PL184839B1 - Szczepionka DNA i zastosowanie polinukleotydu do jej wytwarzania - Google Patents

Abstract

1. Szczepionka DNA, zawierajaca polinukleotyd do immunizacji i dopuszczalny farmaceutycznie nosnik, która wywoluje po wprowadzeniu do tkanki kregowca jedna lub wiele odpowiedzi odpornosciowych przeciwko Mykobakteriom, wybranych z grupy obej- mujacej przeciwciala, CTL, odpowiedz limfocytów T pomocniczych i ochronnych odpo- wiedzi odpornosciowych, znam ienna tym , ze polinukleotyd obejmuje jeden lub wiele genów kodujacych jeden lub wiele bialek Mykobakterii albo ich funkcjonalnych równo- wazników, z grupy obejmujacej antygen 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne rów- nowazniki, polaczonych funkcjonalnie z promotorami transkrypcyjnymi. 4. Zastosowanie polinukleotydu obejmujacego jeden lub wiele genów kodujacych jeden lub wiele bialek Mykobakterii albo ich funkcjonalnych równowazników, z grupy antygenu 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równowazniki, polaczonych funkcjo- nalnie z promotorami transkrypcyjnymi, do wytwarzania szczepionki do wywolania od- powiedzi odpornosciowej u kregowca przeciwko epitopom M ykobakterii. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka DNA do wywoływania reakcji odpornościowej przeciwko Mykobakteriom w organizmie kręgowca, zawierająca polinukleotyd kodujący białka Mykobakterii oraz nośnik dopuszczalny farmaceutycznie.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polinukleotydu do wytwarzania szczepionki DNA.

Główną przeszkodą w opracowaniu szczepionek przeciwko wirusom albo bakteriom, szczególnie tym o licznych serotypach albo wysokim tempie mutacji, przeciwko którym pożądane jest wywołanie przeciwciał neutralizujących i/lub ochronnej odpowiedzi komórkowej, jest zmienność białek zewnętrznych pomiędzy różnymi izolatami albo szczepami. Ponieważ limfocyty T cytotoksyczne (CTL) u myszy i ludzi są zdolne do rozpoznawania epitopów uzyskanych z zakonserwowanych wewnętrznych białek wirusowych (J.W. Yewdell i in. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 1785 (1985); A.R.M. Townsend i in. Cell 44, 959 (1986); A. J. McMichael i in., J. Gen. Virol. 67, 719 (1986); J. Bastin i in., J. Exp. Med. 165, 1508 (1987); A.R.M. Townsend i H. Bodmer, Annu. Rev. Immunol. 7, 601 (1989)) i uważa się je za istotne w odpowiedzi odpornościowej przeciwko wirusom (Y.-L. Lin i B.A. Askonas, J. Exp. Med. 154, 225 (1981);

I. Gardner i in., Eur. J. Immunol. 4, 68 (19740; K.L. Yap i G.L. Ada, Nature 273, 238 (1978); A. J. McMichael i in., New Engl. J. Med. 309, 13 (1983); P.M. Taylor i B.A. Askonas, Immunol. 58, 417 (1986)), wysiłki skierowano na opracowanie szczepionek CTL zdolnych do zapewnienia heterologicznej ochrony przeciwko różnym szczepom wirusa.

Wiadomo, że CTL niszczą komórki zakażone wirusem albo bakterią, gdy ich receptory limfocyta T rozpoznają obce peptydy związane z cząsteczkami MHC klasy I i/lub klasy II. Peptydy te mogą być otrzymane z białek syntetyzowanych endogennie, niezależnie od umiejscowienia i funkcji białka w patogenie. Przez rozpoznanie epitopów w zakonserwowanych białkach CTL mogą zapewnić ochronę heterologiczną. W przypadku bakterii wewnątrzkomórkowych, białka wydzielane albo uwalniane z bakterii ulegają opracowaniu i prezentacji przez cząsteczki MHC klasy I i II, wywołując w ten sposób odpowiedź limfocytów T, która może odgrywać rolę w redukcji albo eliminacji zakażenia.

W większości wysiłków w kierunku wytworzenia odpowiedzi CTL stosowano wektory replikujące w celu wytworzenia antygenu białkowego wewnątrz komórki (J.R. Bennink i in., ibid. 311, 578 (1984); J.R. Bennink i J.W. Yewdell, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 163, 153 (1990); C.K. Stover i in. Nature 351, 456 (1991); A. Aldovini i R.A. Young, Nature 351, 479 (1991); R. Schafer i in., J. Immunol. 149, 53 (1992); C.S. Hahn i in. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 2679 (1992)) albo skupiano się na wprowadzeniu peptydów do cytozolu (F.R. Carbone i M.J. Bevan, J. Exp. Med. 169, 603 (1989); K. Deres i in., Nature 342, 561 (1989); H. Takahashi i in., ibid. 344, 873 (1990); D.S. Collins i in., J. Immunol. 148, 3336 (1992);

M.J. Newman i in., ibid. 148, 2357 (1992)). Oba te podejścia mają ograniczenia, które mogą zmniejszać ich użyteczność jako szczepionki. Wektory retrowirusowe mają ograniczenia co do wielkości i budowy polipeptydów, które mogą być ekspresjonowane jako białka fuzyjne, przy zachowaniu zdolności rekombinowanych wirusów do replikacji (A.D. Miller, Cum Top. Microbiol. Immunol. 158, 1 (1992)), zaś skuteczność wektorów takich jak wirus krowianki w następnych szczepieniach może być osłabiona przez odpowiedź odpornościową przeciwko wirusowi krowianki (E.L. Cooney i in. Lancet 337, 567 (1991). Tak więc, wektory wirusowe i zmodyfikowane patogeny niosą związane ze sobą ryzyko, które może negatywnie wpływać na ich zastosowanie u ludzi (R.R. Redfield i in., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola i in., Arch. Intern. Med. 149, 1569 (1989)). Ponadto, wybór epitopów peptydowych do prezentacji zależy od budowy antygenów MHC osobnika i stąd szczepionki peptydowe mogą mieć ograniczoną skuteczność z powodu różnorodności haplotypów HLA w nie wsobnych populacjach.

Benvenisty N. i Reshef L. (PNAS 83, 9551-9555, (1986)) wykazali, że DNA precypitowany CaCb podawany myszom dootrzewnowo (i.p.), dożylnie (i.v.) albo domięśniowo (i.m.) może ulegać ekspresji. Wstrzyknięcie domięśniowe (i.m.) wektorów ekspresyjnych DNA u myszy powoduje, co wykazano, wychwyt DNA przez komórki mięśniowe i ekspresję białka kodowanego przez DNA (J.A. Wolff i in., Science 247, 1465 (1990);

184 839

G. Ascardi i in.(Nature 352, 815 (1991)). Wykazano, że plazmidy mogą być utrzymywane episomalnie i nie replikują. W następstwie, obserwowano ciągłą ekspresję po wstrzyknięciu i.m. do mięśni szkieletowych szczurów, ryb i naczelnych oraz mięśnia sercowego szczurów (H. Lin i in., Circulation 82, 2217, (1990); R.N. Kitsis i in. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 2217 (1991); E. Hansen i in., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao i in., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff i in., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)). Technikę zastosowania kwasu nukleinowego jako środka leczniczego opisano w WO 90/11092 (4 października 1990), w którym nagie polinukleotydy zastosowano do szczepienia kręgowców.

Ostatnio, opisano równorzędną rolę B7 i prezentacji epitopów przez główny układ zgodności tkankowej (MHC) na powierzchni komórek prezentujących antygen w aktywacji CTL w celu usuwania nowotworu (Edington, Biotechnology 11, 1117-1119, 1993). Gdy cząsteczka MHC na powierzchni komórki prezentującej antygen (APC) prezentuje epitop receptorowi łimfocyta T (TCR), B7 ekspresjonowana na powierzchni tej samej APC działa jako drugi sygnał przez wiązanie CTLA-4 albo CD28. Wynikiem jest gwałtowny podział limfocytów T pomocniczych CD4+, które pobudzają limfocyty T CD8+ do proliferacji i niszczenia APC.

Do powodzenia sposobu nie jest konieczne aby immunizacja była domięśniowa. Tak więc. Tang i in., (Nature, 356, 152-154 (1992)) opisuje, że wprowadzenie mikropocisków ze złota opłaszczonych DNA kodującym bydlęcy hormon wzrostu (BGH) do skóry myszy powoduje wytwarzanie przeciwciał przeciwko BGH przez myszy. Furth i in., (Analytical Biochemistry, 205, 356-368 (1992)) opisuje, że można zastosować urządzenie ,jet injector” w celu transfekcji skóry, mięśni, tkanki tłuszczowej i sutka żywych zwierząt. Różne sposoby wprowadzania kwasów nukleinowych zostały ostatnio opisane (Friedman T. Science, 244, 1275-1281 (1989)). Patrz również, Robinson i in., (Abstracts of Papers Presented at the 1992 meeting on Modem Approaches to New Vaccines, Including prevention of Aids, Cold Spring Harbor, str·. 92; Vaccine 11, 957 (1993)) gdzie udowodniono, że podawanie i.m., i.p. i i.v. DNA grypy ptasiej kurczętom zapewniało ochronę przed letalną ekspozycją. Dożylne wstrzyknięcie kompleksu DNA:liposomy kationowe myszom opisano w Zhu i in., (Science 261, 209-211 (1993); patrz również WO 93/24640, 9 grudnia 1993) w celu wywołania uogólnionej ekspresji klonowanego transgenu. Ostatnio, Ulmer i in., (Science 259, 1745-1749 (1993)) opisał ochronę heterologiczną przed zakażeniem wirusem grypy, przez wstrzyknięcie DNA kodującego białka wirusa grypy.

Wang i in., (PNAS USA 90, 4156-4160 (1993)) opisał wywołanie odpowiedzi odpornościowej przeciwko HIV u myszy, przez szczepienie domięśniowe klonowanym, genomowym (nie składanym) genem HIV. Jednakże, poziom uzyskanej odpowiedzi odpornościowej był bardzo niski, zaś układ wykorzystywał części promotora długich końcowych powtórzeń (LTR) mysiego wirusa guza sutka (MMTV) oraz części promotora i terminatora małpiego wirusa 40 (SV40). SV40 jak wiadomo transformuje komórki, prawdopodobnie przez integrację z komórkowym DNA gospodarza. Tak więc, układ opisany przez Wang i in., jest całkowicie nieodpowiedni do podawania ludziom, co stanowi jeden z przedmiotów niniejszego wynalazku.

WO 93/17706 opisuje sposób szczepienia zwierząt przeciwko wirusowi, w którym cząstki nośnika opłaszczono konstruktem genowym zaś, opłaszczone cząstki rozpędzano w głąb komórek zwierzęcia.

Badania Wolffa i in., (wyżej) jako pierwsze pokazały, że domięśniowe wstrzyknięcie plazmidowego DNA kodującego gen reporterowy powoduje ekspresję genu wmiocytach w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Ostatnie doniesienia pokazują pomyślną immunizację myszy przeciwko wirusowi grypy przez wstrzyknięcie plazmidów kodujących hemaglutyninę (Montgomery D.L. i in., 1993, Cell Biol. 12, 777-783), albo nukleoproteinę (Montgomery D.L. i in., wyżej; Ulmer J.B. i in., 1993, Science, 259, 1745-1749) wirusa grypy typu A. Pierwsze zastosowanie immunizacji DNA przeciwko wirusowi opryszczki opisano w Cox i in., 1993, J. Virol. 5664-5667). Wstrzyknięcie plazmidu kodującego glikoproteinę g IV bydlęcego wirusa herpes typu 1 (BHV-1) spowodowało wzrost przeciwciał przeciwko g IV

184 839 u myszy i cieląt. Po donosowej ekspozycji BHV-1, immunizowane cielęta wykazywały słabsze objawy i wydzielały zasadniczo mniej wirusa niż kontrole.

Gruźlica (TB) jest przewlekłą chorobą zakaźną płuc wywołaną przez patogen Mycobacterium tuberculosis. TB jest jedną z najbardziej klinicznie istotnych chorób w świecie, z częstością 3 milionów zgonów i 10 milionów nowych przypadków rocznie. Ocenia się, że zakażona być może około 1/3 populacji świata, zaś w krajach rozwijających się donosi się o około 55 milionach przypadków. Do przełomu wieków, TB była wiodącą przyczyną śmierci w USA. Dzięki poprawie warunków sanitarnych i nadejściu leków przeciwbakteryjnych częstość śmiertelności stale się zmniejsza do punktu gdzie, jak się oczekuje, choroba ulegnie całkowitemu zanikowi około roku 2000. Jednakże, w większości kraj rozwijających się, liczbą przypadków czynnej gruźlicy rośnie z każdym rokiem od połowy lat 80-ych. Część tego nawrotu przypisuje się imigracji i rosnącej liczbie osób osobników z niedoborem odporności, zakażonych HIV. Pozostawiona bez ingerencji, TB jak się ocenia zabierze ponad 30 milionów ludzkich istnień w ciągu następnych 10 lat. Podobnie jak te liczby, alarmujące jest powstanie wielolekoopomych szczepów M. tuberculosis. Te szczepy MDR są niemożliwe do wyleczenia tradycyjnymi lekami i są odpowiedzialne za kilka ostatnich epidemii TB, szczególnie w ośrodkach miejskich. Stąd, jednym z kluczowych składników długofalowego postępowania z TB będzie skuteczna szczepionka (patrz, Bloom i Murray, 1993, Science 257, 1055).

M. tuberculosis jest wewnątrzkomórkowym patogenem zakażającym makrofagi i zdolnym do przeżycia w surowych warunkach fagolizosomów tego typu komórek. Większość inhalowanych prątków jest niszczona przez aktywowane makrofagi pęcherzykowe. Jednakże, przeżywające prątki mogą się dzielić wewnątrz makrofagów i uwalniać się po śmierci komórki co powoduje napływ limfocytów, monocytów i makrofagów do tego miejsca. Rozpad makrofagów wypełnionych prątkami spowodowany jest nadwrażliwością typu późnego (DTH) i powoduje powstanie litego serowatego guzka otaczającego obszar zakażonych komórek. Trwająca DTH powoduje rozpływ guzka i uwolnienie zamkniętych prątków. Wielka dawka zewnątrzkomórkowych prątków wyzwala dalszą DTH, powodując uszkodzenie oskrzeli i rozsiew drogami limfatycznymi, krwionośnymi i oskrzelowymi i ewentualne rozprzestrzenienie zakaźnych prątków przez wydychane powietrze.

Odporność na TB obejmuje kilka rodzajów komórek efektorowych. Aktywacja makrofagów przez cytokiny, takie jak interferon-γ, jest skutecznym sposobem zmniejszania wewnątrzkomórkowego namnażania mykobakterii. Jednakże, całkowite wykorzenienie prątków tym sposobem nie jest osiągalne. Nabycie odporności przeciwko TB wymaga limfocytów T. Wśród nich, istotne wydają się być zarówno limfocyty CD8+ jak i CD4+ (Orme i in., 1993, J. Infect. Dis. 167, 1481). Te rodzaje komórek wydzielają interferon-γ w odpowiedzi na mykobakterie, co wskazuje na odpowiedź Thl i wykazują aktywność cytotoksyczną wobec komórek docelowych pulsowanych mykobakteriami. Jak wykazano w najnowszych badaniach z użyciem myszy defektywnych pod względem p2-mikroglobułiny i CD8, odpowiedź CTL jest kluczowa w zapewnieniu odporności na M. tuberculosis (Flynn i in., 1992, PNAS USA 89, 12013; Flynn i in., 1993, J. Exp. Med., 178, 2249; Cooper i in., 1993, J. Exp. Med., 178, 2243). W przeciwieństwie, limfocyty B nie wydają się być związane, zaś pasywne przeniesienie przeciwciał przeciwko mykobakteriom nie zapewnia odporności. Stąd, skuteczne szczepionki przeciwko TB muszą wywoływać odporność komórkową.

Pobudzenie antygenowe limfocytów T wymaga prezentacji przez cząsteczkę MHC. Aby antygeny mykobakteryjne miały dostęp do szlaku prezentacji antygenu muszą być uwolnione z bakterii. W zakażonych makrofagach może to być osiągnięte przez wydzielenie albo rozpad bakterii. Mykobakterie mają wiele potencjalnych antygenów limfocytów T, zaś kilka z nich zidentyfikowano (Andersen 1994, Dań. Med. Buli., 41, 205). Niektóre z nich są wydzielane przez bakterie. Uważa się ogólnie, że odporność przeciwko TB spowodowana jest przez limfocyty T CD8+ i CD4+ skierowane przeciwko tym wydzielanym antygenom. Na modelu TB myszy i świnek morskich, ochrona przed ekspozycją na bakterie, mierzona zmniejszeniem utraty ciężaru ciała, została osiągnięta przez zastosowanie mieszaniny wydzielanych antygenów mykobakteryjnych (Pal i Horowitz, 1992, Infect. Immunity 60, 4781; Andersen 1994, Infect. Immunity 62, 2536; Collins, 1994, Veterin. Microbiol. 40, 95).

184 839

U M. tuberculosis zidentyfikowano kilka potencjalnie chroniących antygenów limfocytów T, zaś niektóre z nich są badane jako potencjalne szczepionki. Ostatnie prace wskazują, że głównymi antygenami limfocytów T są te białka, które są wydzielane przez mykobakterie w trakcie ich pobytu w makrofagach, takie jak: i) kompleks białek antygenu 85 (85A, 85B, 85C) (Wiker i Harboe, 1992, Microbiol. Rev. 56, 648), ii) białko 6 kDa określane jako ESAT-6 (Andersen 1994, Infect. Immunity 62, 2536), iii) lipoproteina 38 kDa o homologii zPhoS (young i Garbe, 1991, Res. Microbiol. 142, 55; Andersen 1992. J. Infect. Dis. 166, 874), iv) białko wstrząsu cieplnego GroEL 65 kDa (Siva i Lowrie, 1994, Immunol. 82, 244), v) białko 55 kDa bogate w prolinę i treoninę (Romain i in., 1993, PNaS USA 90, 5322), i vi) lipoproteina 19 kDa (Faith i in., 1991, Immunol. 74,1).

Geny dla każdego z trzech białek antygenu 85 (A, B i C) sklonowano i sekwencjonowano (Borremans i in., 1989, Infect. Immunity 57, 3123; Content i in., Infect. Immunity 59, 3205;

DeWit i in., 1994, DNA Seq. 4, 267). Oprócz tego, te spokrewnione strukturalnie białka stanowią cel dla silnej odpowiedzi limfocytów T po zakażeniu jak i po szczepieniu (Huygen i in., 1988, Scand. J. Iimnunol. 27, 187; Launois i in., 1991, Clin. Exp. Immunol. 86, 286; Huygen i in., 1992, Infect. Immunity 60, 2880; Munk i in., 1994, Infect. Immunity 62, 726; Launois i in., 1994, Infect. Immunity 62, 3679). Tak więc, białka antygenu 85 uważane są za dobre cele szczepionki.

Streszczenie wynalazku

W celu zbadania skuteczności immunizacji DNA w zapobieganiu chorobie wywołanej przez M tb, sekwencje DNA kodujące białka M tb. klonowano do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych. Te konstrukcje DNA wywoływały odpowiedź odpornościową po wstrzyknięciu zwierzętom. Immunizowane zwierzęta zakażano mykobakteriami w celu zbadania, czy bezpośrednia immunizacja DNA genem (albo innymi genami M. tb.) może chronić je przed chorobą. Ujawniono więc kwasy nukleinowe, w tym konstrukty DNA i transkrypty RNA, zdolne do wywoływania ekspresji in vivo białek M. tb. po bezpośrednim wprowadzeniu do tkanek zwierzęcych przez wstrzyknięcie albo w inny sposób. Wstrzyknięcie tych kwasów nukleinowych może wywołać odpowiedź odpornościową, powodującą wytwarzanie cytotoksycznych limfocytów T (CTL) swoistych wobec antygenów M. tb, jak również wywołanie odpowiedzi limfocytów T pomocniczych swoistej wobec antygenów M. tb, która chroni podczas kolejnej ekspozycji.

Te kwasy nukleinowe są przydatne jako szczepionki do wywołania odporności wobec M. tb, która może zapobiegać zakażeniu i/lub złagodzić chorobę wywołaną przez M. tb.

Krótki opis rysunków

Figura 1 pokazuje ogólną zasadę klonowania genów M tb. do wektorów ekspresyjnych.

Figura 2 pokazuje mapę VI Jns.tPA85A.C1.

Figura 3 pokazuje mapę VI Jns.85A.C2.

Figura 4 pokazuje mapę V1Jns.85A.C3.

Figura 5 pokazuje mapę Vlns.tPA85B.Cl.

Figura 6 pokazuje mapę V1 Jns.tPA85C.Cl.

Figura 7 pokazuje potwierdzenie sekwencji N-końcowej konstruktu.

Figura 8 pokazuje ekspresję białek M. tb. w hodowli tkankowej.

Figura 9 pokazuje wytwarzanie przeciwciał swoistych wobec antygenu 85A przez szczepione DNA myszy.

Figura 10 pokazuje wytwarzanie IL-2 przez myszy BALB/c po szczepionce DNA Tb.

Figura 11 pokazuje wytwarzanie IL-2 przez myszy C57BL/6 po szczepionce DNA Tb.

Figura 12 pokazuje wytwarzanie IFN-γ przez myszy BALB/c po szczepionce DNA Tb.

Figura 13 pokazuje wytwarzanie IFN-γ przez myszy C57BL/6 po szczepionce DNA Tb.

Figura 14 pokazuje brak wytwarzania IL-4 przez myszy BALB/c po szczepionce DNA Tb.

Figura 15 pokazuje brak wytwarzania IL-6 przez myszy po szczepionce DNA Tb.

Figura 16 pokazuje brak wytwarzania IL-10 przez myszy po szczepionce DNA Tb.

Figura 17 pokazuje zmniejszenie namnażania BCG w płucach myszy C57BL/6 szczepionych szczepionką DNA Tb.

184 839

Figura 18 pokazuje zmniejszenie namnażania BCG w płucach myszy BALB/c szczepionych szczepionką DNA Tb.

Figura 19 pokazuje zmniejszenie namnażania BCG w śledzionach myszy BALB/c szczepionych szczepionką DNA Tb.

Figura 20 pokazuje zmniejszenie namnażania BCG w śledzionach myszy C57BL/6 szczepionych szczepionką DNA Tb.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dostarcza polinukleotydów, które po wprowadzeniu bezpośrednio do organizmu kręgowców in vivo, w tym ssaków takich jak człowiek, wywołują ekspresję kodowanych białek w organizmie zwierzęcia. W znaczeniu tu użytym, polinukleotyd jest kwasem nukleinowym, który zawiera istotne elementy regulatorowe takie, że po wprowadzeniu do komórki żywego kręgowca są zdolne do kierowania aparatem komórkowym w celu wytwarzania produktów translacji kodowanych przez geny zawarte w polinukleotydzie. W jednym wykonaniu wynalazku, poinukleotydem jest kwas polidezoksyrybonukleinowy, obejmujący geny Mycobaterium tuberculosis (M. tb.) połączone funkcjonalnie z promotorem transkrypcyjnym. W innym wykonaniu wynalazku, szczepionka polinukleotydowa obejmuje kwas polirybonukleinowy, kodujący geny M. tb, które są możliwe do translacji przez eukariotyczny aparat komórkowy (rybosomy, tRNA i inne czynniki translacyjne). Gdy białko kodowane przez polinukleotyd nie jest jednym z normalnie występujących u zwierzęcia z wyjątkiem stanów patologicznych (tj. białkiem heterologicznym) takim jak białka związane z M. tb, układ odpornościowy zwierzęcia jest aktywowany w sposób wyzwalający ochronną odpowiedź odpornościową. Ponieważ te białka egzogenne są wytwarzane przez własne tkanki zwierzęcia, ekspresjonowane białka są przetwarzane przez główny układ zgodności tkankowej (MHC) w sposób analogiczny do zachodzącego podczas zakażenia M. tb. Wynikiem jest, jak pokazano w niniejszym opisie, indukcja odpowiedzi odpornościowej przeciwko M. tb. Polinukleotydy do wywoływania odpowiedzi odpornościowej na kodowane białka określane są tu jako szczepionki polinukleotydowe albo PNV.

Istnieje wiele wykonań niniejszego wynalazku, które specjaliści wywnioskują z opisu. Tak więc, z powodzeniem mogą być zastosowane różne promotory transkrypcyjne, terminatory, wektory nośnikowe albo konkretne sekwencje genowe.

Niniejszy wynalazek pozwala na zastosowanie polinukleotydu, który po wprowadzeniu do tkanek ssaka wywołuje ekspresję in vivo polinukleotydu wytwarzając kodowane białko.

Oczywiste jest dla specjalisty, że możliwe są do wykonania odmiany albo pochodne sekwencji nukleotydowej kodującej białko, zmieniające sekwencję aminokwasową kodowanego białka. Zmienione ekspresjonowane białko może mieć zmienioną sekwencję aminokwasową, ale wciąż może wywoływać odpowiedź odpornościową oddziaływującą z białkami mykobakterii, i jest uważane za funkcjonalny równoważnik. Oprócz tego, mogą być konstruowane fragmenty genów pełnej długości, które kodują części białek pełnej długości. Fragmenty te mogą kodować białko albo peptyd wywołujący przeciwciała, które reagują z białkami mykobakterii i są uważane za funkcjonalne równoważniki.

W jednym z wykonań wynalazku, gen kodujący produkt genowy M. tb. włączony jest do wektora ekspresyjnego. Wektor zawiera promotor transkrypcyjny rozpoznawany przez eukariotyczną polimerazę RNA oraz terminator transkrypcyjny na końcu sekwencji kodującej gen M. tb. W korzystnym wykonaniu, promotor jest promotorem wirusa cytomegalii z sekwencją intronu A (CMV-intA), jednakże specjaliści zauważą, że może być zastosowany dowolny spośród licznych znanych promotorów takich jak silny promotor immunoglobuliny albo inne eukariotyczne promotory genów. Korzystny terminator transkrypcji jest terminatorem bydlęcego hormonu wzrostu. Korzystne jest skojarzenie CMVintA-terminator BGH. Oprócz tego, w celu ułatwienia wytwarzania polinukleotydów w komórkach prokariotycznych, do wektora ekspresyjnego włączony jest ewentualnie marker oporności na antybiotyki pod kontrolą transkrypcyjną odpowiedniego promotora prokariotycznego. Mogą być zastosowane geny oporności na ampicylinę, neomycynę albo dowolny inny stosowny marker oporności na antybiotyk. W korzystnym wykonaniu wynalazku, gen oporności na antybiotyk koduje produkt genowy oporności na neomycynę/kanamycynę. Dalej, w celu ułatwienia

184 839 wytwarzania polinukleotydu w dużych ilościach w organizmach prokariotycznych, korzystne jest aby zawierał prokariotyczny początek replikacji oraz był wektorem występującym w licznych kopiach. Dowolny spośród dostępnych w handlu prokariotycznych wektorów do klonowania zapewnia te elementy. W korzystnym wykonaniu wynalazku, czynności te są zapewnione przez wektory dostępne w handlu znane jako szereg pUC. Może być jednakże konieczne usunięcie sekwencji DNA, które nie są konieczne. Tak więc, sekwencje kodujące lacZ i lacI pUC mogą być usunięte. Jest również pożądane, aby wektory nie były zdolne do replikacji w komórkach eukariotycznych. Minimalizuje to ryzyko integracji sekwencji szczepionki polinukleotydowej do genomu biorcy.

W innym wykonaniu, zastosowany jest wektor ekspresyjny pnRSV, w którym jako promotor zastosowano sekwencję długich końcowych powtórzeń (LTR) wirusa mięsaka Rous'a (RSV). W jeszcze innym wykonaniu zastosowano V1, zmutowany wektor pBR322, w którym klonowano promotor CMV i terminator transkrypcji BGH. W korzystnym wykonaniu wynalazku, elementy V1 i pUC19 połączono tworząc wektor określany jako V1J.

Do V1J, V1JtPA albo innego pożądanego wektora ekspresyjnego klonowany jest gen M. tb, taki jak jeden z genów kompleksu antygenu 85 albo dowolny inny gen M. tb, który może wywołać odpowiedź odpornościową, przeciwko M. tb. (CTL, limfocyty T pomocnicze i przeciwciała). W innym wykonaniu, gen oporności na antybiotyki usuwany jest zV1J i zastępowany genem oporności na neomycynę, tworząc V1J-neo, do którego może być klonowany dowolny spośród licznych genów M. tb. do zastosowania zgodnego z wynalazkiem. W jeszcze innym wykonaniu, wektorem jest V1Jns, który jest tym samym co V1J-neo, z takim wyjątkiem, że zaprojektowano unikalne miejsce restrykcyjne SfiI w pojedynczym miejscu KpnI w pozycji 2114 V1J-neo. Występowanie miejsc SfiI w ludzkim genomowym DNA jest niezwykle rzadkie (około 1 miejsce na 100000 zasad). Tak więc, wektor ten umożliwia dokładne śledzenie integracji wektora ekspresyjnego z DNA gospodarza, przez trawienie SfiI ekstrahowanego genomowego DNA. W dalszym wykonaniu, wektorem jest V1R. W tym wektorze, usunięto tyle DNA ile to możliwe, tworząc niezwykle zwarty wektor. Wektor ten umożliwia zastosowanie większych wstawek, bez zwracania uwagi na to, że kodowane są niepożądane sekwencje i poprawia wychwyt przez komórki, gdy konstrukt kodujący konkretne geny wirusowe jest wprowadzany do otaczających tkanek. Zastosowane sposoby w wytwarzaniu powyższych odmian wektora i opracowywanych procedur mogą być osiągane sposobami znanymi specjalistom.

Z opisanej pracy specjalista zauważy, że jedną z korzyści niniejszego wynalazku jest zapewnienie układu do testowania i analizowania in vivo jak i in vitro, tak że można skorelować różnorodność sekwencji M. tb. z odpowiedzią proliferacyjną CTL i limfocytów T, jak również inne parametry. Izolacja i klonowanie tych różnych genów może być osiągnięta sposobami znanymi specjalistom. Wynalazek dostarcza dalej sposobu systematycznej identyfikacji szczepów M. tb. i sekwencji do wytwarzania szczepionek. Włączenie genów z pierwotnych izolatów szczepów M. tb. zapewnia immunogen, który wywołuje odpowiedź odpornościową przeciwko izolatora klinicznym organizmu, i w ten sposób spełnia dotąd niezaspokojoną potrzebę. Ponadto, jeżeli szczep zakaźny się zmienia, immunogen może być modyfikowany odzwierciedlając jeżeli to konieczne nowe sekwencje.

W jednym wykonaniu wynalazku, gen kodujący białko M. tb. połączono bezpośrednio z promotorem transkrypcji. W celu ograniczenią ekspresji polinukleotydu do konkretnego rodzaju tkanki może być pożądane zastosowanie swoistych dla tkanek promotorów i wzmacniaczy, przykładowo elementu wzmacniającego kinazę kreatyniny mięśni (MCK). Przykładowo, miocyty są zróżnicowanymi końcowo komórkami, które się nie dzielą. Integracja obcego DNA do chromosomów wydaje się wymagać podziału komórki jak i syntezy białka. Tak więc, ograniczenie ekspresji do nie dzielących się komórek takich jak miocyty może być korzystne. Jednakże, zastosowanie promotora CMV jest adekwatne do osiągnięcia ekspresji w wielu tkankach do których wprowadzana jest PNV.

M. tb. oraz inne geny są korzystnie ligowane z wektorem ekspresyjnym, który specyficznie optymalizowano do szczepienia polinukleotydem. Elementy obejmują promotor transkrypcyjny, immunogenne epitopy oraz dodatkowe cistrony kodujące geny immunowzmacniające

184 839 albo immunomodulujące, z ich własnymi promotorami, terminatorami transkrypcyjnymi, bakteryjnymi początkami replikacji i genami oporności na antybiotyki, jak to tu opisano. Ewentualnie, wektor może zawierać wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (IRES) w celu ekspresji mRNA policistronowego. Specjaliści zauważą, że RNA poddawane transkrypcji in vitro w celu wytworzenia wielocistronowych mRNA kodowanych przez odpowiednie DNA również leży w zakresie wynalazku. W tym celu pożądane jest, zastosowanie promotora transkrypcyjnego takiego jak silny promotor polimerazy RNA, taki jak promotor T7 albo SP6, i wykonanie transkrypcji in vitro z użyciem matrycy linearyzowanego DNA. Sposoby te są znane w dziedzinie wiedzy.

Skuteczność ochronną polinukleotydowych immunogenów M. tb. przed następującą potem ekspozycją wykazano immunizację DNA według wynalazku. Jest to korzystne ponieważ nie stosuje się żadnego czynnika zakaźnego, nie jest konieczne żadne łączenie/replikacja bakterii oraz możliwa jest selekcja determinant. Ponadto, ponieważ sekwencja produktów genowych mykobakterii może być zakonserwowana pomiędzy różnymi szczepami M. tb, uzyskiwana jest ochrona przed kolejną ekspozycja na inny szczep M. tb.

Wstrzyknięcie wektora ekspresyjnego DNA kodującego antygen 85A, B albo C może spowodować wytworzenie znacznej ochronnej odporności przed kolejną ekspozycją. W szczególności, może być wytworzona odpowiedź swoistych CTL i limfocytów T pomocniczych.

Ponieważ każdy z produktów genowych M. tb. wykazuje wysoki stopień zakonserwowania wśród różnych szczepów M. tb. oraz ponieważ odpowiedź odpornościowa może być wytworzona w odpowiedzi na wewnątrzkomórkową ekspresję i przetwarzanie przez MHC, należy oczekiwać, że wiele różnych konstruktów PNV M. tb. może dawać odporność krzyżową.

Wynalazek oferuje sposoby wywołania heterologicznej ochronnej odporności bez potrzeby czynników samoreplikujących albo adiuwantów. Wytworzenie przeciwciał o wysokim mianie przeciwko ekspresjonowanym białkom po wstrzyknięciu DNA dla białek wirusowych i ludzkiego hormonu wzrostu (Tang i in., Nature 356, 152, 1992) wskazuje, że jest to wygodny i niezwykle skuteczny sposób tworzenia szczepionek opartych na przeciwciałach, zarówno osobno jak i w połączeniu ze szczepionkami opartymi na limfocytach T cytotoksycznych i limfocytach T pomocniczych skierowanych przeciwko zakonserwowanym regionom antygenów.

Łatwość wytwarzania i oczyszczania konstruktów DNA korzystnie konkuruje z tradycyjnym oczyszczaniem białek, ułatwiając wytwarzanie szczepionek poliwalentnych. Tak więc, mogą być wytworzone liczne konstrukty, przykładowo kodujące geny kompleksu antygenu 85 i dowolny inny gen M. tb. jak również inne geny nie należące do M. tb. mogą być wytwarzane, mieszane i podawane równocześnie. Oprócz tego, ekspresja białka po wstrzyknięciu jest utrzymywana (H. Lin i in., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis i in., PNAS USA 88, 4138 (1991); E. Hansen i in., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao i in., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff i in., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)). Trwałość pamięci limfocytów B i T może być przedłużona (D. Gray iP. Matzinger, J. Exp. Med. 174, 969 (1991); S. Oehen i in., ibid. 176, 1273 (1992)), dając w ten sposób długotrwałą odporność humoralną i komórkową.

Ilość zdolnego do ekspresji DNA albo możliwego do transkrypcji RNA wprowadzanego do organizmu biorcy szczepionki zawiera się w szerokich granicach i może zależeć od siły zastosowanych promotorów transkrypcyjnych i translacyjnych. Oprócz tego, wielkość odpowiedzi odpornościowej może zależeć od poziomu ekspresji białka oraz od immunogenności ekspresjonowanego produktu genowego. Ogólnie, skuteczny dawka w zakresie od około 1 ng do około 5 mg, 100 ng do 2,5 mg, 1 pg do 750 pg, zaś korzystnie około 10 pg do 300 pg podawana jest bezpośrednio do tkanki mięśniowej. Odpowiednie jest również wstrzyknięcie podskórne, wprowadzanie śródskórne, wgniatanie przez skórę i inne sposoby podawania takie jak podawanie dootrzewnowe, dożylne albo wziewne. Uwzględniane jest również szczepienie przypominające. Uwzględniane jest również szczepienie przypominające immunogenami białkowymi M. tb. takimi jak produkty genowe kompleksu antygenu 85 po szczepieniu immunogenem polinukleotydowym M. tb. Może być korzystne podawanie pozajelitowe, takie

184 839 jak dożylne, domięśniowe, podskórne albo innym sposobem białka interleukiny-12 (albo innych cytokin np. GM-CSF) równocześnie albo po wprowadzeniu pozajelitowym PNV według wynalazku.

Polinukleotydy mogą być nagie, tj. niezwiązane z żadnymi białkami, adiuwantami albo innymi czynnikami wpływającymi na układ odpornościowy biorcy. W tym przypadku, pożądane jest aby polinukleotyd był w roztworze dopuszczalnym fizjologicznie, takim jak, choć nie wyłącznie sterylny roztwór soli albo sterylny buforowany roztwór soli. Alternatywnie, DNA może być związany z liposomami, takimi jak liposomy lecytynowe albo inne liposomy znane w dziedzinie wiedzy, w postaci mieszaniny DNA-liposomy, albo DNA może być związane ze znanym w dziedzinie wiedzy adiuwantem wzmagającym odpowiedź odpornościową takim jak białko albo inny nośnik. Mogą być również zastosowane czynniki zwiększające komórkowy wychwyt DNA takie jak, choć nie ograniczone do jonów wapnia. Czynniki te określa się tu ogólne jako reagenty wspomagające transfekcję i nośniki dopuszczalne farmaceutycznie. Znane są również techniki opłaszczania mikropocisków polinukleotydami i są również przydatne w połączeniu z niniejszym wynalazkiem. Dla DNA przeznaczonego do podawania ludziom może być przydatne przechowywanie końcowego produktu DNA w nośniku dopuszczalnym farmaceutycznie albo buforowanym roztworze. Znane są nośniki dopuszczalne farmaceutycznie i buforowane roztwory i opisano je w różnych dokumentach takich jak Remington's Pharmaceutical Sciences.

W innym wykonaniu, wynalazek stanowi polinukleotyd obejmujący ciągłe sekwencje kwasu nukleinowego możliwe do ekspresji z wytworzeniem produktu genowego po wprowadzeniu do tkanek eukariotycznych in vivo. Kodowany produkt genowy korzystnie działa albo jako immunostumulator albo jako antygen zdolny do wywołania odpowiedzi odpornościowej. Tak więc, sekwencje kwasu nukleinowego w tym wykonaniu kodują immunogenny epitop M. tb. oraz ewentualnie cytokinę albo element kostymulujący limfocyta T, taki jak jeden z członków rodziny białek B7.

Istnieje kilka zalet immunizacji genem w stosunku do immunizacji produktem genowym. Pierwszą z nich jest względna prostota z jaką natywny albo prawie natywny antygen może być prezentowany układowi odpornościowemu. Białka ssaków ekspresjonowane rekombinacyjnie w bakteriach, drożdżach albo nawet komórkach ssaków często wymagają, intensywnego traktowania w celu zapewnienia odpowiedniej antygenowości. Drugą zaletą immunizacji DNA jest prawdopodobieństwo wejścia w szlak MHC klasy I i wywołania odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych. Immunizacja myszy zużyciem DNA kodującego nukleoproteinę wirusa grypy typu A (NP) wywoływała odpowiedź CD8+ na NP, która chroniła myszy przed ekspozycją na heterologiczne szczepy grypy (Montgomery D.L. i in., wyżej; Ulmer J. i in., wyżej).

Istnieją silnie dowody na to, że odporność komórkowa jest istotna w kontrolowaniu zakażenia M. tb. (Orme i in., 1993, J. Infect. Dis. 167, 1481; Cooper i in., 1993, J. Exp. Med. 178, 2243; Flynn i in., 1993, J. Exp. Med. 178, 2249; Orme i in., 1993, J. Immunol. 151, 518). Ponieważ immunizacja DNA może wywołać zarówno humoralną jak i komórkową odpowiedź odpornościową, jej największą zaletą może być to, że zapewnia względnie prosty sposób zbadania wielkiej liczby genów M. tb. w kierunku ich potencjalnego zastosowania w szczepionce.

Immunizacja przez wstrzyknięcie DNA umożliwia również, jak to dyskutowano wyżej, łatwe komponowanie szczepionek poliwalentnych. Ostatnio została opisana równoczesna immunizacja licznymi genami wirusa grypy (Donelly i in., 1994, Vaccines, 55-59). Wprowadzenie do szczepionki M. tb. genów, których produkty aktywują różne szlaki odpowiedzi odpornościowej może również zapewnić gruntowną ochronę przed kolejną ekspozycją.

Szczepionki według niniejszego wynalazku są przydatne do podawania zwierzętom domowym i hodowlanym jak również ludziom. Szczepionki według wynalazku mogą być zastosowane w celu zapobiegania i/lub zwalczania zakażenia u dowolnego zwierzęcia hodowlanego w tym, choć nie wyłącznie krów mlecznych, które są podatne na zakażenie mykobakteriami. Techniki podawania tych szczepionek zwierzętom i ludziom znane są specjalistom w dziedzinie, odpowiednio, weterynarii i medycyny.

184 839

Poniższe przykłady dostarczono w celu zilustrowania niniejszego wynalazku, bez ograniczania go do nich.

Przykład 1

Wektory do wytwarzania szczepionek

A) Wektor ekspresyjny VI

Wektor ekspresyjny VI skonstruowano z pCMVIEAKI-DHFR (Y. Wang i in., J. Virol. 61, 1796 (1987)). Geny AKI i DHFR usunięto przez cięcie wektora EcoRI i religację. Wektor ten nie zawierał intronu A w promotorze CMV, a więc dodano go jako fragment PCR, z którego usunięto wewnętrzne miejsce SacI (w pozycji 1855 według numeracji Chapmana i in. Nucl. Acids Res. 19, 3979 (1991)). Jako matrycę do reakcji PCR zastosowano pCMVintA-Lux wytworzony przez ligację fragmentu HindIII i NheI zpCMV6a120 (patrz, Chapman i in., ibid.) obejmującego wzmacniacz/promotor hCMV-IE1 i intron A, w miejscu HindIII i XbaI pBL3, tworząc pCMVIntBL. Fragment genu lucyferazy wielkości 1881 par zasad (HindIII-Smal wypełniony fragmentem Klenowa) zRSV-Lux (J.R. de Wet i in. Mol. Cell Biol. 7, 725, 1987) klonowano w miejsce SalI pCMVIntA, który wypełniono fragmentem Klenowa i traktowano fosfatazą.

Startery obejmujące intron A miały sekwencje: starter 5', Identyfikator Sekw. Nr 1:

5'CTATAT?A\GCAGAGCTCGTTTAG3'; starter 3', Identyfikator Sekw. Nr 2:

5'GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG3’.

Startery zastosowane w celu usunięcia miejsca SacI miały sekwencje: starter sensowny, Identyfikator Sekw·'. Nr 3:

5' GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC3’ ;

starter antysensowny. Identyfikator Sekw·'. Nr 4:

5'GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC3'.

Fragment PCR cięto SacI i BglII i wprowadzono do wektora, który przecięto tymi samymi enzymami.

B) Wektor ekspresyjny V1J

Celem wytworzenia V1J było usunięcie elementów promotora i terminatora transkrypcji z wektora VI w celu umieszczenia ich w bardziej zdefiniowanym kontekście, stworzenie bardziej zwartego wektora i poprawa ilości oczyszczanego plazmidu.

V1J otrzymano z wektorów V1 ipUC18, plazmidów dostępnych w handlu. V1 trawiono enzymami restrykcyjnymi Sspl i EcoRI tworząc dwa fragmenty DNA. Mniejszy z nich, zawierający elementy promotora CMVintA i terminatora transkrypcji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH), kontrolujące ekspresję genów heterologicznych oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym. Końce tego fragmentu DNA „stępiono” stosując polimerazę DNA T4, w celu ułatwienia jego ligacji z innym „tępym” fragmentem DNA.

pUC18 wybrano jako szkielet wektora ekspresyjnego. Znany jest on z wytwarzania dużej ilości plazmidu, jest dobrze scharakteryzowany pod względem sekwencji i funkcji i ma małe wymiary. Z wektora tego usunięto przez częściowe trawienie enzymem restrykcyjnym HaeII cały operon lac. Pozostały plazmid oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stępiono na końcach polimerazą DNA T4, traktowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną i ligowano z elementem CMVintA/BGH opisanym wyżej. Uzyskano plazmidy wykazujące obie możliwe orientacje elementu promotora w szkielecie pUC. Jeden z tych plazmidów dawał znacznie wyższe ilości DNA w E. coli i został oznaczony V1J. Strukturę tego wektora sprawdzono przez analizę sekwencji regionów połączeń, a następnie wykazano porównywalną albo wyższą ekspresję genów heterologicznych w porównaniu z V1.

C) Wektor ekspresyjny V1Jneo

Okazało się konieczne usunięcie genu ampr, stosowanego do selekcji na antybiotyku bakterii niosących V1J, ponieważ ampicylina nie może być stosowana w fermentatorach wielkiej skali. Gen ampr usunięto ze szkieletu pUC V1J przez trawienie enzymami restrykcyjnymi SspI

184 839 i Eam 1105I. Powstały plazmid oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stępiono końce polimerazą DNA T4 i traktowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną. Dostępny w handlu gen kan^r, uzyskany ztranspozonu 903 i zawarty w plazmidzie pUC4K, wycięto stosując enzym restrykcyjny PstI, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym i stępiono końce polimerazą DNA T4. Fragment ten poddano ligacji ze szkieletem V1J i uzyskano plazmidy z genem kanr w obu możliwych orientacjach, które nazwano V1Jneo#1 i #3. Każdy z tych potwierdzono analizą restrykcyjną, sekwencjonowaniem DNA regionów połączeń i jak wykazano powodowały one powstanie podobnych ilości plazmidu co V1J. Ekspresja produktów genów heterologicznych była również dla tych wektorów V1Jneo porównywalna z V1J. Jako konstrukt ekspresyjny, wybrano V1Jneo#3, określany dalej jako V1Jneo, zawierający gen kanr w tej samej orientacji co gen amp'\

D) Wektor ekspresyjny V1Jns

W celu ułatwienia badania integracji, do V1Jneo wprowadzono miejsce SfiI. W miejscu KpnI w sekwencji BGH wektora dodano dostępny w handlu łącznik SfiI wielkości 13 par zasad (New England Biolabs). V1Jneo linearyzowano przez trawienie KpnI, oczyszczono na żelu, stępiono na końcach polimerazą DNA T4 i ligowano ze stępionym łącznikiem SfiI. Izolaty klonalne wybrano przez mapowanie restrykcyjne i potwierdzono przez sekwencjonowanie przez łącznik. Nowy wektor określono jako V1Jns. Ekspresja genów heterologicznych w V1Jns (z SfiI) była porównywalna z ekspressątych samych genów w V1Jneo (z KpnI).

E) VlJns-tPA

W celu dostarczenia sekwencji heterologicznego peptydu sygnałowego białkom wydzielanym i/lub błonowym, V1Jns zmodyfikowano wprowadzając sekwencję sygnałową ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA). Dwa syntetyczne oligomery komplementarne hybrydyzowano i ligowano z trawionym Bg1II V1Jns. Oligomery sensowne i antysensowne miały sekwencje:

5'GATCACCATGGATGC.AATGjAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTG TGG AGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCGA3', Identyfikator Sekw. Nr 5; i

5'GATCTCGCTGGGCGAAACGAAGACTGCTCCACACAGCAGCAGCACACAGC AGAG CCCTCTCTTCATTGCATCCATGGT3', Identyfikator Sekw. Nr 6.

Sekwencję Kozaka podkreślono w oligomerze sensownym. O-ligomery te miały niesparowane zasady kompatybilne z sekwencją ciętą Bg1II. Po ligacji miejsce Bg1II po stronie 5' zostało zniszczone podczas gdy miejsce po stronie 3'jest zachowane do dalszych ligacji. Oba miejsca połączeń jak również całą sekwencję sygnałową tPA potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Oprócz tego, w celu zachowania zgodności z optymalizowanym wektorem V1Jns (=V1Jneo z miejscem SfiI) miejsce restrykcyjne SfiI wprowadzono w miejsce KpnI w regionie terminatora BGH V1Jn-tPA przez stępienie końców miejsca KpnI polimerazą DNA T4, a następnie ligację z łącznikiem SfiI (Nr kat. 1138, New England Biolabs). Modyfikacje tą potwierdzono przez trawienie restrykcyjne i elektroforezę na żelu agarozowym.

F) pGEM-3-X-IRES-B 7 (w którym X = dowolny gen antygenowy). Jako przykład konstruktu dicistronowego szczepionki zapewniającego równoczesną ekspresję genu kodującego immunogen i genu kodującego białko immunostymulujące, mysi gen B7 amplifikowano przez PCR z linii komórkowej chłoniaka z limfocytów B CH1 (uzyskanej z ATCC). B7 jest członkiem rodziny białek zapewniających istotną kostymulację aktywacji limfocytów T przez antygen w kontekście głównego układu zgodności tkankowej I i II. Komórki CH1 zapewniają dobre źródło mRNA B7 ponieważ wykazują fenotyp aktywowany konstytutywnie, zaś b7 jest ekspresjonowane przede wszystkim przez aktywowane komórki prezentujące antygen takie jak limfocyty B i makrofagi. Komórki te były dalej aktywowane in vivo przez zastosowanie cAMP albo IL-4, zaś mRNA wytworzono z użyciem standardowych procedur wykorzystujących tiocyjanian guanidyny. Syntezę cDNA przeprowadzono stosując to mRNA i zestaw GeneAmp RNA PCR kit (Perkin-Elmer Cetus) i starter oligomerowy (5'GTACCTCATGAGCCACATAATACCATG3', Identyfikator Sekw. Nr 7) specyficzny dla B7 położony poniżej otwartej ramki odczytu B7. B7 amplifikowano przez PCR stosując startery sensowny i antysensowny o następujących sekwencjach:

184 839

5'GGTACAAGATCTACCATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGC3', Identyfikator Sekw. Nr 8; i

5'CCACATAGATCTCCATGGGAACTAAAGGAAGGCGGTCTGTTC3^,, Identyfikator Sekw. Nr 9. Oligomery te zapewniały miejsca restrykcyjne Bg1II na końcach wstawki, jak również sekwencję startu translacji Kozaka zawierającą miejsce restrykcyjne NcoI oraz dodatkowe miejsce NcoI położone bezpośrednio przed 3'-końcowym miejscem Bgłll. Trawienie NcoI dało fragment odpowiedni do klonowania do pGEM-3-IRES który trawiono NcoI. Powstały wektor, pGEM-3-IRES-B7, zawierał kasetę IRES-B7, którą łatwo można było przenieść do V1Jns-X, w którym X oznacza gen kodujący antygen.

G) p GEM-3-X-IRES- GM- CSF (w którym X = dowolny gen antygenowy). Wektor ten zawierał kasetę analogiczną do opisanej w punkcie C, z takim wyjątkiem, że zamiast B7 zastosowano cytokinę immunostymulującą GM-CSF. GM-CSF jest cytokiną wywołującą różnicowanie i stymulację makrofagów, która wywołuje, jak opisano silną aktywność przeciwnowotworową limfocytów T in vivo (G. Dranoff i in., PNAS USA 90, 3539 (1993)).

H) pGEM-3-X-IRES-IL-12 (w którym X = dowolny gen antygenowy). Wektor ten zawierał kasetę analogiczną do opisanej w punkcie C, z takim wyjątkiem, że zamiast B7 zastosowano cytokinę immunostymulującą iL-12. IL-12 wykazuje kluczową rolę w przesuwaniu odpowiedzi odpornościowej w kierunku szlaku komórkowego, zdominowanego przez limfocyty T, w przeciwieństwie do odpowiedzi humoralnej (L. Alfonso i in., Science 263, 235,1994).

Przykład 2

Wytwarzanie wektora V1R

W celu ciągłej optymalizacji podstawowego wektora do szczepienia wytworzono pochodną V1Jns oznaczoną V1R. Celem konstrukcji tego wektora było uzyskanie wektora do szczepienia o minimalnych rozmiarach, bez niepotrzebnych sekwencji DNA, który by wciąż zachowywał ulepszoną charakterystykę ekspresji genów heterologicznych i znaczne ilości uzyskiwanego plazmidu, które zapewniały V1J i V1Jns. Określono na podstawie literatury, jak również z doświadczeń, że (1) regiony w szkielecie pUC obejmujące początek replikacji E. coli mogą być usunięte bez wpływu na ilość uzyskiwanego z bakterii plazmidu; (2) region 3' genu kan^r następujący po otwartej ramce odczytu kanamycyny może być usunięty jeżeli w to miejsce zostanie wprowadzony bakteryjny terminator; i (3) ~300 bp z połowy 3' terminatora BGH może być usunięte bez wpływu na jego funkcje regulacyjne (po oryginalnym miejscu restrykcyjnym KpnI w elemencie BGH).

V1R skonstruowano przez zastosowanie PCR w celu syntetyzowania trzech segmentów DNA z V1Jns stanowiąc, odpowiednio, promotor CMVintA/terminator BGH, początek replikacji i element oporności na kanamycynę. Miejsca restrykcyjne unikalne dla każdego segmentu zostały dodane do każdego końca segmentu przy użyciu oligomerów PCR: Sspl i XhoI dla CMVintA/BGH; EcoRV i BamHI dla genu kanr j BclI i Sali dla orf. Te miejsca restrykcyjne wybrano ponieważ umożliwiały one ukierunkowaną ligację każdego z uzyskanych przez PCR segmentów DNA z następującym po tym zniszczeniem miejsc: EcoRV i Sspl pozostawiały tępe końce kompatybilne do ligacji, podczas gdy BamHI i BclI pozostawiały niesparowane zasady kompatybilne do Sali i Xho.l. Po uzyskaniu tych segmentów przez PCR, każdy z segmentów trawiono odpowiednim enzymem restrykcyjnym wskazanym powyżej, a następnie ligowano razem w jednej mieszaninie reakcyjnej zawierającej wszystkie trzy segmenty DNA. Koniec 5' orf został zaprojektowany tak, aby zawierał sekwencję niezależnego terminatora T2 rho, który jest normalnie spotykany w tym regionie tak, że może zapewnić sygnał terminacji dla genu oporności na kanamycynę. Ligowany produkt potwierdzono trawieniem enzymami restrykcyjnymi (>8 enzymów), jak również sekwencjonowaniem DNA przez miejsca połączeń. Ilość uzyskiwanego plazmidowego DNA i ekspresja genów heterologicznych. z użyciem genów wirusowych w V1R wydaje się być podobna do V1Jns. Ogólna redukcja wielkości wektora wyniosła 1346 bp (V1Jns = 4,86 kb; V1R = 3,52 kb).

Sekwencje oligomerów PCR zastosowane do syntezy V1R (miejsca restrykcyjne podkreślono i zaznaczono w nawiasach po sekwencji):

184 839 (1) 5' GGTACAAA\AriGGCTATTGGCCATTGCATACG3[ ^pl], Identyfikator Sekw. Nr 10;

(2) 5'CCACATCTCGAGGAACCGGGTCAATTCTTCAGCACC3' [XhoI], Identyfikator Sekw. Nr 11; (dla segmentu CMVintA/BGH);

(3) 5'GGTACAGATATCGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATC3' [EcoRV], Identyfikator Sekw. Nr 12;

(4) 5' CCAC-ATGGATCCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACC3' B^anHil] , Mattyfikator Sekw. Nr 13; (dla segmentu genu oporności na kanamycynę);

(5) 5'GGTACAIGAACA<CGTAGAAAAlGATCAAAGGATCTTCTTG3' [BcII] , Identyfikator Sekw. Nr 14;

(6) 5' CCACArGTCGACCCGTAAAAAGGCCGCGTGGTTGGTGGn[ |^^_a]_I-_JI identyfikator Sekw. Nr 15; (dla początku replikacji E. coli).

Przykład 3

Hodowla komórek i transfekcja

W celu wytworzenia stabilnie transfekowanych linii komórkowych ekspresjonujących antygeny M. tb, komórki RD (ludzki mięsak wywodzący się z mięśni prążkowanych ATCC CCL 136) hodowano w 37°C, 5% CO 2 w pożywce DmEm z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej inaktywowansj ciepłem, 2θ mM HE-PES, 4 mM L-glutaminy i 100 pg/ml penicyliny i streptomycyny. Komórki wysiano w gęstości 1,5x10⁶ komórek na płytkę 100 mm² i hodowano przez 18 godzin. Komórki transfekowano konstruktem TB w ilości 10 (ig/plytkę i kotransfekowano konspektem Cat stosując zestaw CellPhect (Pharmacia) i poddawano wstrząsowi glicerolowemu (15% gliceryna w PBS, pH 7,2 przez 2 minuty) 5 godzin po dodaniu DNA do komórek. Hodowle zbierano 72 godziny po transfekcji przez płukanie płytek 2 x 10 ml zimnego PBS, pH 7,2, dodanie 5 ml zimnego buforu TEN (40 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) i zdrapanie. Do analizy ekspresji białka, osad komórkowy poddano lizie w 50 μΐ bufom Single Detergent Lysis Bufer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3, 1% Nonidet P-40, 100 mM PMSF, 2 pg/ml aprotyniny, 2 pg/ml leupeptyny i 1 pg/ml pepstatyny A) i sonikowano na lodzie (2-15 sekund). Lizaty odwirowano przy 13000 xg, 4°C przez 10 minut. Stężenie białka oznaczono metodą Bradforda i nałożono po 20 pg białka ekstraktu komórkowego na ścieżkę na 10% żel poliakrylamidowy TRIS-glicyna (Novsx), a następnie przeniesiono na membranę Immobilon P (Millipore). Membrany poddano reakcji przez noc z rozcieńczonym 1:20 mysim przeciwciałem monoklonalnym TD 17-4 (Huygen i in., 1994, Infect. Immunity 62, 363), a następnie 1,5-godzinnej reakcji z rozcieńczonym 1:1000 koniugatem peroksydazy z kozim przeciwciałem przeciwko mysim IgGFc (Jackson). Membrany wywoływano stosując zestaw ECL (Amersham).

Przykład 4

Klonowanie i preparowanie DNA

1. Konstruowanie νΐ.^ΑΡΑ-^Α ^wierająceeo dojrzafy Aga5A / sekwencją sencją łową tPA) wykonano stosując następujące startery:

starter sensowny 85A.C1 (Identyfikator Sekw. Nr 16) GGAAGATCTTTTCCCGGCCGGGCTTGCCG

BglII starter antysensowny 85A (Identyfikator Sekw. Nr 17)

GGAAGATCTTGTCTGTTCGGAGCTAGGC

Ag85A z M. tuberculosis amplifikowano z plazmidu sS5A.tub, wytworzonego przez ligację fragmentu HindIII wielkości 800 bp z fragmentem HiedIll-Sphl wielkości 1600 bp, z fig. 2 Borremans i in., 1989 (Infect. Immunity 57, 3123). Powstała wstawka 2400 bp została wklonowana w miejsca HindIII i SphI BlueScr^ M13+. Całkowitą sekwencję kodującą i regiony flankujące BlueScr^ M13+ (VCS/Slralazens) amplifikowano przez PCR wskazanymi starterami w poniższych warunkach. Każde 100 pl mieszaniny reakcyjnej zawierało 2,5 jednostki klonowanej polimerazy DNA Pfu (Stratagens), 200 mM dNTP, 0,5 pg każdego ze starterów i 250 ng matrycy DNA w buforze reakcyjnym dostarczonym wraz z enzymem (Slralagses). Urządzenie Hybaid Thermal Reactor zaprogramowano w następujący

184 839 sposób: 5 minut denaturacji w 94°C, po czym 25 cykli (1 minuta w 94°C, 2 minuty w 55°C i 3 minuty w 72°C) zakończone 10 minutami wydłużania w 72°C.

Amplifikowany DNA trawiono 50 pg/ml proteinazy K (Boehringer Mannheim) przez 30 minut w 37°C, podgrzano przez 10 minut do 95°C, a następnie dwukrotnie ekstrahowano fenolem(chloroformem-alkoholem izoamylowym) i strącano 1 objętością izopropanolu, dwukrotnie płukano 70% etanolem, suszono i rozpuszczano w 20 pl H 2 O · 3 pg amplifikowanego DNA trawiono 40 jednostkami Bg1II (Boehringer Mannheim) po czym na 1% żelu agarozowym izolowano fragment wielkości 907 bp (w przypadku 85A-C1) i ekstrahowano na „Prep a Gene” (BioRad) według zaleceń producenta.

ng tego fragmentu ligowano z 20 ng wektora Y1Jns.tPA trawionego Bg1II i defosforylowanego, w 10 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2,5 jednostki ligazy DNA T4 (Amersham) w buforze ligacyjnym przez 16 godzin w 14°C, transformowano do kompetentnych komórek E. coli DH5 (BRL) i wysiano na podłoże z agaru LB z dodatkiem kanamycyny (50 pg/ml). Transformanty wybrano, po czym ich plazmidowy DNA trawiono Bg1II (w celu potwierdzenia obecności wstawki) i PvuII w celu określenia jej ukierunkowania.

2. Konstruowanie VlJns-85A(C2) (zawierającego dojrzały Ag85A bez sekwencji sygnałowej) wykonano stosując następujące startery:

starter sensowny 85A C2 (Identyfikator Sekw. Nr 18)

GGAAGATCTACCATGGGCTTTTCCCGGCCGGGCTTGC starter antysensowny 85A (Identyfikator Sekw. Nr 17) GGAAGATCTTGCTGTTCGGAGCTAGGC

Stosowano tą samą procedurę co wyżej, z takim wyjątkiem, że klonowano do V1Jns.

3. Konstruowanie V1Jns-85A(C3) (zawierającego Ag85A z własną sekwencją sygnałową) przeprowadzono stosując startery:

sensowny 85A C3 (Identyfikator Sekw. Nr 19)

GGAAGATCTACCATGGCACAGCTTGTTGACAGGGTT antysensowny 85A (Identyfikator Sekw. Nr 17) GGAAGATCTTGCTGTTCGGAGCTAGGC

Stosowano tą samą procedurę co w 1, z takim wyjątkiem, że klonowano do V1Jns.

4. Konstruowanie V1Jns-tPA-85B (C1) (zawierającego Ag85B z sekwencją sygnałową tPA) przeprowadzono stosując poniższe startery:

sensowny 85B (C1) (Identyfikator Sekw. Nr 20)

GGAAGATCTCCTTCTCCCGGCCGGGGCTGCCGGTCGAG antysensowny 85B (Identyfikator Sekw. Nr 21) GGAAGATCTAACCTTCGGTTGATCCCGTCAGCC

Stosowano tą samą procedurę co w 1, z takim wyjątkiem, że jako matryca do PCR służył p85B.tub.

5. Konstruowanie V1Jns-tPA-85C (C1) (zawierającego Ag85C z sekwencją sygnałową tPA) wykonano stosując poniższe startery;

sensowny 85C (C1) (Identyfikator Sekw. Nr 22)

GGAAGATCTCCTTCTCTAGGCCCGGTCTTCCA antysensowny 85C (Identyfikator Sekw. Nr 23) GGAAGATCTTGCCGATGCTGGCTTGCTGGCTCAGGC.

Stosowano tą samą procedurę co w 1, z takim wyjątkiem, że jako matryca do PCR służył p85C.tub.

6. Konstruowanie V1Jns-85B (C2) (zawierającego Ag85B bez sekwencji sygnałowej) wykonano stosując poniższe startery:

sensowny 85B (C2) (Identyfikator Sekw. Nr 24)

GGAAGATCTACCATGGGCTTCTCCCGGCCGGGGCTGC antysensowny 85B (Identyfikator Sekw. Nr 21)

184 839

GGAAGATCEAACCTTCGGTTGATCCCGTCAGCC.

Stosowano tą samą procedurę co w 1, z takim wyjątkiem, że jako matryca do PCR służył p85B.tub, zaś klonowano do V1Jns.

7. Konstmowtnie VlJns-85C -C2) (zawi erającego Ag 8 5 C b85, s ekezencji sygnałowej) wykonano stosując następujące startery: sensowny 85C (C2) (Identyfikator Sekw. Nr 25)

GGAAGATCTACCATGGGCTTCTCTAGGCCCGGTCTTC aetyseesowny 85C (Identyfikator Sekw. Nr 23) GGAAGATCTTGCCGATGCTGGCTTGCTGGCTCAGGC.

Stosowano tą samą procedurę co w 1, z takim wyjątkiem, że jako matryca do PCR służył p85C.tub, zaś klonowano do V1Jns.

Po analizie restrykcyjnej, wszystkie konstrukcje częściowo sekweecjoeowano przez połączenia wektora. Preparowanie DNA na wielką skalę przeprowadzono jak to opisano (Montgomery i in., wyżej).

Konstrukcje plazmidowe charakteryzowano mapowaniem restrykcyjnym i analizą sekwencji połączeń wektor-wstawka (patrz. fig. 1-6). Wyniki były spójne z opublikowaną sekwencją M. tb. i pokazywały, żekodon startu był zachowany w całości dla każdego konstruktu (fig. 7). Pokazane są również różne dodatkowe aminokwasy nie spokrewnione z Ag85 M. tb, które wprowadzono w wyniku klonowania.

Przykład 5

Ekspresja białek M. tb. z plazmidów V1Jns.tPA

Komórki mięsaka wywodzącego się z mięśni prążkowanych (ATCC CCL 136) wysiano dzień przed użyciem w gęstości 1,2x10⁶ komórek na studzienkę 9,5 cm² w 6-studzieekowych płytkach hodowlanych w DMEM o wysokim stężeniu glukozy z 10% surowicą płodową cielęcą inaktywowaną ciepłem, 2 mM L-glutaminą, 25 mM HEPES, 50U/ml penicyliny i 50 pg/ml streptomycyny. (Wszystkie odczynniki z BRE-Gibco). Plazmidowy DNA, ekstrahowany fenolem:chlogofermem i oczyszczony na chlorku cezu, precypitowano fosforanem wapnia stosując odczynnik CellPhect (Pharmacia) według instrukcji producenta, z takim wyjątkiem, że stosowano 5-15 pg na każdą 9,5 cm2 studzienkę komórek RD. Hodowle poddano wstrząsowi glicerynowemu w sześć godzin po dodaniu precypitatu fosforanu wapnia-DNA; po odżywieniu komórki lekubowaeo przez dwa dni do momentu zbierania.

Lizaty transfekowanych komórek wytworzono w 1x RIPA (0,5% SDS, 1,0% Triton Χ-100, 1% dezoksycholan sodu, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 25 mM TRIS-HCl pH 7,4) z dodatkiem 1 pM leupeptyny, 1 pM pepstatyny, 300 nM aprotyniny i 10 pM TLCK i sonikowano krótko w celu zmniejszenia lepkości. Lizaty rozdzielono przez elektroforezę na 10% żelach Tricine (Novex) i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe. Immunobloty poddano działaniu przeciwciał monoklonalnych przeciwko M. tb. 17/4 i 32/15 (Huygen i in., 1994, Infect. Immunity 62, 363) i wywoływano zestawem do wykrywania ECL (Amersham).

Ekspresję kompleksu genów antygenu 85 M. tb. wykazano przez przejściową ekspresję w komórkach RD. Lizaty transfekowanych albo pozornie transfekowanych komórek frakcjonowano przez SDS-PAGE i analizowano metodą immunologiczną. Fig. 8 pokazuje, że komórki RD traesfekowaee V1Jns.tPA-85A(Cł), V1Jns.tPA-85A(C2), V1Jns.tPA85A(C3) i V1Jns.tPA-85B (C1) ekspresjonują immunoaktywne białko o ciężarze cząsteczkowym rzędu 30-32 kDa.

Przykład 6

Immunizacja przy użyciu PNV i ekspresja białek antygenu 85 in vivo

5-6 tygodniowe samice myszy BALB/c i C57BL/6 znieczulono przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) mieszaniny 5 mg chlorowodorku ketaminy (Ayeco, Fort Dodge, IA) i 0,5 mg ksylazyny (Mobley Corp., Shawnee, KS) w roztworze soli. Tylne łapy umyto 70% etanolem. Zwierzętom wstrzyknięto trzykrotnie po 100 pl DNA (2 mg/ml) zawieszonego w roztworze soli: po 50 pg na łapę. W 17-18 dni po immunizacji, zebrano próbki surowicy i analizowano pod kątem obecności przeciwciał przeciwko Ag85. Fig. 9 pokazuje aktywność właściwą immueoblotów surowic od myszy, którym wstrzyknięto DNA Ag85 (Cl), ale nie od myszy

184 839 otrzymujących kontrolny DNA nie zawierający wstawki genu (V1J). Reaktywność wykrywano w rozcieńczeniach co najmniej 1:160 wobec 300 ng oczyszczonego antygenu 85A (fig. 9b). Pokazuje to, że wstrzyknięcie DNA Ag85 powoduje ekspresję Ag85 in vivo w taki sposób, że wywołał on powstanie odpowiedzi przeciwciał u myszy BALB/c jak i C57BL/6.

Przykład 7

Odpowiedź limfocytów T swoista wobec antygenu 85

Splenocyty od szczepionych myszy analizowano pod kątem wydzielania cytokin w odpowiedzi na ponowną stymulację swoistym antygenem, jak to opisano w Huygen i in., 1992 (Infect. Immunity 60, 2880). Konkretnie, splenocyty inkubowano z białkami przesączu z hodowli (CF) BCG M. bovis oczyszczonym antygenem 85A albo z 20-merowym peptydem (p25) odpowiadającym znanemu epitopowi limfocytów T dla myszy C57BL/6 (aminokwasy 241-260). Myszy immunizowano przy użyciu V1Jns.tPA85A (C1) (100 μg) trzykrotnie w odstępach trzytygodniowych i analizowano 17 dni po ostatnim wstrzyknięciu. Cytokiny badano stosując test biologiczny na IL-2, interferon-γ (IFN-γ) i IL-6 oraz testem ELISA na IL-4 i IL-10. Istotne wytwarzanie IL-2 i IFN-γ obserwowano u myszy BALB/c jak i C57BL/6 szczepionych V1Jns.tPA85A (C1) (fig. 10-13). Ponadto, myszy C57BL/6 reagowały również na epitop limfocytów T rozpoznawany w kontekście H-2^b (fig. 13). Poziomy IL-4, IL-6 i IL-10 nie były podwyższone u myszy szczepionych V1Jns.tPA85A (fig. 14-16). Wyniki te wskazują, że odpowiedź limfocytów T pomocniczych typu Th1 była wywoływana przez szczepionkę DNA.

Przykład 8

Ochrona przed ekspozycją na Mykobakterie

W celu zbadania skuteczności szczepionki DNA M. tb, myszy eksponowano przez dożylne wstrzyknięcie żywych BCG M. bovis (0,5 mg) i badano namnażanie BCG w śledzionach i płucach. Jako kontrola, mierzono namnażanie BCG u naiwnych myszy (zakażenie pierwotne) i myszy szczepionych BCG w dniach szczepienia szczepionką DNA (zakażenie wtórne). Liczba jednostek tworzących kolonie (CFU) w płucach myszy szczepionych VlJns.tPA85A (C1) była istotnie niższa w porównaniu z myszami zakażonymi pierwotnie albo myszami szczepionymi kontrolnym dNa V1J. U myszy C57BL/6, liczba CFU była zmniejszona o 83% w 8 dni po ekspozycji (fig. 17), zaś u myszy BALB/c liczba CFU była zmniejszona o 65% w dniu 20 (fig. 18). W śledzionach liczba CFU była zmniejszona o około 40% w dniu 20 po ekspozycji myszy BALB/c (fig. 19) i w dniu 8 u myszy C57BL/6 (fig. 20). Stąd, odpowiedź odpornościowa obserwowana po wstrzyknięciu szczepionki DNA M. tb. zapewnia ochronę w modelu ekspozycji na żywe M. bovis.

184 839

184 839

FIG.1

184 839

FIG.3

184 839

FIG.5

184 839

FIG.6

184 839

85Α Cl

GTCACCGTCCTTGAGATCACtATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT Het Asp Αία Het Lys Arg jjiy Ley Cyg Cys ¥a_l Ley Leu Leu Cys

GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GAG ATC TTT TCC CGG CCG GGC TTG CCG GTG GAG TAC Gly Ala Vol Phe Vgl|Ser Rcp.Sęr.JGJw.I J^e Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Vol Glu Tyr tPA sig.seq. tPA NH2 ter AG 85 ngture protein (NH2-ter) sekwencja sygnałowa tPA koniec tPA dojrzałe białko AG 85 (koniec m )

85A C2

GTCACCGTCCTTGAGATCTACC ATG GGC TTT TCC CGG CCG GGC TTG CCG GTG GAG TAC

Bgl II fet.Łly PheSec.Arg.PcoŁjyLeyPre Yftj Glu.,Tyr

85A C3

CTGCAGTCACCGTCCTTGAGATCTACBTG GCA CAG CTT GTT GAC AGG GTT CGT Het Alg Gln Leu Vgl Asp Arg Vgl Arg

GGC GCC GTC ACG GGT ATG TCG CGT CGA CTC GTG GTC GGG GCC GTC GGC GCG GCC CTA GTG Gly Ala Vgl Thr Gly Het Ser Arg Arg Leu Vgl Val Gly Alg Vgl Gly Alg Alg Leu Vgl

TCG GGT CTG GTC GGC GGC GTC GGT GGC ACG GCG ACC GCG CGG GCA TTT TCC CGG CCG CGC Ser Gly Leu Vgl Gly Alg Vgl Gly Gly Thr Alg Thr Alg Gly Al<J Phe Ser Aro Pre Gly

85B Cl

CTGęADTCACCGTCCTTGAGATCACCATG GAT GCA ĄTG ĄĄG AGĄ GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG

Het Asp Alg Het Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vg_l Leu Leu

CTG TGT GGA CCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GAG ATC TCC TTC TCC CGG CCG

Leu Cys Gly Alg Vq l Phe Vgl|Ser Pro Ser GLu I le Ser Phe Ser Arg Pro

85C Cl

CTGCAGTCACCGTCCTTGAGATCACC ATG GAT GCA ATG ĄĄG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG Het Asp Alg Het Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vel Leu Leu

CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GAG ATC TCC TTC TCT AGG CCC Leu Cys Gly Alg Vg l Phe Vg l|Ser Pr o $er G l u 11 ę Ser Phe Ser Aro Pro

FIG.7

184 839

Ag85A Ag 858

Cl C2 C3 Cl

SPSPSP SP

FIG. 8

S=SUPERNATANT ffedsącz P= PELLET Osad <__/

184 839 r-t

BALB/C

B6

kD

BCG

FIG.9A

184 839

FIG.9B

184 839

Ε

ο.

Ο Φ

C C C XI <Ο Φ

Ε «α

I ο

V1J-ns-tPA Ag85A-tPA

D CONIROL ^CF Ag85A

FIG.10

Kontrola

E 40000-1 ii 30000H bw cm 20000-1 i o 10000

V1J-ns-tPA Ag85A-tPA PLASMID DNA □ C0NTR0L Kontrola ^CF Ag85A

Hlp25(AA 241-260)

DNA plazmidowy

FłG.11

184 839

v1J-ns-tPA Ag85A- tPA

PLASMID DNA

Kontrola

DNA plazmidowy

FIG.12

DNA plazmidowy □ CONTROL i W Ag85A E3p25(M 241

FIG. 13 ontrola

-260)

184 839

IL-6 pg/ml IL—4 pg/ml

FIG. 14 □ CONTROL Kontrola ggcF Ag85A ^PWM

FIG.15 □ CONTROL Kont ^BCG Ag85A ^PHA

184 839

I | | | νΐJ-ns-tPA Ag85A-tPA vlJ-ns-tPA Ag85A-tPA BALB/c C57BL/6

FIG. 16 □ CONTROL Kontrol Ag85A ^PWM

184 839

DAY 8 DAY 20 DAY 29

V1J—ns—tpa Cl (85A-tpa)

--O-- BCG prim. pierwotny BCG S6C. wtórny

400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0

Dzień δ Dzień 20 Dzień 29

DAYS AFTER BCG INOCULATION

Dni po zakażeniu BCG

FIG.17

Dzień S Dzień 20 Dzień 29

FIG. 18

V1J-ns-tpa . -Cl (85A-tpa)

-O-BCG prim. pierwotny -Δτ- BCG sec. ^wtórny

DAYS AFTER BCG INOCULATION

Dni po zakażeniu BCG

184 839

1000000

900000

800000

700000

600000

500000

400000

300000

200000Η

100000 ο

~Ο- V1

Cl

BCGP prim. pierwotny ' GCG S6C. wtórny

DAY 8 DAY 20 DAY 29

Dzień 8 Dzień 20 Dzień 29

DAYS AFTER BCG INOCULATION

Dni po zakażeniu BCG

FIG. 19

Dzień 8 dzień 20 Dzień 29

DAYS AFTER BCG INOCULATION

FIG.20

prim. pierwotny S6C. wtórny

Dni po zakażeniu BCG

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Szczepionka DNA, zawierająca polinukleotyd do immunizacji i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, która wywołuje po wprowadzeniu do tkanki kręgowca jedną lub wiele odpowiedzi odpornościowych przeciwko Mykobakteriom, wybranych z grupy obejmującej przeciwciała, CTL, odpowiedź limfocytów T pomocniczych i ochronnych odpowiedzi odpornościowych, znamienna tym, że polinukleotyd obejmuje jeden lub wiele genów kodujących jeden lub wiele białek Mykobakterii albo ich funkcjonalnych równoważników, z grupy obejmującej antygen 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równoważniki, połączonych funkcjonalnie z promotorami transkrypcyjnymi.
2. 2. Szczepionka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że gen koduje białko Mycobacterium tuberculosis i jego funkcjonalne równoważniki, z grupy antygenu 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równoważniki.
3. 3. Szczepionka DNA według zastrz. 2, znamienna tym, że gen koduje białko wybrane z grupy obejmującej antygen 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równoważniki.
4. 4. Zastosowanie polinukleotydu obejmującego jeden lub wiele genów kodujących jeden lub wiele białek Mykobakterii albo ich funkcjonalnych równoważników, z grupy antygenu 85A, 85B i/lub 85C oraz ich funkcjonalne równoważniki, połączonych funkcjonalnie z promotorami transkrypcyjnymi, do wytwarzania szczepionki do wywołania odpowiedzi odpornościowej u kręgowca przeciwko epitopom Mykobakterii.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że gen koduje białko Mycobacterium tuberculosis i jego funkcjonalne równoważniki.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że gen koduje białko wybrane z grupy obejmującej antygen 85A, B i/lub C oraz ich funkcjonalne równoważniki.
7. 7. Szczepionka DNA, zawierająca polinukleotyd i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną obejmuje polinukleotyd obejmujący:

   a) eukariotyczny promotor transkrypcyjny;

   b) otwartą ramkę odczytu połączoną funkcjonalnie z promotorem, kodującą jeden lub wiele epitopów mykobakterii i sygnał przerwania translacji; i

   c) ewentualnie jeden lub wiele DRES połączonych funkcjonalnie, jedną lub wiele ramek odczytu kodujących jeden lub wiele dodatkowych genów, oraz jeden lub wiele sygnałów przerywających transkrypcję.
8. 8. Szczepionka DNA według zastrz. 7, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera dodatkowe geny z punktu c) które są genami immunomodulującymi albo immunostymulującymi wybranymi z grupy obejmującej GM-CSF, IL-12, interferon i członków rodziny B7 białek kostymulujących limfocyty T.
9. 9. Szczepionka DNA według zastrz. 7, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera gen mykobakteryjny z punktu a) który koduje białko Mycobacterium tuberculosis i jego funkcjonalne równoważniki.
10. 10. Szczepionka DNA według zastrz. 7, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera gen mykobakteryjny z punktu a) który koduje białko Mycobacterium tuberculosis wybrane z grupy obejmującej antygen 85A, B i/lub C oraz ich funkcjonalne równoważniki.
11. 11. Szczepionka DNA według zastrz. 7, znamienna tym, że polinukleotyd zawiera dodatkowe geny z punktu c) które są genami Mycobacterium tuberculosis wybranymi z grupy obejmującej antygen 85A, B i/lub C oraz ich funkcjonalne równoważniki.

    * * *

    184 839