PL187642B1

PL187642B1 - Przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24

Info

Publication number: PL187642B1
Application number: PL97332742A
Authority: PL
Inventors: Koichiro Ono; Toshihiko Ohtomo; Masayuki Tsuchiya; Yasushi Yoshimura; Yasuo Koishihara; Masaaki Kosaka
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2004-08-31
Also published as: UA76934C2; RU2184147C2; CA2267072A1; WO1998014580A1; CN1765928A; KR20000048884A; HK1024261A1; CZ117399A3; CN1271205C; EP0960936A4; EP0960936A1; IL129286A0; CA2267072C; KR100388256B1; BR9712488A; ZA978865B; CZ296790B6; EP0960936B1; SK44399A3; AU715156B2

Abstract

1. Chimeryczny lancuch L, obejmujacy region staly (region C) ludzkiego lancucha lek- kiego (L), oraz region zmienny (V) lancucha L przeciwciala anty-HM 1.24. 2. Chimeryczny lancuch L wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wymieniony region V lancucha L ma sekwencje aminokwasowa jaka przedlozono w SEQ ID nr: 1. 3. Chimeryczny lancuch L wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wymieniony region C ludzkiego lancucha L jest Ck. 4. Chimeryczny lancuch H, obejmujacy region staly ludzkiego lancucha ciezkiego (H) oraz region V lancucha H przeciwciala anty-HM 1.24. 5. Chimeryczny lancuch H wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze wymieniony region C lancucha H ma sekwencje aminokwasowa jaka przedlozono w SEQ ID nr: 2. 6. Chimeryczny lancuch H wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze wymieniony region C ludzkiego lancucha H jest C?. 7. Chimeryczne przeciwcialo obejmujace (1) lancuch L, zawierajacy region C ludzkiego lancucha L i region V lancucha L prze- ciwciala anty-HM 1.24, oraz (2) lancuch H, zawierajacy region C ludzkiego lancucha H i region V lancucha H prze- ciwciala anty-HM 1.24. 29. Przeksztalcony ludzki lancuch H wedlug zastrz. 28, znamienny tym, ze wymienio- ny region C ludzkiego lancucha H jest ludzkim regionem C?1, wymieniony FR ludzkiego lancucha H pochodzi od FR ludzkiego przeciwciala HSGI, i wymieniony CDR lancucha H ma sekwencje aminokwasowa ukazana w zastrz. 16. PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek odnosi się do przekształconych ludzkich przeciwciał anty-HM

1.24, chimerycznych przeciwciał anty-HM 1.24, kodujących je genów, sposobów wytwarzania wymienionych przeciwciał oraz zastosowania wymienionych przeciwciał. Przekształcone ludzkie przeciwciała i przeciwciała chimeryczne według niniejszego wynalazku są użyteczne jako środek terapeutyczny, itd. przeciw szpiczakowi.

Ludzkie limfocyty B przechodzą rozmaite procesy, które klasyfikuje się na podstawie rodzaju ekspresji antygenów powierzchniowych, i na koniec dojrzewają do komórek plazmatycznych, wytwarzających przeciwciała. W końcowym etapie ich różnicowania, limfocyty B, z jednej strony nabywają zdolności do wytwarzania immunoglobulin cytoplazmatycznych, i z drugiej strony zanikają antygeny związane z limfocytami B, takie jak immunoglobuliny i powierzchniowo-komórkowe, HLA-DR, CD20, receptory Fc receptory dopełniacza C3 i temu podobne, (Ling, N. R. i in., Leucocyte Typing III (1986) strona 320, Oxford UK, Oksford).

Jak dotąd, donoszono o przeciwciałach monoklonalnych, takich jak anty-PCA-1 (Anderson, K.C. i in., J. Immunol. (1983) 130, 1132), anty-PC1 (Anderson, K.C. i in., J. Immunol. (1983) 132, 3172), anty-MM4 (Tong, A.W. i in., Blood (1978) 69 238) i inne, które rozpoznają antygeny na błonie komórkowej komórek plazmatycznych. Jednakże wciąż stosuje się przeciwciała monoklonalne anty-CD38, w celu wykrywania komórek plazmatycznych oraz komórek szpiczaka (Epstein, J. i in., N. Engl. J. Med. (1990) 322, 664, Terstappen, L.W.M.M. i in., Blood (1990) 76, 1739, Leo, R. i in., Ann. Hematol. (1992) 64, 132, Shimazaki, C. i in., Am. J. Hematol. (1992) 39, 159, Hata, H. i in., Blood (1993) 81, 3357, Harada, H. i in., Blood (1993) 81, 2658, Billadeau, D. i in., J. Exp. Med. (1993) 178, 1023).

Jednakże przeciwciało monoklonalne anty-CD38 jest antygenem raczej związanym z aktywacją limfocytów T niż antygenem związanym z różnicowaniem się limfocytów B, i podlega ekspresji na różnych komórkach oprócz limfocytów B. Ponadto mimo, że CD38 nie podlega ekspresji na pewnych limfoplazmocytoidach, podlega silnej ekspresji na krwiotwórczych komórkach prekursorowych. Z powodów, uważa się, te przeciwciało monoklonalne anty-CD38 nie jest odpowiednie do badań nad różnicowaniem się i dojrzewaniem ludzkich limfocytów B oraz do leczenia chorób komórek plazmatycznych.

Goto, T. i in., opisują mysie przeciwciało monoklonalne anty-HM 1.24, które rozpoznaje antygen, mający ciężar cząsteczkowy, wynoszący 29 do 33 kDa, które podlega specyficznie ekspresji na liniach komórkowych B (Blood (1994) 84, 19122-1930). Z powodu faktu, że antygen rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne anty-HM 1.24, uważa się za związany z końcowym różnicowaniem się limfocytów B (Goto, T. i in., Jpn. J. Clin. Immun. (1992) 16, 688-691) oraz że podawanie przeciwciała monoklonalnego anty-HM 1.24 myszom z przeszczepionym szpiczakiem daje specyficzną akumulację przeciwciała przy guzie (Shuji Ozaki i in., The Programm of General Assembly of the 19th Japan Myeloma Study Meeting, prezentacja generalna 3), sugerowano, że przeciwciało monoklonalne anty-HM 1.24, przez oznakowanie radioizotopem, można stosować do diagnozowania położenia guza, terapii pociskowej, takiej jak terapia radioimmunologiczna i temu podobne.

Ponadto, wyżej wymieniona Blood opisuje, ze przeciwciało monoklonalne anty-HM 1.24 pc^siadci aktyywiość cytotokks'czną. zaleeną od dopeeniacza, wobec 1 udzkiee llmi szpiczika RPMI8226.

Snciczak jest chorobą nowotworową charcaterynującc się akumulacją monpklonclnych komórek plczmayyzznyzh (komórek szciczakkwyzh) w szpiku kostnym. Szpizzca jest choro8

187 642 bą, w której limfocyty B w końcowym stadium różnicowania, które wytwarzają i wydzielają immunoglobuliny albo komórki plazmatyczne, mnożą się w sposób monoklonalny głównie w szpiku kostnym, i w związku z tym w osoczu wykrywa się immunoglobuliny monoklonalne lub składniki je stanowiące, łańcuchy L lub łańcuchy H (Masaaki Kosaka i in., Nippo Rinsho (1995) 53,91-99).

W konwencjonalnym leczeniu szpiczaka stosuje się środki chemioterapeutyczne, lecz nie znaleziono skutecznych środków terapeutycznych, prowadzących do remisji szpiczaka i wydłużenia okresu przeżycia pacjentów ze szpiczakiem. Istnieje więc długo oczekiwana potrzeba ukazania się leków, mających terapeutyczny wpływ na szpiczaka.

Mysie przeciwciała monoklonalne posiadają wysoką immunogeniczność (czasem przytaczaną jako „antygeniczność”) u ludzi. W związku z tym, medyczna wartość terapeutyczna mysich przeciwciał monoklonalnych u ludzi jest ograniczona. Przykładowo, mysie przeciwciało monoklonalne podane człowiekowi może ulec metabolizmowi jako obca substancja tak, że okres półtrwania mysiego przeciwciała u człowieka jest stosunkowo krótki, a przez to nie może w pełni wykazać oczekiwanych skutków. Ponadto, ludzkie anty-mysie przeciwciała wzbudzone przeciw podawanemu mysiemu przeciwciału, może wywoływać odpowiedzi immunologiczne, które są niekorzystne i niebezpieczne dla pacjentów, tak jak choroba surowicy, inne reakcje alergiczne i temu podobne. Zatem, mysich przeciwciał monoklonalnych nie można często podawać ludziom.

Aby rozwiązać te problemy, zastosowano metodę redukowania immunogeniczności przeciwciał nie pochodzących od człowieka, takich jak przeciwciała monoklonalne pochodzące od ludzi. Takim przykładem jest metoda wytwarzania chimerycznego przeciwciała, w którym region zmienny (region V) pochodzi ze źródła mysiego, a jego region stały (region C) pochodzi od odpowiedniego przeciwciała ludzkiego.

Ponieważ tak otrzymane chimeryczne przeciwciało zawiera region zmienny pochodzący od przeciwciała mysiego w postaci nieuszkodzonej, oczekuje się, że będzie ono wiązać antygen ze specyficznością identyczną do oryginalnego przeciwciała mysiego. Ponadto, w chimerycznym przeciwciele udział sekwencji aminokwasowych nie pochodzących od człowieka jest znacznie zmniejszony, a więc oczekuje się, że przeciwciało będzie miało niską immunogeniczność w porównaniu z oryginalnym mysim przeciwciałem. Przeciwciało chimeryczne może wiązać się z antygenem w taki sam sposób jak oryginalne przeciwciało mysie i może obejmować odpowiedzi immunologiczne przeciw mysiemu regionowi zmiennemu, choć immunogeniczność jest zmniejszona (LoBuglio, A.F. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4220-4224, 1989).

Druga metoda zmniejszania immunogeniczności przeciwciała mysiego, choć bardziej skomplikowana, może dodatkowo w znacznym stopniu zmniejszyć potencjalną immunogeniczność przeciwciała mysiego. W tej metodzie, przeszczepia się jedynie region określający komplementarność (CDR) regionu zmiennego przeciwciała mysiego, do regionu zmiennego przeciwciała ludzkiego, w celu wytworzenia „przekształconego” regionu zmiennego przeciwciała ludzkiego.

Jednakże, aby uczynić strukturę CDR regionu zmiennego przekształconego ludzkiego przeciwciała możliwie najbardziej podobną do regionu oryginalnego przeciwciała mysiego, jeśli trzeba, przeszczepia się część sekwencji aminokwasowej regionu zrębowego (FR), który podtrzymuje CDR, z regionu zmiennego przeciwciała mysiego do regionu zmiennego przeciwciała ludzkiego. Następnie region V humanizowanego przekształconego ludzkiego przeciwciała wiąże się ze stałym regionem przeciwciała ludzkiego. Część, która pochodzi z nieludzkiej sekwencji aminokwasowej w ostatecznie przekształconym humanizowanym przeciwciele jest CDR, i tylko częścią FR. CDR składa się z hiperzmiennych sekwencji aminokwasowych, które nie wykazują sekwencji specyficznych dla gatunku. Dlatego humanizowane przeciwciało, niosące mysi CDR nie powinno posiadać silniejszej immunogeniczności niż naturalne ludzkie przeciwciało, posiadające CDR przeciwciała ludzkiego.

Pod względem przeciwciał humanizowanych, patrz Riechmann, L. i in., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. i in., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, C.A. i in., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Meada, H. i in., Human Antybodies and Hybridoma, 2,

187 642

124-134, 1991; Groman, S.D. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 41-81-4185, 1991; Tempest, P.R. i in., Bio/Technology, 9, 266-271; 1991; Co, M.S. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

88, 2869-2873, 1991; Carter, P. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; oraz

Sato, K. i in. Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

Queen i in., (międzynarodowe zgłoszenie nr WO 90-07861) opisuje metodę wytwarzania humanizowanego przeciwciała przeciwciała receptora anty-IL-2 Anti-Tac. Jednakże, trudna jest pełna humanizacja wszystkich przeciwciał, nawet postępując zgodnie z metodą jaką przedłożono w WO 90-07861. Tak więc, WO 90-07861 nie opisuje ogólnej metody humanizacji przeciwciał, lecz tylko opisuje metodę humanizacji przeciwciała Anti-Tac, które jest jednym z przeciwciał receptora anty-IL-2. Ponadto, nawet gdy całkowicie postępuje się według metody z WO 90-07861, trudno jest wykonać humanizowane przeciwciało, które posiada aktywność całkowicie identyczną z oryginalnym przeciwciałem mysim.

Ogólnie, sekwencje aminokwasowe CDR/FR poszczególnych przeciwciał, są różne. W związku z tym, określenie reszty aminokwasowej do zamiany w celu konstrukcji humanizowanego przeciwciała oraz wybór reszty aminokwasowej, zamieniającej wymienioną resztę aminokwasową, zmienia się dla poszczególnych przeciwciał. Dlatego metody wytwarzania humanizowanych przeciwciał, jaką przedłożono w WO 90-07861 nie można stosować do humanizacji wszystkich przeciwciał.

Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989) 86, 10029-10033 ma podobny opis jak ten z WO 90-07861. Ten odnośnik opisuje, że otrzymano tylko jedną trzecią aktywności oryginalnego przeciwciała mysiego, dla humanizowanego przeciwciała wytworzonego według metody przedstawionej w WO 90-07861. Innymi słowy, pokazuje to, że samą metodą według WO 90-07861 nie można wytworzyć pełnego humanizowanego przeciwciała, które posiada aktywność równą aktywności oryginalnego przeciwciała mysiego.

Co i in., Cancer Research (1996) 56, 1118-1125 został opublikowany przez grupę wspomnianego wyżej Queena i in. Odnośnik ten opisuje, ze humanizowanego przeciwciała, posiadającego aktywność równą aktywności oryginalnego przeciwciała mysiego nie można by skonstruować nawet metodą wykonania humanizowanego przeciwciała, jaką przedstawiono w WO 90-07861. Tak więc, fakt nie tylko ujawnia, że samą metodą według WO 90-07861 nie można wytworzyć pełnego humanizowanego przeciwciała, które posiada aktywność równą aktywności oryginalnego przeciwciała mysiego, ale że metody konstruowania humanizowanego przeciwciała, jaką przedstawiono w WO 90-07861 nie można stosować do humanizacji wszystkich przeciwciał.

Ohtomo i in., Molecular Immunology (1995) 32, 407-416 opisuje humanizację mysiego przeciwciała ONS-M21. Odnośnik ten ujawnia, że reszta aminokwasowa, którą sugerowano do humanizacji przeciwciała Anti-Tac w WO 90-07861 nie ma związku z aktywnością i nie można stosować metody, jaką przedstawiono w WO 90-07861 do konstruowania humanizowanego przeciwciała.

Kettleborough i in., Protein Eng. (1991) 4, 773-783 opisuje, że skonstruowano kilka humanizowanych przeciwciał z mysiego przeciwciała przez substytucję reszt aminokwasowych. Jednakże wymagana była substytucja więcej reszt aminokwasowych niż sugerowano w metodzie humanizacji przeciwciała Anti-Tac jaką opisano, w WO 90-07861.

Powyższe odniesienia wskazują, że metoda wytwarzania humanizowanych przeciwciał, jaką przedłożono w WO 90-07861 jest techniką możliwą do stosowania jedynie dla opisanego w niej przeciwciała Anti-Tac oraz że nawet użycie wymienionej technologii nie prowadzi do aktywności równej aktywności oryginalnego przeciwciała mysiego.

Oryginalne mysie przeciwciała opisane w tych odnośnikach posiadają sekwencje aminokwasowe różne od sekwencji przeciwciała Anti-Tac opisanego w WO 90-07861. W związku z tym, metoda konstruowania humanizowanego przeciwciała, którą można było stosować dla przeciwciała Anti-Tac, była nie do zastosowania dla innych przeciwciał. Podobnie, ponieważ mysie przeciwciało anty-HM 1.24 według niniejszego wynalazku posiada inną sekwencję aminokwasową niż przeciwciało Anti-Tac, nie można stosować metody konstruowania humanizowanego przeciwciała dla przeciwciała Anti-Tac. Ponadto, z powodzeniem skonstruowane przeciwciało humanizowane według niniejszego wynalazku posiada inną se10

187 642 kwencję aminokwasową niż humanizowane przeciwciało Anti-Tac opisane w WO 90-07861. Fakt ten wskazuje także, że nie można stosować takiej samej metody humanizacji przeciwciał, posiadających różne sekwencje CDR-FR.

Tak więc, nawet jeśli znane jest oryginalne przeciwciało mysie do humanizacji, identyczność sekwencji CDR-FR humanizowanego przeciwciała, posiadającego aktywność, potwierdza się jedynie po próbach i doświadczeniach błędu. WO 90-07861 nie wspomina się o sekwencji FR, którą łączy się w humanizowanym przeciwciele skonstruowanym w niniejszym wynalazku, oraz o fakcie, że aktywne humanizowane przeciwciało można by otrzymać z połączenia z FR, sekwencją mniej więcej CDR.

Jak wspomniano powyżej, przeciwciała humanizowane, jak się oczekuje, są użyteczne do celów terapeutycznych, ale humanizowane przeciwciało anty-HM 1.24 nie jest znane lub nawet nie jest sugerowane. Ponadto, nie ma dostępnej standaryzowanej metody, którą można by generalnie stosować dla każdego przeciwciała do wytwarzania przeciwciała humanizowanego, i potrzeba różnych pomysłów konstruowania humanizowania przeciwciał, które wykazują wystarczającą aktywność wiązania, aktywność hamowania wiązania oraz aktywność zobojętniania (np. Sato, K. i in., Cancer Res., 53, 851-856,1993).

Niniejszy wynalazek przewiduje przekształcone przeciwciała przeciwciała anty-HM

1.24. Nmiejszy wynalazek przewiduje (^ahcj ΙϋάζΙύε/ηινΒίε chimeyczne przeciwciała, użyteczne w procesach konstruowania wymienionych przeciwciał przekształconych. Niniejszy wynalazek dostarcza dalej fragmenty przeciwciał przekształconych. Ponadto, niniejszy wynalazek dostarcza układ ekspresji do wytwarzania przeciwciał chimerycznych, przeciwciał przekształconych oraz ich fragmentów. Niniejszy wynalazek dostarcza sposoby wytwarzania przeciwciał chimerycznych przeciwciała anty-HM 1.24 oraz jego fragmentów, jak również przeciwciał przekształconych przeciwciała anty-HM 1.24 i jego fragmentów.

Konkretniej, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała chimeryczne oraz przeciwciała przekształcone, które specyficznie rozpoznają polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową, jaką przedstawiono w SEQ ID nr: 103. cDNA, który koduje wymieniony polipeptyd wprowadzono między miejsca rozszczepienia XbaI wektora pUC19 i przez to wytworzono plazmid pRS38-pUC19. Escherichia coli, która zawiera ten plazmid pRS38-pUC19 została międzynarodowym depozytem w dniu 5 października 1993, w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, prefektura Ibalaki, Japonia), jako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) pod numerem dostępu FERM BP-4434 na warunkach układu budapeszteńskiego (patrz nie zbadane japońskie zgłoszenie patentowe (Kokai) nr 7-196694).

Jako postać realizacji takich chimerycznych przeciwciał lub przeciwciał przekształconych, wymienia się chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 lub przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24. Szczegółowy opis chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 lub przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, podaje się w niniejszym poniżej.

Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza także chimeryczne łańcuchy L, obejmujące region stały (region C) ludzkiego łańcucha lekkiego (L) oraz region zmienny (V) łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, i chimeryczny łańcuch H, obejmujący region stały ludzkiego łańcucha ciężkiego (H) oraz region V łańcucha ciężkiego (H) przeciwciała anty-HM 1.24.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej przeciwciała chimeryczne, zawierając:

(1) Łańcuch L, obejmujący region C ludzkiego łańcucha L oraz region V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24; oraz (2) Łańcuch H, obejmujący region C ludzkiego łańcucha H oraz region V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej region V przekształconego ludzkiego łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujący:

(1) region zrębowy (FR) regionu V ludzkiego łańcucha L, oraz (2) CDR regionu V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24; oraz region V przekształconego ludzkiego łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24 obejmujący (1) FR regionu V ludzkiego łańcucha H, i (2) CDR regionu V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

187 642

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej przekształcony ludzki łańcuch L przeciwciała antyHM 1.24, 9 obejmujący (1) region C ludzkiego łańcucha L oraz (2) region V łańcucha L, obejmujący FR ludzkiego łańcucha L i CDR łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, oraz przekształcony ludzki łańcuch H przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujący (1) region C ludzkiego łańcucha H oraz (2) region V łańcucha H, obejmujący FR ludzkiego łańcucha H i CDR łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej przekształcone ludzkie przeciwciało przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujące:

(A) Łańcuch L zawierający (1) region C ludzkiego łańcucha L oraz (2) region V łańcucha L, obejmujący FR ludzkiego łańcucha L i CDR łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, oraz (B) Łańcuch H, zawierający (1) region C ludzkiego łańcucha H oraz (2) region V łańcucha H, obejmujący FR ludzkiego łańcucha H i CDR łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej DNA, kodujący region V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, i DNA, kodujący region V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej DNA, kodujący chimeryczny łańcuch L, zawierający (1) region C ludzkiego łańcucha L oraz (2) region V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, oraz

DNA, kodujący chimeryczny łańcuch H, zawierający (1) region C ludzkiego łańcucha H oraz (2) region V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, zawierający:

(1) FR regionu V ludzkiego łańcucha L; oraz (2) CDR regionu V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24; oraz

DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha H przeciwciała anty-HM

1.24, zawierający:

(1) FR regionu V ludzkiego łańcucha H; oraz (2) CDR regionu V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej DNA, kodujący przekształcony ludzki łańcuch L przeciwciała anty-HM 1.24, zawierający:

(1) region C ludzkiego łańcucha L; oraz (2) region V łańcucha L, obejmujący FR ludzkiego łańcucha L oraz CDR łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24; oraz

DNA, kodujący przekształcony ludzki łańcuch H przeciwciała anty-HM 1.24, zawierający:

(1) region C ludzkiego łańcucha H; oraz (2) region V łańcucha H, obejmujący FR ludzkiego łańcucha H oraz CDR łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej wektor, obejmujący wszystkie z różnych DNA wspomnianych powyżej.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej komórkę gospodarza transformowaną powyższym wektorem.

Niniejszy wynalazek dostarcza także sposoby wytwarzania przekształconego go przeciwciała przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujące etapy hodowli komórki gospodarza, które kotransformowano wektorem ekspresji, zawierającym DNA, kodujący wymieniony chimeryczny łańcuch L oraz wektorem ekspresji, zawierającym DNA, kodującym wymieniony łańcuch H, i odzyskiwania żądanego przeciwciała.

187 642

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej sposoby wytwarzania przekształconego ludzkiego przeciwciała przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujące etapy hodowli komórki gospodarza, które kotransformowano wektorem ekspresji, zawierającym DNA, kodujący wymieniony przekształcony ludzki łańcuch L oraz wektorem ekspresji, zawierającym DNA, kodującym wymieniony przekształcony ludzki łańcuch H, i odzyskiwania żądanego przeciwciała.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej kompozycje farmaceutyczne, zwłaszcza środki terapeutyczne wobec szpiczaka, zawierające wymienione przeciwciało chimeryczne lub przekształcone ludzkie przeciwciało.

Niniejszy wynalazek dostarcza dalej kompozycje .farmaceutyczne, które zawierają jako składnik aktywny, przeciwciało chimeryczne specyficznie rozpoznające polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową, jaką przedstawiono w SEQ ID nr: 103 oraz kompozycje farmaceutyczne, które zawierają jako składnik aktywny, przekształcone przeciwciało ludzkie specyficznie rozpoznające specyficznie rozpoznające polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową, jaką przedstawiono w SEQ ID nr: 103. Jako kompozycję farmaceutyczną, konkretnie przewiduje się środek terapeutyczny wobec szpiczaka.

Figura 1 jest wykresem, ukazującym, że w analizie FCM przy użyciu ludzkiej linii komórkowej szpiczaka KPMM2, intensywność fluoruscencji chimerycznego przeciwciała antyHM 1.24 zmienia się w podobny sposób jak przy mysim przeciwciele anty-HM 1.24, w porównaniu z przeciwciałem kontrolnym.

Figura 2 jest wykresem, ukazującym, że w Cell-ELISA przy użyciu komórek WISH, chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24, podobnie jak mysie przeciwciało anty-HM 1.24 hamuje wiązanie biotynylowanego mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 z komórkami WISH w sposób zależny od dawki.

Figura 3 jest wykresem, ukazującym, że kontrolna ludzka IgG1 lub mysie przeciwciało anty-HM 1.24 nie wykazuje cytotoksyczności, podczas gdy chimeryczne przeciwciało antyHM 1.24 wykazuje zwiększoną cytotoksyczność wobec komórki RPMI 8226, przy zwiększonym stosunku E/T.

Figura 4 jest diagramowym przedstawieniem metody konstruowania łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 przez szczepienie CDR w metodzie PCR.

Figura 5 jest diagramowym przedstawieniem metody montowania oligonukleotydów RVH1, RVH2, RVH3 iRVH4 metodą PCR w wytwarzaniu łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 6 jest diagramowym przedstawieniem metody konstruowania regionu V łańcucha H ludzkiego mysiego hybrydowego przeciwciała anty-HM 1.24 w metodzie PCR.

Figura 7 jest diagramowym przedstawieniem metody konstruowania regionu V łańcucha H mysiego ludzkiego hybrydowego przeciwciała anty-HM 1.24 w metodzie PCR.

Figura 8 jest wykresem, ukazującym, że wersja łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 posiada aktywność wiązania antygenu równą aktywności chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24. -1 i -2 ukazują, że są to różne partie.

Figura 9 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, w którym połączono wersję a łańcucha L oraz wersję a, b, f lub h łańcucha H, oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 10 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, w którym połączono wersję b łańcucha L oraz wersję a, b, f lub h łańcucha H, oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 11 jest wykresem, ukazującym aktywność hamowania wiązania przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, w którym połączono wersję a łańcucha L oraz wersję a, b, f lub h łańcucha H, oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 12 jest wykresem, ukazującym aktywność hamowania wiązania przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, w którym połączono wersję b łańcucha L oraz wersję a, b, f lub h łańcucha H, oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 13 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu wersji a, b, c oraz d łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24. -1 i -2 ukazują, że są to różne partie.

187 642

Figura 15 jest wykresem, ukazującym aktywność hamowania wiązania wersji a, c, p oraz r łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 16 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu ludzkiego mysiego hybrydowego przeciwciała anty-HM 1.24, mysiego ludzkiego hybrydowego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 17 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu wersji a, b, c oraz f łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 18 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu wersji a oraz g łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 19 jest wykresem, ukazującym aktywność hamowania wiązania wersji a oraz g łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 20 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu wersji h oraz i łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 21 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu wersji f, h oraz j łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 22 jest wykresem, ukazującym aktywność hamowania wiązania wersji h oraz i łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 23 jest wykresem, ukazującym aktywność hamowania wiązania wersji f, h oraz j łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 24 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu wersji h, k, l, m, n oraz o łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 25 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu wersji a, h, p oraz q łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 26 jest wykresem, ukazującym aktywność hamowania wiązania komórki WISH wersji h, k, l, m, n oraz o łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 27 jest wykresem, ukazującym aktywność hamowania wiązania wersji a, h, p oraz q łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 28 jest wykresem, ukazującym aktywność wiązania antygenu wersji a, c, p oraz r łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 29 jest wykresem, ukazującym, ze wersja s przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 posiada aktywność wiązania antygenu równą aktywności wersji r przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 124.

Figura 30 jest wykresem, ukazującym, że wersja s przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 posiada aktywność hamowania wiązania równą aktywności wersji r przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 31 jest wykresem, ukazującym, że oczyszczone przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 posiada aktywność wiązania antygenu równą aktywności chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Figura 32 jest wykresem, ukazującym, że oczyszczone przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 posiada aktywność hamowania wiązania równą aktywności chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

187 642

Figura 33 jest wykresem, ukazującym, że podawanie chimerycznego przeciwciała antyHM 1.24 powodowało przedłużenie okresu przeżycia w porównaniu z podawaniem kontrolnej ludzkiej IgG1 u myszy z przeszczepionym ludzkim szpiczakiem.

Figura 34 jest wykresem, ukazującym, że przy stosowaniu komórek pochodzących z krwi obwodowej zdrowego człowieka jako komórek efektorowych, kontrolna ludzka IgG1 wykazuje brak cytotoksyczności wobec komórek KPMM2 i mysie przeciwciało anty-HM 1.24 także wykazuje słabą cytotoksyczność, podczas gdy przekształcone ludzkie przeciwciało antyHM 1.24 wykazuje silną cytotoksyczność wobec komórek KPMM2.

Figura 35 jest wykresem, ukazującym, że przy stosowaniu komórek pochodzących z krwi obwodowej zdrowego człowieka jako komórek efektorowych, kontrolna ludzka IgG1 wykazuje brak cytotoksyczności wobec komórek ARH-77 i mysie przeciwciało anty-HM 1.24 także wykazuje słabą cytotoksyczność, podczas gdy przekształcone ludzkie przeciwciało antyHM 1.24 wykazuje silną cytotoksyczność wobec komórek ARH-77.

Figura 36 jest wykresem, ukazującym, że gdy jako komórki efektorowe stosuje się komórki, pochodzące ze szpiku kostnego myszy SCID, kontrolna IgG1 wykazuje brak cytotoksyczności wobec komórek KPMM2, podczas gdy przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24 wykazuje zwiększoną cytotoksyczność wobec komórek KPMM2 ze wzrostem stężenia przeciwciała.

Figura 37 jest wykresem, ukazującym, że u myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkiego szpiczaka poziom ludzkiej IgG w surowicy zwiększa się po podaniu kontrolnej ludzkie IgG1 w porównaniu z poziomem przed podaniem, podczas gdy podawanie przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 hamuje zwiększanie się poziomu ludzkiej IgG w surowicy.

Figura 38 jest wykresem, ukazującym, że u myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkiego szpiczaka podawanie przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 powoduje przedłużenie okresu przeżycia w porównaniu z podawaniem kontrolnej ludzkiej IgGł.

Figura 39 jest wykresem, ukazującym, że u myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkiego szpiczaka poziom ludzkiej IgG w surowicy zwiększa się po podaniu melfalanu oraz kontrolnej ludzkiej IgG1 w porównaniu z poziomem przed podaniem, podczas gdy podawanie przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 hamuje zwiększanie się poziomu ludzkiej IgG w surowicy.

Figura 40 jest wykresem, ukazującym, że u myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkiego szpiczaka podawanie przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 powoduje przedłużenie okresu przeżycia w porównaniu z podawaniem melfalanu lub kontrolnej IgG1.

1. Konstruowanie przeciwciała chimerycznego (1) Kloning DNA , kodującego region V mysiegomonoklonalnego przećiwciała <cityHM 1.24

Wytwarzanie mRNA

W celu klonowania DNA, kodującego region V mysiego moponlopalprgo przeciwciała anty-HM 1.24, cały RNA wytwarzania się odzyskanej hybrydomy przy użyciu znanej metody, takiej jak metoda ultrawirowania z guanidyną (Chirwing, J.M. i in., Biochemistry (1979), 18, 5294-5299), metody AGPC (Chomczynski, P i in., (1987), 162, 156-159), itd i wytwarza się mRNA przy użyciu kolumny z włókna szklanego Oligo(dT)-celulozowej itd, przyłączonej do mRNA Puritication Kit (wyprodukowanego przez Pharmacia), itd. Ponadto przez użycie QuickPrep Purification Kit (wyprodukowanego przez Pharmacia), mRNA można wytworzyć bez etapu ekstrakcji całości RNA.

Wytwarzanie i powielenie cDNA

Z mRNA otrzymanego w powyższej części „Wytwarzanie mRNA”, każdy cDNA dla regionów V łańcucha L oraz łańcucha H syntetyzuje się przy użyciu odwrotnej transkryptazy. cDNA regionu V łańcucha L syntetyzuje się przy użyciu AMV Reverse Transcriptase FirstStrand cDNA Synthesis Kit. W celu powielenia syntetyzowanego cDNA, stosuje się odpowiedni primer, który hybrydyzuje z sekwencją liderową oraz regionem C genu przeciwciała

187 642 (np. primer MKV, mający sekwencje zasad przedstawione w SEQ ID nr: 29 do 39, oraz primer MKC, mający sekwencję zasad przedstawioną w SEQ ID nr: 40).

Syntezę i powielenie cDNA regionu V łańcucha H można przeprowadzić przez PCR (reakcję łańcuchową polimerazy) metodą 5-RACE (Frohman, M.A. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988, Belyawsky, A. i in. Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) przy użyciu zestawu 5'-Ampli FINDER RACE (CLONTECH). Do końca 5' cDNA zsyntetyzowanego jak powyżej, dołącza się FINDER Anchor oraz jako primer do powielenia regionu V łańcucha H, można stosować primer, który specyficznie hybiydyzuje z primerem Anchor (SEQ ID nr: 77) oraz stałego regionu (regionu Cy) łańcucha H myszy (np. primer MHC2a, mający sekwencję zasad przedstawioną przez SEQ ID nr: 42).

Oczyszczanie DNA i określanie jego sekwencji zasad

Przeprowadza się elektroforezę w żelu agarozowym na produkcie PCR, przy użyciu znanej metody w celu odcięcia żądanego fragmentu DNA, a DNA odzyskuje się i oczyszcza, następnie poddaje ligacji z wektorem DNA.

DNA można oczyszczać stosując komercyjny zestaw (np. GENECLEAN II; BIO101). Znany wektor (np. pUC19, Bluescript, itd) można użyć do utrzymywania fragmentów DNA.

Powyższy DNA i powyższy wektor DNA poddaje się ligacji przy użyciu znanego zestawu do ligacji (wyprodukowanego przez Takara Shuzo), w celu otrzymania rozminowanego wektora. Uzyskany rekombinowany wektor wprowadza się następnie do Escherichia coli JM109, po czym wybiera kolonie odporne na ampicylinę, i wytwarza wektor DNA w oparciu o znaną metodę (J. Sambrook, i in., „Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Po trawieniu powyższego DNA wektora enzymami restrykcyjnymi, określa się sekwencje zasad żądanego DNA znaną metodą (J. Sambrook, i in., „Molecular Cloning:, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Według niniejszego wynalazku, można stosować automatyczny układ sekwencjonujący (DNA Sequencer 373A; wyprodukowany przez ABI Co. Ltd.)

Region określenia dopasowania

Region V łańcucha H oraz region V łańcucha tworzą miejsce wiązania antygenu, którego całość struktury posiada podobne właściwości. Tak więc, każdy z czterech regionów zrębowych (FR) zostaje przyłączony przez trzy regiony hiperzmienne, to jest regiony określające dopasowanie (CDR). Sekwencje aminokwasowe fR są stosunkowo dobrze zakonserwowane, podczas gdy zmienność wśród sekwencji aminokwasowych regionów CDR jest niezwykle wysoka (Kabat, E.A. i in., „Sequence of Proteins of Immunological Interest”, US Dept. Health and Human Services, 1983).

Wiele części powyższych czterech FR przyjmuje strukturę płaszczyzny β, w wyniku czego trzy CDR tworzą pętle. CDR mogą czasami tworzyć część struktury płaszczyzny β. Trzy CDR pozostają przestrzennie w ścisłej bliskości jeden wobec drugiego i tworzą miejsce wiązania antygenu z trzema CDR regionu parującego.

Na podstawie tych faktów, sekwencję aminokwasową regionu zmiennego mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 dopasowuje się do bazy danych sekwencji aminokwasowych utworzonych przez Kabata i in., („Sequence of Proteins of Immunological Interest” US Dept. Health and Human Services, 1983), aby prześledzić homologię i przez to znaleźć regiony CDR.

(2) Konstrukcja wektorów ekspresji dla przeciwciała chimerycznego

Po sklonowaniu fragmentu DNA, kodującego regiony V mysiego łańcucha L i łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego, można otrzymać przeciwciało chimeryczne antyHM 1.24 przez związanie tych mysich regionów V z DNa, kodującym region stały ludzkiego przeciwciała, i przez jego późniejszą ekspresję.

Podstawowy sposób konstruowania chimerycznego przeciwciała obejmuje połączenie mysiej sekwencji liderowej i sekwencji regionu V obecnej w klonowanym cDNA z sekwencją, kodującą region C przeciwciała ludzkiego już obecnego w wektorze ekspresji dla komórek ssaka. Alternatywnie obejmuje on połączenie mysiej sekwencji liderowej i sekwencji regionu V obecnej w klonowanym cDNA z sekwencją, kodującą region C przeciwciała ludzkiego, którą następnie łączy się z wektorem ekspresji dla komórek ssaka.

187 642

Region C ludzkiego przeciwciała może być regionem C każdego łańcucha H i regionem C każdego łańcucha L. Można wymienić np. Cy1, Cy2, Cy3 lub Cy4 ludzkiego łańcucha H, albo Cλ lub Ck łańcucha L.

Aby wytworzyć przeciwciało chimeryczne, konstruuje się dwa rodzaje wektorów ekspresji: są to wektor ekspresji, zawierający DNA, kodujący region V mysiego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L pod kontrolą regionu regulatorowego ekspresji, takiego jak układ wzmacniacz/promotor, oraz wektor ekspresji, zawierający DNA, kodujący region V mysiego łańcucha H oraz region C ludzkiego łańcucha H pod kontrolą regionu regulatorowego ekspresji, takiego jak układ wzmazniazn/promktor. Następnie, przy użyciu tych wektorów ekspresji kρtrcnsformuje się ssacze komórki gospodarza i transformowane komórki hoduje in vitro lub in vivo w celu wytworzenia przeciwciała chimerycznego (np. WO 91-16928).

Alternatywnie, DNA, kodujący mysią sekwencję liderową oraz region V łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L oraz DNA, kodujący mysią liderową sekwencję oraz region V łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H obecnego w klonowanym cDNA, wprowadza się do pojedynczego wektora ekspresji (patrz, międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 94-11523), i transformuje się komórki gospodarza przy użyciu wymienionego wektora. Transformowanego gospodarza hoduje się potem in vitro lub in vivo w celu wytworzenia przeciwciała.

1) Konstrukcja chimerycznego łańcucha H

Wektor ekspresji dla łańcucha H przeciwciała chimerycznego można otrzymać przez wprowadzenie cDNA, kodującego region V mysiego łańcucha H do odpowiedniego wektora ekspresji, zawierającego genomowy DNA lub cDNA, kodujący region C łańcucha C przeciwciała ludzkiego. Jako region C łańcucha H można wymienić np. Cy1, Cy2, Cy3 lub Cy4.

Konstrukcja wektora ekspresji dla chimerycznego łańcucha H, zawierającego genomowi DNA Cy1

Jako wektora ekspresji, posiadającego genomowy DNA dla Cy1 jako regionu C łańcucha H, można użyć np. HFE-PMh-gy1 (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92/19759) lub DHFR-AE-RCh-PMłf (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92/19759).

W celu wprowadzenia cDNA, kodującego region V mysiego łańcucha H do tych wektorów ekspresji, można wprowadzić odpowiednie sekwencje zasad przy użyciu metody PCR. Te odpowiednie sekwencje zasad można wprowadzić metodą PCR przy użyciu primera PCR zaplanowanego tak, aby posiadał sekwencję rozdającą dla odpowiedniego enzymu restrykcyjnego przy końcu 5' oraz sekwencję konsensusow-ą Kozaka tuż przed kodonem startowym, oraz primera PCR nαclαnpwanego tak, aby posiadał sekwencję ronnąjązą dla odpowiedniego enzymu restrykcyjnego przy końcu 3' i miejsce donorowe składania, gdzie pierwotny transkrypt genomowego DNA prawidłowo się składa i staje mRNA.

Tak skonstruowany cDNA, kodujący region V mysiego łańcucha H traktuje się odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, wprowadza do wyżej wspomnianego wektora ekspresji i można skonstruować wektor ekspresji chimerycznego łańcucha H, zawierający DNA Cy1.

Konstrukcja wektora ekspresji dla cDNA chimerycznego łańcucha H

Wektor ekspresji, posiadający cDNA Cy1 jako region C łańcucha H można skonstruować następująco. A więc, można go skonstruować przez wytworzenie mRNA z komórek CHO, w którym wektor ekspresji DHFR-AE-RCh-PM1f (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92/19759), kodujący genomowy DNA regionu V łańcucha L humanizowanego przeciwciała PM1 oraz Cy1 regionu C łańcucha H przeciwciała ludzkiego (N. Takahashi i in., Cell 29, 671-679, 1982) oraz genomowy DNA regionu V łańcucha L humanizowanego przeciwciała PM1 i regionu C łańcucha k przeciwciała ludzkiego, zostały zintegrowane; kloning cDNA, zawierającego region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 oraz Cy1 regionu C łańcucha H przeciwciała ludzkiego metodą RT-PCR; oraz ligację z odpowiednim wektorem ekspresji dla zwierzęcych komórek przy użyciu odpowiednich miejsc enzymu restrykcyjnego.

Aby bezpośrednio ligować cDNA, kodujący region V mysiego łańcucha H z cDNA, zawierającym Cy1 regionu C łańcucha H przeciwciała ludzkiego, odpowiednie sekwencje zasad

187 642 można wprowadzić metodą PCR. Przykładowo, te odpowiednie sekwencje zasad można wprowadzić metodą PCR przy użyciu primera PCR zaplanowanego tak, aby posiadał sekwencję rozpawania dla odpowiedniego enzymu restrykcyjnego przy końcu 5' i sekwencję konsensusową Kozaka tuż przed kodonem startowym, oraz primera PCR zaplanowanego tak, aby posiadał sekwencję roznawania dla odpowiedniego enzymu restrykcyjnego przy końcu 3' stosowaną do bezpośredniej ligacji Cył regionu C łańcucha H.

Wektor ekspresji, zawierający cDNA chimerycznego łańcucha H można wprowadzić przez traktowanie tak skonstruowanego cDNA, kodującego region V mysiego łańcucha H odpowiednim enzymem restrykcyjnym, ligację z powyższym cDNA, zawierającym Cył regionu C łańcucha H i wprowadzenie do wektora ekspresji takiego jak pCOS1 lub pCHO1.

2) Konstrukcja łańcucha L przeciwciała chimerycznego

Wektor ekspresji dla łańcucha L przeciwciała chimerycznego można otrzymać przez połączenie cDNA, kodującego region V mysiego łańcucha L z genomowym DNA lub cDNA, kodującym region C łańcucha L przeciwciała ludzkiego, a następnie wprowadzenie do odpowiedniego wektora ekspresji. Jako region C łańcucha L, można wspomnieć np. łańcuch k lub łańcuch b λ.

Konstrukcja wektora ekspresji dla łańcucha k cDNA chimerycznego łańcucha L

Aby skonstruować wektor ekspresji, zawierający cDNA, kodujący region V mysiego łańcucha L, odpowiednie sekwencje zasad można wprowadzić metodą PCR. Przykładowo, te odpowiednie sekwencje zasad można wprowadzić metodą PCR przy użyciu primera PCR zaplanowanego tak, aby posiadał sekwencję rozpoznawania dla odpowiedniego enzymu restrykcyjnego przy końcu 5' i sekwencję konsensusową Kozaka tuż przed kodonem startowym, oraz primera PCR zaplanowanego tak, aby posiadał sekwencję rozzawania dla odpowiedniego enzymu restrykcyjnego przy końcu 3'.

Region C łańcucha k ludzkiego łańcucha L do łączenia z regionem V mysiego łańcucha L można skonstruować np. z użyciem HEF-PM1K-gK (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92/19759), zawierającego genomowy DNA. Wektor ekspresji dla łańcucha k łańcucha L cDNA przeciwciała chimerycznego, można skonstruować przez wprowadzenie sekwencji rozpoznawania odpowiednich enzymów restrykcyjnych przy końcu 5' lub końcu 3' metodą PCR, ligację tak skonstruowanego regionu V mysiego łańcucha L do regionu C łańcucha k, oraz następnie wprowadzenie do wektora ekspresji takiego jak pCOS 1 lub pCHO1.

2. Konstnukeca przekształconego ludzkiego (1) Zaplanowanie regionu V przeksztecconego ludzkiego przeciwciaaa anty-HM 1.24

Aby skonstruować przekształcone przeciwciało ludzkie, w którym CDR mysiego przeciwciała monoklnnalnegn przeszczepia się do przeciwciała ludzkiego, pożądane jest aby istniała wysoka homologia między FR mysiego przeciwciała monoklnnalzegn oraz FR przeciwciała ludzkiego. Tak więc, regiony V łańcucha L i łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM

1.24 porównuje się z regionami V wszystkich znanych przeciwciał, których struktury wyjaśniono, przy użyciu Protein Data Bank.

Region V łańcucha L mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 jest najbardziej podobny do sekwencji konsensusowej podgrupy IV regionu V łańcucha L przeciwciała ludzkiego (HSGIV) z^motagą 66,4%. Z drugiej strony, wykazuje ona homologię 56,9%, 55,8% i 61,5% odpowiednio z HSGI, HSGII i HSGIII.

Region V łańcucha L mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, w porównaniu z regionem V łańcucha L znanych przeciwciał ludzkich, wykazuje homologię 67,0% z regionem V łańcucha L ludzkiego przeciwciała REI z podgrupy I regionu V łańcucha L przeciwciała ludzkiego. Zatem, FR rEi użyto jako materiału wyjściowego do konstruowania regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Zaplanowano wersję regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24. W tej wersji, FR przeciwciała ludzkiego wykonano identycznie zFR na bazie REI obecnego w przekształconym ludzkim przeciwciele CAMPATH-1H (patrz Riechmann, L. i in., Nature 322, 21-25, (1988), FR zawarty w wersji a regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała PM-1 opisanego w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym

187 642 nr WO 92-19759), a mysi CDR wykonano identycznie z CDR w regionie V łańcucha L mysiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Region V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 jest najbardziej podobny do sekwencji konsensusowej regionu V łańcucha H ludzkiego przeciwciała (HSGI) z homologią 54,6%. Z drugiej strony, wykazuje ona homologię 34,6% i 48,1% odpowiednio zHSGII i HSGIII. Gdy region V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 porównuje się z regionem V łańcucha H znanych przeciwciał ludzkich, FR1 do FR3 były najbardziej podobne do regionu V łańcucha H ludzkiego przeciwciała hG3, z podgrupy I regionu V ludzkiego łańcucha H (Rechavi, G. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 855-859), z homologią 67,3%.

Zatem FR ludzkiego przeciwciała HG3 użyto jako materiał wyjściowy do konstruowania regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Jednakże, ponieważ nie opisano sekwencji aminokwasowej FR4 ludzkiego przeciwciała HG3, jako FR4 użyto sekwencji aminokwasowej FR4 ludzkiego przeciwciała JH6 (Ravetch, J.V. i in., Cell, 27, 583-591), która wykazuje najwyższą homologię z FR4 mysiego przeciwciała anty-HM 1.24. FR4 JH6 posiada taką samą sekwencję aminokwasową jak FR4 łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 z wyjątkiem tylko jednego aminokwasu.

W pierwszej wersji a regionu V łańcucha H przekształconego go przeciwciała anty-HM 1.24, FR1 do FR3 wykonano identycznie zFR1 do FR3 ludzkiego przeciwciała HG3 z wyjątkiem, że aminokwasy w pozycji 30 w ludzkim FR1 i pozycji 71 w ludzkim FR3 wykonano identycznie z aminokwasami mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, a CDR wykonano identycznie z CDR w regionie V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24.

(2) KonstKkcja regio nu V łańcucha L przeksztaLcnego ludzkiego przećiprchiła ^πΙυι HM 1.24

Łańcuch L przekształconego ludzkiego praroiwcioło onty-HM 1.24 konstruuje się przez przeszczepienie CDR w metodzie PCR. Metodę ukazuje się schematycznie w fig. 4. Stosuje się osiem primerów PCR do konstruowania przekształconego ludzkiego przeciwciała antyHM 1.24 (wersja a), mającego FR pochodzący od ludzkiego przeciwciała REI. Zewnętrzne primery A (SEQ ID nr: 47) i H (SEQ ID nr: 48) zaplanowano tak aby hybrydyzkwoły z sekwencją DNA wektora ekspresji HEF-VL-gK.

Primery przeszczepiania CDR LIS (SEQ ID nr: 49), L2S (SEQ ID nr: 50) i L3S (SEQ ID nr: 51) posiadają sensowną sekwencję DNA. Primery przeszczepiania CDR L1A (SEQ ID nr: 52), L2a (SEQ ID nr: 53) i L3A (SEQ ID nr: 54) posiadają antysensowną sekwencję DNA, przy czym każdy posiada komplementarną sekwencję DNA (20 do 23 bp) z sekwencją DNA przy końcu 5' odpowiednio primerów L1S, L2S i L3S.

W pierwszym stadium PCR, przeprowadza się cztery reakcje PCRA-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A i L3S-H i kczyszoza każdy produkt PCR. Cztery produkty PCR z pierwszego PCR pozostawia się do zmontowania jeden z drugim przez ich własną komplrmentamkść (patrz WO 92-19759). Następnie, zewnętrzne primery A i H dodaje się do powielenia pełnej długości DNA, kodującego region V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM

1.24 (druga PCR). W powyższce PCR, pla^a^it( HEF-RVL-M21a (ρηΟγζ międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 95-14041), kodujący wersję a regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała ONS-M21 na podstawie FR pochodzącego od ludzkiego przeciwciała REI, można wykorzystać jako matrycę.

W pierwszym stadium PCR użyto DNA matrycy i każdy z primerów.

Produkty PCR A-L1A (215 bp), L1S-L2A (98 bp) L2S-L3A (140 bp) oron L3S-H (151 bp) oczyszcza się przy użyciu 1,5% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia i łączy w drugiej PCR. W drugiej PCR używa się każdego produktu z pierwszej PCR i każdego zewnętrznego primera (a i H).

Fragment DNA o 516 bp uzyskany z drugiej PCR oczyszcza się przy użyciu 1,5% żelu agαroaowrao o niskiej temperaturze topnienia, trawi BamHI i HindIn, i tok otrzymane fragmenty DNA klonuje do wektora ekspresji HEF-V1-gK. Po określeniu sekwencji DNA, plazmid, zawierający fragment DNA, mający prawidłową sekwencję hminkkwaskwą regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, nazwano plazmidem

187 642

HEF-RVLa-AE]M-gK. Sekwencję aminokwasową oraz sekwencje zasad regionu V łańcucha L zawarte w tym plazmidzie HEF-RVLa-AHM--gK ukazuje się w SEQ ID nr: 9.

Wersję b regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 można skonstruować przez mutagenezę przy użyciu PCR. Primery mutagenne FTY-1 (SEQ ID nr: 55) i FTY-2 (SEQ ID nr: 56) zaplanowano tak, aby imitowały fenyloalaninę w pozycji 71 na tyrozynę.

Po powieleniu powyższych primerów przy użyciu plazmidu HEF-RVLa-AHM-gK jako matrycy, końcowy produkt oczyszcza się. Przez trawienie BamHI i HindIII otrzymane fragmenty DNA klonuje się do wektora ekspresji HEF HEF-VL-gK aby otrzymać plazmid HEFRVLb-AHM-gK. Sekwencję aminokwasową oraz sekwencje zasad regionu V łańcucha L zawarte w tym plazmidzie HEF-RVLb-AHM-gK ukazuje się w SEQ ID nr: 10.

(3) KonstKkcja uc^anu V nabe^ań H hazeksztz-contgh ludzJłiego arąa

HM 1.24

3-1. Konstrukcja wersji a do e regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

DNA, kodujący region V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM

1.24 można zaplanować następująco. Przez wiązanie sekwencji DNA, kodującej FR. 1 do 3 ludzkiego przeciwciała HG3 i FR4 ludzkiego przeciwciała JH6 z sekwencją DNA, kodującą CDR regionu V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, można zaplanować pełnej długości DNA, kodujący region V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała antyHM 1.24.

Następnie, miejsce rozpoznania HindIII/sukwencję konsensusową KOZAK oraz miejsce rozpoznania BamHI/jukweccja donorowa składania, odpowiednio, przyłącza się do końca 5' lub końca 3' tej sekwencji DNA tak, aby pozwolić na insercję wektora ekspresji HEF.

Tak zaplanowaną sekwencję DNA dzieli się na cztery oligonukleotydy. Następnie, oligonukleotydy, które potencjalnie przeszkadzają w motowaniu tych oligonukleotydów, poddaje się analizie komputerowej pod względem struktury drugorzędowej.

Sekwencje czterech oligonukleotydów RVH1 do RVH4 przedstawiono w SEQ ID nr: 57 do 60. Te oligonukleotydy mają długość 119 do 144 zasad i mają region nakładający się o 25 do 26 bp. Wśród oligonukleotydów RVH2 (SEQ ID nr: 58) i RVH4 (SEQ ID nr: 60) mają sensowną sekwencję DNA, a RVH1 (SEQ ID nr: 57) i RVH3 (SEQ ID nr: 59) mają antysensowną sekwencję DNA. Metodę montowania tych czterech oligonukleotydów metodą PCR ukazano w rysunku (patrz fig. 5).

PCR przeprowadza się przy użyciu czterech oligonukleotydów i RHP1 (SEQ ID nr: 60) oraz RHP2 (SEQ ID nr: 62) jako primerów zewnętrznych.

Powielone fragmenty DNA o 438 bp oczyszcza się, trawi HindIII i BamHI, a potem klonuje do wektora ekspresji HEF HEF-VH-gyi. Po określeniu sekwencji zasad plazmid, który zawiera fragment DNA, kodujący prawidłową sekwencję aminokwasową regionu V łańcucha H określono jako HEF-RVHa-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad w tym plazmidzie HEF-RVHa-AHM-gy 1 ukazuje się w SEQ ID nr: 11.

Każdą z wersji b, c, d i e regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 konstruuje się następująco.

W konstruowaniu każdej z wersji b i następnej regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, można skonstruować trójwymiarowy model strukturalny regionu V mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, aby przewidzieć pozycję reszty aminokwasowej podstawianej w cząsteczce przeciwciała.

Przy użyciu jako mutagenu primera BS (sekwencja 63) oraz BA (SEQ ID nr: 64) zaplanowanych aby mutować argininę w pozycji 66 na lizynę oraz jako DNA matrycy plazmid HEF-RVHa-AHM-gyi metodą PCR, wersję b powiela się w celu uzyskania plazmidu HEFRVHb-AHM-gyi. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartego w tym plazmidzie HEF-RVHb-AHM-gyi ukazuje się w SEQ ID nr: 12.

Przy użyciu jako mutagenu primera CS (sekwencja 65) oraz CA (SEQ ID nr: 66) zaplanowanych aby mutować treoninę w pozycji 73 na lizynę oraz jako DNA matrycy plazmid HEF-RVHa-AHM-gyi metodą PCR, wersję c powiela się w celu uzyskania plazmidu HEF20

187 642

RVHc-AHM-gy 1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartego w tym plazmidzie HEF-RVHc-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 13.

Przy użyciu jako mutagenu primera DS (sekwencja 67) oraz DA (SEQ ID nr: 68) zaplanowanych aby mutować argininę w pozycji 66 na lizynę i treoninę w pozycji 73 na lizynę oraz jako DNA matrycy plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1 metodą PCR, wersję d powiela się w celu uzyskania plazmidu HEF-RVHd-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartego w tym plazmidzie HEF-RVHd-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 14.

Przy użyciu jako mutagenu primera ES (sekwencja 69) oraz EA (SEQ ID nr: 70) zaplanowanych aby mutować walinę w pozycji 67 na alaninę i metioninę w pozycji 69 na leucynę oraz jako DNA matrycy plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1, wersję e powiela się w celu uzyskania plazmidu HEF-RVHe-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartego w tym plazmidzie HEF-RVHe-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 15.

3-2. Konstrukcja hybrydowego regionu V łańcucha H

Przez konstruowanie hybrydowego regionu V łańcucha H możliwe jest prześledzenie, który FR regionu V humanizowanego przeciwciała nadaje aktywność wiązania i aktywność hamowania wiązania. Wśród dwóch skonstruowanych, sekwencje aminokwasowe zFR1 i FR2, które pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 i z FR3 i FR4 są z wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 (mysie ludzkie hybrydowe przeciwciało anty-HM 1.24) w jednym, a sekwencje aminokwasowe FR1 i FR2 pochodzące z wersji z regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 (ludzkie mysie hybrydowe przeciwciało anty-HM 1.24) w drugim. Wszystkie sekwencje aminokwasowe regionów CDR pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Dwa hybrydowe regiony V łańcucha H konstruuje się metodą PCR. Metodę schematycznie ukazuje się w fig. 6 i 7. Do konstruowania dwóch hybrydowych regionów V łańcucha H można stosować cztery primery. Zewnętrzne primery a (SEQ ID nr: 71) i h (SEQ ID nr: 72) zaplanowano, aby hybrydyzowały z sekwencją DNA wektora ekspresji HEF HEF-VH-gy1. Primer HYS (SEQ ID nr: 73) konstrukcji hybrydowej łańcucha H planuje się tak, aby posiadał sensowną sekwencję DNA, a primer HYA (SEq ID nr: 74) hybrydy łańcucha H, aby posiadał antysensowną sekwencję DNA tak, że sekwencje DNA są komplementarne jedna z drugą.

Do konstruowania regionu V hybyydy łańcucha H, w której sekwencje aminokwasowe FR1 iFR2 pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 i te zFR3 iFR4 są z wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, przeprowadza się PCR przy użyciu plazmidu HEF-1.24H-gy1 jako matrycy, zewnętrznego primera a, hybrydowego primera HYA łańcucha H, oraz PCR przy użyciu plazmidu HEF-RVHa-AHMgyl jako matrycy, hybrydowego primera HYA łańcucha H oraz zewnętrznego primera h, w pierwszym etapie PCR, i każdy produkt PCR oczyszcza się.

Dwa produkty PCR z pierwszej PCR pozostawia się do złożenia przez ich własną komplementarność (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92019759). Następnie, przez dodanie primerów zewnętrznych a i h, w drugim etapie PCR powiela się pełnej długości DNA, kodujący hybrydowy region V łańcucha H, w którym sekwencje aminokwasowe FR1 iFR2 pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 i te zFR3 iFR4 są z wersji a z regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Do konstruowania regionu V hybrydy łańcucha H, w której sekwencje aminokwasowe FR1 i FR2 pochodzą od wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1 , ateFR 3 iFR4 są mysieoo rrzcciwciala anty-HM 12 24, r^rzcr^rw^aadza się PCR przy użyciu plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 jako matrycy, hybrydowego primera HYA łańcucha H oraz PCR przy użyciu plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 jako matrycy, hybrydowego promem HYS łańcucha H oraz zewnętrznego primera h, w pierwszym etapie PCR, i każdy produkt PCR oczyszcza się.

Dwa produkty PCR z pierwszej PCR pozostawia się do połączenia przez ich własną komplementarność (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92019759). Następnie, przez dodanie primerów zewnętrznych a i h, w drugim etapie PCR powiela się pełnej długości DNA, kodujący hybrydowy region V łańcucha H, w którym sekwencje aminokwasowe

187 642

FR1 i FR2 są z wersji a z regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, a te z FR3 i FR4 pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Metody pierwszej PCR, oczyszczanie produktów PCR, łączenie, druga PCR i kloning do wektora ekspresji HEF HEF-VH-gy1 przeprowadza się zgodnie z metodą ukazaną w „przykładzie 9. Konstrukcja regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24”. Po określeniu sekwencji DNA, plazmid, który zawiera fragment DNA, kodujący prawidłową sekwencję aminokwasową hybrydowego regionu V łańcucha H, w którym sekwencje aminokwasowe FR1 iFR2 pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, a FR3 i FR4 są z wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, nazwano HEF-MH-RVH-AHM-gy1.

Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartą w tym plazmidzie HEF-MH-RVH-AHM-gy1 ukazano w SEQ ID nr: 75. Także, plazmid, który zawiera fragment DNA, kodujący prawidłową sekwencję aminokwasową hybrydowego regionu V łańcucha H, w którym sekwencje aminokwasowe FR1 i FR2 pochodzą od wersji a przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, a te FR3 i FR4 są z regionu V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, nazwano HEF-HM-RVH-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartego w tym plazmidzie HEF-HMRVH-AHM-gy1 ukazano w SEQ ID nr: 76.

3-3. Konstrukcja wersji f do s regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

Każdą z wersji f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r i s regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 konstruuje się następująco. W konstruowaniu każdej wersji f i dalej regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, można skonstruować trójwymiarowy model strukturalny regionu V mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, jak wspomniano powyżej, w celu przewidzenia pozycji reszty aminokwasowej, którą chce się podstawiać w cząsteczce przeciwciała.

Przy użyciu jako mutagennego primera FS (sekwencja 78) oraz FA (SEQ ID nr: 79) zaplanowanych tak, że mutujątreoninę w pozycji 75 na serynę i walinę w pozycji 78 na alaninę, oraz jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHe-AHM-gy1 metoda PCR, wersję f powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHf-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHf-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 16.

Przy użyciu jako mutagennego primera GS (sekwencja 80) oraz GA (SEQ ID nr: 81) zaplanowanych tak, że mutują alaninę w pozycji 40 na serynę oraz jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1 metodą PCR, wersję g powiela się aby otrzymać plazmid HEFRVHg-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHg-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 17.

Przy użyciu jako mutagennego primera FS oraz FA oraz jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHb-AHM-gy1, wersję h powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHh-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 18.

Przy użyciu jako mutagennego primera IS (sekwencja 82) oraz IA (SEQ ID nr: 83) zaplanowanych tak, że mutują argininę w pozycji 83 na alaninę oraz serynę w pozycji 84 na fenyloalaninę i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję i powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHi-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHi-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 19.

Przy użyciu jako mutagennego primera JS (SEQ ID nr: 84) oraz JA (SEQ ID nr: 85) zaplanowanych tak, że mutują argininę w pozycji 66 na lizynę i jako matrycy DNA plazmid HEF-RYHf-AHM-gy1, wersję j powiela się aby 1, H otrzymać plazmid HEF-RVHj-AHMgyl. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHj-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 20.

Przy użyciu jako mutagennego primera KS (SEQ ID nr: 86) oraz KA (SEQ ID nr: 87) zaplanowanych tak, że mutują kwas glutaminowy w pozycji 81 na glutaminę i jako matrycy

187 642

DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję k powiela się aby otrzymać plazmid HEFRVHk-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHk-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 21.

Przy użyciu jako mutagennego primera LS (SEQ ID nr: 88) oraz LA (SEQ ID nr: 89) zaplanowanych tak, że mutują kwas glutaminowy w pozycji 81 na glutaminę oraz serynę w pozycji 82b na izoleucynę i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję 1 powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVH1-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVH1-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 22.

Przy użyciu jako mutagennego primera MS (SEQ ID nr: 90) oraz MA (SEQ ID nr: 91) zaplanowanych tak, że mutują kwas glutaminowy w pozycji 81 na glutaminę, serynę w pozycji 82b na izoleucynę oraz treoninę w pozycji 87 na serynę i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję m powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHmAHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHm-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 23.

Przy użyciu jako mutagennego primera NS (SEQ ID nr: 92) oraz NA (SEQ ID nr: 93) zaplanowanych tak, że mutują serynę w pozycji 82b na izoleucynę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję m powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHn-AHMgyl. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHn-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 24.

Przy użyciu jako mutagennego primera OS (SEQ ID nr: 94) oraz OA (SEQ ID nr: 95) zaplanowanych tak, że mutują treoninę w pozycji 87 na serynę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję o powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHo-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHo-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 25.

Przy użyciu jako mutagennego primera PS (SEQ ID nr: 96) oraz PA (SEQ ID nr: 97) zaplanowanych tak, że mutują walinę w pozycji 78 na alaninę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1, wersję p powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHp-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHp-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 26.

Przy użyciu jako mutagennego primera QS (SEQ ID nr: 98) oraz QA (SEQ ID nr: 99) zaplanowanych tak, że mutują treoninę w pozycji 75 na serynę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1, wersję q powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHq-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHq-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 27.

Przy użyciu jako mutagennego primera CS (SEQ ID nr: 65) oraz CA (SEQ ID nr: 66) i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHp-AHM-gy1, wersję r powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHr-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową. i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHr-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 28.

Przy użyciu jako mutagennego primera SS (SEQ ID nr: 100) oraz SA (SEQ ID nr: 101) zaplanowanych tak, że mutują metioninę w pozycji 69 na izoleucynę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHr-AHM-gy1, wersję s powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHsAHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHs-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 102.

Skonstruowane sekwencje aminokwasowe regionu V łańcucha L ukazuje się w tabeli 1, a sekwencje aminokwasowe regionu V łańcucha H ukazuje się w tabelach 2 do 4.

Tabela 1

Sekwencja aminokwasowa regionu V łańcucha H

FR1 CDR1 FR2

3 4

12345678901234567890123 45678901234 567890123456789

AHM DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDYNTAVA WYQQKPGQSPKLLIY

HuSG I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY

187 642

REI DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY

RVLc -------------------------------------------- ------------------------ ----------------------------RVLb ............................................ ......................................................

0123456

AHM SASNRYT

HuSGI

REI

RVLa -----------RVLb -----------CDR2 FR3

7 8

78901234567890123456789012345678

GVPDRITGSGSGTDFTFTISSVQAEDLALYYC

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYC

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDIATYYC •Y·

CDR3	FR4
	9	10
	901234567	8901234567
AHM	QQHYSTPFT	FGSGTKLEIK
HuSGI		FGQGTKVEIK
REI		FGQGTKVEIK

RVLa

RVLb

Tabela 2

Sekwencja cminpkwazpwa regionu V łańcucha H (1)

FR1 CDR1

2 3

123456789012345678901234567890 1234

AHM QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT PYWMQ

HuSGI EVQLVQSGADVKKPGXSVXVSCKASGYTFS

HG3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFN

RVHa -----------------------------------------------------------T ----------RVHb -----------------------------------------------------------T ----------RVHc ------------------------------------------------------T ---------RVHd --------------------------------------------------------T ----------RVHe ------------------------------------------------------------T ---------RVHf -----------------------------------------------------------T ----------RVHg ----------------------------------------------------------T ----------RVHi ------------------------------------------------------------T ----------RVHj --------------------------------------------------------T ---------RVHk -----------------------------------------------------------T ---------RVHl -----------------------------------------------------------T ----------RVHm ------------------------------------------------------------T ----------RVHn ---------------------------------------------------------T ----------RYHo -----------------------------------------------------------T ----------RVHp ----------------------------------------------------------T ----------RVHq -----------------------------------------------------------T ---------RVHr ------------------------------------------------------------T ----------RVHs -------------------------------------------------------T ----------FR2

567890123456789

WVKQRPGQGLEWIG

WVRQAPGXGLDWVG

WVRQAPGQGLEWMG

187 642

Tabela 3

Sekwencja aminokwasowa regionu V łańcucha H (2)

FR1 CDR1 FR2

6 7 8 9

012A3456789012345 67890123456789012ABC345678901234

AHM SIFPGDGDTRYSQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSILAFEDSAVYYCAR HuSGI RVTXTXDXSXNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

HG3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR

RVHa ............................................A----------------------------------------------------RVHb -------------------------- K---------A--------------------------------------------------RVHc -------------------------- -----------A—K------------------------------------------RVHd --------------------------- K---------A—K-----------------------------------------------RVHe --------------------------- --A--L—A---------------------------------------------------RVHf --------------------------- —A-L—A---------S-------A------------------------------RVHg -------------------------- -----------A----------------------------------------------------RVHi -------------------------- K---------A---------S-------A-------------------AF---------RVHj -------------------------- K---------A---------S-------A---------------------------------RVHk ------------------------ KA--L--A--------S-------A------Q-------------------------RVHl -------------------------- K---------A-------S-------A------Q-----1------------------RVHm --------------------------- K---------A---------S-------A------Q-----1-------S----------RVHz --------------------------- K---------A---------S-------A------------1-------------------RVHo -------------------------- K---------A---------S-----A---------------------S--------RVHp ------------------------- -----------A------------------A-------------------------------RVHq -------------------------- -----------A---------S-----------------------------------------RVHr -------------------------- ----------A—K------------A---------------------------------RVHs -------------------------- ------1—A—K------------A--------------------------------Tabela 4

Sekwencja aminokwasowa regionu V łańcucha H (3)

CDR3 10

57890ABJK12

AHM GLRRGGYYFDY

HuSGI

JH6

RVHa ---------------------RVHb ---------------------RVHc ---------------------RVHd ----------------------RVHe ---------------------RVHf ----------------------RVHg ----------------------RVHh ----------------------RVHi ----------------------RVHj ----------------------RVHk ---------------------RVHl ----------------------RVHm ----------------------RVHn ----------------------RVHo ----------------------RVHp ----------------------RVHq ----------------------RVHr ----------------------RVHs ---------------------FR4

34567890123

WGQGT'n,TVSS

WGQGTTLTVSS

187 642

3. Wytwarzanie chimerycznego przeciwciała i przekształconego przeciwciała ludzkiego

Aby wytworzyć przeciwciało chimeryczne lub przekształcone przeciwciało ludzkie, konstruuje się dwa wektory ekspresji dla każdego, które zawierają wektor ekspresji, zawierający DNA, kodujący region mysiego łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H pod kontrolą regulatorowego regionu ekspresji, takiego jak układ wzmacniacz/promotor oraz DNA, kodujący region V mysiego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L pod kontrolą regulatorowego regionu ekspresji, takiego jak układ wzmacniacz/promotor lub wektor ekspresji, zawierający DNA, kodujący region V humanizowanego łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H pod kontrolą regulatorowego regionu ekspresji, takiego jak układ wzmacmacz/promotor i DNA, kodujący region V humanizowanego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha H pod kontrolą regulatorowego regionu ekspresji, takiego jak układ wzmacniacz/promotor.

Następnie, kotransformuje się komórkę gospodarza taką jak komórka ssaka, przy użyciu tych wektorów, i transformowane komórki hoduje się in vitro lub in vivo w celu wytworzenia chimerycznego przeciwciała lub przekształconego ludzkiego przeciwciała (np. międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 91-16928). Ponadto, gen przeciwciała wprowadza się do ssaków, takich jak koza, w celu wytworzenia zwierzęcia trznsgznicznego, z którego mleka można wytworzyć przeciwciało chimeryczne lub przekształcone przeciwciało ludzkie.

Także, region V łańcucha H i region C łańcucha L, oraz region V łańcucha L i region C łańcucha L poddaje się ligacji do pojedynczego wektora w celu transformacji odpowiedniej komórki gospodarza i przez to wytworzenia przeciwciał. Tak więc, w celu ekspresji przeciwciał chimerycznych, DNA, kodujący mysią sekwencję liderową i region V łańcucha H oraz region C ludzkiego łańcucha H obecny w klonowanym cDNA i DNA, kodujący mysią sekwencję liderową i region V łańcucha L oraz region C ludzkiego łańcucha L, wprowadza się do pojedynczego wektora ekspresji (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 94-11523).

W celu ekspresji przekształconego ludzkiego przeciwciała, DNA, kodujący region V humanizowanego łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H, oraz DNA, kodujący region humanizowanego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L wprowadza się do pojedynczego wektora ekspresji (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 94-11523). Przy użyciu wymienionego wektora transformuje się komórki gospodarza i transformowane komórki gospodarza hoduje się in vivo lub in vitro w celu wytworzenia żądanego przeciwciała chimerycznego lub ludzkiego przeciwciała przekształconego.

Transformanta, którego transformowano jak wspomniano powyżej, genem, kodującym żądane przeciwciało chimeryczne lub ludzkie przeciwciało przekształcone, hoduje się i wytworzone przeciwciało chimeryczne lub ludzkie przeciwciało przekształcone można wyizolować z wnętrza lub zewnętrza komórek i oczyszczać do jednorodności.

Izolację i oczyszczanie żądanego białka według niniejszego wynalazku, przeciwciało przeciwciało chimeryczne lub ludzkie przeciwciało przekształcone, można przeprowadzić przy użyciu kolumny powinowactwa. Jako kolumnę, wykorzystującą białko A np. wymienia się HyperD, POROS, Sepharose FF itd. Alternatywnie, można użyć konwencjonalne metody izolacji i oczyszczania stosowane dla białek i metoda nie jest ograniczona w żaden sposób. Przykładowo, połączenia różnych metod chromatograficznych, ultyzwiyowzniz, odsalania, dializy i innych zgodnie z potrzebą, pozwolą na izolację i oczyszczenie przeciwciała chimerycznego lub przekształconego przeciwciała ludzkiego.

W celu wytworzenia chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 lub przekształconego przeciwciała ludzkiego anty-HM 1.24 według niniejszego wynalazku, można użyć metod ekspresji włączając, np. komórki eukariotyczne, takie jak komórki zwierzęce, ustalone układy linii komórkowych ssaków, układ komórkowy owadów, układ komórkowy grzybów i układ komórkowy drożdży, oraz komórki prokn-wtyczne, takie jak komórki bakteryjne, takie jak komórki Escherichia coli i inne. Korzystnie, przeciwciało chimeryczne lub przekształcone przeciwciało ludzkie według niniejszego wynalazku może podlegać ekspresji w komórkach COS, komórkach CHO, komórkach Hela, komórkach Tero, komórkach szpiczaka lub komórkach BHK.

187 642

W tych przypadkach można stosować użyteczne zwykłe promotory, które są do ekspresji komórek ssaków. Przykładowo, korzystnie można stosować ludzki pośredni wczesny promotor cytkmegalkwirusa (HCMV). Przykładami wektorów ekspresji, zawierających promotor HCMV są HCMV-VH-HCy1, HCMV-VLHCk itd. i które pochodzą od pSV2neo (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92-19759).

Ponadto, jako promotor dla ekspresji genu w komórkach ssaków do użytku w niniejszym wynalazku, można stosować promotory wirusowe, takie jak rrarowirus, poliomawirus, adenowirus, małpi wirus 40 (SV40) itd., oraz promotory pochodzące z komórek ssaków, takie jak ludzki czynnik wydłużania łańcucha polipeptydowego 1a (HEF-1a), itd. Przykładowo, jeśli stosuje się promotor SV40, ekspresję można łatwo przeprowadzić przy użyciu metody Mulligana i in., (Nature 277, 108 (1979)), ajeśli stosuje się promotor HEF-1a można użyć metody Mizushima, S. i in., (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990).

Jako źródło replikacji można stosować te, pochodzące od SV40, poliomawirusa, adenowirusa, wirusa brodawczaka bydlęcego (BPV) i innych, a do powielenia licacych kopii genu w układzie komórkowym gospodarza, wektorem ekspresji może być jako marker selekcji, gen fosflaτacsferany ominoglikoaydowej (APH), gen kinazy tymidynowej (TK) gen transfermy ksantynkauocidynofksforybozylowej E. coli (Ecogpt), gen redu^my dipyrrofolionowej (DHRF) i inne.

4. AktywAkść inhibicii biczania pczeciwciała ciam ełpcΏreyo ib prreksztarconego ludzkiego prnrciwoioła (1) Pomiar stężenia przeciwciała

Stężenie oozćszcaknrgo prarciwoiołα można mierzyć metodą ELISA lub pomiarem absorbancji.

Płytki ELISA do pomiary stężenia przeciwciała można wytworzyć następująco. Każdą studzienkę 96-studzirckkwej płytki ELISA (np. Maxisorp, wyprodukowanej przez NUNC) unieruchamia się 100 pl koziego prarciw-lurakiego przeciwciała IgG o stężeniu 1 pg/ml.

Po zablokowaniu 100 pg/ml buforu do rozcieńczania (np. 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NoN3, 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA) pH 8,1), do każdej studzienki dodaje się seryjne rozcieńczenia suprrnotantu hodowlanego komórek, w których zachodziła ekspresja praeciwoioła chimerycznego lub przekształconego ludzkiego przeciwciała, np. suprrnatont hodowlany komórek COS lub komórek CHO, albo oozyszcaknr przrciwoiałk chimeryczne, przeciwciało hybrydowe lub przekształcone ludzkie przeciwciało. Potem dodaje się 100 pl koziego anty-ludzkiego przeciwciała sprzężonego z fosfatazą alkaliczną, 1 mg/ml roztworu substratu (Sigma104, p-niarofenylkfosforαn, wyprodukowany przez SIGMA), a następnie mierzy się absorbuj przy 405 nm przy użyciu czytnika do mikropłytek (Bio Rad). Jako standard do pomiaru stężenia, można użyć ludzkiej IgG1K (wyprodukowanej przez The Binding Site). Otrzymuje się stężenie oczyszczonego przeciwciała przez pomiar absorbuj przy 280 nm i obliczenie z 1 mg/ml jako 1,35 OD.

(2) Aktywność wiązania

Aktywność wiązania można zmierzyć przez Cell-ELISA przy użyciu liii ludzkich komórek owodniowych W1SH (ATCC CCL25). Płytkę Cell-ELISA można sporządzić następująco. Komórki WISH przygotowane w odpowiednim stężeniu za pomocą pożywki PRMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, dodaje się do 96-studaienkonej płytki, inkubuje przez noc i po dwukrotnym przemyciu PBS(-) utrwala z 0,1% aldehydem gitarowym (wćprorukowocćm przez Nakalai tesque).

Po zablokowaniu, do każdej studzienki dodaje się 100 pl seryjnych rozcieńoaeń supernαtonau hodowlanego komórek, w których zachodziła ekspresja przeciwciała chimerycznego anty-HM 1.24, hybrydowego przeciwciała anty-HM 1.24 lub przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, np. suprmotαnt hodowlany komórek COS lub komórek CHO, albo oczyszczone chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24, hybrydowe praroiwciało anty-HM

1.24 lub przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24, inkubuje w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a potem dodaje królicze anty-ludzkie przeciwciało IgG (wyprodukowane przez DAKO).

187 642

Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę dodaje się roztwór substratu i następnie inkubuje. Kolejno, reakcję zatrzymuje się przez dodanie 50 pl 6N kwasu siarkowego i potem mierzy absorbancję przy 490 nm przy użyciu MICROPLATE READER Model 3550 (wyprodukowanego przez Bio-Rad).

(3) Pomiar aktywności inhibicji wiązania

Aktywność inhibicji wiązania przez biotynylowane mysie przeciwciało anty-HM 1.24 mierzy się przez Cell-ELISA przy użyciu linii owodniowej komórkowej WISH (ATCC CCL25). Płytkę Cell-ELISA można sporządzić zgodnie z tym, co wymieniono powyżej (2). Komórki WISH przygotowane w odpowiednim stężeniu za pomocą pożywki PRMI 1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, dodaje się do 96-studzieckowej płytki, mkubuje przez noc, i po dwukrotnym przemyciu wPBS(-) utrwala się 0,1% aldehydem glutarowym (wyprodukowanym przez Nakalai tesąue).

Po zablokowaniu, do każdej studzienki dodaje się 50 pl seryjnych rozhieńhzeń supernatantu hodowlanego komórek, w których zachodziła ekspresja przeciwciała chimerycznego anty-HM 1.24, hybrydowego przeciwciała anty-HM 1.24 lub przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, np. supernatant hodowlany komórek COS lub komórek CHO, albo oczyszczone chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24, hybrydowe przeciwciało anty-HM

1.24 lub przeciwciało anty-HM 1.24, równocześnie dodaae się 50 pl z 2 pg/ml biotynylowanego mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, a potem inkubuje w temperaturze pokojowej przez dwie godziny i po przemyciu dodaje streptoawidynę znakowaną peroksydazą (wyprodukowaną. przez DAKO).

Pomiar aktywności ADCc

Aktywność ADCC przeciwciała chimerycznego lub przekształconego przeciwciała ludzkiego można mierzyć następująco. Najpierw, komórki jednojądrzaste oddziela się od ludzkiej krwi obwodowej lub szpiku kostnego metodą wirowania w gęstości i wytwarza jako komórki efektorowe. Ludzkie komórki szpiczaka wytwarza się jako komórki docelowe przez znakowanie komórek RPMI 8226 (ATCC CCL 155) ⁵¹Cr. Następnie, dodaje się przeciwciało chimeryczne lub przekształcone przeciwciało ludzkie do pomiaru aktywności ADCC i inkubuje, a następnie dodaje się odpowiedni udział komórek efektorowych do komórek docelowych, i inkubuje.

Po inkubacji supernata! pobiera się do pomiaru pod względem radioaktywności przy użyciu licznika gamma. W tym czasie można użyć 1 %o NP-40 do pomiaru maksymalnej uwolnionej radioaktywności. Cytotoksyczność (%) można obliczyć jako (A-C)/(B-C) x 100, gdzie A oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną przez NP-40, a C oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną przez sam płyn hodowlany bez przeciwciała.

Jeśli oczekuje się aktywności ADCC lub aktywności CDC dla regionu C przeciwciała, można użyć ludzkiego Cy1 lub ludzkiego Cy3 jako regionu C przeciwciała. Ponadto, przez dodanie, zmianę lub modyfikację części aminokwasów w regionie C, można indukować wyższą aktywność ADCC lub CDC.

Przykładowo, istnieje polimeryzacja IgG podobna do IgM przez subnstytucję aminokwasową (Smith, R.I.F. i Morrison, S.L, BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683-688), polimeryzacja IgG podobna do IgM przez dodanie aminokwasu (Smith, R.I.F. i in., J. Immunol. (1995), 154, 2226-2236), ekspresja przez tandem wiążący geny, kodujące łańcuch L (Shuford, W i in., Science (1991) 252, 724-727), dimeryzacja IgG przez substytucję aminokwasową (Caron, P.C. i in., J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B.J. Immunology (1992) 148, 2918-2922, dimeryzacja IGG przez modyfikację chemiczną (Wolff, E.A. i in., Cancer Res. (1993) 53 2560-2565) oraz wprowadzenie funkcji ukfektorowej przez zmianę aminokwasu w regionie zawiasowym przeciwciał (Norderhaug, L. i in., Eur. J. Immunol (1991) 21 23792384). Można je osiągnąć przez mutagenezę oligomeru skierowaną miejscowo przy użyciu

187 642 primerów, dodanie sekwencji zasad przy użyciu rozszczepienia enzymem restrykcyjnym, i modyfikatory chemiczne, które indukują wiązanie kowalencyjne.

Diagnostyka in vivo pod względem szpiczaka

Chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 lub przekształcone przeciwciało anty-HM

1.24 według niniejszego wynalazku można stosować jako środki diagnostyczne in vivo pod względem szpiczaka, przez związanie go ze znakowanym związkiem, takim jak radioizotop i inne.

Ponadto, jako środki diagnostyczne in vivo pod względem szpiczaka, można użyć fragmenty chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 lub przekszałconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 takie jak Fab, F(ab')2, Fv lub Fv pojedynczego łańcucha (scFv), gdzie Fv lub Fv łańcucha H lub łańcucha L łączą się przez odpowiedni linker, który związano ze znakowanym związkiem, takim jak radioizotop itd.

Konkretnie, te fragmenty przeciwciał można otrzymać przez konstruowanie genu, kodującego te fragmenty przeciwciał, wprowadzenie ich do wektora ekspresji i potem ekspresję w odpowiedniej komórce gospodarza, albo trawienie chimerycznego przeciwciała anty-HM

1.24 lub przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 odpowiednim enzymem.

Wyżej wymienione środki diagnostyczne dla szpiczaka można podawać układowo w sposób pozajelitowy.

Kompozycja farmaceutyczna i środek terapeutyczny wobec szpiczaka.

W celu potwierdzenia efektów terapeutycznych chimerycznego przeciwciała anty-HM

1.24 lub humanizowanego przeciwciała anty-HM 1.24 według niniejszego wynalazku, wymienione przeciwciała podaje się zwierzęciu z przeszczepionymi komórkami szpiczaka i ocenia się skutki przeciwnowctworcwe.

Jako komórki szpiczaka do przeszczepienia zwierzęciu zaleca się ludzkie komórki szpiczaka i można np. wymienić KPMM2 (japoński nie zbadany opis patentowy (Kokai) nr

7-236475), RPMI8226 (ATCC CCL 155), ARH-77 (ATCC CRL 1621) oraz S6B45 (Suzuki, H i in., Eur. J. Immunol (1992) 22, 1989-1993). Jako zwierzęta, którym przeszczepia się wymienione komórki, zaleca się zwierzęta, u których zmniejszone są funkcje immunologiczne albo ich brak, i można wymienić nagie myszy, myszy SCID, myszy beżowe i nagie szczury.

Ponadto, oceniane skutki przeciwnowotworowe można potwierdzić przez zmianę w ilości ludzkich immunoglobulin w surowicy, pomiar objętości guza i/lub ciężar, zmianę ciężaru ludzkich białek Bence Jonesa w moczu, okres przeżycia zwierząt lub inne.

Kompozycje farmaceutyczne lub środki terapeutyczne dla szpiczaka, które zawierają jako składnik aktywny chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 lub przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24 według niniejszego wynalazku, można podawać układowo lub miejscowo w sposób pozajelitowy. Przykładowo, można wybrać iniekcję dożylną, taką jak infuzję kroplową, iniekcję domięśniową lub iniekcję podskórną, a tryb dawkowania można wybrać według potrzeby w zależności od wieku i stanu medycznego pacjenta.

Skuteczne dawkowanie wybiera się od zakresu 0,01 mg do 1000 mg/kg ciężaru ciała/dawkę. Alternatywnie, można wybrać dawkowanie 5 mg/kg ciężaru ciała, korzystnie 50 do 100 mg/kg ciężaru ciała.

Kompozycje farmaceutyczne lub środki terapeutyczne wobec szpiczaka, które zawierają jako składnik aktywny chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 lub przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 według niniejszego wynalazku, mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne nośniki lub dodatki w zależności od drogi podawania.

Jako przykłady takich nośników i dodatków można wymienić wodę, farmaceutycznie dopuszczalne rozpuszczalniki, kolagen, alkohol poliwinylowy, poliwinylcpirclidcn, polimer karboksywinylowy, kabroksymetylocelulozę sodową, poliakrylan sodu, alginian sodu, dekstran rozpuszczalny w wodzie, karboksymetyloskrobię sodową, pektynę, metylocelulozę, etylocelulozę, gumę ksantanową, gumę arabską, kazeinę, żelatynę, agar, diglicerynę, glicerynę, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, wazelinę, parafinę, alkohol stearylowy, kwas stearynowy, ludzką albuminę surowicy (HSA), mannitol, sorbitol, laktozę, farmaceutycznie dopuszczalne środki powierzchniowo czynne i inne. Dodatki do stosowania można wybrać lecz bez ograniczenia, z powyższych lub ich połączeń.

187 642

Następnie, niniejszy wynalazek zostanie wyjaśniony bardziej konkretnie.

Przykład 1. Kloning cDNA, kodującego region V mysiego przeciwciała anty-HM 1.24

1. Izolacja informacyjnego RNA (mRNA)

Przy użyciu Fast Track mRNA Isolation Kit wersja 3.2 (wyprodukowanego przez Invitrogen) zgodnie z instrukcją, do niego załączoną, wyizolowano mRNA z 2 x 10 ’ komórek hybrydomy (FERM BP-5233), które wytwarzają mysie przeciwciało anty-HM 1.24.

2. Powielenie genu, kodującego region zmienny przeciwciała metodą PCR

Przeprowadzono PCR przy użyciu cyklera cieplnego do powielania (wyprodukowanego przez Perkin Elmer Cetus).

2-1. Powielenie i fragmentacja genu, kodującego region V mysiego łańcucha L

Z tak wyizolowanego mRNA, zsyntetyzowano cDNA o pojedynczej nici przy użyciu AMY Reverse Trascriptase First-strand cDNA Sythesis Kit (wyprodukowanego przez Life Science) i użyto do PCR. Jako primery stosowane do PCR, użyto primerów MKV (mysi zmienny kappa) (Jones, S.T. i in., Bio/Technology, 9, 88-89, (1991)) ukazanych w SEQ ID nr: 29 do 39, które hybrydyzują z sekwencją liderową mysiego łańcucha L typu kappa.

100 μΐ roztworu PCR, zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kcl, 0,1 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCF, 5 jednostek polimerazy DNA Ampli Taq (wyprodukowanej przez Perkin Elmer Cetus), 0,25 mM primerów MKV ukazanych w SEQ ID nr: 29 do 39, 3 mM primera MKC ukazanego w SEQ ID nr: 40 i 100 ng cDNA o pojedynczej nici pokryto 50 μl oleju mineralnego, a następnie ogrzewano przy początkowej temperaturze 94°C przez 3 minuty, a potem w temperaturze 94°C przez 1 minutę, w temperaturze 55°C przez 1 minutę i w temperaturze 72°C przez 1 minutę w tym porządku. Po powtórzeniu tego cyklu 30 razy, mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 72°C przez 10 minut. Powielony fragment DNA oczyszczono przez agarozę o niskiej temperaturze topnienia (wyprodukowanej przez Sigma) i trawiono XmaI wyprodukowanym przez New England Biolabs) oraz SalI (wyprodukowanym przez Takara Shuzo) w temperaturze 37°C.

2-2. Powielenie i fragmentacja cDNA, kodującego region V mysiego łańcucha H

Gen, kodujący region V mysiego łańcucha H powielono metodą 5'RACE (szybkie powielenie końców cDNA; Frohman, M.A. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002), Edwards, J.B.D.M. i in., Nucleic Acids Res., 19, 5227-5232 (1991)). Po syntezie cDNA przy użyciu Primera P1 (SEQ ID nr: 41), który specyficznie hybrydyzuje ze stałym regionem mysiego IgG2, cDNA, kodujący region V mysiego łańcucha H powielono przez 5'-AmpliFINDER RACE kIt (wyprodukowany przez CLONTECH) przy użyciu primera MHC2a (SEQ ID nr: 42), który specyficznie hybrydyzuje ze stałym regionem mysiej IgG2 oraz primera kotwiczącego (SEQ ID nr 77) dołączonych do zestawu. Powielony fragment DNA oczyszczono za pomocą agarozy o niskiej temperaturze topnienia (wyprodukowanej przez Sigma) i trawiono EcoRI (wyprodukowanym przez Takara Shuzo) oraz XmaI (wyprodukowanego przez New England Biolabs) w temperaturze 37°C.

3. Łączenie i transformacja

Fragment DNA, obejmujący gen, kodujący region V mysiego łańcucha L typu kappa wytworzonego jak powyżej poddano ligacji z wektorem pUC19 wytworzonego przez trawienie SalI i XmaI przez reakcję w mieszaninie reakcyjnej, zawierającej 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolu, 1 mM ATP, 50 mg/ml glikolu polietylenowego (8000) i jedną jednostkę ligazy DNA T4 (wyprodukowanej przez GIBCO-BRL) w temperaturze 16°C przez 2,5 godziny. Podobnie fragment DNA, kodujący region V mysiego łańcucha H poddano reakcji i ligacji z wektorem pUC19 wytworzonym przez trawienie EcoRI i XmaI w temperaturze 16°C przez trzy godziny.

Następnie dodano 10 μΐ powyższej mieszaniny ligacyjnej do 50 μl kompetentnych komórek Escherichia coli DH α, które pozostawiono na lodzie przez 30 minut, w temperaturze 42°C przez 1 minutę i ponownie na lodzie przez jedną minutę. Następnie dodano do nich 400 μΐ pożywki 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), inkubowano w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a potem E. coli powleczono na pożywce agarowej 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), zawierającej 50 μΕ/ml

187 642 ampicyliny, a potem inkuepwanp przez noc w temperaturze 37°C, aby uzyskać transformanty E. coli.

Transformanty hodowano przez noc w temperaturze 37°C w 10 ml pożywki 2xYT, zawierającej 50 pl/ml ampicyliny, a następnie z tej hodowli wytworzono plazmidowy DNA przy użyciu metody zasadowej (Molezular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laborctpry Press, (1989)).

Tak otrzymany plazmid, zawierający gen, kodujący region V mysiego łańcucha L typu kappa, pochodzący od hybrydomy, która wytwarza ρrnezlwclałp anty-HM 1.24, określono jako cUCHMVL9. Plazmid otrzymany wyżej wymienioną metodą, zawierający gen, kodujący region V mysiego łańcucha H, pochodzącego od hybrydomy, która wytwarza przeciwciało anty-HM 1.24, określono jako) pUCHMVHR16.

Przykład 2. Określanie sekwencji zasad DNA

Sekwencje zasad regionu kodującego cDNA w powyższym plazmidzie określono przy użyciu automatycznego sekwencera DNA (wyprodukowanego przez AcplieZ Biosystems Inc.) oraz Taq Dye Deoxy Terminat Cycle Sequencing Kit (wyprodukowanego przez Applied Biosystems Inc.) w protokole wskazanym przez producenta.

Sekwencję zasad genu kodującego region V łańcucha L mysiego przeciwciała anty-HM

1.24 zawartego w plazmidzie cUCMHVL9 ukazuje się w SEQ ID Nr: 1. Sekwencję zasad genu kodującego region V łańcucha L mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 zawartego w plazmidzie pUCHMVHR16 ukazuje się w SEQ ID Nr: 2.

Przykład 3. Określenie cDr

Całe struktury regionów C łańcucha L i łańcucha H posiadają podobieństwo między sobą, w którym cztery części zrębowe są połączone przez trzy regiony hiperzmienne, to jest regiony określające dopasowanie (CDR). Sekwencje aminpkwaspwe zrębów są stosunkowo dobrze zakonserwowane lecz zmienność w sekwencji aminokwasowej jest niezwykle wysoka (Kabat, E.A. i in., „Sequence of Proteins of Immunological Interest”, US Dept. Health and Human Seryices, 1983).

Na podstawie tych faktów, sekwencję aminokwasową regionu zmiennego przeciwciała anty-HM 1.24 porównano z sekwencjami αmlnkkwazpwymi przeciwciał w bazach danych do poszukiwania homologii, i region CDR określono zgodnie z tabelą 5.

Tabela 5

Plazmid	Sekwencja nr	CDR(1)	CDR(2)	CDR(3)
pUCHMVL9	3-5	24-34	50-56	89-97
pUCHMY^^	6-8	31-35	50-56	99-109

Przykład 4. Potwierdzenie ekspresji klonowanego cDNA (Konstruowanie chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24)

1. Konstruowanie wektora ekspresji

Aby skonstruować wektor ekspresji, który wykazuje ekspresję chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24, klony cUCHMVL9 i pUCHMVHR16, kodujące regiony V odpowiednio łańcucha L i łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, modyfikowano metodą PCR, a potem wprowadzono do wektora ekspresji HEF (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92-19759).

Wsteczny primer ONS-L722S (SEQ ID nr: 43) dla regionu V łańcucha L i wsteczny primer VHR16S (SEQ ID nr 44) dla regionu V łańcucha H zaplanpwcnp tak, że hybryZynuią one z DNA, kodującym początek sekwencji liderowej regionu V każdego i posiadają kρnzensusową sekwencję Kozak (Kozak, M. i in., J Mol. Biol., 196, 947-950, (1987) oraz miejsce rozpoznania dla enzymu restrykcyjnego HindIII. Primer o kierunku zgodnym VL9A (SEQ ID nr 45) dla regionu V łańcucha L i primer o kierunku zgodnym VHR16A (SEQ ID nr: 46) dla regionu V łańcucha H zaplanowano tak, że hybrydy zują one z sekwencją DNA, kodującą koniec regionu J i posiadają donorową sekwencję składania oraz miejsce rozpoznania dla enzymu restrykcyjnego BamHI.

100 pl mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,1 mM dNTP, 1,5 mM MgCb, 100 pmole każdego z każdych primerów, 100 ng DNA matrycy

187 642 (pUCHMVL9 i pUCHMVHR16), oraz 5 jednostek enzymu Ampli Taq pokryto 50 gl oleju mineralnego i potem po początkowej denztuyzcji w temperaturze 94°C, ogrzewano w temperaturze 94°C przez 1 minutę, w temperaturze 55°C przez 1 minutę i w temperaturze 72°C przez 1 minutę przez 30 cykli i na koniec inkubowano w temperaturze 72°C przez 10 minut.

Produkt PCR oczyszczono przez 1,5% żel agarozowy o niskiej temperaturze topnienia i trawiono HindIII i BamHI, a potem klonowano do HEF-VL-gK dla regionu V łańcucha L i do HEF-VH-gy1 dla regionu V łańcucha H. Po określeniu sekwencji DNA, plazmidy, zawierające fragment DNA, który zawiera prawidłową sekwencję DNA nazwano, odpowiednio, HEF-ł^L-gK i HEF-1.24H-gy1.

Regiony, kodujące odpowiedni region zmienny z powyższych plazmidów HEF-ł.22LgK i HEF-ł.22H-gy1, trawiono enzymami restrykcyjnymi HindIII i BamHI, aby wytworzyć fragmenty restrykcyjne, które wprowadzono do miejsca HindIII i BamHI wektora plazmidowego pUC19 i nazwano je odpowiednio cUCl9-ł.22L-gκ i pUC19-1,22H-gył.

Escherichia coli, zawierającą odpowiednie plazmidy pUCWH.24L-gK i pUC19-1.24Hgyl nazwano Escherichia coli DH5z (pUC19-1. 24L-gK) i Escherichia coli DH5a (pUC19L24H-gy1), i uczyniono międzynarodowym depozytem 29 sierpnia 1996 w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, (Higashi 1-Chomę 1-3, Tsukuba city, prefektura Ibalaki, Japonia), pod numerami dostępu FERM BP-5646 i FERM BP-5624 na warunkach układu budapeszteńskiego.

2. Transfekcja do komórek COS-7

Aby zaobserwować krótkotrwałą ekspresję chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24, powyższe wektory ekspresji testowano w komórkach COS-7 (ATCC CRL-1651). HEFU^LgK i HEF-1.24H-gy1 kotransformowano do komórek COS-7 przez elektrocorację przy użyciu urządzenia GenePulser (wyprodukowanego przez BioRad). Każdy DNA (10 gg) dodano do 0,8 ml równych ilości 1 x 10⁷ komórek/ml w PBS i poddano pulson przy 1500 V i pojemności 25 gF.

Po okresie odzysku, wynoszącym 10 minut w temperaturze pokojowej, komórki po elektrocoracji dodano do 30 ml płynnej hodowli DMEM (wyprodukowanej przez GIBCO), zawierającej 10% bydlęcej surowicy płodowej pozbawionej y-globuliny. Po inkubacji przez 72 godziny w inkubatorze BNA120D (wyprodukowanym przez TABAI) zCO₂, supernatant hodowlany zebrano i usunięto resztki komórkowe przez wirowanie, które użyto w następnym doświadczeniu.

3. Analiza FCM

Aktywność wiązania z antygenem chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 prześledzono przez analizę FCM (cytometria przepływowa), przy użyciu komórek KPMM2. Po 4,7 x 105 komórek KPMM2 (japoński nie zbadany opis patentowy (Kokai) nr 7-236475) przemyto PBS(-), dodano 50 gl hodowli komórek COS-7, które wytwarzają powyższe chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 oraz 50 gl buforu FACS (PBS(-), zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej i 0,1% azydku sodu) lub 5 gl 500 ng/ml oczyszczonego przeciwciała antyHM 1.24 i 95 gl buforu FACS i inkubowano na lodzie przez jedną godzinę.

Jako kontrolę, dodano 50 gl 2 gg/ml chimerycznego SK2 (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 94-28159) i 50 gl buforu FACS albo 5 gl 500 g g/ml oczyszczonej mysiej IgG2aK (UPC10) (wyprodukowanej przez CAPPEL) zamiast oczyszczonego mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz 95 gl buforu FACS, i podobnie inkubowano. Po przemyciu buforem FACS, dodano 100 gl 25 gg/ml koziego przeciw ludzkiego przeciwciała sprzężonego z FITC (GAM) (wyprodukowanego przez CAPPEL) albo 10 gg/ml koziego anty-mysiego przeciwciała sprzężonego z FITC (GAM) (wyprodukowanego przez Becton Dickinson) i inkubowano w temperaturze lodu przez 30 minut. Po przemyciu buforem FACS zawieszono to w jednym ml buforu FACS i mierzono intensywność fluorescencji każdej komórki przez FACScan (wyprodukowany przez Becton Dickinson).

Jak ukazano w fig. 1, ujawniono, że chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 wiązało się z komórkami KPMM2 ponieważ pik intensywności fluorescencji przesunął się w prawo u komórek z chimerycznym przeciwciałem anty-HM 1.24 w porównaniu z kontrolą, podobnie

187 642 do przypadku, gdzie dodano mysie przeciwciało anty-HM 1.24. Potwierdziło to, że klonowany cDNA koduje region zmienny mysiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Przykład 5. Ustalenie linii komórkowej CHO, która stabilnie wytwarza chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24

1. Konstruowanie wektora ekspresji dla chimerycznego łańcucha H

Po strawieniu powyższego plazmidu HEF-1.24H-gy1 enzymami restrykcyjnymi PVuI i BamHi, oczyszczono fragment o około 2,8 kbp, zawierający promotor EFI oraz DNa, kodujący region V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, przy użyciu 1,5% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia. Następnie powyższy fragment DNA wprowadzono do fragmentu o około 6 kbp wytworzonego przez trawienie wektora ekspresji użytego dla wektora ekspresji ludzkiego łańcucha H, DHFR-AE-Rvh-PM.1f (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92/19759), zawierającego gen DHFR i gen, kodujący region stały ludzkiego łańcucha H, za pomocą PvuI i BamHI, w celu konstrukcji wektora ekspresji DHFRAE-HEF-1.24H-gy1 dla łańcucha H chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

2. Wprowadzenie genu do komórek CHO

Aby ustalić układ stabilnego wytwarzania chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24, geny wyżej wspomnianych wektorów DHFR-AE-Rvh-PM1f i DHFR-AE-HEF-1.24H-gy1, które przeprowadzono w liniowe przez trawienie PvuI, wprowadzono jednocześnie do komórki CHO (dostarczonej przez Medical Research Council Collaboration Center), metodą elektroporacji w warunkach podobnych do wyżej wymienionych (wyżej wymieniona transfekcja do komórek COS-7).

3. Powielenie genu przez MTX

Wśród komórek CHO z wprowadzonym genem, tylko te komórki CHO, do których wprowadzono zarówno wektor ekspresji łańcucha L jak i łańcucha H, mogą przeżyć w płynnej hodowli α-MEM pozbawionej nukleozydów (wyprodukowanej przez GIBCO-BRL), do której dodano 500 pg/ml G418 (wyprodukowanej przez GIBCO-BRL), i 10% bydlęcej surowicy płodowej, i tak też je wybierano. Następnie, do powyższej płynnej hodowli dodano 100 nM MTX (wyprodukowanej przez Sigma). Wśród klonów, które się namnożyły, wybrano te, które w wielkich ilościach wytwarzają chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24. W wyniku tego, otrzymano klony #8-13, które wykazują. wydajność produkcji około 20 pg/ml chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 i nazwano linią komórkową, wytwarzaaącą chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24.

Przykład 6. Konstruowanie chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24

Chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 skonstruowano następującą metodą. Powyższe komórki, wytwarzające chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 poddano ciągłej hodowli przez 30 dni stosując jako pożywkę Iscove's Modified Dulbecco's Medium (wyprodukowaną przez GIBCO-BRL), zawierającą 5% bydlęcej surowicy noworodkowej pozbawionej y-glibuliny (wyprodukowanej przez GIBCO-BRL) w urządzeniu do hodowli komórek przy wysokiej gęstości systemu Verax 20 (wyprodukowanym przez CELLEX BIOSCIENCE Inc.).

W dniu 13, 20, 23, 26 i 30 po rozpoczęciu hodowli, płyn hodowlany odzyskano przy użyciu jednostki filtrującej pod ciśnieniem S/ARTOBRAN (wyprodukowanej przez Sartorius), a potem chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 oczyszczono przez powinowactwo przy użyciu układu zbierającego przeciwciała o dużej objętości Afi-Prep System (wyprodukowanego przez Nippon Gaishi) oraz kolumny Super Protein A (objętość łoża: 100 ml, wyprodukowanej przez Nippon Gishi) przy użyciu PBS jako buforu absorpcji/przemywania i 0,1 M buforu cytrynianu sodu (pH 3) jako buforu wymywającego zgodnie z załączoną instrukcją. Wymyte frakcje wyregulowano do pH około 7,4 przez natychmiastowe dodanie 1 M Tris-HCl (pH 8,0). Stężenie przeciwciała zmierzono przez absorbancję przy 280 nm i obliczono z 1 pg/mljako 1,35 OD.

Przykład 7. Określenie aktywności chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24

Chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 oceniono przez następującą aktywność inhibicji wiązania

1. Pomiar aktywności inhibicj wiązania

1-1 Konstruowanie biotynylowanego przeciwciała anty-HM 1.24

187 642

Po rozcieńczeniu mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 0,1 M buforu wodorowęglanowego do 4 mg/ml, dodano 4 μΐ 50 mg/ml biotynn-N-hy<Łroksysukcynoimidu (wyprodukowanego przez EY LABS Inc.) i przereagowano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie dodano tam 1,5 ml 0,2 M roztworu glicyny, izkubowazn w temperaturze pokojowej przez 30 minut aby zatrzymać reakcję, a następnie zebrano biotynylowane frakcje IgG przy użyciu kolumny PD-10 (wyprodukowanej przez Pharmacia Biotech).

1-2. Pomiar aktywności inhibicji wiązania

Aktywność inhibicji wiązania przez biotynylowane mysie przeciwciało anty-HM 1.24 zmierzono przez Cell-ELISA przy użyciu ludzkiej linii komórek owodniowych WISH (ATCC CCL 25). Płytki ELISA sporządzono następująco. Do 96-studzienkowej płytki dodano 4 x 10⁵komórek/ml wytworzonych za pomocą pożywki PRMI1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, inkub^a^ przez noc i po dwukrotnym przemyciu PBS(-) unieruchomiono 0,1% aldehydem glutarowym (wyprodukowanym przez Nakalai tesque).

Po zablokowaniu, do każdej studzienki dodano 50 pl seryjnych rozcieńczeń chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 lub mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 otrzymanego przez oczyszczanie przez powinowactwo i równocześnie dodano 50 μl 2 ng/ml biotynylowanego mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, izkubowazo przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dodano streptoawidynę znakowaną peroksydazą (wyprodukowaną przez DAKO). Po inkubowaniu w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę i potem przemyciu, dodano roztwór substratu. Po zatrzymaniu reakcji przez dodanie 50 μΐ 6N kwasu siarkowego, zmierzono absorbancję przy 490 nm przy użyciu MICROPLATE READER Model 3550 (wyprodukowanego przez Bio-Rad).

Wynik, jaki ukazano w fig. 2, ujawnił, ze chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 ma identyczną aktywność inhibicji wiązania z mysim przeciwciałem anty-HM 1.24 do bintynylnwanego mysiego przeciwciała anty-HM 1.24. Wskazuje to, że przeciwciało chimeryczne miało taki sam region V jak mysie przeciwciało anty-HM 1.24.

Przykład 8. Pomiar aktywności ADCC chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24

Aktywność ADCC (cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciała) zmierzono zgodnie z metodą jaką przedłożono wCurrent Protocols in Immunology, rozdział 7. Immunologie studies in humans, wydawca John E, Coligan i in., John Wiley & Sons, Inc., 1993.

1. Wytwarzanie komórek efektorowych

Monocyty wydzielono z krwi obwodowej lub szpiku kostnego zdrowych ludzi i pacjentów ze szpiczakiem mnogim metodą wirowania gęstościowego. Tak więc, równą ilość PBS(-) dodano do krwi obwodowej lub szpiku kostnego zdrowych ludzi i pacjentów ze szpiczakiem mnogim, które nawarstwiono na Ficoll (wyprodukowanym przez Pharmacia^Conrey (wyprodukwanym przez Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd.) (specyficzna ciężkość 1,077) oraz wirowano przy 400 g przez 30 minut. Warstwę monocytów zebrano i przemyto dwukrotnie RPMI 1640 (wyprodukowaną przez Sigma) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (wyprodukowaną przez Witaker) i sporządzono przy gęstości komórek 5 x 10⁶/ml tym samym płynem hodowlanym.

2. Wytwarzanie komórek docelowych

Ludzką linię komórkową szpiczaka RPMI 8226 (ATCC CCL 155) radioznakowano przez inkubację w RPMI 1640 (wyprodukowaną przez Sigma) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (wyprodukowaną przez Witaker) razem z 0,1 mCi 51 Cr-chromianem sodu w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po radinznakowaziu, komórki przemyto trzykrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) i wyregulowano do stężenia 2 x 10⁵/ml.

3. Test ADCC

Do 96-studzienkowej płytki z dnem w kształcie U (wyprodukowanej przez Corning) dodano 50 μΐ 2 x 10⁵ komórek docelowych/ml, 1 ng/ml oczyszczonego przez powinowactwo chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 lub kontrolnej ludzkiej IgG (wyprodukowanej przez Serotec) i poddano reakcji w temperaturze 4°C przez 15 minut.

187 642

Następnie, dodano do niej 100 pl 5 x 10⁶ komórek efektorowych/ml i hodowano w inkubatorze z CO2 przez 4 godziny, gdy stosunek (E:T) komórek efektorowych (E) do komórek docelowych (T) ustawiono na 0:1, 5:1, 20:1 lub 50:1.

Pobrano sto pl supematantu i zmierzono licznikiem gamma (ARC361, wyprodukowanym przez Aloka) radioaktywność uwolnioną do supernatantu hodowlanego. Do pomiaru maksymalnej radioaktywności użyto 1% NP-40 (wyprodukowanego przez BRL). Cytoksyczność (%) obliczono przez (A-C)/(B-C)x 100, gdzie A oznacza radioaktywność (cpm) uwolnionej przez NP-40, a C oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną przez płyn sam hodowlany bez przeciwciała.

Jak ukazano w fig. 3, po dodaniu chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 w porównaniu z kontrolną IgG1, cytotoksyczność rosła ze wzrostem stosunku E:T, co wskazuje, że to chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 posiada aktywność ADCC. Ponadto, ponieważ nie obserwowano cytotoksyczności nawet po dodaniu mysiego przeciwciała, pokazało to, że część Fc przeciwciała ludzkiego jest potrzebna do uzyskania aktywności ADCC gdy komórką efektorowąjest komórka, pochodząca od człowieka.

Przykład 9. Konstruowanie przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

1. Planowanie regionu V przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

Aby skonstruować przekształcone ludzkie przeciwciało, w którym CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego przeszczepiono do ludzkiego przeciwciała, zaleca się, aby istniała wysoka homologia między FR mysiego przeciwciała i FR ludzkiego przeciwciała. Tak więc, regiony V łańcucha L i łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 porównano z regionami V równocześnie wszystkich znanych przeciwciał, których struktury wywołano przy użyciu Protein Data Bank.

Region V łańcucha L mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 jest najbardziej podobny do sekwencji konsesusowej podgrupy IV (HSGIV) regionu V ludzkiego łańcucha L, z homologią 66,9%. Z drugiej strony, wykazuje on homologię 56,9%, 55,8% i 61,5% odpowiednio z HSGI, HSGH i HSGIH.

Po porównaniu regionu V łańcucha L mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 z regionem V łańcucha L znanych ludzkich przeciwciał, wykazał on homologię 67,0% z regionem V REI ludzkiego łańcucha L, jednej z podgrup I regionu V ludzkiego łańcucha L. Tak więc, FR REI użyto jako materiału wyjściowego do konstrukcji regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Zaplanowano wersję a regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24. W tej wersji, ludzkie FR wykonano identycznie z FR na podstawie REI obecnym w przekształconym ludzkim przeciwciele CAMPATH-1H (patrz Riechmann, L. im., Nature 322, 21-25, (1988), FR zawartym w wersji a regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego PM-1 opisanego w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 92-19759), a mysi CDR wykonano identycznie z CDR w regionie V łańcucha L mysiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Region V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 jest najbardziej podobny do sekwencji konsensusowej HSGi regionu V ludzkiego łańcucha H z homologią 54,7%. Z drugiej strony, wykazuje on homologię 34,6% i 48,1% HSGII i HSGIII, odpowiednio. Po porównaniu regionu V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 z regionem V łańcucha H znanych przeciwciał ludzkich, FR1 do FR3 jest najbardziej podobny do regionu V łańcucha H ludzkiego przeciwciała HG3 jednej z podgrup I regionu V ludzkiego łańcucha H (Rechavi, G i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 855-859) z homologią 67,3%.

Zatem, FR ludzkiego przeciwciała HG3 użyto jako materiału wyjściowego do konstruowania regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24. Jednakże, ponieważ sekwencja aminokwasowa FR4 ludzkiego HG3 nie została opisana, użyto sekwencji aminokwasowej FR4 ludzkiego przeciwciała JH6 (Ravetch, J.V. i in., Cell, 27, 583-591), która wykazuje cajwyższąhomologię z FR4 łańcucha H mysiego przeciwciała antyHM 1.24. FR4 JH6 posiada taką samą sekwencję aminokwasową jak FR3 łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 z wyjątkiem jednego aminokwasu.

187 642

W pierwszej wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, FR1 do FR3 wykonano identycznie zFR1 do FR3 ludzkiego HG3, a CDR wykonano identycznie z CDR regionu V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 z wyjątkiem tego, że aminokwasy w pozycji 30 w ludzkim FR1 i pozycji 71 w ludzkim FR3 wykonano identycznie z aminokwasami w mysim przeciwciele anty-HM 1.24.

2. Konstruowanie ragionu V hrncucaa L praeksrtzeconego ludzkiego pezeciwzicła cnaya HM 1.24

Łańcuch L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 skonstruowano przez przeszczepienie CDR metodą PCR. Metodę ukazano w fig. 4. Użyto osiem primerów PCR do konstruowania przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 (wersja a), mającego FR, pochodzący z ludzkiego przeciwciała REI. Zewnętrzne primery A (SEQ ID Nr: 47) oraz H (SEQ ID Nr: 48) zaplanowano tak, aby hybrydyzował z sekwencją DNA wektora ekspresji HEF-VL-gK.

Primery przeszczepiające CDR L1S (SEQ ID Nr: 49), L2S (SEQ ID Nr: 50) oraz L3S (SEQ ID Nr: 51) posiadają sekwencję DNA sensowną. Primery przeszczepiające CDR L1A (SEQ ID Nr: 52), L2A (SEQ ID Nr: 53) i L3A (SEQ ID Nr: 54) posiadają antysensowną sekwencję DNA (20 do 23 bp) wobec sekwencji DNA przy końcu 5' odpowiednio primerów L1S, L2S i L3S.

W pierwszym etapie PCR przeprowadzono cztery reakcje A-L1A, P1S-L2A, L2S-L3A oraz L3S-H w celu oczyszczenia produktów PCR. Cztery produkty PCR z pierwszego PCR pozostawiono do połączenia między sobą przez ich własną komplementargcść (patrz międzynarodowy opis patentowy nr WO 92-19759). Następnie dodano zewnętrzne primery A iH w celu powielenia pełnej długości DNA, kodującego region V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 (druga PCR). W powyższej PCR jako matryce wykorzystano plazmid HEF-RVL-M21a (patrz międzynarodowy opis patentowy nr WO 95-14041), kodujący wersję a regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała ONS-M21 opartego o FR, pochodzący od ludzkiego przeciwciała REI.

W pierwszym etapie PCR użyto mieszaniny PCR, zawierającej 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kcl, 0,1 mM dNTP, 1,5 mM MgCh, 100 ng matrycowego DNA, 100 pmoli każdego primera i 5 jednostek Ampli Taq. Każdą rurę PCR pokryto 50 pl oleju miera^ego. Następnie po uprzednim zdegaturowaniu przez ogrzanie w temperaturze 94°C, poddano cyklowi reakcyjnemu w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę, a potem inkubowano w temperaturze 72°C przez 10 minut.

Produkty PCR A-L1A 215 bp), L1S-L2A (98 bp), L2S-L3A (140 bp) i L3S-H (151 bp) oczyszczono przy użyciu 1,5% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia i połączono w drugiej PCR. W drugiej PCR 98 pl mieszaniny PCR, zawierającej 1 pl każdego z produktów z pierwszego etapu PCR oraz 5 jednostek Ampli Taq, igkubcwanc przez 2 cykle o temperaturze 94°C przez 2 minuty, 55°C przez 2 minuty i 72°C przez 2 minuty, a potem dodano 100 pmoli każdego z zewnętrznych primerów (A iH). Rury PCR powleczono 50 pl oleju mineralnego i przeprowadzono 30 cykli w warunkach takich samych jak powyższe.

Fragment DNA o 516 bp otrzymany z drugiej PCR oczyszczono przy użyciu 1,5% żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia, trawiono BamHI i HindIII i tak otrzymane fragmenty DNA klonowano do wektora ekspresji HEF-VL-gK. Po określeniu sekwencji DNA, plazmid, zawierający prawidłową sekwencję aminokwasową regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 nazwano HEF-RVLa-AHM-£K. Sekwencję aminokwasową oraz sekwencję zasad regionu V łańcucha L zawartego w tym plazmidzie 11111^-1^1^^11^1-^ ukazuje się w SEQ ID Nr: 9.

Wersję b regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 skonstruowano przez mutagenezę przy użyciu PCR. Primery mutagenne FTY-1 (SEQ ID Nr: 55) i FTY-2 (SEQ ID Nr: 56) zaplanowano tak, aby mutowały feny^lam^ w pozycji 71 na tyrozynę.

Po powieleniu powyższych primerów przy użyciu plazmidu HEF-RVka-AΉM-gκ jako matrycy, końcowy produkt oczyszczono i trawiono BamHI i HindIII. Uzyskane fragmenty DNA klonowano do wektora ekspresji HEF HEF-VL-gK, aby otrzymać plazmid HEF-RVLb36

187 642

AHM-gK. Sekwencję aminokwasową otoz sekwencję zasad regionu V łańcucha L zawartego w tym plazmidzie HEF'-RVLb-AHM-gK ukazuje się w SEQ ID Nr: 10.

3. Konstrκowanik renionu gi H praeksztzrconego lddz,oiego przeo jp^aca οπΙο··HM 1.24

3-1. Konstruowanie wersji a do e regionu V łoaouchα H przekształconego ludzkiego praeoiwcioło anty-HM 1.24

DNA, kodujący region V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 zaplanowano następująco. Przez połączenie sekweccłi DNA, kodującej FR1 do 3 ludzkiego praeoiwoioło HG3 i FR4 ludzkiego prneoiwoiαłα JH6 z sekwencją DNA, kodującą CDR regionu V łańcucha H mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, zaplanowano pełnej długości DNA, kodujący region V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Następnie, koniec 5' i koniec 3' tej sekwencji DNA, miejsce rozpoznania HindII[/sekwencja konsensusowa KOZAK oraz miejsce rozpoznania BomHI/srkwencjo donorowa składania, odpowiednio, połączono tak, aby umożliwić wprowadzenie wektora ekspresji HEF.

Tak zaplanowaną sekwencję DNA podzielono na cztery kligknuklektydy. Następnie, oligonukleotydy, które potencjalnie przeszkadzały w łąoaeniu tych oligonuklektyrów poddano komputerowej analizie pod względem struktury drugorzędowej. Sekwencje czterech oligonukleotydów RVH1 do RVH4 ukazuje się w SEQ ID Nr: 57 do 60. Te Ollgonukleotydy mają długość 119 do 144 zasad i mają regiony nakładające się o 25 do 26 bp. Wśród oligonukleotydów, RVH2 (SEQ ID Nr: 58) i RVH4 (SEQ ID Nr: 60) mają sensowną sekwencję DNA, a RvH1 (SEQ iD Nr: 57) i RVH3 (SEQ ID Nr: 59) mają antysensowną sekwencję DNA. Sposób łączema tych czterech oligonukleotydów metodą PCR ukazuje się w rysunku (patrz fig. 5).

Mieszaninę PCR (98 μΐ), zawierającą 100 ng każdego z czterech oligonukleotydów i 5 jednostek Ampli Taq zdrnoturowono najpierw przez ogrzanie w temperaturze 94°C przez 2 minuty, i poddano dwóm cyklom inkubacji, obejmującym 94°C przez 2 minuty, 55°C przez 2 minuty i 72°C przez 2 minuty. Po dodaniu 100 pmoli każdego z zewnętrznych primerów RHP1 (SEQ ID Nr: 61) i RHP2 (SEQ ID Nr: 62) rurę PCR powleczono 50 pl oleju mineralnego. Następnie najpierw adrnoaurowono ją przez ogrzanie w temperaturze 94°C przez 1 minutę, a potem poddano 38 cyklom o temperaturze 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę, po czym ickubonoco w temperaturze 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA o 438 bp konyszozonk przy użyciu 1.5% żelu ogorozkwego o niskiej temperaturze topnienia, trawiono Hindlll i BamHl i potem klonowano do wektora ekspresji HEF, HEF-VH-gy1. Po określeniu sekwencji zasad, plazmid, który zawiera fragment DNA, kodujący sekwencję aminokwasom prawidłowego regionu V łańcucha H nazwano HEFRVHa-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową oraz sekwencję zasad regionu V łańcucha H aoworargo w tym plazmidzie HEF-RVHa-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID Nr: 11.

Każdą z wersji b, c, d i e regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 skonstruowano następująco.

Przy użyciu jako mutagennego primera BS (sekwencja 63) oraz BA (SEQ ID nr: 64) αplonowαcycp tak, że mutują argininę w pozycji 66 na lizynę oraz jako matrycy DNA plazmid HE--RVHo-AHM-gy1 metodą PCR, wersję b powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHbAHM-gy1. Sekwencję ammokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHb-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 12.

Przy użyciu jako mutagenu primera CS (sekwencja 65) oraz CA (SEQ ID nr: 66) zaplanowanych aby mutować treoninę w pozycji 73 na lizynę oraz jako DNA matrycy plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1 metodą PCR, wersję c powiela się w celu uzyskania plazmidu HEFRVHo-AHM-gy1. Sekwencję ominokwosową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartego w tym plazmidzie HEF-RVHc-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 13.

Przy użyciu jako mutagenu primera DS (sekwencja 67) oraz DA (SEQ ID nr: 68) aoplαnowonyoh aby mutować argininę w pozycji 66 na lizynę i treomnę w pozycji 73 na lizynę oraz jako DNA matrycy plazmid HEF-RVΉo-AHM-gy1 metodą PCR, wersję d powiela się w celu uzyskania plazmidu HEF-RVHd-AHM-gy1. Sekwencję ominkkwoskwą i sekwencję zasad regionu V łańcucha H aonortegk w tym plazmidzie HEE-RVHd-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 14.

187 642

Przy użyciu jako mutagenu primera ES (sekwencja 69) oraz EA (SEQ ID nr: 70) zaplanowanych aby mutować walinę w pozycji 67 na alaninę i metioninę w pozycji 69 na leucynę oraz jako DNA matrycy plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1, wersję e powiela się w celu uzyskania plazmidu HEF-RVHe-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową. i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartego w tym plazmidzie HEF-RVHe-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ED nr: 15.

3-2. Konstruowanie hybrydydowego regionu łańcucha H

Skonstruowano dwa hybrydowe regiony V łańcucha H. Jeden jest mysim ludzkim przeciwciałem anty-HM 1.24, w którym sekwencje aminokwasowe z FRI i FR2, pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, aFR3 iFR4 są z wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 a drugie jest ludzkim mysim hybrydowym przeciwciałem anty-HM 1.24, w którym sekwencje aminokwasowe FR1 iFR2, pochodzące z wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, a te z FR3 i FR4 pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24. Wszystkie sekwencje aminokwasowe regionów CDr pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Dwa hybrydowe regiony V łańcucha H konstruuje się metodą PCR. Metodę schematycznie ukazuje się w fig. 6 i 7. Do konstruowania dwóch hybrydowych regionów V łańcucha H użyto cztery primery. Zewnętrzne primery a (SEQ ID nr: 71) i h (SEQ ID nr: 72) zaplanowano, aby hybrydyzowały z sekwencją DNA wektora ekspresji HEF HEF-VH-gy1. Primer HYS (SEQ iD nr: 73) konstrukcji hybrydowej łańcucha H (SEQ ED nr: 73) zaplanowano tak, aby posiadał sensowną sekwencję DNA, a primer HYA (SEQ ID nr: 74) hybrydy łańcucha H, aby posiadał antysensowną sekwencję DNA tak, że sekwencje DNA są komplementarne jedna z drugą.

Do konstruowania regionu V hybrydy łańcucha H, w której sekwencje aminokwasowe FRI i FR2 pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 i te z FR3 i FR4 są z wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, przeprowadzono PCR przy użyciu plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 jako matrycy, hybrydowego primera HYS (SEQ ID nr: 73), zewnętrznego primera h (SEQ ID nr: 72), w pierwszym etapie PCR, i każdy produkt PCR oczyszcza się. Dwa produkty PCR z pierwszej PCR pozostawia się do połączenia przez ich własną komplementarność (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92-19759).

Następnie, w drugim etapie PCR, przez dodanie primerów zewnętrznych a(SEQ ID nr: 71) i h (SEQ ED nr: 72) powiela się pełnej długości DNA, kodujący hybrydowy region V łańcucha H, w którym sekwencje aminokwasowe FRI i FR2 pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 i te z FR3 i FR4 są z wersji a z regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Do konstruowania regionu V hybrydy łańcucha H, w której sekwencje aminokwasowe FRI i FR2 pochodzą od wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM1, a te FR3 i FR4 są mysiego przeciwciała anty-HM 1.24-, przeprowadza się PCR przy użyciu plazmidu HEF-RVHa-AHM-gy1 jako matrycy, zewnętrznego primera a i hybrydowego primera HYA łańcucha H oraz PCR przy użyciu plazmidu HEF-1.24H-gy1 jako matrycy, hybrydowego primera HYS łańcucha H oraz zewnętrznego primera h, w pierwszym etapie PCR, i każdy produkt PCR oczyszcza się. Dwa oczyszczone produkty PCR z pierwszej PCR pozostawia się do połączenia przez ich własną komplementarność (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92019759).

Następnie w drugim etapie PCR, przez dodanie primerów zewnętrznych a i h, powiela się pełnej długości DNA, kodujący hybrydowy region V łańcucha H, w którym sekwencje aminokwasowe FR1 i FR2 są z wersji a z regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, a te z FR3 i FR4 pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Metody pierwszej PCR, oczyszczanie produktów PCR, montowanie, druga PCR i kloning do wektora ekspresji HEF HEF-VH-gy1 przeprowadza się zgodnie z metodą ukazaną w „przykładzie 9. Konstrukcja regionu V łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24”.

Po określeniu sekwencji DNA, plazmid, który zawiera fragment DNA, kodujący prawidłową sekwencję aminokwasową hybrydowego regionu V łańcucha H, w którym sekwencje

187 642 aminokwasowe FR1 i FR2 .pochodzą od mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, a FR3 i FR4 są z wersji a regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, nazwano HEF-MH-RVH-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarta w tym plazmidzie HEF-MH-RVH-AHM-gy1 ukazano w SEQ ID nr: 75. Także, plazmid, który zawiera fragment DNA, kodujący prawidłową sekwencję aminokwasową hybrydowego regionu V łańcucha H, w którym sekwencje aminokwasowe FR1 i FR2 pochodzą od wersji z regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała antyHM 1.24, a te FR3 i FR4 są z mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, określono jako HEF-HMRVH-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawartego w tym plazmidzie HEF-HM-RVH-AHM-gy1 ukazano w SEQ ID nr: 76.

3-3. Konstruowanie wersji f do s regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

Każdą z wersji f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r i s regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 konstruuje się następująco.

Przy użyciu jako mutagennego crimerz FS (sekwencja 78) oraz FA (SEQ ID nr: 79) zaplanowanych tak, że mutują treoninę w pozycji 75 na serynę i walinę w pozycji 78 na alaninę, oraz jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHe-AHM-gy1 metoda PCR, wersję f powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHf-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHf-AHM-gył ukazuje się w SEQ ID nr: 16.

Przy użyciu jako mutagennego primera GS (sekwencja 80) oraz GA (SEQ ID nr: 81) zaplanowanych tak, że mutują alaninę w pozycji 40 na serynę oraz jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHz-AHM-gył metodą PCR, wersję g powiela się aby otrzymać plazmid HEFRVHg-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHg-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 17.

Przy użyciu jako mutagennego primera FS oraz FA oraz jako matrycy DNA plazmid HEF-RVH9-AHM-gy1, wersję h powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHh-AHM-gył. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHh-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 18.

Przy użyciu jako mutagennego primera IS (sekwencja 82) oraz IA (SEQ ID nr: 83) zaplanowanych tak, że mutują argininę w pozycji 83 na alaninę oraz serynę w pozycji 84 na fenylozlzniaę i jako matrycy DNA plazmid nEF-RVHh-AHM-gy1, wersję i powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHi-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHi-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 19.

Przy użyciu jako mutagennego primera JS (SEQ ID nr: 84) oraz JA (SEQ ID nr: 85) zaplanowanych tak, że mutują argininę w pozycji 66 na lizynę i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHf-AHM-gy1, wersję j powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHj-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHj-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 20.

Przy użyciu jako mutagennego primera KS (SEQ ID nr: 86) oraz KA (SEQ ID nr: 87) zaplanowanych tak, że mutują kwas glutaminowy w pozycji 81 na glutaminę i jako matrycy DNa plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję k powiela się aby otrzymać plazmid HEFRVHk-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHk-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 21.

Przy użyciu jako mutagennego primera LS (SEQ ID nr: 88) oraz LA (SEQ ID nr: 89) zaplanowanych tak, że mutują kwas glutaminowy w pozycji 81 na glutaminę oraz serynę w pozycji 82b na izoleucynę i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję 1 powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHl-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie ΠEF-.FVl·-l-AHM-gγł ukazuje się w SEQ ID nr: 22.

Przy użyciu jako mutagennego primera MS (SEQ ID nr: 90) oraz MA (SEQ ID nr: 91) zaplanowanych tak, że mutują kwas glutaminowy w pozycji 81 na glutaminę, serynę w pozycji 82b na izoleucynę oraz tyzoninę w pozycji 87 na serynę i jako matrycy DNA pla187 642 zmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję m powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHmAHM-gy1. Sekwencję αminkkwαspwą i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHm-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 23.

Przy użyciu jako mutagennego primera NS (SEQ ID nr: 92) oraz NA (SEQ ID nr: 93) zaplanowanych tak, że mutują serynę w pozycji 82b na inpleucynę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję m powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHn-AHMgyl. Sekwencję aminokwaspwą i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym planmiZnie HEF-RVHn-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 24.

Przy użyciu jako mutagennego primera OS (SEQ ID nr: 94) oraz OA (SEQ ID nr: 95) zaplanowanych tak, że mutują treoninę w pozycji 87 na serynę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHh-AHM-gy1, wersję o powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHp-AHM-gy1. Sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHo-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 25.

Przy użyciu jako mutagennego primera PS (SEQ ID nr: 96) oraz PA (SEQ ID nr: 97) zaplanowanych tak, że mutują walinę w pozycji 78 na alaninę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1, wersję p powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHp-AHM-gy1. Sekwencję amlnpkwaspwą i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHp-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 26.

Przy użyciu jako mutagennego primera QS (SEQ ID nr: 98) oraz QA (SEQ ID nr: 99) zaplanowanych tak, że mutują yrepninę w pozycji 75 na serynę, i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHa-AHM-gy1, wersję q powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHq-AHM-gy1. Sekwencję aminpkwcsową i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHq-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 27.

Przy użyciu jako mutagennego primera CS (SEQ ID nr: 65) oraz CA (SEQ ID nr: 66) i jako matrycy DNA plazmid HEF-RVHp-AHM-gy1, wersję r powiela się aby otrzymać plazmid HEF-RVHr-AHM-gy1. Sekwencję αmmkkwazkwą i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHr-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 28.

Wersję s regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 skonstruowano przez mutagenezę przy użyciu PCR. Mutagenny primer SS (SEQ ID Nr: 100) i SA (SEQ ID Nr: 101) naclanpwanp tak, aby mutowały metioninę w pozycji 69 na izoleucynę.

Po powieleniu powyższych primerów przy użyciu plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 jako matrycy, produkt końcowy oczyszczono, trawiono BamHI i HindIII i otrzymany fragment DNA klonowano do wektora ekspresji HEF, HEF-VH-gy1, aby uzyskać plazmid HEF-RVHsAHM-gy1. Sekwencję aminokwazpwą i sekwencję zasad regionu V łańcucha H zawarte w tym plazmidzie HEF-RVHr-AHM-gy1 ukazuje się w SEQ ID nr: 102.

Regiony, kodujące region zmienny każdego wyżej wymienionego plazmidu HEFRVLa-AHM-gK i HEF-RVHr-AHM-gy1 trawiono aby utworzyć fragmenty restrykcyjne, enzymami restrykcyjnymi HindIII i BamHI. Wprowadzono je do miejsc HindIII i BamHI wektora plazmidowego pUC19. Każdy plazmid nazwano pUC19-RVLa-AHM-gK i pUC19RVHr-AHM-gy1.

Escherichia coli, zawierającą odpowiednie plazmidy nazwano cUC19-RVLa-AHM-gy1 i cUC19-RVHr-AHM-gy1 Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLc-AHM-gκ) i Ezzherizhia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gy1), i uczyniono międzynarodowym depozytem 29 sierpnia 1996 w National Institute of Bioszienze and Human-Tezhnology, Agency of Industrial Science and Tezhnplpgy, MITI, (Higashi F-Chome 1-3, Tsukuba city, prefektura ^Ιι^, Japonia), pod numerami dostępu FERM BP-5645 i FERM BP-5643 na warunkach układu budapeszteńskiego.

Regiony, kodujące region zmienny wyżej wymienionego plazmidu HEF-RVHs-AHMgic trawiono, aby utworzyć fragment restrykcyjny, enzymami restrykcyjnymi HindIII i BamHI. Wprowadzono je do miejsc HindIII i BamHI wektora plazmidowego pUC19. Otrzymany plazmid nazwano pUC19-RVHz-AHM-gy1.

Escherichia coli, zawierającą plazmid cUC19-RVHz-AHM-gy1 nazwano Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1), i uczyniono międzynarodowym depozytem 29 września 1996 w National Institute of Bioscience and Human-Tezhnolpgy, Agency of Industrial

187 642

Science and Technology, MITI, (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, prefektura Ibalaki, Japonia), pod numerem dostępu FERM BP-6127 na warunkach układu budapeszteńskiego.

4. Konstκnzja przjasztaeconego ludzkiego przeciwzaCa wmayaHM -HM chimecheznego przeciwciała anty-HM 1.24 i hybrydowego przeciwciała łańcucha H

Aby ocenić każdy łańcuch przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, pozostawiono przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 i chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 jako kontrolę dodatnią do ekspresji. W konstruowaniu każdej wersji b i dalej regionu V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, przeciwciało hybrydowe łańcucha H pozostawiono do ekspresji w celu prześledzenia, która sekwencja aminokwasowa wFR powinna zostać podstawiona. Ponadto, wyrażono to w połączeniu z chimerycznym łańcuchem H w celu oceny wersji a łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

4-1. Ekspresja przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 (1)

Dziesięć pg każdego z wektorów ekspresji (HEF-RVHa-AHM-gy1 do HEF-RVHrAHM-gy1) dla łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz wektora ekspresji (HEF-RVLa-AHM-gK do HEF-RVLb-AHM-gK) dla łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, Cotrazsfeknwano do komórek COS-7 przez elektroporację przy użyciu urządzenia Gene Pulser (wyprodukowanego przez BioRad). Każdy DNA (10 pg) dodano 0,8 ml równych ilości 1 x 10⁷ komórek/ml w PBS i poddano impulsom przy 1500 V i pojemności 25 pF.

Po okresie odzysku, wynoszącym 10 minut w temperaturze pokojowej, komórki po elektroporacji dodano do 30 ml płynnej hodowli DMEM (wyprodukowanej przez GIBCO), zawierającej 10% bydlęcej surowicy płodowej pozbawionej γ-globuliny. Po inkubacji przez 72 godziny w inkubatorze BNA120D (wyprodukowanym przez TABAI) z CO2 w warunkach temperatury 37°C i 5% CO2, supernatant hodowlany zebrano i usunięto resztki komórkowe przez wirowanie przy 1000 rpm przez 5 minut w wirówce 15PR-22 (wyprodukowanej przez HITACHI) zaopatrzonej w rotor 03 wirówki (wyprodukowany przez HITACHI) oraz miCrokoncentrator (Centricon 100, wyprodukowany przez Amicon), ultrafiltrowano przy użyciu wirówki J2-21 (wyprodukowanej przez BECKMAN) zaopatrzonej w rotor JA-20.1 (wyprodukowany przez BECKMAN) i użyto do Cell-ELISA.

Ekspresja przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 (2)

Dziesięć pg każdego wektora ekspresji (HEF-RVHo-AHM-gγ1) dla wersji „s” łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oraz wektora ekspresji (HEFR.VLa-AHM-gK) dla łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, kotransfekowann do komórek COS-7 przez elektroporację przy użyciu urządzenia Gene Pulser (wyprodukowanego przez BioRad). Każdy DNA (10 (rg) dodano 0,8 ml równych ilości 1 x 107 komórek/ml w PBS i poddano impulsom przy 1500 V i pojemności 25 pF.

Po okresie odzysku, wynoszącym 10 minut w temperaturze pokojowej, komórki po elektroporacji dodano do 30 ml płynnej hodowli DMEM (wyprodukowanej przez GIBCO), zawierającej 10% bydlęcej surowicy płodowej pozbawionej γ-globuliny. Po inkubacji przez 72 godziny w inkubatorze BNA120D (wyprodukowanym przez TABAI) z CO2 w warunkach temperatury 37°C i 5% CO2, supernatant hodowlany zebrano i usunięto resztki komórkowe przez wirowanie przy 1000 rpm przez 5 minut w wirówce 05PR-22 (wyprodukowanej przez HITACHI) zaopatrzonej w rotor 03 wirówki (wyprodukowany przez HITACHI) oraz mikrokoncentrator (Centricon 100, wyprodukowany przez Amicon), zatężono przez ultrafiltrację przy użyciu wirówki J2-21 (wyprodukowanej przez BECKMAN) zaopatrzonej w rotor JA20.1 (wyprodukowany przez BECKMAN) i wyjałowiono przez filtrację przy użyciu filtra, Millex GV13mm (wyprodukowanego przez Millipore) i użyto do Cell-ELISA.

4-2. Ekspresja chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24

Przy użyciu dziesięciu pg każdego wektora ekspresji HEF-1.24H-gY1 dla łańcucha H chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 i wektora ekspresji HEF-1.24L-gK dla łańcucha L chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24, chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 użyte do Cell-ELlSA przygotowano zgodnie z wyżej wymienioną metodą dla ekspresji przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

187 642

4-3. Ekspresja przeciwciała anty-HM 1.:24, zawierającego wersję a humanizowanego łańcucha L i chimerycznego łańcucha H

Przy użyciu dziesięciu gg każdego wektora ekspresji HEF-1.24H-gy1 dla łańcucha H chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 i wektora ekspresji HEF-RVLa-AHM-gK dla łańcucha L przekształconego przeciwciała anty-HM 1.24, przeciwciało anty-HM 1.24, zawierające wersję a łańcucha L i chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 użyte do Cell-ELISA przygotowano zgodnie z wyżej wymienioną metodą dla ekspresji przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

4-4. Ekspresja hybrydowego łańcucha H przeciwciała

Przy użyciu dziesięciu gg każdego wektora ekspresji (HEF-MH-R.VH-AHM-gy1 oraz HEF-HM-RVH-AHM-gK dla regionu V łańcucha H hybrydy i wektora ekspresji HEF-RVLaAHM-gK dla łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, hybrydowe przeciwciało łańcucha H użyte do Cell-ELISA przygotowano zgodnie z wyżej wymienioną metodą dla ekspresji przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

4- 5. Pomiar stężenia przeciwciała

Stężenie otrzymanego przeciwciała mierzono przez ELISA. Każdą studzienkę 96-studzienkowej płytki ELISA (Maxisorp, wyprodukowanej przez NUNC) unieruchamiono przez dodanie 100 gl koziego przeciw-ludzkiego przeciwciała IgG (wyprodukowanego przez BIO SOURCE) wytworzonego do stężenia 1 gg/ml buforem do powlekania (0,1 M NaHCO3, 0,2% NaN3, pH 9,6) i inkubację w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po zablokowaniu 100 gg/ml buforu do rozcieńczania (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCE, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA) pH 8,1), do każdej, studzienki dodaje się 100 gl seryjnego rozcieńczenia supernatantu hodowlanego komórek, cos-7, wydzielających przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24, chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 lub hybrydowe przeciwciało łańcucha H, które zatężono przez ultrafiltrację i inkubowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po przemyciu dodano 100 gl znakowanego fosfatazą alkaliczną koziego przeciwciała anty-ludzkiego IgG (wyprodukowanego przez DAKO).

Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę i przemyciu, dodano 100 gl 1 gg/ml roztworu substratu (Sigma104, p-nitrofenylofosforan, SIGMA) rozpuszczonego w buforze do substratu (50 mM NaHCO3, 10 mM MgCĘ, pH 9,8), a następnie zmierzono absorbancję przy 405 nm przy użyciu MICROPLATE READER Model 3550 (wyprodukowanego przez Bio Rad). Jako standard do pomiaru stężenia użyto ludzkiej IgG1K (wyprodukowanej przez The Binding Site).

5. Ustalenie UcI- k^i^mórkmóej <2H-O, Htóra stabilsta wytwarza arzaksztełcona lunekle przeciwciało anty-HM 1.24

5- 1. Konstruowanie wektora ekspresji dla łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

Przez trawienie plazmidu HEF-RVHe-AHM-gγ1 enzymami restrykcyjnymi PvuI i BamHI oczyszczono fragment o około 2,8 kbp, zawierający DNA, kodujący promotor EF1 i region V łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, przy użyciu 1,5% żelu agarozkwugk o niskiej temperaturze topnienia. Następnie, powyższy fragment DNA wprowadzono do fragmentu o około 6 kbp, który wytworzono przez trawienie wektora ekspresji stosowanego dla wektora ekspresji ludzkiego łańcucha H, DHFR-AE-RVh-PM1f (międzynarodowy opis patentowy nr WO 92-19752), zawierającego gen DHFR i gen, kodujący region stały ludzkiego łańcucha H za pomocą PvuI i BamHI do konstrukcji wektora ekspresji, DHFR-AE-HEF-RVHr-AHM-gy1, dla łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

5-2. Wprowadzenie genu do komórek CHO

Aby ustalić układ stabilnej produkcji przerształcknugk ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, geny wyżej wzmlumkcy<lh wektorów DHFR-AE-HEF-RVHr-AHM-gy1 oraz

HEF-RVLa-AHM-gK, które przeprowadzono w liniowe przetrawienie PvuI, wprowadzono równocześnie do komórki CHO DXB-11 metodą elektroporacji w warunkach podobnych do wyżej wymienionych (transfekcja do wyżej wymienionych komórek COS-7).

187 642

5-3. Powielenie genu przez MTX

Wśród komórek CHO z wprowadzonym genem, tylko te komórki CHO, do których wprowadzono zarówno wektor ekspresji łańcucha L jak i łańcucha H, mogąprzeżyć w płynnej hodowli α-MEM pozbawionej nukleozydów (wyprodukowanej przez GIBCO-BIEL), do której dodano 500 pg/ml G418 (wyprodukowanej przez GEBCO-BRL), i 10% bydlęcej surowicy płodowej, i tak też je wybierano. Następnie, do powyższej płynnej hodowli dodano 100 nM MTX (wyprodukowanej przez Sigma). Wśród klonów, które się namnożyły, wybrano te, które wytwarzają przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24 w wielkich ilościach. W wyniku tego, otrzymano klon 1, który wykazuje wydajność produkcji około 3 pg/ml przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 i nazwano linią komórkową, wytwarzającą przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24.

5-4. Konstruowanie przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

Przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 konstruowano następującą metodą. Powyższe komórki CHO, które wytwarzają przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM

1.24 hodowano przez 10 dni, stosując jako pożywkę, pożywkę α-MEM pozbawioną nukleozydów (wyprodukowaną przez GIBCO-BRL), do którego dodano 500 pg/ml G418 (wyprodukowanej przez GIBCO-BRL) oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej pozbawionej y, przy użyciu inkubatora BNAS120D (wyprodukowanego przez TABAI) w warunkach temperatury 37°C i 5% CO2. W dniu 8 i 10 po rozpoczęciu hodowli, płyn hodowlany odzyskano, resztki komórkowe usunięto przez wirowanie przez 10 minut przy 2000 rpm przy użyciu wirówki RL-500SP (wyprodukowanej przez Tomy Seiko) zaopatrzonej w rotor TS-9, a potem wyjałowiono przez filtrację przy użyciu filtru butelkowego (wyprodukowanego przez FALCON), mającego membranę o 0,45 pm średnicy.

Po dodaniu równych ilości PBS(-) do płynu hodowlanego komórek CHO, które wytwarzają przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24, oczyszczono przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 przez powinowactwo przy użyciu układu do oczyszczania przeciwciał z wysoką prędkością ConSep LC100 (wyprodukowanego przez MILLIPORE) oraz kolumny Hyper D Protein A (wyprodukowanej przez Nippon Gaishi) stosując PBS(-) jako buforu absorpcji/przemywania oraz 0,1 M buforu cytrynianu sodu (pH3) jako buforu elucyjnego zgodnie z załączonymi instrukcjami. Wymyte frakcje wyregulowano do pH około 7,4 przez natychmiastowe dodanie 1 M Tris-HCl (pH 8,0) a potem użycie koncentratora do ultrafiltracji wirówkowej Centriprep-10 (wyprodukowanego przez MILLIPORE), przeprowadzono zatężenie i substytucję na PBS(-) i wyjałowiono przez filtrację stosując filtr błonowy MILlEX-GV (wyprodukowany przez MILLIPORE) o wielkości porów 0,22 pm, aby otrzymać oczyszczone przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24. Stężenie przeciwciał zmierzono przez abocrbagcję przy 280 nm i obliczono z 1 mg/ml jako 1,35 OD.

Przykład 11. Określanie aktywności przekształconego ludzkiego przeciwciała antyHM 1.24

Przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 oceniono pod względem następującej aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania

1. Metoda pomiaru aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania

1-1. Pomiar aktywności wiązania antygenu

Aktywność wiązania antygenu zmierzono przez Cell-ELISA przy użyciu komórek WICH. Płytki Cell-ELISA przygotowano jak opisano powyżej w przykładzie 7.1-2.

Po zablokowaniu, do każdej studzienki dodano 100 pl seryjnych rozcieńczeń przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, które otrzymano z zatężonego supernatantu hodowli komórek COS-7 lub oczyszczono z supernatantu hodowli komórek CHO. Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i przemyciu, dodano znakowane peroksydazą królicze przeciwciało anty-ludzkie IgG (wyprodukowane przez DAKO). Po inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemyciu, dodano 100 pl roztworu substratu. Po inkubacji, reakcje zatrzymano przez 50 pl 6N kwasu siarkowego i zmierzono abocrbancję przy 490 nm przy użyciu MIcRoPLATE READER Model 3550 (wyprodukowanego przez Bio-Rad).

187 642

1- 2. Pomiar aktywności inhibicji wiązania

Aktywność inhibicji wiązania przez znakowane biotyną mysie przeciwciało anty-HM

1.24 zmierzono przez Cell-ELlSA przy użyciu komórek WISH. Płytki Cell-ELISA przygotowano jak opisano w powyższym przykładzie 7.1-2. Po zablokowaniu, do każdej studzienki dodano 50 ąl seryjnych rozcieńczeń przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, które otrzymano z zatężonego supernatantu hodowli komórek COS-7 lub oczyszczono z supernatantu hodowli komórek CHO, i równocześnie dodano 50 ąl znakowanego biotyną mysiego przeciwciała anty-HM 1.24. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez dwie godziny i przemyciu, dodano znakowaną peroksydazą streptoawidynę (wyprodukowana przez DAKO). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez dwie godziny i następnie przemyciu, do każdej studzienki dodano 100 ąl roztworu substratu. Po inkubacji, reakcję zatrzymano przez 50 ąl 6 N kwasu siarkowego i zmierzono absorbancję przy 490 nm przy użyciu MICROPLATE READER Model 3550 (wyprodukowanego przez Bio-Rad).

2. Ocena przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

2- 1. Łańcuch L

Wersję a łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania antygenu. Jak ukazano w fig. 8, jeśli ekspresja wersji a łańcucha ł zachodzi w połączeniu z chimerycznym łańcuchem H, wykazała ona podobny poziom aktywności wiązania antygenu. Jednakże, biorąc pod uwagę dalszy wzrost aktywności i zgodność z łańcuchem H, skonstruowano wersję b łańcucha ł. Wersje a i b łańcucha L oceniono razem pod względem aktywności wiązania antygenu, po połączeniu z wersjami a, b, f lub h łańcucha H. Jak ukazano w fig. 9, 10, 11 i 12, wersja a łańcucha L posiadała wyższą aktywność niż wersja b dla obu aktywności we wszystkich wersjach a, b, f i h łańcucha H. Zatem, wersję a łańcucha L przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM

1.24 użyto do następnego doświadczenia.

2-2. Wersje a do e łańcucha H

Wersje a do e łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono w połączeniu z wersją a łańcucha L jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania. Wynik, jaki ukazano w fig. 11, 13, 14 i 15 wskazuje, że wszystkie wersje miały słabsze obie aktywności w porównaniu z chimerycznym przeciwciałem anty-HM 1.24, sugerując, że wymagana jest dodatkowa substytucja aminokwasowa.

2-3. Hybrydowe przeciwciało łańcucha H

Hybrydowe przeciwciało łańcucha H oceniono jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania antygenu. Wynik, jaki ukazano w fig. 16, wskazywał, że ludzkie-mysie hybrydowe przeciwciało anty-HM 1.24 wykazuje podobną aktywność do chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24, podczas gdy mysie ludzkie hybrydowe przeciwciało anty-HM 1.24 miało słabszą aktywność niż chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24. Wskazywało to, że w celu skonstruowania przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, mającego aktywność wiązania antygenu podobną do chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24, jest konieczna zamiana aminokwasów zawartych w FR3 lub FR4 wśród zawartych w regionie V łańcucha H.

2-4 Wersje f do r łańcucha H

Wersję f łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania antygenu. Wynik, jaki ukazano w fig. 17, wskazywał, że jego aktywność wiązania antygenu jest zmniejszona w porównaniu z chimerycznym przeciwciałem anty-HM 1.24, lecz jest większa w porównaniu z powyższymi wersjami a do c, sugerując, ze każdy z czterech aminokwasów w pozycjach 67, 69, 75 i 78, które zamieniono w tej wersji, jest odpowiedzialny za aktywność przekształconego ludzkiego przeciwciała.

Wersję g łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania antygenu. Wynik, jaki ukazano w fig. 18 i 19, wskazywał, że ta wersja wykazała podobny poziom aktywności do powyższej wersji a, ujawniając, że jak ukazano w powyższym hybrydowym ludzkim mysim przeciwciele łańcucha H, aminokwas w pozycji 40, który przekształcono w tej wersji nie jest odpowiedzialny za wzrost aktywności przekształconego ludzkiego przeciwciała.

187 642

Wersje h do j łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania. Wynik, jaki ukazano w fig. 20, 21, 22 i 23, wskazywał, że wszystkie wersje były słabsze pod względem obu aktywności w porównaniu z chimerycznym przeciwciałem anty-HM

1.24 i były podobne do wyżej wspomnianej wersji f, sugerując, ze aminokwasy w pozycji 67 i 69 wśród czterech aminokwasów, które przekształcono w wersji f nie są odpowiedzialne za wzrost aktywności przekształconego ludzkiego przeciwciała.

Wersje k do p łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania. Wynik, jaki ukazano w fig. 24, 26 i 27, wskazywał, że wszystkie wersje były słabsze pod względem obu aktywności w porównaniu z chimerycznym przeciwciałem anty-HM 1.24 i były podobne do wyżej wspomnianej wersji h, sugerując, że aminokwasy w pozycji 80 i dalej, które ostatnio przekształcono w tych sześciu wersjach, nie są odpowiedzialne za wzrost aktywności przekształconego ludzkiego przeciwciała.

Wersję q łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania. Wynik, jaki ukazano w fig. 25, wskazywał, że ta wersja była słabsza pod względem obu aktywności w porównaniu z chimerycznym powyższą wersją h lub wersją p i była podobna do wyżej wspomnianej wersji z, sugerując, że substytucja aminokwasu w pozycji 78 jest zasadnicza dla wzrostu aktywności przekształconego ludzkiego przeciwciała.

Wersję r łańcucha H anty-HM 1.24 oceniono metodą wspomnianą powyżej. Wynik jaki ukazano w fig. 15 i 28 wskazywał, że wersja r ma podobny poziom aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania do chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24.

Powyższe wyniki wskazują, że minimalną wymaganą konwersją dla przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, aby posiadało podobny poziom aktywności wiązania antygenu do mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 lub chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24, jest dla aminokwasów w pozycjach 30, 71 i 78 i ponadto 73.

Aktywność wiązania antygenu oraz aktywność inhibicji wiązania dla wersji a do r łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, streszczono w tabeli 6.

Tabela 6
Wersja łańcucha H	Aktywność wiązzniz antygenu	Aktywność inhibicji wiązania
z	+	+
b	+	+
c	+	+
d	+	nie zmierzono
z	+	nie zmierzono
f	++	++
σ &	+	+
h	++	++
i	++	++
j	++	++
k	++	++
1	++	++
m	++	++
n	++	++
o	++	++
P	++	++
q	+	+
r	+++	+++

2-5. Wersja s łańcucha H

Wersję s łańcucha H przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono w połączeniu z wyżej wymienioną wersją z łańcucha L jak wspomniano dla pomiaru aktywności wiązania i aktywności inhibicji wiązania. Wynik, jaki ukazano w fig. 29 i 30 wskazy187 642 wał, że wersja s ma podobny poziom aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania jak wersja r.

Jak wspomniano powyżej, przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 według niniejszego wynalazku zachowuje zdolność do wiązania się z antygenem nawet po zamianie jednego lub więcej aminokwasów na inne aminokwasy. W związku z tym, niniejszy wynalazek obejmuje przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24, w którym jedną lub więcej reszt aminokwasowych zamieniono na inne aminokwasy w regionie zmiennym łańcucha H łub łańcucha L tak długo, jak zachowuje on oryginalne właściwości.

3. Ocena oczyszczonego przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

Oczyszczone przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 oceniono pod względem powyższej aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania. Wynik, jaki ukazano w fig. 31 i 32, wskazuje, ze przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 posiada podobny poziom aktywności wiązania antygenu i aktywności inhibicji wiązania jak chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24. Ten fakt wskazuje, że przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 posiada taką samą aktywność wiązania jak mysie przeciwciało antyHM 1.24.

Przykład 12. Wpływ przeciwgcwotwcrowy chimerycznego przeciwciała anty-HM

1.24 na mysi model ludzkiego szpiczaka

1. Wytwarzanie przeciwciała do podawania

1-1. Wytwarzanie chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24

Oczyszczone chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 otrzymane w powyższym przykładzie 6 zatężono i roztwór buforowy zamieniono na PBS(-) przy użyciu koncentratora wirówkowego z ultrafiltracją Centriprep 10 (wyprodukowanego przez Amicon). Wyjałowicnc je przez filtrację przy użyciu filtru błonowego MILLEX-Gv (wyprodukowanego przez MILLIPORE) o wielkości porów 0,22 pm. Wytworzono je do stężenia 200 pg/ml, stosując PBS(-) wyjałowiony przez filtrację, który użyto do następnych doświadczeń. Stężenie przeciwciała zmierzono przez absorbancję przy 280 nm i obliczono z 1 mg/ml jako 1,35 OD.

1-2. Oczyszczanie kontrolnej ludzkiej IgG1

Ludzką IgG1 stosowaną jako kontrolę dla chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 oczyszczono następująco. Po dodaniu równej ilości PBS(-) do Hu IgG1 Kappa Purified (wyprodukowanego przez BINDING SITE), oczyszczono je przez powinowactwo przy użyciu układu do szybkiego oczyszczania przeciwciał ConSep LC100 (wyprodukowanego przez MILLIPORE) oraz kolumny Hyper D Protein A (wyprodukowanej przez Nippon Gaishi) stosując PBS(-) jako bufor absorpcyjny oraz 0,1 M bufor cytrynianu sodu (pH 3) jako bufor elucyjny, zgodnie z załączonymi instrukcjami. Wymyte frakcje wyregulowano do pH około 7,4 przez natychmiastowe dodanie 1 M Tris-HCl (pH 8,0) a następnie stosując koncentrator wirówkowy z ultrafiltracją Centriprep 10 (wyprodukowanego przez Amicon) przeprowadzono zatężenie i zamianę buforu na PBS(-) oraz wyjałowiono przez filtrację przy użyciu filtru błonowego M^LEX-GV (wyprodukowanego przez MILLIPORE) o wielkości porów 0,22 pm. Wyregulowano to do 200 pg/ml, stosując PBS(-) wyjałowiony przez filtrację i użyto do następnych doświadczeń. Stężenie przeciwciała zmierzono przez absorbancję przy 280 nm i obliczono z 1 mg/ml jako 1,35 OD.

2. Metoda oceny ilościowej ludzkiej IgG z surowicy w surowicy myszy

Ludzką IgG zawartą w mysiej surowicy oceniono ilościowo przez następującą ELISA. 100 pl koziej anty-ludzkiego IgG rozcieńczonej do 1 pg/ml 0,1 M buforem wodorowęglanowym (pH 9,6) dodano do 96-studzienkowej płytki (wyprodukowanej przez NINC) i igkubcwano przez noc w temperaturze 4°C, aby unieruchomić przeciwciało, po zablokowaniu, dodano 100 pl seryjnie rozcieńczonej mysiej surowicy lub j IgG jako standardu (wyprodukowanej przez CAPPEL) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po przemyciu, dodano 100 pl 2000-krctnie rozcieńczonej anty-ludzkiej IgG znakowanej fosfatazą alkaliczną i inkubowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po przemyciu dodano roztwór substratu i inkubowano, a następnie zmierzono absorbancję przy 405m nm przy użyciu MICORPLATE READER Model 3550 (wyprodukowanego przez Bio-Rad).

187 642

3. Wpływ przew jwnowntWΌnoavy chimeopcznećg przeo jwaiała :gityłjOM lH4na komórki ludzkiego sapicaoko prneszozepionyop do myszy

3-1. Konstruowanie myszy z prnrsaczrpiknćmi ludzkimi komórkami sapicaoko

W sposób następujący skonstruowano mysz z przeszczepionymi ludzkimi komórkami szpiczaka. Komórki KPMM2 pasażowane in vivo przy użyciu myszy SCID (hodowanej w Nihon CLEA) wytworzono przy stężeniu 3 x 10⁷ komórek/ml za pomocą pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (wyprodukowaną przez GIBCOBRL). Dwieście pi zawiesiny powyższych komórek KPMM2 wstrzyknięto przez żyłę ogonową do myszy SCID (samiec, 8-tygkrnionć, wyhodowany przez Nihon CLEA), której poprzedniego dnia podano dootrzewnowo 100 pl ocay-osiaio GM1 (wyprodukowanej przez Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd.).

3-2. Podawanie przeciwciała

W dniu 12 po przeszczepieniu komórek KPMM2 zebrano surowicę od powyższej myszy z przeszczepionymi ludzkimi komórkami sapicaoko i ludzką IgG w surowicy oceniono ilościowo przy użyciu ELISA wspomnianej w powyższym 2. Pobranie komórek KPMM2 w szpiku kostnym potwierdzono przez wzrost ludzkiej IgG w surowicy. W dniu 14, 21 i 28 po przeszczepieniu komórek KPMM2, podano tym myszom dootrzewnowo 100 pl każdego z przeciwciał wytworzonych w powyższym 1.

3-3. Ocena wpływu przeciwcowotworowegk chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 na mysz z przeszczepionymi ludzkimi komórkami sapiozako

Wpływ praeoiwnowotworowć chimerycznego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono przez okres przeżycia myszy. Jak ukazano w fig. 33, myszy, którym podano chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 wykazały przedłużony okres przeżycia w porównaniu z myszami, które otrzymały kontrolną ludzką IgG1. Tak więc, potwierdzono, że chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 posiada wpływ przrcinnowotworonć na mysz z prnrszozepiknymi ludzkimi komórkami szpicaoko.

Przykład 13. Pomiar aktywności ADCC przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24

Aktywność ADCC (oytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciała) zmierzono zgodnie z metodą jaką przedłożono wCurrent Protocols in Immunolkgy, rozdział 7. Immunologie studies in humans, wydawca John E, Coligan i in., John Wiley & Sons, Inc., 1993.

1. Wćtworzαcir komórek efektorowych

Komórki jednojądrzoste wydzielono z krwi obwodowej zdrowych ludzi metodą wirowania gęstośoiowrgk. Tak więc, równą ilość PBS(-) dodano do krwi obwodowej zdrowych ludzi, które nawarstwiono na Ficoll-Paque (wyprodukowanym przez Pharmacia) i wirowano przy 400 g przez 40 minut. Warstwę komórek jrdnojądrnostyoh zebrano i przemyto cztery razy pożywką RPMI 1640 (wyprodukowaną przez GlBCO BRL) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (wyprodukowaną przez GIBCO BRL) i sporządzono przy gęstości komórek 5x10⁶/ml z tą samą pożywką hodowlaną.

Indukowano LAK (komórki zabijające aktywowane limfokiną) ze szpiku kostnego myszy SCID (wyhodowanych przez N^on CLEA). Tak więc, komórki szpiku kostnego wyizolowano z kości udowej myszy i przemyto dwukrotnie pożywką RPMI 1640 (wyprodukowaną przez GIBCO BRL) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (wyprodukowaną przez GIBCO BRL) i sporządzono przy gęstości komórek 5 x 10⁶/ml z tą samą pożywką hodowlaną. Inkubowano to razem z 50 ng/ml rekombinowanej ludzkiej IL-2 (wyprodukowanej przez R&D SYSTEMS) i 10 ng/ml rekombinowαcego mysiego GM-CSF (wyprodukowanego przez R&D SYSTEMS) w inkubatorze z CO2 (wyprodukowanego przez TABAl), przez siedem dni. Liczbę komórek wyregulowano na 2 x 10⁶/ml tą samą pożywką hodowlaną.

2. Wytwarzanie komórek docelowych

Ludzką linię komórkową sapioaoko KPMM2 (japoński nie zbadany opis patentowy (Kokai) nr 7-236475) lub ARH-77 pochodzącą z białaczki plonmotycznej (ATCC CCL-1621) rodioanocanikkwono przez inkubację w pożywce RPMI 1540 (wyprodukowanej przez GIBCO BRL) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (wyprodukowaną przez GlBCO BRL) razem z 0,1 mCi 51Cr-chromianu sodu (wyprodukowanego przez ICN) w temperaturze 37°C

187 642 przez 60 minut. Po radioczaccniknwaziu, komórki przemyto trzykrotnie tą samą pożywką hodowlaną i ustawiono na 2 x 10⁵/ml.

3. TestADCC

Do 96-stpdciezknwej płytki z dnem w kształcie U (wyprodukowanej przez Becton Dickinson) dodano 50 pl 2 x 105 komórek docelowych/ml, 50 pl przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, mysie przeciwciało anty-HM 1.24, kontrolną ludzką IgG1 (wyprodukowaną przez THE BINDING SITE) lub kontrolną mysią IgG2 (UPC10, wyprodukowaną przez CAPPEL) i poddano reakcji w temperaturze 4°C przez 15 minut.

Następnie, 100 pl komórek efektorowych hodowano w inkubatorze z CO2 przez 4 godciny, gdy stosunek (E:T) komórek efektorowych (E) do komórek docelowych (T) ustawiono na 0:1, 3,2:1, 8:1,20:1 lub 50:1.

Pobrano sto pl supematantu i zmierzono radioaktywność uwolnioną do supematantu hodowlanego przez licznik gamma (ARC-300, wyprodukowany przerz Aloka). Dla zmierzenia maksymalnej radioaktywności użyto 1% NP-40 (wyprodukowanego przez Nakalai). Cytotoksyczność (%) obliczono przez (A-C)/(B-C)x 100, gdzie A oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną w obecności przeciwciała, B oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną przez NP-40, a C oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną przez samą, pożywkę hodowlaną bez przeciwciała.

Figura 34 ukazuje wynik uzyskany gdy komórki wytworzone z krwi obwodowej od zdrowego człowieka stosowano jako komórki efektorowe, a komórki KPMM2 stosowano jako komórki docelowe. Figura 35 ukazuje wynik uzyskany gdy komórki wytworzone z krwi obwodowej od zdrowego człowieka stosowano jako komórki efektorowe, a ARH-77 stosowano jako komórki docelowe. Gdy dodano przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24, cytotoksyczność rosła ze wzrostem stężenia przeciwciała, jak porównano z kontrolną ludzką IgG1, wskazując, że przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 posiada aktywność ADCC.

Ponadto, po dodaniu przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24, cytotoksyczność ewidentnie wzrosła co porównano z mysim przeciwciałem anty-HM 1.24, wskazując, że przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 posiada wyższą aktywność ADCC niż mysie przeciwciało anty-HM 1.24. Ponadto, gdy użyto KPMM2 jako komórek docelowych, dodanie przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 o stężeniu 0,1 pg/ml lub wyższego, nie spowodowało zmian w cgtntokoyccności, wskazując, że stężenie, wynoszące 0,1 pg/ml lub wyższe ma wystarczającą aktywność ADCC.

Figura 36 ukazuje, że wynik otrzymany gdy użyto komórki wytworzone ze szpiku kostnego myszy SCID, jako komórki efektorowe. Gdy dodano przekształcone przeciwciało antyHM 1.24, cytotoksyczność wzrosła ze wzrostem stężenia przeciwciała, jak porównano z kontrolną ludzką IgG1, wskazując, że przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 posiada aktywność ADCC. Ponadto, dodanie przekształconego ludzkiego przeciwciała antyHM 1.24 o stężeniu 0,1 pg/ml lub wyższym nie powodowało zmian cytntnksycznnści, wskazując, że stężenie, wynoszące 0,1 pg/ml lub wyższe ma wystarczającą, aktywność ADCC.

Wyniki ukazują, że przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24 ma aktywność ADCC nawet gdy użyte komórki efektorowe pochodzą od ludzi lub myszy.

Przykład 14. Wpływ przeciwznwotwnrnwg przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 na mysi model szpiczaka ludzkiego

1. Wytwarzanie przeciwciała do podawania

Przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24 otrzymane przez wprowadzenie plazmidu HEF-RVLa-AHM-gK i plazmidu HEF-RVHr-AHM-gy1 do komórek CHO wytworzono do stężenia 40, 200 i 1000 pg/ml przy użyciu PBS(-) wyjałowionego przez filtrację, a kontrolną ludzką IgG1 otrzymaną w przykładzie 12.1-2 wytworzono do stężenia 200 pg/ml przy użyciu PBS(-) wyjałowionego przez filtrację, których użyto jako przeciwciał do podawania.

2. Wpływ przeciwnowotworowy przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM

1.24 na mysz z przeszczepionymi ludzkimi komórkami szpiczaka ,

2-1. Konstrukcja myszy z p^sz^ptonymi ludzkimi komórkami ocpiccaka

187 642

Myszy z przeszczepionymi ludzkimi komórkami snpizzaka wytworzono zgodnie z przykładem 12.3-1. Użytymi myszami były myszy SCID (cięziotygodniowe) (wyhodowane przez Nihon CLEA).

2-2. Podawanie przeciwciał

W dniu 9 po przeszczepieniu komórek KPMM2, zebrano surowicę od powyższych myszy z crneznzzclonymi ludzkimi komórkami znciczakα wytworzonych w powyższym 2-1 i oceniono ilościowo ludzką IgG w surowicy przy użyciu ELISA wymienionej w powyższym

12.2. Pobranie komórek KPMM2 na szpiku kostnym potwierdzono przez wzrost poziomu ludzkiej IgG w surowicy. W dniu 10 po przeszczepieniu komórek KPMM2 podano dożylnie tym myszom 100 pl każdego z przeciwciał wytworzonych w powyższym 1.

2-3. Ocena wpływu crzeciwnowotworowego przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 na mysz z przeszczepionymi ludzkimi komórkami zzpiczaka

Wpływ przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono przez zmianę ilości ludzkiej IgG w mysiej surowicy i okresu przeżycia myszy.

Zmianę ilości ludzkiej IgG w surowicy myszy oceniono ilościowo dla surowicy zebranej w dniu 35 po przeszczepieniu komórek KPMM2 przez określenie j IgG przy użyciu ELISA wymienionej w przykładzie 12.2. Wynik jaki ukazano w fig. 37 ujawnił, że w grupie, której podawano kontrolną ludzką IgG ilość ludzkiej IgG w surowicy w dniu 35 po przeszczepieniu komórek KPMM2 wzrosła o około 1000 razy w porównaniu z surowicą w dniu 9 (dzień przed podaniem przeciwciała), podczas gdy w grupie, której podano przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 była ona prawie równa lub niższa od tej z dnia 9 dla każdej dawki, wskazując, że przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 hamowało wzrost komórek KPMM2. Z drugiej strony, dla okresu przeżycia jaki ukazano w fig. 38, przedłużenie zaobserwowano dla grupy, w której podano przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 co porównano z grupą, której podawano kontrolną ludzką IgG1. Powyższe ukazuje, że przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 posiada wpływ crzeciwnowotwprkwy na mysz z crzeznznpionymi ludzkimi komórkami znciczaka.

Przykład 15. Porównanie wpływu przeciwnowotwρrpwegk między przekształconym ludzkim przeciwciałem anty-HM 1.24 i istniejącym lekiem melfalanem na mysi model ludzkiego snpicnaka

1. Wytwarzanie leków do podawania

1-1. Wytwarzanie przeciwciał do podawania

Przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 otrzymane przez wprowadzenie plazmidu HEF-RVLa-AHM-gK i plazmidu HEF-RVHr-AHM.-gy1 do komórek CHO wytworzono do stężenia 40 i 200 pg/ml przy użyciu PBS(-) wyjcłpwipnegp przez filtrację, a kontrolną ludzką IgG1 otrzymaną w przykładzie 12.1-2 wytworzono do stężenia 200 pg/ml przy użyciu PBS(-) wyjałowionego przez filtrację, których użyto jako przeciwciał do podawania.

1- 2. Wytwarzanie melfalanu

Melfalan (wyprodukowany przez SIGMA), który jest istniejącym lekiem na zzciczaka, wytworzono do stężenia 0,1 mg/ml przy użyciu 0,2% karboksymeyylkcelulpny (CMC) (wyprodukowanej przez Daicel Chemical Induzyriez, Ltd.).

2. Przeciwnowotworowy wpływ przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM

1.24 oraz melfalanu na mysz z przeszczepionymi ludzkimi komórkami snpicnaka

2- 1. Konstrukcja myszy z przeszczepionymi ludzkimi komórkami szpizzaka

Mysz z przeszczepionymi ludzkimi komórkami snciczaka skonstruowano zgodnie z przykładem 14.2-1.

2-2. Podawanie leku

W dniu 9 po przeszczepie komórek KPMM2 zebrano surowicę od powyższej myszy z przeszczepionymi ludzkimi komórkami sncicncka wytworzonej w powyższym 2-1, i oceniono ilościową ludzką IgG w surowicy przy użyciu ELISA wymienionej w powyższym

12.2. Pobranie komórek KPMM2 w szpiku kostnym potwierdzono przez wzrost poziomu ludzkiej IgG w surowicy. W dniu 10 po przeszczepie komórek KPMM2, podano dożylnie tym myszom 100 pl przeciwciał wytworzonych w powyższym 1-1. Ponadto podawano doustnie 200 pl 0,2% roztworu CMC raz dziennie przez pięć dni od 10 dnia po przeszczepie. Z drugiej

187 642 strony, dla grupy, które podawano melfalan, podawano doustnie roztwór melafalanu wytworzonego w powyższym 1-2 w ilości 100 gl na 10 g ciężaru ciała (1 mg/kg w postaci melfalanu) raz dzlunnlu przez pięć dni od dnia 10 po przeszczepie komórek KPMM2.

2-3. Ocena wpływu pezehiwckwotwttrowego przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 na mysz z przeszczepionymi ludzkimi komórkami szpiczaka

Wpływ przuhiwnkwotworkwy przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 oceniono przez zmianę ilości ludzkiej IgG w surowicy myszy i okres przeżycia myszy.

Zmianę ilości ludzkiej IgG w surowicy myszy khenionk ilościowo dla surowicy zebranej w dniu 35 po przeszczepie komórek KPMM2 przez określenie ludzkiej IgG przy użyciu ELISA wymienionej w przykładzie 12.2. Wynik, jaki ukazano w fig. 39 ujawnił, że w kontrolnej grupie, której podawano ludzką IgG, ilość ludzkiej IgG w surowicy w dniu 35 po przeszczepie komórek KPMM2 wzrósł około 1000-krotnie w porównaniu z dniem 9 (dzień przed podaniem przeciwciała), podczas gdy wydawało się, że komórki KPMM2 rosły u tych myszy. Również w grupie, której podawano melfalan, ilość ludzkiej IgG w surowicy była większa niż przed podaniem leku, lecz nie tak duża jak w kontrolnej grupie, której podawano ludzką IgG. Ten wynik wskazuje, że podawanie melaalacu nie hamowało wzrostu komórek KPMM2 w sposób doskonały. Z drugiej strony, w grupie, której podawano przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24, ilość ludzkiej IgG w surowicy w dniu, była mniejsza niż w dniu 9 po przeszczepie dla każdej dawki, wskazując, ze przekształcone ludzkie przeciwciało antyHM 1.24 hamowało wzrost komórek KPMM2.

Z drugiej strony, dla okresu przeżycia, jaki także ukazano w fig. 40, obserwowano wydłużeme dla grupy, której podawano przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 w porównaniu z grupą kontrolną, której podawano ludzką IgG lub grupą, której podawano melfalan. Z powyższego okazuje się, że przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 na wpływ przeclwnowktwkrowy na mysz z przeszczepionymi ludzkimi komórkami szpiczaka oraz że wpływ przehiwnowktworowy niniejszego przeciwciała jest silniejszy niż istniejącego leku melfalanu.

Powyższe wyniki wskazują, że gdy stosuje się komórki efuktkrkwe, pochodzące od człowieka, mysie przeciwciało anty-HM 1.24 ma niewielką cztktoksyhzność na ludzkie komórki szpiczaka, podczas gdy przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 oraz chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24 wykazuje silną cztotkksyhznkść. Fakt ten wskazuje wagę humanizowanego przeciwciała i daje nadzieję na użyteczność przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24 u ludzi.

Przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 wykazało bardzo silny wpływ przeciwnowktworowy na myszy SCID z przeszczepionymi ludzkimi komórkami szpiczaka. Ponieważ u ludzi komórki efektorowe pochodzą od ludzi i limfocyty są normalnie obecne, oczekuje się nawet silniejszego wpływu przehiwnowotworkwegk przekształconego ludzkiego przeciwciała anty-HM 1.24.

W modelu szpiczaka, przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 wykazało silny wpływ przeciwnkwotwkrkwy w porównaniu z istniejącym lekiem, a zatem oczekuje się, że przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24 stanie się epokowym lekiem do leczenia szpiczaka.

Odnośnik do przykładu 1. Konstrukcja hybrydomy, która wytwarza mysie przeciwciało monkklonalne anty-HM W 1.24

Wytworzono hybrydomę, która wytwarza mysie przeciwciało monoklknalne anty-HM

1.24 zgodnie z metodą opśsaną u Goto, T. i łn., Blood (1994) 84, 1992-1930.

Linię komórek plazmatzhznzhh KPC-32 ujemnych pod względem antygenu jądrowego wirusa Epsteina-Barra (1 x 10⁷ komórek) pochodzących ze szpiku kostnego człowieka ze szpiczakiem mnogim (Goto, T. i in., Jpn. Clin. Hematol. (11991) 32, 1400) podawano dootrzewnowo dwukrotnie myszom BALB/C (wyhodowanym przez Charles River) co sześć tygodni.

W celu dodatkowego podniesienia wytwarzania miana przeciwciał, 1,5 x 1(0’ komórek KPC-32 wstrzyknięto do śledziony myszy trzy dni przed uśmierceniem zwierząt (Goto, T. iin., Tokushima, J. Exp. Med (1990) 37, 89). Po uśmierceniu myszy, śledziony usunięte

187 642 zgodnie z metodą Grotha, de St. i Schreideggera (Cancer Research (1981), 41, 3465) poddano fuzji komórkowej z komórkami szpiczaka SP2/0.

Przeciwciała w supernatancie hodowli hybrydomy przesiano przez ELISA (Posner, M.R. i in J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) przy użyciu płytek powleczonych komórkami KPC-32. 5 x 10⁴ komórek kPc zawieszono w 50 ml PBS i rozlano równe ilości do 96-studzienkowych płytek (z dnem w kształcie U, Corning, wyprodukowane przez Iwaki). Po zablokowaniu PBS, zawierającym 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA), dodano supernatant hybrydomy i inkubowano w temperaturze 4°C przez 2 godziny. Następnie, poddano reakcji ze znakowanym peroksydazą kozim anty-mysim przeciwciałem IgG (wyprodukowanym przez Zymed) w temperaturze 4°C przez 1 godzinę, przemyto raz i przereagowano z roztworem substratu o-fenylodiaminą (wyprodukowanym przez Sumitomo Bakelite) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po zatrzymaniu reakcji 2N kwasem siarkowym, zmierzono absorbancję przy 492 nm przy użyciu czytnika ELISA (wyprodukowanego przez Bio-Rad). W celu usunięcia hybrydomy, która wytwarza przeciwciało przeciw ludzkiej immunoglobulinie, dodatni supernatant hodowlany hybrydomy uprzednio adsorbowano do ludzkiej surowicy i przesiano pod względem reaktywności z innymi składnikami subkomórkowymi. Wybrano dodatnie hybrydomy i prześledzono ich reaktywność wobec różnych linii komórkowych i próbek ludzkich, przy użyciu cytometrii przepływowej. Ostatecznie wybrane klony hybrydomy klonowane dwukrotnie, wstrzyknięto do jamy brzusznej myszy BALB/C traktowanych środkiem o nazwie pristane, a potem otrzymano od nich płyn puchlinowy.

Przeciwciało monoklonalne oczyszczono z mysiego płynu puchlinowego przez precypitację z siarczanem amonu i zestaw do chromatografii powinowactwa Protem A (Ampure PA, wyprodukowany przez Amersham). Oczyszczone przeciwciało sprzężono z izotiocyjanianem fluoresceiny (FlTC) przy użyciu zestawu do sprzęgania Quick Tag FILC (wyprodukowanego przez Boehringer Mannheim).

W wyniku, przeciwciała monoklonalne wytworzone przez reakcję 30 klonów hybrydomy z komórkami KPC-32 i RPMI 8226. Po klonowaniu, prześledzono reaktywność supematantu tych hybrydom z innymi liniami komórkowymi i komórkami monojądrzastymi z krwi obwodowej.

Wśród nich trzy klony wytwarzały przeciwciała monoklonalne, które specyficznie reagują z komórkami plazmatycznymi. Poza tymi trzema klonami wybrano klon hybrydomy, który wytwarza przeciwciało monoklonalne najbardziej użyteczne dla analizy cytometrii przepływowej i który posiada cytotoksyczność zależną od dopełniacza przeciw komórkom RPUI 8226 i nazwano HM1.24. Podklasę przeciwciała monoklonalnego wytworzonego przez te hybrydomę określono przez ELISA, stosując królicze przeciwciało anty-mysie specyficzne dla podklasy (wyprodukowane przez Zymed). Przeciwciało anty-HM 1.24 miało podklasę IgG2 k. Hybrydomę, która wytwarza przeciwciało anty-HM 1.24 uczyniono międzynarodowym depozytem 14 września 1995 w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, prefektura Ibalaki, Japonia), pod numerem dostępu FERM BP-5233 na warunkach układu budapeszteńskiego.

Odnośnik do przykładu 2. Kloning cDNA, kodującego polipeptyd antygenu HM 1.24

1. Konstrukcja biblioteki cDNA

1) Wytwarza^c-atkowitego RNA cDNA, który koduje antygen HM 1.24, który jest białkiem specyficznie rozpoznawanym przez mysie przeciwciało anty-HM 1.24 wyizolowano następująco.

Od ludzkiej linii komórkowej szpiczaka mnogiego KPMM2 wytworzono całkowity RNA zgodnie z metodą Chirwing i in., (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). Tak więc, 2,2 x 1 komórek KPMM2 homogenizowano całkowicie w 20 ml 4 M tiocyjnanianu guanidyny (wyprodukowanego przez Nakalai tesque).

Homogenat nawarstwiono na warstwie 5,3 M chlorku cezu w rurce od wirówki, która następnie wirowano przy użyciu rotora Beckman SW40 przy 31000 rpm w temperaturze 20°C przez 24 godziny, aby wytrącić RNA. Osad RNA przemyto 70% etanolem i rozpuszczono

187 642 w 300 pl 10 mM Tris-HCl, zawierającym 1 mM EDTA i 0,5% SDS. Po dodaniu do niego

Pronase (wyprodukowanego przez Boe^nger) do stężenia 0,5 mg/ml, inkubcwanc go w temperaturze 37°C przez 30 minut. Mieszaninę ekstrahowano fenolem i chloroformem, aby wytrącić RNA. Następnie, osad RNA rozpuszczono w 200 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), zawierającym 1 mM EDTA.

2) Wytworzenie poli(A)+RNA

Stosując około 500 ng całkowitego RNA wytworzonego jak powyżej jako materiał źródłowy, oczyszczono poli(A)+RNA przy użyciu Fast Track 2.0 m RNA Kit (wyprodukowany przez InvitiOgen) zgodnie z instrukcjami załączonymi do zestawu.

3) Konstruowanie biblioteki cDNA

Stosując 10 pg powyższego poli (A)+RNA jako materiał źródłowy, zsygtetyzowagc cDNA o podwójnej nici przy użyciu zestawu do syntezy cDNA TimeSaver cDNA Sythesis Kit (wyprodukowagogc przez Pharmacia) zgodnie z instrukcjami załączonymi do zestawu i przy użyciu adaptera EcoRI Directional Cloning Toolbox (wyprodukowanego przez Pharmacia) dołączono do niego adapter EcoRI zgodnie z instrukcjami załączonymi do zestawu. Traktowanie kinazą i enzymem restrykcyjnym MotI adaptera EcoRI przeprowadzono zgodnie z intrukcjami załączonymi do zestawu. Ponadto, adapter z przyłączonym cDNA o podwójnej nici, mający wielkość około 500 bp lub więcej, wyizolowano i oczyszczono przy użyciu 1,5% żelu agaro/Owego o niskiej temperaturze topnienia (wyprodukowanego przez SIGMA), aby uzyskać około 40 pl cDNA o podwójnej nici przyłączonego do adaptera.

cDNA o podwójnej nici przyłączony do adaptera otrzymany w ten sposób dcłąo/cnc do wektora pCOSł (japoński nie zbadany opis paptentowy (Kokai) 8-255196), który traktowano uprzednio enzymami restrykcyjnymi EcoRI i NotI oraz fosfatazą alkaliczną (wyprodukowaną przez Takara Shuzo) przy użyciu T4 do konstrukcji ligazy DNA (wyprodukowanej przez GIBCO BRL) aby skonstruować bibliotekę cDNA. Skonstruowaną bibliotekę DNA poddano transdukcji do szczepu Escherichia coli DH5a (wyprodukowanej przez GIBCO BRL) i oszacowano całkowitą wielkość na około 2,5 x 10⁶ nie/alożnyoh klonów.

2. Kloning przez ekspresję bezpośrednią

1) Transfe^ja do komórek COS-7 cDNA powielono przez hodowlę około 5 x 10⁵ klonów powyższej tragodukowagej Escherichia coli w pożywce 2-YT (Molecular Cloning: A I.aboratory Manual, Sambrook, i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, i DNA plazmidu odzyskano z Escherichia coli metodą zasadową (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, i in., Cold Spring Harbor kabcratcry Press, (1989)). Otrzymany DNA plazmidu tragsfekowago do komórek COS-7 przez eloktrcpcraoję przy użyciu urządzenia GenePulser (wyprodukowanego przez BioRad).

Tak więc, 10 pg cozyozc/cnegc DNA plazmidu dodano do 0,8 ml komórek COS-7, które zawieszono w pBs przy stężeniu 1 x 10' komórek/ml i poddano impulsom przy 1500 V i pojemności 25 pF. Po 10 minutach okresu odzysku w temperaturze pokojowej, ktomórki po elektroporacji hodowano w DMEM (wyprodukowanej przez GIBCO BRL) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą w warunkach temperatury 37°C i 5% CO2 przez trzy dni.

2) Wytwarzanie płytki do płukania

Płytkę do płukania powleczonych mysim przeciwciałem anty-HM 1.24 wytworzono metodą B. Seed i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). Tak więc, mysie przeciwciało anty-HM 1.24 dodano do 50 mM Tris-HC; pH 9,5 do stężenia 10 ng/ml. Trzy ml ro/twcru tak wytwcrzcgegc przeciwciała dodano do płytki z hodowlą tkankową o średnicy 60 mm i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po trzykrotnym przemyciu 0,15 M roztworem NaCl i zablokowaniu PBS, zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej, 1 mM EDTA i 0,02% NaN3, płytki te użyto w następnym klogingu.

3) Kloning biblioteki cDNA

Komórki COS-7 transfekowage jak opisano powyżej odłączono przez PBS, zawierający 5 mM EDTA, a potem przemyto raz PBS, zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej. Te komórki zawies/onc następnie w PBS, zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej i 0,02% NaN3 do stężenia około 1 x 106 komórek/ml, które dodano do płytek do płukania wytworzo52

187 642 nych jzk powyżej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po trzykrotnym delikatnym przemyciu PBS, zawierającym 5% płodową surowicę bydlęcą, 0,02% NZN3, DNa plazmidu odzyskano z komórek związanych z płytką do przemywania przy użyciu roztworu, zawierającego 0,6% SDS i 10 mM EDTA.

Odzyskany plazmidowy DNA trzndukowano ponownie do Escherichia coli DH5a. Po powieleniu DNA plazmidu jak powyżej, odzyskano go metodą zasadową. Odzyskany DNA plazmidu transfekowzno do komórek COS-7 metodą elektroporacji i DNA plazmidu odzyskano ze związanych komórek jzk opisano powyżej. Taką samą procedurę powtórzono jeszcze raz i odzyskany DNA plazmidu trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i NotI. W wyniku potwierdzono stężenie insertu o wielkości około 0,9 kbp. Escherichia coli trznsdukowzno częścią odzyskanego DNA plazmidu i inokulowzno do płytki z zgarem 2-YT, zawierającej 50 gg/ml ampicyliny. Po całonocnej hodowli, DNA plazmidu odzyskano z pojedynczej kolonii. Trawiono go enzymami restrykcyjnymi EcoRI i NotI i otrzymano klon c3.ł9, mający insert o 0,9 kbp.

Sekwencję zasad tego klonu określono przez reakcję przy użyciu zestawu PRISM, Dye Terminater Cycle Sequencing (wyprodukowanego przez Perkin Elmer) zgodnie z instrukcjami załączonymi do zestawu i sekwencjonowano przy użyciu ABI 373A DNA Seqiencer (wyprodukowanego przez Perkin Elmer). Ich sekwencję aminokwasową i sekwencję zasad ukazuje się w SIQ ID nr: 103.

cDNA, kodujący polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową, jaką przedłożono w SEQ ID nr: 103 wprowadzono do miejsca rozszczepienia XbaI wektora pUC19 i wytworzono jako plazmid pRS38-cUCł9. Escherichia coli, która zawiera ten plazmid pRS38pUC19 uczyniono międzynarodowym depozytem 5 października 1993 jako Escherichia coli DH5a (cRS38-cUC19) w National Institute of Bioscience and Human-Tzchnoloσy, Agency of Industrial Science znd Technology, MITI, (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, prefektura Ibalaki, Japonia), pod numerem dostępu FERM BP-4434 na warunkach układu budapeszteńskiego (patrz nie zbadane japońskie zgłoszenie patentowe (Kokai) nr 7-196694).

Możliwość stosowania w przemyśle

Ponieważ chimeryczne, przeciwciało anty-HM 1.24 składa się z regionu zmiennego mysiego przeciwciała anty-HM 1.24 i stałego regionu przeciwciała ludzkiego, a przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24 składa się z regionu określającego dopasowanie mysiego przeciwciała anty-HM 1.24, regionu zrębowego ludzkiego przeciwciała orzz stałego regionu ludzkiego przeciwciała, posiada ono niską zntygeniczność wobec ludzi, z zatem oczekuje się, że będzie stosowane jZko kompozycja medyczna, zwłaszcza do leczenia szpiczaka.

Odnośnik do dostarczonych organizmów

Claims

1. Chimeryczny łańcuch L, obejmujący region stały (region C) ludzkiego łańcucha lekkiego (L), oraz region zmienny (V) łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24.

2. Chimeryczny łańcuch L według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha L ma sekwencję aminokwasowąjaką przedłożono w SEQ ID nr: 1.

3. Chimeryczny łańcuch L według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony region C ludzkiego łańcucha L jest Ck.

4. Chimeryczny łańcuch H, obejmujący region stały ludzkiego łańcucha ciężkiego (H) oraz region V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

5. Chimeryczny łańcuch H według zastrz. 4, znamienny tym, ze wymieniony region C łańcucha H ma sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 2.

6. Chimeryczny łańcuch H według zastrz. 4, znamienny tym, Że wymieniony region C ludzkiego łańcucha H jest Cy.

7. Chimeryczne przeciwciało obejmujące (1) łańcuch L, zawierający region C ludzkiego łańcucha L i region V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, oraz (2) łańcuch H, zawierający region C ludzkiego łańcucha H i region V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

8. Chimeryczne przeciwciało według zastrz. 7, znamienne tym, że wymieniony region V łańcucha L ma sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID Nr: 1, oraz wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID Nr: 2.

9. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24 obejmujący (1) region zrębowy (FR) regionu V ludzkiego łańcucha L, oraz (2) CDR regionu V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24.

10. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 9, znamienny tym, że wymieniony CDR ma sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez następujące sekwencje aminokwasowe:

CDR1: Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala (SEQ ID nr: 3)

CDR2: Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr (SEQ ID nr: 4)

CDR3: Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr (SEQ ID nr: 5)

11. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 10, znamienny tym, że wymieniony FR pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała ludzkiej podgrupy I (HSGI).

12. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 11, znamienny tym, że wymieniony FR pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała REI.

13. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 11, znamienny tym, że wymieniony FR jest zasadniczo taki sam jak FR ludzkiego przeciwciała REI.

14. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 11, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha L ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVLa w tabeli 1.

15. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24 obejmujący (1) FR regionu V ludzkiego łańcucha H, oraz (2) CDR regionu V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

16. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 15, znamienny tym, że wymieniony CDR ma sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez następujące sekwencje aminokwasowe:

187 642

CDR1: Pro Tyr Trp Met Gln (SEQ ID Nr: 6)

CDR2: Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly (SEQ ID Nr: 7)

CDR3: Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID Nr: 8).

17. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 16, znamienny tym, ze wymieniony FR pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała HSGI.

18. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 16, znamienny tym, że wymieniony FR 1-3 pochodzi od FR 1-3 ludzkiego przeciwciała HG3.

19. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 16, znamienny tym, ze wymieniony FR 1-3 jest zasadniczo taki sam jak FR 1-3 ludzkiego przeciwciała HG3, i wymieniony FR4 jest zasadniczo taki sam jak FR4 ludzkiego przeciwciała JH6.

20. Łańcuch H przekształconego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 16, znamienny tym, że aminokwas w pozycji 30 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR1 oznacza treoninę, aminokwas w pozycji 71 zgodnie definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza alaninę, i aminokwas w pozycji 78 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza alaninę.

21. Łańcuch H przekształconego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 16, znamienny tym, ze aminokwas w pozycji 73 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza lizynę.

22. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 17, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHl, RVHfm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr lub RVHs w tabeli 2 do 4.

23. Przekształcony ludzki łańcuch L przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujący (1) region C ludzkiego łańcucha L, oraz (2) region V łańcucha L, zawierający FR ludzkiego łańcucha L oraz CDR łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24.

24. Przekształcony ludzki łańcuch L według zastrz. 23, znamienny tym, że wymieniony region C ludzkiego łańcucha L jest ludzkim regionem Ck, wymieniony FR ludzkiego łańcucha L pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała HSGI, i wymieniony CDR łańcucha L ma sekwencję aminokwasową ukazaną w zastrz. 10.

25. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 23, znamienny tym, ze wymieniony FR pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała REI.

26. Region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 23, znamienny tym, Ze wymieniony Fr jest zasadniczo taki sam jak FR ludzkiego przeciwciała REI.

27. Przekstałcony ludzki łańcuch L według zastrz. 23, znamienny tym, ze wymieniony region V łańcucha L ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVLa w tabeli 3.

28. Przekształcony ludzki łańcuch H przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujący (1) region C ludzkiego łańcucha H, oraz (2) region V łańcucha H, zawierający FR ludzkiego łańcucha H oraz CDR łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

29. Przekształcony ludzki łańcuch H według zastrz. 28, znamienny tym, że wymieniony region C ludzkiego łańcucha H jest ludzkim regionem Cy1, wymieniony FR ludzkiego łańcucha H pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała HSGI, i wymieniony CDR łańcucha H ma sekwencję aminokwasową ukazaną w zastrz. 16.

30. Przekształcony ludkzi łańcuch H według zastrz. 28, znamienny tym, że wymieniony FR 1-3 pochodzi od FR 1-3 ludzkiego przeciwciała HG3 i wymieniony FR4 pochodzi od FR4 ludzkiego przeciwciała JH6.

31. Przekształcony ludzki łańcuch H według zastrz. 28, znamienny tym, że wymieniony FR 1-3 jest zasadniczo taki sam jak FR 1-3 ludzkiego przeciwciała hG3 i wymieniony FR4 jest zasadniczo taki sam jak FR4 ludzkiego przeciwciała JH6.

32. Łańcuch H przekształconego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 28, znamienny tym, że aminokwas w pozycji 30 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR1 oznacza treoninę, aminokwas w pozycji 71 zgodnie definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza

187 642 alaninę, i aminokwas w pozycji 78 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza alaninę.

33. Łańcuch H przekształconego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 28, znamienny tym, że aminokwas w pozycji 73 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza lizynę.

34. Przekształcony ludzki łańcuch H według zastrz. 28, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVH1, RVHfoi, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr lub RVHs w tabeli 2 do 4.

35. Przekształcone ludzkie przeciwciało przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujące (A) łańcuch L obejmujący (1) region C ludzkiego łańcucha L, oraz (2) region V łańcucha L, zawierający FR ludzkiego łańcucha L oraz CDR łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24, oraz (A) łańcuch 14 obejmujący (1) region C ludzkiego łańcucha H, oraz (2) region V łańcucha H, zawierający FR ludzkiego łańcucha H oraz CDR łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

36. Przekształcone ludzkie przeciwciało według zastrz. 35, znamienne tym, że wymieniony CDR łańcucha L ma sekwencję aminokwasową ukazaną w zastrz. 10, wymieniony CDR łańcucha H ma sekwencję aminokwasową ukazaną w zastrz. 16, wymieniony FR ludzkiego łańcucha L pochodzi od Fr przeciwciała HSGI, wymieniony FR ludzkiego łańcucha H pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała HSGI, wymieniony region C ludzkiego łańcucha H jest ludzkim regionem Ck, oraz wymieniony region C ludzkiego łańcucha H jest ludzkim regionem Cyi.

37. Przekształcone ludzkie przeciwciało według zastrz. 35, znamienne tym, że wymieniony FR łańcucha L pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała REI, wymieniony fR 1-3 łańcucha H pochodzi od ludzkiego przeciwciała HG3 i wymieniony FR4 łańcucha H pochodzi od FR4 ludzkiego przeciwciała JH6.

38. Przekształcone ludzkie przeciwciało według zastrz. 35, znamienne tym, że wymieniony region V łańcucha L ma sekwencję aminokwasową przedstawionąjako RVLa w tabeli 1.

39. Przekształcone ludzkie przeciwciało według zastrz. 35, znamienne tym, że wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHl, RVHfoi, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr lub RVHs w tabeli 2 do 4.

40. DNA, kodujący region V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24.

41. DNA, według zastrz. 41, znamienny tym, ze wymieniony region V łańcucha L koduje sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ iD nr: 1.

42. DNA, według zastrz. 41, znamienny tym, że DNA, któty koduje wymieniony region V łańcucha L ma sekwencję nukleotydowąjaką przedłożono w SEQ ID nr: 1.

43. DNA, kodujący region V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

44. DNA, według zastrz. 44, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha H koduje sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 2.

45. DNA, według zastrz. 44, znamienny tym, że DNA, któiy koduue wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję nukkotydow-ąjaką przedłożono w SEQ ID nr: 2.

46. DNA, kodujący chimeryczny łańcuch L, obejmujący:

(1) region C ludzkiego łańcucha L, oraz (2) region V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24.

47. DNA, według zastrz. 47, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha L koduje sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 1.

48. DNA, według zastrz. 47, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha L ma sekwencję nukleotydowąjaką przedłożono w SeQ ID nr: 1.

49. DNA, kodujący chimeryczny łańcuch L, obejmujący:

(1) region C ludzkiego łańcucha H, oraz (2) region V łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

187 642

50. DNA, według zastrz. 50, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha H koduje sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 2.

51. DNA, według zastrz. 50, znamienny tym, ze wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję nukleotydowąjakąprzedłożono w SEQ ID nr: 2.

52. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha L przeciwciała antyHM 1.24, obejmujący:

(1) FR regionu V ludzkiego łańcucha L, oraz (2) CDR regionu V łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24.

53. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 53, znamienny tym, że wymieniony cDr ma sekwencję aminokwasową ukazaną w zastrz. 10.

54. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 53, znamienny tym, że wymieniony FR pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała HSGI.

55. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 53, znamienny tym, ze wymieniony FR pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała REI.

56. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 53, znamienny tym, że wymieniony FR jest zasadniczo taki sam jak FR ludzkiego przeciwciała REI.

57. DNA według zastrz. 51, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha L koduje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVLa w tabeli 1.

58. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha L według zastrz. 53, który ma sekwencję nukleotydowąjakąprzedłozono w SEQ ID nr: 9.

59. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha H, obejmujący:

(1) FR regionu V ludzkiego łańcucha H, oraz (2) CDR regionu V łańcucha H przeciwciała anty- HM 1 24.

60. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 60, znamienny tym, że wymieniony CDr ma sekwencję aminokwasową ukazaną w zastrz. 16.

61. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 60, znamienny tym, że wymieniony FR pochodzi od FR ludzkiego przeciwciała HSGI.

62. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 60, znamienny tym, że wymieniony FR 1-3 pochodzi od FR 1-3 ludzkiego przeciwciała HG3.

63. DNA, kodujący region V przekształconego ludzkiego łańcucha H według zastrz. 60, znamienny tym, że wymieniony fR 1-3 jest zasadniczo taki sam jak FR 1-3 ludzkiego łańcucha HG3.

64. DNA, kodujący region V łańcucha H przekształconego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 60, znamienny tym, że aminokwas w pozycji 30 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR1 oznacza treoninę, aminokwas w pozycji 71 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza alaninę, i aminokwas w pozycji 78 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza alaninę.

65. DNA, kodujący region V łańcucha H przekształconego przeciwciała ludzkiego według zastrz. 60, znamienny tym, że aminokwas w pozycji 73 zgodnie z definicjami Kabata w wymienionym FR3 oznacza lizynę.

66. DNA, kodujący region V przekształconego łańcucha H według zastrz. 60, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHl, RVHfm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr lub RVHs w tabeli 2 do 4.

67. DNA, kodujący region V przekształconego łańcucha H według zastrz. 60, który ma sekwencję nukleotydową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 28 lub 102.

68. DNA, kodujący przekształcony ludzki łańcuch L przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujący:

(1) region C ludzkiego łańcucha L, oraz (2) region V ludzkiego łańcucha L, zawierającego FR ludzkiego łańcucha L i CDR łańcucha L przeciwciała anty-HM 1.24.

69. DNA, według zastrz. 69, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha L koduje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVLa w tabeli 1.

187 642

70. DNA według zastrz. 69, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha L ma sekwencję nukleotydową, jaką przedłożono w SEQ ID nr: 9.

71. DNA według zastrz. 69, znamienny tym, że wymieniony region C łańcucha L jest regionem Ck ludzkiego łańcucha L.

72. DNA, kodujący przekształcony ludzki łańcuch H przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujący:

(1) region C ludzkiego łańcucha H, oraz (2) region V ludzkiego łańcucha H, zawierającego FR ludzkiego łańcucha H i CDR łańcucha H przeciwciała anty-HM 1.24.

73. DNA, kodujący przekształcony ludzki łańcuch H według zastrz. 73, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję aminokwasową przedstawioną jako RVHf, RVHh, RVHi, RVHj, RVHk, RVHl, RVHfm, RVHn, RVHo, RVHp, RVHr lub RVHs w tabeli 2 do 4.

74. DNA, kodujący przekształcony ludzki łańcuch H według zastrz. 73, znamienny tym, że wymieniony region V łańcucha H ma sekwencję nukleotydową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 18,19, 20, 21, 22,23, 24, 25,28 lub 102.

75. DNA, kodujący przekształcony ludzki łańcuch H według zastrz. 73, znamienny tym, ze wymieniony region C ludzkiego łańcucha H jest regionem Cy1 ludzkiego łańcucha H.

76. Wektor, zawierający DNA według zastrz. 41, albo 42, albo 43, albo 44, albo 45, albo 46, albo 47, albo 48, albo 49, albo 50, albo 51, albo 52, albo 53, albo 54, albo 55, albo 56, albo 57, albo 58, albo 59, albo 61, albo 62, albo 63, albo 64, albo 65, albo 66, albo 67, albo 68, albo 69, albo70, 7lbo71, albo72, 7lbo 73, 7lbo74, 7lbo75, 7lbo 76.

77. Komórka gospodarza transformowana wektorem, zawierającym DNA według zastrz. 41 albo 42, albo 43, albo 44, albo 45, albo 46, albo 47, albo 48, albo 49, albo 50, albo 51, albo 52, albo 53, albo 54, albo 55, albo 56, albo 57, albo 58, albo 59, albo 61, albo 62, albo 63, albo 64, albo 65, albo 66, albo 67, albo 68, albo 69, albo 70, albo 71, albo 72, albo 73, albo 74, albo 75 albo 76.

78. Sposób wytwarzania chimerycznego przeciwciała przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujący etapy: hodowli komórki gospodarza kotransformowanej wektorem ekspresji, zawierającym DNA według zastrz. 41, albo 42, albo 43, albo 47, albo 48 albo 49, oraz wektorem ekspresji, zawierającym DNA według zastrz. 44, albo 45, albo 46, albo 50, albo 51, albo 52, oraz odzyskania żądanego przeciwciała.

79. Sposób wytwarzania przekształconego przeciwciała przeciwciała anty-HM 1.24, obejmujący etapy: hodowli komórki gospodarza kotransformowanej wektorem ekspresji, zawierającym DNA według zastrz. 54, albo 55, albo 56, albo 57, albo 58, albo 59, albo 69, albo 70, albo 71 albo 72, oraz wektorem ekspresji, zawierającym DNA według zastrz. 61, albo 62, albo 63, albo (61, albo 66, albo 66, allo 66, allb, 68, all» 69, allo 70, allo 7E allo Ί2, albo (3, all» (4. albo 75, albo 76, oraz odzyskania żądanego przeciwciała.

80. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca jako składnik aktywny chimeryczne przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w sEq ID nr: 103.

81. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca jako składnik aktywny chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24.

82. Środek terapeutyczny przeciw szpiczakowi, zawierający jako składnik aktywny chimeryczne przeciwciało, które rozpoznaje polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 103.

83. Środek terapeutyczny przeciw szpiczakowi, zawierający jako składnik aktywny chimeryczne przeciwciało anty-HM 1.24.

84. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca jako składnik aktywny przekształcone przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 103.

85. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca jako składnik aktywny przekształcone ludzkie przeciwciało anty-HM 1.24.

187 642

86. Środek terapeutyczny przeciw szpiczakowi, zawierający jako składnik aktywny przekształcone przeciwciało, które rozpoznaje polipeptyd, mający sekwencję aminokwasową jaką przedłożono w SEQ ID nr: 103.

87. Środek terapeutyczny przeciw szpiczakowi, zawierający jako składnik aktywny przekształcone przeciwciało anty-HM 1.24.