PL188190B1 - Sposób wytwarzania polipeptydu - Google Patents
Sposób wytwarzania polipeptyduInfo
- Publication number
- PL188190B1 PL188190B1 PL96360440A PL36044096A PL188190B1 PL 188190 B1 PL188190 B1 PL 188190B1 PL 96360440 A PL96360440 A PL 96360440A PL 36044096 A PL36044096 A PL 36044096A PL 188190 B1 PL188190 B1 PL 188190B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- enzyme
- paa
- dna
- coa
- coa ligase
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 32
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims abstract description 18
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 65
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 21
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 20
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 15
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 5
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- -1 phenylacetyl Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N acetic acid phenyl ester Natural products CC(=O)OC1=CC=CC=C1 IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 12
- 229940049953 phenylacetate Drugs 0.000 claims 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 7
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims 6
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims 3
- 102100037458 Dephospho-CoA kinase Human genes 0.000 claims 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- ZIGIFDRJFZYEEQ-ZBWAGTGGSA-N Phenylacetyl coenzyme A Natural products S(C(=O)Cc1ccccc1)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C ZIGIFDRJFZYEEQ-ZBWAGTGGSA-N 0.000 claims 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims 2
- 108010049285 dephospho-CoA kinase Proteins 0.000 claims 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 2
- QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N fluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)CF QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 claims 2
- ZIGIFDRJFZYEEQ-CECATXLMSA-N phenylacetyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC1=CC=CC=C1 ZIGIFDRJFZYEEQ-CECATXLMSA-N 0.000 claims 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims 2
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 claims 2
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 claims 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000005870 Coenzyme A Ligases Human genes 0.000 claims 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims 1
- 108010011449 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase Proteins 0.000 claims 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 claims 1
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 claims 1
- 244000089486 Phragmites australis subsp australis Species 0.000 claims 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims 1
- 244000197975 Solidago virgaurea Species 0.000 claims 1
- 235000000914 Solidago virgaurea Nutrition 0.000 claims 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- 108010013491 acyl-CoA-6-aminopenicillanic acid acyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 claims 1
- SPNAEHGLBRRCGL-BIEWRJSYSA-N adipoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 SPNAEHGLBRRCGL-BIEWRJSYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims 1
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 claims 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 claims 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 claims 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 claims 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 claims 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims 1
- OEXFMSFODMQEPE-CGSNXLPNSA-N hexanoyl-coenzyme a Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OEXFMSFODMQEPE-CGSNXLPNSA-N 0.000 claims 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 claims 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims 1
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 claims 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 claims 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims 1
- SBPBPUFWNOBPMN-CECATXLMSA-N phenoxyacetyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)COC1=CC=CC=C1 SBPBPUFWNOBPMN-CECATXLMSA-N 0.000 claims 1
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims 1
- 108010089113 phenylacetate - CoA ligase Proteins 0.000 claims 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 claims 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012552 review Methods 0.000 claims 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 claims 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 claims 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 4
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091060592 XDNA Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPEONPCAJPLMDZ-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(3-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-carbonyl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound C1(C=CC(N1C=1C=C(C(=O)C2(C(=O)NC(C2)=O)O)C=CC1)=O)=O KPEONPCAJPLMDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDGFKZKMIQQRPU-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-4-[3-(3-bromo-5-chloro-4-hydroxyphenyl)-1,1-dioxo-2,1$l^{6}-benzoxathiol-3-yl]-6-chlorophenol Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Cl)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Cl)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 MDGFKZKMIQQRPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039819 Actin, alpha cardiac muscle 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000615866 Antho Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241001057440 Didion Species 0.000 description 1
- JYGLAHSAISAEAL-UHFFFAOYSA-N Diphenadione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C1C(=O)C(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JYGLAHSAISAEAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101000959247 Homo sapiens Actin, alpha cardiac muscle 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000009172 bursting Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N n-[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-2-acetamido-4,5,6-trihydroxy-1-oxohexan-3-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-4-yl]acetamide Chemical compound C[C@H]1O[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@@H]1O CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- RMJPDRUNCDRUQC-MCDZGGTQSA-M sodium;[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O RMJPDRUNCDRUQC-MCDZGGTQSA-M 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/02—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin in presence of phenylacetic acid or phenylacetamide or their derivatives not to be used
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Sposób wytwarzania polipeptydu posiadajacego aktywnosc ligazy PAA-CoA, obej- mujacy hodowle gatunku Penicillium, obróbke tej hodowli i odzyskiwanie produktu kon- cowego, znam ienny tym, ze hoduje sie gatunek Penicillium, korzystnie Penicillum chry- sogenum, grzybnie zbiera, przeprowadza sie nadzwiekowienie grzybni, usuwa resztki komórek, frakcjonuje sie produkt nadzwiekowienia metoda chromatografii anionowymien nej, a nastepnie chromatografii oddzialywan hydrofobowych, chromatografii jonowo- asocjacyjnej z eluowaniem substratu i chromatografii saczenia przez zel, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne sa wykrywane przy uzyciu oznaczenia zaleznego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A. PL PL PL
Description
Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami:
Przykład 1- Fermentacja P. chrysogenum
Zarodnikami Penicillium chrysogenum (SmithKline Beecham BW 1901) zaszczepiono 15 ml pożywki PVS (35 g/l wyciągu z kukurydzy, 15 g/l glukozy, 5 g/l CaCO3, 8 ml/l oleju rzepakowego, pH doprowadzone do 5,9 przy użyciu NaOH) w kolbie Erlenmeyera 100 ml. Kulturę hodowano przez 48 h w temperaturze 26°C wytrząsając ruchem orbitalnym (230 obr./min) przed pobraniem 1ml całej brzeczki i przeniesieniem do 10 ml pożywki C5 (35 g/l wyciągu z kukurydzy, 85 g/l laktozy, 10 g/l CaCO3, 10 g/l NaH2POą, 8 g/l (NH^SO4, 4 g/l MgSO4 • 7H2O, 4 g/l Na2SO4, 6 ml/l oleju rzepakowego, pH doprowadzone do 6,0 przy użyciu NaOH) w kolbie Erlenmeyera 100 ml. Następnie kulturę hodowano przez 55 h w temperaturze 26°C wytrząsając ruchem orbitalnym (230 obr./min) przed zebraniem grzybni.
Przykład 2 - Wytwarzanie ekstraktów protein z P. chrysogenum do oznaczenia, oczyszczenia i blottingu metodą Western ligazy PAA-CoA.
Grzybnie z kolby Erlenmeyera 55 h C% hodowane jak opisano w przykładzie 1 zebrano metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych (Whatman GF/A). Matę grzybni przemyto 300 ml roztworu 0,9% (wag./obj.) chlorku sodowego (4°C), a następnie zdrapano z sączka i umieszczono w 10 ml buforu do oznaczania ligazy (30 mM Tris-HCl pH 9,0,1 mM ditiotreitolu, 100 pg/ml Prefabloc™ w 50% glicerolu). Następnie grzybnię nadźwiękowiono na łaźni lodowej (rozrywanie 3 x 15 s przy użyciu generatora ultradźwięków Ultrasonics model W-385, nastawienie mocy 5, tempo cyklu 5 s, 50% cyklu roboczego), a następnie resztki grzybni sprasowano w pastylkę metodą odwirowania (18000 x g, 4°C, 30 min). Supernatant zamrożono w -70°C do przechowywania albo stosowano natychmiast do oznaczania ligazy PAA-CoA, oczyszczania lub blottingu metodą Western (przykład 7).
Przykład 3 - Oznaczanie ligazy PAA-CoA in vitro.
W celu wykazania obecności aktywności ligazy PAA-CoA w ekstraktach lub frakcjach z chromatografii kolumnowej mieszano 20 pl z roztworem 0,1 M kwasu fenylooctowego w 50 mM Tris-HCl pH 7,5 (20 pl), 0,1 M soli sodowej ATP (10 pl), 0,2 M chlorku magnezowego 10 pl, 0,02 M soli sodowej koenzymu A (10 pl) i 0,015 M ditiotreitolu (10 pl) w plastikowych probówkach Eppendorfa. Probówki mieszano ruchem wirowym (5 s), a następnie umieszczano w łaźni wodnej o temperaturze 30°C na 15 minut. Następnie do mieszaniny dodawano metanol (100 pl) i probówki odwirowywano (14K, 1 min) w celu wytrącenia protein. Frakcje supernatantu analizowano na obecność PAA-CoA metodą HPLC (przykład 4). W każdej serii oznaczeń razem z wzorcem PAA-CoA jako próbę kontrolną dodatnią oznaczano ekstrakt protein wytworzony z fermentacji w kolbie P chrysogenum (przykład 1).
Przykład 4 - Analiza HPLC supernatantów z oznaczenia.
Próbki supernatantów z oznaczeń ligazy PAA-CoA (przykład 3) analizowano na obecność PAA-CoA używając układu HPLC Waters LCM1. Próbki (100 pl) wstrzykiwano na kolumnę sprężającą Radial Pak C18 w temperaturze pokojowej przy szybkości przepływu 2,5 ml/min, używając fazy ruchomej 0,2 M fosforanu sodowego pH 5,4 (Bufor A) izokratycznie od 0-4 min. Następnie stosowano liniowy gradient do 100% Bufora B zawierającego 0,16 M
188 190 fosforan sodowy o pH 5,4 w 40% acetonitrylu (4-10 min). Przez dalsze 2 min utrzymywano 100% Bufora B, a następnie układ ponownie doprowadzano do równowagi przygotowując do następnego wstrzyknięcia przy użyciu liniowego gradientu z powrotem do 100% A (12-13 min). Piki wykrywano przy 260 nm, zaś PAA-CoA miał czas retencji 12 min. Za próbki dodatnie uznawano te, które miały piki współeluujące się ze wzorcem PAA-CoA i wykazywały takie same jak wzorzec widma absorpcyjne UV określone na spektrometrze z zespołem fotodiod.
Przykład 5 - Oczyszczanie ligazy PAA-CoA.
Wymagana była staranność, ponieważ stwierdzono skrajnie labilną aktywność enzymu. Nieskuteczne były próby strącania enzymu siarczanem amonowym, ponieważ w otrzymanym materiale nie można było stwierdzić żadnej aktywności. To samo przez się odróżnia niniejszy enzym od opisanego w WO 96/10085 (Gist-Brocades).
O ile nie stwierdzono inaczej, to następującą urocedurę prowadzono zo temp etaturzc 4°C stosując bufor C zawierający 30 mM Tris-HCl, 4 mM DtT, 4 mM EDTA, 5 mM MgCh i 20% glicerolu (obj.) przy pH 9,0. Rozdziały uzyskiwano stosując układ Phacmaoia HiLoad™. Ekstrakt bez komórek (500 ml), wytworzony jak w przykładzie 1, rozmrażano powoli w temperaturze 4°C. Następnie ekstrakt uadtowjono na pH 9,0 stosując 5 M NaOH przy mieszaniu na łaźni lodowej. Do tego mieszanego ekstraktu dodano 275 g żywicy jonowymiennej Q-Ssdhjcose Fast Flow (Pharmacia), którą uprzednio przemyto 3 1 wody, a następnie 1 1 buforu C. Tę mieszaninę mieszano przez 1,5 h na łaźni lodowej. Następnie zawiesinę przesączono przez dalsze 50 g przemytej żywicy Q-Sepharese na spiekanym sączku szklanym pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie żywicę przemyto kolejnymi 100 ml bufora C, a następnie zostawiono aż odciekła do sucha, otrzymując 600 ml klarownego ekstraktu zawierającego ligazę PAA-CoA. Następnie dodano siarczan amonowy (92,4 g, tj. ilość mniejsza niż do strącania) i roztwór mieszano na łaźni lodowej przez 1 h, po czym przesączono (sączek 0,45 pm, Millipere, typ HA).
Następnie ekstrakt ligazy PAA-CoA (700 ml) podano z szybkością 1 ml/min na kolumnę Phenylsepharese 6 Fast Flow o niskim podstawieniu (Pharmacia, 12 cm x 2,6 cm średnicy) uprzednio potraktowaną 1 1 bufora D (jak bufor C ze 140 g/l siarczanu amonowego). Następnie napełnioną kolumnę przemyto 230 ml bufora D z szybkością 0,8 ml/min, a potem sluowαno liniowym gradientem od 100% bufora D do 100% bufora C przez 238 ml z szybkością 0,8 ml/min. Zbierano frakcje po 5,5 ml i testowano na obecność aktywności ligazy PAA-CeA, jak podano w przykładzie 3. Frakcje aktywne, od 41 do 49, zlano razem otrzymując 50 ml, które podano z szybkością 0,5 ml/min na 5 ml kolumnę HiTrap™ Blue do chromatografii dowinowactwa (Pharmacia), uprzednio przemytą 50 ml bufora C. Napełnioną kolumnę przemyto 15 ml bufora C, a następnie eluowauo stosując liniowy gradient od 100% bufora C do 100% bufora E w ciągu 25 ml z szybkością 0,5 ml/min. Bufor E był taki jak bufor C, z dodatkiem kwasu fenylooctowego do otrzymania końcowego stężenia 0,5 M, który donownis nastawiono na pH 9,0 przy pomocy stałego NaOH. Eluowanie z kolumny dowiuowaotwa przy pomocy naturalnego substratu zastosowano dla zwiększenia selektywności oczyszczania i dla umożliwienia pomiaru aktywności enzymu w powstałych frakcjach. Eluowanie NaCl okazało się nieskuteczne, ponieważ ta sól hamowała aktywność enzymu. W przeciwieństwie do tego enzym opisany w WO 96/10085 okazał się stabilny przy eluowaniu w KC1.
Frakcje aktywne 21, 22 i 23 zlano razem otrzymując 6 ml, które następnie rozdzielano przy szybkości przepływu 0,25 ml/min na wysokosprawner kolumnie z wykluczaniem wielkości Ssdhaoryl S-200 (Pharmacia, 64 cm x 2,6 cm średnicy), którą uprzednio równoważono w buforze F (jak bufor C, z nastawieniem na pH 7,5 przy użyciu 5 M HC1). Frakcje aktywne, 54 do 65, zlano razem otrzymując 11 ml, które zatężono do 60 μ1 metodą ułtrαsąozeuia wirówkowego (Centcioou, odcinanie przy ciężarze cząsteczkowym 10000, Amicon Inc.). Analiza frakcji z kolumny wykluczania wielkości metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowymSDS (przykład 6) wykazała proteinę o ciężarze 63 000, której intensywność korelowała z aktywnością ligazy PAA-CoA. Do zakończenia oczyszczania i do umożliwienia sekwsuojeuowania aminokwasów N-terminalnych ligazy PAA-CoA zastosowano Blottmg metodą Western (przykład 6).
188 190
Przykład 6 - Blotting metodą Western proteiny ligazy PAA-CoA.
W celu uzyskania materiału do sekwencjonowania aminokwasów N-terminalnych oczyszczoną proteinę (60 gl, przykład 5) zmieszano z równą objętością bufora próbki SDSPaGe zawierającego 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (10 ml), dodecylosiarczan sodowy (2 g, ultraczysty), 2-merkaptoetanol (1 ml), glicerol (10 ml), destylowaną wodę demineralizowaną (7 ml) i błękit bromochlorofenolowy 0,1% (2 ml). Tę mieszaninę gotowano przez 10 min i zostawiono do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Próbki (5, 15 i 20 gl) załadowano na wylany żel poliakryloamidowy 10% (żel spiętrzający 4%) w kuwecie do elektroforezy Bio-Rad Mini Protean II, przygotowany przy zastosowaniu procedury producenta. Elektroforezę prowadzono w buforze elektrodowym zawierającym 0,025 M Tris, 0,192 M glicyny i 0,1% wag./obj. dodecylosiarczanu sodowego (ultra-czystego) przy 200 V przez 45 min, po czym żel poliakryloamidowy umieszczono w buforze do elektroblottingu (10 mM kwasu 3-[cykloheksyloamino]-1propanosulfonowego, pH 11 w 10% metanolu) na 5 min. Proteiny w żelu poliakryloamidowym przeniesiono na membranę unieruchamiającą Applied Biosystems ProBlott™ przy użyciu kuwety do przenoszenia elektroforetycznego Bio-Rad Mini Trans-Blot zgodnie z procedurą Applied Biosystems. Na zakończenie blottingu membranę zabarwiono błękitem Coomassie R-250 stosując sposób barwienia w procedurze Applied Biosystems. Z membrany wycięto pasmo protein przy 63 kDa i ten materiał zastosowano do ustalania sekwencji aminokwasów N-terminalnych (przykład 7).
Przykład 7 - Ustalanie sekwencji aminokwasów N-terminalnych.
Sekwencję aminokwasów N-terminalnych uzyskano z proteiny po blottingu (przykład 6) stosując Applied Biosystems (ABI) 477A Pulsed Liquid Seąuencer. Sekwencję uzyskano stosując normalną chemię Edmana z rozpoznawaniem uwolnionych aminokwasów znaczonych PTH przy pomocy chromatografii wąskokanałowej ABI 120A. Analiza oczyszczonej proteiny ligazy PAA-CoA dała następujące przypisanie sekwencji: V-F-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P
Przykład 8 - Synteza peptydu N-terminalnego ligazy PAA-CoA.
Sekwencję aminokwasów N-terminalnych określoną z proteiny 63 000 PAA-CoA (przykład 7) zastosowano do syntezy peptydu. Został on zsyntetyzowany przez Peptide and Protein Research Consultants (Washington Singer Laboratories, University of Exeter, Perry Road, Exeter, Devon EX4 4QG, UK) jako 50 mg wolnych peptydów. 12 mg skoniugowano z BSA (albuminą z osocza wołowego) aktywowaną maleimidem przy zastosowaniu SMCC (4-(Nmaleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sukcynoimidylu), a 2,5 mg skoniugowano z OVA (owalbuminą) aktywowaną maleimidem przy zastosowaniu MBS (estrem N-hydroksysukcynoimidowym m-maleimidobenzoilu).
Przykład 9 - Wytworzenie przeciwciał poliklonalnych wobec peptydu pochodzącego z N-końca proteiny 63 kDa ligazy PAA-CoA.
Peptyd sprzężony z BSA (przykład 8) wykorzystano do otrzymania przeciwciał poliklonalnych królika specyficznych wobec proteiny ligazy PAA-CoA. Koniugat peptyd-BSA (375 gg/l) wysterylizowano metodą sączenia (sączek 0,2 gm) i 1 ml sterylnego roztworu starannie zmieszano z 2 ml nie-wrzodziejącego kompletnego adjuwantu Freundsa (Brian Morris International, Guilford, Wielka Brytania). Całkowitą ilość 0,8 ml tej mieszaniny (100 gg koniugatu peptydu-BSA) podano podskórnie nowozelandzkim białym królikom (w przybliżeniu dziesięciotygodniowym) w czterech różnych miejscach iniekcji. Dalsze immunizacje podano w 28 i 58 dniu po początkowej immunizacji jak opisano wyżej, z tym wyjątkiem, ze zastosowano nie-wrzodziejący niekompletny adjuwant Freundsa. Próbki krwi do testów pobrano z brzeżnej żyły ucha w 42 i 72 dniu po początkowej immunizacji dla oceny miana przeciwciał i specyficzności przy użyciu oznaczenia ELISA (oznaczenia immunosorbentu związanego z enzymem) (przykład 10).
Przykład 10 - Oznaczenie immunosorbentu związanego z enzymem (ELISA) do określenia miana przeciwciał i specyficzności wobec ligazy 63 kDa PAA-CoA.
Oznaczenie miana przeciwciał
Płytkę do mikromianowania o 96 zagłębieniach płaskodennych (Nunc MaxiSorp™) pokryto koniugatem peptydu-OVA ligazy PAA-CoA (200 gl na zagłębienie, 0-10 gg/ml) w roztworze fizjologicznym buforowanym fosforanami pH 7,2 (8 g/l chlorku sodowego, 0,2 g/l
188 190 chlorku potasowego, 1,44 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 0,24 g/l diwodoroortofosforanu potasowego, pH 7,2). Pokrytą płytkę do mikromianowania inkubowano w 4°C przez w przybliżeniu 18 h, po czym płytkę przemyto cztery razy buforem do przemywania (10 mM Tris, 0,15 M chlorku sodowego, 0,02% azydku sodowego, 0,05% Tween 20, pH 7,2) przy użyciu urządzenia do przemywania płytek Dynatech MRW. Ten sposób przemywania stosowano w pozostałej części procedury, o ile nie podano inaczej. Do płytki dodano bufor blokujący (1,56 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 0,5% gamma-globuliny wołowej z Sigma, pH 7,4, 200 pl na zagłębienie) i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze Dynatech Varishaker przez 1 h. Wszystkie kolejne inkubacje w 37 °C wykonywano tym sposobem. Płytkę przemyto cztery razy, a następnie do płytki dodano przeciwciało poliklonalne królika (100 pl na zagłębienie, rozcieńczenie 0-1:500000), rozcieńczone w buforze do oznaczenia (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodowego, 1 mM chlorku magnezowego, 0,5% BSA, 0,25% gamma-globuliny wołowej, 0,02% azydku sodowego, pH 7,4), i inkubowano w temperaturze 37°C. Po przemyciu płytki, do płytki dodawano biotynylowane przeciwciało antykrólicze IgG z Amersham (100 pl na zagłębienie, rozcieńczenie 1:5000 w buforze do oznaczenia), i inkubowano w temperaturze 37°C.
Płytkę przemyto i dodano do płytki koniugat streptawidyny z fosfatazą alkaliczną z Amersham (100 pl na zagłębienie, rozcieńczenie 1:2000 w buforze do oznaczenia), i inkubowano w temperaturze 37°C. Po przemyciu płytki dodano do płytki (100 pl na zagłębienie) fosforan p-nitrofenylu (Sigma, 1 mg/ml) rozpuszczony w buforze zawierającym 0,1 M glicyny, (7,51 g/l glicyny, 203 mg/l chlorku magnezowego, 136 mg/l chlorku cynkowego, pH 10,4), i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 min. Następnie dodano do płytki wodorotlenek sodowy (2 M, 50 pl na zagłębienie) i zmierzono absorbancję każdego zagłębienia przy 405 nm stosując czytnik płytek Anthos Labtec. Otrzymano miana przeciwciał pomiędzy 1:500000 i 1:1000000.
Oznaczanie specyficzności przeciwciała
Dla wykazania, że przeciwciała monoklonalne królika mogą reagować z nieskoniugowanym peptydem ligazy PAA-CoA wykonano oznaczenie ELISA jak opisano wyżej, ze zmianą na etapie inkubacji, który wykorzystywał przeciwciała poliklonalne królika. Przeciwciała rozcieńczono 1:100000-1:400000 w buforze do oznaczenia i 50 pl rozcieńczonego przeciwciała dodano do zagłębień zawierających 50 pl nieskoniugowanego peptydu (0-20 pg/ml) przygotowanego w buforze do oznaczenia zawierającym 2-merkaptoetanol (0,01% obj.). Przy stężeniu nieskoniugowanego peptydu w przybliżeniu 2 pg/ml osiągnięto 50% inhibicji reaktywności przeciwciała z koniugatem peptydu-OVA.
Przykład 11- Oznaczenie specyficzności przeciwciała na biotach uzyskanych metodą Western na ligazę PAA-CoA w ekstraktach z Penicillium chrysogenum, E. coli i na oczyszczonych próbkach proteiny.
Ekstrakty wytworzone z hodowli w kolbach Penicillium chrysogenum (BW 1901 i BW 1900A - szczep pochodzący z projektu przypadkowej mutacji), z E. coli JM 109 i z próbek oczyszczonej proteiny ligazy PAA-CoA blottingowano metodą Western jak opisano w przykładzie 6, z tym że nie barwiono membrany błękitem Coomassie. Membrany po blottingu umieszczono w buforze blokującym (1,56 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 8,8 g/l chlorku sodowego, 0,2 g/l ficoll 400, 0,2 g/l poliwinylopirolidonu, 0,5% gamma-globuliny wołowej, pH 7,4) i inkubowano przez około 18 h w 4°C. Następnie membranę przemyto cztery razy buforem do przemywania (10 mM Tris, 0,15 M chlorku sodowego, 0,05% Tween 20, pH 7,2) przed inkubacją (temperatura pokojowa, 60 min) z przeciwciałami poliklonalnymi królika wytworzonymi jak podano w przykładzie 9 i uprzednio rozcieńczonymi 1:100 w buforze do oznaczania (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodowego, 1 mM chlorku magnezowego, 0,5% BSA, 0,25% gamma-globuliny wołowej pH 7,4). Po czterech dalszych przemywaniach w buforze do przemywania membranę inkubowano z koniugatem oślej przeciwkróliczej IgG z peroksydazą chrzanu (Bio-Rad, 1:2000 w buforze do oznaczania, 60 min, temperatura pokojowa), a następnie czterokrotnie przemyto buforem do przemywania. Następnie membranę inkubowano z S^ł^:^^^^tem peroksydazy (Bio-Rad Horseradish Peroxidase Conjugate Substrate Kit) przez 10 min w temperaturze pokojowej przed zatrzymaniem reakcji metodą przemycia
188 190 biotu przy pięciu zmianach destylowanej wody zdemineralizowanej. Za wyniki pozytywne uznano te próbki proteiny ligazy PAA-CoA, które miały pasmo przy około 63 000, które współmigrowało z pasmem oczyszczonej ligazy PAA-CoA. W ekstrakcie protein E. coli JM 109 nie wykryto pozytywnego pasma przy 63 Οθ0.
Przykład 12 - Konstrukcja banku cDNA Penicillium chrysogenum.
Bank cDNA Penicillium chrysogenum (szczep SmithKline Beecham BW 1901) skonstruowano według podręcznika do ZAP Express™ cDNA Synthesis Kit z Stratagene. RNA wydzielono ze szczepu BW 1901 jak następuje. Szczep BW 1901 hodowano jak podano w przykładzie 1 przez 40 h przed zebraniem grzybni metodą sączenia przez dwa sączki z mikrowłókna szklanego Whatman GF/A 9,0 cm. Grzybnię przemyto 100 ml DEPC (dietylopirokarbanianu) potraktowanego wodą destylowaną. Następnie grzybnię roztarto w ciekłym azocie stosując moździerz i tłuczek potraktowane DEPC. Zamrożoną sproszkowaną grzybnię przeniesiono do probówki do wirówki 50 ml, zawierającej 10 ml roztworu G (4 M tiocyjanianu guanidyniowego, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA). Proszek zawieszono w roztworze G i zostawiono na łaźni lodowej na 15 min. Resztki grzybni tabletkowano przy 17500 x g w temperaturze 4°C przez 20 min. Supernatant zebrano w innej probówce do wirówki 50 ml i RNA ekstrahowano jak opisali Chomczynski i Sacchi (1987) Analytical Biochemistry 162, 156-159. Z całkowitej ilości RNA wydzielono poliA+ RNA stosując zestaw wirującej kolumny z celulozą CP Laboratories Mini-Oligo (DT) zgodnie z instrukcją producenta. PoliA+ RNA analizowano metodą elektroforezy żelowej jak opisali Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (wydanie drugie). Pobrano próbki poliA4 RNA(5 pg) i wykorzystano do syntezy cDNA o podwójnym łańcuchu flankowanego przez miejsce restrykcji EcoRI na końcu 5' i miejsce restrykcji Xhol na końcu 3' cDNA, zgodnie z protokołem syntezy cDNA ZAP Express™ Stratagene. Tak zsyntetyzowane cDNA frakcjonowano zależnie od wielkości przepuszczając przez kolumny wirujące Sephacryl S-400 Stratagene dostarczone z zestawem do syntezy cDNA zgodnie z instrukcją producenta. Frakcjonowane cDNA ligowano do ramion XhoI i EcoRI ZZAP Express zgodnie z podręcznikiem Stratagene. Następnie ligowane ZDNA pakietowano stosując zestaw Gigapack II Gold Packaging Stratagene według procedury z podręcznika. Powstałe bakteriofagi cDNA wzmocniono przez posiewanie na pożywce stałej, inkubując przez 8 godzin. Otrzymano ponad 250000 niezależnych klonów i bakteriofagi eluowano w 20 ml pożywki SM (0,1 M NaCl, 0,01 M MgSOą, 0,05 M Tris-HCl pH 7,5, 0,01% żelatyny) na szalkę Nunc, podzielono i przechowywano jak opisali Sambrook i in. (1989).
Przykład 13 -Badania immunoprzesiewowe banku cDNA.
Bank ZZAP Express cDNA z przykładu 12 badano przesiewowe na klony, które wyrażały proteinę ligazy PAA-CoA 65 kDa, stosując przeciwciała wytworzone jak podano w przykładzie 9. Bank cDNA przesiewano jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Bankiem λΖ AP Express w odpowiednim rozcieńczeniu zakazono E. coli szczep XLI Blue MRF'. Zakażone bakterie hodowano przez 4 h na agarozie Luria zawierającej 10 mM MgSOą, 0,2% maltozy i 5 mM IPTG (w celu wzbudzenia ekspresji wstawki cDNA) w temperaturze 37°C przed nałożeniem nitrocelulozy (Hybond-C, Amersham) i inkubowaniem przez noc w temperaturze 37°C. Następnie sączki poddano badaniom immunoprzesiewowym stosując pierwotne przeciwciała królika (przykład 9) w rozcieńczeniach 1/1000, podczas gdy wtórne przeciwciało, kozie przeciwciało przeciwkrólicze skoniugowane z fosfatazą alkaliczną (produkt Sigma A8025) zastosowano w rozcieńczeniach 1/2000. Lokalizację klonów pozytywnych przeprowadzono stosując tabletki BCIP/NBT (fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu/nitrobłękit tetrazoliowy) zakupione od Sigma (produkt B-5655) zgodnie z instrukcją producenta. Zidentyfikowano i wybrano dwadzieścia cztery klony pozytywne, zawieszono ponownie w buforze SM (5,8 g/l NaCl, 2 g/l MgSOą · 7H2O, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,01% żelatyny) i powtórnie badano przesiewowe przy niższej gęstości plamek aż do zidentyfikowania sygnału pozytywnego dla jednej plamki.
Przykład 14 - Subklonowanie klonów pozytywnych
Pozytywne klony ZZAP Express cDNA zidentyfikowane w badaniach immunoprzesiewowych (przykład 13) zostały wycięte jako plazmidowe pochodne pBKCMV przy zastoso188 190 waniu bakteriofaga pomocniczego ExAssist i procedury wycinania dostarczonej przez Stratagene. Następnie klony plazmidowe były hodowane (selekcja kanamycyną) i „minipreparowane” jak podali Sambrook i in. (1989) tamże. Następnie otrzymane plazmidy analizowano podwójnymi wyciągami Xbal/Sstl w celu scharakteryzowania wielkości wstawki cDNA klonów. Wstawki cDNA miały wielkość w zakresie od 700 bp (par zasad) do 2,8 kbp, przy największej grupie (12 klonów) posiadających wstawkę o wielkości 2,0 kbp. Plazmidy były również trawione przez Sau3 A (odcinający 4 pary zasad) dla potwierdzenia grup klonów na podstawie podobnych wzorów restrykcji. W ten sposób klony podzielono na 6 grup na podstawie wspólnych wzorów trawienia restrykcyjnego. Następnie reprezentatywne klony z każdej grupy testowano na produkcję proteiny 63 000 ligazy PAA-CoA metodą analizy Western i na aktywność enzymu.
Przykład 15 - Wykazanie pozytywnych klonów cDNA przy użyciu blottingu metodą Western.
Ekstrakty protein z reprezentatywnych wyciętych klonów pozytywnych w teście immunoprzesiewowym wytworzono biorąc hodowlę klonów E. coli hodowanych przez noc w bulionie Luria i kanamycynie (50 pg/ml, IPTG (5 mM) w temperaturze 25°C i dodając równą objętość buforu próbki SDS-PAGE, gotując i poddając elektroforezie jak w przykładzie 6. Następnie proteiny poddano blottingowi metodą Western dla oznaczenia obecności proteiny ligazy PAA-CoA 63 000 (przykład 11). Immunobarwienie membrany wykonano jak w przykładzie 11, z tym że zastosowano koniugat przeciwkróliczej IgG z fosfatazą alkaliczną (rozcieńczenie 1:2000 w buforze do oznaczania), a Substratem fosfatazy był BCIP/NBT w postaci tabletek (Sigma) stosowany zgodnie z instrukcją producenta. Jedną grupę klonów (wielkość wstawki cDNA 2,0 kb) zidentyfikowano jako mającą proteinę 63 kDa (wspólmigrującą z próbą kontrolną BW 1901).
Przykład 16 - Oznaczenie klonów E. coli na aktywność ligazy.
Bulion zawierający komórki E. coli (wyhodowane jak w przykładzie 15) wirowano w chłodzonej wirówce Denley przy 4000 x g w temperaturze 4°C przez 7 min w celu pastylkowania komórek. Supematant odrzucono, a komórki zawieszono ponownie w buforze do oznaczania ligazy (przykład 2) w połowie pierwotnej objętości bulionu. Następnie komórki oziębiono na łaźni lodowej przed nadźwiękowieniem w celu rozerwania komórek. Warunki nadźwiękowienia: Apollo Electronisc Sonicator, nastawienie mocy 5, 50% cyklu roboczego, po 30 s rozrywania przez 7 min na łaźni lodowej. Ekstrakty albo stosowano natychmiast albo przechowywano do użycia w temperaturze -80°C. Aktywność ligazy PAA-CoA wykazano stosując procedurę oznaczania opisaną w przykładzie 3, z tym wyjątkiem że stosowano 40 pl ekstraktu, a mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 60 min w temperaturze 30°C. Obecność PAA-CoA w supematantach oznaczenia wykazano stosując HPLC jak opisano w przykładzie 4 przy uzupełnieniu o detektor zespołu fotodiod Waters 996 do analizy spektralnej. Aktywność ligazy PAA-CoA wykryto w klonie 6,6 (reprezentatywnym dla grupy ze wstawką cDNA o wielkości 2,0 kb) i potwierdzono wytworzenie PAA-CoA przez analizę zespołem diod wobec wzorca PAA-CoA.
Przykład 17 - Sekwencja 5' DNA klonów ligazy PAA-CoA.
Klon 6,6 (= pPEN09) „maksi-preparowano” i DNA oczyszczono gradientami CsCl jak opisali Sambrook i in. (1989). Przygotowano mapę restrykcji pPEN09 wykonując pojedyncze i podwójne trawienie enzymami (fig. 2). Następnie ten klon sekwencjonowano używając startera (5' -ACAGGAAACAGCTAfGAClCTTGG') zakupionego od Cruachem i stosując zestaw Pharmacia T7 według instrukcji producenta. Sekwencja końca 5' wstawki cDNA, pokazana poniżej, pozwoliła sprawdzić, że przetłumaczona sekwencja aminokwasów na N-końcu cDNA odpowiadała sekwencji peptydów otrzymanej poprzednio (przykład 6), z wyjątkiem początkowej metioniny (brakującej z sekwencji peptydów).
18fi 190
| TCTAAACCCCGAGATCACCTCAGTTTCCTGCACTTTGGAGACCTGCCC | 26 | |||||||
| CTATATrrACCCCGAGGATTTGGGAAA | ATG | GTT TTT | TTA CCT | 15 | ||||
| M | V | F | L P | 5 | ||||
| CCA AAG | GAG TCC | GGT CAA | TTG | GAC | CCA | ATT | CCC | 48 |
| P K | E S | G Q | L | D | P | I | P | 16 |
| GAC AAT | ATT CCA | ATC AGC | GAG | TTT | ATG | CTC | AAT | 81 |
| D N | I P | I S | E | F | M | L | N | 27 |
Pozostałość pPEN09 sekwencjonowano stosując normalne reakcje terminacji dinukleotydów zawierających 7-deaza dGTP. Jako znacznik stosowano [35S]dATP Reakcje sekwencji analizowano na klinowych żelach poliakryloamidowych 6% zawierających 8 M mocznik [Sanger i in. (1977) PNAS 74, 5463-5467; Chen i Seeburg (1985) DNA 4, 165-170]. Zagnieżdżone delecje tworzono zarówno z końców T7 i T3 stosując nukleazę ExoIII i SI [Henikoff (1984) Gene 24, 351-359]. Klony delecji selekcjonowano wielkością do sekwencjono wania DNA metodą elektroforezy na żelach agarozowych. Wybrane klony sekwencjonowano jak pPEN09. W miarę potrzeb syntetyzowało wewnętrzne startery sekwencjonowania. Kompletną sekwencję wstawki cDNA pokazano na fig. 3. Przetłumaczoną sekwencję protein pokazano na fig. 1.
Porównanie wydedukowanej sekwencji aminokwasów proteiny ligazy PAA-CoA z bazą danych sekwencji protein Narodowej Biomedycznej Fundacji Badawczej (NBRF-PIR) i bankiem danych sekwencji protein SWISS-PROT oprogramowaniem DNASTAR najlepsze dopasowanie dało dla ligazy 4-kumaryniano-CoA ziemniaka. Stosując program DNASTAR megalign (metoda skupisk) ułożono obok siebie proteinę ligazy PAA-CoA i ligazę 4-kumarynianoCoA ziemniaka. Analiza odstępów sekwencji ujawniła 25% podobieństwa aminokwasów pomiędzy dwiema proteinami. Podobne porównanie z syntazami acetylo-CoA grzybów (Penicillium, Aspergillus, Neurospora i drożdży) wykazało tylko 15% podobieństwa.
Ostatnie trzy aminokwasy proteiny ligazy PAA-CoA to seryna-lizyna-izoleucyna. Ta sekwencja aminokwasów odpowiada zgodności do C-terminalnego sygnału kierującego mikrociało (CMTS) i te same aminokwasy są uważane za zasadniczo istotne dla kierowania proteiny katalazy Hansenula polymorpha do mikrociał (Didion i Roggenkamp (1992) FEBS Lett. 303 (2-3), 113-116). Tripeptyd C-terminalny SKI może również kierować proteiny do mikrociał Neurospora crassa (de Zoysa i Connerton (1994) Cum Genet. 26, 430-437). Ostatni etap biosyntezy penicyliny wykonywany przez proteinę ACTF (stosujący PAA-CoA - produkt ligazy PAA-CoA) zlokalizowano w mikrociałach w P. chrysogenum (Muller i in. (1991) EMBO J. 10 (2), 489-495). Proteina ACTF również ma CMTS, który potrzebny jest do kierowania do mikrociała (EP 0488 180 A2). To, że proteina ligazy PAA-CoA ma CMTS, jest spójne z jej rolą w biosyntezie penicyliny.
Przykład 18 - Hybrydyzacja genomowego DNA z sondą cDNA ligazy PAA-CoA.
Genomowe DNA z szeregu szczepów, w tym z Penicillium chrysogenum typu naturalnego NRRL1951, BW1900A, BW1901, wydzielono jak następuje. Szczepy hodowano jak w przykładzie 1 i zebrano po 40 h metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych Whatman GF/A. Grzybnię przepłukano w 0,9 M NaCl przed zamrożeniem w ciekłym azocie. Grzybnię roztarto na drobny proszek w ciekłym azocie i proszek ponownie zawieszono w roztworze G (przykład 12), pozostawiając na łaźni lodowej na 15 min. Resztki grzybni pastylkowano przy 17500 x g w temperaturze 4°C przez 20 min. Supematant zebrano w innej probówce do wirówki 50 ml i DNA ekstrahowano fenolem/chloroformem pH 8,0, ekstrahowano chloroformem i strącano etanolem jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Kwas nukleinowy ponownie zawieszono w 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA i usunięto RNA działaniem RNAzy jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Genomowe DNA trawiono BamHI, a produkty trawienia elektroforezowano, blottingowano na membranę Hybond N (Amersham) jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Membranę hybrydyzowano wstawką cDNA z pPEN09 jak następuje: Membranę pre-hybrydyzowano w 6 x SSC, 1% SDS, 6% PEG 6000, 100 pg/ml zdenaturowanego, fragmentowanego DNA nasienia śledzia w 60°C przez 6 h. Potem do roztworu hybrydyzującego dodano znaczony, zdenaturowany fragment cDNA (stosując zestaw Megaprime Amersham i 32P-dCTP według instrukcji producenta) i hybrydyzację kontynuowano przez noc w 60°C. Następnie membrany przemywano w 65°C
188 190 w 2 x SSC, 01% SDS przez 30 min (dwukrotnie). Membrany audiografowano jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Wyniki wykazały wspólny pojedynczy fragment 8 kb BamHI ze wszystkich szczepów Penicillium (w tym naturalnego typu NRRL 1951), który hybrydyzował z sondą cDNA.
Przykład 19 - Konstrukcja banku 9EMBL3.
Hodowlę w kolbie P chrysogenum szczepu SmithKline Beecham BW1900A przygotowano szczepiąc jedną ezą zarodników 50 ml pożywki ACM (20 g/l wyciągu słodowego, 1 g/l baktopeptonu, 20 g/l glukozy) i inkubując z wytrząsaniem w temperaturze 25°C. Po 40 godzinach wzrostu, grzybnię zebrano metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych Whatman GF/A i przepłukano w 0,9 M NaCl. Następnie grzybnię ponownie zawieszono w 0,9 M NaCl zawierającym 10 mg/ml Novozymu (Novo Biolabs, Novo Industri. Dania) i inkubowano w temperaturze 25°C przez 2 h. Protoplasty oczyszczono z resztek grzybni przepuszczając przez sączek bawełniany przed odwirowaniem przy 4000 x g przez 10 min w celu pastylkowania protoplastów'. Protoplasty dwukrotnie przepłukano w 0,9 M NaCl przed dodaniem tiocyjanianu guanidyniowego, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA dla rozpuszczenia protoplastów. Resztki usunięto metodą odwirowania, zaś supematant zawierający DNA chromosomowe dodano do równej objętości 8 M LiCl, łagodnie zmieszano i przechowywano w -20°C przez 30 min. Następnie proteiny i nieco RNA pastylkowano metodą odwirowania (10000 x g, 4°C, 10 min), a supematant zawierający dNa chromosomowe został strącony etanolem. DNA chromosomowe częściowo strawiono Sau3A i fragmentowane DNA chromosomowe frakcjonowano pod względem wielkości na gradiencie gęstości sacharozy, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Frakcje zawierające fragmenty Sau3A większe niż 10 kb zlano razem i zastosowano do konstrukcji banku 9EMBL3. Fragmenty genomowe Sau3A ligowano do ramion 9EMBL3 BamHI otrzymanych z Promega. Następnie ligowane XDNA pakietowano stosując zestaw Packagene Promega. Następnie pakietowane XDNA wzmocniono zakażając komórki E. coli szczep LE392 i plamki odbito na podłożu bakteryjnym i inkubowano przez 8 h w temperaturze 37°C, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Otrzymano w przybliżeniu 18000 niezależnych klonów. Bakteriofagi eluowano do buforu SM i przechowywano właściwie (jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże).
Przykład 20- Klonowanie genomowego DNA ligazy PAA-CoA.
Z klonu 6.6 cDNA fragment Sstl-Xbal zawierający wstawkę cDNA (fig. 2) wykorzystano do sondowania banku A.EMBL3 (wytworzonego w przykładzie 19) metodą hybrydyzacji plamek, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże (warunki takie same jak w przykładzie 18). W pierwotnym badaniu przesiewowym zidentyfikowano szereg pierwotnych wyników pozytywnych, które wybrano i zastosowano do wtórnego badania przesiewowego przy niższych rozcieńczeniach. Powtórzono hybrydyzację plamek i poszczególne plamki zidentyfikowano jako hybrydyzujące z sondą cDNA ligazy PAA-CoA. Te klony AEMBL wybrano i wzmocniono. Klony AEMBL trawiono jednym z enzymów BamHI, EcoRI albo Sall oraz wszystkimi kombinacjami ich par, wraz z pojedynczymi produktami trawienia genomowego DNA ze szczepu BW 1900A. Produkty trawienia poddano elektroforezie, blottingowi i charakteryzacji metodą hybrydyzacji Southema, i zidentyfikowano fragmenty restrykcyjne zawierające cały gen ligazy PAA-CoA. Fragment 6,5 kb EcoRI pobrano z niektórych klonów AEMBL (takie same fragmenty obserwowane w produktach trawienia DNA chromosomowego) i podstawiony pod pIJ2925 (G 30 R. Janssen i M. J. Bibb (1993) Gene 124 (1) 133-134). Mapę restrykcyjną genomowego DNA przedstawiono na fig. 4.
Przykład 21- Transformacja P. chrysogenum szczep BW 1901 ligazą PAA-CoA.
Subklon 6,5 kb EcoRI w pI2925 (przykład 20, = paMX131) razem z liniowym fragmentem amdS z p3SR2 (Hynes i in. (1983) Mol. Celi. Biol. 3, 1430-1439) zastosowano do współtransformowania protoplastów P. chrysogenum szczep BW 1901 (sposób, jak opisali Tilbum i in. (1984) Gene 26, 205-221). Transformanty wybrano pod względem zdolności do wykorzystywania acetamidu. Następnie transformanty badano przesiewowo na miano PenV. Szereg transformantów miał wyższe poziomy PenV w porównaniu z próbą kontrolną BW 1901 (do 111% przy powtórnych testach), sugerując możliwe scalenie obu plazmidów. Taki wynik może poprzeć rolę tego klonu w biosyntezie penicyliny.
188 190
MVELPPKESGQLDPIPDNIPISEFMLNERYGRVRHASSRDPYTCGrTGKSYSSKEVANR
VDSLARSLSKEFGWAPNEGSEWDKTLAVEALNTIDSLPLFWAVHRLGGVLTPANASY
SAAELTHQLLDSKAKALVTCVPLLSISLEAAAKAGLPKNRIYLLDVPEQLLGGVKPPA
GYKSVSELTQAGKSLPPVDELRWSAGEGARRTAFVCYSSGTSGLPKGVMISHRNVIA
NTLQIKAFEQNYRDGGGTKPASTEVALGLLPQSHIYALWIGHAGAYRGDQ-nVLPiCF
ELKSYLNAIQQYKISALFLVPPIHHMLGTQDVCSKYDLSSVTSLFTGAAPLGMETAAD
FLKLYPNŁIRQGYGLTETCTVVSSTHPHDrWLGSSGALLPGVEARJVTPENKEITTYD
SPGELWRSPSWLGYLNNEKATAETFVDGWMRTGDEAVIRRSPKGIEHVTTVDRIKE
LKVKGLQVAPAELEAHILAHPDVSDCAVIAIPDDRAGEVPKAIWKSASAGSDESVS
QALVKYVEDHKARHECWLKGGIRFVDAIPKSPSGKILRRLIRDQEKEARRKAGSKI
FIG. 1 r~l <
O u
CL <
ca υ
C
O
J*
H
C
N υ
UJ1
-M •H
O
CL iud^
IFUIg
PID
Pqx ιθςχ m§a ΛΉ033 F3 _ u
c
JJ
Φ >
£ o
>1 o
+J
W
Cl
M e
CL (β £
psj PID IPS pms .SP £
»4
C
N υ
rf «Μ •4 o
CL ra°03 [7 npraa
IPS psj
PSS
188 190 gaattcggcacgagtctaaaccccgagatcacctcagtttcctgcactttggaga
CCTGCCCCTATATTACCCCGAGGATTTGGGAAAATGGTTTTTTTACCTCCAAAGGA
GTCCGGTCAATTGGACCCAATTCCCGACAATATTCCAATCAGCGAGTTTATGCTCA
ATGAGAGATATGGACGAGTGCGACACGCCAGCTCCCGGGACCCATACACCTGTGG taitaccgggaagtcatactcgtcgaaagaggtagccaatcgcgtcgactcgctg
GCTCGTAGTCTATCAAAGGAATTTGGTTGGGCGCCGAATGAAGGGTCAGAATGGG
ATAAGACATTGGCCGTGTTTGCęCTCAACACTATCGATTCCTTACCCCTATTCTGG
GCCGTTCACAGACTGGGCGGTGTTCTCACTCCCGCCAACGCATCATACTCCGCCG ccgagctgacgcatcagctgcttgattccaaggccaaggcccttgtgacttgtgt tcctctcctctccatctcactggaagctgcagccaaagctggtctcccgaagaaca
GAATCTACTT ACTC GATGT AC CTGAGC AGGTTCTTGGCGGAGTC AAGG CTC C AGG aggatacaagtccgtttccgaactgacccaggctgggaagtctctcccgccagtg
GATGAATTGCGATGGAGCGCGGGTGAAGGTGCCCGGCGAACAGCATTTGTGTGCT
ACTCAAGTGGAACGTCTGGATTGCCGAAAGGAGTCATGATCTCACACCGCAACGT
GATCGGCAATACCCTTCAGATCAAGGCGTTTGAGCAGAACTACCGGGATGGTGGG
GGCACAAAGCCTGCGAGTACTGAGGTTGCTCTTGGTCTCCTTCCGCAGAGCCATA
TCTATGCTCTTGTGGTCATTGGCCATGCTGGGGCATACCGAGGCGACCAAACAAT
CGTTCTCCCCAAATTCGAATTGAAATCCTACCTGAACGCCATCCAACAGTACAAG
ATCAGTGCGGTGTTCCTGGTACCTCCGATCATCATTCACATGCTGGGCACTCAAGA
CGTGTGCTCCAAGTATGACCTGAGTTCCGTGACGTCTCTGTTCACGGGAGCGGCA
CCCCTGGGTATGGAGACAGCTGCCGATTTCCTCAAACTCTACCCGAACATTTTGAT
CCGCCAAGGATACGGTCTGACAGAGACATGCACGGTCGTAAGCTCGACCCACCCG
CACGATATCTGGCTAGGTTCATCCGGCGCTTTGCTCCCTGGAGTCGAGGCACGAA
TTGTGACGCCTGAAAACAAGGAAATCACAACGTACGACTCACCGGGCGAATTGGT
GGTCCGAAGCCCAAGCGTCGTCCTGGGCTATTTGAACAACGAAAAACCCACCGCA
GAGACATTTGTGGACGGATGGATGCGTACGGGAGACGAGGCTGTCATCCGTAGA
AGCCCGAAGGGCATCGAGCACGTGTTTATTGTCGATCGGATCAAGGAGTTGATCA
AGGTCAAGGGTCTGCAAGTCGCGCCTGCCGAACTCGAAGCCCATATCCTCGCCCA
CCCCGATGTCTCGGACTGTGCTGTCATCGCTATTCCGGATGATCGTGCAGGAGAA
GTACCCAAGGCCATTGTTGTGAAGTCCGCCAGCGCAGGATCGGACGAATCTGTCT cccaggctctcgtgaagtatgttgaggaccacaaggctcgtcacaagtggttgaa gggaggtatcagatttgtggatgccattcccaagagcccgagtggtaagattctt cgtcggttgatccgtgaccaagagaaggaggcacggagaaaggctggtagcaag atctaaaaatgtcgggggtagctttgattagaacttggtctgggaaacttggaaa ccgataaccattgttggcttgaactagaagtatatatgtaaatacgtgataaaca aggcatctcatctgctgttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcgag
Claims (1)
- Sposób wytwarzania polipeptydu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA, obejmujący hodowlę gatunku Penicillium, obróbkę tej hodowli i odzyskiwanie produktu końcowego, znamienny tym, że hoduje się gatunek Penicillium, korzystnie Penicillum chrysogenum, grzybnię zbiera, przeprowadza się nadźwiękowienie grzybni, usuwa resztki komórek, frakcjonuje się produkt nadźwiękowienia metodą chromatografii anionowymiennej, a następnie chromatografii oddziaływań hydrofobowych, chromatografii jonowo-asocjacyjnej z eluowaniem substratu i chromatografii sączenia przez żel, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne są wykrywane przy użyciu oznaczenia zależnego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A.Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA. Enzym posiadający aktywność ligazy fenyloacetylokoenzymu A (PAA-CoA) jest użyteczny w syntezie penicylin z produktów pośrednich uczestniczących w biosyntezie penicyliny.Droga przemian biochemicznych do penicyliny G jest ujawniona w literaturze (Queener (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34 (6), 943-948; Martin (1992) J. Industrial Microbiol. 9, 73-90; Luengo (1995) J. Antibiotics 48 (11), 1195-1212). Droga przemian była przedmiotem znacznych badań mających na uwadze wzrost wydajności (miana) w procesach fermentacji.U Penicillium chrysogenum (pędzlaka złociejącego) fenylooctan (PAA) i fenoksyoctan (POA) zostają aktywowane do odpowiednich tioestrów CoA enzymem ligazą (np. ligazą PAA-CoA). Te tioestry następnie zostają wykorzystane do biosyntezy penicyliny G w przypadku PAA oraz penicyliny V w przypadku POA. Dlatego ligazę PAA-CoA uważa się za niezbędną w biosyntezie tych ważnych handlowo antybiotyków leczniczych.Enzym mający aktywność ligazy PAA-CoA (J. Biol. Chem. 267 (12), 7084-7090 (1990)) wydzielono z Pseudomonas putida metodą oczyszczania obejmującą strącanie siarczanem amonowym i wymywanie chlorkiem potasowym z kolumny DEAE-Sephacel. Enzym ma masę cząsteczkową 48 000 +/- 1 000, optimum pH 8,2, i jest zaangażowany w katabolizm paA.Próby oznaczenia enzymu z P. chrysogenum mającego aktywność ligazy PAA-CoA metodą hydroksaminianową (oznaczanie kolorymetryczne wykrywające hydroksaminian fenyloacetylu lub hydroksaminian fenoksyacetylu przy 540 nm) opisali Kogekar i Deshpande (1983) Ind. J. Biochem. Biophys. 20, 208-212 oraz Brunner i Rohr (1975) Methods Enzymol. 43, 476-481; jednak inni badacze (Martinez-Blanco i in. (1992) J. Biol. Chem. 267 (8), 54745481) są zdania, że proteina nie została oczyszczona albo aktywność nie została szczegółowo scharakteryzowana. Ponadto ci ostatni autorzy nie zdołali znaleźć tego enzymu podaną procedurą.WO 96/10085 (Gist Brocades, opublikowano 4 kwietnia 1996) podaje przegląd tych i innych prób wydzielenia ligazy PAA CoA, która działa na drodze przemian penicyliny. W WO 96/10085 opisano syntazę enzymu acylo-CoA jako otrzymaną ze szczepu Penicillium chrysogenum B10 przechowywanego w PanLabs (USA). Wśród właściwości przypisywanych enzymowi są następujące: ciężar cząsteczkowy około 50 000 (określono metodą sączenia w żelu), optymalne pH 8 do 8,5 (niska aktywność przy pH 7 lub poniżej), optymalna temperatura 40°C, pH ponad 7,25. Co ważne, enzym możną oczyszczać metodą strącania siarczanem amonowym. Ma on dość szeroką specyficzność (tj. jest w stanie katalizować tworzenie fenoksyacetylo-koenzymu A, fenyloacetylokoenzymu A, adypoilo-koenzymu A i heksanoilo-koenzymu A z Mg2+, ATP, CoASH, i odpo188 190 wiednio kwasu fenoksyoctowego, fenylooctowego, kwasu adypinowego lub kwasu heksanowego, ale nie wykazuje żadnej aktywności wobec kwasu octowego. Wykazano także, że enzym jest stabilizowany środkami redukującymi. Wysokie stężenie siarczanu amonowego lub glicerolu również stabilizuje enzym. Nie podano wskazań co do czystości dla aktywności enzymatycznej enzymu otrzymanego ujawnionymi sposobami, nie podano sekwencji ani też sekwencji N-terminalnej enzymu, jak również nie scharakteryzowano odpowiadającego mu DNA, ani nie podano jego sekwencji.Mimo tych wszystkich wysiłków niewiele wiadomo o autentycznym enzymie ligazy PAA-CoA, który działa in vivo u gatunku Penicillium. Przypuszczano, że odpowiedzialny enzym może być zaangażowany w metabolizm pierwotny (Smith i in. (1990) Biotechnology 8, 39-41). Martinez-Blanco i in. (1992) tamże, wybrali jeden enzym jako możliwego kandydata, syntazę acetylo-CoA, i oczyścili go z P. chrysogenum na podstawie aktywności syntazy acetylo-CoA. Byli oni w stanie wykazać, że poza tworzeniem pochodnej CoA octanu syntaza acetylo-CoA mogła aktywować kilka kwasów tłuszczowych (C2-C8) i in vitro niektóre cząsteczki aromatyczne (w tym PAA).Gen syntazy acetylo-CoA poddano sekwencjonowaniu (Międzynarodowy Opis Patentowy WO 92/07079, Gouka i in. (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 514-519, MartinezBlanco i in. (1993) Gene 130, 265-270) i wykazano, że jest homologiczny z innymi syntazami acetylo-CoA pochodzącymi z grzybów. Jednakże mutacje w tym genie wybrane kwasem fluorooctowym nie wydają się zmieniać poziomu wytwarzania penicyliny (Międzynarodowy Opis Patentowy WO 92/07079) sugerując, że w rzeczywistości za aktywację PAA odpowiedzialny jest inny enzym.W niniejszym wynalazku opracowano bezpośrednie oznaczenie aktywności ligazy PAACoA w połączeniu z właściwą procedurą oczyszczania, co pozwoliło na oczyszczenie, a następnie klonowanie tego, co uważane jest za autentyczną ligazę PAA-CoA. Enzym wydzielony według niniejszego wynalazku ma N-terminalną sekwencję aminokwasów, różną od syntazy acetylo-CoA wymienionej wyżej i posiada szereg różnych właściwości (np. ciężar cząsteczkowy) wskazując, że wydzielono enzym inny niż wszystkie enzymy, którym dotąd przypisywano tę rolę. Właściwości charakterystyczne dla enzymu wydzielonego w niniejszym wynalazku obejmują bezwzględną zależność od CoASH jako substratu, podczas gdy enzym wydzielony przez Kogekara i Deshpande (1983), testowano w warunkach, w których pomijano CoASH. Ta i inne różnice między wydzielonymi proteinami (np. optymalne pH i inne właściwości charakterystyczne podane w przykładach poniżej) wykazują, ze enzym według niniejszego wynalazku jest różny od każdego z opisanych poprzednio. Uważa się, że niniejsze rozwiązanie stanowi pierwsze wydzielenie czystej postaci enzymu ligazy PAA CoA z gatunków Penicillium. W szczególności obecność C-terminalnego peptydu SKI jest zgodna z rzeczywistą rolą tego enzymu w biosyntezie penicyliny. Enzym według wynalazku różni się od enzymu opisanego w powyżej wspomnianej publikacji WO 96/10085 tym, że ma różny ciężar cząsteczkowy, i ze enzym według niniejszego wynalazku jest wrażliwy na strącanie siarczanem amonowym i solami chlorkowymi w odróżnieniu od enzymu opisanego w WO 96/10085.Zgodnie z tym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA, obejmujący hodowlę gatunku Penicillium, obróbkę tej hodowli i odzyskiwanie produktu końcowego, polegający na tym, że hoduje się gatunek Penicillium, korzystnie Penicillum chrysogenum, grzybnię zbiera, przeprowadza się nadźwiękowienie grzybni, usuwa resztki komórek, frakcjonuje się produkt nadźwiękowienia metodą chromatografii anionowymiennej, a następnie chromatografii oddziaływań hydrofobowych, chromatografii jonowo-asocjacyjnej z eluowaniem substratu i chromatografii sączenia przez żel, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne są wykrywane przy użyciu oznaczenia zależnego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A.Otrzymany zgodnie ze sposobem według wynalazku polipeptyd kodowany jest przez sekwencję DNA przedstawioną na Fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2. Sekwencja ta koduje peptyd posiadający aktywność ligazy fenyloacetylokoenzymu A (PAA-CoA). Sekwencją DNA kodującą ten polipeptyd może być też sekwencja, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA oznaczoną jako SEQ ID nr 2.188 190Polipeptyd otrzymywany sposobem według wynalazku ma pozorny ciężar cząsteczkowy, oznaczony metodą SDS-PAGE wynoszący około 63 000.Polipeptyd, ten korzytnie obejmuje sekwencją aminokwasów N-terminalnych: V-F-L-PP-K-E-S-G-Q-L-D-P, a zwłaszcza sekwencję aminokwasów pokazaną na fig. 1, oznaczoną jako sekwencja ID SEQ nr 1.Wektor do ekspresji enzymu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA w odpowiednim organizmie gospodarza zawiera sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, lub sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA SEQ ID nr 2.Tą sekwencją DNA transformuje się organizm gospodarza w celu wytwarzania penicyliny.Enzym posiadający aktywność ligazy PAA-CoA można zatem wytwarzać znanymi metodami inżynierii genetycznej które w swoich standardowych etapach obejmują transformację komórki gospodarza z gatunku Penicillium, hodowlę stransformowanej komórki gospodarza, obróbkę tej hodowli i odzyskiwanie produktu końcowego, a w przypadku realizacji niniejszej, hoduje się komórkę gospodarza, którą transformuje się wektorem zawierającym sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawiona na fig. 3 oznaczona jako sEQ ID nr 2, lub przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA SEQ ID nr 2, w celu ekspresji enzymu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA, w odpowienim organizmie gospodarza, następnie prowadzi się ekstrakcję i oczyszczanie, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne są wykrywane przy użyciu oznaczenia zależnego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A, dając w przybliżeniu 1000-krotny wzrost czystości.Enzym można stosować w biotransformacjach w in vitro. Np. do syntezy estru CoA albo do syntezy penicyliny mieszając z acylo-CoA : acylotransferazą 6-APA. Biotransformacje in vitro można prowadzić stosując całe komórki, ekstrakty bez komórek, komórki o zwiększonej przepuszczalności albo enzymy wydzielone z mikroorganizmów, albo którekolwiek z nich w postaci unieruchomionej.Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu całych komórek mikroorganizm może mieć postać rosnącej hodowli, odpoczywającej hodowli, przemytej grzybni, unieruchomionych komórek lub protoplastów.Przy stosowaniu ekstraktów bez komórek przydatnie wytwarza się je przez ścinanie i/lub rozkład chemiczny lub enzymatyczny albo innymi sposobami rozrywania, korzystnie metodą nadźwiękowienia, i ewentualnie następnie usuwając resztki komórek, przy pozostawieniu aktywności enzymów w roztworze.Enzym korzystnie wytwarza się zgodnie z poniższymi przykładami stosując dostępne w handlu szczepy P chrysogenum, w tym typ naturalny NRRL 1951. Inne przydatne szczepy P. chrysogenum obejmują szczepy wytwarzające wysokie ilości penicyliny, np. szczep BW1901 (EMBO J. 9 (3), 741-747 (1990) D. J. Smith i in.).Enzym można wytwarzać hodując mikroorganizm w typowy sposób, szczególnie w warunkach aerobowych w przydatnej pożywce ciekłej lub półstałej. Warunki hodowli mogą być następujące: temperatura w zakresie 5-50°C, korzystnie 25-30°C, a pH w zakresie 3-9, korzystnie 6 - 8, najkorzystniej 7,2.Enzym można wydzielić i stosować w postaci oczyszczonej, postaci częściowo oczyszczonej, w stanie zanieczyszczonym tak jak otrzymano, jako przesącz z preparatu rozerwanych komórek. Najdogodniej enzym zostaje np. co najmniej częściowo oczyszczony w celu usunięcia innych enzymów, które mogłyby również katalizować niszczenie materiałów początkowych lub enzymu.Najdogodniej enzym unieruchamia się na nierozpuszczalnym podłożu tak, jak w procedurach dyskutowanych przez Powella (1990) w Microbial Enzymes and Biotechnology, red. Fogarty & Kelly, str. 369-394. Daje to również korzyść w postaci zwiększonej wydajności i przerobu.Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu całych komórek przydatną pożywkę do hodowli stanowi pożywka: KH2PO4 2 g, K2HPO4 1,5 g, KC1 0,2 g, MgCl2 • 6H2O 0,2 g,188 190Na2SO4 · IOH2O 0,22 g, glukoza 1,0 g w 1 litrze wody dejonizowanej o pH 6,5 lub wodnym układzie z dopasowaniem pH.Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu ekstraktów bez komórek, pożywkę do hodowli stanowi odpowiedni bufor. Oprócz substratów enzymu, mieszanina reakcyjna może zawierać jeden lub więcej innych czynników, np. jonów metali lub stabilizatorów, np. tioli.Biotransformację można przeprowadzić w środowisku wodnym, utrzymując przydatnie mieszaninę reakcyjną w zakresie pH 4-10, przydatniej od 6 do 10, korzystnie około 9,0. Korzystnie pH reguluje się buforami lub korzystnie metodą dodawania roztworu mianowanego kwaśnego lub zasadowego. Temperatura reakcji powinna ogólnie leżeć w zakresie 5-50°C, korzystnie 22-45°C, najkorzystniej 30-37°C. Alternatywnie, reakcję można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych albo w obecności rozpuszczalników organicznych np. acetonu, ketonu metylowo-izobutylowego (MIBK).Czas reakcji zależy od takich czynników jak stężenie reagentów i czynników, temperatura i pH. Po zakończeniu reakcji produkt można wydzielić typowymi sposobami. Początkowe oczyszczanie dogodnie obejmuje etap chromatografii.DNA genu kodującego ligazę PAA-CoA znajduje się wewnątrz fragmentu DNA pokazanego na fig. 2. W szczególności DNA stanowi zasadniczo sekwencja DNA na fig. 3 / ID SEQ 2.Należy rozumieć, że to DNA nie jest w swoim stanie naturalnym, lecz w postaci wydzielonej lub zasadniczo czystej i dlatego może nie mieć dokładnej konfiguracji zilustrowanych miejsc restrykcji, jeśli to DNA wyprowadzono normalnymi technikami obejmującymi delecję, podstawienie, addycję lub inwersję nukleotydów z DNA zgodnie z dowolnym aspektem wyżej opisanego wynalazku.DNA kodujące ligazę PAA-CoA może pochodzić z P chrysogenum. Jednak przydatne są także sekwencje DNA pochodzące z innych organizmów, zwłaszcza organizmów innych niż P. chrysogenum, które to sekwencje nie mają konfiguracji pokazanych miejsc restrykcji, lecz hybrydyzują, korzystnie w ścisłych warunkach hybrydyzacji, z DNA pokazanym na fig. 2 lub jego podfragmentem, i które kodują ligazę PAA-CoA lub enzym o aktywności ligazy PAA-CoA (ścisłe warunki hybrydyzacji podano np. w przykładzie 18).Wektor obejmujący takie DNA, jest wektorem ekspresji do ekspresji ligazy PAA-CoA w przydatnym organizmie gospodarza. Specyficznym przykładem takiego wektora ekspresji jest pBK-CMV (zakupiony od Stratagene) i stosowany w tym wynalazku do ekspresji w E. coli. W tym wynalazku wstawka cDNA ligazy PAA-CoA (= pPEN09, fig. 2) jest korzystnym wektorem do ekspresji w E. coli.DNA i zawierające je wektory mogą znaleźć zastosowanie w wielu dziedzinach działalności przemysłowej. Odnosi się to również do mikroorganizmów gospodarzy zmienionych tymi wektorami i wyrażanymi przez nie enzymami. Np. DNA można wykorzystać jako sondę hybrydyzacji do identyfikowania i wydzielania związanych lub pokrywających się genów obecnych w całkowitym DNA komórkowym P chrysogenum (NRRL 1951) i innych mikroorganizmów wytwarzających enzymy o podobnej strukturze i specyficzności.Wektory rekombinowane zawierające to DNA po przeniesieniu do przydatnych gospodarzy mogą mieć znaczenie przy wytwarzaniu genetycznie zmienionych mikroorganizmów, które syntetyzują zwiększone ilości penicyliny.Korzystnie jest zwiększyć ilość aktywności PAA-CoA w odpowiednim organizmie. Wektory rekombinowane można by również stosować przy wytwarzaniu nowych lub hybrydowych antybiotyków na drodze transferu genów (patrz np. D.A.Hopwood i in., Naturę, 1985, 341, 642-644). Enzymy kodowane przez DNA niniejszego wynalazku można stosować np. w układach bez komórek, zwłaszcza przy unieruchomieniu na przydatnych podłożach stałych, w celu wytwarzania znanych antybiotyków z naturalnych prekursorów albo nowych antybiotyków z „nienaturalnych” prekursorów otrzymanych np. metodą syntezy chemicznej.DNA lub jego fragment (niekoniecznie zawierający nietknięty gen) można łączyć, albo technikami rekombinacji DNA albo metodą naturalnych procesów rekombinacji, z fragmentem genu zaangażowanym w biosyntezie w celu wytworzenia genu hybrydowego zdolnego do188 190 kierowania syntezą hybrydowego enzymu. Takie enzymy można stosować do wytwarzania nowych antybiotyków sposobami analogicznymi do opisanych tu uprzednio.DNA można również modyfikować znanymi technikami mutagenezy ukierunkowanej na miejsca enzymu (w sposób analogiczny do opisanego np. przez G. Wintera i in., Nature, 1982, 299. 756-758; albo przez Zollera i Smitha, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 64876500) z wytworzeniem DNA, w którym dokonano specyficznych mutacji i/lub delecji. Zmutowane DNA można zastosować do otrzymania zwiększonej wydajności (lub miana) penicyliny z przydatnego mikroorganizmu gospodarza.Zmutowane DNA można również stosować do otrzymania nowych lub hybrydowych antybiotyków metodą przenoszenia genów, lub stosować do wytwarzania zmutowanych enzymów (mutein), które można stosować do wytwarzania nowych antybiotyków metodami analogicznymi do opisanych tu uprzednio. Zmutowane DNA można również stosować do zmieniania innych właściwości fermentacyjnych u przydatnych organizmów, np. tolerancję na PAA, zmienione substraty.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9513403.7A GB9513403D0 (en) | 1995-06-30 | 1995-06-30 | Novel product |
| PCT/EP1996/002799 WO1997002349A1 (en) | 1995-06-30 | 1996-06-26 | PHENYLACETYL-CoA LIGASE FROM PENICILLIUM CHRYSOGENUM |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL188190B1 true PL188190B1 (pl) | 2004-12-31 |
Family
ID=10776961
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96324225A PL186765B1 (pl) | 1995-06-30 | 1996-06-26 | DNA, polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA, wektor, organizm gospodarza, zastosowanie transformowanego organizmu gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu |
| PL96360440A PL188190B1 (pl) | 1995-06-30 | 1996-06-26 | Sposób wytwarzania polipeptydu |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96324225A PL186765B1 (pl) | 1995-06-30 | 1996-06-26 | DNA, polipeptyd posiadający aktywność ligazy PAA-CoA, wektor, organizm gospodarza, zastosowanie transformowanego organizmu gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6245524B1 (pl) |
| EP (1) | EP0835316B1 (pl) |
| JP (1) | JP3819429B2 (pl) |
| KR (1) | KR100455054B1 (pl) |
| CN (1) | CN1145699C (pl) |
| AT (1) | ATE239081T1 (pl) |
| AU (1) | AU6417396A (pl) |
| DE (1) | DE69627856T2 (pl) |
| DK (1) | DK0835316T3 (pl) |
| ES (1) | ES2198493T3 (pl) |
| GB (1) | GB9513403D0 (pl) |
| MX (1) | MX9800212A (pl) |
| PL (2) | PL186765B1 (pl) |
| PT (1) | PT835316E (pl) |
| SI (1) | SI0835316T1 (pl) |
| WO (1) | WO1997002349A1 (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU701665B2 (en) * | 1994-09-28 | 1999-02-04 | Gist-Brocades B.V. | Process of producing beta-lactam antibiotics applying microorganisms with increased ligase activity |
| ES2108651B1 (es) | 1996-03-18 | 1998-07-16 | Antibioticos Sa | Procedimiento para incrementar la produccion de penicilina g (bencilpenicilina) en penicillium chrysogenum mediante la expresion del gen pcl. |
| ES2220176B1 (es) * | 2002-05-27 | 2006-02-16 | Universidad De Extremadura | Nuevo enzima protelotico, procedimiento para su obtencion y aplicaciones. |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU701665B2 (en) | 1994-09-28 | 1999-02-04 | Gist-Brocades B.V. | Process of producing beta-lactam antibiotics applying microorganisms with increased ligase activity |
-
1995
- 1995-06-30 GB GBGB9513403.7A patent/GB9513403D0/en active Pending
-
1996
- 1996-06-26 AU AU64173/96A patent/AU6417396A/en not_active Abandoned
- 1996-06-26 WO PCT/EP1996/002799 patent/WO1997002349A1/en not_active Ceased
- 1996-06-26 ES ES96923946T patent/ES2198493T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-26 DE DE69627856T patent/DE69627856T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-26 SI SI9630612T patent/SI0835316T1/xx unknown
- 1996-06-26 PL PL96324225A patent/PL186765B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 MX MX9800212A patent/MX9800212A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 AT AT96923946T patent/ATE239081T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 PL PL96360440A patent/PL188190B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-06-26 PT PT96923946T patent/PT835316E/pt unknown
- 1996-06-26 CN CNB961964049A patent/CN1145699C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-26 EP EP96923946A patent/EP0835316B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-26 US US08/981,215 patent/US6245524B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-26 KR KR1019970709851A patent/KR100455054B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-26 DK DK96923946T patent/DK0835316T3/da active
- 1996-06-26 JP JP50478297A patent/JP3819429B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1194002A (zh) | 1998-09-23 |
| HK1010213A1 (en) | 1999-06-17 |
| ES2198493T3 (es) | 2004-02-01 |
| AU6417396A (en) | 1997-02-05 |
| DE69627856D1 (de) | 2003-06-05 |
| US6245524B1 (en) | 2001-06-12 |
| GB9513403D0 (en) | 1995-09-06 |
| PL324225A1 (en) | 1998-05-11 |
| MX9800212A (es) | 1998-04-30 |
| EP0835316A1 (en) | 1998-04-15 |
| DK0835316T3 (da) | 2003-08-25 |
| KR100455054B1 (ko) | 2005-01-17 |
| WO1997002349A1 (en) | 1997-01-23 |
| ATE239081T1 (de) | 2003-05-15 |
| KR19990028533A (ko) | 1999-04-15 |
| CN1145699C (zh) | 2004-04-14 |
| PL186765B1 (pl) | 2004-02-27 |
| SI0835316T1 (en) | 2003-12-31 |
| DE69627856T2 (de) | 2004-03-11 |
| JPH11508450A (ja) | 1999-07-27 |
| JP3819429B2 (ja) | 2006-09-06 |
| PT835316E (pt) | 2003-08-29 |
| EP0835316B1 (en) | 2003-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4306802B2 (ja) | アミダーゼ | |
| US6174706B1 (en) | DNA encoding triol polyketide synthase | |
| US5108918A (en) | Method for identifying and using biosynthetic genes for enhanced production of secondary metabolites | |
| JP3289726B2 (ja) | クラバラン酸の生合成遺伝子 | |
| FI104984B (fi) | Menetelmä biosynteettisten tai säätelygeenien identifioimiseksi ja käyttämiseksi sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi | |
| AU3798900A (en) | Novel proteins related to gaba metabolism | |
| PL188190B1 (pl) | Sposób wytwarzania polipeptydu | |
| EP0448180B1 (en) | A method of modulating the production of secondary metabolites | |
| EP0320272B1 (en) | DNA encoding ACV synthetase | |
| MXPA98000212A (en) | Fenilacetil-coa ligasa from penicillium chrysoge | |
| US6815189B1 (en) | Gene from acremonium chrysogenum encoding a protein with cephalosporin C acetylhydrolase activity and methods of use of such gene | |
| Courtright | Differential rates of synthesis of glycerokinase and glycerophosphate dehydrogenase in Neurospora crassa during induction | |
| US5912140A (en) | Recombinant pneumocystis carinii aminoacyl tRNA synthetase genes, tester strains and assays | |
| US5925515A (en) | Direct selection of transformants on acetate-containing media | |
| JP3816593B2 (ja) | キラータンパク質 | |
| HK1010213B (en) | Phenylacetyl-coa ligase from penicillium chrysogenum | |
| US6258555B1 (en) | DNA encoding ACV synthetase | |
| NOLTE et al. | Purification and characterization of chloramphenicol acetyltransferase from Flavobacterium CB60 | |
| WO1999055881A1 (en) | Cephalosporin deacetylase, gene coding for it, and preparation method of deacetylated cephalosporin compounds using it | |
| JP2003528569A (ja) | バチルス・セレアス由来のゼッターマイシンａの生合成遺伝子 | |
| JP2000515008A (ja) | アスペルギルス属のポルホビリノーゲン合成酵素およびこれをコードする核酸 | |
| JPH0638763A (ja) | セファロスポリンｃ生合成に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片 | |
| JPH099966A (ja) | セファロスポリンｃ生合成に係わる遺伝子を含むｄｎａ断片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20110626 |