PL187209B1 - Immunogenna cząsteczka, zawierająca ją kompozycjafarmaceutyczna, ligand, sposób przygotowania cząsteczki immunogennej i jej zastosowanie - Google Patents

Abstract

1 . Immunogenna czasteczka, znamienna tym, ze zawiera (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17, o lacznie do 15 am inokwasów, produkow anego przez linie kom órkow a hybry- domy zdeponowana w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierajaca dalsze skladniki wiazania hapten-nosnik, lub jesli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dw a konce polaczone ze soba przez dwie dodatkowe reszty cysteinow e tw orzace mostek dwu- siarczkowy lub usieciowane chemicznie, lub jesli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujacy sie na koncu karbok- sylowym zablokowany w postaci am idowanej i/lub aminokwas na aminowym koncu zablokowany w postaci acetylowanej, lub ew entualnie jest flanko- wany grupa lub dwiema grupami pom ocniczym i i/lub ma dodatkowa grupe sprzegajaca, (b) czastke, która wywoluje odpow iedz immunologiczna przeciw peptydowi BSW17, przy czym skladnik (a) je st inny niz Lys-Thr-Lys-Gly- -Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe. 8 Kompozycja farm akologiczna zawierajaca adjuwant, znam ienna tym , ze zawiera czasteczke immunogenna, zaw ierajaca (a) co najmniej. 9 Ligand zawierajacy dom ene przeciwciala otrzymana przez immunizowanie czasteczka, znamienny tym, ze czasteczka je st czasteczka. 11 Sposób przygotowywania czasteczki immunogennej okreslonej w zastrz 1, znamienny tym, ze bezposrednio sprzega sie kow alencyjnie 12. Zastosowanie czasteczki immunogennej zawierajacej (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW 17 o lacznie do 15 ami- nokwasów, produkowanego przez linie kom órkow a hybrydomy zdeponowana w ECACC za numerem depozytow ym 96121916, ew entualnie zawierajacej dalsze skladniki wiazania hapten-nosnik, lub jesli peptyd mimotopowy BSW17 je st cykliczny, to ma ewentualnie dwa konce polaczone ze soba przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tw orzace mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie, lub jesli mimotop peptydowy BSW 17 je st liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujacy sie na koncu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub am inokwas na aminowym koncu zablokowany w postaci acetylow anej, lub ew entualnie je s t flankow any grupa lub dw iem a grupam i pom ocniczym i i/lub m a dod atk o w a grupe sp rzeg ajaca, (b) czastke, która wywoluje odpow iedz immunologiczna przeciw peptydowi BSW17, przy czym skladnik (a) je st inny niz Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe- -Phe-Val-Phe, do otrzymywania leku do leczenia alergii i atopowego zapalenia skóry 13 Zastosowanie czasteczki immunogennej zawierajacej (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW 17 o lacznie do 15 am i- nokwasów, ewentualnie zawierajacej dalsze skladniki wiazania hapten-nosnik, lub jesli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa konce polaczone ze soba przez dw ie dodatkowe reszty cysternowe tworzace mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie, lub jesli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujacy sie na koncu karboksylowym zablokow any w postaci am idowanej i/lub amino- kwas na aminowym koncu zablokow any w postaci acetylowanej, lub ewentualnie jest flankowany grupa lub dwiema grupami pomocniczym i i/lub ma dodatkowa grupe sprzegajaca, (b) czastke, która wywoluje odpowiedz immunologiczna przeciw peptydowi B S W 17, przy czym skladnik (a) je st inny niz Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe do otrzymywania szczepionki przeciwko uczuleniom. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest immunogenna cząsteczka zawierająca co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17, kompozycja farmaceutyczna zawierająca adjuwant i immunogenną cząsteczkę, ligand zawierający domenę przeciwciała otrzymaną przez immunizowanie immunogenną cząsteczką, sposób przygotowania cząsteczki immunogennej oraz zastosowanie cząsteczki immunogennej do otrzymywania leku do leczenia alergii i atopowego zapalenia skóry lub do otrzymywania szczepionki przeciwko uczuleniom. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy hamowania oddziaływań, które mogłyby normalnie spowodować wyzwolenie reakcji komórek tucznych i bazofili indukowanych przez związaną z komórką IgE połączoną z alergenem, prowadzącej do uwolnienia farmaceutycznie aktywnych mediatorów, jak również syntezę de novo cytokin biorących udział w regulacji reakcji uczuleniowych i zapalnych.

Objawy uczulenia wywołane są uwolnieniem z komórek do otaczających je tkanek i struktur naczyniowych farmakologicznie aktywnych mediatorów, w znacznej mierze histaminy, leukotrienów i enzymów. Mediatory te są zazwyczaj gromadzone lub syntetyzowane de novo w wyspecjalizowanych komórkach takich jak komórki tuczne czy bazofilne granulocyty. Komórki tuczne są rozproszone w tkankach zwierząt, podczas gdy bazofile krążą w układzie naczyniowym. Komórki te syntetyzują i przechowują mediatory tak długo póki nie zajdzie specjalna sekwencja zdarzeń uruchamiająca ich uwolnienie.

Dobrze znana jest funkcja przeciwciał będących immunoglobulinami E (IgE) w pośredniczeniu w reakcji uczuleniowej. IgE jest kompleksem odpowiednio względem siebie ułożonych łańcuchów polipeptydowych, który podobnie jak u innych immunoglobulin zbudowany jest z dwóch łańcuchów lekkich i dwóch ciężkich połączonych ze sobą mostkami dwusiarczkowymi i przyjmujących kształt litery „Y”. Każdy z lekkich łańcuchów ma dwie domeny, jedną zmienną (Vl) połączoną z domeną o względnie niezmiennej sekwencji aminokwasowej nazywanej domeną stalą (Cl). Przeciwnie łańcuchy ciężkie posiadają jedną domenę zmienną (Vh) i w przypadku IgE cztery domeny stałe (Ch1, Ch2, Ch3, Ch4 znane również jako Ce1, Ce2, Ce3, Ce4). Za wiązanie antygenu odpowiedzialne są „ramiona” przeciwciała, w obszarze tym występują regiony, w których struktura polipeptydu jest zmienna, nazywane są one fragmentami F'ab lub F(ab')2 co obrazuje dwa ramiona Fab' połączone ze sobą mostkami dwusiarczkowymi. „Ogon” lub centralna oś przeciwciała zawiera niezmienne lub stałe sekwencje peptydów i nazywany jest fragmentem Fc. Fragment Fc zawiera miejsca, które umożliwiają przeciwciału, przez wiązanie z receptorem Fc, komunikowanie się z innymi cząsteczkami lub komórkami układu immunologicznego.

Receptory Fc są cząsteczkami wiążącymi się specyficznie z miejscami aktywnymi w obrębie regionu Fc immunoglobuliny. Receptory Fc mogą występować jako integralne białka błonowe zlokalizowane w obrębie zewnętrznej błony plazmatycznej lub jako wolne „rozpuszczalne” cząsteczki swobodnie krążące w surowicy krwi lub innych płynach ciała. U człowieka wysokie powinowactwo wiązania IgE z receptorem FesRI jest związane ze złożonym oddziaływaniem białko-białko, w którym udział biorą różne części trzeciego regionu stałego łańcucha ciężkiego (Cs3) przeciwciała IgE i centralnej, błonowej domeny typu immunoglobulinowego (a2) podjednostki FcsRIa.

187 209

Mimo, że reszty aminokwasowe z domeny Cs3 rejonu stałego ciężkiego łańcucha IgE i obszar należący do domeny α2 receptora FcsRIa zidentyfikowano jako ważne dla wiązania łańcuchów to jednak dokładny mechanizm tego procesu jest nadal niejasny. Dane doświadczalne dostarczone przez pomiar fluorescencyjnego przeniesienia energii jak również analiza promieniowania rentgenowskiego i neutronowego rozpraszania wykazały, że ludzka IgE przyjmuje wygiętą strukturę, co jak się spekuluje, wspomaga wyjątkowo wysokie powinowactwo IgE do FcsRI (Kd « 10'¹⁰ M). Co więcej postuluje się, że taka wygięta struktura cząsteczki jest odpowiedzialna za tworzenie równomolowego kompleksu pomiędzy IgE a związanym z komórką lub rozpuszczonym FcsRIa, choć również cząsteczka IgE będzie dostarczała identycznych epitopów wiązania receptora w dwóch domenach Cs3. Ta jedńowartościowość jest funkcjonalnie konieczna jeśli pominięte ma być uruchomienie reakcji w nieobecności alergenu (fig. 1). Oddziaływujące obszary zależnie od ich funkcji mogą już być odsłonięte, a tym samym zdolne do wiązania receptorów komórkowych. Alternatywnie, mogą być ukryte do momentu gdy przeciwciało zwiąże się z antygenem w konsekwencji zmieniając strukturę przeciwciała, a w szczególności odsłonić miejsca aktywne, które następnie mogą wyzwalać specyficzną reakcję immunologiczną. W oparciu o dane z analizy obrazu dichroizmu kołowego zaproponowano, że za równomolowe (1:1) wiązanie kompleksu Fce/FcsRI z powierzchnią komórki odpowiada zmiana struktury Cs3 po związaniu receptora.

Aby wystąpiło uczuleniowe (immunologiczne) uwolnienie w organizmie histaminy z komórek tucznych i bazofili, cząsteczki IgE muszą zaadsorbować się lub związać swoim obszarem Fc z rejonem Fc receptora komórkowego tym samym umocowując cząsteczkę IgE na komórkach tucznych lub bazofilach. Części Fab' związanych z komórką cząsteczek IgE muszą być usieciowane przez szczególny dopasowany antygen (alergen). Gdy dochodzi do takich oddziaływań komórka tuczna lub bazofil automatycznie wyzwalają proces uwalniania histaminy do lokalnego środowiska, wywołując dobrze znane objawy uczuleniowe. Inne biochemiczne reakcje następują w późnej fazie reakcji czego efektem jest synteza de novo i uwalnianie cytokin i innych mediatorów [Ravetch, J.V. i J.P. Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492],

Klasyczne podejście do leczenia alergii obejmujące ogólnoustrojową terapię preparatami antyhistaminowymi, lub steroidami, lub próby odczulenia pacjenta nie są skierowane na podstawowe oddziaływanie IgE-komórka tuczna/bazofil. Inne podejście skupia się na wytwarzaniu polipeptydów zdolnych do blokowania, na powierzchni komórki, wiązania przeciwciała IgE z receptorem Fc i zastąpienia przeciwciała IgE w miejscu jego wiązania gdy już IgE zostało związane. Co więcej, prowadzono badania celem określenia natury hipotetycznego, zlokalizowanego w obrębie obszaru Fc w IgE, miejsca „efektorowego”, odnośnie którego spekuluje się, że wytwarza sygnał immunologiczny wyzwalający uwalnianie mediatorów przez komórki tuczne i bazofile.

Pokazano również, że skuteczne jest stosowanie zrekombinowanych fragmentów IgE jako immunogenów do wytworzenia ochronnych szczepionek z anty-IgE. Podstawowym argumentem przeciw takim szczepionkom jest obawa, że używając do immunizacji dużych fragmentów IgE można wywołać nie tylko wytwarzanie hamujących przeciwciał, lecz również spowodować powstanie usieciowania, a w konsekwencji przeciwciał anafilaktycznych u pacjenta (fig. 2).

Strategia przezwyciężenia tego problemu stawia za cel identyfikację możliwie najmniejszego fragmentu IgE, najlepiej zawierającego jedynie miejsce wiązania receptora, który byłby maskowany w kompleksie IgE/FceRI po związaniu się z nim, a tym samym niedostępny dla usieciowania przez odpowiedź immunologiczną wytworzoną przez szczepionkę. Próby zrekonstruowania takiej złożonej cząsteczki wydają się rokować małe szansę sukcesu z uwagi na znaczną odległość pomiędzy różnymi obszarami Cs3 zaangażowanymi w oddziaływania IgE/FceRI.

Obecnie stwierdzono, że problemy nierozerwalnie związane z „klasycznym” podejściem do szczepionki można przezwyciężyć przez zastosowanie w aktywnej immunizacji mimotopów BSW17, zarówno jako chemicznie syntetyzowanych peptydów związanych z odpowiednim nośnikiem i zrekombinowanych konstruktów fuzyjnych (np. z owalbuminą, IgG, itp.).

187 209 (A) , (Sekw. id.rn i) (B) , (Sekw. id. wr 2), (C) , ((ekwS ed.

(D) , (SekwS ed.

(E) , (SekwS id. rn 5), (G), (Sekw , id , rr 7), (Ή), (Sckm, id . nr 8), (I) , (Sekw. id . nr 9), (F) (Sekw. id . nr 6), (J) , (Sekw . id . nr 10), (K) , (Sekw. ek. nrd 1) (L) , (S)kw. id. nrl 2( (M) , (Skkw. id. nrl 3) (N) , (Sekw. iw Nr 14, .

nr 3), nr 4) ,

Przedmiotem wynalazku jest immunogenna cząsteczka, która zawiera:

(a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17, o łącznie do 15 aminokwasów, produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierająca dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą;

(b) cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BSW17, przy czym składnik (a) jest inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe.

Korzystnie cząsteczka że jest w postaci polimerowego peptydu lub zrekombinowanego białka fuzyjnego, gdzie jeden monomerowy składnik polimerowego peptydu lub jeden składnik białka fuzyjnego stanowi fragment mimotopu peptydowego BSW17, a druga część polimerowego peptydu lub białka fuzyjnego stanowi cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BSW17.

Cząsteczka według wynalazku jest korzystnie w postaci koniugatu peptydu mimotopowego BSW17 z nośnikiem immunogennym.

Korzystnie fragment mimotopu peptydowego BSW17 jest zbudowany z, lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z:

Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-T rp-V al

Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val

Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp

V al-Asn-Leu-Thr-T rp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly

Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly

Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu

Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu

Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val

Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu

V al-T rp-Thr-Ala-Cys-Gly-T yr-Gly-Arg-Met

Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser

Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-T yr-Trp

Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly

Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg

Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O), (Sekw. id. nr 15),

Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P), (Sekw. id. nr 16) oraz

Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q), (Sekw. id. m 1 7).

W korzystnym rozwiązaniu fragment mimotopu peptydowego BSW17 (a) ma sekwencję aminokwasową Gly-Glu-Phe-Cys-He-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (Sekw. id. nr 27) i jest cykliczny, a mianowicie jest to peptyd Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Yal (A) z dwoma końcami związanymi ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy, i zawiera dalsze składniki Gly-Glu-Phe- i -Gly-Asp-Pro-Ala wiązania hapten-nośnik.

Innym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmakologiczna zawierająca adjuwant i zawiera cząsteczkę immunogenną, zawierającą (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17 o łącznie do 15 aminokwasów, produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierającą dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym

187 209 zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą; (b) cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BSW17, przy czym składnik (a) jest inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-V al -Phe.

Przedmiotem wynalazku jest również Ugand zawierający domenę przeciwciała otrzymaną przez immunizowanie cząsteczką peptydu mimotopowego BSW17 o łącznie do 15 aminokwasów, produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierającą dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą; inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe, gdzie domena przeciwciała jest również reaktywna wobec sekwencji aminokwasowej ciężkiego łańcucha IgE zawierającego naturalny epitop rozpoznawany przez BSW17. Korzystnie ligand według wynalazku jest w postaci przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu Fab' lub F(ab')2Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowywania cząsteczki immunogennej według wynalazku, w którym bezpośrednio sprzęga się kowalencyjnie (a) fragment mimotopu peptydowego BSW17 produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, z (b) częścią zdolną do wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw peptydowi BSW17, stosując bis-N-sukcynimi-dylowe pochodne lub korzystnie bis(sulfosukcynimidylo)suberan (BSS) lub glutaraldehyd lub karbodiimid, korzystniej dicykloheksylo-karbodiimid (DC) lub 1-etylo-3-(3-dimetyloamino-propylo)karbodiimid jako środek sprzęgający.

Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cząsteczki immunogennej zawierającej (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17 o łącznie do 15 aminokwasów, produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierającej dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą;

(b) cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BSW17, przy czym składnik (a) jest inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe, do otrzymywania leku do leczenia alergii i atopowego zapalenia skóry albo do otrzymywania szczepionki przeciwko uczuleniom.

Fragment mimotopu peptydowego BSW17 o łącznie do 15 aminokwasów, np. jedna z sekwencji (A) do (Q) (Sekw. id. nr 1 do nr 17) w immunogennej cząsteczce według wynalazku korzystnie zawiera do pięciu, korzystnie jeden lub dwa zwłaszcza jeden rodzaj mimotopowego peptydu BSW17. Składnik (b) korzystnie jest tradycyjnym nośnikiem immunogennym, jakie omówiono poniżej, zwłaszcza BSA lub KHL.

Fragment mimotopu peptydowego BSW17 np. korzystnie przedstawione poniżej cząsteczki (A) do (Q), korzystniej (A), (D) i (G) a szczególnie (A) i (D), mogą być otoczone w immunogenach przez kilka, korzystnie jedną lub dwie dodatkowe grupy pomocnicze takie jak acetylowa, cysteiny lub lizyny, i/lub dodatkowe grupy sprzęgające takie jak DC lub BSS np. jakie opisano dla specyficznych immunogenów według wynalazku i załączono poniżej w przykładzie 8 jako koniugaty (2) do (4), (6) do (11), (13) i (14).

BSW17 jest monoklonalnym przeciwciałem rozpoznającym epitop konformacyjny w Fce wraz z jego końcową częścią zlokalizowaną w Ce3 Linia komórkowa hybrydomy produkującej

187 209 przeciwciała monoklonalne BSW17 została złożona w ECACC, 19 grudnia 1996 roku z klauzulą Traktatu Budapeszteńskiego o depozycie mikroorganizmów, pod numerem depozytowym 96121916. Jak podsumowano na fig. 3, przeciwciało to ujawnia interesujący zestaw aktywności biologicznych. BSW17 lub BSW17-podobne przeciwciała krążą ^w układzie naczyniowym chroniąc przed reakcjami alergicznymi przez hamowanie aktywacji komórek tucznych i bazofili przez kompetycyjne hamowanie oddziaływania IgE/IgERI i obniżenie poziomu IgE w surowicy przez regulację w dół szlaku syntezy IgE na poziomie limfocytów B.

Mimotopowe peptydy BSW17 są obecnie identyfikowane przez przeszukiwanie fagowej biblioteki ekspresyjnej losowych peptydów, np. peptydów które naśladują co najmniej część złożonego epitopu konformacyjnego zlokalizowanego na cząsteczce IgE. Chemicznie syntetyzowane mimotopowe peptydy związane z immunogennym nośnikiem białkowym mogą być użyte np. jako szczepionki w celu specyficznego wytworzenia przeciwciał u uczulonego gospodarza, hamujących wzbudzenie komórek tucznycH/bazofili przez blokowanie wiązania IgE/ FcsRIa i/lub syntezy IgE. Jako mimotopy przeciwciał anty-IgG indukują one odpowiedź immunologiczną której efektem jest wytwarzanie u gospodarzy przeciwciał podobnych do BSW17. Ponieważ pokazano, że BSW17 jest nie wywołującym reakcji anafilaktycznej inhibitorem wiązania IgE/ FcsRI i syntezy IgE w limfocytach B to przeciwciała te rozwinięte przeciw szczepionce opartej na mimotopie BSW17 posiadają analogiczne właściwości ochronne. Odpowiedź immunologiczna jest bardzo specyficzna bowiem w przeciwieństwie do „podejścia od strony klasycznej szczepionki”, nie ma tu fragmentów białka będących pochodnymi IgE, które mogłyby wywoływać sieciowanie przeciwciał u immunizowanego pacjenta (fig. 4).

Przeciwciała wytworzone przeciw immunogenom według wynalazku, w przeciwieństwie do przeciwciał wytwarzanych przez Hybrydomy BSW17, są endogennymi, a tym samym mogą być użyte profilaktycznie u pacjenta, człowieka.

Wynalazek dotyczy również ligandów np. przeciwciał lub fragmentów będących ich pochodnymi skierowanych przeciw mimotopowym peptydom BSW17 użytym w immunizacji biernej (patrz poniżej) przez przeciwciała lub fragmenty przeciwciał także rozpoznające naturalne epitopy BSW17 obecne na ludzkich IgE; mianowicie dotyczy to ligandów posiadających domeny przeciwciał specyficznych dla cząstek mimotopowycH peptydów BSW17 jak zdefiniowano powyżej, a sekwencja domeny przeciwciała reaguje również z sekwencją aminokwasową występującą w ciężkim łańcuchu IgE zawierającym naturalny epitop rozpoznawany przez BSW17. Taki ligand może być wytworzony u ssaków jako przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne; korzystnie gdy są w postaci przeciwciał monoklonalnych, korzystnie jeśli w postaci samych fragmentów Fab' lub F(ab')2.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowań immunogennycH cząsteczek zdefiniowanych powyżej do leczenia chorób zależnych od IgE, takich jak alergie i atopowe zapalenie skóry.

Wynalazek dotyczy również profilaktycznych lub leczniczych immunizacji przeciw chorobom zależnym od IgE, takim jak alergie i atopowe zapalenia skory.

Immunogeny według wynalazku chodź zasadniczo nie są zdolne do pośredniczenia w niecytologicznym uwolnieniu Histamin są zdolne wyeliminować przeciwciała o silnej serologicznej reaktywności krzyżowej posiadające docelową sekwencję aminokwasową obszaru Fc z IgE. Tak więc użyteczne są one same lub zastosowane jako szczepionka.

Pierwotna dawka immunogenu (np. od około 0,2 mg do około 5 mg, korzystnie około 1 mg) jest przykładowo podana domięśniowo po czym doszczepienie wykonuje się podając taką samą dawkę 14 do 28 dni później. Oczywiście dawka zależeć będzie od wieku, wagi i ogólnego stanu zdrowia pacjenta. Immunizacja może być „aktywna” lub „bierna”. W immunizacji „aktywnej” pacjent otrzymuje immunogen według wynalazku, a zatem odpowiedź anty HIgE jest aktywnie indukowana w układzie immunologicznym pacjenta.

„Bierną” immunizację uzyskuje się podając pacjentom dotkniętym chorobą zależną od IgE, korzystnie w formie zastrzyku, przeciwciała anty-mimotopowi BSW17, które mogą być przeciwciałami poliklonalnymi lub monoklonalnymi.

Przeciwciała poliklonalne przeciw mimotopowi BSW17 mogą być przygotowane przez podanie immunogenu według wynalazku, korzystnie stosując adjuwant, ssakowi nie będącemu człowiekiem i zebranie wytworzonej u ssaka surowicy odpornościowej. Wyższe miano surowicy

187 209 można uzyskać doszczepiając zwierzęta, po pewnym czasie. Nie ma szczególnego ograniczenia dotyczącego gatunku ssaków, który może być użyty w celu rozwinięcia przeciwciał; ogólnie korzystnym jest użycie królików lub świnek morskich lecz konie, koty, psy, kozy, świnie, bydło, owce itp. mogą również być użyte. W trakcie wytwarzania przeciwciał, w celu uzyskania zawiesiny, określona ilość immunogenu według wynalazku, który jest np. rozpuszczony w soli fizjologicznej do pożądanego stężenia, miesza się z kompletnym adjuwantem Freunda. Zawiesina jest podawana ssakom, np. śródotrzewnowo, np. królikowi, w ilości od około 50 do około 2500 pg na wstrzyknięcie immunogenu według wynalazku. Korzystnie jeśli, dla uzyskania immunizacji, zawiesina jest podawana co około dwa tygodnie przez 2-3 miesięcy, korzystnie przez około miesiąc. Po upływie 1 do 2 tygodni od ostatniej immunizacji przeciwciała są zbierane przez pobranie krwi immunizowanego zwierzęcia, jej odwirowanie i wyodrębnienie surowicy z krwi.

Monoklonalne przeciwciała przeciw mimotopowi BSW17 mogą być np. ludzkimi lub mysimi. Korzystnie jeśli pacjentowi poda się przygotowany fragment Fab' z mysich przeciwciał monoklonalnych lub, dla ograniczenia reakcji odpornościowej skierowanej przeciw obcej, zwierzęcej immunoglobulinie, chimerowe przeciwciało ludzko-mysie (zawierające ludzki region Fc i mysi region Fab'). Mysie przeciwciało monoklonalne może być przygotowane zgodnie z metodą Kohlera i Milsteina (Kohler, G. i Milstein, C., Naturę 256 [1975] 495), np. fuzja komórek śledziony hiperimmunizowanych myszy z komórkami odpowiedniej linii komórkowej mysiego szpiczaka. W celu rozwinięcia ludzkich przeciwciał monoklonalnych można zastosować szereg metod w tym wytwarzanie ich przez:

(1) limfocyty B transformowane wirusem Epsteina-Barra;

(2) hybrydyzację linii komórkowych z limfocytami B;

(3) hybrydomy ludzko-mysie;

(4) hybrydomy ludzko-ludzkie;

(5) heterohybrydomy człowiek x człowiek-mysz oraz (6) klonowanie zestawu (ekspresja w wektorach fagowych).

Najkorzystniejszymi są heterohybrydomy człowiek x człowiek-mysz łączące korzystne cechy rodzicielskich komórek mysich i ludzkich. Linie komórkowe heterohybrydom człowiek-mysz mogą być użyteczne do fuzji z limfocytami B.

W celu immunizacji przeciwciała mogą być wprowadzane do gospodarza najbardziej klasycznie przez zastrzyk domięśniowy. Zastosowany może być dowolny tradycyjny nośnik płynny lub stały akceptowany przez gospodarza i nie powodujący odpornościowych efektów ubocznych wpływających na gospodarza, ani szkodliwych działań wobec szczepionki. Jako nośnik może być użyty tylko roztwór soli buforowany fosforanem (PBS) o fizjologicznym pH np. około 6,8 do 7,2, korzystnie około pH 7,0, lub z odpowiednim adjuwantem, taki adjuwant oparty na wodorotlenku glinu. Ilość immunogennego antygenu w zastrzyku może wahać się od około 50 pg do około 500 pg korzystnie od około 200 pg do około 300 pg w objętości rozpuszczalnika od około 0,25 ml do około 1 ml, korzystnie 0,5 ml. Po pierwszym wstrzyknięciu wymagane będą wielokrotne dostrzykiwania, które mogą być dokonane np. w rocznych odstępach czasu.

Uznano, że „aktywna” immunizacja jest korzystną dla człowieka, lecz również inne ssaki mogą być traktowane w podobny sposób, a mianowicie stosując analogi miotopów odpowiadające IgE innych zwierząt takich jak np. pies. Określenie „nośnik immunogenny” obejmuje tu taki materiał, który posiada zdolność samodzielnego wywoływania odpowiedzi immunologicznej w gospodarzu będącym zwierzęciem, a który może być kowalencyjnie związany bezpośrednio z peptydem zarówno poprzez wiązanie peptydowe jak i estrowe powstające pomiędzy wolnymi grupami karboksylowymi, aminowymi lub hydroksylowymi występującymi w peptydzie i odpowiednimi grupami w immunogennym materiale nośnikowym lub alternatywnie przez wiązanie za pośrednictwem klasycznych bifunkcjonalnych grup sieciujących lub jako białko fuzyjne.

Przykłady takich nośników obejmują: albuminy takie jak BSA; globuliny; tyroglobuliny; hemoglobuliny; hemocjaniny (szczególnie hemocjaninę z czareczki (Patella sp.) - Keyhole Limpet Hemocyanin [KLH]) wydzielone z glist, np. ekstrakt z glisty lub ich oczyszczone produkty;

187 209 polilizyna, kwas poliglutaminowy; kopolimer lizyny i kwasu glutaminowego, kopolimer zawierający lizynę lub omitynę; itd. Obecnie szczepionki uzyskiwane są z wykorzystaniem jako immunogenicznego nośnika toksoidu błólinicy lub toksoidu tężyczki, toksoidy te mogą być również użyte w obecnym wynalazku. Szczególnie korzystne jest wykorzystanie w schemacie „aktywnej” immunizacji oczyszczonego białka pochodnej tuberkuliny (PPD), bowiem (1) samo ono nie indukuje odpowiedzi limfocytów T (np. jest „haptenem limfocytów T”) i zachowuje się jak pełen dojrzały antygen bowiem jest rozpoznawane przez limfocyty T i co za tym idzie; (2) wiadomo, że stanowi jeden z najpotężniejszych haptenowych „nośników” w sensie wiązania i prezentowania antygenu; i (3) może być zastosowane u człowieka bez dalszych badań.

Jako czynniki wiążące hapteny-nośniki, standardowo używane do przygotowania antygenów mogą być użyte np. czynniki zestawione powyżej lub w poniższych przykładach.

Stosowany w wynalazku proces wiązania składników (a) z cząstkami (b) może być dokonany w znany sposób. Tak więc przykładowo do bezpośredniego związania kowalencyjnego korzystne jest użycie jako czynników wiążących pochodnych bis-N-sukcynimidylu, korzystniej bis(sulfosukcynimidylo)suberynianu (BSS). W celu kowalencyjnego związania peptydów (a) z immunogennym nośnikiem (b) mogą również być użyte aldehyd glutarowy lub karbodiimid korzystniej dicykloheksylo-karbodiimid (DC) lub 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)-karbodiimid.

Ilość haptenu i czynnika wiążącego kompleks hapten-nośnik [np. składnik (a)] i nośnika [np. składnik (b)] może być łatwo oszacowana w tradycyjny sposób. Korzystnym jest, aby nośnik był użyty w ilości od około 1 do około 6 razy wagowo więcej, korzystniej od około 1 do około 5 razy wagowo więcej niż hapten i aby czynnik wiążący kompleks hapten-nośnik był użyty w ilości od około 5 do około 10 razy równoważników molowych haptenu. Po reakcji, do uzyskania żądanego, antygenu złożonego z kompleksu peptydu i nośnika, nośnik jest związany z haptenem poprzez czynnik wiążący. Uzyskiwany immunogen według wynalazku może być łatwo wyodrębniony przy pomocy tradycyjnych sposobów np. dializa, filtracja w żelu, frakcjonowanie przez wytrącanie itp.

Preparat wyjściowego materiału może być uzyskiwany klasycznymi sposobami. Odpowiednie peptydy, przeznaczone do użycia jako składnik (a) mogą np. być identyfikowane przez przeszukiwanie biblioteki ekspresyjnej losowych peptydów skonstruowanej na wektorze fagowym i bezpośrednio syntetyzowane np. w sposób tradycyjny na fazie stałej np. dla peptydów cyklicznych metoda fazy stałej wykorzystuje dobrze znaną procedurę, „F-moc” lub alternatywnie mogą być identyfikowane przy pomocy strategii peptydomimetycznej przeszukującej losowo syntetyzowane peptydy. Wynalazek został przedstawiony na rysunku na którym:

Figura 1 przedstawia oddziaływanie IgE z jej receptorem IgERI z wysokim powinowactwem

Figura 2 przedstawia „klasyczny” sposób otrzymywania szczepionki przeciw IgE

Figura 3 przedstawia schemat aktywności biologicznej BSW17

Figura 4 przedstawia leczenie oparte na mimotopie BSW17

Figura 5 przedstawia ujawniane przez fagi mimotopy BSW17 specyficznie rozpoznające BSW17

Figura 6 przedstawia ujawniane przez fagi mimotopy BSW17 hamujące wiązanie IgE/BSW17

Figura 7 przedstawia wiązanie peptydu mimotopowego BSW17 chemicznie zsyntetyzowanego z BSW17

Figura 8a przedstawia rozpoznawanie przez BWS17eyklieznego mimotopu BSW17 GEFCINHRGYWVCGDPA-KHL (BSS) koniugatu (SDS 236) i Fce(500-509)-KLH(BSS) koniugatu (SDS 237)

Figura 8b przedstawia rozpoznawanie koniugatów różnych mimotopów BSW17 przez BSW17

Figura 9a przedstawia specyficzne rozpoznawanie przez BSW17 koniugatów [BSA(DC)] mimotopu BSW17 i koniugatu [KLH(aldehyd glutarowy)] Fce (500-509)

Figura 9b przedstawia specyficzne rozpoznawanie koniugatów [KLH(DC); Lys] mimotopu BSW17 przez BSW17

187 209

Figura 10a przedstawia odpowiedź immunologiczną przeciw ludzkim IgE wywołaną u królika po immunizacji koniugatami (1) mimotopu BSW17

Figura 10b przedstawia odpowiedź immunologiczną przeciw ludzkim IgE wywołana u królika po immunizacji koniugatami (2) mimotopu BSW17

Figura 11 przedstawia miano otrzymanej w wyniku immunizacji królika surowicy zawierającej przeciwciała przeciw mimotopowi BSW17

Figura 12 przedstawia izotypową specyficzność odpowiedzi na anty ludzką IgE wywołanej u królików immunizowanych mimotopem BSW17

Figura 13 przedstawia kompetycję surowicy przeciw mimotopowi BSW17 z BSW17 o wiązanie IgE

Figura 14 przedstawia wiązanie oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciał przeciw mimotopowi BSW17 z hIgE

Figura 15 przedstawia badanie króliczych surowic przeciw mimotopowi BSW17 i oczyszczonych przez powinowactwo przeciwciał przeciw mimotopowi BSW17 po kątem zdolności wywoływania reakcji anafilaktycznej w ludzkich komórkach krwi:

- R2/0, R4/0: surowica królików R2 i R4 przed immunizacją szczepionką z mimotopu BSW17;

- R2/SDS214, R4/SDS213: surowica królików R2 i R4 65 dni po pierwotnej immunizacji;

- anty SDS213, anty SDS214: oczyszczone przez powinowactwo przeciwciała przeciw mimotopowi BSW17;

- R2/0 PC, R4/0 PC: wyzwalająca reakcję kontrola pozytywna (PC) w obecności surowicy królika

Stężenie próbek:

A = 0,1 pg przeciwciał przeciw mimotopowi BSW17 (lub równoważnik w pełnej surowicy królika) na ml

B = 1,0 pg przeciwciał przeciw mimotopowi BSW17 (lub równoważnik w pełnej surowicy królika) na ml

C = 5,0 pg przeciwciał przeciw mimotopowi BSW17 (lub równoważnik w pełnej surowicy królika) na ml

Objaśnienia:

Ac

AMS

BSA

BSS

BSW17 peptyd mimotopowy BSW17 cfu

DC

EBV

ELISA

FcsRI

FCS gam gar h

HEPES

HRP cee^^l iiarczan amonu albiminia z surowicy l^y^aUcecj bisetulfosιύrcynimidylo)subeΓaiian monoklonatae ]ρ^εεΝ^εϊι^ IgG s^rowm,, przeciw epi topowi CH3 natywnemu IgE (J. Knutti-Muller i wsp. [1986] 457-465; S^ies^ner i wsp. Int. Arch. A^gy Immunol. 105 [1994] 75) naśaadujący r^iaUraa^tre ephop h^<^'kłiijj g^E rozpoznawany przez monoklonalne przeciwciała przeciw ludzkim BSW17.

j8dnostki tworzenia kolonii dihekcytakarbodlimid wruis Epsielna-Barra oznaczeme immιmororbcyinε receptob i o wy/sokim powinowactwie z regtanem stałym IgE rielęca surówka ptadowa kozee przeciw mysim ^τζϊε preeciw króbczym iłudk^

N-2-hydrnksyetylpipeiyzyna-N’-2-kwas dano^l fonowy peroksydaza z chrzanu (=POX)

187 209

HSA

IgE

IPTG

KHL

Le27

LB-szalki peptyd mimotopowy

PBS

PEG

POX

PPD rh IL-3

RIA szalki RPMI1640

Pożywka SB sLt

TBS

VCS

Przykłady albumina z ludkiiej surowicy immunoglobuiina E

-D-tiogalaktocyd ήεηΌκ]ηηίη3 z czareczki monoklonaine przeciwciała hddzkim

IgE. (Allergy [1986], powyżej; Int. Arch. Allergy Immunol. [1994] powyżej) zzalki z pożywką Luna-Bertam peptyd któty naśiaduie ρ^^ϊϊκ^ konfoemacyjargo epitopu cząsteczki przeciwciała π^νζόζ ooii b^fftrπwvary_>' Oofforanηm giiko 1 polietyianowy perokyydaza z c-bzzami (=HRP) oczyzzczonz Hakko , ]^(^)ch(d^na ^π^Πην zrekombinowίasa hidzka inierieukina-3 zaaBii do onnazzeń rddioimmanolggiraηych k^ymni ροό!οίζ do hodo wi i komórek (Sigma, St. Louis, USA) poćywka Sodiuη-BSacro (ΜίΜΜοΐβ,

Szwecja) rozpu^czl^z ieukotrian rozffóóz ηϊι bufonwYni^y Tris aag hełperewy VCS Ml Z (StsaSaran, USA).

W poniższych przykładach obrazujących wynalazek lecz w żadnym stopniu nie ograniczającymi jego zakresu odniesienia do temperatury są w stopniach Celsjusza.

Przykład 1: Przeciwslergiczae właściwości skierowanego przeciw hIgE mo nokloaalaeao przeciwciała BSW17

Jako model do testowania antyalergicznych właściwości BSW17 i przeciwciał typu BSW17 wytwarzanych u pacjentów, którymi są ludzie, przez aktywną immunizację peptydami mimotypowymi BSW17, przedstawiono wpływ BSW17 na uwalnianie histamin przez ludzkie komórki typu bazofili uzyskiwane z hodowli szpiku kostnego prowadzonej w obecności rhIL-3.

Jednojądrowe komórki uzyskiwano ze szpiku kostnego pacjentów, wηmaaaeąaηcC przeszczepu główki kości udowej, poprzez osadzanie w roztworze FiaollaHcpaque (1,077 g/ml; 400 g). 5 x 10⁵ komórek/ml hodowano w podłożu RPMI1640 zswirraeącηm 15% fCs i 2 ng/ml ludzkiej rhIL-3. Po 6 dniach hodowli w 37° w atmosferze zawierającej 5% CO2 dodawano równą objętość pożywki zawierającej rhIL-3. W dniu 12 komórki zbierano i używano do biernego uczulania i testu określającego uwalnianie histaminy. Około 5 x 10⁵ komórek szpiku kostnego, pfcCodząayah z hodowli, inkubowano w buforze HA (20 mM HEPES; pH = 7,4; 0,3 mg/ml HSA) z 500 ng/ml ludzkiego IgE w obecności 50-krftarao nadmiaru moaoklonalaycC przeciwciał przeciw IgE. Całkowita objętość mieszaniny inkubacyjaee wynosiła 1 ml. Po 2 godzinach inkubacji w 37° nadsącze z komórek są użyte do pomiaru histaminy w czasie biernego uczulania. Osadzone komórki użyto do wyzwolenia wydzielania histaminy. Do określenia wielkości bezpośredniego wyrzutu histaminy biernie uczulone komórki szpiku kostnego zawieszono w 0,3 ml buforu HCM (bufor HA zawierający 0,6 M CaCl2 i 1 mM MgCl₂ i inkubfwanf z 0,1 pg/ml anafilaktyczargo mfafkloaalnrgf przeciwciała Le27 skierowanego przeciw IgE. Poziom histaminy w supernataacie i w osadzie komórek mierzono w Techniafa Autfaaalηsrr II Tarrytown, New York, USA). Wydzielenie histaminy oblicza się w procentach [zgodnie ze wzorem: wydzielona histamina (%) = histamina w nadsączu podzielona przez histaminę w nadsączu + histaminę w osadzie komórkowym i pomnożona przez 100]. Oblicza się w procentach uwolnienie histaminy w czasie biernego uczulania [zgodnie ze wzorem: histamina wydzielona (%) = histamina w nadsączu (po uczuleniu biernym) podzielona przez histaminę w nadsączu (po wyzwoleniu reakcji) + histamina w nadsączu (po uczuleniu) + histamina w osadzonych komórkach razy 100]. Obliczono wielkość speccfiazaego wydzielenia

187 209 histaminy zależnego od przeciwciał anty-IgE [zgodnie ze wzorem: specyficzne wydzielenie histaminy (%) = % całkowitego wydzielenia histaminy minus % spontanicznego wydzielenia histaminy].

Wyniki trzech niezależnie przeprowadzonych doświadczeń podsumowano w tabeli I:

Tabela I

Wpływ przeciwciał przeciw IgE na uwalnianie histaminy przez uczulone komórki szpiku kostnego

	Specyficzne uwolnienie histaminy (%) **
Doświadczenie I	Doświadczenie 2	Doświadczenie 3
Uczulany z*	A	B	A	B	A	B
IgE (kontrola)	3,0	I0,3	4,3	II,0	I,5	36,5
+BSWI7	3,6	3,I	3,0	I,5	4,4	0,9
+Le27	II,0	2,7	8,7	I,7	I5,7	3,8

*) komórki ludzkiego szpiku kostnego hodowano z rhIL-3 (2 ng/ml) uczulano pasywnie a IgE (0,5 pg/ml) lub z IgE i przeciwciałami przeciw IgE (0,25 pg/ml) **) A: Uwolnienie histamin w czasie uczulania

B: Uwolnienie histamin po wyzwoleniu przez przeciwciało monoklonalne Le27 przeciw IgE (0,1 pg/ml).

Dane w tabeli I jasno pokazują, że komórki szpiku kostnego inkubowane z IgE i BSWI7 nie uwalniają histaminy w czasie uczulania lecz hamują wyzwolenie przez Le27. W komórkach szpiku kostnego inkubowanych z IgE i Le27 dochodzi do wyzwolenia w czasie biernego uczulania do poziomu, który powoduje, że w czasie drugiej inkubacji z anafilogennymi przeciwciałami monoklonalnymi więcej histaminy nie może być uwolnione. Komórki szpiku kostnego biernie uczulane w nieobecności zarówno przeciwciał przeciw IgE mogą jednak uwalniać histaminę po następnym wyzwoleniu przez Le27. Można podsumować, że:

a) sam BSWI7 nie powoduje reakcji anafilaktycznej i

b) BSWI7 zabezpiecza ludzkie bazofile przed uwolnieniem histaminy spowodowanym działaniem czynnika wyzwalającego. Co za tym idzie przy wytwarzaniu przeciwciał BSWI7 podobnych, przez aktywną immunizację mimotopowym peptydem BSWI7, u pacjentów z alergią można oczekiwać ochrony immunizowanego gospodarza przed rozwojem reakcji alergicznej.

Przykład 2: Przeszukiwanie biblioteki ekspresyjnej, fragmentów DNA kodujących losowe peptydy skonstruowanej na wektorze ekspresyjnym oraz selekcja pozytywnych klonów

Stosując do przeszukiwania skonstruowane na wektorze bakteriofagowym biblioteki ekspresyjnej przy pomocy testu biologicznego wykryto cząsteczki bakteriofagów specyficznie rozpoznawane przez BSWI7 bowiem bibliotekę skonstruowano tak, że liniowe lub koliste cząsteczki peptydów złożonych z 6 do I5 aminokwasów były połączone odpowiednio z fagowymi peptydami p III i p VIII. W celu amplifikacji biblioteki fagowej 2 ml płynnej hodowli

E. coli szczepu XL-I blue hodowano na pożywce SB do OD600 = I,0, inkubowano w temperaturze pokojowej przez I5 min z I0^w fagów. Dodawano I0 ml pożywki SB zawierającej I0 mg/ml tetracykliny i 2θ pg/ml karbenicyliny, a następnie wysiewano na szalki z pożywką LB zawierającą karbanicylinę w stężeniu I00 μ g/ml odpowiednio I0,I i 0,I pg mieszaniny. Hodowlę ińkubowano przez 37° przy intensywnym wytrząsaniu następnie dodawano I00 ml pożywki SB zawierającej I0 pg/ml tetracykliny i 50 pg/ml karbenicyliny i kontynuowano inkubację przez następną godzinę. Dodawano fag pomocniczy w ilości I0 ¹² chi. Po dwóch godzinach intensywnego wytrząsania w 37° dodawano kanamycynę do końcowego stężenia 70 pg/ml i dalej prowadzono hodowlę przez całą noc. Po odwirowaniu przy 4000 x g w 4° przez 20 minut, nadsącz mieszano z 38 ml lodowato zimnego, jałowego roztworu 12% NaCl i I6%o PEG 8000, schładzano na lodzie przez 30 minut i wirowano przez 30 minut przy I0000 g w 4°. Osad fagów zawieszano w 2 ml TBS zawierającego I,5% kazeiny i przechowywano w 4°. W celu przeszukiwania

187 209 metodą biologiczną szalki Costar do RIA (Costar 3690) pokrywano, przez noc w 4°, roztworem BSW17 o stężeniu 20 pg/ml w 0,1 M buforze węglanowym, pH 9,6, a następnie blokowano je roztworem TBS zawierającym 1,5% kazeinę. Dodawano 2 x 10¹' cfu fagów i inkubowano w 37° przez 2 godz., następnie płukano je dziesięć razy roztworem PBS / 0,1% Tween 20. Studzienki płukano wodą, a związane fagi odpłukiwano, przez 10 min., w końcowej objętości 200 pl 0,1 M HCl, pH 2,2. Odpłukane fagi zobojętniano 2 M roztworem zasady Tris i namnażano w sposób opisany powyżej.

W celu selekcji pozytywnych klonów 50 pl bakterii E. coli szczepu XL-I blue hodowano w pożywce SB do OD600 = 1,0, a następnie inkubowano je z 1 pl rozcieńczonego 10'⁸ razy namnożonego faga, po 3 powtórzeniach przesiewania prowadzonych przez 15 min. w temperaturze pokojowej wysiewano je na szalki LB zawierające 100 pg/ml karbenicyliny i hodowano przez noc. Losowo wybrane kolonie przeszczepiano na szalki z pożywką LB zawierającą 100 pg/ml karbenicyliny. Po 4 godzinach w 37°, filtry nitrocelulozowe nasączano 10 mM IPTG i nakładano na powierzchnią hodowli, którą kontynuowano przez noc w temp. 32°. Filtry usuwano i inkubowano w 37° przez 30 minut w atmosferze CHG3. Resztki bakterii usuwano przez inkubację filtrów przez 1 godzinę w 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 3% BSA, 100 U DNAzy 1i 40 mg lizozymu w 100 ml, blokowano w TBS zawierającym 1,5% kazeiny. Filtry płukano w TBS, TBS/0,5% Tween 20, a następnie TBS. Każde płukanie prowadzono przez 10 min. Dla wybarwienia paski inkubowano w roztworze TBS zawierającym w 1 ml 600 pg 4-chloro-1-naftylu i 0,042% nadtlenek wodoru (woda utleniona).

Przykład 3: Charakteryzacja cząsteczek faga ujawniających peptydy naśladujące naturalny epitop BSW17 (peptydy mimotopowe BSW17)

Różne cząsteczki fagów ujawniające odpowiednio koliste peptydy zbudowane z siedmiu, ośmiu lub dziewięciu aminokwasów i liniowe peptydy zawierające dziesięć i piętnaście reszt aminokwasowych odnośnie których stwierdzono, że wiążą BSW17. Określono sekwencje nukleotydowe DNA kodujące te peptydy. Zgodnie z ich homologią z innymi jak również występujących homologicznych regionów w obrębie Fcc w oparciu o analizę sekwencji DNA można określić trzy grupy fagów ujawniających peptydy rozpoznawane przez BSW17. Ogólny wynik przedstawiono w tabeli 2:

Tabela 2

Sekwencje peptydowe ujawnianych przez fagi mimotopów BSW17

Grupa A:

Cys

+ Arg

+ Arg

+ His

P Asn

P Tyr

P Gly

o Phe

o Trp

o Val

Cys

n=7

++

Cys

o Ile

P Asn

+ His

+ Arg

P Gly

P Tyr

o Trp

o Val

Cys

n=3

+++

Cys

P Thr

+ Arg

o Leu

+ His

P Thr

P Gly

P Tyr

o Trp

0 Val

Cys

n=2

+

Cys

P Trh

o Leu

P Ser

o Val

o Phe

P Gly

P Tyr

o Trp

0 Val

Cys

n=1

+/-

+ = naładowany pozytywnie p = bez ładunku, polarny o = nie polarny n = liczba klonów ujawniających odpowiednią sekwencję +(++), +/- = siła rozpoznawania BSW17 (np. odpowiednio Sekw. id. nr 19, nr 19, nr 20 i Nr 21)

Drugim peptydem z wyżej wspomnianej grupy A (Sekw. id. nr 19) jest peptyd (A) (Sekw. id. nr 1) posiadający dwie dodatkowe cysteiny pozwalające na jego cyklizację.

Pozostałe trzy peptydy, odpowiednio Sekw. id. nr 18, Sekw. id. nr 20 i Sekw. id. nr 21 są peptydami przygotowywanymi poniżej w podobny sposób.

187 209

Grupa B:

Val	Asn	Leu	Pro	Trp	Ser	Phe	Gly	Leu	Glu
Val	Asn	Arg	Pro	Trp	Ser	PHe	Gly	Leu	Glu
Val	Lys	Leu	Pro	Trp	Arg	Phe	Tyr	Giln	Val

Trzy przedstawione wyżej peptydy należące do grupy B to odpowiednio peptydy (G) (Sekw. id. nr 7), (H) (Sekw. id. nr 8) i (I) (Sekw. id. nr 9).

Grupa C:

Leu

Thr

Leu

Ser

His

Pro

His

Trp

Val

Leu

Asn

His

Phe

Val

Ser

Val

Trp

Thr

Ala

Cys

Gly

Tyr

Gly

Arg

Met

Cys

Ser

Met

Gly

Pro

Asp

Gin

Thr

Leu

Arg

Cys

Cys

Leu

Leu

Asp

Ser

Arg

Tyr

Trp

Cys

Cys

Gin

Pro

Ala

His

Ser

Leu

Gly

Cys

Cys

Leu

Trp

Gly

Met

Gin

Gly

Arg

Cys

Cys

Gly

THr

Val

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Przedstawione powyżej 7 peptydów z grupy C to odpowiednio peptyd (O) (Sekw. id. nr 15), peptyd (J) (Sekw. id. nr 10), peptyd (P) z dwoma dodatkowymi cysteinami (Sekw. id. nr 22), peptyd (L) z dwoma dodatkowymi cysteinami (Sekw. id nr 23), peptyd (M) z dwoma dodatkowymi cysteinami (Sekw. id. nr 24), peptyd (N) z dwoma dodatkowymi cysteinami (Sekw. id. nr 25) i peptyd (K) z dwoma dodatkowymi cysteinami (Sekw. id. nr 26). Peptydy z grupy C posiadające dwie, otaczające je cysteiny wiążą silnie BSW17. Cała grupa C nie wykazuje Homologii pomiędzy jej sekwencją a Fce; peptydy są wyjątkowymi mimotopami naśladującymi epitop BSW17 jedynie strukturalnie.

Jak można zobaczyć z tabeli 2, karboksylowe końcowe części peptydów z grupy A są wysoce konserwowane, a ich aminowe końcowe części, choć znacznie bardziej zdegenerowane, zawierają posiadające pozytywny ładunek, polarne aminokwasy. To rozmieszczenie ładunków wydaje się mieć zasadnicze znaczenie w rozpoznawaniu BSW17, bowiem jeden klon, który odbiega w końcowej części aminowej od tej zasady wykazuje zdolność jedynie bardzo słabego wiązania BSW17. Nie stwierdzono ciągłej sekwencji aminokwasowej o znaczącej Homologii w obrębie Fcs Jednak porównanie wzoru rozmieszczenia aminokwasów pozwala zlokalizować te peptydy w obrębie sekwencji aminokwasowej domeny Cs4 pomiędzy aminokwasami od 500 do 508. Postulowano, że dekapeptyd Fcs zlokalizowany pomiędzy aminokwasem 500 a 508 jest wymagany do wyzwolenia reakcji komórek tucznych przez wiązaną z receptorem IgE.

Peptydy należące do grupy B również są Homologiczne względem siebie, co więcej ich aminowa końcowa część jest prawie identyczna z sekwencją aminokwasową Fcs zawartą między aminokwasami 370 a 375. Sekwencja ta jest częścią Cs3 i zawiera lub jest przylega do obszaru dla którego pokazano, że jest zaangażowany w wiązanie IgE z jej receptorem o wysokim powinowactwie. Odkrycie to wyjaśnia Hamowanie przez BSW17 oddziaływania IgE/IgERI.

Można podsumować, że złożony epitop konformacyjny rozpoznawany przez BSW17 zawiera strukturę konformacyjną utworzoną przez ciąg aminokwasów 500-508 (w obrębie Cs4) i 370-375 (w Cs3) z cząsteczki IgE (numeracja zgodnie z E.A. Padlan i D.R.Davies, Molecul. Immunol. 23 (1986) 1063). Przeciwciała wytworzone w poszczególnych osobnikach w wyniku immunizacji mimotopami z przedstawionych powyżej grup A i B związanymi z imunogennymi cząsteczkami nośnika powinny więc chronić przed reakcją alergiczną przez blokowanie wiązania IgE z jej receptorem o wysokim powinowactwie i/lub wyzwolenia degralulacji komórek docelowych.

187 209

Peptydy zebrane w grupie C w tabeli nie wykazują znaczącej homologii pomiędzy sobą a nie z Fce. Co za tym idzie obejmują one „unikalne mimotopy” naśladujące trójwymiarową strukturę rozpoznawaną przez BSW17. Używając te mimotopy jako immunogeny można będzie również uzyskać u immunizowanego gospodarza wytworzenie anty alergicznych przeciwciał podobnych do BSW17.

Wytwarzanie odpowiedzi immunologicznej podobnej do BSW17 specyficznie skierowanej przeciw epitopowi BSW17 ludzkiej IgE pokazano w następnych przykładach 4 do 6 dla wybranych mimotopów:

Przykład 4: Bakteriofagi ujawniające peptydy mimotopowe BSW17 są specyficznie rozpoznawane przez BSW17

Oznaczeniem ELISA wykazano wiązanie mimotopowych peptydów ujawnianych przez cząsteczki fagów (grupa A z tabeli 2: pierwszy klon = klon 1 z fig. 5 = Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys = Sekw. id. nr 18; drugi klon = klon 18 z fig. 5 = Cys-Ile-Asn-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys = Sekw. id. nr 19) ze specyficznym dla antygenu hiper zmiennym rejonem BSW17. Studzienki w szalkach Costar pokrywano 10 pg BSW17 i różnymi przeciwciałami monoklonalnymi po czym prowadzono klasyczny test ELISA. Po blokowaniu BSA studzienki inkubowano ze 100 pl typowego buforu do inkubacji do testu ELISA zawierającego cząsteczki bakteriofagów otrzymane z nadsączów hodowli bakterii zainfekowanej fagiem, w których miano faga wynosiło 10⁹ cfu/ml. Po wypłukaniu szalki inkubowano z przeciwciałem anty-M13 sprzężonym z peroksydazą z chrzanu (HPR) (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) w buforze inkubacyjnym. Inkubacje prowadzono przez godzinę w temperaturze-pokojowej. Po końcowym płukaniu, cząsteczki fagów związane z pokrywającym przeciwciałem uwidaczniano poprzez reakcję HPR związanej z surowicą anty M13 z Substratem chromogenic/nym prowadzoną po zakończeniu klasycznej procedury ELISA. Fig. 5 pokazuje, że fagi ujawniające mimotopy bardzo specyficznie wiążą się z BSW17, a nie wiążą się z innymi przeciwciałami takimi jak 8E7, 3G9 i 5H10 które są również przeciwciałami monoklonalnymi przeciw Ce3, a które zostały wytworzone przy pomocy zrekombinowanego immunogenu Ce3, ani z 5H5/F8 które są innym przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw zewnątrzkomórkowej części ludzkiego FceRIa. Uwzględniono jako negatywną kontrolę zrekombinowany łańcuch a FceRI i jako kontrolę pozytywną studzienki powlekane surowicą opornościową przeciw M13.

Przykład 5: Bakteriofagi ujawniające peptydy mimotopowe BSW17 hamują przez współzawodnictwo wiązanie BSW17 z IgE

Specyficzność oddziaływania mimotop-BSW17 pokazano przez wykazanie, że przyłączenie cząsteczek faga ujawniających mimitop oddziałuje w wiązaniu BSW17/IgE. Komórki bakterii hodowano w pożywce SB zawierającej tetracyklinę w stężeniu 10 pg/ml i karbemeilmę w stężeniu 50 pg/ml do OD600 = 0,4 wtedy dodawano bakteriofaga pomocniczego i inkubację kontynuowano przez dalsze 2 godz. w 37°. Następnie dodawano kanamycynę do końcowego stężenia 70 pg/ml i inkubację kontynuowano przez noc. Cząsteczki fagów wytrącano glikolem polietylenowym. Miękkie szalki do RIA powlekano roztworem BSW17 o stężeniu 20 pg/ml w 0,1 M buforze węglanowym o pH 9,6, a następnie blokowano TBS zawierającym 1,5% kazeinę. Ludzkie IgE znakowano ^I stosując metodę z chloraminą T, a następnie używano 100000 cpm na studzienkę do wiązania do powlekanych szalek do RIA w obecności wzrastającego stężenia odpowiednio nie znakowanych IgE (krzywa standardowa) lub cząsteczek faga. Wszystkie doświadczenia przeprowadzano w temperaturze pokojowej, płytki płukano trzykrotnie 0,9% NaCl + 0,05% Tween 20, cięto na fragmenty, a każdą studzienkę niezależnie zliczano przez 1 minutę w liczniku promieniowania γ.

Fagi ujawniające mimotopy (PhBSW.6-9 z fig. 6 = klon 1 z fig. 5 = CRRHNYGFWVC = Sekw. id. nr 18; PhBSW.29-8 z fig.6 = klon 18 z fig. 5 = CINHRGWWC = Sekw. id. nr 19) (patrz powyżej przykład 4) hamowały wiązanie BSW17 z IgE. Fig. 6 pokazuje wiązanie znakowanej 1²5i IgE z BSW17 w obecności ujawnianego przez klony fagowe mimotopu BSW17. Zaczernione kółka wyznaczają standardową krzywą hamowania przez niewyznakowane IgE, co pozwala oszacować hamowanie wiązania znakowanych IgE w obecności cząsteczek faga w ilości 10¹¹ cfu/ml. Uzyskiwane w obecności klonów fagowych hamowanie jest porównywalne z hamowaniem przez nie znakowaną IgE w stężeniu odpowiednio 1 pg/ml i 1,7 pg/ml.

187 209

Przykład 6: Indukcja specyficznej dla epitopu reakcji immunologicznej przez immunizację królików klonami fagowymi ujawniającymi mimotop.

W celu sprawdzenia możliwości uzyskania szczepionki opartej na mimotopie BSWI7 króliki immunizowano odpowiednio cząsteczkami fagowymi ujawniającymi peptydy mimotopowe BSWI7 i jako kontrolą fagiem pomocniczym VCS MI3. I0I cfu świeżo przygotowanych fagów dializowano w 4° wobec PBS. Do pierwszego szczepienia stosowano I ml zawiesiny emulgowanej kompletnym adjuwantem Freunda lub I ml emulgowany niekompletnym adjuwantem Freunda do doszczepienia. Immunizację powtarza się przez doszczepienia podskórne wykonywane co I4 dni. Po trzecim doszczepieniu pobierano I2 ml krwi, którą następnie przeprowadzano w skrzep przez 4 godziny w temperaturze pokojowej w probówce szklanej, a następnie wirowano przez I0 minut przy 2000 g. Nadsącze sprawdzano oznaczeniem ELISA pod kątem obecności przeciwciał przeciw ludzkim IgE. Ludzkie IgE uzyskane od trzech osób (SUSII-IgE; PS-IgE; WT-IgE) rozcieńczano w PBS do stężenia 50 pg/ml i I pl nakraplano na nitrocelulozę. Nitrocelulozę blokowano przez I godzinę TBS zawierającym I,5% kazeinę. Króliczą surowicę rozcieńczano I:200 w TBS zawierającym I,5% kazeinę i inkubowano przez noc. Płukanie prowadzono każdorazowo przez I0 minut używając TBS, TBS-0,05% Tween 20 i TBS. Używane do wywoływania sprzężone z HRP kozie przeciwciało przeciw królikowi rozcieńczano I:I000 w TBS zawierającym I,5% kazeinę, a następnie prowadzono inkubację przez 4 godziny. Płukanie i barwienie prowadzono jak opisano uprzednio. Jak pokazano w tabeli 3 kontrolna surowica królika immunizowanego fagiem VCS MI3, jak również surowica królika nie immunizowanego wykazywały słabą reakcję przeciw ludzkim IgE, co najprawdopodobniej wynika z obecności naturalnie występujących auto przeciwciał przeciw króliczym IgE reagujących krzyżowo z ludzkimi IgE. Jakkolwiek, poza silną odpowiedzią immunologiczną skierowaną przeciw bakteriofagowemu białku pVIII stanowiącemu białko otoczki, surowice królików immunizowanych fagami ujawniającymi mimo top BSWI7 zawierały również dużą ilość przeciwciał specyficznie rozpoznających ludzką IgE.

Tabela 3

Odpowiedź anty IgE królików immunizowanych fagiem ujawniającym mimotop BSWI7

Rozpoznawanie IgE (względne OD)
Surowica królika	SUSII-IgE	PS-IgE	WT-IgE
nie immunizowane	2,0 ± 0,3	2,0 ± 0,2	2,0 + I,0
fag pomocniczy VCS MI3	2,0 ± 0,6	2,0 ± I,0	3,0 ±0,5
PhBSW.6-9 (=klon I)	5,0 ± 0,2	8,0 ± 0,6	2I,0 ± I,0
PhBSW.29-8 (=klon I8)	16,5 ±0,7	9,0 + 0,4	25,0 ± I,0

Test specyficzności surowicy opornościowej przeciw epitopowi BSWI7 może być pokazany w teście współzawodnictwa ELISA: paski nitrocelulozy przygotowywano w sposób opisany powyżej i inkubowano przez noc z surowicą królika rozcieńczoną I:50 buforem TBS zawierającym I,5% kazeinę. Po płukaniu dodawano mAb BSWI7 znakowane peroksydazą z chrzanu (BSWI7-HRP) którą rozcieńczano I:50000 w TBS zawierającym I,5% kazeinę, reakcję prowadzono 4 godziny. Następne płukanie i barwienie przeprowadzono jak to opisano. Jak można odczytać z tabeli 4 wiązanie BSWI7-HRP z preparatami IgE uzyskanymi z różnych źródeł jest hamowane przez surowicę z królików immunizowanych fagami ujawniającymi mimotop BSWI7, podczas gdy surowica z królików immunizowanych fagiem pomocniczym nie wykazuje działania hamującego:

187 209

Tabela 4

Hamowanie oddziaływania BSW17/IgE przez surowicę królików immunizowanych fagami ujawniającymi mimotop BSW17

	Rozpoznawanie różnych IgE (% hamowania)
	SUS11-IgE	WT-IgE	PS-IgE	Zavasal-IgE
fag pomocniczy VCS M13	0	0	0	0
PhBSW.6-9	34	65	63	51
PhBSW.29-8	52	65	48	47

Dalej w przykładach 7 i 8 pokazano przydatność chemicznie syntetyzowanych peptydów mimotopowych związanych z białkiem nośnikowym jako immunogenów do przygotowania szczepionki przeciwuczuleniowej:

Przykład 7: Chemicznie syntetyzowane peptydy mimotopowe BSW17 wiążą BSW17 wykazując do niego wysokie powinowactwo

Celem potwierdzenia, że pochodząca od bakteriofaga część fagowych mimotopów BSW17 może zostać pominięta bez zniszczenia biologicznej aktywności sekwencji peptydowego mimotopu zsyntetyzowano chemicznie peptydy w tym cykliczny mimotopowy oktapeptyd BSW17 (A) [przedstawiony w formie liniowej a tabela 2, Grupa A, klon drugi jako peptyd (A) z dodatkową cysteiną (Sekw. id. nr 19) zawierający tu jako sekwencje otaczające 7 dodatkowych reszt aminokwasowych Gly-Glu-Phe- i -Gly-Asp-Pro-Ala umożliwiających prawidłowe składanie kolistego mimotopu peptydowego]:

Gly-Glu-Phe-Cys-ne-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp^al-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (Sekw. Id. nr 27)

Po zsyntetyzowaniu, w standardowy sposób, peptyd zcyklizowano poprzez dwie cysteiny i znakowano fluorescencyjnie przez Rhodol Green. Wiązanie z coraz wyższymi stężeniami BSW17 unieruchomionego na szalce mikrotitracyjnej immunologicznej, w warunkach dla oznaczenia ELISA, określono na podstawie pomiaru fluorescencji pokazano na fig. 7.

Przykład 8: Chemicznie zsyntetyzowane mimotopy peptydowe BSW17 związane z białkami nośnikowymi są specyficznie rozpoznawane przez BSW17

Różnorodne mimotopy peptydowe są chemicznie syntetyzowane i wiązane z immunogennymi nośnikami peptydowymi. Reakcje sprzęgania przeprowadzano stosując standardową procedurę oraz peptyd i białko nośnikowe w proporcjach masy jak 1:1. Koniugaty uzyskiwane z niżej opisanych sprzężonych odmian przygotowywano przez:

- sprzęganie aldehydem glutarowym

- sprzęganie DC (diheksylokarbodiamid)

- sprzęganie BSS [bis(sulfosukcynimidylo)suber'ynian]

- usieciowanie lizyną

Uzyskiwanymi skoniugowanymi mimotopami są:

(1) P1 = Urnowy KTKGSGFFVF . BSA (aldehyd (2) P4 =. Dniowy Ac(HRGYWVC - BSA DC) (3) P5 = Umowy AcRSRSGGYWLWC - BSA CDC) (4) SAF 1 -KUH = cykliczny GEFC4HR.GYWVCGDP A . KUH CDC) (5) SAF2-KLHf = Umowy KTKGSGFFVF . KLH DC) (6) = Umowy VN.LPWSFGLU . KLH DC) (7) SAF3-Lvs = Umowy ν'ΝΤ,ΡΧΥΈΚιΐυ . usieciowane iżzyną (8) SAF4-KUH = Urnowy YNLTWSRASG . KLH DC) (9) SAF5-KUH = V4'LTWS . KLH (DC) (10) SDS214 =. cykHczny GFFCRRHNYGFWACGDPA . KUH (BSS) (11) SDS213 . SDS227. SDS236. SDS252 = cykHczny GEFCINHRGYWVl CGDPA - KLH (BSS) (12) SDS237. SDS253 = Urnowe KTK.GSGFFVF . KLH COSS)

187 209 (13) SDS242. SESS254 == Urnowe ANLPWSFGLE - KLH ^SSi oaaz (14) SDS243 = Urnowe VNLTWSRASG - KFH BSSS), gdzie (1), (5) i (12) są cząsteczkami immunogenów referencyjnych przygotowanych odpowiednio przez wiązanie aldehydem glutarowym, DC i BSS tak, że:

(1) np. P1 ma sekwencję aminokwasową rejonu 500-509 ludzkiej IgE, Sekw. id. nr 28, związaną z BSA przy pomocy aldehydu glutarowego;

(5) np. SAF2iKLH -est tym samym peptydem, Sekw. id. w. 28 zwi28anwią a ICLH przy pomocy DC i

(12) np. SDSbSD ϊ 2DSb5D Sątym samym yepmPJm., d^kw. ed. ru^- d8 n^wiązi^j^ąn z KFH przy pomocy BSS.

IaaJ pJptyds są immuaogJaami według wsaplαnku, konkretnie:

- (2) (P4) jest N-arJtylowansm pJptyeJm (A) (Sekw. id. nr 1) z dodatkową cysteiną przyłączoną do C-końca (Sekw. id. nr 29) związaną z BSA przy pomocy DC;

- (3) (P5) jest N-acJtylowαnym pJptydJm (C) (Sekw. id. nr 3) z dodatkową cysteiną na C-końcu (Sekw. id. nr 30) związanym z BSA przy pomocy DC;

- (4) (SAF1-KLH) jest peptydem z przykładu 7 (Sekw. id. nr 31) rsklinowansm poprzez mostek dwuelprrnkowy tworzony pomiędzy dwoma, znajdująrsmi się na końcu cząsteczki, cysternami i związany z KLH przy pomocy DC;

- (6) (SAF3-KLH) jest peptydem (G) (Sekw. id. nr 7) związanym z KLH przy pomocy DC;

- (7) (SAF3-Lss) jest pep^em (G) (Sekw. id. nr 7) związanym przez usiJriowpniJ lizyną;

- (8) (SAF4-KLH) jest peptydem (D) (Sekw. id. nr 4) związanym z KLH przy pomocy DC;

- (9) (5AFt-KLH) jest peptydem (q) (Sekw. id. nr 17) związanym z KLH przy pomocy DC;

- (10) (5ES214) jest pierwszym pJptyeJm z grupy A z tabeli 2 zawiJrαjąrsm te same 7 dodatkowych, pochodzących z bakteriofaga reszt αmlaokwαsowsrh jak peptyd z przykładu 7 (Sekw. id. nr 32) csklizowans i związaas z KLH przy pomocy BSS;

- (11) (SDS213, SDS227, SDSąy6, 5D5ąt2 jest tym samym peptydem jak (4) powyższy peptyd (Sekw. id. nr 31), csklizowαnsm i związanym z KLH przy pomocy BSS;

- (13) (SDS242, SDS254) jest pJptydJm (G) (Sekw. id. nr 7) związanym z KLH przy pomocy BSS; i

- (14) (SDS243) jest pJptydJm (D) (Sekw. id. nr 4) związanym z KLH przy pomocy BSS.

Figura 8a pokazuje, że zarówno rsklirzas mimotop BSW17 koniugowans z KLH przez

BSS (11) np. SDS2y6 i „oryginplas” Jpitop będący pochodną Fm (12) np. SDS2y7, np. Fm. (500-509) związane jako liniowe eJptyes z KLH (przy pomocy BSS), są rozpoznawane przez BSW17, gdzie rozpoznawanie wykazuje zależność od dawki, podczas gdy wolny KLH nie ujawnia zdolności wiązania. Szalki immuaologirznJ mikrotitrarsjnJ pokrywa się 1 pg każdego z SDSąy6, 5DS2y7 lub wolnym KLH i inloibuje wobec roztworu BSW17 o rosnącym stężeniu. Związane przeciwciało wykrywa się przy pomocy przeciwciała koziego skierowanego przeciw mysim IgG skoniugowanego z HPR (ganlgG-HRP). Przedstawione dane są średnią z dwóch powtórzeń pomniejszoną o tło wynikające z wiązania z nie opłaszczonymi studzienkami (blokowane BSA).

Figura 8b podsumowuje wyniki uzyskane w testach ELISA z różnymi koniugatami mimotopu BSW17 związanymi z białkiem nośnikowym przy pomocy różnych procedur chemicznego wiązania. Studzienki szalki immunologicznej powlekano, każdą 5 pg koniugatu mimotopu lub wolnym KLH i inkubowano z 10 pg BSW17. Związane przeciwciało wykrywano kozią anty mysią IgG-HRP (gamlgG-HRP). Przedstawione wyniki są średnimi z dwóch pomiarów pomniJjezonsml o wartość tła wynikającą z wiązania do nie powlekanej studzienki (blokowana BSA). W przJriwiJńetwiJ do wolnego KLH, dla każdego koniugowanego mimotopu BSW17 stwierdzono, że jest on rozpoznawany przez BSW17. Jakkolwiek, z eksperymentów powtarzanych w ciągu kilku tygodni stało się jasnym, że koniugaty z KLH wiązanym za pomocą DC są mniej stabilne i stopniowo tracą swoją zdolność wiązania BSW17. PrzJriwalJ koniugaty mimotopu BSW17 uzyskane przez sprzęgane za pomocą BSS potwierdziły swoją stabilność w +4°.

187 209

Na fig. 9a i 9b pokazano, że mimotopy BSW17 sprzęgane z KLH lub BSA są specyficznie rozpoznawane przez BSW17, a nie są przez inne nie mające związku z BSW17 monoklonalne przeciwciała 3G9 (przeciw ludzkiej Ce3) i 5H5/F8 (przeciw ludzkiej RIa). Ponownie, płytki immunologiczne mikrotitracyjne powlekane 5 pg każdego z przedstawionych koniugowanych mimotopów inkubowano wobec odpowiedniego przeciwciała monoklonalnego. Związane przeciwciało wykrywano przy pomocy gamlgG-HPR. Przedstawione wyniki są średnią z dwóch powtórzeń pomniejszoną o tło wynikające z wiązania z nie powlekaną studzienką (blokowana BSA).

Przykład 9: W wyniku immunizacji królika koniugowanym mimotopem BSW17 jest wytworzenie in vivo przeciwciała przeciw ludzkim IgE

W celu potwierdzenia specyficzności immunogenności koniugowanych mimotopów BSW17 immunizowano króliki, w sposób opisany poniżej, zestawem preparatów mimotop/nośnik:

Królik nr	Immunogen	Rodzaj koniugatu
R1	(10)SDS214
R2	(10)SDS214	mimotopy Cs4
R3	(11)SQS213
R4	(11)SDS213
1	KLH (Pierce)
2	KLH-BSS linker	kontrolne KLH
4	2) SDS-37-
11	(12)SDS237	Ce.4 (500-509)
7	(6) SAF3-KLH
13	3 (7) SAF3-Lys
14	SDS242	mimotopy Cs3
16	(13)SDS242
17	(13)SDS254
18	(7) SAF3-Lys
5	(8) SAF4-KLH	Ce3 (370-379)
8	(8) SAF4-KLH
19	(14)SDS243
20	(14)SDS243
12	(4) SAFI-KLH
15	(4) SAFI-KLH	mimotopy Ce4

Króliki immunizowano przez podskórne wstrzyknięcie 200 pg odpowiedniego preparatu koniugatu rozpuszczonego w całkowitej objętości 500 pl buforu fosforanowo-solankowego (PBS). Do pierwszej immunizacji próbki mieszano w proporcjach 1:1 z kompletnym adjuwantem Freunda (króliki R1-R4) lub TiterMax (Sigma; króliki 1-20). Przed pierwszą immunizacją pobierano 5 ml próbkę krwi. Doszczepianie wykonywano w 21 i 28 dni od pierwszego zastrzyku stosując niepełny adjuwant Freunda. Próbki krwi pobierano w 28 i 49 dniu, a surowicę sporządzano z wszystkich próbek.

Wytwarzanie w immunizowanych królikach odpowiedzi immunologicznej przeciw ludzkim IgE śledzono przy pomocy testu ELISA: płytkę immunologiczną mikrotitracyjną powlekaną 5 pg

187 209 ludzkiego IgE (SUS-11; JW8) inkubowano ze 100 μί próbek surowicy, które rozcieńczono 1:50 buforem do inkubacji ELISA. Królicze przeciwciała związane z ludzką unieruchomioną IgE wykrywano przez inkubację z kozimi przeciwciałami, koniugowanymi z HPR, skierowanymi przeciw króliczym IgG (garlgG-HPR). Pomiar wartości OD450 skorygowano przez odczyt uzyskany dla 1:50 rozcieńczonej surowicy królików pobranej przed ich immunizacją. Dane przedstawione na fig. 10a i 10b przedstawiają wartości średnie uzyskane z dwóch pomiarów. Fig. 10a i 10b wyraźnie pokazują, indukcją przeciwciał skierowanych przeciw ludzkim IgE u królików immunizowanych różnymi koniugatami mimotopu BSW17.

Stosując ELISA określono miano nowo syntetyzowanych przeciwciał względem odpowiednio nośnika-KLH, peptydu użytego jako immunogenu i ludzkiej IgE stosując odpowiednio serie ich rozcieńczeń w inkubacjach w obecności unieruchomionych KLH, koniugatu białka mimotopowego z BSA i ludzkiej IgE. Dwa przykłady takiego oznaczania miana surowicy przedstawiono na fig. 11 odpowiednio dla (11) np. SDS213 i dla (10), np. SDS214.

Powyższe przykłady przedstawiają możliwości zastosowania koniugatów mimotopu BSW17 jako immunogenu do indukcji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw ludzkim IgE.

Przykład 10: Odpowiedź immunologiczna skierowana przeciw hIgE u królików indukowanych przez immunizację koniugatami mimotopu BSW17 jest izotypowo specyficzna i konkuruje z BSW17 o wiązanie IgE

Specyficzność izotypową odpowiedzi immunologicznej przeciw ludzkim IgE indukowanej u immunizowanych królików kontrolowano testem ELISA: każdą ze studzienek płytki immunologicznej mikrotitracyjnej pokrywano odpowiednio 3 μg ludzkiej IgE (SUS-11), IgA, IgG i IgM i inkubowano z 100 μί próbek surowic rozcieńczonych 1:50 buforem do inkubacji w teście ELISA. Królicze przeciwciała związane przez osadzone ludzkie przeciwciała wykrywano przez inkubację z kozimi garlgG-HPR. Zmierzoną wartość OD405 skorygowano odczytem otrzymanym dla rozcieńczonej 1:50 surowicy pobranej przed immunizacją, a pochodzącą od każdego, odpowiedniego królika. Dane podane w fig. 12 są wartością średnią z dwóch pomiarów. Jak można było zobaczyć odpowiedź immunologiczna wytworzona przez króliki w wyniku immunizacji koniugatem mimotopu BSW17 jest specyficzna względem IgE z wyjątkiem częściowego rozpoznawania ludzkiej IgM przez surowicę królika immunizowanego (10) np. SDS214.

W teście kompetycji ELISA pokazano ponadto, że surowica odpornościowa z królika immunizowanego SDS214 jest zdolna do częściowego współzawodnictwa z BSW17 o wiązanie IgE. Każdą ze studzienek płytki immunologicznej (do mikromiareczkowania) powlekano 1 μg ludzkiej IgE (SUS-11) i inkubowano zarówno z 5 μg BSW17 lub buforu bez BSW17. Po przepłukaniu dodawano do drugiej inkubacji 100 μΐ 1:50 rozcieńczonej w buforze do rozcieńczeń do testu ELISA surowicy opornościowej przeciw SDS213. Królicze przeciwciała związane przez nie poddane obróbce unieruchomione ludzkie IgE i IgE wcześniej inkubowane z BSW17 są wykrywane przez inkubację z kozimi garlgG-HPR. Dane podane na fig. 13 przedstawiają wartość średnią uzyskaną dla dwóch pomiarów.

Przykład 11: Przeciwciała przeciw HIgE wytwarzane przez króliki immunizowane koniugatem mimotopu BSW17 mogą być oczyszczone przez chromatografię powinowactwa z wykorzystaniem mimotopu peptydowego sprzężonego z Sefaroząjako odczynnika

Przykład ten pokazuje, że odpowiedź immunologiczna przeciw hIgE wywoływana u królików przez immunizacją koniugatem mimotopu BSW17 jest identyczna ze specyficzną odpowiedzią przeciw mimotopowi peptydowemu.

Oczyszczanie przez powinowactwo immunologiczne króliczych poliklonalnych przeciwciał przeciw mimotopowi BSW17

a) Wysalanie siarczanem amonu:

Do 22 ml króliczej surowicy opornościowej (60 mg/ml całkowitego białka co oznaczono odczynnikiem Bradforda, BSA-Standard, BIO-RAD) dodano 5,5 g stałego AMS (25% wag./obj.), mieszaninę mieszano przy pomocy mieszadła magnetycznego przez 3 godz. i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Osad usuwano przez wirowanie przy 18000 obr. na min. (Sorvall) przez 45 min. i płukano 25 ml 25% wodnego roztworu (wag./obj.) AMS. Przepłukany

187 209 osad ponownie odwirowano, jak-wyżej i zamieszano w 10 ml PBS, 0,05% NaN₃, pH 7,2 i dializowano przez noc w +4° wobec 5 l buforu o takim samym składzie.

b) chromatografia immunopowinowactwa:

Dializat filtrowano przy pomocy jednostki filtracyjnej Millex-GV (Millipore) o średnicy porów 0,2 pm i nanoszono na kolumnę Pharmacia XK16/30 wypełnioną 10 ml CH-Sepharose 4B, z którą kowalencyjnie związano 5 mg mimotopu peptydowego BSW17 SDS227; przy szybkości przepływu wynoszącej 1 ml/min w PBS, 0,05% NaN₃ jako buforze rozwijającym. Po naniesieniu i odpłukaniu niezwiązanych frakcji białek, specyficzne związane przeciwciała są wymywane 0,1 M buforem glicyna/HCl,I pH 2,8. Eluat (frakcje # 12-20 w objętości 9 ml) zbierano przy ciągłym mieszaniu do natychmiastowego zobojętnienia do pH 7,4 przez dodanie 3,3 M Tris/HAc, 0,8% NaN₃ pH 8,0 (50 pl/ml) i ostatecznie dializowano przez noc w +4° wobec 3 l PBS, 0,05% NaN3, pH 7,2. Stężenie całkowitego białka (zgodnie z oznaczeniem odczynnikiem Bradforda, BlgG Standard (BIO-RAD) wynosiło 1 mg/ml. Odzysk białka względem białka naniesionego wynosi około 0,7%.

Oczyszczone przez powinowactwo frakcje IgG badano testem ELISA pod kątem wiązania hIgE. Studzienki szalki immunologicznej mikrotitracyjnej powlekano roztworami o coraz wyższym stężeniu IgE (JW8) i inkubowano wobec 5 pg oczyszczonych odpowiednio surowicy opornościowej przeciw SDS-213 i surowicy opornościowej przeciw SDS-214. Związane przeciwciało jest wykrywane przez garlgG-HPR. Dane przedstawione na fig. 14 przedstawiają wartości średnie uzyskane dla dwóch pomiarów. Jak można odczytać z fig. przeciwciała klasy IgG oczyszczone na kolumnie powinowactwa z mimotopem BSW17 rozpoznają ludzkie IgE w sposób zależny od dawki. We frakcji oczyszczonej przez kolumnę oznaczono jedynie niską aktywność wiążącą tła. Dane te dowodzą, że indukowana u królika aktywność anty hIgE jest identyczna z aktywnością skierowaną przeciw mimotopowi peptydowemu.

Przykład 12: Przeciwciała przeciw ludzkiej IgE wytwarzane przez króliki po immunizacji koniugatem mimotopu BSW17 nie powodują reakcji anafilaktycznej komórek krwi człowieka.

Pokazano tu, że przeciwciała anty-IgE wytwarzane przez króliki immunizowane koniugatem mimotopu BSW17 nie wywołują reakcji anafilaktycznej bazofili z krwi człowieka. Jako system testowy użyto komercyjnie dostępny zestaw CAST sLt ELISA (Buhlmann AG, Allschwii, Szwajcaria). W oznaczeniu tym określano uwalnianie rozpuszczalnego leukotrienu (sLt) przez ludzkie bazofile w wyniku wyzwolenia reakcji tych komórek przez czynnik anafilaktyczny, prowadząc oznaczenie zgodnie z protokołem eksperymentalnym załączonym przez dostawcę. Odczyt oznaczenia podawany jest w pg sLt obecnego w ml supernatancie zawiesiny białych krwinek po inkubacji komórek z badanymi próbkami i określona przez porównanie z krzywą standardową. Krzywą standardową uzyskano wykonując do testu ELISA serię rozcieńczeń sLT ze środkiem kompetycyjnym. Uwzględniono również kontrole negatywne i pozytywne, którymi odpowiednio były poziomy tła sLT będące wynikiem jego spontanicznego uwalniania przez przygotowaną próbkę komórek krwi (PB = „pacjent w ślepej próbie”) oraz maksymalna ilość sLT, która może zostać uwolniona przez przygotowaną próbkę komórek krwi (PC = „pacjent kontrolny”; wynik uzyskany po zapoczątkowaniu reakcji komórek w próbkach na usieciowane przeciwciało anty-IgERIa).

W celu sprawdzenia obecności aktywowanych bazofili, a co za tym idzie wyzwalających reakcję anafilaktyczną przeciwciał anty-hIgE badano pełne surowice uzyskane od królików immunizowanych koniugatem mimotopu BSW17 jak również opisane w przykładzie 11 przeciwciała przeciw mimotopowi BSW17. Jako źródło bazofili posłużyła świeża krew pobrana od zdrowego dawcy, którą przygotowano postępując rygorystycznie zgodnie z protokołem załączonym do zestawu CAST ELISA. Wyniki zebrane na fig. 15 podsumowują uzyskane wyniki pokazując, że ani oczyszczona surowica królicza zawierająca wytworzone w wyniku immunizacji koniugatem mimotopu BSW17 przeciwciała anty-hlGE, ani oczyszczone przeciwciała przeciw mimotopowi BSW17 nie są zdolne pobudzić ludzkie komórki krwi do uwolnienia leukotrienu, a tym samym nie mogą wywołać reakcji anafilaktycznej. Właściwość ta jest wymaganiem podstawowym, którego spełnienie pozwala stosować mimotopy BSW17 jako szczepionkę anty-alergiczną dla ludzi.

187 209

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Novartis AG (b) ULICA: Schwarzwaldallee 215 (C) MIASTO: Bazylea (e) PAŃSTWO: Szwajcaria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CH-4058 (G) TELEFON: 61-324 5269 (H) TELEFAX: 61-322 7532 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: PEPTYDY IMUNOGENNE (iii) LICZBA SEKWENCJI: 32 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (v) OBOWIĄZUJĄCE DANE ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: WO PCT/EP97/...

(B) DATA ZGŁOSZENIA: 21-MARCA-1997 (vi) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: GB 9604412.8 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 01-MARCA-1996 (vi) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: GB 9617702.7 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 22-SIERPNIA-1996 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 1:

(i) CHAFRAKEEYSTYIKA SEEK/VENCJIi (A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (c) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa

187 209 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 1:

Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val 1 5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 2:

Arg Asn His Arg Gly Tyr Trp Val 1 5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (c) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 3:

Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA S^IK^^INCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa

187 209 (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 4:

Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 5:

Val Asn Leu Pro Trp Ser Arg Ala Ser Gly 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 6:

Val Asn Leu Thr Trp Ser Phe Gly Leu Glu 15 10

187 209 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 7:

Val Asn Leu Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 8:

Val Asn Arg Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 9:

187 209

Val Lys Leu Pro Trp Arg phe Tyr Gln Val 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 10:

Val Trp Thr Ala Cys Gly Tyr Gly Arg Met 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 11:

Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser

5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny

187 209 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 12:

Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp 1 5 (2) INFOORACCJEDLS SEW. ID D N: 1 3:

(i) CHCRCKTERYSTYKC SEKWENCJI:

(C) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZSJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TCK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZSJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 13:

Gln Pro Ala His Ser Leu Gly 1 5 (2) INnFRRASCJD^S EKK^JD N Nr : 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(C) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 14:

Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg 1 5 (2) INFORMASCEENASSEK. ID N N: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK

187 209 (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 15:

Leu Thr Leu Ser His Pro His Trp Val Leu Asn His Phe 15 10

Val Ser (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 16:

Ser Met Gly Pro Asp Gln Thr Leu Arg

5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 17:

Val Asn Leu Thr Trp Ser

5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa

187 209 (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 18:

Cys Arg Arg His Asn Tyr Gly Phe Trp Val Cys 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 19:

Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 20:

Cys Thr Arg Leu His Thr Gly Tyr Trp Val Cys 15 10

187 209 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 21:

Cys Thr Leu Ser Val Phe Gly Tyr Trp Val Cys 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 22:

Cys Ser Met Gly Pro Asp Gln Thr Leu Arg Cys 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 23:

187 209

Cys Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp Cys 1 5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 24:

Cys Gln Pro Ala His Ser Leu Gly Cys 1 5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 25:

Cys Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg Cys 1 5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny

187 209 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 26:

Cys Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser Cys

5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 27:

Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys 15 10

Gly Asp Pro Ala 15 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 28:

Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe

10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy

187 209 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) rOdZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) AFTYSEFSRWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 29:

Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys

5 (2) INFORMACJE DLA SEKW. IN NR: 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYEEFSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 30:

Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp Cys 15 10 (2) INFORMACJE DLA SEKW. IN NR: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (c) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 31:

Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys 15 10

Gly Asp Pro Ala 15

187 209 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: peptydowa (iii) HIPOTETYCZNA: TAK (iii) ANTYSENSOWNA: NIE (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 32:

Gly Glu Phe Cys Arg Arg His Asn Tyr Gly Phe Trp Val 15 10

Cys Gly Asp Pro Ala

187 209

187 209

Fig. 1: Oddziaływanie pomiędzy IgE i jej receptorem IgERI o wysokim powinowactwie.

187 209

Fig. 2: „Klasyczny” sposób otrzymywania szczepionki przeciw IgE

nie hamujące, powodu

A, . , . . f\ jące reakcję, anafilakzobojętniające ^Jt^_czną?

187 209

Fig. 3: Profil aktywności biologicznej BSW17

Usuwalne z powierzchni IgE

Zobojętnianie IgE

Nie powodują reakcji, anafilaktycznej

4. Hamowanie syntezy IgE

187 209

Fig. 4: Immunoterapia oparta na zastosowaniu mimotopu BSW17

Analog BSW17: zobojętniający, nie powodujący reakcji anafilaktycznej, usuwa z powierzchni komórki związane z receptorem IgE, hamuje syntezę IgE

187 209

5Η10 5H5/FB R1_a

Fig. 5 Ujawniane przez fagi mimotopy BSW17 specyficznie rozpoznają BSW17

187 209 wiązanie Ι-IgE (cpm)

Fig. 6: Ujawniane przez fagi mimotopy BSW17 hamują wiązanie IgE/BSW17

współzawodnictwo z niewyznakowanym IgE-SUSll (pg/ml)

187 209

Fig. 7: Wiązanie chemicznie zsyntetyzowanych mimotopów peptydowych BSW17 do BSW17

CM ν τ- χ— ν

CO

LD

CM o

u>

o o

CM

O [BSW17] uM tuu 0£S/00S=W3/X3 4^3 *W| Jon|j %

187 209

Fig. 8a: Rozpoznawanie cyklicznego mimotopu BSW17

GEFCINHRGYWyCGDPA-KLH (BSS) skoniugowanego (SDS 236) i Fce (500-509)-KLH (BSS) skoniugowanego (SDS 237) przez BWS17

OD40S

Mg BSW 17

187 209

OD 4OS

Fig. 8b: Rozpoznawanie różnych koniugatów mimotopu BSW17 przez BSW17

I _l y	τ _)	I _j	irt > 1	I	I	Ol LO OJ	co LO Ol	'cr iO OJ
1 LL	1 OJ LL	1 co LL	co LL <<	1 LL	1 to LL	co Q	co Q	CO Q
<	<	<	CO	<	<	co	co	co
V)	ω	CO	co	CO

I _i

187 209

Fig. 9a: Specyficzne rozpoznawanie koniugatów [BSA (DC)] mimotopu BSW17 i koniugatu [KLH (aldehyd glutarowy)] Fce (500-509) przez BSW17

O.D.405

Pl P4 P5

P1= KTKGSGFFYF-BSA; P4 = AclNHRGVWVC-BSA; P5 = AcRSRSGGYWLWC-BSA

187 209

Fig 9b: Specyficzne rozpoznawanie koniugatu fKLH (DC); Lys] mimotopu BSW17 przez BSW17

O.D. 405

n.d. = nie określono

187 209

Fig. 10a: Odpowiedź immunologiczna przeciw ludzkim IgE wywołana u królików po immunizacji koniugatami (1) mimotopu BSW17

fl <u N O fl	>> U
	i
’3	o
N
O	3
Ł.	tsi

tti

I

CO ci

Ol

Ci

OD 405

ci <N o’

O

SDS 213 SDS 214

187 209

Fig. 10b: Odpowiedź immunologiczna przeciw ludzkim IgE wywołana u królików po immunizacji koniugatmi (2) mimotopu BSW17

O-T>-

SDS 237 SAF3KLH SAF4KLH SAF1KLH SAF3Lys SDS242

SDS243

187 209

Fig. 11: Miano przeciwciał przeciw mimotopowi BSW17 w surowicy wytworzone po immunizacji królików

IMMUNIZACJA KRÓLIKÓW MIMOTOPEM BSW17 ZKONIUGOWNYYM Z KLH - KONIUGAT SDS 213

O

O

O

SO^ ΉΌ >>

U o

a ··* a

<d

N

U

-fi .2 *3

N o

U fi.

O o

ε

OO >

ω

OJD

-C

187 209

Fig. 12: Izotypowa specyficzność odpowiedzi przeciw ludzkim

IgE u królików immunizowanych mimotopem BSW17

R2 (SDS 214)

K4(SDS 213)

187 209

IMMUNIZACAA KRÓLIKÓW MIMOTOEEM BSW17

SOP ΌΌ

187 209

Fig. 13: Współzawodnictwo surowicy przeciw mimotopowi BSW17 z BSW17 o wiązanie IgE

SUS-11 IgE - R2 (SDS 214) surowica 1:50)

187 209

Fig. 14: Wiązanie oczyszczonych przez powinowactwo przeciwciał przeciw BSW17 do hIgE

OD 405

KS hlgE (JW8)

187 209 pg/ml sLt

Fig. 15 Sprawdzanie króliczej surowicy przeciw mimotopowi

BSW17 i oczyszczonych przez powinowactwo przeciwciał przeciw mimotopowi BSW17 z uwagi na zdolność wywoływania reakcji anafilaktycznej* w ludzkich komórkach krwi

187 209 pg/ml sLt

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Immunogenna cząsteczka, znamienna tym, że zawiera:

   (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17, o łącznie do 15 aminokwasów, produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierająca dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej ; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą;

   (b) cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BsW17, przy czym składnik (a) jest inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe.
2. 2. Cząsteczka według zastrz 1, znamienna tym, że jest w postaci polimerowego peptydu lub zrekombinowanego białka fuzyjnego, gdzie jeden monomerowy składnik polimerowego peptydu lub jeden składnik białka fuzyjnego stanowi fragment mimotopu peptydowego BSW17, a druga część polimerowego peptydu lub białka fuzyjnego stanowi cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BSW17.
3. 3. Cząsteczka według zastrz. 1 w postaci koniugatu peptydu mimotopowego BSW17 z nośnikiem immunogennym.
4. 4. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że fragment mimotopu peptydowego BSW17 jest zbudowana z, lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z:

   Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-T rp-V al (At),

   Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (B),

   Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (C),
5. 5. Cząsteczka według zastrz. I, znamienna tym, że fragment mimotopu peptydowego BSWI7 jest zbudowana z, lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z:

   V al-Asn-Leu-Thr-T rp- S er-Arg-Ala-Ser-Gly (D),

   Val -Asn-Leu-Pro-T rp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (E),

   V al-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (G),

   Val-A sn-Arg-Pro-T rp-S er-Phe-Gly-Leu-Glu (H),

   V al-Lys-Leu-Pro-T rp-Arg-Phe-T yr-Gln-V al (I),
6. 6. Cząsteczka według zastrz. I, znamienna tym, że fragment mimotopu peptydowego BSWI7 jest zbudowana z, lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z:

   Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (I⁷),

   Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J),

   Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K),

   Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L),

   Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M),

   Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N),

   Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O),

   Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) oraz

   Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q).
7. 7. Cząsteczka według zastrz. I, znamienna tym, że fragment mimotopu peptydowego

   BSWI7 (a) ma sekwencję aminokwasową Gly-Glu-Phe-Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-frp-Val-Cys-Gly-Asp-Pro-Ala (Sekw. id. nr 27) i jest cykliczny, a mianowicie jest to peptyd Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) z dwoma końcami związanymi ze sobą przez dwie dodatkowe

   187 209 reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy, i zawiera dalsze składniki Gly-Glu-Phei -Gly-Asp-Pro-Ala wiązania hapten-nośnik.
8. 8. Kompozycja farmakologiczna zawierająca adjuwant, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę immunogenną, zawierającą (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17 o łącznie do 15 aminokwasów, produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierającą dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą; (b) cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BSW17, przy czym składnik (a) jest inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-V al-Phe.
9. 9. Ligand zawierający domenę przeciwciała otrzymaną przez immunizowanie cząsteczką, znamienny tym, że cząsteczką jest cząsteczka peptydu mimotopowego BSW17 o łącznie do 15 aminokwasów, produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierającą dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą; inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe, gdzie domena przeciwciała jest również reaktywna wobec sekwencji aminokwasowej ciężkiego łańcucha IgE zawierającego naturalny epitop rozpoznawany przez BSW17.
10. 10. Ligand według zastrz. 9, znamienny tym, że jest w postaci przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu Fab' lub F(ab')211. Sposób przygotowywania cząsteczki immunogennej określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że bezpośrednio sprzęga się kowalencyjnie (a) fragment mimotopu peptydowego BSW17 produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, z (b) cząstką zdolną do wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw peptydowi BSW17, stosując bis-N-sukcynimidylowe pochodne lub korzystnie bis(sulfosukcynimidylo)suberan (BSS), lub glutaraldehyd, lub karbodiimid, korzystniej dicykloheksylo-karbodiimid (DC), lub 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimid jako środek sprzęgający.
11. 12. Zastosowanie cząsteczki immunogennej zawierającej (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17 o łącznie do 15 aminokwasów, produkowanego przez linię komórkową hybrydomy zdeponowaną w ECACC za numerem depozytowym 96121916, ewentualnie zawierającej dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny, to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą; (b) cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BSW17, przy czym składnik (a) jest inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe, do otrzymywania leku do leczenia alergii i atopowego zapalenia skóry.
12. 13. Zastosowanie cząsteczki immunogennej zawierającej (a) co najmniej jeden fragment mimotopu peptydowego BSW17 o łącznie do 15 aminokwasów, ewentualnie zawierającej dalsze składniki wiązania hapten-nośnik; lub jeśli peptyd mimotopowy BSW17 jest cykliczny,

    187 209 to ma ewentualnie dwa końce połączone ze sobą przez dwie dodatkowe reszty cysteinowe tworzące mostek dwusiarczkowy lub usieciowane chemicznie; lub jeśli mimotop peptydowy BSW17 jest liniowy, ma ewentualnie aminokwas znajdujący się na końcu karboksylowym zablokowany w postaci amidowanej i/lub aminokwas na aminowym końcu zablokowany w postaci acetylowanej; lub ewentualnie jest flankowany grupą lub dwiema grupami pomocniczymi i/lub ma dodatkową grupę sprzęgającą; (b) cząstkę, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciw peptydowi BSW17, przy czym składnik (a) jest inny niż Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Yal-Phe do otrzymywania szczepionki przeciwko uczuleniom.