PL188157B1

PL188157B1 - Zastosowanie pozakomórkowych proteinaz

Info

Publication number: PL188157B1
Application number: PL97329161A
Authority: PL
Inventors: Michel Hooreman
Original assignee: Michel Hooreman
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-04
Publication date: 2004-12-31
Also published as: CA2251009C; JP2000509025A; WO1997037681A1; NO984632D0; JP4196225B2; NZ332107A; CA2251009A1; NO324877B1; US6440413B1; FR2747045A1; FR2747045B1; PL329161A1; CZ318598A3; TR199801976T2; AP9801357A0; HUP9902421A2; NO984632L; HUP9902421A3; AP1018A; CN1221347A

Abstract

1. Zastosowanie pozakom órkowych proteinaz, w których skladnikiem aktyw nym jest dominujaca proteinaza pozakom órkowa typu II z Streptomycces fradiae, lub ich m ieszanin z jed n a lub innymi dwiema pozakom órkowym i proteinazam i wytwa- rzanym i przez Streptomycces fradiae, lub jedna lub dwiem a proteinazam i, których sekwencja aminokwasowa posiada 60% homologii z sekwencjami dominujacej prote- inazy pozakomórkowej lub z sekwencjami mieszaniny proteinaz, w polaczeniu z za- róbka lub podlozem obojetnym, nietoksycznym i dopuszczalnym fizjologicznie do w ytworzenia kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia chorób tran- zytu jelitowego i przedluzonego przylegania zarazków do blon sluzowych, do ula- tw ienia regeneracji kosm ków blony sluzowej jelit i do zapobiegania i/lub leczenia w rzodów trawiennych i enterotoksemii zapewniajac regulacje w ydzielania sluzu je li- towego, oskrzelowego lub plciowego. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie pozakomórkowych proteinaz, w których składnikiem aktywnym jest dominująca proteinaza pozakomórkowa typu II z Streptomycces fradiae, lub ich mieszanin z jedną lub innymi dwiema pozakomórkowymi proteinazami wytwarzanymi przez Streptomycces fradiae, lub jedną lub dwiema proteinazami, których sekwencja aminokwasowa posiada 60% homologii z sekwencjami dominującej proteinazy pozakomórkowej lub z sekwencjami mieszaniny proteinaz, w połączeniu z zaróbką lub podłożem obojętnym, nietoksycznym i dopuszczalnym fizjologicznie do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia chorób tranzytu jelitowego i przedłużonego przylegania zarazków do błon śluzowych, do ułatwienia regeneracji kosmków błony śluzowej jelit i do zapobiegania i/lub leczenia wrzodów trawiennych i enterotoksemii zapewniając regulację wydzielania śluzu jelitowego, oskrzelowego lub płciowego.

Korzystnie proteinaza pozakomórkowa może służyć do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia, złego absorbowania środków leczniczych lub odżywek. Może ona służyć także do wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia, chorób trzustki i niewydolności wątroby.

Korzystnym innym zastosowniem według wynalazku może być wytwarzanie leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia, chorób zakaźnych, dysfunkcji immunolologicznych, jak również zwiększania skuteczności szczepionek.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie pozakomórkowej proteinazy lub proteinaz zdefiniowanych w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia, niewydolności hormonalnych i chorób degeneracyjnych związanych ze starzeniem.

Celowym jest stosowanie do wytwarzania leku takich proteinaz pozakomórkowych, w których dominującą proteinazą jest pozakomórkowa proteinaza wytworzona przez hodowlę Streptomyces fradiae o aktywności właściwej wyższej od 100000 U.A./mg, posiadająca ciężar cząsteczkowy od 30000 do 36000 i korzystnie około 32000, punkt izoelektryczny około 7,0, zdolną do niszczenia seletywnego podjednostki A toksyny cholery bez niszczenia podjednostki B, w mieszaninie lub w połączeniu z zaróbką lub podłożem obojętnym, nietoksycznym i dopuszczalnym fizjologicznie.

Proteinazy homologiczne można wyekstrahować z hodowli różnych mikroorganizmów, a w szczególności Streptomyces fradiae lub Streptomyces griseus.

Składnik aktywny jest podawany drogą ustną, płucną lub płciową w dawkach zawartych między 5000 i 100000 U.A. W tym celu składnik aktywny jest wprowadzany, w mieszaninie lub w połączeniu z klasycznymi zarobkami, w jednej z form farmaceutycznych odpowiednich dla tego typu podawania.

Składnik aktywny występuje zwłaszcza w jednej z typowych form w technice farmaceutycznej, takich jak tabletki, drażetki, kapsułki żelowe, kapsułki, proszki, roztwory lub zawiesiny, aerozole suche, czopki i tabletki dopochwowe.

Podawanie jest zależne od zapotrzebowania terapeutycznego, i wynosi od jednego do trzech razy dziennie.

Wszystkie wyniki uzyskane na zwierzętach wydają się mieć to samo źródło tzn. zasadnicze działanie PANSTIMASE® na jelita; działanie to ma szereg aspektów, które zostaną kolejno opisane.

Badania farmakologiczne pozakomórkowych proteinaz zawartych w odpowiedniej kompozycji.

Działanie PANSTIMASE® w jelicie.

1. Kosmki jelitowe.

W przypadku szczurów stosunkowo młodych (około 2 miesiące), badania mikroskopii fotonowej wykazują, że kosmki jelitowe wykazują normalny rozwój, tak dla szczurów kontrolnych, jak i dla szczurów poddawanych działaniu PANSTIMASE®.

188 157

W przypadku szczurów stosunkowo starych (około 7 miesięcy), badania te wykazują, że kosmki jelitowe szczurów kontrolnych uległy atrofii, podczas gdy w przypadku szczurów poddawanych działaniu PANSTIMASE® od ich odstawienia od sutka w wieku 4 tygodni są tak rozwinięte jak w przypadku szczurów w wieku 2 miesięcy. Zatem można stwierdzić, że PANSTIMASE® wywołuje pewne „odmłodzenie” jelit, których kosmki jelitowe zachowują dłużej swoją początkową zdolność rozwoju i szybkiego odnawiania.

Jelito nie jest jedynie filtrem, nieaktywnym fizjologicznie; jest także największym z gruczołów wewnątrzwydzielniczych (B. Leblanc i in., Rec. Med. Vet. 1981, 157 629; K. UvnasMoberg, Science, wrzesień 1989, 24). Jelito, złożone z małych komórek o szybkim odnawianiu podczas całego życia, jest narządem najbogatszym w kwasy nukleinowe: DNA+RNA (G. Durand i in., Ann. Biol. Anim. Bioch. Biophys. 1966 6 389); ma zatem najsilniejszą utajoną zdolność syntezy protein.

Badanie wycinków histologicznych jelit wskazuje, że PANSTIMASE® pozwala na lepsze wyrażenie tej utajonej zdolności, a zatem większą produkcję licznych związków fizjologicznie aktywnych: enzymów trawiennych, hormonów (działających na trzustkę, wątrobę, mózg), immunoglobiny, cytokiny, neurotransmittery (np. VIP= Vasoactive Intestinal Peptide); komórkowe czynniki wzrostu (lub przeżycia). Można zatem wyjaśnić, że PANSTIMASE®, działający bezpośrednio w jelitach, może działać pośrednio na narządy i układy fizjologiczne, na które wpływają uprzednio wymienione związki; co wyjaśniłoby silne działanie PANSTIMASE® na trzustkę (A. Estival i in., komunikat do Joumee Metabolisme de Nancy, 25-26 stycznia 1979, Universite de Nancy I).

Jelito jest również narządem najbardziej bogatym w komórki immunizacyjne, które krążą w naczyniach krwionośnych i limfatycznych, lub które się grupują i mnożą w płytkach Peyera. Te komórki immunizacyjne są składnikiem MALT (Mucosae Associated Lymphoid Tissue), które się dzielą na GALT umiejscowione w jelicie, i BALT w oskrzelach, i które stanowią analogie z SALT umieszczonych w skórze. GALT i BALT są od siebie wzajemnie zależne i działają w synergii dla zapewnienia obrony immunizacyjnej błony śluzowej i dla przyczynienia się do obrony organizmu w całości.

Badanie przekrojów histologicznych jelit pokazuje, że PANSTIMASE® stymuluje bezpośrednio GALT; może zatem stymulować pośrednio ogólną obronę immunizacyjną. To wyjaśnia zatem fakt, że PANSTIMASE® zwiększa odporność zwierząt na choroby zakaźne.

2. Mikrokosmki jelitowe.

Na szczurach, młodych bądź starych, próby przy użyciu mikroskopii elektronowej pokazują, że mikrokosmki jelitowe szczurów kontrolnych są otoczone przez nadlepki śluz i przez ślady resztek pożywienia; natomiast w przypadku szczurów poddanych działaniu PANSTIMASE® są one bardziej wyraźne, wyższe i liczniejsze. PANSTIMASE® może zatem zwiększyć całkowitą rozwiniętą powierzchnię mikrokosmków jelitowych, tzn. ich zdolność absorpcji.

Działając „in vitro” PANSTIMASE® na fragmenty jelit pobrane od szczurów kontrolnych, można stwierdzić, że może on bez niszczenia mikrokosmków jelitowych, wyeliminować śluz nadlepki, który je otacza; to działanie umiarkowanym środkiem czyszczącym może się odbyć w ciągu kilku minut. W przypadku „in vivo” to czyszczenie błony śluzowej jelit pozwala na ustanowienie ściślejszego kontaktu między zarazkami a tą błoną śluzową, co może wywołać zwielokrotnienie w jelicie komórek immunizacyjnych zdolnych do walki przeciw zarazkom.

3. Komórki wydzielające i mikrogruczoły wewnątrzwydzielnicze.

Różne komórki wydzielające (wytwarzające śluz, lizozymowe...) oraz liczne mikrogruczoły zewnątrzwydzielnicze są rozdzielone w całości jelit, w którym powodują one znaczne ilości wydzielin (około 2000 ml dziennie u człowieka). Wydzielanie tych wydzielin może być zahamowane lub nawet zablokowane wskutek obecności mikrozatyczek śluzowych.

Badanie przekrojów histologicznych jelit wykazało, że PANSTIMASE® rozkłada te mikrozatyczki, przywraca normalne wydzielanie i wywołuje jako reakcję zwiększenie ich wytwarzania.

Wiadomo, że wydzielina śliny zawiera czynnik wzrostu komórkowego: Epithelial Growth Factor (E G F); w ten sam sposób wydzieliny jelitowe mogą zawierać czynniki wzrostu

188 157 zdolne do działania na enterocyty, limfocyty. Zwiększenie wytwarzania takich czynników wskutek działania PANSTIMASE® może wyjaśnić lepszy rozwój kosmków jelitowych i GALT, co wywnioskowano na podstawie przekrojów histologicznych jelit szczurów poddawanych działaniu.

4. Płytki PEYERa.

Płytki PEYERa, które są agregatami komórek immunizacyjnych rozdzielonych w całym jelicie, są liczniejsze u szczurów poddawanych działaniu PANSTIMASE®: u tych szczurów pojawiły się one w dwunastnicy, lecz u szczurów kontrolnych jedynie poczynając od jelita czczego; są one także bardziej gęste, ich limfocyty sąrminiejsze, bardziej zwarte i wydają się bardziej aktywne (są bardziej intensywnie barwione przez reagenty stosowane w histologii).

5. Brak długotrwałej przyczepności zarazków.

PANSTIMASE® może przeciwstawić się długotrwałemu przyleganiu zarazków na błonach śluzowych, a zwłaszcza na błonie śluzowej jelit.

Ta długotrwała przyczepność wynika z tworzenia wiązań chemicznych między adherentami umieszczonymi na tych zarazkach i ich receptorami na błonie śluzowej: adherenty i receptory są złożonymi (gliko-lipo) proteinami.

Badania „in vitro” wykazały, że PANSTIMASE®, który ma pewne powinowactwo do protein złożonych, może przecinać adherenty lub odłączać receptory błony śluzowej, tam gdzie są one umieszczone; często następuje zerwanie przyczepności, co może się dokonać po kilkudziesięciu minutach.

Ponadto PANSTIMASE® może stymulować odnowienie kosmków jelitowych jelit, tzn. usunięcie starych komórek anormalnych lub takich, na które wpłynęła przyczepność zarazków; to usunięcie jest ułatwione przez intensyfikację przepływu wydzielin jelitowych, których wytwarzanie jest zwiększone pod wpływem działania PANSTIMASE®.

Widoczne jest, że gdy PANSTIMASE® może najpierw pozwolić na ściślejszy kontakt między zarazkami i błoną śluzową jelit (i wywołać zwielokrotnienie w jelitach komórek immunizacyjnych zdolnych do walki z zarazkami), może także się przeciwstawić długotrwałej przyczepności tych zarazków do błony śluzowej i ich przenikaniu do tkanki położonej poniżej.

6. Niszczenie enterotoksyn proteinowych.

Przy stężeniach zawartych między 10 i 100 U.A./ml i przy ogrzewaniu do 37°C przez kilkadziesiąt minut, PANSTIMASE® niszczy liczne toksyny proteinowe i może tym samym przyczynić się do zapobieżenia i/lub leczenia biegunek. Spośród toksyn niszczonych przez PANSTIMASE® można wymienić toksynę botulinową, toksynę cholery, toksynę LT wytwarzaną przez patogenne pałeczki okrężnicy oraz Czynnik Cytotoksyczny Martwicy, również wytworzony przez te pałeczki okrężnicy.

W tych samych warunkach proteinazy endogenne (trypsyna, chymotrypsyna...) nie niszczą tych toksyn i nie mogą zatem przyczyniać się do zapobiegania i/lub leczenia tych biegunek.

W przypadku toksyny LT, PANSTIMASE® niszczy podjednostkę A, która jest agresywna, bez niszczenia podjednostki B, która jest immunostymulująca.

7. Wniosek.

PANSTIMASE® wywiera w całym jelicie zasadnicze działanie, które stymuluje funkcjonowanie tego kluczowego narządu, i w konsekwencji całego organizmu; z czego wynika znaczna liczba przykładów zastosowań terapeutycznych.

Zastosowania terapeutyczne.

Zasadnicze działanie PANSTIMASE® na jelita pozwala na rozważenie jego wykorzystania lub wykorzystania składników aktywnych, z których jest on złożony, a mianowicie dominującej proteinazy pozakomórkowej z jedną z co najmniej dwóch innych proteinaz pozakomórkowych, dla przyczynienia się do zapobiegania lub leczenia chorób.

1. Mukowiscydoza i choroby układu oddechowego.

Mukowiscydoza charakteryzuje się nadmiernym wydzielaniem zbyt lepkiego śluzu, na poziomie jelitowym jak i na poziomie oskrzeli. Cały śluz ma ten sam rodzaj struktury biochemicznej; dlatego też PANSTIMASE® może optymalizować lepkość śluzu jelitowego, śluzu oskrzelowego i śluzu płciowego.

188 157

Proteinaza lub proteinazy pozakomórkowe według wynalazku, lub proteinaza lub proteinazy, których sekwencje aminokwasowe wykazują co najmniej 60% homologii z sekwencjami proteinazy lub proteinaz pozakomórkowych według wynalazku można wykorzystać dla wytwarzania leku przeznaczonego do optymalizacji lepkości śluzu jelitowego, oskrzelowego i/lub płciowego.

Proteinaza łub proteinazy pozakomórkowe według wynalazku, lub proteinaza lub proteinazy, których sekwencje aminokwasowe wykazują co najmniej 60% homologii z sekwencjami proteinazy lub proteinaz pozakomórkowych według wynalazku można wykorzystać dla wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia mukowiscydozy i chorób związanych z nadmiarem wydzielania śluzu jelitowego, oskrzelowego i/lub płciowego, a zwłaszcza gdy jest on zbyt lepki.

2. Poprawa resorpcji i krążenia krwi.

Przez swoje umiarkowane działanie czyszczące na ściankę jelit, PANSTIMASE® przyczynia się do poprawy resorpcji.

Tę poprawę resorpcji można stwierdzić przez dawkowanie do krwi zwierząt leków podawanych doustnie. Np. podaje się kurczakom za pomocą sondy gastrycznej, 50 mg teracykliny bez PANSTIMASE® (grupa kontrolna) lub w połączeniu z 3 mg PANSTIMASE® o 400 U.A./mg (grupa badana); 2 godz po tym podaniu pobrano 2,5 ml krwi i stwierdzono, że średnie stężenie tetracykliny w surowicy wynosi 1,35 mcg/ml dla grupy kontrolnej i 1,90 mcg/ml dla grupy badanej.

Tę poprawę resorpcji można zanalizować bardziej dokładnie badając wiązanie leków w różnych narządach. Np. podawano pstrągom przez 2 dni pożywienie z lekiem zawierające 4 g/kg oksytetracykliny nie uzupełnianej PANSTIMASE® (grupa kontrolna), bądź uzupełniane przez 300 mg/kg PANSTIMASE® o 400 U.A./mg (grupa badana). Następnie uśmiercono te ryby i dawkowano antybiotyk do wątroby, mięśni i nerek. Stwierdzono, że PANSTIMASE® pozwala na otrzymanie znacznego zwiększenia stężenia komórkowego antybiotyku, które bardzo zależy od rozpatrywanego narządu: .

+100% w wątrobie bądź 5,75 mcg/g dla próbki badanej w porównaniu do 2,5 mcg/g dla próbki kontrolnej +400% w mięśniach bądź 1,75 mcg/g dla próbki badanej w porównaniu do 0,3 mcg/g dla próbki kontrolnej +1000% w nerkach bądź 5,75 mcg/g dla próbki badanej w porównaniu do 0,5 mcg/g dla próbki kontrolnej.

Stwierdzono, że PANSTIMASE® wywołuje lepszą resorpcję oksytetracykliny i lepsze rozprowadzenie tego antybiotyku w całym organizmie, co jak się zdaje powoduje poprawę krążenia krwi.

Proteinaza lub proteinazy pozakomórkowe według wynalazku, lub proteinaza lub proteinazy, których sekwencje aminokwasowe wykazują co najmniej 60% homologii z sekwencjami proteinazy lub proteinaz pozakomórkowych według wynalazku można wykorzystać dla wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia złej absorpcji leków lub substancji odżywczych, jak również do leczenia zaburzeń krążenia krwi; w szczególności lek ten jest przeznaczony do leczenia niedostatecznego przyswajania pożywienia, stwierdzonego u osób starszych i u chorych otrzymujących leki, których wtórne efekty wpływają na prawidłowe funkcjonowanie jelit.

3. Wrzody trawienne i enterotoksemie.

Wrzody trawienne wynikają z przyczepności do ścianek żołądka bakterii (Helicobacter pylori) i pewne enterotoksemie wynikają z przyczepności do ścianek jelit różnych zarazków.

PANSTIMASE® przeciwdziała długotrwałej przyczepności zarazków do błon śluzowych i niszczy liczne enterotoksyny; może zatem przyczyniać się do stymulowania odnowienia jelit i może zapobiegać i/lub leczyć wrzody trawienne oraz enterotoksemie.

Natomiast przy hodowli przemysłowej stwierdzono, że PANSTIMASE® jest zdolny do zmniejszenia liczby świń cierpiących na wrzody trawienne, jak również śmiertelności wskutek enterotoksemii.

188 157

Proteinaza lub proteinazy pozakomórkowe według wynalazku, lub proteinaza lub proteinazy, których sekwencje aminokwasowe wykazują co najmniej 60% homologii z sekwencjami proteinazy lub proteinaz pozakomórkowych według wynalazku można wykorzystać dla wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia długotrwałej przyczepności zarazków do błon śluzowych, dla ułatwienia regeneracji kosmków jelitowych dotkniętych atrofią lub zniszczonych na błonie śluzowej jelit, jak również dla zapobiegania i/lub leczenia wrzodów trawiennych i enterotoksemii.

4. Cukrzyca, niewydolność wątroby i zaburzenia przechodzenia zawartości jelitowej.

W poprzednio cytowanym opisie patentowym wskazano już, że PANSTIMASE® stymulowała czynność zewnątrzwydzielniczą trzustki; w istocie stwierdzono znaczne zwiększenie stężenia w trzustce wszystkich dawkowanych enzymów i proenzymów: +50% w przypadku amylazy, +70% w przypadku trypsynogenu i chymotrypsynogenu, +80% w przypadku lipazy (A. Estival i in., Komunikat na Joumees Metabolisme de Nancy, 25-26 stycznia 1979, Uniwersytet Nancy I).

Badanie przekrojów histologicznych trzustki wykazało następnie, że wysepki Langerhansa są liczniejsze i mają lepszy wygląd w przypadku szczurów poddawanych działaniu. Badania te sugerują, że PANSTIMASE® stymuluje przede wszystkim czynność wewnątrzwydzielnicza trzustki, z konsekwencjami dla ogólnego polepszenia anabolizmu proteinowego, z czego wynika następująca po tym stymulacja jego czynności zewnątrzwydzielniczej.

To stymulowanie, które wywiera wpływ na trzustkę, działa również na wątrobę, co w konsekwencji daje poprawę przechodzenia zawartości jelitowej. Przy intensywnej hodowli obserwuje się często zatwardzenie u uwiązanych ciężarnych macior; stwierdzono, że uzupełnianie ich pożywienia PANS ' ffMASE® pozwala na uniknięcie tych szkodliwych zaburzeń przechodzenia zawartości jelitowej.

Proteinaza lub proteinazy pozakomórkowe według wynalazku, lub proteinaza lub proteinazy, których sekwencje aminokwasowe wykazują co najmniej 60% homologii z sekwencjami proteinazy lub proteinaz pozakomórkowych według wynalazku można wykorzystać dla wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia cukrzycy, niewydolności wątroby i zaburzeń przechodzenia zawartości jelitowej.

5. Choroby infekcyjne, dysfunkcje immunizacyjne i szczepienia..

Wskazano już, że PANSTIMASE® działa korzystnie na GALT, i w konsekwencji na zespół układu immunologicznego. Wynika z tego poprawa w 3 różnych obszarach.

A. Choroby infekcyjne.

Pewne obserwacje przy intensywnej hodowli wykazały, że PANSTIMASE® polepsza często stan sanitarny zwierząt, co przede wszystkim przypisuje się temu, że poprawia resorpcję antybiotyków, które dodaje się w większości pożywienia przemysłowego. Następnie stwierdzono, że ta poprawa była szczególnie wyraźna w przypadku infekcji przez różne wirusy, podczas gdy są one zasadniczo nieczułe na działanie antybiotyków. Stwierdzenia te dotyczą grypy i choroby Aujesky'ego u trzody chlewnej, choroby Gumboro i kurcząt i niesztowicy u koźląt.

W tym ostatnim przypadku infekcja wirusowa, stwierdzona w trakcie badania w stacji doświadczalnej, była przedmiotem dokładnych obserwacji przeprowadzonych łącznie na 120 koźlętach; Procent zwierząt nie dotkniętych chorobą wyniósł 34% dla grupy kontrolnej, a 70% dla grupy poddanej działaniu; procent zwierząt bardzo dotkniętych chorobą wyniósł 28%, jednak żadne zwierzę nie było bardzo dotknięte w przypadku grupy poddanej działaniu.

To działanie przeciwwirusowe można wyjaśnić przez fakt, że PANSTIMASE® zwiększa liczbę i gęstość płytek PEYERa, które są agregatami komórek immunizacyjnych rozprowadzonych w całym jelicie.

B. Dysfunkcje inununizacyjne.

Inne obserwacje na prosiakach w hodowli intensywnej wykazały, że PANSTIMASE® zmniejsza czas trwania zapalenia stawów, które są reakcjami zapalnymi, następującymi po zranieniach stawów u zwierząt hodowanych przy metalowych kratach. Po zagojeniu się ran, te reakcje zapalne mogą stopniowo zanikać wskutek działania komórek immunizacyjnych zwanych supresywnymi, licznych w jelicie, i które mogą migrować do stref zapalenia. Jest możli188 157 we, że PANSTIMASE® stymuluje rozmnażanie tych komórek w jelicie i że ułatwia ich migrację, co wyjaśnia fakt, że zmniejsza się o około 50% czas trwania zapalenia stawów.

C. Szczepienia.

Poprawę stanu sanitarnego stwierdzoną w hodowli intensywnej można wyjaśnić przez lepszą reakcję na szczepienia zwierząt otrzymujących pożywienie uzupełnione PANSTIMASE®. Wstępne próby laboratoryjne na myszach potwierdziły w istocie skuteczność szczepień, zwłaszcza w przypadku wykonywania ich drogą ustną.

Proteinaza lub proteinazy pozakomórkowe według wynalazku, lub proteinaza lub proteinazy, których sekwencje aminokwasowe wykazują co najmniej 60% homologii z sekwencjami proteinazy lub proteinaz pozakomórkowych według wynalazku można wykorzystać dla wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia chorób zakaźnych i dysfunkcji immunizacyjnych, jak i zwiększania skuteczności szczepionek.

6. Nieewziolności hormonalne i clooiro^jy det^tenjrru^c^jjn.; związane ze sfarzernem.

Stwierdzono, że w przypadku starej trzody reproduktorów, PANSTIMASE® wywołuje zmniejszenie przedziału czasu między odstawieniem od sutka a zapładniającym kryciem samicy (co ma tendencję do zwiększania się u macior), i stymulację popędu płciowego (który ma tendencję do zmniejszania się u wieprzów). Okazuje się, ze PANSTIMASE® pozwala zaradzić niewydolnościom hormonalnym i przypuszczalnie innym efektom negatywnym związ;anym ze starzeniem.

Można w istocie stwierdzić, że PANSTIMASE® wywołuje „odmłodzenie” u starych szczurów reproduktorów i zmniejszenie efektów negatywnych starzenia u starych macior i kur reproduktorów.

A. Pierwsze lwycie szczurów odbywa się w normalnym przm^adku w wieku około 70 chi i; jeśli odbywa się w wieku około 140 dni, osiągi reprodukcji są złe dla grupy kontrolnej, natomiast lepsze dla grupy poddanej działaniu (otrzymującej to samo pożywienie uzupełnione przez 300 mg/kg PANSTIMASE® o 400 U.A./mg).

	Gnipa Oaktralka	Grupa kontrolna	Grupa poddana działaniu
	krycie po 70 dn.	krzcie po 140 dn.	Orzcie po 140 dn.
% cakładkiuria	62%	29%	45%
śmiertelność a0ałakatadowa szczurząt	18%	35%	18%
liczba szczurząt odstawionych od ^^”1 na miot	9	6,6	8,1

Stwierdzono, że szczury kontrolne kryte 140 dnia dały gorsze wyniki, natomiast szczury poddane działaniu również kryte 140 dnia dały wyniki, które są porównywalne z wynikami normalnymi szczurów kontrolnych krytych 70 dnia; identyczne wyniki uzyskano w przypadku śmiertelności okołoporodowej. Można zatem powiedzieć, że PANSTIMASE® wywołuje „odmłodzenie” szczurów w wieku 140 dni.

B. Maciory repryduktoriu zmienionOl iak by \oe'biamZy w ..złym dziue” np. tanim j<kc wtedy, gdy hodowca ^.ι!, że nie mogą utrzymać równowagi, ani ułożyć się w sposób giętki (zamiast padnięcia całym ciężarem z ryzykiem zmiażdżenia nowonarodzonych prosiaków). W hodowli 80 macior, przud mzkotzzytakiem PANSTIMASE®, maciory są zmieniane średnio po 4,4 cyklach reprodukcji; sześć miesięcy po tym wykorzystamu, okazało się, że można zmienić maciory średnio po 5,8 cyklach reprodukcji. Można zatem uważać, że PANSTIMASE® pozwoliło na przedłużenie o około 30% życia kroduktzmkego macior buz niedopuszczalnej zmiany ich „dobrego stanu” i ich osiągów.

188 157

Starzejąc się kury nośne mają tendencję do produkcji jaj o bardziej kruchej skorupce, tego rodzaju, że procent jaj pękniętych może przewyższyć 10% przy końcu znoszenia jaj. PANSTIMASE® pozwoliła na zmniejszenie o połowę tego procentu, co implikuje stymulację metabolizmu fosforowapniowego.

Proteinaza lub proteinazy pozakomórkowe według wynalazku, lub proteinaza lub proteinazy, których sekwencje aminokwasowe wykazują co najmniej 60% homologii z sekwencjami proteinazy lub proteinaz pozakomórkowych według wynalazku można wykorzystać dla wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia niewydolności hormonalnych i chorób degeneracyjnych związanych ze starzeniem, np. zapalenia stawów, artrozy i osteoporozy.

Wstępna ocena tolerancji proteinaz pozakomórkowych.

Próby toksykologiczne wykazały, że PANSTIMASE® nie działa toksycznie na prosięta, gdy jest podawane podczas 1 miesiąca przy dawce 20 razy wyższej od dawki aktualnie zalecanej, która wynosi 40000 U.A. na kg pożywienia, ani nie działa toksycznie na szczury, gdy jest podawane podczas 3 miesiąca przy dawce 200 razy wyższej od tej dawki stosowanej.

W konsekwencji można było rozpocząć wstępną próbę tolerancji u człowieka, przy stosowanej dawce stosunkowo podwyższonej względem dawki obecnie przewidzianej; w istocie wykorzystano kapsułki żelowe zawierające 750000 U.A. PANSTIMASE® oczyszczonego (przyjęto 50 mg próbki zawierającej 15000 U.A./mg), który podano chorym w ilości 2 do 3 kapsułek żelowych dziennie podczas 2 lub 3 tygodni.

Wybrano 24 pacjentów (12 mężczyzn - 12 kobiet), o średnim wieku 44 lata, przy rozpiętości wieku od 25 do 70 lat; 17 z tych pacjentów cierpiało na dyspepsję w szerszym znaczeniu tego słowa, bez wykrycia w badaniach paraklinicznych żadnej organicznej zmiany chorobowej (badania laboratoryjne, radiologia, w pewnych przypadkach endoskopia); 7 z tych pacjentów było nosicielami organicznych zmian chorobowych: 3 - trzustkowej, 2 - gastrektomii (jeden ze względu na wrzód, inny ze względu na nowotwór), 2 - kolektomii (jedna osoba - wrzodowo-krwotoczne zapalenie odbytnicy i okrężnicy, jedna - nowotwór).

W zespole tych 24 pacjentów, zbadano zmianę symptomów i ciężaru, gdy występował deficyt wagi, przy niedożywieniu lub bez, na początku leczenia. Szereg osobników sygnalizowało poprawę związaną z regularnością przechodzenia zawartości jelitowej w przypadku zatwardzenia lub - przeciwnie biegunki, jak również przybranie na wadze w przypadku niedożywienia.

Rozpoczęto także wstępną próbę dotyczącą mukowiscydozy u chorego w wieku 18 lat, który otrzymywał codziennie przez 3 tygodnie 2 kapsułki żelowe zawierające każda 10000 U.A. PANSTIMASE®; stwierdzono poprawę symptomów, na poziomie jelit (stolec w mniejszej ilości i mniej kleisty) oraz na poziomie oskrzelowym (odkrztuszanie łatwiejsze i mniej częste).

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie pozakomórkowych proteinaz, w których składnikiem aktywnym jest dominująca proteinaza pozakomórkowa typu II z Streptomycces fradiae, lub ich mieszanin z jedną lub innymi dwiema pozakomórkowymi proteinazami wytwarzanymi przez Streptomycces fradiae, lub jedną lub dwiema proteinazami, których sekwencja aminokwasową posiada 60% homologii z sekwencjami dominującej proteinazy pozakomórkowej lub z sekwencjami mieszaniny proteinaz, w połączeniu z zaróbkąlub podłożem obojętnym, nietoksycznym i dopuszczalnym fizjologicznie do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia chorób tranzytu jelitowego i przedłużonego przylegania zarazków do błon śluzowych, do ułatwienia regeneracji kosmków błony śluzowej jelit i do zapobiegania i/lub leczenia wrzodów trawiennych i enterotoksemii zapewniając regulację wydzielania śluzu jelitowego, oskrzelowego lub płciowego.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia, złego absorbowania środków leczniczych lub odżywek.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia, chorób trzustki i niewydolności wątroby.
4. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia, chorób zakaźnych, dysfunkcji immunolologicznych, jak również zwiększania skuteczności szczepionek.
5. Zastosowanie pozakomórkowej proteinazy lub proteinaz zdefiniowanych w zastrz. 1, do wytwarzania leku przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia, niewydolności hormonalnych i chorób degeneracyjnych związanych ze starzeniem.

Wynalazek dotyczy zastosowania pozakomórkowych proteinaz, których składnikiem aktywnym jest dominująca proteinaza pozakomórkowa typu II ze Streptomuces fradiae.

Kompozycje farmaceutyczne oparte na pozakomórkowej proteinazie typu II lub kompleksie enzymatycznym zawierającym ten enzym stymulują czynność jelit i mogą się przyczyniać do zapobiegania i/lub leczenia wielu chorób w tym także chorób degeneracyjnych związanych ze starzeniem.

Znane są kompozycje farmaceutyczne zawierające jako składnik aktywny jeden lub więcej enzymów wyekstrahowanych lub zawartych w kompleksie enzymatycznym otrzymanym przez hodowlę Streptomyces fradiae w warunkach określonych we Francuskim Opisie Patentowym 2600340 na nazwisko zgłaszającego.

W cytowanym uprzednio opisie patentowym opisano wytwarzanie i zastosowanie w zootechnice nowego kompleksu proteolitycznego otrzymanego wychodząc z nitkowatej bakterii Streptomyces fradiae; kompleks ten jest dalej określany przez obecną nazwę handlową PANSTIMASE®.

Ta bakteria nitkowata może wytwarzać równocześnie co najmniej 5 proteinaz i 2 peptydazy; te 7 enzymów zostało opisanych przez K. Morihara i in., (Biochim. Biophys. Acta, 1967, 139, 382). Ponieważ są one dodawane łącznie do pożywienia spożywanego przez zwierzęta, te 7 enzymów wywołuje nadmierne zmniejszenie lepkości śluzu jelit i może następnie wywołać tworzenie wrzodów na ściankach jelit. Dlatego zatem, te 7 enzymów jeśli są podawane łącznie wywiera przeciwny efekt zootechnologiczny.

W warunkach wskazanych w uprzednio cytowanym opisie patentowym otrzymuje się PANSTIMASE®, który składa się wyłącznie z 3 proteinaz pozakomórkowych, z przewagą jednej z nich i z wyłączeniem proteinaz i peptydaz wewnątrzkomórkowych. Po dodaniu do

188 157 pożywienia spożywanego przez zwierzęta PANSTIMASE® wywołuje umiarkowane zmniejszenie lepkości śluzu jelit i nie jest zdolny do atakowania ścianki jelit.

Równocześnie ze stosunkowo umiarkowanym działaniem na proteiny śluzu jelit, PANSTIMASE® wywiera silniejsze działanie na proteiny surowców wchodzących w skład pożywienia, co poprawia ich trawienie.

Oprócz tych bezpośrednich działań w jelitach, PANSTIMASE® wywiera działania pośrednie na różne narządy, zwłaszcza na trzustkę; jak już wskazano w uprzednim opisie patentowym, stwierdzono, że wywołuje on zwiększenie o 50 do 80% stężenia enzymów lub proenzymów w tym narządzie.

Ze względu na te korzystne działania PANSTIMASE® jest obecnie stosowana jako uzupełnienie dodawane do pożywienia przeznaczonego dla zwierząt dla polepszenia ich wzrostu lub produktywności. Można także stwierdzić, że poprawia on odporność na choroby zakaźne, bakteryjne lub wirusowe i zmniejsza pewne efekty negatywne starzenia.

Stwierdzenia te zasugerowały zastosowanie w terapii, zwierząt jak i ludzi, PANSTIMASE® lub składników aktywnych, z których jest on złożony, a mianowicie, dominującej proteinazy pozakomórkowej wytworzonej przez Streptomyces fradiae lub mieszaniny tej dominującej proteinazy pozakomórkowej z co najmniej jedną z dwóch innych proteinaz pozakomórkowych wytworzonych przez Streptomyces fradiae.

Składniki aktywne kompozycji farmaceutycznych wymagają jednak dodatkowego oczyszczania względem produktu stosowanego dla zwierząt. W warunkach wskazanych w uprzednio cytowanym opisie patentowym, otrzymuje się nieoczyszczony PANSTIMASE®, którego miano wynosi co najmniej 2000 U.A./mg.

Jednostka Ansona (w skrócie U.A.) jest tu zdefiniowana jako ilość enzymu, która inkubowana przez 10 min w 25°C i przy pH 7,5 w obecności denaturowanej hemoglobiny, uwalnia substrat równoważny 1 mcg tyrozyny, oznaczoną przez absorpcję spektrofotometryczną przy 280 nm na przesączu niewytrącalnym przez kwas trojchlorooctowy.

Dopasowywanie warunków wskazanych w cytowanym uprzednio opisie patentowym pozwala na otrzymanie półoczyszczonego PANSTIMASE®, którego miano wynosi co najmniej 4000 U.A./mg. Klasyczne techniki frakcjonowanego wytrącania, lub przepuszczanie przez kolumnę pozwalają na otrzymanie oddzielnie każdej z 3 proteinaz składających się na PANSTIMASE®. Aktywność właściwa dominującej proteinazy pozakomórkowej wynosi ponad 100000 U.A./mg i jest wyraźnie wyższa niż 2 innych proteinaz; jej ciężar cząsteczkowy wynosi około 32 kDa, a punkt izoelektryczny - około 7,0.

Ta dominująca proteinaza sama wykazuje główne właściwości fizjologiczne PANSTIMASE®, a mianowicie sama wywiera charakterystyczne działanie na dwie ważne proteiny: toksynę cholery i kolagen.

Toksyna cholery jest homologiem toksyny LT wytwarzanej przez pewne patogenne pałeczki okrężnicy; jest ona złożona z podjednostki A, która jest agresywna, i podjednostki B, która jest immunostymulująca. Przy małym stężeniu, porównywalnym do istniejącego w jelitach zwierząt otrzymujących żywność uzupełnianą PANSTIMASE®, dominująca proteinaza niszczy selektywnie podjednostkę A bez niszczenia podjednostki B, która zachowuje zatem swoją zdolność stymulowania układu immunologicznego.

Kolagen jest proteiną najbardziej rozpowszechnioną w królestwie zwierząt. U ssaków różne rodzaje kolagenu stanowią około jednej trzeciej ogółu protein. Wiadomo, że rozpuszczalność kolagenu z mięśni w ciepłej wodzie jest znaczna, jeśli pochodzi od młodych zwierząt, a słaba jeśli pochodzi od zwierząt starych.

Gdy kolagen ze zwierząt starych poddaje się działaniu dominującej proteinazy zwiększa się jego rozpuszczalność w ciepłej wodzie, co staje się porównywalne z rozpuszczalnością w przypadku kolagenu od młodych zwierząt. Można wywnioskować, że ta proteinaza wywołuje pewne „odmłodzenie” kolagenu.

Większość wyników badań na zwierzętach odpowiada próbom wykonanym z PANSTIMASE® nieoczyszczonym lub półoczyszczonym. W przypadku człowieka można zastosować albo PANSTIMASE® półoczyszczony, albo proteinazę lub proteinazy oczyszczone, z których jest on złożony, a mianowicie dominującą proteinazę pozakomórkową lub mieszaninę tej pro4

188 157 teinazy pozakomórkowej z jedną z co najmniej dwóch innych proteinaz pozakomórkowych, lub z proteinazą lub proteinazami, których sekwencje aminokwasowe mają co najmniej 60% homologii z sekwencjami dominującej proteinazy pozakomórkowej lub z sekwencjami mieszaniny proteinaz, takiej jak określono uprzednio.