	0,4	1,1
	1,7	1,6
CUTLASS™	0,4	1,1
	1,7	2,5
MVP™	0,4	6,0
	1,7	7,7
	2,0	12,1
FLORBAC™ HPVP	0,2	1,1
	0,8	2,0
DIPEL™ 2X	0,2	1,2
	0,8	2,3
	2,0	3,9
JAVELIN™ VG	0,2	0
	0,8	1,08
	2,0	2,9
XENTARI™	0,2	1,2
	0,8	1,6
	2,0	2,4

7. Bioassaye na list

Bioassaye na list se prováděly s larvami Spodoptera exigua ve druhém stadiu na brokolicích a použit byl BIOBIT™ FC a Ia. Poměr Ia k BIOBITu™ FC byl 2 g la/BIU BIOBIT™ FC. Brokolice byly ošetřeny pomocí pojízdného ostřikovače a objem s nosičem byl 225 1/ha (20 gal/akr). Když postřik na listech

4« ····

Β uschl, byly listy z rostlin otrhány a zamořeny larvami

Spodoptera exigua druhého stadia. Níže, v tabulce VI, jsou uvedeny výsledky. 100 %ní mortalita byla zaznamenána při dávce BIOBITu™ FC + Ia 8,7 BlU/ha, zatímco samotný BIOBIT™

FC usmrtil 92 % larev při 58,8 BlU/ha, a 8„%,při 17,óBIU/ha.-' — · .....* “ ^J'

Ošetřené rostliny byly také na osm hodin vystaveny přímému slunečnímu záření a pak byly listy otrhány a zamořeny. Po osmi hodinách na slunečním světle vykázal samotný BIOLIT™ FC při 58,8 BlU/ha mortalitu 27 %, zatímco BIOBTT™ FC + Ia vykázal 100 % mortality při 8,7 BlU/ha.

Při pokusech na list prováděných s larvami časného TM čtvrtého stadia vykázal samotný- BIOBIT FC 75 % mortality při 52 BlU/ha a BIOBIT™ FC (FC znamená ztekutelný koncentrát) spolu s Ia vykázal 100 % mortality při 13 BlU/ha.

Tabulka VI BIOASSAYE NA LIST
Ošetření	BlU/ha	mortalita %	larvární stadium
BIOBIT™ FC	58,8	92	2
BIOBIT™ FC	17,6	8	2
BIOBIT™ FC + Ia	8,7	100	2
BIOBIT™ FC + sluneční
záření 8 hodin	58,8	27	2
BIOBIT™ FC + Ia	+
sluneční záření	8 hodin 8,7	100	2
’ΒΤΟΒΊΤ™ FC	52	75	4
BIOBIT™ FC + Ia	*13	100 *	4

8. Polní pokusy

Polní pokusy na cizrně (Spodoptera exigua) ukázaly, že výsledek u samotného BIOBITu™ FC při 70 BlU/ha byl 51 %, zatímco 2 g Ia/BIU BIOBIT™ FC při 40 BlU/ha vykázaly 89 % « · · · 9 9 (vztaženo na neošetřený případ). JAVELIN™ VG při 45 BIU/ha vykázal 51 %.

Polní pokusy na kukuřici cukrové (Spodoptera frugiperda) ukázaly, že s 2 g Ia/BIU BIOBIT™ FC při 39,5 BIU/ha je výsledek 84 ’ • 9 ··*« • 9 • 9 · · uskutečněny s koloniemi citlivé a xylostella. Resistentní můry byly z pole Floridy, u nichž se vyvinula resitence exposici na JAVELIN™ VG. Analýzy při bioassay s a XENTARI™ byly průměru šesti cm

9. Stupně resistence

Bioassaye byly resistentní Plutella sesbírané vzorky z vůči B. t. po intensivni byly prováděny s BIOBITem™ HPVP a Ia namáčením listu. Resistence vůči JAVELIN™ zjišťovány bez Ia. Disk ze zelného listu o byl na 10 sekund ponořen do jedné z osmi různých koncentraci vzorků B. t. nebo formulací B. t./Ia. Rozsah koncentrací byl od 1 ppm do 1000 ppm. Disky listů byly dvě hodiny sušeny na vzduchu a umístěny do plastikových petri misek s larvami (0,2 až 0,4 mg) druhého stadia. Dávka dvacetipěti kusů hmyzu/den byla opakována dvakrát, aby bylo dosaženo dávky 50 kusů. Mortalita se zaznamenávala po 72 hodinách při 27 C. Regrese mortality u dávky se analyzovala průběžně. Stupně resistence byly vypočítány dělením hodnot LC^q a LC^q citlivých můr. Výsledky jsou v tabulce VII a ukazují, že BIOBIT™ HPVP potencuje při 2 g Ia/BIU a 4 g Ia/BIU. Konkrétně při 4 g Ia/BIU je dvojnásobné snížení stupně -resistence—LCrTj a děšěťiňašbbňé snížení stupně resistence -tc₉₀.

Λ

X

		« 99 9999
0 ♦	•		99	9 9 ·
•	*··	•	•	• · 9
	• ♦	«	•	• 0 9 9 *^J
4	a	•	9	* 9
		···	999	·· *

Tabulka VII STUPNĚ RESISTENCE Plutella xylostella (B.t.k. resistentní)
Testovaný vzorek	lc₅₀ rr	^90 RR
JAVELIN™ VG	„^302,6 ____	.. 3829,7* -
BIOBIT™ HPVP	20,5	98,5
2 g Ia/BIU BIOBIT™ HPVP	23,2	88,0
4 g Ia/BIU BIOBIT™ HPVP	10,4	11,5
XENTARI™	9,7	8,2

Vynález zde popsaný a nárokovaný není ve svém rozsahu omezen na provedení zde uváděná, protože tato provedení jsou zamýšlena jako ilustrace některých aspektů vynálezu. Jakákoliv ekvivalentní provedení je třeba považovat za jsoucí v rozsahu tohoto vynálezu. Ve skutečnosti různé modifikace vynálezu, spolu se zde ukázanými a popsanými, se stanou z předcházejícího popisu zřejmými pro ty, kteří mají zkušenosti v oboru. Takové modifikace jsou také považovány za spadající do rozsahu připojených nároků.

Jsou zde citovány různé reference, jejichž objevy jsou vtěleny odkazem v jejich celistvostech.

Uložení mikroorganismů

Následující kmeny Bacillu thuringiensis byly podle _______^^P£É^á_dohody_3Ho^y_v_A_gr.ic.ult.ura.l__Re.sea-r_eh-Servi-ce .i_l.„_w„^^X^{atent CultUr}F Collection (NRRL), Nothern^ Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.

Kmen.

Přírůstkové číslo

Datum uložení

EMCC0086

NRRL B-21147

6. října 1993

Druhy byly deponovány za podmínek, které zaručují, že

•4 4444	4 4 4· 4444
4 G 4	o a	44	• · 4
4 «··	«	4	• · 4
• · *	4	•	* 44 4 ·
• ·	4	4	• 4'
	·· 4	• 4«	• 4 ·

přístup ke kultuře bude dosažitelný během řízení o této patentové přihlášce tomu, koho určí Commissioner of Patents and Trademarks (předseda úřadu pro patenty a ochranné známky), který je pro to zmocněn podle 37 C.F.R. 1.14 a_U.S.C. 122.^Uloženývzorek představuje podstatně, čistou kulturu každého deponovaného druhu. Uložený vzorek je dostupný, jak vyžadují cizí patentová práva v zemích, v nichž jsou zaregistrovány protějšky nebo příbuzné přihlášky subjektu. Avšak je třeba rozumět, že dostupnost uloženého vzorku nezakládá volnost provozovat předložený vynález za narušení patentových práv udělovaných státním aktem.

Claims

« ·· ···· 9 B 9 B B • B B • • 9 · • 9 · 38 « · · • · • • • ·« • • 9 9· • 999 9 9 9 * * 9

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob získání faktoru, který zesiluje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) pěstováni kultury kmene Bacillus (b) získání faktoru ze supernatantu kultury ze stupně (a).
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kmen podle stupně (a) je pěstován ve fermentačním prostředí,
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se ti m, ž e dále zahrnuje isolaci řečeného faktoru zé supernatantu pomocí sloupcové chromatografie.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že faktor má v ³H NMR spektru chemické posuny kolem δ 1,5; 3,22; 3,29; 3,35; 3,43; 3,58; 3,73; 3,98; 4,07;

4,15; 4,25; 4,35 a chemické posuny kolem δ 31,6; 37,2;

51,1; 53,3; 54,0; 54,4; 61,5; 61,6; 64,1; 65,6; 158,3; 170,7 a 171,3.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že faktor má strukturu I *

. L.

OH NH_O

I I I

H₉NC0-NH-CH₉-CH-NHC0-CH-CH-CH-CH-CH₉-CH-CH-CH^-0H

I III ²

CONH₂ OH OH OH

OH nebo je její solí.

(I) ič

• 4 • 444 · 4 44 «444 • • • 4 4 4 4 4 4 • 444 4 4 4 4 4 « • » 4 • ♦ 44 4 4 9 • 4 » 4 »44 444 44 4
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kmenem Bacillu je kmen Bacillus thuringiensis.

Ί. Způsob podle nároku 6, vyznač u j\í_c í ^s e tím, že kmen Bacillus thuringiensis je volen ze skupiny tvořené kmeny Bacillus thuringiensis subsp. aizawa.i, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis susp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis _________subsp----s-o-t-t-o-, Bac-i-Tl-u-s----t-huri-ngiensi-s—subsp“ stíbT&xi cus~, .... _t i. m rni·: Bori Ί
7 c thuringiensis subsp. tenebrionis”; Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis Subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis and Bacillus thuringiensis subsp.

*· »444 • 9 ♦· 9 4 9 9* 9 9 9 • ··· • 9 9 9 9 • • 9 • • 4*4 « • • • 9 9 • ·· 4 4 ·· ·· 4

yunnanensis,
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m, ž e kmenem Bacillus thuringiensis je kmen Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.

· .h Hta. — J·

UV
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že s druhem Bacillus související pesticid zahrnuje delta-endotoxin druhu Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že delta-endotoxin druhu Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment se volí ze skupiny tvořené Cryl, CrylI, CrylII, CrylV, CryV a CryVI.
11. Způsob podle nároku 10,vyznačuj ící se tím, že delta-endotoxin druhu Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment je CrylA delta-endotoxin nebo jeho pesticidně účinný fragment.
12. Způsob podle nároku 11,vyznačuj ící se tím, že delta-endotoxin druhu Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment je CrylC delta-endotoxin nebo jeho pesticidně účinný fragment.