PL187219B1

PL187219B1 - Środek farmaceutyczny i zastosowanie kompozycji agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości

Info

Publication number: PL187219B1
Application number: PL96328831A
Authority: PL
Inventors: Hua Z. Ke; David D. Thompson
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2004-06-30
Also published as: US6323232B1; CN1515317A; AP2002002661A0; HK1018210A1; CN1515258A; CN1515254A; UY24472A1; EP0883404A1; AU1039897A; CZ271898A3; ATE405273T1; KR19990087337A; CN1515316A; JP2002308771A; CA2247420A1; AP975A; CA2247420C; DZ2186A1; BG102726A; MA26420A1

Abstract

1. Srodek farmaceutyczny zawierajacy kompozycje agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddzialywujacej na anabolizm kosci, oraz ewentualnie farmaceutyczny no- snik lub rozcienczalnik, znam ienny tym, ze jako agoniste/antagoniste estrogenu zawiera (E)-3-[1 -[4-[2-(dimetyloamino)etoksy]fenylo]-2-fenylo-1-butenylo]fenol lub (-)-cis-6- fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol, a jako sub- stancje oddzialywujaca na anabolizm kosci zawiera prostaglandyne, korzystnie PGE2- PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są środek farmaceutyczny oraz zastosowanie kompozycji agoeists/aetagoeikty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości.

Określenie „agknista/aetagkeikta estrogenu” odnosi się do związków, które wiążą się z receptorem estrogenowym, hamują cykl metaboliczny kości i zapobiegają ubytkowi kości. Takie działanie specjalista może łatwo ustalić na podstawie standardowych testów obejmujących testy wiązania receptora estrogenowego oraz standardowe histomorfometryczne i densytometryczne pomiary kości (E. F. Eriksen i inni, Bone Histomorphometry, Raven Press, New York, 1994, str. 1-74; S. J. Grier i inni, The Use of Dual-Energy X-Ray Absorptiometry In Animals, Inv. Radiol., 1996, 31(1): 50-62; H. W. Wahner i I. Fogelman, The Evaluation of Osteoporosis: Dual Energy X-Ray Absorptiometry in Clinical Practice, Martin Dunitz Ltd., London 1994, str. 1-296).

Substancje oddziaływujące na anabolizm kości zwiększają masę kości do poziomu powyżej progu pękania kości (World Health Organ-iza^on Study World Health Organization, „Assessment of Fracture Risk and its Applieatike to Serteeieg for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a WHO Study Group. World Health Organization Technical Series 843 ”).

Osteoporoza jest ogólekustrojkwą chorobą układu kostnego charakteryzującą się małą masą kości oraz degradacją tkanki kostnej, co powoduje zwiększoną kruchość kości i podatność na złamania. W Stanach Zjednoczonych Ameryki choroba ta dotyka ponad 25 milionów ludzi i powoduje ponad 1,3 miliona złamań rocznie, w tym corocznie 5θ0θΟΟ złamań kręgosłupa, 250000 złamań biodra i 240000 złamań nadgarstka. Złamania biodra są najpoważniej187 219 sze, gdyż powodują 5-20% zgonów pacjentów w ciągu roku, a 50% przeżywających czynią niesprawnymi.

Największe ryzyko osteoporozy występuje u ludzi w podeszłym wieku, a ponadto przewiduje się, że problem znacznie wzrośnie wraz ze starzeniem się populacji. Przewiduje się także, że ogólnoświatowa częstotliwość występowania złamań kości potroi się w ciągu następnych 60 lat, a w jednym z badań oszacowano, że w 2050 r. będzie 4,5 mlliona złmnńi biodra na świecie.

U kobiet występuje większe ryzyko pojawienia się osteoporozy niż u mężczyzn. Kobiety doświadczają nagłego przyspieszenia utraty kości zaraz po przejściu menopauzy. Inne czynniki zwiększające ubytek kości, a przez to prowadzące do osteoporozy, to palenie, nadużywanie alkoholu, siedzący tryb życia oraz przyjmowanie małych ilości wapnia.

U kobiet środkiem z wyboru w profilaktyce osteoporozy i utraty kości po przejściu menopauzy jest estrogen. Ponadto w EP nr 0605193A1 doniesiono, że estrogen, szczególnie przyjmowany doustnie, obniża poziom LDL w osoczu oraz podwyższa poziom korzystnych lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL). Jednakże długookresowe leczenie estrogenem wiąże się z występowaniem wielu różnych ₍zaburzeń, takich jak zwiększenie ryzyka raka macicy, raka endometrium i prawdopodobnie raka sutka, co spowodowało, iż wiele kobiet unika tego leczenia lub przyjmuje lek tylko przez krótki okres czasu. Pomimo iż uważa się, że ryzyko wystąpienia raka endometrium zmniejsza się przy równoczesnym przyjmowaniu progesteronu, nadal istnieje obawa, że przyjmowanie estrogenu może zwiększać ryzyko wystąpienia raka sutka. Ostatnio sugerowane sposoby leczenia, potencjalnie zmniejszające ryzyko raka, takie jak skojarzone przyjmowanie progesteronu i estrogenu, powodują wystąpienie u pacjentów niedopuszczalnego krwawienia. Ponadto łączenie progesteronu z estrogenem wydaje się osłabiać wpływ estrogenu na zmniejszenie poziomu cholesterolu w surowicy przez estrogen.

Występowanie znacznych niepożądanych skutków ubocznych związanych z leczeniem estrogenami potwierdza potrzebę znalezienia alternatywnego leczenia osteoporozy, mającego pożądany korzystny wpływ na poziom LDL w osoczu, ale nie powodującego niepożądanych skutków ubocznych.

Ostatnio zaproponowano zastosowanie kilku agonistów/antagonistów estrogenu w leczeniu osteoporozy. W Osteoporosis Conference Script nr 1812/13 kwietnia 16/20, 1993 r. na str. 29 podano, że raloksyfen, 6-hydroksy-2-(4-hydroksyfenylo)-3-[4-(2-piperydynoetoksy) benzoilo]benzo[b]tiofen, imituje korzystne działanie estrogenu na kości i lipidy, ale, inaczej niż estrogen, w minimalnym stopniu wpływa na macicę [L. J. Black i inni, Raloxifene (LY139481 Hcl) Prevents Bone Loss and Reduces Serum Cholesterol Without Causing Uterine Hypertrophy in Ovariectomized Rats, J. Clin. Invest, 1994, 93:63-69].

Tamoksyfen, 1-(4-(e-dimetyloaminoetoksyfenylo)-1,2-difenylobut-1-en, jest antyestrogenem, który zaproponowano jako środek o łagodzącym działaniu na raka sutka, jednak stwierdzono, że wykazuje on pewną aktywność estrogenową w macicy. W J Reproduction and Fertility (1993)99, 395, podano, że tamoksyfen w dawkach 200 i 400 mg/kg/dzień zmniejsza masę jąder i drugorzędowych organów płciowych u samców szczura.

Ponadto w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 5254594 ujawniono zastosowanie droloksyfenu w leczeniu chorób kości, włącznie z osteoporozą. Takie środki jak droloksyfen zapobiegają ubytkowi kości i tym samym zmniejszają ryzyko złamania, nie wywołując estrogenowych skutków ubocznych. Jednakże uważa się, że sam estrogen i jego agoniści zmniejszają ryzyko złamania tylko o 50%, a zatem pozostaje około 50% kobiet z osteopenią narażonych na ryzyko złamania związanego z osteoporozą.

W leczeniu osteoporozy proponuje się także stosowanie nieestrogenowych agonistów/antagonistów, takich jak bisfosfoniany. Przykładowo bisfosfonianem przeznaczonym obecnie do leczenia osteoporozy jest Fosamax® . Inne foffomany, te^epk risedronat , iiludronat i ibandronat, są obecnie przedmiotem badań kontrolnych.

Frost i inni w „Treatment of Osteoporosis by Manipuiatifn of Coherent Bone Cell Populations”, Clinical Orthopedics and Related Research, 143, 227 (1979) ujawniają teoretyczny model sugerujący, że powinno być możliwe zsynchronizowanie aktywności i metabolizmu

187 219 komórek kości przez podanie najpierw środka aktywującego komórki kości, a następnie środka hamującego resorpcję kości, co umożliwi normalne tworzenie się kości.

Tang i inni w Restoring and Maintaining Bone in Osteogenic Female Rat Skeleton: I. Changes in Bone Mass and Structure, J Bone Minerał Research 7(9), str. 1093-1104, 1992, ujawniają dane odnoszące się do koncepcji utraty, przywrócenia i utrzymania (LRM), która jest próbą praktycznego odwrócenia istniejącej osteoporozy. Według koncepcji LRM środków oddziaływujących na anabolizm używa się do odtworzenia masy i budowy kości (faza +), a następnie zmienia je na środek mający ustaloną zdolność utrzymywania masy kości, tak aby utrzymać nową kość (faza +/-). W badaniach na szczurach użyto PGE2 i risedronatu, bisfosfonianu, aby wykazać, że większość nowych kości gąbczastych i korowych indukowanych przez PGE2 można utrzymać przez co najmniej 60 dni po przerwaniu podawania PGE2 dzięki podawaniu risedronatu.

Ujawniono także kombinacje bisfosfonianów i prostaglandyn przeznaczone do leczenia osteoporozy. W zgłoszeniu patentowym EP nr 0381296 opisano zestaw, przy użyciu którego prowadzi się najpierw leczenie zapewniające aktywację wzrostu kości, a następnie leczenie środkami hamującymi resorpcję kości. Jako przykładowe związki aktywujące kości wymieniono hormon przytarczyc (PTH), fosforan nieorganiczny, hormon wzrostu, fluorek, hormon tarczycy (np. tyroksynę), pewne metabolity witaminy D oraz prostaglandyny (PGE2 w dawce 10 mg/kg na dzień). Jako środki hamujące resorpcję kości ujawniono polifosfoniany.

W PCT/US93/08529 ujawniono równoczesne podawanie środka aktywującego kość, takiego jak prostaglandyna, sprzężonego chemicznie ze związkiem hamującym resorpcję kości, który dostarcza środek aktywujący kość selektywnie do miejsca docelowego. W wyniku stopniowej hydrolizy nowego związku zhydrolizowane produkty mają zdolność hamowania resorpcji kości (poprzez bisfosfoniany) oraz stymulacji lub wzrostu kości (poprzez PGE2).

Skutki kombinacji prostaglandyny E2 z risedronatem (bisfosfonianem) badali Lin i inni, Effects of Prostaglandin E2 and Risedronate Administration on Cancellous Bone in Older Female Rats, Bone 15(5), str. 489-496, 1994.

Qiu i inni w Experimental Study on Antiatherosclerotic Treatment by PGE2, Combined With Vitamin E and Estradiol, Chinese Medicał Journał, , 108(1) rtr. 3-^-36, ujawnił i, że pojedyncza dawka PGE2 w połączeniu z witaminą E i z estradiolem hamowała koordynująco uszkodzenia aortalne i wieńcowe, a także agregację płytek, proliferację mięśni gładkich oraz peroksydację lipidów, w większym stopniu niż pojedyncza dawka PGE2.

W abstrakcie „Nonhormonal Alternatives for the Management of Early Menopause in Younger Women with Breast Cancer”, Monogr. Natł. Cancer Inst. (16), 161-167, 1994, stwierdzono, że „Zastosowanie pewnych terapii nieestrogenowych w zapobieganiu i leczeniu osteoporozy dało obiecujące rezultaty. Tradycyjne zalecenia w celu utrzymania integralności szkieletu, takie jak ćwiczenia z ciężarkami, dieta bogata w wapń i z obniżonym spożyciem kofeiny, alkoholu i białka, unikanie palenia oraz przedsięwzięcia minimalizujące urazy rozszerzono o użycie lub badanie leków (pojedynczo lub w połączeniach). Do leków tych należą progestyny, metabolity witaminy D, dająca się wstrzykiwać lub donosowa syntetyczna kalcytonina łososiowa, bisfosfoniany, fluorek sodu, hormon przytarczyc, czynniki wzrostu, tamoksyfen itd.”

W europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 0635270 ujawniono kompozycję farmaceutyczną raloksyfenu i hormonu przytarczyc (PTH) lub jego fragmentów i zmodyfikowanych pochodnych aminokwasowych, przeznaczoną do stosowania w leczeniu osteoporozy Nie podano tam żadnych wzmianek o możliwości stosowania raloksyfenu wraz z innymi środkami anabolicznymi.

W artykule „Present and Future of Osteoporosis Therapy” opublikowanym w Bone, tom 17, nr 2, 1995 1. na sti. 23S-99S lywnniooo, że prostagladyyyy odzziałwują na anaoolimn kości. Jednak, mimo że prootaglan0yaa E2 nasila okoaookostyrwż i śródkostne tworzenie się kości, może ona upośledzać wytrzymałość szkieletu poprzez zwiększenie porowatości warstwy korowej.

Opis patentowy St. ZjżOo. Ameryki nr 5281590 dotyczy sposobu leczenia osteoporozy u ssaka. W opisie tym ujawniono szereg podstawionych związków Oibżazoksazżpiyrwych wykazujących aktywność antagonistów prrstaglaadyay E2, jednak brak jest w nim wzmianek

187 219 na temat możliwości łączenia tych związków z innymi środkami wpływającymi na tworzenie się kości.

Zatem pomimo, iż istnieje wiele różnych terapii chorób objawiających się małą masą kości, a zwłaszcza osteoporozy, nadal występuje potrzeba opracowania alternatywnych terapii, ponieważ obecne terapie w ograniczonym stopniu zmniejszają częstotliwość złamań związanych z osteoporozą.

Nieoczekiwanie okazało się, że taką terapię umożliwia środek farmaceutyczny według wynalazku, zawierający kompozycję agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości, oraz ewentualnie farmaceutyczny nośnik lub rozcieńczalnik, którego cechą jest to, że jako agonistę/antagonistę estrogenu zawiera (E)-3-[l-[4-[2-(dimetyloamino) etoksy]fenylo]-2-fenylo-l-butenylo]fenol (droloksyfen) lub (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidynl-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol,. a jako substancję oddziaływującą na anabolizm kości zawiera prostaglandynę, korzystnie PGE2 .

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości, to jest kompozycji droloksyfenu lub (-)-cis6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1 -yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu z prostaglandyną, korzystnie PGE2, do wytwarzania leku do leczenia stanu objawiającego się małą masą kości u ssaków, zwłaszcza osteoporozy.

Szczególnie korzystnie powyższych agonistów/antagonistów estrogenu stosuje się w połączeniu z PGE2.

Określenie „prostaglandyna” odnosi się do związków będących analogami naturalnych prostaglandyn PGDi, PGD2, PGE2, PGEi i PGF2Ct, przydatnych w leczeniu osteoporozy. Związki te wiążą się z receptorami prostaglandyny. Występowanie takiego wiązania specjalista może łatwo ustalić na podstawie standardowych testów (S. An i inni, Cloning and Expression of the EP2 Subtype of Humań Receptors for Prostaglandin E2, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, 197(1): 263-270).

Prostaglandyny są acyklicznymi związkami spokrewnionymi ze związkiem podstawowym, kwasem prostanowym. Atomy węgla w podstawowej prostaglandynie numeruje się kolejno od karbocyklicznego atomu węgla, poprzez pierścień cyklopentylowy do końcowego atomu węgla w sąsiadującym bocznym łańcuchu. Normalnie sąsiadujące boczne łańcuchy są w orientacji trans. Obecność grupy okso przy C-9 grupie cyklopentylowej jest charakterystyczna dla prostaglandyny klasy E, natomiast PGE2 zawiera trans-nienasycone wiązanie podwójne pomiędzy C13-C14 i wiązanie podwójne cis w pozycji C5-C6·

Przykładowe prostaglandyny ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjedn. Ameryki nr 4171331 i 3927197. W publikacji Norrdina i innych, The Role of Prostaglandins in Bone in Vivo, Prostaglandins Leukotriene Essential Fatty Acids 41, 139-150, 1990, przedstawiono przegląd prostaglandyn aktywnych w stosunku do kości.

Określenie „stan objawiający się małą masą kości” odnosi się do stanu chorobowego, w którym poziom masy kości jest mniejszy od właściwej dla wieku normalnej masy, określonej w normach Światowej Organizacji Zdrowia „Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994), Report of a World Health Organization Study Group, World Health Organization Technical Series 843 Obejmuje ono również samoistną osteoporozę dziecięcą i osteoporozę pierwotną. Leczenie osteoporozy obejmuje również zapobieganie lub zmniejszanie powikłań występujących przez dłuższy okres czasu, takich jak skrzywienie kręgosłupa i spadek wzrostu, unikanie konieczności stosowania protez chirurgicznych oraz zapobieganie nieprawidłowemu działaniu gruczołu krokowego. Obejmuje ono ponadto zwiększanie zrastania się pęknięć kości i zwiększanie powodzenia przeszczepów kostnych, a także leczenie chorób ozębnej i ubytków kości zębodołu.

Określenie „stan objawiający się małą masą kości” odnosi się także do ssaków, u których występuje znacznie większe od przeciętnego prawdopodobieństwo rozwinięcia się chorób opisanych powyżej, takich jak osteoporoza (kobiety po klimakterium, mężczyźni w wieku ponad 60 lat i osoby leczone środkami znanymi z tego, że powodują osteoporozę jako działanie uboczne, takimi jak glukokortykoid).

187 219

Określenie „masa kości” w rzeczywistości odnosi się do masy kości na jednostkę powierzchni, zwanej czasem mineralną gęstością kości.

Określenia „leczenie” lub „leczyć” odnosi się również do działania zapobiegawczego (np. profilaktycznego) i łagodzącego.

Środek według wynalazku znajduje zastosowanie w sposobie leczenia ssaków z małą masą kości, korzystnie osteoporozy. Sposób ten polega na tym, że ssakowi, u którego występuje stan objawiający się małą masą kości, podaje się terapeutycznie skuteczną ilość wyżej zdefiniowanych agonistów/antagonistów estrogenu, oraz terapeutycznie skuteczną ilość wyżej zdefiniowanej substancji oddziaływującej na anabolizm kości.

Środek farmaceutyczny według wynalazku jest przydatny w zastosowaniach terapeutycznych jako środek oddziaływujący na cykl metaboliczny lub zapobiegający resorpcji kości albo przyspieszający tworzenie się kości u ssaków, zwłaszcza u ludzi. Zatem środek według wynalazku zwiększa lub utrzymuje masę kości, co zapobiega osteoporozie i pokrewnym zaburzeniom kostnym, albo powoduje ich zahamowanie i/lub cofanie się. Środek ten zapewnia przyrost masy kostnej szybszy i większy od uzyskiwanego w przypadku takich samych dawek wyżej zdefiniowanych agonistów/antagonistów estrogenu lub takich samych dawek wyżej zdefiniowanych substancji oddziaływujących na anabolizm kości. Tak więc wykazuje on działanie synergiczne, zwiększając masę kości i zmniejszając szybkość ich pękania w stopniu większym od uzyskiwanego w wyniku zastosowania osobno każdego z tych składników.

Poszczególne związki można podawać dowolnym sposobem zapewniającym ogólnoustrojowe i/lub miejscowe podanie danego związku. Można je więc podawać doustnie, pozajelitowo, dodwunastniczo itp. Zazwyczaj środek według wynalazku podaje się doustnie, z tym że można również stosować podawanie pozajelitowe (np. dożylne, domięśniowe, podskórne lub wewnątrzrdzeniowe), np. w przypadku, gdy podawanie doustne jest nieodpowiednie z uwagi na założony cel, lub gdy pacjent nie może przełknąć leku. Dwa związki tworzące środek według wynalazku można podawać równocześnie lub kolejno, w dowolnej kolejności, korzystnie w postaci pojedynczego środka farmaceutycznego zawierającego te dwa związki w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.

Przykładowo substancję oddziaływującą na anabolizm kości, samą lub w połączeniu z agonistą/antagonistą estrogenu, można podawać przez okres od 3 miesięcy do 3 lat, a następnie podawać samego agonistę/antagonistę estrogenu przez okres od 3 miesięcy do 3 lat i ewentualnie powtórzyć cały cykl leczenia. Alternatywnie można stosować substancję oddziaływującą na anabolizm kości, samą lub w połączeniu z agonistą/antagonistą estrogenu, przez okres od 3 miesięcy do 3 lat, a następnie podawać samego agonistę/antagonistę estrogenu do końca życia pacjenta. Substancję oddziaływującą na anabolizm kości można np. podawać raz dziennie, a agonistę/antagonistę estrogenu można podawać codziennie w jednej lub większej liczbie dawek. Alternatywnie oba związki można podawać kolejno, przy czym substancję oddziaływującą na anabolizm kości można podawać raz dziennie przez okres czasu wystarczający do powiększenia masy kości do poziomu powyżej progu pękania kości, a następnie podawać agonistę/antagonistę estrogenu) codziennie w jednej lub większej liczbie dawek.

Korzystnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości podaje się przez okres od około 3 miesięcy do około 3 lat i ewentualnie po tym okresie podawania tego związku podaje się agonistę/antagonistę estrogenu przez okres od około 3 miesięcy do około 3 lat, bez podawania w tym okresie substancji oddziaływującej na anabolizm kości.

Alternatywnie po podawaniu substancji oddziaływującej na anabolizm kości agonistę/antagonistę estrogenu podaje się przez okres powyżej około 3 lat, bez podawania w tym okresie substancji oddziaływującej na anabolizm kości.

Korzystnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości podaje się raz dziennie w postaci zapewniającej szybkie uwalnianie, korzystnie doustnej (to znaczy należy unikać postaci dawkowanych o przedłużonym uwalnianiu).

W każdym przypadku ilość i okres czasu podawania związków będą oczywiście zależne od leczonego osobnika, ostrości choroby, sposobu podawania i oceny lekarza przepisującego lek. Dlatego też, z uwagi na różnice pomiędzy poszczególnymi pacjentami, podane poniżej dawki stanowiąjedynie wskazówki co do dawek pozwalających uzyskać aktywność (np. przy187 219 rost masy kostnej), którą uważa się za odpowiednią dla danego pacjenta. Przy ustalaniu żądanego stopnia aktywności lekarz musi uwzględnić szereg czynników, takich jak wyjściowy poziom masy kości, wiek pacjenta, występowanie wcześniejszej choroby, a także występowanie innych chorób (np. sercowo-naczyniowych). Podawanie agonisty/antagonisty estrogenu może korzystnie wpływać na układ sercowo-naczyniowy, zwłaszcza u kobiet po przejściu menopauzy.

Stosowana ilość agonisty/antagonisty estrogenu jest określona jego aktywnością jako środka hamującego ubytek kości. Aktywność tę można określić na podstawie farmakokinetyki poszczególnych związków oraz minimalnej/maksymałnej dawki hamującej ubytek kości, z wykorzystaniem niżej opisanego protokołu agonisty/antagonisty estrogenu.

Ogólnie skuteczna dawka agonisty/antagonisty estrogenu wynosi 0,01-200 mg/kg/dzień, korzystnie 0,5-100 mg/kg/dzień.

W szczególności skuteczna dawka droloksyfenu wynosi 0,1-40 mg/kg/dzień, korzystnie 0,1-5 mg/kg/dzień.

Skuteczna dawka (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1 -yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu wynosi 0,0001-100 mg/kg/dzień, korzystnie 0,001-10 mg/kg/dzień.

Ogólnie substancję oddziaływującą na anabolizm kości, np. PGE2, stosuje się w ilości wystarczającej do zwiększenia masy kości do poziomu powyżej progu pękania kości (którego szczegóły podano w cytowanym powyżej World Health Organization Study).

Ogólnie skuteczna dawka substancji oddziaływującej na anabolizm kości wynosi 0,001100 mg/kg/dzień, korzystnie 0,1-10 mg/kg/dzień.

W szczególności skuteczna dawka PGE₂ wynosi 0,001-10 mg/kg/dzień, korzystnie 0,011 mg/kg/dzień.

W przypadku podawania doustnego środek farmaceutyczny może mieć postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków itp. Tabletki dogodnie zawierają różne zarobki, takie jak cytrynian sodu, węglan wapnia i fosforan wapnia, stosowane wraz z różnymi środkami ułatwiającymi rozpad, takimi jak skrobia, korzystnie skrobia ziemniaczana lub tapiokowa, oraz pewne złożone krzemiany, wraz ze środkami wiąźącymi, takimi jak poliwinyłopirolidon, sacharoza, żelatyna i guma arabska. Przy tabletkowaniu często są przydatne środki smarujące, takie jak stearynian magnezu, laurylosiarczan sodu i talk. Stałe kompozycje podobnego typu stosuje się również jako wypełnienie miękkich i twardych kapsułek żelatynowych, przy czym do korzystnych materiałów w takim zastosowaniu należy również laktoza czyli cukier mleczny oraz glikole polietylenowe o wysokiej masie cząsteczkowej. Dla wytworzenia wodnych zawiesin i/lub eliksirów do podawania doustnego substancje czynne można łączyć z różnymi środkami słodzącymi, środkami aromatyzującymi, środkami barwiącymi, środkami emulgującymi i/lub środkami zawieszającymi, a także z rozcieńczalnikami, takimi jak woda, etanol, glikol propylenowy, gliceryna i różne ich kombinacje.

Do podawania pozajelitowego można stosować roztwory w oleju sezamowym lub arachidowym albo wodne roztwory glikolu propylenowego, a także sterylne wodne roztwory odpowiednich soli rozpuszczalnych w wodzie. Takie wodne roztwory w razie potrzeby można dogodnie buforować, a ciekłemu rozcieńczalnikowi można najpierw nadać izotoniczność za pomocą odpowiedniej ilości soli lub glukozy. Takie wodne roztwory są szczególnie przydatne do iniekcji dożylnej, domięśniowej, podskórnej i śródotrzewnowej. W takim przypadku wszystkie sterylne wodne ośrodki łatwo wytwarza się zwykłymi sposobami znanymi specjalistom.

Do podawania przezskómego (czyli miejscowego) wytwarza się rozcieńczone wodne, lub częściowo wodne roztwory' (zazwyczaj o stężeniu około 0,1-5%), pod innymi względami podobne do wyżej opisanych roztworów do podawania pozajelitowego.

Sposoby wytwarzania różnych środków farmaceutycznych z określonymi ilościami substancji czynnej są znane lub będą dla specjalistów oczywiste (patrz np. Remingtoris Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., wyd. 15. (1975)).

Środki farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać 0,1-95%, a korzystnie 1-70% substancji czynnej (substancji czynnych). W każdym przypadku podawany środek lub preparat będzie je zawierał w ilości skutecznie leczącej chorobę/stan leczonego pacjenta.

187 219

W związku z tym, że środek według wynalazku umożliwia zwiększanie i utrzymywanie masy kości poprzez zastosowanie kombinacji substancji czynnych, które można podawać osobno, może mieć on także postać zestawu zawierającego odrębne preparaty farmaceutyczne tych substancji czynnych. Zestaw zawiera zatem preparat agrnisty/antagonisty estrogenu i preparat substancji oddziaływującej na anabolizm kości w odpowiednim pojemniku, takim jak podzielona butelka lub podzielony pakiecik foliowy. Zazwyczaj zestaw zawiera wskazówki odnośnie podawania odrębnych składników. Postać zestawu jest szczególnie dogodna, gdy odrębne składniki korzystnie podaje się w różnych postaciach dawkowanych (np. Oo podawania doustnego i pozajelitowego), gdy podaje się je w różnych odstępach czasu, lub gdy pożądane jest dopasowywanie poszczególnych składników kompozycji przez lekarza.

Przykład takiego zestawu stanowi tak zwane opakowanie listkowe. Opakowania listkowe są znane w przemyśle opakowań i są powszechnie stosowane do pakowania farmaceutycznych jednostkowych postaci dawkowanych (tabletek, kapsułek itp.). Opakowanie listkowe zazwyczaj składa. się z arkusika stosunkowo sztywnego materiału przykrytego folią, korzystnie z przezroczystego tworzywa. W czasie pakowania w folii tworzywowej formuje się zagłębienia. Zagłębienia mają kształt i wielkość pakowanych tabletek lub kapsułek. Następnie w zagłębieniach umieszcza się tabletki lub kapsułki i arkusz stosunkowo sztywnego materiału szczelnie łączy się z folią po stronie folii przeciwnej do kierunku, w którym wykonane zostały zagłębienia. W efekcie tabletki lub kapsułki są szczelnie zamknięte w zagłębieniach pomiędzy folią z tworzywa i arkuszem. Korzystnie wytrzymałość arkusza jest taka, że tabletki lub kapsułki można wyjąć z listka naciskając ręcznie na zagłębienie, na skutek czego w arkuszu tworzy się otwór w miejscu zagłębienia. Tabletkę lub kapsułkę można następnie wyjąć przez ten otwór.

Pożądane jest umieszczenie instrukcji na karcie, np. w postaci liczb w sąsiedztwie tabletek lub kapsułek, które to liczby odpowiadają dniom cyklu, w których zaznaczone tabletki lub kapsułki powinny zostać połknięte. Inny przykład takiej instrukcji stanowi nadrukowany na karcie następujący kalendarz „pierwszy tydzień, poniedziałek, wtorek, itd., ...drugi tydzień, poniedziałek, wtorek...” itp. Łatwo można sobie wyobrazić inne warianty instrukcji. „Dzienną dawkę” może stanowić pojedyncza tabletka lub kapsułka albo szereg pigułek lub kapsułek przeznaczonych na dany dzień. Ponadto dzienną dawkę substancji oddziaływującej na ayaars lizm kości może stanowić jedna tabletka lub kapsułka, a dzienna dawka agonisty/aytαgoyisty estrogenu może składać się z szeregu tabletek lub kapsułek. Powinno to być odzwierciedlone na instrukcji.

Można też stosować dozownik przeznaczony Oo dozowania dziennych dawek, po jednej na raz, w kolejności ich przewidywanego stosowania. Korzystnie dozownik wyposażony jest w instrukcję, aby ułatwić postępowanie zgodnie z trybem leczenia. Przykład takiej instrukcji stanowi mechaniczny licznik wskazujący liczbę dozowanych dziennych dawek. Inny przykład takiej instrukcji stanowi zasilana z baterii pamięć mikroprocesorowa sprzężona z odczytem ciekłokrystalicznym, albo układ przypominający z sygnałem dźwiękowym, który np. odczytuje dane, że ostatnia dzienna dawka została pobrana i/lub przypomina pacjentowi, że należy wziąć następną dawkę.

Wraz z wyżej zdefiniowanymi substancjami czynnymi stanowiącymi składniki środka farmaceutycznego według wynalazku można stosować inne środki zapobiegające resorpcji (bisfosfonian, estrogen, estradiol, premarin, esTon, estriol lub 17α- albo Γ7β-żtyaylożstradirl) oraz inne środki oddziaływujące na ayaarlizm kości (aydrogży), agoyiota/antaaryistα ayOroażyu).

Przykładowo z dpoloksyfżnżm, można łączyć inne niż wyżej zdefiniowane substancje oddziaływujące na anabolizm kości, takie jak hormon przytarczyc, hormon wzrostu lub czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu.

Oprócz Orrlrksyfeyu można także stosować inne związki mu pokrewne, a mianowicie tamoksyfen (2shydrrksy-1,2,3-propanotpikapaoksylaa (1:1) (Z)-2-[4s(1,2-0ifenylo-1-butżaylr) fżnoksy]-N,N-dimetylożtanramiay) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4536516; 4-hy0rrksytamoksyfża ujawniony w opisie patentowym Stanów ZjeOn. Ameryki nr 4623660; palokoyfey (chlorowodorek [6-hyOrokoy-2-(4-hyOrrkoyfżaylr)bżazo[b]tiżn-3-ylr] [4-[2-(1-pipżrydynylo)żtoksy]fżyylr]mżtaaoau) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4418068; trpżmyfża (2187219 hydroksy-l,2,3-propanotrikarboksylan (1:1) (Z)-2-[4-(4-chloro-l ,2-difenylo-l -butenylo)fenoksy]-N,N-dimetyIoetanoaminy) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4996225; centchroman (l-[2-[[4-(metoksy-2,2-dimetylo-3-fenylochroman-4-ylo)fenoksy]etylo]pirolidyna) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3822287; i idoksyfen (l-[[4-[[l-(4-jodofenylo)-2-fenylo-lbutenylojfenoksyjetylojpirolidyna) oraz związki pokrewne ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4839155.

Oprócz (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-l-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-olu jako agonisty/antagonisty estrogenu można także stosować związki mu pokrewne, a mianowicie związki o ogólnym wzorze

w którym

A oznacza CH₂ lub NR;

B, D i E niezależnie oznaczają CH lub N;

Y oznacza (a) fenyl ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R⁴;

(b) naftyl ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R⁴;

(c) C3-C8 cykloalkil ewentualnie podstawiony 1-2 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R⁴;

(d) C3-C8 cykloalkenyl ewentualnie podstawiony 1-2 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R⁴;

(e) pięcioczłonowy heterocyklil zawierający do 2 heteroatomów wybranych z grupy obejmującej -0-, -NR²- i -S(0)_n-, ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R⁴;

(f) sześcioczłonowy heterocyklil zawierający do 2 heteroatomów wybranych z grupy obejmującej -O- , -NR²- i -S(0)_n-, ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R⁴;

(g) bicykliczny układ pierścieniowy składający się z pięcio- lub sześcioczłonowego pierścienia heterocyklicznego skondensowanego z pierścieniem fenylowym, który to pierścień heterocykliczny zawiera do 2 heteroatomów wybranych z grupy obejmującej -O- , -NR²- i -S(O)_n-j ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R⁴;

Z oznacza (a) grupę -(CH₂)_pW(CH₂)_q;

(b) -O(CH₂)_PCR⁵R⁶;

(c) -O(CH₂)_pW(CH₂)_q;

(d) -OCHR²CHR³; albo (e) -SCHR²CHR³;

G oznacza (a) -NR⁷R⁸;

187 219 (b) /CHj); -N \

(CH^ gdzie n oznacza 0, 1 lub 2; m oznacza 1, 2 lub 3;

Z² oznacza -NH-, -O-, -S- lub -CH2-; ewentualnie skondensowany poprzez sąsiednie atomy węgla z jednym lub dwoma pierścieniami fenylowymi, oraz ewentualnie, niezależnie podstawiony przy atomach węgla 1-3 podstawnikami, a także, ewentualnie, niezależnie podstawiony przy atomie azotu odpowiednim pod względem chemicznym podstawnikiem wybranym spośród R⁴;

(c) ugrupowapie bicykliccmel iuniny zawierające 5-12 atom ów wógl a, w układzie mzstkowym lub skondensowanym, ewentualnie podstawione 1-3 podstawnikami niezależnie wybranymi spośród R4; albo Z¹ i G mogą razem oznaczać z

W oznacza (a) -CH2-;

(b) -CH=CH-;

(c) -O-;

(d) -NR2-;

(e) -S(O)n-;

(f) -C(O>;

(g) -CR2(OH)-;

(h) -CONR2-;

(i) -NR2CO-

lub (k) -C=C-; R oznacza atom wodom lub C1-C6 alkil;

R2 i R³ niezależnie oznaczają (a) atom wodoru lub (b) C1-C4 alkil; R4 oznacza (a) atom wodoru; (b) atom chlorowca;

(c) C1-C6 alkil;

(d) C1-C4 alkoksyl;

(e) C1-C4 acyloksyl;

(f) grupę C1-C4 alkilotio;

(g) C1-C4 alkilosulfinyl;

(h) C1-C4 aleilosolfocyl;

(i) hydroksy-(C1-C4)alkil;

(j) arylo-(C_rC4)alkil;

(k) -CO2H;

(l) -CN;

(m) -CONHOR;

(n) -SO2NHR;

187 219 (Ο) -ΝΗ₂;

(ρ) grupę C1-C4 alkiloaminową;

(q) grupę C1-C4 dialkiloaminową;

(r) -NHSO2R;

(s) -NO2;

(t) aryl; lub (u) -OH; R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają Ci-Cg alkil albo tworzą razem pierścień C3-C10 karbocykliczny;

R⁷ i R⁸ niezależnie oznaczają (a) fenyl;

(b) pierścień C3-C10 karbocykliczny, nasycony lub nienasycony;

(c) pierścień C3-C₎₀ heterocykliczny zawierający do dwóch heteroatomów wybranych spośród -0-, -N- i -S-;

(d) H;

(e) Ci-Cć alkil; albo (f) tworzą razem z R⁵ i R⁶ 3-8-członowy pierścień zawierający atom azotu;

R 1 R⁸ w postaci liniowej lub pierścieniowej mogą być ewentualnie podstawione podstawnikami, w liczbie do trzech, niezależnie wybranymi spośród Ci-Cć alkilu, atomu chlorowca, alkoksylu, hydroksylu i karboksylu; pierścień utworzony przez R⁷ i R⁸ może być ewentualnie skondensowany z pierścieniem fenylowym; e oznacza O, 1 lub 2; m oznacza 1, 2 lub 3; n oznacza O, 1 lub 2; p oznacza O, 1, 2 lub 3; q oznacza O, 1, 2 lub 3; oraz ich izomery optyczne i geometryczne, a także ich nietoksyczne farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami, N-tlenki, estry i czwartorzędowe sole amoniowe.

Do korzystnych związków tego typu należą związki o wzorze

lub

-N w którym G oznacza.

albo

R oznacza H, OH, F lub Cl; a każdy spośród B i E niezależnie oznacza CH lub atom azotu.

Do szczególnie korzystnych związków należą:

cis-6-(4-fluorofenylo)-5-[4-(2-piperydyn-l-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol ;

cis-6-fenyIo-5-[4-(2-pirolidyn-l-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol; cis-l-(6'-pirolidynoetoksy-3'-pirydylo)-2-fenylo-6-hydroksy-I,2,3,4-tetrahydronaftalen; l-(4'-pirolidynoetoksyfenylo)-2-(4-fluorofenylo)-6-hydroksy-1,2,3,4-tetrahydroizochinolina;

cis-6-(4-hydroksyfenylo)-5-[4-(2-piperydyn-l-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol;

l-(4’-pirolidynoetoksyfenylo)-2-fenylo-6-hydroksy-l,2,3,4-tetrahydroizochinolina.

187 219

Ponadto jako dodatkowych agonistów/antagonistów estrogenu można stosować pochodne 2-fenyio-3-arfilobenzotiofenu i 1-tlenku 2-fenylo-3-aroilfbsnzotiofenu ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4133814; antagonistów estrogenu o wzorze

OR³

4 w którym R² oznacza fenyl lub cyklopentyl, a R oznacza H,

-CH₂CH₂—N lub -CH2CHOHCH2OH ^dnicer i inni, J. Med.. Chem., 12, 881 (1969); agonistów/antagonistów estrogenu o wzorze

R w którym Ph oznacza rodnik 1,2-fenylenowy, Ar oznacza monocykliczną arylową grupę karbocykliczną podstawioną grupą trzsciorzędowo-amino-niższoalkiloksyiowąt w której trzeciorzędowa grupa aminowa jest oddzielona od grupy oksy co najmniej dwoma atomami węgla, R oznacza atom wodoru, rodnik alifatyczny, karbocykliczny rodnik arylowy, rodnik karbocykliczno-arylo-aiifatycznyt heterocykliczny rodnik arylowy lub rodnik heterocykliczno-arylo-alifatyczny, grupa -(CiH2i-2)- oznacza nierozgałęziony rodnik alkilenowy zawierający 3-5 atomów węgla, zawierający podstawniki Ar i R, ich sole, N-tlenki, sole N-tlenków lub czwartorzędowe związki amoniowe, ujawnionych w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3234090; zasadowe etery o działaniu agonistów/antagonistów estrogenu, o wzorze _:-^^Ar

Ph ,*(f-₂H_2n_₂) ¹R w którym Ph oznacza rodnik 1 t2-fsnyisnfwyt Ar oznacza monocykliczną arylową grupę karbocykliczną podstawioną co najmniej jedną grupą amino-niższoaikiioksylowąt w której atom azotu jest oddzielony od atomu tlenu co najmniej dwoma atomami węgla, R oznacza rodnik arylowy, a grupa -(CiH2i-2)- oznacza niższy alki^n tworzący z Ph 6- lub 7-członowy pierścień, przy czym jego dwa atomy węgla w pierścieniu zawierają jako podstawniki grupy Ar i R, ich sole, N-tlenki, N-tlenki soli i czwartorzędowe związki amoniowe, ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3277106; oraz związki będące agonistami/antagonistami estrogenu, o wzorze

187 219

w którym Ri i R2 są wybrane z grupy obejmującej niższy alkil lub są połączone tworząc 5-7członowy nasycony pierścień heterocykliczny, ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3274213.

Jako dodatkową substancję oddziaływującą na anabolizm kości można stosować agonistę/antagonistę prostaglandyny, fluorek sodu, hormon przytarczyc (PTH), aktywne fragmenty hormonu przytarczyc, hormon wzrostu lub czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu.

Określenie „agonista/antagonista prostaglandyny” odnosi się do związków, które wiążą się z receptorami prostaglandyny (patrz np. S. An i inni, Cloning and Expression of the EP2 Subtype of Human Receptors for Prostaglandin E2, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, 197(l):263-270) naśladując działanie prostaglandyny in vivo (np. stymulując tworzenie się kości i wzrost masy kości).

Jako tę dodatkową substancję oddziaływującą na anabolizm kości można przykładowo stosować 2-dezkarboksy-2-(tetrazol-5-ilo)-11-dezoksy-15-podstawione-omega-pentanorprostaglandyny (opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 3932389);

p-bifenylowe estry 16-arylo-13,14-dihydro-PGE2 (opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 4018892);

2,3,6-podstawione-4-pirony (opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 4219483);

2,3,6-podstawione-4-pirony (opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 4132847); p-bifenylowe estry 16-arylo-13,14-dihydro-PGE2 (opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 4000309);

p-bifenylowe estry 16-arylo-13,14-dihydro-PGE2 (opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 3982016);

podstawione cyklopentany (opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 4621100); cyklopentanony (opis patentowy Stanów Zjedn. Ameryki nr 5216183).

Określenie „fluorek sodu” odnosi się do fluorku sodu we wszelkich postaciach, np. do fluorku sodu o powolnym uwalnianiu, fluorku sodu o przedłużonym uwalnianiu. Fluorek sodu o przedłużonym uwalnianiu ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 4904478.

Określenie „hormon przytarczyc” odnosi się do hormonu przytarczyc, jego fragmentów lub metabolitów, oraz jego strukturalnych analogów, które mogą pobudzać tworzenie się kości i wzrost masy kości. Przykładowe hormony przytarczyc ujawniono w publikacjach „Human Parathyroid Peptide Treatment of Vertebral Osteoporosis”, Osteoporosis Int, 3, (Supp. 1): 199-203 i „PTH 1-34 Treatment of Osteoporosis with Added Hormone Replacement Therapy: Biochemical, Kinetic and Histological Responses”, Osteoporosis Int., 1: 162-170.

Określenie „czynnik stymulujący wydzielanie hormonu wzrostu” odnosi się do związków, które stymulują wydzielanie hormonu wzrostu lub naśladują działanie hormonu wzrostu, np. stymulując tworzenie się kości, co prowadzi do wzrostu masy kości. Szereg takich związków ujawniono w następujących publikowanych zgłoszeniach patentowych PCT: WO 95/14666, WO 95/13069, WO 94/19367, WO 94/13696 i WO 95/34311.

Szczególnie korzystnym czynnikiem stymulującym wydzielanie hormonu wzrostu jest N-[l(R)-[1,2-dihydro-1-metanosulfonylospiro[3H-indoIo-3,4'-piperydynj-1'-ylo)karbonylo]2-(fenylometyloksy)etylo]-2-amino-2-metylopropanoamid: MK-677, a ponadto korzystne są 2-amino-N-[2-(3a-(R)-benzylo-2-metylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo-[4,3-c]pirydyn-5-ylo)-1-(R)-benzyloksymetylo-2-oksoetylo]izobutyroamid lub jego sól z kwasem L14

187 219 winowym; 2-amino-N-{l-(R)-benzyloksymetylo-2-[3a-(R)-(4-fluorobenzylo)-2-metylo-3-okso2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo-[4,3-c]pirydyn-5-ylo]-2-oksoetylo}izobutyroamid i 2-aminoN-[2-(3a-(R)-benzylo-3-okso-2,3,3a,4,6,7-heksahydropirazolo-[4,3-c]pirydyn-5-ylo)-l-(R)-benzyloksymetylo-2-oksoetylo]izobutyroamid.

Środki farmaceutyczne według wynalazku są przydatne w zastosowaniach terapeutycznych jako środki, które oddziaływują na cykl metaboliczny lub zapobiegają resorpcji kości albo przyspieszają tworzenie się kości u ssaków, zwłaszcza u ludzi. W związku z tym, że takie objawy są ściśle związane z rozwojem osteoporozy i innymi zbliżonymi zaburzeniami kostnymi, takie środki, z uwagi na ich działanie na kości, zapobiegają osteoporozie albo powodują jej zatrzymanie, cofanie się lub odwrócenie.

Użyteczność środka farmaceutycznego według wynalazku w leczeniu stanów objawiających się niską masą kości, a zwłaszcza osteoporozy, u ssaków (tj. ludzi, w szczególności kobiet) można określić jako aktywność poszczególnych związków w znanych testach in vitro i in vivo opisanych poniżej. Testy te umożliwiają porównanie aktywności poszczególnych związków badanych i związków znanych. Wyniki tych testów porównawczych są użyteczne w określaniu poziomów dawek u ssaków, włącznie z człowiekiem, w leczeniu takich chorób.

Protokół leczenia skojarzonego i sekwencyjnego

Poniższe protokoły mogą być oczywiście zmieniane przez specjalistów. Na przykład mogą być użyte samce lub samice szczura bez uszkodzeń, samce z niedoborem hormonów płciowych (z wyciętymi jądrami) lub samice z niedoborem hormonów płciowych (z wyciętymi jajnikami). Ponadto w badaniach można użyć samce lub samice szczura w różnym wieku, takim jak 12 miesięcy. Szczury mogą być bez uszkodzeń lub wykastrowane (z wyciętymi jądrami lub jajnikami) i można im podawać substancje oddziaływujące na anabolizm, takie jak prostaglandyna E2 (PGE2) w różnych dawkach, np. 1, 3 lub 6 mg/kg/dzień, przez pewien okres czasu, np. przez dwa tygodnie do dwóch miesięcy, a następnie podawać agonistę/antagonistę estrogenu, takiego jak droloksyfen w różnych dawkach, np. 1, 5, 10 mg/kg/dzień, przez pewien okres czasu, np. przez dwa tygodnie do dwóch miesięcy, lub stosować leczenie skojarzone zarówno z substancją oddziaływującą na anabolizm kości jak z agonistą^/antagonistą estrogenu w różnych dawkach przez pewien okres czasu, np. przez dwa tygodnie do dwóch miesięcy. U wykastrowanych szczurów leczenie można zacząć w dzień po operacji (w celu zapobieżenia utracie kości) lub w momencie gdy wystąpiła już utrata kości (w celu przywrócenia masy kości).

W następujących opisanych protokołach użyto PGE2 jako substancję oddziaływującą na anabolizm kości i droloksyfenu jako agonistę/antagonistę estrogenu, jednakże zgodnie z protokołem można także przebadać inne substancje oddziaływujące na anabolizm kości lub innych agonistów/antagonistów estrogenu.

Sto cztery samice szczurów Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, MA) w wieku 12 miesięcy poddaje się operacji sham lub pozbawiającej jajników (OVX) operacji w miesiącu 0. Trzy miesiące po operacji szczurom OVX podaje się przez 2 miesiące próstaglandynę E2 (PGE2), znaną substancję oddziaływującą na anabolizm kości, w dawce 3 mg/kg/dzień (zastrzyki podskórne) lub PGE2 w dawce 10 mg/kg/dzień skojarzoną z droloksyfenem w dawce 10 mg/kg/dzień (doustnie). Następnie PGE2 odstawia się z leczenia i szczurom podaje się nośnik (10% alkohol w roztworze soli) lub droloksyfen (10 mg/kg/dzień, doustnie) przez następne półtora miesiąca, jak to opisano poniżej.

Grupa I: 8 szczurów, którym wykonano autopsję w miesiącu 0, wyjściowa grupa kontrolna.

Grupa II: 8 szczurów po operacji sham, którym wykonano autopsję w miesiącu 3, grupa kontrolna przed podawaniem leków.

Grupa III: 8 szczurów po operacji sham, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa IV: 8 szczurów po operacji sham, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-6,5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

187 219

Grupa V: 8 szczurów OVX, którym wykonano autopsję w miesiącu 3, grupa kontrolna przed podawaniem leków'.

Grupa VI: 8 szczurów OVX, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa VII. 8 szczurów OVX, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-6,5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa VIII: 8 szczurów OVX. któym wtrrzykiwarno podskórne e 3 mg PGE2 kg/J dzień przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa IX: 8 szczurów' OVX. którym wstrzykiwano ρ<^<3η1^<^ι-ΏΪ€ϊ 3 mg PGE2/'kg/ dzień przez miesiące 3-5, a następnie nośnik przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa X: 8 szczurów·' OVX, którym wstrzykiwano ρί^ί^;ι1«^ιτ^ϊέ: 3 ng Ρ<ΟΕ^2/1<$υ dzień przez miesiące 3-5, oraz podawano doustnie 10 mg droloksyfenu/kg/dzień, przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa XI: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano ptk:l·5l^<5r^ni¢t 3 mg PGE2/kjg dzień oraz podawano doustnie 10 mg drklkksyffnu/kg/drifń, przez miesiące 3-5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa XII: 8 szczurów' OVX, którym wstrzykiwano p<od^1<ttl-Ilit: 3 mg Pt^GEE/l^kg' dzień oraz podawano doustnie 10 mg droloksyfenu/kg/dzień, przez miesiące 3-5, a następnie nośnik przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa XIII: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie 3 mg PGE2^/kg/ dzień oraz podawano doustnie 10 mg droloksyfenu/kg/dzień, przez miesiące 3-5, a następnie doustnie sam droloksyfen przez miesiące 56,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

PGE2 (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI) lub proszek droloksyfenu (PAzer Inc., Groton, CT) najpierw rozpuszcza się w 100% etanolu, a następnie rozcieńcza roztworem soli fizjologicznej do wymaganych stężeń (ostateczne stężenie etanolu wynosiło 10%). Roztwór PGE2 wstrzykuje się podskórnie codziennie w grzbiet, w dawce 1 ml/kg. Roztwór drklkksyffnu podaje się doustnie codziennie w dawce 1 ml/szczura. Wszystkim szczurom wstrzykuje się podskórnie 10 mg/kg kalcmny (flukroehromowy znacznik kości, Sigma Chemical Co. St. Louis MO) w 12 i 2 dniu przed śmiercią, aby zbadać dynamiczne zmiany w tkance kostnej. Szczury zabija się przez uśpienie ketaminą.

Ocenia się następujące cechy końcowe:

Pomiary mineralizacji kości udowej:

Od każdego ze szczurów pobiera się podczas autopsji prawą kość udową i skanuje stosując absorpcjometrię rentgenowską z dwoistą energią (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) z oprogramowaniem „Regional High Reso^on Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Wielkość skanowanego obszaru wynosi 5,08 x 1,902 cm, rozdzielczość wynosi 0,0254 x 0,0127 cm, a prędkość skanowania wynosi 7,25 mm/s. Obrazy skanowanych kości udowych analizuje się i oznacza powierzchnię kości, zawartość mineralną kości (BMC) oraz gęstość mineralną kości (BMD) całej kości udowej (WF), dalszych przynasad kości udowej (DMF), trzonu kości udowej (FS) oraz bliższej kości udowej.

Pomiary mineralizacji kręgów lędźwiowych:

Do oznaczenia powierzchni kości, zawartości mineralnej kości (BMC) oraz gęstość mineralną kości (BMD) całego kręgosłupa lędźwiowego i każdego z sześciu kręgów lędźwiowych (LV1 -6) u uśpionych szczurów wykorzystuje się absorpcjometrię rentgenowską z dwoistą energią (QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) z oprogramowaniem „Regional High Rfsklutikn Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Szczury usypia się wstrzykując (dootrzewnowo) 1 ml/kg mieszaniny ketamina/rompun (w stosunku od 4 do 3) i umieszcza na platformie dla szczurów. Wielkość skanowanego obszaru wynosi 6 x 1,9 cm, rozdzielczość

187 219 wynosi 0,0254 x 0,0127 cm, a prędkość skanu wynosi 7,25 mm/s. Można uzyskać i zanalizować obraz skanu całego kręgosłupa lędźwiowego. Oznacza się powierzchnię kości (BA), zawartość mineralną kości (BMC) oraz wylicza się gęstość mineralną kości (BMC podzielone przez BA) dla całego kręgosłupa lędźwiowego i każdego z sześciu kręgów lędźwiowych (LV1-6). ,

Analiza histomorfometryczna kości gąbczastej bliższych przynasad kości piszczelowej:

Prawą kość piszczelową usuwa się podczas autopsji, oddziela od mięśni i tnie na trzy części. Bliższą kość piszczelową utrwala się w 70% etanolu, odwadnia w roztworach o stopniowo zmieniających się stężeniach etanolu, odtłuszcza w acetonie i zatapia w metakrylanie metylu (Eastman Organie Chemicals, Rochester, NY). Czołowe części bliższych przynasad kości piszczelowej tnie się na kawałki o grubości 4 do 10 pm używając mikrotomu ReichertJung Polycut S. Jeden kawałek o grubości 4 pm i jeden o grubości 10 pm używa się do histomorfometrii kości gąbczastej. Kawałek 4 pm wybarwia się w modyfikowanym barwniku Masson's Trichrome, a kawałki 10 pm pozostają niewybarwione.

Do statycznych i dynamicznych pomiarów histomorfometrycznych wtórnej gąbczastości bliższych przynasad kości piszczelowej pomiędzy 1,2 a 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada używa się systemu histomorfometrycznego Bioquant OS/2 (R&M biometrics, Inc., Nashville, TN). Pierwszy region 1,2 mm przynasad kości piszczelowej należy pominąć, aby ograniczyć pomiary tylko do wtórnej gąbczastości. Kawałków 4 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do objętości kości, struktury kości oraz resorpcji kości, natomiast kawałków 10 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do tworzenia się i cyklu metabolicznego kości.

I. Pomiaiy i obliczenia odnoszące się do objętości i stnkhry kości belecAowatej:

1. Całkowita oowlrrzchnia rrznassad (W, rmn²) : powierzciirna pjrznnasad pomiędzy 1,2 do 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada.

2. Powirrzchnid beierzki (BV , nun)): saktowttd ρί^ϊ^Λ^ beczki w obrę^e TV

3. Całkowity obwód kości ęeleczkowaiej (Bs, mm))i długość całkowitego obwodu beleczki.

4. Objętość kości beleczkowatej (BV/TV, %)i BV/TV x 100

5. Liczba kości belecr:kowaiej (TBN, liczba/mm)i 1,199/2 x BSTV

6. Grubość kości belecrZ;owatej (TBT, pm) i (2000/1,199) x (BVBS)

7. Rozdzielenie kości belecrZowatej (TBS, pm)' (2000 x 1,199) x (TV-BV)

II. Pomiary i obliczenie resorpcei kości

1. Liczba PStepZlastów (OCN, liczba): całkowita liczba osteoZlastów w całkowitym obszarze przynasad.

2. Obwód ο8ϊ6ο1^^ (OCP , mm) : długość obwodu pokzt'tej przez istespZlast.

3. Liczba osieokiastów/mm (0CN/mm - riczba/mm) i OCNB3S

4. Procentowy' obwód osteokiasU- (%OCP , %>: i OCPB3S x 100

III. Pomiary i obliczenia odnoszące się do tworzenia się i cyklu metabolicznego kości:

1. Pojedynczo znakowany kalceiną obwód (SLS ' mm) i całkowita długość obwodu beleczki pojedynczo znakowanej kalceiną.

2. Podwójnie znakowany kalceiną obwód (DLS, mm): całkowita długość obwodu beleczki podwójnie znakowanej kalceiną

3. Wewnętrznie znakowana a^^^t^t^łct^^^ć (ILWi pm)' średnia odległość pomiędzy dwoma znacznikami kalcernpwymr.

4. Procentowy obwód mineralizujący (PMSi %o) : (SLS/2 + DLS)/BS x 100.

5. Szybkość odłożenia mineralnego (Mar, pmaZiień):ILW/preetovę w znakowaniu

6. Szybkość tworzenia się kości/ppwierecCnir (BFR/BS, pm2/a/pm): (SLS/2 + DLS) x MAR/BS

7. Szybkość cvklu metabolicznego kości (BTR, ‘Lo/rok)' (SLS/2 + DLS) x MAR/BY x'100

187 219

Statystyka

Obliczenia statystyczne można wykonać przy pomocy pakietu StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Analizę testu zmienności (ANOVA) i następujący po niej Fisher's PLSD można wykorzystać do porównywania różnic pomiędzy grupami.

Protokół z agonistą/antagonistą estrogenu

Agoniści/antagoniści estrogenu stanowią klasę związków hamujących cykl metaboliczny kości i zapobiegających utracie kości wywołanej niedoborami estrogenu. Model utraty kości u myszy z wyciętymi jajnikami jest powszechnie używany jako model pomenopauzalnej utraty kości. Przy użyciu tego modelu można przebadać skuteczność związków będących agonistami/antagonistami estrogenu w zapobieganiu utracie kości i hamowaniu resorpcji kości.

W badaniach używa się szczury Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, MA) w różnym wieku (np. 5 miesięcy). Podczas okresu badań szczury trzyma się pojedynczo w klatkach 20 cm x 32 cm x 20 cm. Wszystkie szczury mają swobodny dostęp do wody oraz pożywienia granulowanego dostępnego w handlu (Agway ProLab 3000, Agway County Food, Inc., Syracuse, NY) zawierającego 0,97% wapnia, 0,85% fosforu oraz 1,05 IU/g witaminy D3.

Grupę szczurów (8 do 10) poddaje się operacji sham i podaje doustnie nośnik (10% etanolu i 90% roztworu soli, 1 ml/dzień), natomiast inne szczury pozbawia się obustronnie jajników (OVX) i podaje albo nośnik (doustnie), albo 17p-estradiol (Sigma, E-8876, E2, 30 pg/kg, codziennie zastrzyk podskórny) lub agonistę/antagonistę estrogenu (np. droloksyfen w dawkach 5, 10 lub 20 mg/kg, codziennie doustnie) przez pewien okres czasu (np. przez 4 tygodnie). Wszystkim szczurom wstrzykuje się podskórnie 10 mg/kg kalceiny (fluorochromowy znacznik kości, Sigma Chemical Co. St. Louis MO) w 12 i 2 dniu przed śmiercią, aby zbadać dynamiczne zmiany w tkance kostnej. Po czterech tygodniach hodowli szczury poddaje się autopsji.

Ocenia się następujące cechy końcowe:

Przyrost masy ciała:

Masa ciała w momencie autopsji minus masa ciała w momencie operacji.

Masa i histologia macicy:

Macicę usuwa się z każdego ze szczurów podczas autopsji i natychmiast waży. Następnie macicę obrabia się do pomiarów histologicznych takich jak powierzchnia tkanki w przekroju, grubość zrębu oraz grubość nabłonka światła.

Całkowity poziom cholesterolu w osoczu:

Krew uzyskuje się przez nakłucie serca i zostawia do skrzepnięcia w 4°C, następnie odwirowuje przy 2000 g przez 10 minut. W próbkach osocza oznacza się całkowity cholesterol osoczowy stosując test cholesterolowy kalorymetryczny o wysokiej czułości (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN).

Pomiary mineralizacji kości udowej:

Od każdego ze szczurów pobiera się podczas autopsji prawą kość udową i skanuje używając absorpcjometrii rentgenowskiej z dwoistą energią (DXA, QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) z oprogramowaniem „Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA). Wielkość skanowanego obszaru wynosi 5,08 x 1,902 cm, rozdzielczość wynosi 0,0254 x 0,0127 cm, a prędkość skanu wynosi 7,25 mm/s. Obrazy skanowanych kości udowych analizuje się i oznacza powierzchnię kości, zawartość mineralną kości (BMC) oraz gęstość mineralną kości (BMD) całej kości udowej (WF), dalszych przynasad kości udowej (DMF), trzonu kości udowej (FS) oraz bliższej kości udowej.

Prawą kość piszczelową usuwa się podczas autopsji, oddziela od mięśni i tnie na trzy części. Bliższą kość piszczelową utrwala się w 70% etanolu, odwadnia w roztworach o stopniowo zmieniających się stężeniach etanolu, odtłuszcza w acetonie i zatapia w metakrylanie metylu (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY). Czołowe części bliższych przynasad kości piszczelowej tnie się na kawałki o grubości 4 do 10 pm używając mikrotomu ReichertJung Polycut S. Jeden kawałek o grubości 4 pm i jeden o grubości 10 pm używa się do histomorfometrii kości gąbczastej. Kawałek 4 pm wybarwia się w modyfikowanym barwniku Massońs Trichrome, a kawałki 10 pm pozostają niewybarwione.

187 219

Do statycznych i dynamicznych pomiarów histomorfometrycznych wtórnej gąbczastości bliższych przynasad kości piszczelowej pomiędzy 1,2 a 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada używa się systemu histomorfometrycznego Bioąuant OS/2 (R&M biometrics, Inc., Nashville, TN). Pierwszy region 1,2 mm przynasad kości piszczelowej pomija się, aby ograniczyć pomiary tylko do wtórnej gąbczastości. Kawałków 4 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do objętości kości, struktury kości oraz resorpcji kości, natomiast kawałków 10 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do tworzenia się i cyklu metabolicznego kości.

I. Pomiary i obliczenia odnoszące się do objętości i struktury kości beleczkowatej:

1. Całkowita powierzchnia przynasad (TV, mm²): powierzchnia przynasad pomiędzy 1,2 do 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada

2. Powierzchnia beleczki (BV, mm²): całkowita powierzchnia beleczki w obrębie TV

3. Obwód kości beleczkowatej (BS, mm): długość całkowitego obwodu beleczki

4. Objętość kości beleczkowatej (BV/TV, %): BV/TV x 100

5. Liczba kości beleczkowatej (TBN, liczba/mm): 1,199/2 x BS/TV

6. Grubość kości beleczkowatej (TBT, pm): (2000/1,199) x (BV/BS)

7. Rozdzielenie kości beleczkowatej (TBS, pm): (2000 x 1,199) x (TV-BV)

II. Pomiary i obliczenie resorpcji kości

1. Liczba osteoklastów (OCN, liczba): całkowita liczba osteoklastów w całkowitym obszarze przynasad

2. Obwód osteoklastu (OCP, mm): długość obwodu beleczki pokrytej przez osteoklast

3. Liczba osteoklastów/mm (OCN/mm, liczba/mm): OCN/BS

4. Procentowy obwód osteoklastu (%OCP, %): OCP/BS x 100

1. Pojedynczo znakowany kalceiną obwód (SLS, mm): całkowita długość obwodu beleczki pojedynczo znakowanej kalceiną

2. Podwójnie znakowany kalceiną obwód (DLS, mm): całkowita długość obwodu beleczki podwójnie znakowanej kalceiną.

3. Wewnętrznie znakowana szerokość (ILW, pm): średnia odległość pomiędzy dwoma znacznikami kalceinowymi

4. Procentowy obwód mineralizacyjny (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BS χ 100

5. Szybkość odłożenia mineralnego (MAR, pm/dzień) :ILW/przerwę w znakowaniu

6. Szybkość tworzenia się kości/powierzchnię (BFR/BS, pm²/d/pm): (SLS/2 + DLS) x MAR/BS

7. Szybkość cyklu metabolicznego kości (BTR, %/rok): (SLS/2 + DLS) x MARTW x 100

Statystyka

Obliczenia statystyczne można wykonać przy pomocy pakietu StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA). Analizę testu zmienności (ANOVA) i następujący po niej Fisher's PLSD można wykorzystać do porównania różnic pomiędzy grupami.

Protokół z substancją oddziaływującą na anabolizm kości

Do badań aktywności substancji oddziaływującej na anabolizm kości w stymulowaniu tworzenia się kości i zwiększania masy kości mogą być użyte samce lub samice szczura bez uszkodzeń, samce z niedoborem hormonów płciowych (z wyciętymi jądrami) lub samice z niedoborem hormonów płciowych (z wyciętymi jajnikami).

Do badań używa się samic lub samców szczura w różnym wieku (np. 3 miesięczne). Szczury mogą być bez uszkodzeń lub wykastrowane (z wyciętymi jądrami lub jajnikami) i można im podawać substancje oddziaływujące na anabolizm, takie jak prostaglandyna E₂(PGE₂) w różnych dawkach (np. 1, 3 lub 6 mg/kg/dzień) przez pewien okres czasu (np. przez dwa tygodnie do dwóch miesięcy). U wykastrowanych szczurów leczenie zaczyna się w dzień po operacji (w celu zapobieżenia utracie kości) lub w momencie gdy wystąpiła już utrata kości (w celu przywrócenia masy kości). Podczas badań wszystkie szczury mają swobodny dostęp do wody oraz pożywienia granulowanego dostępnego w handlu (Teklad Rodent Diet licz187 219 liczba 8064, Harlan Teklad, Madison, WI) zawierającego 1,46% wapnia, 0,99% fosforu oraz 4,96 IU/g witaminy D3. Wszystkim szczurom wykonuje się podskórny zastrzyk 10 mg/kg kalceiny w 12 i 2 dniu przed śmiercią. Szczury zabija się.

Ocenia się następujące cechy końcowe:

Pomiary mineralizacji kości udowej:

Analiza histomorfometryczna kości gąbczastej bliższych przynasad kości piszczelowej

Prawą kość piszczelową usuwa się podczas autopsji, oddziela od mięśni i tnie na trzy części. Bliższą kość piszczelową utrwala się w 70% etanolu, odwadnia w roztworach o stopniowo zmieniających się stężeniach etanolu, odtłuszcza w acetonie i zatapia w metakrylanie metylu (Eastman Organie Chemicals, Rochester, NY). Czołowe części bliższych przynasad kości piszczelowej tnie się na kawałki o grubości 4 do 10 pm używając mikrotomu ReichertJung Polycut S. Jeden kawałek o grubości 4 pm i jeden o grubości 10 pm używa się do histomorfometrii kości gąbczastej. Kawałek 4 pm wybarwia się w modyfikowanym barwniku Masson's Trichrome, a kawałki 10 pm pozostają niewybarwione

Do statycznych i dynamicznych pomiarów histomorfometrycznych wtórnej gąbczastości bliższych przynasad kości piszczelowej pomiędzy 1,2 a 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada używa się systemu histomorfomstrycznsgo Bioquant OS/2 (R&M bifmstricst Inc., Nastawlle, TN). Pierwszy region 1,2 mm przynasad kości piszczelowej pomija się, aby ograniczyć pomiary tylko do wtórnej gąbczastości. Kawałków 4 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do objętości kości, struktury kości oraz resorpcji kości, natomiast kawałków 10 pm używa się do oznaczenia wskaźników odnoszących się do tworzenia się i cyklu metabolicznego kości.

1. Całkowita powierzchnia przynasad (TW, mm/): po wierzchnia przynasad pomiędzy 1,2 do 3,6 mm odległości od połączenia płytka wzrostu-nasada

2. Powierzchnia beleczki (BV, mm^): całkowita powierzchnia beleczki w obrębie TV

3. Obwód kości beleczkowatej (BS, mm): długość całkowitego obwodu beteczki

4. C^lbj<tO3Ść kość - beiec:drowtie- (BVTTV, %) : BVTTV x 100

5. Liczba koce - beteczkowatej (TBN , iiczba/nmi) : 1,19922 x BS/TV

6. Grnbość koćc: beiec:krowate- TTBT, pm)) : 22000/,,199- x (BVB3S)

7. kość: l^eb^<^;d^(^v^itej:- (TBS , pm: : 22000 x 1,199- x

II. Poirnayy 5 οΒΠοζεηϊε resopncj: kości

1. Liczba osieokłastów (OCN, Hczba:: całkowita iiczba oseeoklastów w całkowitym obszarze przynasad

2. Obwód osteoldastu (OCP, mm): długość obwodu beleczk: pokrytej przez osteoMast

3. Liczba osteoklastów-7mm (OCN/mm: liczba/mm) : OCN/BS

4. Procentowy obwód osteoklastu (%OCP: %) : OCP/BS x 100

1. Pojedynczo znakowany kalceiną obwód (SLS: mm): całkowita długość obwodu beleczki pojedynczo znakowanej kalceiną

2. Podwójnie znakowany kaReiną obwód (DLS, mm): całkowita długość obwodu beteczki podwójnie znakowanej kalceiną

4. Procentowy obwód minsraiizowania (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BS x 100

187 219

5. Szybkość odłożenia mineralnego (MAR, μτη/dzień) :ILW/przerwę w znakowaniu

6. Szybkość tworzenia się kości/powierzchnię (BFR/BS, pm²/d/pm)· (SLS/2 + DLS) x MAR/BS

7. Szybkość cyklu metabolicznego kości (BTR, %/rok): (SLS/2 + DLS) x MAR/BV x 100

Statystyka

Test wiązania receptora estrogenowego in vitro

Do oznaczenia powinowactwa wiązania poszczególnych związków z receptorem estrogenowym używa się testu wiązania receptora estrogenowego in vitro, który mierzy zdolność związków będących agonistami/antagonistami estrogenu do usunięcia [3H]-estradiolu z ludzkiego receptora estrogenowego uzyskanego metodami rekombinacji w drożdżach.

Materiały użyte w teście to:

(1) bufor do testu, TD-0.3 (zawierający 10 nM Tris, pH 7,6, 0,3 M chlorek potasu i 5 mM Ditiotreitol (DTT) (Sigma Co.), pH 7,6);

(2) radioligand - [3H]-estradiol uzyskany z New England Nuclear;

(3) zimny ligand - estradiol uzyskany z Sigma;

(4) rekombinowany ludzki receptor estrogenowy, hER.

Przygotowuje się roztwór badanego związku w TD-0.3 z 4% DMSO i 16% etanolu. Trytowany estradiol rozpuszcza się w TD-0.3 w takiej ilości, że jego ostateczne stężenie w teście jest 5 nM. HER również rozcieńcza się TD-0.3, tak aby każda studzienka zawierała 410 pg całkowitego białka. Przy stosowaniu płytek do mikromiareczkowania do każdego inkubatu dodaje się 50 μΐ zimnego estradiolu (wiązanie niespecyficzne) lub roztworu związku, 20 pl irytowanego estradiolu i 30 pl roztworów hER. Na każdej płytce znajdują się 3 studzienki odpowiadające pełnemu wiązaniu oraz studzienki z badanym związkiem w różnych stężeniach. Płytki inkubuje się przez noc w 4°C. Reakcje wiązania następnie kończy się w wyniku dodania i zmieszania 100 ml 3% hydroksyapatytu w 10 mM tris o pH 7,6, inkubacji przez 15 minut w 4°C. Mieszanki odwirowuje się i osad przemywa się 4 razy 1% Tritonem Χ-100 w 10 mM Tris o pH 7,6. Osad hydroksyapatytu zawiesza się w środku Ecoscint A i mierzy się radioaktywność metodą scyntygrafii β. Wyznacza się średnią z wszystkich trzech punktów danych (zliczenia/minutę, cpm). Wiązanie specyficzne wylicza się odejmując niespecyficzne cpm (określone jako zliczenia pozostające po oddzieleniu mieszaniny reakcyjnej zawierającej zrekombinowany receptor, radioligand oraz nadmiar nieznaczonego ligandu) od całkowicie związanych cpm (określanych jako zliczenia pozostające po oddzieleniu mieszaniny reakcyjnej zawierającej tylko zrekombinowany receptor i radioligand). Skuteczność związku określa się wyznaczając IC50 (stężenie związku niezbędne do zahamowania o 50% całkowitego specyficznego wiązania irytowanego estradiolu). Wyznacza się wiązanie specyficzne w obecności związku w różnych stężeniach i wylicza jako procent specyficznego wiązania całkowicie związanego specyficznego radioligandu. Wyniki przedstawia się na wykresie jako procent hamowania przez związek (skala liniowa) w funkcji stężenia związku (skała logarytmiczna).

Przykład

104 samice szczura Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, MA) w wieku 12 miesięcy poddano operacji sham lub wycięciu jajników (OVX) w miesiącu 0. 3 miesiące po operacji szczurom OVX rozpoczęto podawanie prostaglandyny E2 (PGE2), znanej substancji oddziaływującej na anabolizm kości, w dawce 3 mg/kg/dzień (iniekcja podskórna), albo PGE2 w dawce 3 mg/kg/dzień (iniekcja podskórna) w połączeniu z droloksyfenem w dawce 10 mg/ kg/dzień (doustnie), przez 2 miesiące. Następnie podawanie PGE2 przerwano i szczurom podawano nośnik (10% alkohol w roztworze soli) lub droloksyfen (10 mg/kg/dzień, doustnie) przez kolejne 1,5 miesiąca, w sposób opisany poniżej.

187 219

Grupa II: 8 szczurów po operacji sham, któiym wykonano autopsję w miesiącu 3, grupa kontrolna przed podawaniem leków.

Grupa III: 8 szczurów po operaei - sham- któym- podano dousnme nośnk- (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa IV: 8 po operaej- sham, któym- podirno όο^ύπε nośnik 110% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-6,5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa V: 8 szczurów OVX, którym wykonano autopsję w miesiącu 3, grupa kontrolna przed podawaniem leków.

Grupa VI: 8 szczurów OVX, którym podano doustnie nośnik (10% etanol w roztworze soli) przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w wiesjąco 5.

Grupa VII. 8 szczurów OVX, któiym podirno doustme nośnik (10% dano- w roztworze soli) przez miesiące 3-6,5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa VIII: 8 szczurów OVX , kórym wstzzykiwίnlo podekóncie 3 mg PGE/kcg/ dzień przez miesiące 3-5, a następnie wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa IX: 8 szczurów OVX, któym wstrzykiwano podskórne 3 mg POEtó/kg/ dzień przez miesiące 3-5, a następnie nośnik przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa X: 8 szczurów OVX, któym wstrzykiwano podskónue 3 mg PCiE/k-cg/ dzień przez miesiące 3-5, oraz podawano doustnie 10 mg droloksyfenu/kg/dzień, przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa XI 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie 3 mg PGE2/kg/ dzień oraz podawano doustnie 10 mg droloksyfenu/kg/drjeń, przez miesiące 3-5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 5.

Grupa XII: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie 3 mg PGE2/kg/ dzień oraz podawano doustnie 10 mg droloksyfenu/kg/dzień, przez miesiące 3-5, a następnie nośnik przez miesiące 5-6,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

Grupa XIII: 8 szczurów OVX, którym wstrzykiwano podskórnie 3 mg PGE2/kg/ dzień oraz podawano doustnie 10 mg dtoloksyfenu/kg/dzień, przez miesiące 3-5, a następnie doustnie sam droloksyfen przez miesiące 56,5, po czym wykonano autopsję w miesiącu 6,5.

PGE? (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI) lub proszek dtoloksyfeno (PAzer Inc., Groton; CT) najpierw rozpuszczano w 100% etanolu, a następnie rozcieńczano do wymaganych stężeń (ostateczne stężenie etanolu wynosiło 10%). Roztwór PGE2 wstrzykiwano podskórnie codziennie w grzbiet, w dawce 1 ml/kg. Roztwór dtoloksyfecu podawano doustnie codziennie w dawce 1 ml/szczura.

Pomiary zwartości części mineralnej lędźwiowej kości kręgowej.

Absorpcjometrię rentgenowską z dwoistą energią (QDR 1000/W, Hologic Inc., Waltham, MA) z oprogramowaniem „Regional High Resolution Scan” (Hologic Inc., Waltham, MA) zastosowano do wyznaczania powierzchni kości, zawartości części mineralnej kości (MBC) oraz gęstości wineralcej kości (BMD) całego kręgosłupa lędźwiowego oraz każdego z 6 kręgów lędźwiowych (LV1 = 6) znieczulonym szczurom. Szczury znieczulano wstrzykując im śtódottreącoąo 1 ml/kg mieszaniny eetawicr/rompuc (stosunek 4:3), a następnie umieszczano na platformie dla szczurów. Wielkość skanowanego obszam wynosiła 6 x 1,9 cm, rozdzielczość wynosiła 0,0254 x 0,0127 cm, a prędkość skanowania wynosiła 7,25 mm/s. Uzyskano obraz skanowany całego kręgosłupa lędźwiowego. Wyznaczono powierzchnię kości (BA) i zawartość mineralną kości (BMC), po czym wyliczano gęstość mineralną kości (BMD) (przez podzielenie MBC przez BA) dla całego kręgosłupa lędźwiowego i każdego z 6 kręgów lędźwiowych (LV1-6).

187 219

W miesiącach 3, 5 i 6,5 po operacji BMC i BMD całego kręgosłupa lędźwiowego i każdego z kręgów lędźwiowych u szczurów OVX była znacząco, o 15-27%, niższa niż u zwierząt kontrolnych po operacji sham. U szczurów, którym w 3 miesiące po OVX podano samą PGE2 lub w kombinacji z droloksyfenem, przez 2 miesiące, nastąpiło całkowite odtworzenie BMC i BMD do wielkości u zwierząt kontrolnych po operacji sham. Nie stwierdzono różnicy w BMC i BMD szczurów OVX, którym podawano samą PGE2 lub kombinację PGE2 z droloksyfenem, co wskazuje, że droloksyfen nie osłabia anabolicznego działania PGE2. Po przerwaniu podawania PGE2 zaobserwowano znaczący spadek BMD LV1, LV2 i LV3 oraz BMC LV2 Natomiast w przypadku, gdy szczurom OVX po przerwaniu podawania PGE2 podawano droloksyfen, odtworzenie przez PGE2 kości zostało w całości utrzymane. Podobnie przerwanie podawania PGE2 i droloksyfenu na 1,5 miesiąca spowodowało znaczący spadek BMD LV3. Natomiast w przypadku, gdy przerwie się podawanie PGE2, a podawanie droloksyfenu kontynuuje się przez kolejne 1,5 miesiąca, w kręgosłupie lędźwiowym tych szczurów OVX nie stwierdzono ubytku kości. Stwierdzono, że droloksyfen, środek przeciwresorpcyjny nie hamuje anabolicznego działania PGE2 u osteogenicznych szczurów. Ponadto droloksyfen skutecznie utrzymuje odtworzony przez PGE2 poziom kości po przerwaniu podawania PGE2. Wyniki te potwierdzają słuszność strategii stosowania substancji oddziaływującej na anabolizm do odtwarzania masy kości osteoporotycznego szkieletu, a następnie środka przeciwresorpcyjnego w celu utrzymania odtworzonej masy kości.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Środek farmaceutyczny zawierający kompozycję agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości, oraz ewentualnie farmaceutyczny nośnik lub rozcieńczalnik, znamienny tym, że jako agonistę/antagonistę estrogenu zawiera (E)-3-[1-[4[2-(dimetyloamino)etoksy]fenylo]-2-fenylo-1-butenylo]fenol lub (-)-cis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol, a jako substancję oddziaływującą na anabolizm kości zawiera prostaglandynę, korzystnie PGE2.
2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako agonistę/antagonistę estrogenu zawiera (-)-eis-6-fenylo-5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo]-5,6,7,8-tetrahydronaftalen-2-ol.
3. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, że jako prostaglandynę zawiera PGE2.
4. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako agonistę/antagonistę estrogenu zawiera (E)-3-[1-[4-[2-(dimetyloamino)etoksy]fenyło]]2-fenylo-1-butenylo]fenol.
5. Środek według zastrz. 4, znamienny tym, że jako prostaglandynę zawiera PGE₂ .
6. Zastosowanie kompozycji agonisty/antagonisty estrogenu i substancji oddziaływującej na anabolizm kości, to jest kompozycji (E)-3-[1-[4-[2-(dimetyloamino)etoksy]fenylo]-2fenylo-1-butenylo]fenolu lub (-)-cis%%enyk>5-[4-(2-pirolidyn-1-yloetoksy)fenylo_|-5,6,7,8tetrahydronaftalen-2-olu z prostaglandyną, korzystnie pGe₂, do wytwarzania leku do leczenia stanu objawiającego się małą masą kości u ssaków, zwłaszcza osteoporozy.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym agonistą/antagonistą estrogenu jest (-)-cis6-fenylo-5-[4-(2-pirklidsn-1-yloetkkks0enylo]-5,6,7,8-tetrahydroeaftalen-2-ol.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, w którym prostaglandynąjest PGE₂.
9. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym agonista/antagonistą estrogenu jest (E)-3[ 1 -[dTd-ddimeyldoaminojttoksyfeenyooJ-dfeenyoo-1 -butenyk) ffenol.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, w którym prkktaglandynąjest PGE2