PL187923B1 - Wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny i jego zastosowanie - Google Patents
Wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny i jego zastosowanieInfo
- Publication number
- PL187923B1 PL187923B1 PL32910897A PL32910897A PL187923B1 PL 187923 B1 PL187923 B1 PL 187923B1 PL 32910897 A PL32910897 A PL 32910897A PL 32910897 A PL32910897 A PL 32910897A PL 187923 B1 PL187923 B1 PL 187923B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hemoglobin
- solution
- total
- weight
- polymerized
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 title claims description 21
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims abstract description 214
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims abstract description 214
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 206
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 39
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 39
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 28
- 108010076770 hemoglobin polymer Proteins 0.000 claims description 25
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 19
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 14
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 13
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- 108010011424 polyhemoglobin-pyridoxal-5-phosphate Proteins 0.000 claims description 11
- 108010003320 Carboxyhemoglobin Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 claims description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 8
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 7
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 7
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 7
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 claims description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 7
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 6
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003635 deoxygenating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 51
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 12
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 11
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 10
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 9
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 9
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 9
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 239000004696 Poly ether ether ketone Substances 0.000 description 6
- JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N benzene-1,4-diol;bis(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 6
- 229920002530 polyetherether ketone Polymers 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 108010001708 stroma free hemoglobin Proteins 0.000 description 5
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 5
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 5
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 4
- 108010064719 Oxyhemoglobins Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 201000001505 hemoglobinuria Diseases 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 2
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010002255 deoxyhemoglobin Proteins 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PREOBXYMXLETCA-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-carboxyphenoxy)-4-oxobutanoyl]oxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1OC(=O)CCC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O PREOBXYMXLETCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 208000032456 Hemorrhagic Shock Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 229940021013 electrolyte solution Drugs 0.000 description 1
- 238000002146 exchange transfusion Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000018875 hypoxemia Diseases 0.000 description 1
- -1 i.e. Proteins 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000005980 lung dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- AJDUTMFFZHIJEM-UHFFFAOYSA-N n-(9,10-dioxoanthracen-1-yl)-4-[4-[[4-[4-[(9,10-dioxoanthracen-1-yl)carbamoyl]phenyl]phenyl]diazenyl]phenyl]benzamide Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2NC(=O)C(C=C1)=CC=C1C(C=C1)=CC=C1N=NC(C=C1)=CC=C1C(C=C1)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC2=C1C(=O)C1=CC=CC=C1C2=O AJDUTMFFZHIJEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002103 osmometry Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036325 urinary excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001043 yellow dye Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Surgery (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1 . W odny roztw ór polim eryzow anej aldehydem glutarow ym hem oglobiny, z n a m ie n n y tym , ze zaw iera tetram er w ilosci co n ajwyzej 0,8% w agow o w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej w roztw orze, oraz hem oglobine, która w ykazuje dystrybucje m asy czasteczkow ej w ynoszaca 10 - 24% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w ynoszacej 128000, w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej, 18 - 30% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w ynoszacej 192000, w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej, 45 - 10% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej 2560 0 0 w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej. 14 Sposób w ytw arzania roztw oru pirydoksylow anej, polim eryzow anej hem oglobiny zaw ierajacej okolo 16% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w ynoszacej 128000, okolo 26% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w yno- szacej 192000 1 okolo 58% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w ynoszacej 2 56000, przy czym zaw artosc pro- centow a poszczególnych polim erów hem oglobiny podano w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej, który to roztw ór m ozna podaw ac pacjentow i-czlow iekow i - w ilosci do okolo 3 I bez pow odow ania pogorszenia w ydolnosci nerek, z n a m ie n n y tym , ze (a) z m ieszaniny zaw ierajacej czerw one cialka krwi usuw a sie leukocyty za p om oca filtracji przez filtr o m inim alnym srednim w ym iarze porów dostatecznym do uniem ozliw ienia przechodzenia leukocytów , (b) czerw one cialka poddaje sie lizie; (c) do produktu z etapu (b) dodaje sie tlenek w egla i ogrzew a sie do tem peratury 6 0 -6 2 °C przez okolo 10 godzin, z w ytw orze- niem poddanego obróbce cieplnej roztw oru hem oglobiny; (d) poddany obróbce cieplnej roztw ór hem oglobiny z etapu (c) filtruje sie usuw ajac zreby 1 zanieczyszczenia zrebow e, które ule- gly w ytraceniu podczas ogrzew ania, (e) poddany obróbce cieplnej roztw ór hem oglobiny odgazow uje sie przez rozproszenie tlenu i nastepnie przez roztw ór poddany obróbce cieplnej w tem peraturze okolo 10°C rozprasza sie azot z w ytw orzeniem piany 1 odgazow anego roztw oru poddanego obróbce cieplnej, (f) odgazow any roztw ór poddaje sie pirydoksylacji; (g) roztw ór pirydoksylow anej hem oglobiny poddaje sie polim eryzacji, (h) roztw ór pirydoksylow anej, polim eryzow anej hem oglobiny z etapu (g) natlenia sie, ( 1 ) roztw ór z etapu (h) oczyszcza sie usuw ajac z roztw oru hem oglobine tetram eryczna i zbiera sie oczyszczona polim eryzow ana hem oglobine p irydoksylow ana przy czym roztw ór ten zaw iera m niej niz 0,8% w agow o tetram eru hem oglobiny w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej, (j) roztw or oczyszczonej polim eryzow anej hem oglobiny pirydoksylow anej z etapu ( 1 ) odtlenia sie, (k) poziom pH 1 elektrolitów w roztw orze oczyszczonej polim eryzow anej hem oglobiny pirydoksylow anej doprow adza sie do w artosci fizjologicznych PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny i zastosowanie. Wodny roztwór hemoglobiny jest namiastką krwinek czerwonych, a więc bezkomórkową namiastką krwinek czerwonych, zawierającą w zasadzie wolny od tetramerów, usieciowany, polimeryzowany, roztwór hemoglobiny, wolny od zanieczyszczeń zrębowych.
Banki krwi od wielu lat dostarczają krwi pełnej do zastępowania własnej krwi pacjenta w czasie zabiegu chirurgicznego, po urazie lub w innych sytuacjach. Jednakże krew pełna uzyskiwana od dawców krwi nie nadaje się do pewnych zastosowań. Zastosowanie krwi pełnej nastręcza trudności zwłaszcza z powodu konieczności odpowiedniego doboru dawcy oraz z powodu problemów ze stabilnością i przechowywaniem produktów, jak również toksyczną spowodowaną wirusami i innymi substancjami zanieczyszczającymi. Problemy te mają szczególne znaczenie w sytuacjach nagłych, na przykład przy stosowaniu krwi przez siły zbrojne. W związku z tym włożono dużo wysiłku w opracowanie namiastek krwi pełnej uzyskiwanej od dawców krwi. Wynikiem tych wysiłków są rozmaite modyfikacje krwi pochodzącej od ludzi lub innych ssaków. Ze stanu techniki wiadomo, że hemoglobina pozbawiona zrębu ma właściwości transportu tlenu i odwracalnego wiązania z tlenem (lub ligandem). Ponieważ problemy z toksycznością uniemożliwiają zastosowanie hemoglobiny pozbawionej zrębu jako namiastki krwi, produkt ten wymaga dalszych modyfikacji dla opracowania nietoksycznego, korzystnego produktu farmaceutycznego.
Modyfikacje te obejmują (1) całkowite lub w zasadzie całkowite pozbawienie hemoglobiny zrębu i zrębowych substancji zanieczyszczających (2) pirydoksylację (3) polimeryzację lub usieciowanie (4) usuwanie tetrameru (5) modyfikację tlenkiem węgla lub innymi ligandami.
Jednakże roztwory hemoglobiny, wytworzone tymi sposobami, zdolne do przenoszenia tlenu w ilości dostatecznej do podtrzymania życia, wykazują liczne niepożądane działania i właściwości. Na przykład głównym działaniem niepożądanym jest zmniejszenie wydolności nerek. Uważano, że zmiany te związane są z obecnością niepożądanych substancji zanieczyszczających, takich jak endotoksyny bakteryjne lub fragmenty błon krwinek czerwonych (zrąb). Jakkolwiek takie substancje zanieczyszczające rzeczywiście powodują zaburzenia czynności
187 923 nerek, zastosowanie roztworów hemoglobiny w zasadzie wolnych od tych substancji zanieczyszczających również powoduje istotne zaburzenia czynności nerek. Zaburzenia czynności nerek przypisuje się obecności niepolimeryzowanego tetrameru hemoglobiny w ilości fizjologicznie niedopuszczalnej. Inne niepożądane działania wlewu hemoglobiny tetramerycznej obejmują skurcz naczyń, hemoglobinurię (wydalanie hemoglobiny z moczem), zmniejszenie częstości akcji serca, wzrost średniego ciśnienia tętniczego krwi oraz wynaczynienie podawanej substancji, zwłaszcza do jamy otrzewnej.
W praktyce żadna z obecnie znanych namiastek krwi, pochodnych hemoglobiny, nie umożliwiła całkowitego uniknięcia problemów toksyczności. Również czas półtrwania tych produktów po podaniu ich pacjentowi jest niedopuszczalnie krótki. Taki czas półtrwania wymaga wymiany objętości krwi w krótkich odstępach czasu. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania takich produktów hemoglobinowych nietoksycznych dla pacjentów, których czas półtrwania po podaniu jest dostatecznie długi. Oczywiście produkty te muszą być zdolne do odwracalnego transportu tlenu do tkanek w podobny sposób, jak krew pełna.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US-5464814 ujawniono sposób wytwarzania polimeru hemoglobiny o wąskim zakresie masy cząsteczkowej, przy czym średnia wynosi około 120000 (patrz kolumna 6, wiersze 32-38). Stwierdzono, że produkt ten jest nietoksyczny i zasadniczo wolny od tetramerów.
W europejskim opisie patentowym nr EP-361720 ujawniono roztwór hemoglobiny oparty na substytucie krwi otrzymanym z wolnej od zrębu hemoglobiny na drodze procesu, który jest inny od sposobu według niniejszego rozwiązania (patrz, str. 3, wiersze 29-46; str. 5, wiersze 1-7; i str. 6, wiersze 15-55). Polimeryzacja hemoglobiny PLP-TS musi być prowadzona beztlenowo (patrz, str. 5, wiersze 1-32). W opisie tym nie ujawniono dystrybucji masy cząsteczkowej ani zawartości tetrameru w polimeryzowanym produkcie.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US-5194590 ujawniono nietoksyczny roztwór, zasadniczo wolnej od tetrameru, usieciowanej, polimeryzowanej hemoglobiny, która jest wolna od zrębu i innych zanieczyszczeń oraz sposób wytwarzania tego roztworu. Dystrybucja masy cząsteczkowej produktu, oparta na HPLC, wydaje się wynosić 120000-600000. Średnia masa cząsteczkowa wynosi około 120000 (patrz, kolumna 15, wiersze 10-30). Około 58% ma masę cząsteczkową wynoszącą 12000, 26% ma masę cząsteczkową wynoszącą 192000, 11% ma masę cząsteczkową wynoszącą 32000. Tak więc, dystrybucja masy cząsteczkowej jest inna od produktu według niniejszego rozwiązania.
Przedmiotem wynalazku jest wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, który według wynalazku zawiera tetramer w ilości co najwyżej 0,8% wagowo w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej w roztworze, oraz hemoglobinę, która wykazuje dystrybucję masy cząsteczkowej wynoszącą
- 24% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000 w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;
- 30% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;
- 70% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej 256000 w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej.
Korzystnie, roztwór dodatkowo zawiera (a) całkowitą hemoglobinę w ilości 9,5 - 12,0 g/dl;
(b) całkowitą methemoglobinę w ilości mniejszej niż 8% całkowitej hemoglobiny;
(c) całkowitą karboksyhemoglobinę w ilości mniejszej niż 5% całkowitej hemoglobiny;
(d) stężenie sodu wynoszące 135 - 155 mmola/1;
(e) stężenie potasu wynoszące 3,5 - 4,5 mmol/1;
(f) stężenie chlorku wynoszące 85 - 110 mmol/kg;
Korzystnie, roztwór według wynalazku zawiera (g) całkowite wolne żelazo w ilości mniejszej niż 2,0 ppm;
(h) całkowity tetramer w ilości mniejszej niż 0,8% wagowo w stosunku do hemoglobiny całkowitej;
187 923 (i) endotoksynę w ilości mniejszej niż 0,03 EU/1.
Korzystnie, roztwór według wynalazku dodatkowo zawiera (j) fosfolipidy w ilości mniejszej niż 50 ng/Hb; i (k) glikolipidy w ilości mniejszej niż 2 ng/Hb.
Korzystnie, roztwór według wynalazku wykazuje osmolalność wynoszącą 280 - 360 mmol/kg.
Korzystnie, roztwór według wynalazku wykazuje dysocjację tlen - hemoglobina wynoszącą 31 - 43 hPa.
Korzystnie, roztwór według wynalazku wykazuje czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 15 godzin.
Korzystnie, roztwór według wynalazku wykazuje czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 24 godziny.
Korzystnie, roztwór według wynalazku można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi
- w ilości do około 5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek.
Korzystnie, roztwór według wynalazku można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi
- w ilości do około 5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek, oraz tym, że czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 24 godziny.
Korzystnie, roztwór według wynalazku zawiera (a) całkowitą hemoglobinę w ilości 9,5 - 12,0 g/dl;
(b) całkowitą methemoglobinę w ilości mniejszej niż 8% całkowitej hemoglobiny;
(c) całkowitą karboksyhemoglobinę w ilości mniejszej niż 5% całkowitej hemoglobiny;
(d) dysocjację tlen - hemoglobina wynoszącą 31 - 43 hPa;
(e) osmolalność wynoszącą 280 - 360 mmol/kg;
(f) stężenie sodu wynoszące 135 - 155 mmol/1;
(g) stężenie potasu wynoszące 3,5 - 4,5 mmol/1;
(h) stężenie chlorku wynoszące 85 - 110 mmol/kg;
(i) całkowite wolne żelazo w ilości mniejszej niż 2,0 ppm;
(j) 10 - 24% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 128000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;
(k) 18 - 30% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;
(l) 45 - 70% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 256000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;
(m) całkowitą ilość tetrameru mniejszą niż 0,8%;
(n) endotoksynę w ilości mniejszej niż 0,03 EU/1;
(o) fosfolipidy w ilości mniejszej niż 50 ng/Hb;
(p) glikolipidy w ilości mniejszej niż 2 ng/HB.
Korzystnie, roztwór według wynalazku, w postaci preparatu, zawiera około 16% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, około 26% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 192000 i około 58% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 256000, przy czym wszystkie procenty podano w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej.
Korzystnie, roztwór według wynalazku można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi
- w ilości do około 1,5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny zawierającej około 16% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, około 26% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 i około 58% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 256000, przy czym zawartość procentową poszczególnych polimerów hemoglobiny podano w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, który to roztwór można podawać pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 3 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek, który według wynalazku polega na tym, że
187 923 (a) z mieszaniny zawierającej czerwone ciałka krwi usuwa się leukocyty za pomocą filtracji przez filtr o minimalnym średnim wymiarze porów dostatecznym do uniemożliwienia przechodzenia leukocytów;
(b) czerwone ciałka poddaje się lizie;
(c) do produktu z etapu (b) dodaje się tlenek węgla i ogrzewa się do temperatury 60-62°C przez około 10 godzin, z wytworzeniem poddanego obróbce cieplnej roztworu hemoglobiny;
(d) poddany obróbce cieplnej roztwór hemoglobiny z etapu (c) filtruje się usuwając zręby i zanieczyszczenia zrębowe, które uległy wytrąceniu podczas ogrzewania;
(e) poddany obróbce cieplnej roztwór hemoglobiny odgazowuje się przez rozproszenie tlenu i następnie przez roztwór poddany obróbce cieplnej w temperaturze około 10°C rozprasza się azot z wytworzeniem piany i odgazowanego roztworu poddanego obróbce cieplnej;
(f) odgazowany roztwór poddaje się pirydoksylacji;
(g) roztwór pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji;
(h) roztwór pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny z etapu (g) natlenia się;
(i) roztwór z etapu (h) oczyszcza się usuwając z roztworu hemoglobinę tetrameryczną i zbiera się oczyszczoną polimeryzowaną hemoglobinę pirydoksylowaną, przy czym roztwór ten zawiera mniej niż 0,8% wagowo tetrameru hemoglobiny w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;
(j) roztwór oczyszczonej polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej z etapu (i) odtlenia się;
(k) poziom pH i elektrolitów w roztworze oczyszczonej polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej doprowadza się do wartości fizjologicznych.
Korzystnie, sposób według wynalazku polega na tym, że hemoglobinę polimeryzuje się aldehydem glutarowym.
Korzystnie, sposób według wynalazku polega na tym, że dodatkowo (al) przeterminowaną lub nieprzeterminowaną krew przepuszcza się przez odpowiednie urządzenie aspirujące pod zredukowanym ciśnieniem, z wytworzeniem mieszaniny zawierającej czerwone ciałka krwi;
(a2) w atmosferze tlenku węgla, produkt z etapu (b) przemywa się 1 % roztworem chlorku sodu z wytworzeniem roztworu hemoglobiny o pH 6,0 - 6,5;
i przemyty roztwór z etapu (a2) rozcieńcza się wodą z wytworzeniem roztworu komórek lizowanych;
roztwór lizowanych komórek filtruje się przez filtr z wytworzeniem roztworu hemoglobiny wolnej od zanieczyszczeń zrębowych i materiału ścianek komórkowych;
odgazowany roztwór pirydoksyluje się za pomocą pirydoksalo-5'-fosforanu w stosunku molowym pirydoksalo-5'-fosforanu do hemoglobiny wynoszącym od 1:1 do 3:1, z wytworzeniem pirydoksylowanej hemoglobiny;
roztwór pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji za pomocą wodnego roztworu aldehydu glutarowego z wytworzeniem roztworu polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej o dystrybucji masy cząsteczkowej wynoszącej około 65-75% polimeru i 25-35% tetrameru;
i oczyszczoną, polimeryzowaną hemoglobinę pirydoksylowaną odtlenia się za pomocą azotu.
Wyżej zdefiniowany wodny roztwór hemoglobiny jest przeznaczony do stosowania jako lek do leczenia pacjenta cierpiącego z powodu utraty krwi.
Tak więc, przedmiotem niniejszego wynalazku są namiastki hemoglobiny, nietoksyczne dla ludzi, przy czym ich czas półtrwania jest dostatecznie długi i wynosi co najmniej 15 godzin po podaniu człowiekowi. Produkty hemoglobinowe według niniejszego wynalazku są pozbawione zrębu, pirydoksylowane i polimeryzowane, jak również wolne od wirusowych i innych substancji zanieczyszczających. Ponadto produkty te są w zasadzie wolne od leukocytów (krwinek białych) i płytek krwi.
Tak więc, zakresem niniejszego wynalazku objęte są sposoby wytwarzania namiastek hemoglobiny według niniejszego wynalazku. Sposoby te obejmują usuwanie leukocytów i płytek
187 923 z krwi; płukanie i poddawanie lizie krwinek czerwonych; usuwanie zanieczyszczeń zrębowych i zrębu poprzez filtrację i obróbkę cieplną; wytwarzanie dezoksylowanej postaci hemoglobiny; pirydoksylację i polimeryzację; dalsze oczyszczanie i zatężanie; usuwanie tlenu. Powstały produkt hemoglobinowy można wytwarzać w takiej postaci, aby zapewnić produkt hemoglobinowy, w którym poziom elektrolitów pozostaje w granicach normy fizjologicznej.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również wodny preparat pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny, przy czym hemoglobina stanowi hemoglobinę polimeryzowaną aldehydem glutarowym, zawierającą materiał tetrameryczny o profilu masy cząsteczkowej przedstawionym na fig. 3. Preparat ten można stosować do wytwarzania bezkomórkowej namiastki krwinek czerwonych. Według tej cechy wynalazku, preparat najpierw oczyszcza się w celu usunięcia tetrameru, a następnie łączy z odpowiednią ilością elektrolitów dla wytworzenia fizjologicznej dopuszczalnej bezkomórkowej namiastki krwinek czerwonych, którą można następnie stosować do leczenia pacjentów (ludzi), wymagających wlewu nośnika tlenu.
Wynalazek ilustruje rysunek, na którym:
fig. 1 stanowi schematyczny diagram, przedstawiający część sposobu i wyposażenia, stosowanego w celu wytwarzania odtlenionego roztworu hemoglobiny, gotowego do pirydoksylacji i polimeryzacji;
fig. 2 stanowi schematyczny diagram, przedstawiający część sposobu i wyposażenia do obróbki rozpoczynającej się od pirydoksylacji i polimeryzacji, w wyniku której uzyskuje się odtleniony, oczyszczony, pirydoksylowany, polimeryzowany produkt hemoglobinowy oraz część sposobu i urządzenia, stosowanego do wytwarzania z ostatecznego produktu hemoglobinowego preparatu o fizjologicznym poziomie elektrolitów;
fig. 3 stanowi obraz HPLC polimeryzowanego materiału po obróbce glicyną, przed oczyszczeniem. Produkt polimeryzowany wskazują piki w czasie retencji (RT) 15,57, 16,08, 17,00 i 18,19. Materiał tetrameryczny wskazują piki w RT 19,88 i 20,51. Polimer stanowi 76,2% tego materiału;
fig. 4 stanowi obraz HPLC produktu hemoglobinowego według niniejszego wynalazku. Produkt polimeryzowany wskazują piki w RT 15,7, 16,33, 17,32 i 18,56. Tetramer wskazuje pik w rT 21,18;
fig. 5 stanowi schematyczny diagram, przedstawiający sposób oczyszczania przez chromatografię kolumnową według niniejszego wynalazku;
fig. 6 stanowi schematyczny diagram, przedstawiający sposób oczyszczania przez filtrację membranową według niniejszego wynalazku.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest bezkomórkowa namiastka krwinek czerwonych, zawierająca w zasadzie wolną od tetramerów, usieciowaną, polimeryzowaną, pirydoksylowaną hemoglobinę, wolną od zrębu, zanieczyszczeń zrębowych i innych substancji zanieczyszczających.
W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „usieciowana” oznacza chemiczne umieszczenie „mostków” cząsteczkowych na cząsteczce lub w cząsteczce, lub pomiędzy cząsteczkami, w celu zmiany kształtu, wielkości, czynności lub charakterystyki fizycznej cząsteczek. Cząsteczki usieciowane mogą być polimeryzowane lub niepolimeryzowane, to znaczy cząsteczki usieciowane mogą być tetrameryczne.
W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „tetramer” oznacza cząsteczki hemoglobiny o masie cząsteczkowej około 64 Kd; to znaczy, że pojęcie to odnosi się zarówno do natywnych, jak i wewnątrzcząsteczkowo usieciowanych cząsteczek hemoglobiny.
W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „w zasadzie wolny od tetrameru” oznacza taki poziom czystości w odniesieniu do zanieczyszczenia tetramerem, w którym nie stwierdza się pewnych reakcji biologicznych na tetramer podawany ssakowi. Głównym kryterium jest nieobecność zaburzeń czynności nerek przy podawaniu produktu we wlewie w ilościach farmaceutycznie skutecznych, to znaczy jest to poziom czystości wynoszący około 99% lub więcej (czyli obecne jest poniżej 1% tetrameru). Korzystny produkt według niniejszego wynalazku zawiera nie więcej niż około 0,8% tetrameru w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej (THb). Innymi słowy, w zasadzie wolny od tetrameru produkt według niniejszego wynalazku zawiera niepolimeryzowany tetramer hemoglobiny w ilości nie przekraczającej ilości fizjologicznie
187 923 dopuszczalnej. Szczególnie korzystne produkty według niniejszego wynalazku zawierają poniżej około 0,5% tetrameru; najbardziej korzystne produkty według niniejszego wynalazku zawierają około 0,3-0,4% tetrameru. Stwierdzono, że taka ilość tetrameru jest fizjologicznie dopuszczalna.
W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcia „produkt ultraoczyszczony” lub „produkt oczyszczony” mają to samo znaczenie, co pojęcie „w zasadzie wolny od tetrameru”.
W rozumieniu niniejszego opisu, % hemoglobiny całkowitej (THb) definiuje się jako ilość gramów hemoglobiny na 100 ml roztworu.
W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „roztwór polimeryzujący” oznacza roztwór zawierający środek „usieciowujący” lub „polimeryzujący”, taki jak aldehyd glutarowy, imidoestry, diaspiryna lub inny, w biochemicznie odpowiednim nośniku.
W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „polimeryzowany” oznacza umieszczenie mostków cząsteczkowych między cząsteczkami lub podjednostkami tetramerycznymi, przy czym dochodzi do zwiększenia wielkości i masy powstałej polimeryzowanej cząsteczki w stosunku do hemoglobiny natywnej lub tetramerycznej. Hemoglobina polimeryzowana nie jest hemoglobiną tetrameryczną.
Za „roztwór hemoglobiny” w rozumieniu niniejszego opisu uważa się roztwór hemoglobiny tetramerycznej lub polimeryzowanych cząsteczek hemoglobiny, przy czym cząsteczki nie znajdują się wewnątrz krwinki czerwonej. Taki roztwór nie musi być wolny ani w zasadzie wolny od zrębu krwinek czerwonych lub zanieczyszczeń zrębowych. Jednakże korzystne roztwory polimeryzowanej hemoglobiny są wolne od zrębu krwinek czerwonych i zanieczyszczeń zrębowych.
Pojęcie „błona półprzepuszczalna” oznacza błonę przepuszczalną dla niektórych rodzajów cząsteczek i nieprzepuszczalną dla innych, i, między innymi, błonę działającą jako wybiórczy filtr wykluczający cząsteczki o pewnej masie cząsteczkowej.
Produkt wytwarzany sposobem według niniejszego wynalazku, roztwór polimeryzowanej pirydoksylowanej hemoglobiny, w zasadzie wolnej od tetramerycznej (natywnej, usieciowanej wewnątrzcząsteczkowo) hemoglobiny, zrębowych i różnych innych substancji zanieczyszczających, wytworzony z hemoglobiny tetramerycznej, poddanej obróbce cieplnej i inaktywacji wirusów, jest dopuszczalny fizjologicznie i korzystny w zastosowaniach terapeutycznych i klinicznych. Produkt wykazuje odwracalną zdolność wiązania tlenu, niezbędną dla właściwości transportu tlenu. W szczególności, produkt wykazuje dobrą charakterystykę ładowania i rozładowywania przy zastosowaniu, co koreluje z tym, że jego krzywa dysocjacji tlenu-hemoglobiny (P5o) jest podobna, jak krwi pełnej. Produkt wiąże się z tlenem z dużym powinowactwem, w naczyniach włosowatych płuc, i następnie odpowiednio uwalnia tlen w tkankach organizmu. Zastosowanie produktu nie wymaga również badania zgodności z biorcą.
Produkt wykazuje również po podaniu ludziom czas półtrwania wynoszący co najmniej około 15 godzin, korzystniej, około 24 godziny. Niniejszy produkt hemoglobinowy można podawać we wlewie pacjentom do 3,0 1, a nawet do 5,0 1. Innymi słowy, produkt hemoglobinowy według niniejszego wynalazku można stosować do zastąpienia w zasadzie całej objętości krwi pacjenta (człowieka) bez powodowania skurczu naczyń, toksycznego wpływu na nerki, hemoglobinurii ani innych problemów związanych z dożylnym podawaniem syntetycznych lub półsyntetycznych nośników tlenu i namiastek krwi. Tak więc zakresem niniejszego wynalazku objęty jest sposób dokonywania przetoczenia pacjentowi, korzystnie, człowiekowi, pewnej ilości wolnego od zrębu, wolnego od tetrameru, polimeryzowanego, pirydoksylowanego produktu hemoglobino wego, nietoksycznego dla pacjenta, w ilości co najmniej około 5 1. Sposób ten obejmuje podłączenie pacjenta do urządzenia infuzyjnego lub innego podobnego urządzenia do wykonania wlewu łub przetoczenia u pacjenta.
Sposób według niniejszego wynalazku jest unikalny, ponieważ pozwala wytworzyć produkt, w którym poziom tetrameru nie przekracza około 1%, korzystniej, nie przekracza 0,8% masy całkowitej hemoglobiny w roztworze. Sposób według niniejszego wynalazku jest również korzystny, ponieważ produkt ostateczny jest w zasadzie wolny od antygenów i patogenów drobnoustrojów i wirusów. Takie antygeny i patogeny drobnoustrojów i wirusów są ograniczone do poziomu niewykrywalnego, to znaczy, że produkt jest jałowy przy przeprowadzeniu
187 923 analizy w sposób określony w Farmakopei Stanów Zjednoczonych, XXIII rozdział <Ί\>. Przykłady takich antygenów i patogenów stanowią na przykład bakterie, riketsje, grzyby, pierwotniaki, wirusy i inne drobnoustroje. Co najważniejsze, sposób zapewnia produkt biologiczny wolny od wirusów wywołujących wirusowe zapalenie wątroby i zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS).
W odniesieniu do właściwości fizjologicznych, produkt biologiczny według niniejszego wynalazku przy podawaniu go w postaci wlewu w ilościach do co najmniej 5 1, nie powoduje skurczu naczyń, toksycznego wpływu na nerki, hemoglobinurii ani innych problemów, pojawiających się przy dożylnym podawaniu znanych roztworów hemoglobiny, zawierających fizjologicznie niekorzystnie ilości hemoglobiny tetramerycznej. Podawanie dożylne produktu wytwarzanego niniejszym sposobem nie powoduje istotnego zmniejszenia wytwarzania moczu, istotnego zmniejszenia prędkości filtracji kłębuszkowej, istotnego wynaczynienia do jamy otrzewnej ani istotnej zmiany zabarwienia wytwarzanego moczu.
Tak więc, sposób według niniejszego wynalazku zapewnia bezkomórkową namiastkę krwinek czerwonych, korzystną w leczeniu urazów, zawału mięśnia serca, udaru, ostrego niedokrwienia i zaburzeń związanych z niedoborem tlenu, takich jak hipoksemia i hipoksja, lub końcowe stadia hipoksji spowodowane zaburzeniami czynności lub niewydolnością płuc, to znaczy niezdolnością do pełnego natlenienia krwi. Produkt jest również korzystny w leczeniu wszystkich chorób i stanów, wymagających podawania płynów (w celu resuscytacji) (na przykład uraz, a zwłaszcza wstrząs krwotoczny), podania płynów w celu wypełnienia łożyska naczyniowego lub transfuzji wymiennej. Oprócz zastosowania w leczeniu produkt może być korzystny w konserwacji narządów do przeszczepów.
Sposób według niniejszego wynalazku obejmuje następujące etapy:
1. aspiracj a i filtracj a krwinek czerwonych
2. płukanie/liza komórek
3. obróbka cieplna
4. zatężanie przez ultrafiltrację
5. odgazowywanie
6. modyfikacja chemiczna
7. oczyszczanie
8. wielokrotne zatężanie UP
9. odtlenianie
10. wytwarzanie preparatu
Korzystny materiał początkowy w sposobie według niniejszego wynalazku stanowi przeterminowana ludzka krew pełna lub koncentrat krwinek czerwonych (masa erytrocytama). Można również stosować krew nieprzeterminowaną. Korzystnie, w niniejszym procesie nie stosuje się krwi pełnej przechowywanej ponad dwa tygodnie po upływie terminu ważności wskazanego na opakowaniu. Zastosowanie krwi pełnej przeterminowanej o ponad dwa tygodnie powoduje dodatkowe trudności w ekstrakcji hemoglobiny i usuwaniu resztek komórkowych, takich jak białka zrębu i substancje zanieczyszczające.
Wszystkie sposoby opisane w niniejszym wynalazku odnoszą się również do krwi innych ssaków, przy zastosowaniu ewentualnie niewielkich modyfikacji, znanych specjalistom. Większość etapów przeprowadza się w temperaturze od około 2 do około 8°C, korzystnie około 4°C.
W czasie aspiracji i filtracji krwinek czerwonych krwinki czerwone w warunkach jałowych ekstrahuje się z woreczków, do których krew została pobrana od dawcy, bez wprowadzania powietrza do krwi, i przepuszcza przez serię filtrów dla uzyskania zawiesiny krwinek czerwonych o zmniejszonej zawartości leukocytów i płytek krwi. Powstałą zawiesinę poddaje się następnie płukaniu i lizie komórek.
Zawiesinę płucze się w atmosferze tlenku węgla około 1% roztworem NaCl dla usunięcia pozostałych białek osocza. Przepłukane krwinki czerwone traktuje się następnie wodą do wstrzyknięć dla uzyskania lizy komórek, a powstałą mieszaninę klaruje się urządzeniem do filtracji o skrzyżowanym przepływie. Sklarowany produkt poddaje się następnie obróbce cieplnej w celu strącenia dodatkowego materiału zrębowego, który usuwa się przez filtrację.
187 923
Produktem tego etapu jest roztwór wolnej od zrębu hemoglobiny (SFH), której THb wynosi około 3% (stężenie wagowe). Po obróbce cieplnej roztwór wolnej od zrębu hemoglobiny, zawierający karboksyhemoglobinę, zatęża się i odgazowuje w celu uzyskania roztworu SFH zawierającego dezoksyhemoglobinę. Odgazowanie obejmuje pierwszy etap saturacji roztworu karboksyhemoglobiny tlenem przez około 16 godzin dla wytworzenia roztworu zawierającego utlenowaną hemoglobinę i około 7% wagowo, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, karboksyhemoglobiny. Następnie tlen usuwa się azotem, argonem lub helem dla wytworzenia roztworu zawierającego wolną hemoglobinę, to znaczy hemoglobinę nie związaną w kompleksach i około 7% wagowo w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej oksyhemoglobiny. Powstały odgazowany roztwór filtruje się i przenosi do naczynia dla modyfikacji chemicznej.
Po odgazowaniu roztwór wolnej od zrębu hemoglobiny poddaje się pirydoksylacji, stosując pirydoksalo-5'-fosforan (P5P) w stosunku molowym pirydoksalo-5'-fosforanu do hemoglobiny około 1:1-3:1. Zamiast tego wolną od zrębu hemoglobinę można pirydoksylować, stosując 2-Nor-2-formylopirydok.salo-5’-fosforan. Do mieszaniny pirydoksylującej dodaje się środek redukujący, taki jak cyjanoborowodorek sodowy lub, korzystnie, borowodorek sodowy. Nadmiar odczynników i soli usuwa się poprzez dializę przeciwko apirogennej wodzie lub, korzystnie, poprzez diafiltrację wodą do wstrzyknięć. Hemoglobinę pirydoksylowaną polimeryzuje się następnie z roztworem aldehydu glutarowego.
Roztwór wolnej od zrębu, pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji z zastosowaniem wodnego roztworu aldehydu glutarowego. Czas trwania polimeryzacji i ilość dodanego aldehydu glutarowego zależą od objętości roztworu hemoglobiny, pożądanej wydajności uzyskiwania polimeru i pożądanej dystrybucji masy cząsteczkowej. Na ogół dłuższy czas polimeiyzacji zwiększa wydajność i dystrybucję masy cząsteczkowej polimerów. Wydajność około 75% wagowo polimerów w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej uzyskuje się w czasie około 16-18 godzin. Korzystny koniec polimeryzacji definiuje się jako ten moment, w którym roztwór zawiera około 75% wagowo polimerów w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, co monitoruje się poprzez HPLC zależną od wielkości cząstki. Zamiast tego koniec definiuje się jako ten moment, w którym roztwór zawiera około 65% polimerów w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, to znaczy około 2,5 godziny. Reakcję polimeryzacji chłodzi się poprzez dodanie wodnej glicyny. Bufor należy dodawać jak najszybciej. Usieciowanie stabilizuje się następnie poprzez dodanie, znów jak najszybsze, wodnego roztworu borowodorku sodowego. Ten spolimeryzowany roztwór następnie zatęża się i poddaje diafiltracji w atmosferze tlenu, w celu natlenowania roztworu. Na koniec do roztworu dodaje się wodę, w takiej ilości, aby roztwór zawierał około 4% wagowo hemoglobiny.
Wynikiem polimeryzacji według niniejszego wynalazku jest większa wydajność wytwarzania polimerów o wąskim zakresie masy cząsteczkowej, jak to przedstawiono na fig. 3 i w przykładzie 1 poniżej.
Roztwór polimeryzowanej, pirydoksylowanej hemoglobiny następnie oczyszcza się poprzez chromatografię kolumnową, filtrację, na przykład filtrację membranową, lub oboma tymi sposobami w celu usunięcia z roztworu resztkowej, niepolimeryzowanej (tetramerycznej) hemoglobiny. Roztwór oczyszczonej, polimeryzowanej hemoglobiny zatęża się następnie do około 6%, stosując urządzenie do ultrafiltracji w przygotowaniu do wymiany gazowej.
Zatężony roztwór następnie odtlenia się azotem. Odtlenienie prowadzi się w temperaturze 10-12°C do momentu, w którym ilość oksyhemoglobiny w roztworze wynosi poniżej 16% wagowo hemoglobiny całkowitej.
Powstały roztwór odtlenowanej, oczyszczonej i polimeryzowanej hemoglobiny zatęża się następnie poprzez ultrafiltrację w atmosferze azotu w schłodzonym naczyniu. pH doprowadza się do wartości około 8,8-9,0, i ewentualnie poziom elektrolitów, w miarę potrzeby, doprowadza się do poziomu występującego w prawidłowym osoczu. Ponadto dodać można ewentualnie konwencjonalne przeciwutleniacze, takie jak glutation, askorbinian lub glukoza. Po zatężeniu roztworu do pożądanego poziomu, korzystnie około 10% wagowo polimeryzowanej, pirydoksylowanej, oczyszczonej, wolnej od tetrameru i zrębu hemoglobiny, roztwór wyjaławia się poprzez filtrację i przenosi w jałowym urządzeniu do przenoszenia do odpowiednich farmaceutycznie
187 923 dopuszczalnych pojemników. Poniżej przedstawiono charakterystykę powstałego roztworu hemoglobiny.
| Hemoglobina polimeryzowana | |
| Hemoglobina całkowita (g/dl)1 | 9,5-12,0 |
| Methemoglobina (% Hb całkowitej/ | <8,0 |
| Karboksyhemoglobina (% Hb całkowitej)1 | <5,0 |
| P50 (kPa1) | 31-43 |
| Osmolalność (mmol/kg)2 | 280-360 |
| Sód (mmol/1)3 | 135-155 |
| Potas (mmol/1)3 | 3,5-4,5 |
| Chlorki (mmol/1/ | 85-110 |
| Wolne żelazo (ppm)4 | <2,0 |
| Dystrybucja masy cząsteczkowej - pik 128 Kd (%/ | 10-24 |
| Dystrybucja masy cząsteczkowej - pik 192 Kd (%)5 | 18-30 |
| Dystrybucja masy cząsteczkowej - pik 256 Kd (%/ | 45-70 |
| Tetrametr (64 K) (%)5 | <0,8 |
| Endotoksyny (EU/ml)6 | <0,03 |
| Fosfolipidy (ng/Hb/ | <50 |
| Glikolipidy (ng/Hb)7 | <2 |
'Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony spektrofotometrycznie ‘Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony przez osmometrię 3Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony elektrodąjonospecyficzną ^Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony przez adsorpcję atomową 5Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony przez HPLC zaleznąod wielkości cząsteczki 6Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony przez LAL z zastosowaniem testu dostępnego w firmie Associates ofCape Cod, przy czym odczynniki testowe mają numery katalogowe 100-5, 800-1 i 3100-5 7Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony w HPTLC.
Poniższe przykłady przedstawiają niektóre cechy niniejszego wynalazku.
Należy jednak rozumieć, że przykłady te mają na celu jedynie ilustrację, nie mają zaś znaczenia decydującego odnośnie do warunków i zakresu niniejszego wynalazku.
Temperaturę wyrażono w stopniach Celsjusza, jeżeli nie wskazano inaczej. Jeżeli nie wskazano inaczej, wszystkie odsetki, na przykład hemoglobiny całkowitej (THb) wyrażono w postaci stężenia wagowego. Należy również zauważyć, że podano typowe warunki reakcji (na przykład, temperaturę, czas reakcji); można również stosować warunki poza podanym zakresem, jakkolwiek zwykle nie jest to korzystne.
Jeżeli nie wskazano inaczej, wszystkie naczynia i zbiorniki stosowane w sposobie według niniejszego wynalazku wykonano ze stali nierdzewnej 316-L, korzystnie, z gatunku przeznaczonego do zastosowania farmaceutycznego takiej stali nierdzewnej, poddanej starannemu polerowaniu, co umożliwia jego łatwe i szybkie czyszczenie. Rozmaite rurki łączące wykonano z tej samej stali nierdzewnej lub z farmaceutycznego gatunku teflonu lub silikonu. Filtry i błony stosowane w sposobie według niniejszego wynalazku można nabyć w firmie Millipore Inc., Pall-Filtron lub Cuno Inc.
Czas półtrwania produktu według niniejszego wynalazku oznacza się in vivo u ssaków, na przykład u ludzi. Typowo, od ssaka pobiera się próbkę krwi po pewnym czasie od podania
187 923 produktu w postaci wlewu. Następnie określa się ilość produktu poprzez odwirowanie próbki krwi, wyznaczenie części osocza, jaką on stanowi, spektrofotometryczne oznaczenie poziomu hemoglobiny w osoczu i następnie skorelowanie ilości produktu pozostałego w organizmie ssaka z czasem półtrwania produktu.
Chromatografię HPLC zależną od wielkości cząstek według niniejszego wynalazku przeprowadzono w następujący sposób: próbkę rozcieńcza się, stosując 0,2m bufor fosforan potasowy o pH 6,9, do stężenia 0,2 g/dl, przefiltrowuje przez filtr 0,2μ i wstrzykuje do układu HPLC, utworzonego z następujących składowych (w kolejności przepływu przez układ):
1. Pompa model 2248, Pharmacia
- fazę ruchomą stanowi 0,2M fosforan potasowy o pH 6,9
- prędkość przepływu wynosi 1,0 ml/min
2. 45-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm
3. Urządzenie do wlewów Rheodyne, model 7725i, z pętlą na próbki PEEK o pojemności 100 μΐ
4. 18-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm
5. Filtr model Upchurch A431, 0,5μ
6. 9-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm
7. Kolumna Guard Phenomenex Biosep SEC S-3000 75 x 7,8 mm
8. 824-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm
9. Kolumna Phenomenex Biosep SEC S-3000 600 x 7,8 mm
10. 23-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm
11. Detektor Pharmacia Uvicord SD UV
- długość fali 280 nm
- kuweta przepływowa: objętość 8 μί, długość drogi 2,5 mm
- zakres: 2 aUfS
- stała czasowa: 10 sekund.
Szczytową absorbancję w 280 nm zapisuje się w integratorze LKB 2221, integrującym poszczególne pola pod krzywą w punkcie szczytowym i obliczającym pole hemoglobiny całkowitej dla każdego rodzaju polimeru.
Wynalazek można lepiej zrozumieć na podstawie poniższych nieograniczających przykładów.
Przykład 1
W odniesieniu do fig. 1, z torebki 20 z przeterminowaną krwią pobraną od krwiodawcy (krew pełna lub masa erytrocytama) umieszcza się w odpowiednim jałowym urządzeniu do aspiracji 22. Przykładem odpowiedniego urządzenia do aspiracji jest układ posiadający dwie stacje aspiracji. Po umieszczeniu torebki w stacji aspiracyjnej igła urządzenia do aspiracji przebija torebkę z krwią dawcy, wprowadzając około 150 ml 1% (stężenie wagowe) wodnego roztworu chlorku sodowego i aspiruje przeterminowaną krew z torebki w warunkach zmniejszonego ciśnienia lub próżni. Zaaspirowanąkrew przepuszcza się przez filtr 24 o głębokości 100μ, i następnie przez dwa filtry 26 o głębokości 5μ, po kolei. Kiedy krew przechodzi przez filtry o głębokości 5μ, dochodzi do usunięcia leukocytów z krwi. Typowo aspiruje się około 170 jednostek przeterminowanej krwi pełnej, poddaje się je filtracji i następnie przenosi do zbiornika 1, jak to przedstawiono na fig. 1. Filtry płucze się następnie około 75 l 1% (stężenie wagowe) wodnego roztworu chlorku sodowego.
Przed wprowadzeniem krwi do zbiornika 1, zbiornik 1 napełnia się około 70 l 1% wodnego roztworu chlorku sodowego. Po zaaspirowaniu całej ilości 170 jednostek przeterminowanej krwi pełnej, jej przefiltrowaniu i przeniesieniu i przepłukaniu filtru, zbiornik zawiera około 250 1 4% roztworu hemoglobiny całkowitej. W czasie etapów aspiracji i filtracji zbiornik 1 utrzymuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, na przykład w próżni, przy czym ciśnienie wynosi 27-37 kPa. Po przeniesieniu całości przeterminowanej krwi do zbiornika 1 próżnię wyłącza się i do zbiornika wprowadza tlenek węgla, tak że zbiornik zawiera atmosferę tlenku węgla.
Zbiornik 1 łączy się z filtrem 28 0,65μ, o zasilaniu stycznym, jak to przedstawiono na fig. 1. Początkową zawartość, to znaczy 250 1 4% roztworu hemoglobiny całkowitej, zatęża się do około 125 l 8% roztworu hemoglobiny całkowitej przez mikrofiltrację przez filtr o zasilaniu
187 923 stycznym. W tym mbmrneir pH roztworu hemoglobiny ynnbzl około 6-6,5. Po zatężeniu do 8% hemoglobiny całkowitej roztwór płucze się, dodając 1% (wagowo) roztwór chlorku sbdbyrgo, i następnie przez diafiltrację i usunięcie filtratu w tej samej ilości, co dodany roztwór chlorku zbObyrgb. 125 l roztworu hemoglobiny typowo płucze się bkbłb 8-krotną objętością 1% roztworu chlorku ubObwrgb (około 1000 l). Po przepłukaniu roztwór zatęża się do około 70 l, to znaczy około 14% hemoglobiny całkowitej, i dodaje się wodę do wstrzyknięć, tak aby objętość roztworu doprowadzić do około 180 l. Po dodaniu wody do wstrzyknięć komórki pęcznieją i pękają, uwalniając hemoglobinę do roztworu. Stężenie powstałego roztworu hemoglobiny wynosi około 5% hemoglobiny całkowitej (THb).
Powstały roztwór klaruje się, nadal w zbiorniku 1. Roztwór najpierw zatęża się do około 50 l, potem przenosi do zbiornika 2. Kiedy roztwór pompuje się przez filtr, zatrzymuje on substancje ąanireąnząezaJąer ze zrębu krwinek czerwonych i materiał z błony komórkowej. Pozostałe 50 l roztworu w zbiorniku 1 płucze się (poddaje diafiltraeji) około 2,5 objętością wody do wstrzyknięć. Tę 2,5-krotną objętość wody do wstrzyknięć do płukania dodaje się do zbiornika 2. Materiał pozostały w zbiorniku 1 zatęża się następnie do około 20 l i filtrat dodaje do zbiornika 2. Objętość pozostałą w zbiorniku 2 stanowi około 280 1 0,0% roztworu hemoglobiny całkowitej.
Powstały roztwór wolnej od zrębu hemoglobiny poddaje się następnie obróbce cieplnej w zbiorniku 2 w temperaturze około 60-62°C przez czas około 10 godzin. W tym czasie roztwór w umiarkowany sposób miesza się. W czasie ogrzewania roztworu i przechodzenia przez temperaturę około 55°C tworzy się strąt.
Powstały 0,0% roztwór hemoglobiny THb (stężenie wagowe), pozbawionej zrębu, filtruje się następnie przez 0,2μ filtr 00, następnie przez 0,1 μ, filtr 02 i przenosi do zbiornika 0. Przrflltroysnn roztwór hemoglobiny zatęża się następnie do około 18% THb, po czym płucze i poddaje diafiltracji czterema objętościami wody do yztrzn0olęć (180 l). Zatężanie i diafiltrację prowadzi się stosując ultrafiltr 04 do masy cząsteczkowej 10 kllodaltooów (kD). Dren 05 połączony z ultrafiltrem 04 zbiera filtrat. W tym mbmrkeir 45 l 18% roztworu hemoglobiny całkowitej zawiera 50 ng fosfolipidów na gram hemoglobiny, poniżej 2 ng glikolipidów os gram hemoglobiny, poniżej 1% methemoglobiny, poniżej około 0,00 jednostek rndbtokznnbwych rn0btbkznnn ma mililitr w pH 6-6,5. Hemoglobinę w roztworze stanowi 0arbbkzyhrmogtobina.
Powstały roztwór karbokuneembglbblnn przenosi się następnie do zbiornika 4, w którym 0arbb0znermbglobinę poddaje się najpierw natlenieniu, a potem odtlrnlrkiu. Zbiornik 4 wyposażony jest w pierścień rozpraszający gaz, do którego doprowadzany jest tlen i azot, z dna zbiornika do urządzenia aerozolowego z licznikiem, umieszczonego na szczycie zbiornika 4 i kolektor przelewu piany, podłączony do komory piany 1, tak że piana wytworzona w zbiorniku 4 podawana jest do komory piany 06, w której pianę Obodrosujr się do cieczy i podaje na powrót do zbiornika 4. Zbiornik 4 zawiera również zestaw pierścieni przesuwających, wypełniających około jednej trzeciej objętości zbiornika. Komora piany 06 zawiera wentyl gazu do usuwania gazu. Roztwór w zbiorniku 4 stanowi 10% roztwór hemoglobiny całkowitej.
W czasie pierwszego etapu natleniania tlen rozprasza się przez roztwór z prędkością wystarczającą do uzyskania jednolitej dyspersji gazu w naczyniu. Naczynie o objętości 200 l jest natryskiwane z prędkością około 25 1 gazu na minutę. Natlenienie karboksnhrmbglbbinn prowadzi się przez czas około 16 godzin, tak że powstały roztwór zawiera poniżej 5% karbo0snermbolbbion w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej. Natlenienie prowadzi się w temperaturze około 10°C. Piana wytwarzana w zbiorniku 4 jest zbierana w komorze piany 06, osiada i następnie powstały roztwór podaje się na powrót do zbiornika 4.
Po natlenieniu roztwór natryskuje się z podobną prędkością azotem przez okoto 6 godzin lub do momentu, gdy poniżej 10% bkznhrmogloblkn, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, pozostanie w roztworze. Natrysk azotem prowadzi się w temperaturze około 10°C przy pH okoto 6-6,5. Zamiast tego można dokonać konwersji OarboOsnermbglbblnn do Ο^bOznermbgtobmn, stosując wnmiroiaez membranowy. Należy zauważyć, że w zasadzie nie zachodzi denaturaj hemoglobiny, jak można by oczekiwać na tym etapie wytwarzania piany. Powstały bdtlrntony roztwór jest gotowy do modyfikacji chemicznej.
187 923
W odniesieniu teraz do fig. 2, roztwór dezoksyhemoglobiny przenosi się do zbiornika 5 dla modyfikacji chemicznej. Do zbiornika 5, zawierającego dezoksyhemoglobinę w roztworze o temperaturze około 4°C, dodaje się następnie wodny roztwór pirydoksalo-5-fosforanu (P5P) (93,75 g/l), w stosunku molowym P5P do hemoglobiny 1:1 -3:1. Korzystny jest stosunek molowy P5P do hemoglobiny 2:1. Pirydoksylację prowadzi się w temperaturze około 4°C. Roztwór P5P typowo dodaje się przez około 1 minutę i miesza przez około 15 minut, a następnie do roztworu hemoglobiny dodaje się roztwór borowodorku sodowego/wodorotlenku sodowego w stosunku molowym borowodorku sodowego do hemoglobiny wynoszącym około 20:1. Korzystny roztwór wodny borowodorku sodowego/wodorotlenku sodowego zawiera 0,8 g wodorotlenku sodowego na 2 1i 90,8 g borowodorku sodowego na 2 1. Roztwór borowodorku dodaje się jak najszybciej, przez czas około 1 minuty, i następnie miesza przez godzinę. Powstałe 50 l roztworu pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się następnie diafiltracji z zastosowaniem 10 kD ultrafiltru 38 dla usunięcia nadmiaru odczynników, czterema objętościami wody do wstrzyknięć. Dren 40 połączony z ultrafiltrem 38 zbiera filtrat z filtru 38.
Po tej filtracji czterema objętościami, to znaczy 200 l, wody do wstrzyknięć, hemoglobinę poddaje się polimeryzacji. Do zbiornika 5 zawierającego pirydoksylowaną hemoglobinę dodaje się wodę do wstrzyknięć w ilości wystarczającej do wytwarzania 4,5% roztworu hemoglobiny całkowitej (około 175 l roztworu hemoglobiny). Do roztworu pirydoksylowanej hemoglobiny dodaje się roztwór aldehydu glutarowego w stosunku molowym aldehydu glutarowego do hemoglobiny około 24:1. Roztwór aldehydu glutarowego typowo podaje się przez czas około 2-5 godzin pompą z dozownikiem, do roztworu hemoglobiny. Reakcję polimeryzacji prowadzi się przez około 18 godzin. Docelowa dystrybucja masy cząsteczkowej wynosi około 75% polimeru i 25% tetrameru. Polimery docelowe mają masę cząsteczkową poniżej 600000, przy czym dominująca frakcja masy cząsteczkowej znajduje się w zakresie 100000-350000.
Gdy reakcja polimeryzacji osiągnie docelową dystrybucję masy cząsteczkowej (po około 18 godzinach) do roztworu hemoglobiny dodaje się wodną glicynę (około 166 g/l) (w celu schłodzenia) w stosunku molowym glicyny do hemoglobiny wynoszącym 140:1. Por. fig. 3, która stanowi obraz HPLC powstałego polimeryzowanego schłodzonego glicyną produktu hemoglobinowego. Powstały roztwór miesza się następnie przez około 10 minut, po czym do roztworu hemoglobiny dodaje się roztwór borowodorku sodowego/wodorotlenku sodowego (o powyższym stężeniu) przy stosunku molowym borowodorku sodowego do hemoglobiny wynoszącym 28:1. Powstałą mieszaninę miesza się przez około 1 godzinę. Roztwór zatęża się następnie do około 50 l (ultrafiltr 38) i płucze czterema objętościami (200 l) wody do wstrzyknięć. Do zatężonego roztworu dodaje się dodatkową porcję borowodorku sodowego w tym samym stosunku molowym, jak wskazano powyżej, i całość ponownie miesza się przez 1 godzinę. Powstały roztwór płucze się czterema objętościami wody do wstrzyknięć (200 l), w wyniku czego uzyskuje się polimeryzowaną, pirydoksylowaną, wolną od zrębu hemoglobinę, poddaną obróbce cieplnej.
Powstały roztwór natlenia się przez pozostawienie roztworu w atmosferze tlenu i następnie przeniesienie do układu oczyszczania 42. Oczyszczanie można przeprowadzić poprzez chromatografię kolumnową, filtrację, korzystnie filtrację błonową (diafiltrację) lub połączenie diafiltracji i chromatografii kolumnowej.
W jednym z wykonań roztwór przenosi się do naczynia chromatograficznego, zbiornika 6, jak to przedstawiono na fig. 5. W tym wykonaniu powstały roztwór oksyhemoglobiny rozcieńcza się następnie do około 200 l (4% hemoglobiny całkowitej) w zbiorniku 6, a stężenie chlorków doprowadza się do 22 mM roztworem chlorku sodowego. Nie ma konieczności dostosowywania stężenia sodu.
Pięć próbek powstałego roztworu hemoglobiny, o objętości 40 l na próbkę, poddaje się następnie chromatografii z zastosowaniem kolumny 44. Kolumna 44 zawiera żel powinowactwa, który stanowi żel agarozowy, zmodyfikowany żółtym barwnikiem (dostępny w firmie Affmity Chromatography, Ltd., pod nazwą Mimetic Yellow Nr 1), który wykazuje wyższe powinowactwo do polimeru, niż do tetrameru.
Chromatografię prowadzi się w następujący sposób. 40 l roztworu natlenionej, polimeryzowanej, pirydoksylowanej, wolnej od zrębu hemoglobiny ładuje się na kolumnę 44, kolumnę
187 923 płucze się piętnastoma objętościami kolumny (około 750 l) 30 mM wodnego buforu NaCl w celu usunięcia tetrameru. Kolumnę płucze się następnie około 250 l 300 mM buforu chlorku sodowego dla wypłukania polimeru. Frakcje polimeru zbiera się do zbiornika 7. Frakcje niepożądane wysyła się do drenu 46. Po usunięciu poszczególnych próbek kolumnę regeneruje się roztworem 15 mM HC1 (150 l), ponownie zrównoważonego 30 mM wodnego NaCl (250 l) i na kolumnę ładuje się następną próbkę roztworu (40 l). Kolumnę ponownie płucze się 30 mM NaCl i następnie 300 mM NaCl. 40 1 próbki roztworu hemoglobiny dodaje się do kolumny i poddaje chromatografii aż do opróżnienia zbiornika 6.
Frakcje zebrane w zbiorniku 7 poddaje się ultrafiltracji (zatęża) stosując filtr 48, połączony z drenem 50 aż do objętości około 40 l (6% hemoglobiny całkowitej). Stężony roztwór hemoglobiny przenosi się następnie do zbiornika 8, wymiany gazowej, w celu odtlenienia.
Zamiast tego roztwór przenosi się do naczynia zwrotnego obiegu filtracyjnego 10, jak to przedstawiono na fig. 6. Hemoglobinę rozcieńcza się następnie do około 4% THb w zbiorniku 10. 4% roztwór THb poddaje się następnie diafiltracji, stosując 10 mM NaCl i filtr 52 (masa cząsteczkowa 300000), dostępny w handlu w firmie Pall-Filtron. Filtrację prowadzi się do momentu, gdy 97% materiału hemoglobinowego przejdzie przez filtr i do zbiornika 11 (około 3% materiału, to znaczy polimery o wysokiej masie cząsteczkowej, pozostaje w zbiorniku 10). Ilość hemoglobiny oznacza się spektrofotometrycznie, stosując kooksymetr.
Materiał powstały w zbiorniku 11 stanowi około 2-4% THb i zawiera około 7-10% tetrameru w stosunku do THb. 2-4% THb poddaje się następnie diafiltracji z użyciem 10 mM NaCl i filtr 54 (masa cząsteczkowa 100000), dostępny w handlu w firmie Pall-Filtron, połączony z drenem lub syfonem 56. Filtrację prowadzi się do momentu, w którym poziom tetrameru, oznaczony w chromatografii zależnej od wielkości cząstek, z zastosowaniem kolumny BioSep SEC-S3000 600 x 7,8 mm, wynosi poniżej 0,8% masy hemoglobiny wagowo. Powstały roztwór oczyszczonej hemoglobiny pozostaje początkowo w zbiorniku 11, po czym przenoszony jest do zbiornika 8 wymiany gazowej w celu odtlenienia.
Zbiornik 8 wymiany gazowej może stanowić ten sam zbiornik, co zbiornik 4, lub, korzystnie, inny zbiornik. Zbiornik 8 wymiany gazowej wyposażony jest w zasadzie tak samo, jak zbiornik 4 wymiany gazowej z fig. 1, i przyłączony do komory piany 58 w taki sam sposób, jak zbiornik 4 do komory piany 36. Odtlenienia dokonuje się w czasie około 2,5 godziny, stosując rozpraszanie azotu w temperaturze około 10°C i pH roztworu około 7,5. Rozpraszanie azotu prowadzi się do momentu, w którym poniżej około 16% oksyhemoglobiny, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, pozostaje w roztworze. Powstały roztwór dezoksyhemoglobiny przenosi się następnie do zbiornika 9 w celu wytworzenia preparatu.
W zbiorniku 9 do wytwarzania preparatu roztwór najpierw zatęża się do około Ί% hemoglobiny całkowitej, a pH doprowadza się do około 8,8-9,0 w temperaturze 4°C. pH doprowadza się do odpowiedniej wartości stosując 0,2M NaOH. Do roztworu hemoglobiny o pH 8,8-9,0 dodaje się następnie roztwory elektrolitów. Dodaje się glukozę i glicynę do uzyskania końcowego stężenia wynoszącego, odpowiednio, około 5 g/l i 1,75 g/l. Do roztworu dodaje się chlorek potasowy do uzyskania stężenia potasu wynoszącego od około 3,5 do 4,5 mM. Dodaje się wówczas 3M chlorek sodowy dla uzyskania stężenia chloru wynoszącego 85-110 mM. Następnie dodaje się mleczan sodowy dla uzyskania stężenia jonów sodowych 135-155 mM. Na koniec dodaje się 0,45-molowy roztwór kwasu askorbinowego dla podwyższenia stężenia kwasu askorbinowego do około 1000 mg/l. Kwas askorbinowy dodaje się jako środek konserwujący/przeciwutleniający do przechowywania. Ostateczna osmolalność roztworu hemoglobiny wynosi od około 280 do 360 mmol/kg.
Roztwór hemoglobiny w postaci preparatu zatęża się następnie do około 10% hemoglobiny całkowitej, stosując filtr 60 połączony z syfonem 62 i 10% roztwór hemoglobiny wyjaławia się poprzez filtrację przez filtr 64 i pakuje do wyjałowionych torebek w warunkach jałowych.
Charakterystykę produktu wytwarzanego w niniejszym przykładzie, serii A, przedstawiono w tabeli 1. W tabeli 1 przedstawiono ponadto charakterystykę serii B i C, wytwarzanych sposobem opisanym powyżej dla serii A.
187 923
Tabela 1
| Seria | |||
| Test | A | B | C |
| Hemoglobina, g/dl | 10,4 | 10,2 | 10,2 |
| Methemoglobina, % | 4,6 | 6,0 | 5,6 |
| Karboksyhemoglobina, % | 0,2 | 1,4 | 1,5 |
| P50 (Torr, pH 7,35-7,45, pCO2 47-53 kPa) | 28,5 | 26,8 | 27,0 |
| Osmolalność (mmol/kgl) | 318 | 320 | 317 |
| Sód (mmol/1) | 142 | 144 | 142 |
| Potas (mmol/1) | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Chlor (mmol/1) | 98 | 99 | 94 |
| Wolne żelazo (ppm) | 0,7 | 12 | 1 0 |
| Dystrybucja masy cząsteczkowej - % dla | 128:16 | 128:11 | 128:16 |
| 192:26 | 192:23 | 192:26 | |
| każdej masy cząsteczkowej (Kd) | 2568:58 | 2568:66 | 256s:58 |
| Tetrametr, % | 0,4 | 0,3 | 0,4 |
| Endotoksyna, (EU/ml) | <0,03 | <0,03 | <0,03 |
8 Materiał zawiera również małą ilość materiału o wyższej masie cząsteczkowej
W powyższym opisie przedstawiono szczegółowy opis korzystnych wykonań niniejszego wynalazku, w celu ilustracji, a nie ograniczenia. Należy rozumieć, że wszelkie inne modyfikacje i sposoby równoważne niniejszego wynalazku, oczywiste dla specjalistów, są objęte jego zakresem według zastrzeżeń.
187 923
Λ u
Ο <Μ «5
Φ •η υ C <0 <ϋ Λί
α>
Q Ν
187 923
FIG. 4 FIGLI
| o | |
| o o | >1 |
| m | fi |
| w | •rł |
| 1 | |
| u | o |
| ω | r-ł |
| w | tP |
| 0 ε | |
| u | φ |
| w | X! |
| o | •n |
| H | Φ |
| cq | fi |
| <ΰ | |
| U | o |
| N | |
| CU | >1 |
| a | M |
| N <0 | Φ |
| «-4 | |
| Λ | O |
| O | CU |
>, c
•rł Λ O ι—I
O
E
0)
Λ
•n
Φ fi rtJ
Z
O
N <0
M
Xł
O >1 h
Φ ε
o
CU
Φ fi
O
N ϋ
N
W >n
N υ
o
187 923
O
U hemoglobina
30ιιΜ N<jt I 300irt4 Nof. I 15ΠΜ IICL -
un o
Li>ιΛ >4 O <D r-1 £ CT •H O i ε o o PM X!
187 923
10nW NoC I I OrrM NoC I
| < | i Ιλ | ||||
| 0 J 1 | |||||
| i ' L | |||||
| Λ ·Η t—1 i | |||||
| N G r-l \J |
Ό C O -P r—I d Q ·&.
a a
ni b
id c
fd
| fd | £ fd |
| c | Ó C |
| 0 | Ν Ή |
| N | >ιΛ |
| 0 | P 0 |
| N | Φ r-l |
| w | ε tu |
| >1 | •H 0 |
| N | r-i ε |
| υ | o ω |
| o | Chx: |
φ
CJ
P O <1) I-I ε
•H o ή ε
O Φ PU Λ
187 923 ο
Ό π3
Ό
Ο £
>ι £
Ο
C ο
Μ
Λί •Η
I
Μ
4J
•Η
Λ ζ Λ Ό a) α Μ ϊ Ο π) Ε-ι Ό
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (17)
- Zastrzeżenia patentowe1. Wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, znamienny tym, że zawiera tetramer w ilości co najwyżej 0,8% wagowo w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej w roztworze, oraz hemoglobinę, która wykazuje dystrybucję masy cząsteczkowej wynoszącą10 - 24% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;18 - 30% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;45 - 10% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej 256000 w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej.
- 2. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera (a) całkowitą hemoglobinę w ilości 9,5 - 12,0 g/dl;(b) całkowitą methemoglobinę w ilości mniejszej niż 8% całkowitej hemoglobiny;(c) całkowitą karboksyhemoglobinę w ilości mniejszej niż 5% całkowitej hemoglobiny;(d) stężenie sodu wynoszące 135 - 155 mmola/1;(e) stężenie potasu wynoszące 3,5 - 4,5 mmol/1;(f) stężenie chlorku wynoszące 85 - 110 mmol/kg;
- 3. Roztwór według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera (g) całkowite wolne żelazo w ilości mniejszej niż 2,0 ppm;(h) całkowity tetramer w ilości mniejszej niż 0,8% wagowo w stosunku do hemoglobiny całkowitej;i (i) endotoksynę w ilości mniejszej niż 0,03 EU/1.
- 4. Roztwór według zastrz. 3, znamienny tym, że dodatkowo zawiera (j) fosfolipidy w ilości mniejszej niż 50 ng/Hb; i (k) glikolipidy w ilości mniejszej niż 2 ng/Hb.
- 5. Roztwór według zastrz. 2, znamienny tym, że wykazuje osmolalność wynoszącą 280 - 360 mmol/kg.
- 6. Roztwór według zastrz. 2, znamienny tym, że wykazuje dysocjację tlen - hemoglobina wynoszącą 31 - 43 hPa.
- 7. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 15 godzin.
- 8. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 24 godziny.
- 9. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek.
- 10. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek, oraz tym, że czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 24 godziny.
- 11. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera (a) całkowitą hemoglobinę w ilości 9,5 - 12,0 g/dl;(b) całkowitą methemoglobinę w ilości mniejszej niż 8% całkowitej hemoglobiny;(c) całkowitą karboksyhemoglobinę w ilości mniejszej niż 5% całkowitej hemoglobiny;(d) dysocjację tlen - hemoglobina wynoszącą 31 - 43 hPa;(e) osmolalność wynoszącą 280 - 360 mmol/kg;187 923 (f) stężenie sodu wynoszące 135 - 155 mmol/1;(g) stężenie potasu wynoszące 3,5 - 4,5 mmol^^1;(h) stężenie chlorku wynoszące 85 - 110 mmol/kg;(i) całkowite wolne żelazo w ilości mniejszej niż 2,0 ppm;Cj 10- 24% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 128000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;(k) 18 - 30% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;(l) 45 - 70% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 256000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;(m) całkowitą ilość tetrameru mniejszą niż 0,8%;(n) endotoksynę w ilości mniejszej niż 0,03 EU/1;(0) fosfolipidy w ilości mniejszej niż 50 ng/Hb;(р) glikolipidy w ilości mniejszej niż 2 ng/HB.
- 12. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że w postaci preparatu zawiera około 16% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, około 26% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 192000 i około 58% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 256000, przy czym wszystkie procenty podano w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej.
- 13. Roztwór według zastrz. 12, znamienny tym, że roztwór można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 1,5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek.
- 14. Sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny zawierającej około 16% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, około 26% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 i około 58% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 256000, przy czym zawartość procentową poszczególnych polimerów hemoglobiny podano w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, który to roztwór można podawać pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 3 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek, znamienny tym, że (a) z mieszaniny zawierającej czerwone ciałka krwi usuwa się leukocyty za pomocą filtracji przez filtr o minimalnym średnim wymiarze porów dostatecznym do uniemożliwienia przechodzenia leukocytów;(b) czerwone ciałka poddaje się lizie;(с) do produktu z etapu (b) dodaje się tlenek węgla i ogrzewa się do temperatury 60-62°C przez około 10 godzin, z wytworzeniem poddanego obróbce cieplnej roztworu hemoglobiny;(d) poddany obróbce cieplnej roztwór hemoglobiny z etapu (c) filtruje się usuwając zręby i zanieczyszczenia zrębowe, które uległy wytrąceniu podczas ogrzewania;(e) poddany obróbce cieplnej roztwór hemoglobiny odgazowuje się przez rozproszenie tlenu i następnie przez roztwór poddany obróbce cieplnej w temperaturze około 10°C rozprasza się azot z wytworzeniem piany i odgazowanego roztworu poddanego obróbce cieplnej;(f) odgazowany roztwór poddaje się pirydoksylacji;(g) roztwór pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji;(h) roztwór pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny z etapu (g) natlenia się;(1) roztwór z etapu (h) oczyszcza się usuwając z roztworu hemoglobinę tetrameryczną i zbiera się oczyszczoną polimeryzowaną hemoglobinę pirydoksylowaną, przy czym roztwór ten zawiera mniej niż 0,8% wagowo tetrameru hemoglobiny w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;(j) roztwór oczyszczonej polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej z etapu (i) odtlenia się;(k) poziom pH i elektrolitów w roztworze oczyszczonej polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej doprowadza się do wartości fizjologicznych.
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że hemoglobinę polimeryzuje się aldehydem glutarowym.187 923
- 16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że dodatkowo (al) przeterminowaną lub nieprzeterminowaną krew przepuszcza się przez odpowiednie urządzenie aspirujące pod zredukowanym ciśnieniem, z wytworzeniem mieszaniny zawierającej czerwone ciałka krwi;(a2) w atmosferze tlenku węgla, produkt z etapu (b) przemywa się 1 % roztworem chlorku sodu z wytworzeniem roztworu hemoglobiny o pH 6,0 - 6,5;i przemyty roztwór z etapu (a2) rozcieńcza się wodą z wytworzeniem roztworu komórek lizowanych;roztwór lizowanych komórek filtruje się przez filtr z wytworzeniem roztworu hemoglobiny wolnej od zanieczyszczeń zrębowych i materiału ścianek komórkowych;odgazowany roztwór pirydoksyluje się za pomocą pirydoksalo-5'-fosforanu w stosunku molowym pirydoksalo-5'-fosforanu do hemoglobiny wynoszącym od 1:1 do 3:1, z wytworzeniem pirydoksylowanej hemoglobiny;roztwór pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji za pomocą wodnego roztworu aldehydu glutarowego z wytworzeniem roztworu polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej o dystrybucji masy cząsteczkowej wynoszącej około 65-75% polimeru i 25-35% tetrameru;i oczyszczoną, polimeryzowana hemoglobinę pirydoksylowaną odtlenia się za pomocą azotu.
- 17. Wodny roztwór hemoglobiny zdefiniowany w zastrz. 1 do stosowania jako lek do leczenia pacjenta cierpiącego z powodu utraty krwi.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1438996P | 1996-03-28 | 1996-03-28 | |
| PCT/US1997/005088 WO1997035883A1 (en) | 1996-03-28 | 1997-03-27 | Method and apparatus for preparing an acellular red blood cell substitute |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL329108A1 PL329108A1 (en) | 1999-03-15 |
| PL187923B1 true PL187923B1 (pl) | 2004-11-30 |
Family
ID=21765191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL32910897A PL187923B1 (pl) | 1996-03-28 | 1997-03-27 | Wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny i jego zastosowanie |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6498141B2 (pl) |
| EP (1) | EP0928294B1 (pl) |
| JP (1) | JP2000507947A (pl) |
| CN (1) | CN1129608C (pl) |
| AP (1) | AP1028A (pl) |
| AT (1) | ATE241646T1 (pl) |
| AU (1) | AU740210B2 (pl) |
| BG (1) | BG63919B1 (pl) |
| BR (1) | BR9708388A (pl) |
| CA (1) | CA2250274C (pl) |
| CZ (1) | CZ299357B6 (pl) |
| DE (1) | DE69722422T2 (pl) |
| DK (1) | DK0928294T3 (pl) |
| ES (1) | ES2200177T3 (pl) |
| IL (1) | IL126376A (pl) |
| IS (1) | IS4854A (pl) |
| NO (1) | NO324121B1 (pl) |
| NZ (2) | NZ538045A (pl) |
| OA (1) | OA10884A (pl) |
| PL (1) | PL187923B1 (pl) |
| PT (1) | PT928294E (pl) |
| RO (1) | RO121089B1 (pl) |
| RU (1) | RU2203087C2 (pl) |
| SK (1) | SK134398A3 (pl) |
| UA (1) | UA64710C2 (pl) |
| WO (1) | WO1997035883A1 (pl) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE241646T1 (de) * | 1996-03-28 | 2003-06-15 | Northfield Lab | Verfahren und vorrichtung zur herstellung eines zellfreien ersatzes roter blutzellen |
| CA2444590C (en) | 2001-04-18 | 2009-12-01 | Robert L. Mcginnis | Stabilized hemoglobin solutions |
| DE10220992A1 (de) * | 2002-05-11 | 2003-12-04 | Sanguibiotech Ag | Verwendung eines oder mehrerer Sauerstoffträger, ausgewählt aus Hämoglobin, Myoglobin und Derivaten hiervon zur Behandlung einer Organfunktionsstörung infolge eines akuten Versorgungsmangels und zur Behandlung/Vermeidung einer Gewebeschädigung infolge einer solchen Störung |
| CN1703235A (zh) * | 2002-10-03 | 2005-11-30 | 北原实验室有限公司 | 治疗大量失血患者的方法 |
| JP2006516994A (ja) | 2003-01-29 | 2006-07-13 | ノースフィールド ラボラトリーズ、インコーポレイテッド | テトラマーの量を低下させた重合ヘモグロビン溶液及び調製するための方法 |
| RU2278677C2 (ru) * | 2004-09-30 | 2006-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "МБФ" | Средство для стимулирования эритропоэза и устранения дефицита железа |
| SE0501462L (sv) * | 2005-06-23 | 2006-09-26 | Proliff Ab | Förfarande för framställning av blodplättslysat |
| WO2007087570A2 (en) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Polymerized hemoglobin media and its use in isolation and transplantation of islet cells |
| US20090004159A1 (en) * | 2006-01-24 | 2009-01-01 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi | Polymerized Hemoglobin Media and Its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells |
| RU2340354C1 (ru) * | 2007-06-05 | 2008-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Кровезаменитель с функцией переноса кислорода |
| RU2341286C1 (ru) * | 2007-07-25 | 2008-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Способ получения кровезаменителя и установка для осуществления способа |
| RU2361608C1 (ru) * | 2008-03-18 | 2009-07-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Научно-Производственная Компания "Медбиофарм" | Кровезаменитель с функцией переноса кислорода, фармацевтическая композиция (варианты) |
| WO2019018403A1 (en) * | 2017-07-18 | 2019-01-24 | Virtech Bio, Llc | BLOOD SUBSTITUTES COMPRISING HEMOGLOBIN AND METHODS OF MAKING |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0179879A1 (en) * | 1984-04-27 | 1986-05-07 | Synthetic Blood Corporation | A substitute for human blood and a method of making the same |
| US5194590A (en) * | 1986-06-20 | 1993-03-16 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| US4826811A (en) * | 1986-06-20 | 1989-05-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| US5464814A (en) * | 1986-06-20 | 1995-11-07 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| IL87708A (en) * | 1988-09-08 | 1994-04-12 | Technion Inst For Research And | Hemoglobin-based blood substitute possessing a colloid oncotic pressure substantially similar to human blood and method for the preparation thereof |
| SE9001378D0 (sv) * | 1990-04-18 | 1990-04-18 | Kabivitrum Ab | A method for the preparation of pyridoxylated hemoglobin |
| TW381022B (en) * | 1993-08-16 | 2000-02-01 | Hsia Jen Chang | Compositions and methods utilizing nitroxides to avoid oxygen toxicity, particularly in stabilized, polymerized, conjugated, or encapsulated hemoglobin used as a red cell substitute |
| ATE241646T1 (de) * | 1996-03-28 | 2003-06-15 | Northfield Lab | Verfahren und vorrichtung zur herstellung eines zellfreien ersatzes roter blutzellen |
| US5998361A (en) * | 1996-10-18 | 1999-12-07 | University Of Maryland At Baltimore | Polymerized hemoglobin |
-
1997
- 1997-03-27 AT AT97919943T patent/ATE241646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 CZ CZ0310098A patent/CZ299357B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 RU RU98119535/14A patent/RU2203087C2/ru active
- 1997-03-27 CA CA002250274A patent/CA2250274C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-27 EP EP97919943A patent/EP0928294B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-27 NZ NZ538045A patent/NZ538045A/en unknown
- 1997-03-27 AP APAP/P/1998/001353A patent/AP1028A/en active
- 1997-03-27 NZ NZ332067A patent/NZ332067A/en unknown
- 1997-03-27 BR BR9708388-7A patent/BR9708388A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-03-27 ES ES97919943T patent/ES2200177T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-27 CN CN97194998A patent/CN1129608C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-27 UA UA98095067A patent/UA64710C2/uk unknown
- 1997-03-27 PT PT97919943T patent/PT928294E/pt unknown
- 1997-03-27 AU AU24253/97A patent/AU740210B2/en not_active Ceased
- 1997-03-27 PL PL32910897A patent/PL187923B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 DE DE69722422T patent/DE69722422T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-27 US US09/155,419 patent/US6498141B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-27 DK DK97919943T patent/DK0928294T3/da active
- 1997-03-27 SK SK1343-98A patent/SK134398A3/sk unknown
- 1997-03-27 IL IL126376A patent/IL126376A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-03-27 RO RO98-01433A patent/RO121089B1/ro unknown
- 1997-03-27 WO PCT/US1997/005088 patent/WO1997035883A1/en not_active Ceased
- 1997-03-27 JP JP9534650A patent/JP2000507947A/ja active Pending
-
1998
- 1998-09-25 NO NO19984473A patent/NO324121B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-09-25 OA OA9800177A patent/OA10884A/en unknown
- 1998-09-28 IS IS4854A patent/IS4854A/is unknown
- 1998-10-01 BG BG102810A patent/BG63919B1/bg unknown
-
2002
- 2002-10-17 US US10/274,099 patent/US20030191050A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-11-19 US US10/993,228 patent/US20050065067A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-01-10 US US11/972,322 patent/US7521417B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-04-20 US US12/426,566 patent/US20100197566A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7521417B2 (en) | Method and apparatus for preparing an acellular red blood cell substitute | |
| RU2337705C2 (ru) | Растворы полимеризованного гемоглобина с пониженным количеством тетрамера и способ их получения | |
| EP1308460A2 (en) | Method and apparatus for preparing an acellular red blood cell substitute | |
| KR100562762B1 (ko) | 무세포성적혈구대체물을제조하기위한방법및장치 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20100327 |