PL184625B1 - Nowe pochodne kwasu nonatetraenowego i zawierające je kompozycje farmaceutyczne - Google Patents

Abstract

1. Nowa pochodna kwasu nonatetraeno- wego o wzorze 47, w którym wiazanie C7 -C8 jest wiazaniem podwójnym, zas R1 i R2 razem oznaczaja grupe C3 -C6 alkilenowa, oraz jej farmaceutycznie dozwolone sole i estry. 3. Kompozycja farmaceutyczna zawie- rajaca skladnik aktywny i ewentualnie far- maceutycznie dozwolony obojetny nosnik, znamienna tym, ze jako skladnik aktywny zawiera pochodna kwasu nonatetraenowego o wzorze 47, w którym, wiazanie C7 -C8 jest wiazaniem podwójnym, zas R1 i R2 razem oz- naczaja grupe C3 -C6 alkilenowa, lub jej far- maceutycznie dozwolona sól lub ester. Wzór 47 PL PL PL

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku są nowe pochodne kwasu nonatetraenowego i zawierające je kompozycje farmaceutyczne.

Bardziej szczegółowo, przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna kwasu eonatetraenowego o wzorze 47, w którym wiązanie C7-C8jest wiązaniem podwójnym, zaś R_t i R razem oznaczają grupę C₃-C6 alkil^^n^o^wą oraz jej farmaceutycznie dozwolone sole i estry.

Korzystnymi związkami według wynalazku są związki następujące:

kwas (2F,4E)-3-metylo-5-(2-((F)-2-(2,6,6-trimetylo-1-cykloheksen-1-ylo)wieylo)-1-cyklopenten-1-ylo)-2,4-pentadienowy, kwas (2E,4E)-3-metylo-5-(2-(2-((E)-2-(2,6,6-trimetylo -1 -cykloheksen-1 -ylo)winylo)- 1 -cykloheksen-1 -ylo)-2,4-pentadienowy, kwas pE,4E)-3-metylo-5-(2-((F.)-2-(2.6.6-trimety]o-1 -cykloheksen-1 ^0^^10)-1 -cyklohepten^1-ylo)-2,4-peetadieeowy i kwas (2E,4E)-3-metylo-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimetylo-1-cykloheksen- 1 -ylo)wieylo)-1 -cy kłooktcn -1 -yCo)-2,4-pentadtenvwy.

W całym dalszym opisie przyjmuje się, że określenie „retinoidy o aktywności RAR α’ oznacza grupę obejmuj ącąkwas all-traes-retieojowy, kwas 9-cis-retinojowy i kwas 13-cis-retinqjowy.

184 625

Kwasy retinojowe wywierają swe działanie wiążąc się z białkami należącymi do rodziny białek znanych jako jądrowe receptory kwasu retinojowego („RAR”). Trzej członkowie tej rodziny oznaczeni sąjako RAR α, RAR βί RAR γ. Kwas 9-cis-retinojowy wiąże się z grupąreceptorów znanych jako receptory X kwasu retinojowego („RXR”) [Levin i in.. Naturę, 355. 359 361 (1992); Heyman i in., Cell, 68, 397 - 406 (1992)], podczas gdy kwas all-trans-retinojowy i 13-cis-retinojowy (wiążące się z RAR α) nie wiążą się z nimi. Jednakże, kwas 9-cis-retinojowy działa także jako ligand dla receptorów grupy RAR, w wyniku czego może wywoływać niepożądane skutki uboczne obserwowane w przypadku kwasu all-trans-retinojowego i kwasu 13-cis-retinojowego. Znane jest tworzenie zarówno przez receptory RAR, jak i receptory RXR heterodimerów pośredniczących w ich czynnościach biologicznych [Leid i in., Cell, 68, 377 395 (1992); Yu i in., Cell, 67, 1251 - 1266 (1991); Zhang i in.. Nature, 355, 441 - 446 (1992)]. Związki według wynalazku wykazują wysoki stopień selektywności w stosunku do receptorów rodziny RXR. Sąone użyteczne jako środki antyproliferacyjne i znajdujązastosowanie we wskazaniach dermatologicznych i onkologicznych. W szczególności, związki według wynalazku hamująproliferację komórek łojowych. Wiadomo, że przyczyną trądzika jest proliferacja komórek łojowych. Toteż, zahamowanie proliferacji komórek łojowych jest znanym sposobem leczenia trądzika i dlatego związki według wynalazku są użyteczne w leczeniu trądzika.

Oprócz tego, selektywne wobec receptorów RXR związki według wynalazku, stosowane w dawkach, w których jako takie nie są aktywne, podwyższają aktywność retinoidów użytecznych w leczeniu raka, a zwłaszcza białaczki i guzów litych, a wśród nich guzów głowy, szyi i sutka, przy czym w sposób specjalny dotyczy to guzów sutka. Ale są one także użyteczne same z siebie, w leczeniu stanów dermatologicznych, w szczególności trądzika i uszkodzeń skóry powstałych w wyniku oparzenia słonecznego, i to przy zmniejszonym oddziaływaniu toksycznym w porównaniu z kwasem 9-cis-retinojowym lub kwasem 13-cis-retinojowym. Retinoidy o aktywności RAR α, takie jak kwas all-trans-retinojowy i kwas 13-cis-retinojowy, są związkami, których aktywność biologiczna opartajest na ich wiązaniu się z receptorami RAR α i transaktywacji tych receptorów. Tak więc, związki według wynalazku są użyteczne jako środki wzmagające aktywność retinoidów o aktywności RAR α w leczeniu tych chorób, w przypadku których rozpoznana jest przydatność stosowania wspomnianych retinoidów^. Stosowanie związków według wynalazku łącznie z retinoidem o aktywności RAR α umożliwia użycie o wiele mniejszych dawek tego ostatniego, albo też zwiększa moc działania retinoidu przyjmowanego w zwykłej dawce. Dotyczy to wszelkich wskazań, w przypadku których stwierdzono przydatność stosowania retinoidu o aktywności RAR α

Tak więc przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, zawierająca składnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dozwolony obojętny nośnik, która jako składnik aktywny zawiera pochodną kwasu nonatetraenowego o wzorze 47, w którym wiązanie C₇-C₈jest wiązaniem podwójnym, zaś R, i R₂ razem oznaczają grupę C₃-C₆ alkilenową, lub jej farmaceutycznie dozwoloną sól lub ester.

Powyższa kompozycja, w przypadku stosowania do podawania miejscowego, korzystnie zawiera wspomnianąpochodnąw ilości wynoszącej od około 0,05% do około 3% wag. w stosunku do całkowitego ciężaru kompozycji.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna w postaci dawki jednostkowej przeznaczona do podawania doustnego, która zawiera pierwszy związek wybrany z grupy obejmującej kwas all-trans-retinojowy, kwas 9-cis-retinojowy i kwas 13-cis-retinojowy;

oraz drugi związek będący pochodnąkwasu nonatetraenowego o wzorze 47, w którym wiązanie C7-C₈jest wiązaniem podwójnym, zaś Rj i R₂ razem oznaczają grupę C₃-C₆ alkilenową, lub jego farmaceutycznie dozwolone sole lub estry, przy czym wspomniany pierwszy związek jest obecny we wspomnianej postaci dawki jednostkowej w ilości wynoszącej od 10 do 50 mg, w wspomniany drugi związek obecny jest we wspomnianej postaci dawki jednostkowej w ilości od 1 do 10 razy większej od ilości wspomnianego pierwszego związku.

184 625

Stwierdzono, że związki według wynalazku wzmagają aktywność retinoidów o aktywności RAR α pod względem powodowania różnicowania się ludzkich komórek białaczkowych w standardowym teście hodowli komórkowej. I tak, związki według wynalazku wykazują aktywność polegaj ącą na wzmaganiu aktywności retinoidów o aktywności RARapod względem powodowania regresji lub remisji nowotworów hematologicznych, a zwłaszcza tych nowotworów, które związane są z białaczką promielocytową. Ten sposób leczenia białaczki urzeczywistnić można za pomocą podawania związku według wynalazku układowo choremu, łącznie z retinoidem o aktywności RAR a, znanym ze swej użyteczności jeśli chodzi o opóźnienie rozwoju nowotworów hematologicznych lub powodowanie ich regresji. Ilość leku zależeć będzie od stopnia rozwoju i rozmiarów nowotworów i od wymagań chorego.

Stwierdzono, że związki według wynalazku wzmagają aktywność retinoidów o aktywności RARapod względem powodowania regresji lub remisji guzów litych, zwłaszcza tych guzów, które związane sąz rakiem głowy i szyi oraz z rakiem sutka. Tak więc, związki według wynalazku wykazują aktywność polegającą na wzmaganiu aktywności znanej z działania retinoidów o aktywności RARapod względem powodowania regresji lub remisji guzów litych, a zwłaszcza tych guzów, które związane sąz rakiem głowy i szyi oraz z rakiem sutka. Tego rodzaju sposób leczenia urzeczywistnić będzie można za pomocą podawania związku według wynalazku układowe choremu, łącznie z retinoidem o aktywności RAR a, wykazującym aktywność z punktu widzenia powodowania regresji lub remisji guzów litych, a zwłaszcza guzów głowy, szyi i sutka. Ilość omawianego leku zależeć będzie od stopnia rozwoju i rozmiarów nowotworów i od wymagań chorego.

W przypadku powyżej przytoczonych zastosowań terapeutycznych, związek według wynalazku stosuje się układowo, jako kompozycję zawierającą związek według wynalazku, ewentualnie w połączeniu ze związkiem o aktywności RAR a, oraz farmaceutycznie dozwolony nośnik zgodny ze wspomnianym związkiem (wspomnianymi związkami). Przy wytwarzaniu takiej kompozycji wykorzystać można jakikolwiek typowy, farmaceutycznie dozwolony nośnik, w przypadku podawania omawianego leku drogą doustną, na ogół podaje się go w regularnych odstępach czasowych, dogodnie podczas posiłków, albo raz na dzień.

Do farmaceutycznie dozwolonych soli należąjakiekolwiek sole chemicznie dopuszczalne, w tej dziedzinie techniki, z punktu widzenia tworzenia soli kwasu retinojowego, i nadające się do podawania, w składzie farmaceutycznie dozwolonego preparatu, osobom choiym. Można tu wykorzystać dowolną tego rodzaju dogodną, farmaceutycznie dozwoloną sól związków według wynalazku. Spośród typowych soli, które można w tym przypadku zastosować, wymienić tu można, na przykład, sole zasadowe, takiejak sole utworzone z metalami alkalicznymi, na przykład sole sodowe lub potasowe, sole utworzone z metalami ziem alkalicznych, na przykład sole wapniowe i magnezowe, oraz sole amoniowe lub alkiloamoniowe.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, związki według wynalazku można stosować w postaci ich farmaceutycznie dozwolonych, ulegających hydrolizie estrów. W omawianych tu kompozycjach i sposobach według wynalazku użyć można jakichkolwiek farmaceutycznie dozwolonych, ulegających hydrolizie estrów. Spośród tych estrów wymienić tu można estry aromatyczne, takie jak ester benzylowy (OBzl) lub ester benzylowy podstawiony, na przykład, takimi podstawnikami jak niższa grupa alkilowa, chlorowiec, grupa nitrowa, grupa tio lub podstawiona grupa tio, przy czym wymienić tu można takie podstawniki jak niższa grupa alkilowa, grupa tert-butylowa, grupa cyklopentylowa, grupa cykloheksylowa, grupa cykloheptylowa i grupa 9-fluorenylometylowa.

Kompozycje farmaceutyczne wytworzyć można w jakiejkolwiek typowej postaci, włączając w to: (a) postacie stałe do podawania drogą doustną, takiejak tabletki, kapsułki, pigułki, proszki, granulki itp., oraz (b) preparaty przeznaczone do podawania miejscewego, takiejak roztwory, zawiesiny, maści, kremy, żele, proszki zmikronizowane, aerozole itp. Omawiane tu kompozycje farmaceutyczne mogąbyć jałowe i/lub mogą zawierać adiuwanty, takiejak, na przykład, środki konserwujące, stabilizatory, środki zwilżające, emulgatory, sole przeznaczone do modyfikowania ciśnienia osmotycznego i/lub bufory.

184 625

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wspomniane powyżej związki według wynalazku są użyteczne przy stosowaniu w formie farmaceutycznie dozwolonych postaci przeznaczonych do podawania drogą doustną. Tego rodzaju farmaceutyczne kompozycje według wynalazku zawierają wspomniany związek według wynalazku, lub jego farmaceutycznie dozwolone sole i jego farmaceutycznie dozwolone estry, łącznie ze zgodną, farmaceutycznie dozwoloną substancją będącąjego nośnikiem. Można w tym przypadku użyć jakiejkolwiek typowej substancji stanowiącej nośnik. Nośnikiem takim może być tu obojętna substancja organiczna lub nieorganiczna, nadająca się do podawania drogą doustną. Do odpowiednich nośników należy woda, żelatyna, guma arabska, laktoza, skrobia, stearynian magnezowy, talk, oleje roślinne, glikole polialkilenowe, wazelina itp. Następnie, preparaty farmaceutyczne mogą zawierać także i inne środki farmaceutycznie aktywne, korzystnie retinoid o aktywności RAR α Można także dodać jeszcze inne dodatki, takie jak środki aromatyzujące, środki konserwujące, stabilizatory, środki emulgujące, bufory itp., zgodnie z przyjętą praktyką formułowania preparatów farmaceutycznych.

Preparaty farmaceutyczne wytworzyć można z nadaniem dowolnej typowej postaci dawkowania przeznaczonej do podawania drogą doustną, włączając w to postacie stałe do podawania drogą doustnątakie jak tabletki, kapsułki, pigułki, proszki, granulki itp. Do korzystnych postaci dawkowania do podawania drogą doustną należą tabletki, kapsułki żelatynowe twarde lub miękkie, z metylocelulozy lub innego, stosownego materiału, łatwo rozpuszczającego się w przewodzie pokarmowym. Przewidywane, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dawkowanie w przypadku przyjmowania drogą doustną, będzie się zmieniać w zależności od wymagań danego pacjenta i jest ustalane przez lekarza ordynującego lek.

W przypadku doustnego podawania choremu związków według niniejszego wynalazku, w celu wzmożenia różnicującej aktywności retinoidów o aktywności RAR α, zastosowanych do leczenia białaczki promielocytowej albo guzów głowy, szyi lub sutka, związki według wynalazku podaje się, na ogół, osobom dorosłym raz na dzień w lości około od 1 do 10 razy większej od ilości retinoidu o aktywności RAR α Stosowana ilość retinoidu o aktywności RAR wynosi od około 20 mg/m² do około 300 mg/m² dziennie, korzystnie od około 50 mg/m² do około 100 mg/m² dziennie, przy czym dokładna wielkość dawkowania zmienia się w zależności od rozmiarów i masy ciała chorego. Na ogół, leczenie skojarzone prowadzi się w okresie około trzech miesięcy.

Związki według wynalazku, albo ich farmaceutycznie dozwolone sole lub ulegające hydrolizie estry, oraz retinoidy o aktywności RAR α, można podawać łącznie, jako kompozycję doustną, zawierającą związek według wynalazku, jego farmaceutycznie dozwolone sole lub estry, w połączeniu z retinoidem o aktywności RAR α, w ilości dostatecznej do leczenia, z udziałem tej kombinacji, białaczki promielocytowej lub guzów głowy, szyi lub sutka.

Ogólnie, korzystną postacią doustnej dawki jednostkowej sątabletki lub kapsułki zawierające od 10 do 50 mg retinoidu o aktywności RAR α i związek według wynalazku w ilości od 1do 10 razy większej od ilości retinoidu o aktywności RAR α, j ego farmaceutycznie dozwolone sole lub jego farmaceutycznie dozwolone, ulegające hydrolizie estry. Tak więc, ilość związku według niniejszego wynalazku zawarta w każdej tabletce lub kapsułce może wynosić od 10 do 500 mg. Tego rodzaju tabletki lub kapsułki można podawać raz lub dwa razy dziennie, w zależności od masy ciała i rozmiarów chorego.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, miejscowe i doustne stosowanie związków według wynalazku, ich farmaceutycznie dozwolonych soli i ich farmaceutycznie dozwolonych, ulegających hydrolizie estrów, okazuje się skuteczne w leczeniu wszelkich postaci trądzika, zarówno połączonych, jak i nie połączonych ze stanem za palnym.

W przypadku miejscowego stosowania na skórę, kompozycj e zawieraj ące związek według wynalazku w farmaceutycznie dozwolonym nośniku korzystnie sporządza się w postaci maści, nalewek, kremów, żelów, roztworów, płynów kosmetycznych, aerozoli, zawiesin, szamponów, mydeł do włosów itp. W rzeczywistości, zgodnie z niniejszym wynalazkiem wykorzystać można jakąkolwiek typowo kompozycję stosowaną do nanoszenia na owłosioną skórę głowy czy na całą skórę. Spośród korzystnych sposobów nanoszenia kompozycji zawierającej składnik aktywny według wynalazku, wymienić można nanoszenie składnika aktywnego według wynalazku

184 625 sformułowanego jako żel, płyn kosmetyczny lub krem. Preparat kosmetyczny przeznaczony do stosowania miejscowego na skórę można wytworzyć za pomocązmieszania powyżej wspomnianego składnika aktywnego według wynalazku z nietoksycznymi, terapeutycznie obojętnymi, stałymi lub ciekłymi nośnikami, zazwyczaj stosowanymi przy formułowaniu preparatów tego rodzaju. Preparaty te powinny zawierać co najmniej około 0,05% wag. składnika czynnego według wynalazku w przeliczeniu na całkowity ciężar kompozycji. Ponieważ składnik aktywny według wynalazku jest względnie nietoksyczny i niepodrażniający, można go stosować w kompozycjach do podawania domiejscowego w ilości przekraczającej 3,0%. Korzystnie, kompozycje te zawierają od około 1% do około 2% wag. składnika aktywnego według wynalazku w przeliczeniu na całkowity ciężar kompozycji. Także korzystnie, omawiane preparaty stosuje się na skórę raz dziennie lub dwa razy dziennie. Preparaty te stosuje się zgodnie z wymaganiami chorego. W praktycznym wykonaniu niniejszego wynalazku, składnik czynny według wynalazku można także nanosić w postaci roztworu wodnego, albo roztworu alkoholowego, takiego jak roztwór w alkoholu etylowym.

Do wytworzenia powyżej opisanych preparatów przeznaczonych do stosowania miejscowego użyć można także składników dodatkowych, takich jak środki konserwujące, środki zagęszczające, środki zapachowe itp., typowo stosowane w dziedzinie formułowania preparatów farmaceutycznych przeznaczonych do stosowania miejscowego. Oprócz tego, w skład preparatów przeznaczonych do stosowania miejscowego zawierających powyżej wspomniany środek aktywny według wynalazku, włączyć można typowe środki o działaniu przeciwutleniaczy. Do tego rodzaju typowych przeciwutleniaczy, których wykorzystanie jest możliwe w przypadku omawianych preparatów, należą: N-metylo- α-tokoferoloamina, tokoferole, butylohydroksyanizol, butylohydroksytoluen, Etoxyquin itp.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, można tu wykorzystać także typowe środki zapachowe i płyny kosmetyczne, ogólnie stosowane do sporządzania przeznaczonych do miejscowego stosowania preparatów do włosów·'. Poza tym, jeżeli jest to pożądane, przy wytwarzaniu preparatów według wynalazku przeznaczonych do stosowania miejscowego użyć można typowych środków emulgujących. Preparaty w postaci maści, zawierające składnik aktywny według wynalazku, mogą obejmować mieszaniny złożone z półstałego węglowodoru pochodzącego z przerobu ropy naftowej i układu dyspersyjnego, w którym znajduje się składnik aktywny według wynalazku i odpowiedni rozpuszczalnik.

Kompozycje w postaci kremu zawierające składnik aktywny według wynalazku, korzystnie obejmująemulsje utworzone z fazy wodnej, złożonej z substancji pochłaniającej wilgoć, stabilizatora lepkości i wody, fazy olejowej, złożonej z alkoholu tłuszczowego, półstałego węglowodoru pochodzącego z przerobu ropy naftowej i emulgatora, oraz fazy zawierającej składnik aktywny według wynalazku zdyspergowany w wodnym roztworze typu stabilizator/bufor, w skład preparatów przeznaczonych do stosowania miejscowego włączyć można stabilizatory. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wykorzystać można jakikolwiek typowy stabilizator. W przypadku fazy olejowej funkcję stabilizatora pełni składnik w postaci alkoholu tłuszczowego. Tego rodzaju składniki korzystnie wywodzą się spośród produktów redukcji nasyconych kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach, zawierających co najmniej około 14 atomów węgla. Preparaty farmaceutyczne na bazie kremu, zawierające składnik aktywny według wynalazku, mogą być złożone, na przykład, z emulsji wodnych zawierających alkohol tłuszczowy, półstały węglowodór pochodzący z przerobu ropy naftowej, glikol etylenowy oraz środek emulgujący.

Ogólnie, leczenie trądzika, czy to połączonego ze stanem zapalnym, czy nie połączonego ze stanem zapalnym, przeprowadzić można przez doustne podawanie choremu związku według wynalazku w dawce wynoszącej od 0,1 do 10 mg/kg, raz, lub dwa razy na dzień. Leczenie trądzika można przeprowadzić za pomocą miejscowego na niesienia przeznaczonej do stosowania miejscowego kompozycji, zawierającej związek według wynalazku w ilości od około 0,05% do około 3% wag, korzystnie od około 1% do około 2% wag, raz lub dwa razy na dzień.

184 625

Wielkość dawkowania i sposób dawkowania, przyjęte przy leczeniu określonej choroby, typowo zależąod drogi podawania, oraz od wieku, masy ciała, rozmiarów i stanu choroby danego osobnika.

Znane są w tej dziedzinie wiedzy sposoby oznaczania właściwości retinoidów, dotyczących wiązania i transaktywacji, a odnoszących się do receptorów RAR i RXR [patrz, na przykład : Levin i in.. Nature, 355 359 - 361 (23 stycznia 1992); Allenby i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,30 - 34 (styczeń 1993); Allenby i in„ J. Biol. Chem.. 269.16689-16695 (17 czerwca 1994). Do oznaczania właściwości, dotyczących wiązania i transaktywacji, retinoidów przytoczonych i zamieszczonych w niniejszym opisie przykładach, użyto metod zasadniczo takich, jakie zostały opisane w powyższych publikacjach.

Aktywność związków według wynalazku, wykorzystywaną do leczenia trądzika, można oznaczyć jakimkolwiek typowym sposobem. I tak, na przykład, przejawiana przez związki według wynalazku zdolność hamowania proliferacji komórek łojowych stanowi standardowy model leczenia trądzika. Aktywność antyproliferacyjną w stosunku do komórek łojowych, wykazywaną przez związki według wynalazku można oznaczyć zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładzie XX (1).

Oprócz tego, zdolność związków według wynalazku zmniejszania rozmiarów łagiewek myszy Rhino stanowi podstawę innego standardowego modelu leczenia trądzika. Aktywność tę można oznaczyć; zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładzie XX (2). Następnie, zdolność związków według wynalazku zmniejszania rozmiarów gruczołów łojowych złocistego chomika syryjskiego stanowi inny standardowy model leczenia trądzika. Aktywność tę można oznaczyć zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładzie XX (3).

Zdolność związków według wynalazku wzmagania aktywności RAR aretinoidów można określić w jakikolwiek typowy sposób. I tak, przejawianą przez związki według wynalazku zdolność wzmagania aktywności RAR aretinoidów można określić poprzez pomiar aktywności kombinacji związku według wynalazku z retinoidem o aktywności RAR ai standardowym teście skrinigowym o znanej zastosowalności do stanu chorobowego, co do którego wiadomo, że można go skutecznie leczyć wspomnianym retinoidem. Zmniejszenie stężenia retinoidu o aktywności RAR α potrzebnego do uzyskania konkretnego poziomu aktywności, albo zwiększenie aktywności retinoidu przy stałym stężeniu, wykaże wzmagającą aktywność związków według wynalazku, przy czym stężenie związku według wynalazku jest tego rodzaju, że związek ten, sam z siebie, nie przejawia żadnej aktywności, albo przejawia jąjedynie w stopniu nieznacznym.

I tak, na przykład, przedstawione poniżej wyniki dotyczące zdolności związków według wynalazku wzmagania aktywności retinoidów pod względem różnicowania komórek HL-60 (standardowy model białaczki ludzkiej) wykazują wzmagającą aktywność związków według wynalazku. Zdolność związków według wynalazku wzmagania aktywności retinoidów o aktywności RAR apod względem różnicowania komórek HL-60 można wykazać, zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładzie XVIII.

Oprócz tego, przedstawione poniżej wyniki dotyczące zdolności związków według wynalazku wzmagania aktywności retinoidów o aktywności RAR α ukierunkowanej na hamowanie aktywacji mysich komórek B (standardowy model immunosupresji) wykazują wzmagającą aktywność związków według wynalazku. Zdolność związków według wynalazku wzmagania aktywności retinoidów pod względem hamowania aktywacji mysich komórek B można wykazać stosując sposób postępowania opisany w przykładzie XIX.

Następnie, wyniki przedstawione poniżej, a odnoszące się do zdolności związków według wynalazku wzmagania aktywności retinoidów o aktywności RAR α pod względem hamowania wzrostu linii komórek raka sutka (model guza litego) wykazują wzmagaj ącą aktywność związków według wynalazku. Zdolność związków według wynalazku wzmagania aktywności retinoidów ukierunkowanej na hamowanie wzrostu linii komórek raka sutka można wykazać stosując sposób postępowania opisany w przykładzie XXI.

Związki według wynalazku można wytwarzać jakimkolwiek typowym sposobem. Korzystne sposoby wytwarzania przedstawione są na schematach 3 i 7.

184 625

Związki o wzorze 47, w którym R, i R2 razem oznaczają grupę C3-C6 alkilenową, można łatwo wytworzyć sposobem przedstawionym na schemacie 3 [R.M. Coates i in., J. Org. Chem., 47. 3597 (1982)]. I tak, cykliczny keton 8 (na przykład cyklopentanon lub cykloheksanon, itd.) poddaje się działaniu tribromku fosforu w środowisku dimetyloformamidu, w wyniku czego otrzymuje się bromoaldehyd 9 (Coates i in., wyżej), który, następnie, poddaje się sprzęganiu i soląfosfoniową 10, w wyniku czego otrzymuje się bromek winylu 11. Następnie tak otrzymany bromek winylu przekształca się w aldehyd 12 na drodze transmetylowania i reakcji z dimetyloformamidem. Gdyjuż dysponuje się tak otrzymanym nowym aldehydem, łatwo można wytworzyć końcowy związek 13 za pomocą sprzęgnięcia związku 12 z fosfonianem 5. Po przeprowadzeniu hydrolizu otrzymuje się pożądany kwas.

Na schemacie 7 przedstawiono korzystny sposób wytwarzania związku pośredniego 12 do wykorzystania go w ciągu reakcji uwidocznionych na schemacie 3, gdy Rji R2 razem oznaczają grupę C3-C6 alkilenową. I tak, keton 8 przekształca się w ester 36 z zastosowaniem metod znanych [na przykład: Org. Synthesis, Coll. Vol., 5,198 (1873)], po czym dokonuje się przekształcenia w enolofosforan 37. W wyniku usunięcia ugrupowania fosforanu przy użyciu dimetylomiedzianu [J. Org. Chem., 53,2984 (1988)] otrzymuje się następnie ester 38, który poddaje się reakcji z diizopropyloamidkiem litowym, po czym następuje addycja cyklocytralu 39 i w rezultacie otrzymuje się lakton 40 [Tet. Letters, 21,2509 (1980)]. Lakton 40 poddaje się obróbce z udziałem tertbutanolanu potasowego i po zadaniu produktu reakcj i j odkiem metylu otrzymuj e się ester 41. Ester ten poddaje się redukcji przy użyciu diizobutylohydrydoglinu, po czym dokonuje się utlenienia ditlenkiem manganu, w wyniku czego otrzymuje się aldehyd 12.

Wynalazek objaśniają następujące przykłady. W przykładach tych, zatężanie odbywa się przez odparowanie rozpuszczalnika w wyparce obrotowej, o temperaturze 40°C, pod ciśnieniem 36,6 hPa. Skrót HPLC odnosi się do chromatografii cieczowej wysokosprawnej, wykonywanej przy użyciu Water Prep 500 i ładunków krzemionki. Wszystkie związki pośrednie i związki końcowe charakteryzowano metodą spektroskopii H-NMR.

Przykład IV. Wytwarzanie kwasu (2E,4E)-3-metyko-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimetylo-1cykloheksen-1 -ylo)winylo)-1 -cykloheksenll-ylo--2,4-pentadienowego.

Zawiesinę 18 g chlorku ((2,666-trimetylo-1-cykloheksen-1-yka)metyk))trifenylofosfoniowego i 300 ml tetrahydrofuranu oziębiono do temperatury -60°C, po czym wkroplono do niej 32 ml 1,4 M roztworu n-butylolitu i heksanie i całość mieszano jeszcze w ciągu 10 minut. Do tak utworzonego zimnego roztworu dodano 8,5 g 2-bromocykloheksenu-1-karboaldehydu (o czystości 75% według oznaczenia metodąHNMR) w postaci roztworu i tetrahydrofuranie, po czym otrzymaną mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej, i następnie mieszano jeszcze w ciągu 2 godzin. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano heksan i utworzoną mieszaninę przemyto wodą w 50% wodnym metanolem, po czym osuszono siarczanem magnezowym. Rozpuszczalniki usunięto, w wyniku czego otrzymano 12,5 g surowego (E)-l-bromo-2l(2,6,6-trimetylo-1-cykloheksen-1lylo)winylo)cykloheksenu w postaci mieszaniny izomerów, którą użyto, jako taką, a następnym etapie procesu. Po przeprowadzonym w sposób typowy transmetalowaniu, a następnie reakcji z DMP, otrzymano 4,5 g surowego aldehydu, który rozpuszczono w 100 ml tetrahydrofuranu i poddano reakcji z użytym w nadmiarze fosfonianem (jak w przykładzie I), w wyniku czego otrzymano 3 g estru metylowego kwasu (2E,4E)-3lmetyl lo-5-(2-((E) 2-(2,6,6-trimetylo-1 -cykloneksen-1 -ylo)wmylo)- - -y^H^(^nels^^n11 -ylo--2,4-pentadienowego, w postaci oleju (po oczyszczeniu metodąHPLC przy użyciu układu 2,5% eter/heksan). Po przeprowadzeniu hydrolizy przy użyciu wodnego roztworu wodorotlenku potasowego i krystalizacji z mieszaniny heksanu i tetrahydrofuranu, otrzymano 1,6 g krystalicznego kwasu (2E,4E)-3lmetylo-5-(2-((E)-2 (2,6,6-trimetylo-1 -cykloheksen-1 -yk))winyk))-- -y^kk^hels^^n1 - -ylo) 2,4lpentadienkwego.

Przykład V. Wytwarzanie kwasu (2E,4E)-3-metylo-5-(2-((E)-2 (2,6,6-trimetylo-1cykloheksen-1 -ylojwinylo)-1 -ογΜορβ^εη-- -j^Io --2,4-pentadiekoweko.

Sposobem opisanym w przykładzie IV, 2-bromocyklkpenteno-1 -karboaldehyd przekształcono w ester etylowy kwasu (2E,4E0-3-metylo-5-(2l((E)-2l(2,6,6-trimetylo-1-cyklkheksen-1lylo)winy184 625 lo)-1-cyklopenten-1-ylo)-2,4-pentadienowego, w którego, po przeprowadzeniu hydrolizy z udziałem zasady, otrzymano kwas (2E,4E)-3-metylo-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimetylo-1-cykloheksen- 1 -ylo)winylo)-1 -cykiopenten- - -ylo--2,4-pentadicnowy.

Przykład VI. Wytwarzanie kwasu (2E,4E)-3-mety lo-5-(2-(-((1.)-2-(2,6,6-tri mety lo-1cykloheksen-1 -ylo)winylo-1 -ονΗοΙιερΙ-οη-1 -yIo--2,4-pentadieyoweoo.

Sposobem opisanym w przykładach IV i V, 1-bromocykloheptpno-2-karboaldehyd przekształcono w ester etylowy kwasu (2E,4E)-3-metylo-5-cyklohepten-1-ylo)-2,4-pentadieeOl wego, z którego, po przeprowadzeniu hydrolizy z udziałem zasady, otrzymano kwas (2E,4E) -3 -metylo-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimetylo-1 -cykloheksen-1 -yIo)winyIo) 1 y lylo) l2,4-peetadienoo^Γy.

Przykład VII. Wytwarzanie kwasu (2E,4E)-3-metylo-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimetylo-1l cykloheksen-1 -ylo)winylo)l 1 ^ΗοοΒεη- - -yIo1-2,4-pentadieyoweoo.

Sposobem opisanym w powyższych przykładach, 1-bromocyklookteeo-2-karboaldehyd przekształcono w ester etylowy kwasu (2E,4E)-3-metylo-5-(2l((E)-2l(2,4,6ltrimptylo-1-cykloheksee-1-ylo)winylo)-1-cyklookten-1lylo)-2,4lpeetadieeowego, z którego, po przeprowadzeniu hydrolizy z udziałem zasady, otrzymano kwas (2E,4E)-3lmetylOl5-(2l((E)-2,6,6-trimetylo-1 -cykloheksen-1 ^0^^^)- - -ckklo()kieίll 1 -ylo^ ,4-pentoPienowy.

Przykład XVIII. Pod wpływem retinoidów, komórki HL-60 (linia komórek ludzkiej białaczki szpikowej) różnicująsię do granulocytów. W tym różnicowaniu się komórek HI-60 do granulocytów pośredniczy RAR α dając w ten sposób podstawę zastosowania retinoidów do leczenia białaczki. Wyniki tego testu wykazują, że związki o aktywności selektywnej wobec RXR według wynalazku, stosowane w dawkach, w których same z siebie nie przejawiaaąaktywności, zdolne są do wzmagania (nawet w zakresie sięgającym rzędu wielkości) sprzyjającego różnicowaniu działania kwasu all-trans-retinojowego, oraz innego retinoidu o aktywności selektywnej wobec RAR α, o wzorze ogólnym55 (związekA). Zdolność poddawanych badaniu związków do transaktywacji receptorów retinoidów przedstawia się następująco:

Tabela 1

Związek	Aktywacja (ED50, nM)
RAR α	RXR α
Kwas all-traeSlretieojywy	6,7	41
Związek A	3	>10000
Związek z przykładu IV	>10000	1,7

Różnicowanie się komórek HL-60.

Indukowane retinoidami różnicowanie się komórek HL-60 badano mierząc ich potencjał wybuchu oddechowego poprzez redukcję NBT (błękit nitrotetrazolowy) [Pick i in,, J. Reticuloendythelial Soc., 30, 581 - 593 (1981)].

Komórki HL-60 utrzymywano w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodowego, 1% aminokwasów egzogennych, 50 jedn/nl penicyliny i 50 μ g/ml streptomycyny (= RPMI/PCS). Stwierdzono, że komórki nie zawierają mikoplazmy. Do płaskodennych dołków w płytce do mikromiareczkowania wysiano po 30000 komórek/100 μ/l RPMi/PCS. W tym samym czasie dodano po 10 μΐ roztworu retinoidów w pełnym podłożu, w wyniku czego uzyskano stężenia końcowe wynoszące od 10-¹ do 10- M (roztwory podstawowe w etanolu o stężeniu 10'² M przetrzymywano w temperaturze -20°C, chroniąc przed dostępem światła). Po upływie 3 dni usunięto podłoże przy użyciu pipety wielokanałowej i zastąpiono je 100 μl roztworu NBT (1 mg/ml w PBS z 200 nM tetradekanoilooctanu forbolu (PMA)). Po upływie dodatkowej godziny inkubacji w temperaturze 37°C usunięto roztwór NBT i wprowadzono 100 μΐ 10°% SDS i 0,01 N HCl. Ilość zredukowanego NBT skwantyfikowano fotometrycznie przy 540 nm, z użyciem zautymatyzowanego czytnika płytek. Obliczono wartość średnią dla 3 dołków. Błąd standardowy średniej mieścił się w zakresie od 5 do 10%.

184 625

Wyniki. Wpływ retinoidów o aktywności selektywnej wobec SXR na różnicowanie się komórek HL-60.

Zgodnie ze swąniewielką zdolnością działaniajako aktywator RAR α, retinoid o aktywności selektywnej wobec RXR i przykładu IV okazał się wyraźnie mniej aktywny, jako czynnik indukujący róż nicowanie się komórek HL-60, od kwasu all-trans-retinojowego (fig. 1). Rzeczywiście, związek z przykładu IV okazał się faktycznie nieczynny nawet w stężeniu 1 x 10'6 M, co dobrze się zgadza z jego właściwościami dotyczącymi transaktywacji. Komórki HL-60 wydają się być około 10 razy bardziej wrażliwe na działanie retinoidów od układu transaktywacji (porównaj tabela 1, RAR α i fig. 1).

Jednakże, jak można to zobaczyć na fig. fig. 2 i 3, retinoid o aktywności selektywnej wobec RXR z przykładu IV okazał zdolność wzmagania działania kwasu all-trans-retinojowego i związku A w stężeniach, w których sam z siebie nie był aktywny. Wzmożenie to było rzędu od 3 x do 10 x , co oznacza, że do osiągnięcia porównywalnego poziomu różnicowania się komórek HL-60 potrzeba użycia samego kwasu all-trans-retinojowego lub samego związku A w stężeniu od 3 do 10 x wyższym.

Z analizy otrzymanych wyników okazuje się, w sposób oczywisty, że efekty działania ligandów o aktywności selektywnej wobec RXR na różnicowanie się komórek HL-60 są większe niż tylko addytywne, a zatem nie można ich wytłumaczyć pozostałymi efektami aktywacji RAR. Zaobserwowane skutki działania są także nieco wyraź niej zaznaczone wtedy, gdy zastosowany zostanie raczej korzystny lgand RAR α (związek A) niż mniej selektywny (RAR vs. RXR) kwas all-trans-retinojowy (all-trans RA). To działanie wzmagającejest także zgodne z danymi otrzymanymi w eksperymentach przeprowadzonych in vitro, które pokazują, że RXR tworzy heterodimery z RAR, co prowadzi do spotęgowanej aktywności transkrypcyjnej na RAR-specyficznych sekwencjach promotorowych. W chwili obecnej nie jest jeszcze jasne, dlaczego dla zaistnienia tego rodzaju efektów potrzebne są względnie wysokie stężenia retinoidów o aktywności selektywnej wobec RXR (10-7 M). Stężenia te są o ponad dwa rzędy wielkości wyższe od wartości EC₅₀ stwierdzonej w teście aktywacji transkrypcji RXR, ale nie wiadomo, czy po utworzeniu się heterodimeru następują zmiany skłonności RxR do wiązania retinoidów. I tak, na przykład, wartości ED50, jak to pokazano w tabeli 1, mogą okazać się nie w pełni reprezentatywne, jeśli chodzi o skutki działania, w którym pośredniczą heterodimery z udziałem RXR.

Przykład XIX. Związek z przykładu IV poddano badaniu pod względemjego zdolności do hamowania proliferacji mysich komórek B przy łącznym zastosowaniu razem z all-trans RA. Ligand selektywny wobec rXr według wynalazku wzmagał aktywność polegającąna hamowaniu proliferacji mysich komórek B przez all-trans RA. Materiały i metody. Retinoidy. Właściwości retinoidów użytych i opisywanych tu badaniach, dotyczące wiązania się i transaktywacji, przedstawiono w następującej tabeli:

Tabela 2

Retinoid	Wiązanie RARIC ED50(nM)	Amywacja RAR ED50 (nM)	Wiązanie RXRIC50 (nM)	Aktywacja RXR ED50 (nM)
All-trans RA	14	6,7	>10000	41
Związek z przykładu IV	>10000	>10000	92	1,7

Testy komórkowe. Założono hodowlę zawiesinową pojedynczych komórek mysiej śledziony na płytkach do mikromiareczkowania o 96 płaskodennych dołkach, przy 0,2 ml/dołek i 2 x 10⁵ komórek/ml, w podłożu IMDM uzupełnionym 10% surowicy płodowej cielęcej, HEPES, antybiotykami i 50 pM 2-merkaptoetanolu. Wprowadzono 50 pg/ml mitogenu specyficznego względem komórek B, liposacharydu zE. coli (DIFCO) (LPS). Hodowle inkubowano w temperaturze 37°C w nawilgacanej atmosferze, przy 5% CO₂.

Wpierw, retinoidy przeznaczone do badania zmiareczkowano w trzech powtórzeniach od 10 nM do 10 pM i dalszych oznaczeń poniechano w całym okresie hodowli. Następnie, zmiarecz184 625 kowano też związki aktywne, do osiągnięcia wartości IC50. Jako związku porównawczego użyto cyklosporyny i (Sandoz AG) (od 1 nM do (JM).

Po upływie 2, 3 i 4 dni hodowli, komórki oznakowano impulsowo przy użyciu [³H]-tymidyny (1 pCi/dołek, w ciągu 4 godzin). Następnie hodowle zebrano na filtry z włókna szklanego i dokonano pomiaru radioaktywności włączonej do DNA, przy użyciu cieczowego licznika scyntylacyjnego β (Betaplate, Wallac Oy, Turku, Finlandia)

Otrzymane wyniki wyrażono jako % odpowiedzi hodowli nie poddanych tego rodzaju obróbce. Indukowaną mitogenem proliferację komórek mierzono jako włączenie ³H-tymidyny po upływie 24,48 i 72 godzin hodowli. Retinoidy wprowadzano do hodowli na początku okresu hodowli.

Wyniki.

1. Wpływ ligandów o aktywności selektywnej wobec RXR na proliferację mysich komórek B.

Ligand o aktywności selektywnej wobec RXR z przykładu IV poddano badaniu wpierw pod względem bezpośredniego zakłócania indukowanej LPS proliferacji mysich komórek B. Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 4. Wykaaająone, że retinoid z przykładu IV działa i sposób hamujący, a IC50 wynosi 100 nM. Ta jego moc stanowi L/100 mocy all-trans RA (IC5₀= 1 nM). W dniu 4, retinoid z przykładu IV w niskich dawkach (w przybliżeniu równych IC50 w dniu 3) nieznacznie wzmaga odpowiedź, co jest zgodne z wynikami otrzymanymi dla wszystkich retinoidów przejawiających aktywność w tym układzie.

2. Ligandy o aktywności selektywnej wobec RXR wzmagają hamujące działanie kwasu all-trans-retinojowego na proliferację mysich komórek B.

All-trans RA hamuje indukowaną LPS proliferację mysich komórek B przy IC50 = 1 nM. Zahamowanie maksymalne uzyskuje się przy 10-30 nM i nigdy nie przekracza ono 75-80 %o. Ligand o aktywności selektywnej wobec RXR i przykładu IV według wynalazku dawkowano do hodowli stymulowanych LPS, eksponowanych na 1 nM all-trans RA. Równolegle założono hodowle eksponowane na 10 nM all trans RA. We wszystkich przypadkach, ligand RXR z przykładu IV według wynalazku w stężeniach, w których sam z siebie wywierał zaledwie nieznaczne działanie hamujące, powodował nasilenia wpływu 1 nM RA do poziomu obserwowanego w przypadku 10 nM RA. Podobne wyniki otrzymano w 2 i 3 dniu hodowli. Dane dla dnia 3 są pokazane na fig. 5.

Biorąc pod uwagę aktywność związku z przykładu IV, możliwyjest tu efekt addytywny lub wzmagający. Wyniki otrzymane w późniejszych momentach hodowli wskazują, jednakże, na to, że efekt działania nie jest po prostu addytywny, ale raczej polega na wzmożeniu odpowiedzi.

W dniu 4,1 nM RA nie działajuż dłużej hamująco i w rzeczywistości wywołuje niewielkie wzmożenie odpowiedzi, podczas gdy poziom hamowania 10 nM RA wynosi tylko około 30%. Przyczyna tego zjawiska nie jest znana, ale może tu odgrywać rolę okres półtrwania związku. Ligand o aktywności selektywnej wobec RXR również wywiera podobny wpływ (patrz krzywa na fig. 4). Jednakże, kombinacja 1 nM RA i ligandu RXR z przykładu IV według wynalazku wciąż daje w wyniku zahamowanie rzędu osiąganego przy 10 nM RA. Otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 6.

Powyższe wyniki wykazują, że retinoid o aktywności selektywnej wobec RXR (z przykładu IV) wzmaga działanie all-trans RA w układzie czynnościowym, w którym w czynności retinoidu pośredniczy RAR α Wzmożenie takie uzyskuje się przy 10 - 30-krotnym nadmiarze ligandu RXR w stosunku do poziomu all-trans RA. Wielkość tego wzmożenia jest w przybliżeniu 10-krotna: poziom zahamowania osiągany zazwyczaj działaniem 10 nM RA uzyskuje się tu przy 1 nM RA w kombinacji z ligandem RXR według wynalazku.

Przykład XX. Następujące oznaczenia, wykonane z zastosowaniem typowych metod badania aktywności przeciwtrądzikowej, wykazują przeciwtrądzikową aktywność związków według wynalazku.

(1) Aktywność antyproliferacyjna wobec ludzkich komórek łojowych.

Metody. Komórki łojowe wyodrębniono z gruczołów łojowych osób dorosłych z zastosowaniem kombinacji metod enzymatycznych i mechanicznych (Doran i in., 1991). Komórki hodowano

184 625 w podłożu Iscove’a, zawierającym 10% surowicy płodowej cielęcej i 4 pg/ml deksametazonu, na warstwie mysich fibroblastów 3T3 o zatrzymanym wzroście. Komórki wprowadzono do podłoża bez związku poddawanego badaniu, po czym związek ten wprowadzono, w świeżym podłożu, po upływie 24-48 godzin od zapoczątkowania hodowli. Świeże podłoże, z zawartością związku poddawanego badaniu, wprowadzano do hodowli co 48 godzin. W dniu zebrania komórek, hodowle opłukano 0,03% EDTA w PBS w celu usunięcia samych tylko fibroblastów 3T3, po czym inkubowano w mieszaninie 0,05% trypsyna/0,03% EDTA. Następnie sporządzono zawiesinę komórek i energicznie ją wymieszano, aby powstała zawiesina pojedynczych komórek, po czym je policzono przy użyciu hemocytometru.

Roztwory podstawowe omawianych związków sporządzono jako 10- M roztwory w 100% DMSO i przechowywano je w temperaturze -20° C bez dostępu światła. Związki te, w roztworze, doprowadzano do temperatury pokojowej i stosowano przez rozcieńczenie bezpośrednio w pełnym podłożu do uzyskania właściwego stężenia.

Związki poddawano badaniu pod względem hamowania proliferacji komórek łojowych in vitro przy stężeniu 1(0-’M i 10⁷M.

Związki z przykładu IV badano pod względem ich działania w sensie hamowania proliferacji ludzkich komórek łoj owych pierwszego pasażu in vitro po upływie 10 dni ekspozycj i na lek. Otrzymane wyniki podane sąjako stężenie (w nM) potrzebne do zahamowania wzrostu o 50% (IC₅₀).

Tabela 3

Hamowanie proliferacji ludzkich komórek łojowych in vitro

Związek	IC50(nM)
Związek z przykładu IV	>1000 (badano dwukrotnie)
Kwas 13-cis-retinojowy	100
Kwas 9-cis-retinojowy	100

W przypadku związku z przykładu IV otrzymano mamy przebieg krzywej dawka-odpowiedź, przy supresji wzrostu sięgającej 30 - 40%. Aczkolwiek wynik taki jest o wiele gorszy od uzyskanego dla kwasu 13-cis-retinojowego, wciąż jeszcze wskazuje on na aktywność biologiczną związku in vitro.

(2) Aktywność dotycząca zmniejszania rozmiarów łagiewek myszy Rhino.

W modelu tym, związki poddaje się badaniu pod względem ich zdolności zmniejszania rozmiarów istniejących uprzednio łagiewek, skeratynizowanych struktur będących przywłosowymi gruczołami łojowymi, przypominających ludzkie zaskómiki (Mezick i in, 1985).

Metoda. Użyto myszy samic Rhino (hr^rh hr^rl1), w wieku od 6 do 8 tygodni, otrzymanych z Jackson Laboratories, które podzielono na grupy po 6 sztuk. Przeznaczone do badania związki rozpuszczono w 100% acetonie i przez cały czas trwania eksperymentu przechowywano w temperaturze 4°C w atmosferze azotu. Związki badane nanoszono na grzbiety myszy co dzień, przez 5 dni w ciągu 3 kolejnych tygodni. Następnego dnia po zaaplikowaniu ostatniej dawki myszy uśmiercono zmuszając do wdychania CO2. Następnie wycięto z grzbietu każdej myszy płat skóry i inkubowano go w 2 M roztworze bromku scu^d^vw<oj^<^o w ciągu 2-3 godzin, w temperaturze pokojowej. Następnie oddzielono naskórek od skóry właściwej. Następnie naskórek poddano odwadnianiu w stopniowanych stężeniach etanolu 70%, 80%, 95% i 100% oraz w ksylenie. Próbki przetrzymywano w każdym z powyższych roztworów w ciągu 2 godzin. Próbki skóry wyjęto z ksylenu i umieszczono na mikroskopowym szkiełku przedmiotowym. Do oznaczenia średnicy średniej oraz powierzchni łagiewek wykorzystano analizę obrazu, z zastosowaniem oprogramowania Ultimage image analysis. Zbadano mniej więcej po 5 pól najednąpróbkę, przy zmierzeniu średnio 150 łagiewek na jedną mysz.

Wyniki. Badaniu na myszach Rhino, przy podawaniu miejscowym, poddano związek według wynalazku z przykładu IV.

184 625

Myszom podawano miejscowo 100 gl dawki kwasu 13-cis-retinojowego, kwasu 9-cis-retionojowego oraz związku z przykładu IV w postaci roztworu acetonowego. Otrzymane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4.

Tabela 4

Związek	Dawka (gg/dzień)	Wielkość łagiewki (gm2/łagiewkę)	Zmiana w stosunku do kontroli (%)
Vehiculum		9750 ±508	—
13-cisRA	0,1	9187 ±794	-6“
	1	6400 ±424	-34
	10	3793 ±368	-1
	100	3132 ±305	-68
9-cisRA	0,1	8650 ± 427	-11
	1	6926 ± 497	-29
	10	3540 ± 354	-64
	100	2644 ±312	-73
Związek z przykładu IV	0,1	9843 ± 565	+ lns
	1	9491 ±507	^ns
	10	8951 ±964	-8“
	100	5916 ±992	-39

W powyższej tabeli 4 użyto następującego oznaczenia skrótowego:

^ns = statystycznie nieistotna w stosunku do kontroli; wszystkie inne wartości p <0,05.

Uwagi:

Podczas trwania tego eksperymentu zaobserwowano szereg działań ubocznych. Zwierzęta potraktowane 100 gg dawką kwasu 13-cis-retinojowego przejawiły w dniu 5 złuszczanie się i powstawanie rumienia. Te same objawy, ale o jeden dzień wcześniej, zanotowano u zwierząt potraktowanych taką samą dawką kwasu 9-cis-retinojowego.

W dniu 7 dawkowania leku, przy 100 gg dawkach związku z przykładu IV, nie zanotowano powstawania dostrzegalnego rumienia.

Gdyby omawiane związki uszeregować, przy stężeniu 100 gg, zgodnie z nasileniem objawów złuszczania się/rumienia od stanu najbardziej poważnego do najmniej poważnego, wtedy kolejność ta byłaby następująca : 9-cis RA, 13-cis RA, i związek z przykładu IV. Tak więc, związki według wynalazku wywoływały podrażnienie mniejsze niż powodowane przez porównawcze związki 9-cis RA i 13-cis RA.

(3) In vivo wpływ związków według wynalazku na wielkość gruczołów łojowych złocistego chomika syryjskiego.

Metody. Złocistym chomikom syryjskim Charles River, samcom, podawano wskazane dawki badanych związków w postaci roztworów acetonowych. Związki przechowywano w temperaturze 4°C, bez dostępu światła. Co tydzień sporządzano świeże roztwory.

Dawki badanych związków podawano chomikom co dzień, przez 5 dni, po czym następowały 2 dni odpoczynku i dawkowanie kontynuowano znów przez 5 dni i w ten sposób postępowano, aż do podania ogółem 20 dawek. Objętość roztworu wynosiła 50 gl/ucho.

Chomiki uśmiercono zmuszając je do wdychania CO₂, po czym pobrano uszy w celu dokonania oceny histologicznej. Po pobraniu ucha, oddzielono powierzchnię brzuszną od reszty ucha i wysztancowano 2 mm skrawki, wycięte w odległości 5 mm od końca ucha. Wycinki te poddano barwieniu przy użyciu 0,1% Sudan Black B w postaci roztworu w 100% glikolu propylenowym, przez noc. Po odbarwieniu, skwantyfikowano wielkość gruczołów łojowych przy użyciu urządzenia Donsanto Image Analysis System.

184 625

Dane wyrażono jako średnią powierzchnię 80 - 120 gruczołów łojowych/dawkę, jako % wycinków kontrolnych (potraktowanych jedynie rozpuszczalnikiem).

Tabela 5

Wpływ 4-tygodeiowego stosowania miejscowego związku z przykładu IV i kwasu n-cis-retinojowego na wielkość gruczołu łojowego ucha chomika

Związek	Dawka (ąg/dzień)	Wielkość gruczołu łojowego	Zmiana w stosunku do kontroli (%)
Vehiculum	—	16475± 1708	—
13-cis RA	1	14029 ±2977	-15-
	10	12965 ±2029	-21
	100	10459± 1302	-37
Związekz przykładuIV	1	13237± 1491	-20
	10	17046 ±4667	+3ns
	100	13043 ±1577	-21

W powyższej tabeli 5 użyto następującego oznaczenia skrótowego :

= statystycznie nieistotna w stosunku do kontroli; wszystkie inne wartości istotne w stosunku do kontroli z vehiculum. Odnośniki literaturowe: Doran i in., „Characterization of human sebaceous cells in vitro, J. Invest. Dermatol., 96, 341 -348 (1991); Mezicki in., „Topical and systemie effects of retinoids on horn-filled utriculus size in the rhino mouse. A model to quantify „antykeratinizing” effects of retinoids”, J. Invest. Dermatol.. 83, 110 - 113 (1985).

Przykład XXI. Badaniu poddano związek z przykładu VI pod względem jego zdolności hamowania rozwoju linii komórek ludzkiego raka sutka w łącznym działaniu z retinoidem o aktywności RAR α, a mianowicie kwasem all-F-3,7-dimetylo-9-[(2-metoksy-4-metylo 6-oktyloksy)fenylo]-2,4,6,8-nonatetraenowym (związek B) o wzorze 56.

Otrzymane wyniki wykazały, że ligand o aktywności selektywnej wobec RXR według wynalazku wzmagał aktywność związku B polegającą na hamowaniu rozwoju guza litego.

1. Synteza związku B. Związek B wytworzono z zastosowaniem sposobu postępownia przedstawionego na schemacie 10.

Roztwór 50,4 g kwasu 2,6-dihydroksy-4-metylobeezoesowego 57 w 750 ml acetonu zadano 100 ml jodku metylu i po dodaniu 124,2 g węglanu potasowego całość ogrzewano pod chłodnicązwrotnąw ciągu 18 godzin. Następnie mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i odsączono substancje stałe. Roztwór zatężono, w wyniku czego otrzymano produkt surowy, który rozpuszczono w octanie etylu. Otrzymany roztwór przemyto 1N, zimnym, wodnym roztworem wodorotlenku sodowego, po czym usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 54 g estru metylowego kwasu 2,6-dimetoksy-4-mptylobpnzopsowpgo 58.52,5 g powyższego związku rozpuszczono w 1000 ml dichlorometanu oziębionego do temperatury -70° C, po czym do otrzymanego tak roztworu dodano roztwór trichlorku boru w tym samym rozpuszczalniku, użyty w ilości 180 ml, o stężeniu 29,3 g/100 ml. Otrzymaną mieszaninę ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano jeszcze w ciągu 45 minut, po czym wylano na lód. Warstwę organiczną od dzielono, przemyto większą ilością wody, osuszono siarczanem magnezowym, przesączono i zatężono. Otrzymaną pozostałość poddano oczyszczaniu metodą preparatywnej chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC) przy użyciu chromatografu Waters prep. 500 (z zastosowaniem do elucji układu 7 % octan etylu/heksan), w wyniku czego otrzymano 28,3 g czystego estru metylowego kwasu 1-hydroksy-6-metoksy-4-metylobenzoesowego 59 w postaci ciała stałego. Sporządzono roztwór 35 g tego związku i 700 ml ketonu etylowo-metylowego zawierającego 27,1 g węglanu potasowego, po czym dodano do niego 34,2 g jodku oktylu i całość ogrzewano pod chłodnicązwrotnąw ciągu 20 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną oziębiono i odsączono substancje stałe, a przesącz zatężono, a następnie ponownie rozpuszczono, w mie184 625 szaninie heksanu i octanu etylu. Następnie otrzymany roztwór przemyto wodnym roztworem zasady (1 N roztworem wodorotlenku sodowego) i wodą, po czym osuszono siarczanem magnezowym i zatężono do sucha. Pozostałość poddano oczyszczaniu metodą HPLC, jak wyżej, i wyniku czego otrzymano 51,8 g czystego estru metylowego kwasu 2-metoksy-6-oktyloksy'4-metylobenzoesowego 60. Sporządzono roztwór 51,8 g tego związku w 500 ml toluenu i po oziębieniu go do temperatury -60° C dodano do niego 281 ml 25% roztworu diizobutylohydrydoglinu i heksanie, po czym całość ogrzano do temperatury pokojowej. Następnie, do mieszaniny reakcyjnej ostrożnie dodano 100 ml mieszaniny wody i metanolu 1 : 1 przy oziębianiu tak prowadzonym, aby utrzymać temperaturę 20° C. Następnie dodano 500 ml heksanu i siarczan magnezowy. Po odsączeniu substancji stałych, rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano surowy alkohol 61. Sporządzono roztwór 47 g tego związku i 500 ml acetonitrylu zawierającego 54,9 g bromowodorku trifenylofosfoniowego i ogrzewano go pod chłodnicą zwrotną w ciągu 22 godzin. Następnie rozpuszczalniki usunię to pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymaną surową sól 62 wysuszono w temperaturze pokojowej pod ά/ηίοηίοηι 0,13 hPa. (Związek ten można przekrystalizować z tetrahydrofuranu, w wyniku czego otrzyma się czysty bromek [(2-metoksy-6-oktylo!ksy-4-metylo)fenylo] metylotrifenylofosfoniowy). Następnie otrzymaaąjak wyżej sól 62 można przekształcić (z udziałem związku o wzorze 63) w kwas all-E-yó-dimetylo^-^-metoksy-4-metylo-oktyloksy)fenylo] 2,4,6,8-nonatetraenowy, czyli związek B o wzorze 64 (odpowiadającym wzorowi 56, powyżej), sposobem opisanym w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4894480 (przykład 5).

2. Przeprowadzenie testu. Badania nad wiązaniem i transaktywacją.retinoidów przeprowadzono z udziałem związku B oraz związku z przykładu VI, jak powyżej opisano. Otrzymane wyniki zamieszczono w poniższej tabeli VI.

T a b e l a VI

Związek	Aktywacja	Wiązanie
RAR EC5<>(nm) % max	RXR EC5o(nM) % max	RAR IC50 (nM) %		RXR IC50 (nM)
B	μ	11	114	Przy 1000 0	240	- -
	β	5,3	82		500	- -
	γ	przy 1000	48		>10000	<20
Związek	α	przy 1000	4	1,4 - - - -	>10000	24		110
z przykładu VT	β	przy 1000	8		>10000	9		- -
	γ	przy 100	9		>10000	245		150

Hodowlę linii komórek raka sutka, T47-D, otrzymanej z ATCC (nr rejestracyjny HTB133) prowadzono w podłożu RPMI1640 uzupełnionym 10% FBS, 10 pg/ml insuliny i 13 ng/ml gentamycyny. Inkubacja odbywała się w temperaturze 37°C przy 4,5% CO₂ i 95,5% powietrza nawilżanego. Komórki zebrano po osiągnięciu 70 - 80% zlania się i speletyzowano. Komórki ponownie zawieszono w podłożu i wysiano (po 150 pl/dołek) na 96-dołkowe płytki (Corning) przy gęstości pozwalającej osiągnąć liniowy wzrost w ciągu 7 dni trwania testu (co oznacza, że komórki T47-B wysiano w ilości 4 x 10³ komórek/dołek). Płytki umieszczono w inkubatorze, w temperaturze 37°C, na noc.

Po upływie 18-24 godzin od posiania, wprowadzono leki (1 mM roztwór podstawowy i 100% DMSO). Kombinacje leków sporządzono na osobnych 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania i ręcznie naniesiono na płytki testowe. Testy MTT przeprowadzono w dniach 3 - 7 od wprowadzenia leków. Test MTT jest to test oparty na za stosowaniu związku tetrazoliowego, w przypadku którego dokonuje się pomiaru żywotności komórek w hodowli. Roztwór podstawowy Mtt (a więc roztwór bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego

184 625 w 1x PBS o stężeniu 5 mg/ml) wprowadzono na płytki w ilości po 50 pl/dołek, po czym płytki te inkubowano w ciągu 2,5 godziny w temperaturze 37°C.

Następnie usunięto płyn za pomocąodessania, po czym wprowadzono po 50 pl 95% etanolu i płytki poddano wstrząsaniu na wstrząsarce Mini-Orbital Shaker (Bellco) w ciągu 15 minut, w celu solubilizacji utworzonego formazanu. Gęstość optyczną, dla każdego dołka, mierzono przy użyciu zautomatyzowanego czytnika płytek (spektrofotometr Microplate EL320 Reader, Bio-Tek Instruments) pracującego przy testowej długości fali 570 nm i porównawczej długości fali 660 nm. Procent zahamowania wzrostu komórek, spowodowanego przez związek B w rozmaitych stężeniach we współdziałaniu ze związkiem z przykładu VI w stałym stężeniu, oznaczano według następującego równania:

% zachamowania =

OD 5₇₀ (bez leku) - OD 5₇₀ (z lekiem) θθ

OD₅₇₀(bez leku)

Otrzymane wyniki przedstawiono graficznie na fig. 7. Wyniki te wykazują, że związek o aktywności selektywnej wobec RXR według wynalazku wzmaga aktywność retinoidu o aktywności RAR α jeśli chodzi o zahamowanie wzrostu linii komórek guza litego.

Przykład XXII. Wytwarzanie kapsułek żelatynowych twardych zawierających 20 mg substancji aktywnej.

Skład kapsułek Jedna kapsułka zawiera:

Związek o wzorze 47 20,0 mg

Retinoid RAR α 20,0 mg

Żelatyna Bloom 30 70,0 mg

Maltodekstryna MD 05 108,0 mg dl- α Tokoferol 2,0 mg

Askorbinian sodowy 10,0 mg

Celuloza mikrokrystaliczna 48,0 mg

Stearynian magnezowy 2,0 mg (ciężar zawartości kapsułki 280,0 mg

Sposób postępowania

Substancje aktywne poddaje się mieleniu na mokro, w roztworze zawierającym żelatynę, maltodekstrynę, dl-«-tokoferol i askorbinian sodowy, po czym otrzymaną w wyniku mielenia na mokro zawiesinę suszy się metodą rozpyłową i otrzymany proszek miesza z celulozą mikrokrystalicznąi stearynianem magnezowym. Tak otrzymaną mieszaniną napełnia się, po 280 mg, kapsułki żelatywnowe twarde o odpowiedniej wielkości i kolorze.

Opis figur.

Figura 1. Indukcja różnicowania się komórek HL-60 z udziałem kwasu all-trans-retinojowego (all-trans RA), innego retinoidu o aktywności selektywnej wobec RAR α (związek A, jak w niniejszym opisie) oraz związku o aktywności selektywnej wobec RXR z przykładu IV (jak w niniejszym opisie).

Podpis pod figurą. Indukcja różnicowania się komórek HL-60 z udziałem all-trans RA, związku A, retionoidu o aktywności selektywnej wobec RAR α, oraz związku z przykładu IV, retionoidu o aktywności selektywnej wobec RXR. Wartość OD54₀ jest proporcjonalna do liczby zróżnicowancyh komórek HL-60.

Figura 2. Indukcja różnicowania się komórek HL-60 z udziałem kombinacji kwasu alltrans-retinojowego (all-trans RA) i związku z przykładu IV.

Podpis pod figurą. Indukcja różnicowania się komórek HL-60 z udziałem kombinacji alltrans RA i związku z przykładu IV, retinoidu o aktywności selektywnej wobec RXR.

Podpis pod figurą: kombinacja all-trans RA i retinoidu o aktywności selektywnej wobec

RXR.

184 625

Figura 3. Indukcja różnicowania się komórek HL-60 z udziałem kombinacji związku A i związku zprzykładu IV.

Podpis pod figurą. Indukcja różnicowania się komórek HL-60 z udziałem kombinacji związku A i związku z przykładu IV, retinoidu o aktywności selektywnej wobec RXR.

Podpis nad figurą: kombinacja związku A i retinoidu o aktywności selektywnej wobec

RXR.

Figura 4. Włączenie tymidyny przez hodowle komórek B eksponowanych na all-trans RA lub związek z przykładu IV.

Podpis pod figurą. Włączenie tymidyny przez hodowle eksponowane na all-trans RA lub związek z przykładu IV, retinoid o aktywności selektywnej wobec RXR. Wartości podano w stosunku do hodowli nie poddanych działaniu związków.

Figura 5. Zahamowanie indukowanej LPS proliferacji komórek B przez all-trans RA i związek z przykładu IV, same lub w kombinacji, w dniu 3 hodowli.

Podpis pod figurą. Zahamowanie indukowanej LPS proliferacji komórek B przez kwas retinojowy (RA) i związek z przykładu IV, retinoid o aktywności selektywnej wobec RXR, same lub w kombinacji. Wyniki odnoszą się do dnia 3 hodowli.

Figura 6. Zahamowanie indukowanej LPS proliferacji komórek B przez all-trans RA i związek i przykładu IV, same lub w kombinacji, w dniu 4 hodowli.

Podpis pod figurą. Zahamowanie indukowanej LPS proliferacji komórek B przez kwas retinojowy (RA) i związek z przykładu IV, retinoid o aktywności selektywnej wobec RXR, same lub w kombinacji. Wyniki odnoszą się do dnia 4 hodowli.

Figura 7. Wzmożona antyproliferacyjna aktywność związku o aktywności RAR α (związek B) i związku o aktywności selektywnej wobec rXr (związek z przykładu VI) w stosunku do linii komórek raka sutka.

Claims (5)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Nowa pochodna kwasu nonatetraenowego o wzorze 47, w którym wiązanie C₇-C₈ jest wiązaniem podwójnym, zaś R, iR₂ razem oznaczają grupę C<-C₆ alkilenową, oraz jej farmaceutycznie dozwolone sole i estry.
2. 2. Pochodna według zastrz. 1, wybrana z grupy obejmującej: kwas (2E,4E)-3-metylo-5-(2-(('E)-2-(2,6,6-trimet ylo-1 -cykloheksen-1 -ylo)winylo)-1 -c yklo penten- - -ylo)-2,4-penta dienowy. k\vas(2E,4E)-3-metylo-5-(2-(2-((E)-2-(2,6,6-trinuaylo-1-cykloheksen-1-ylo)winylo) -1 -cykloheksen-1 -ylo--2,4-pentadeenvwy, kwas (2E,4E)-3-metylo-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimetylo-1-cykloheksen-1-ylo)winylo)-1-cyklohepten-1-ylo)-2,4-pentadienowyikwas (2E,4E)-3-metylo-5-(2-((E)-2-(2,6,6-trimetylo-1-cyklo-heksen-1 -ylo)winylo)-1 -cykoookeen- l-ylo)-2,4-pentadienvwy.
3. 3. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dozwolony obojętny nośnik, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera pochodną kwasu nonatetraenowego o wzorze 47, w którym wiązanie C7-C₈ jest wiązaniem podwójnym, zaś R] i R2 razem oznaczają grupę C₃-C₆ alkilenową, lub jej farmaceutycznie dozwoloną sól lub ester.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że w przypadku stosowania do podawania miejscowego zawiera wspomnianą pochodną w ilości wynoszącej od około 0,05% do około 3% wag. w stosunku do całkowitego ciężaru kompozycji.
5. 5. Kompozycja farmaceutyczna w postaci dawki jednostkowej przeznaczona do podawania doustnego, znamienna tym, że zawiera pierwszy związek wybrany z grupy obejmującej kwas all-transretinojowy, kwas ę-cis-retinojowy i kwas 13-cis-retinojowy; oraz drugi związek będący pochodnąkwasu eoeatetraeeowego o wzorze 47, w którym wiązanie C7-C8jest wiązaniem podwójnym, zaś Rj i 1% razem oznaczają grupę C₃-C₆ alkilenową, lub jego farmaceutycznie dozwolone sole lub estry, przy czym wspomniany pierwszy związek jest obecny we wspomnianej postaci dawki jednostkowej w ilości wynoszącej od 10 do 50 mg, a wspomniany drugi związek obecny jest we wspomnianej postaci dawki jednostkowej w ilości od 1 do 10 razy większej od ilości wspomnianego pierwszego związku.