PL188749B1

PL188749B1 - Zastosowanie przeciwciała anty-4-1BB i kompozycjaleku

Info

Publication number: PL188749B1
Application number: PL97332699A
Authority: PL
Inventors: Alejandro A. Aruffo; N.Jan Chalupny; Lieping Chen; Robert S. Mittler; Walter W. Shuford; Anthony W. Siadak
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2005-04-29
Also published as: US6210669B1; NO991676L; HUP9904697A3; KR100520339B1; CN1232402A; BR9712278A; EP0948353A4; JP2001502325A; CA2268340A1; NO991676D0; PL332699A1; IL129138A0; NZ334691A; KR20000049045A; AU738981B2; WO1998016249A1; AU4747097A; RU2192281C2; EP0948353A1; HUP9904697A2

Abstract

1. Zastosowanie przeciwciala anty-4-1BB do wytwarzania kompozycji leku do leczenia chorób i stanów patologicznych zwiazanych z terapia immunosupresyjna przez tlumienie od- powiedzi immunologicznej na antygen. 4. Zastosowanie wedlug zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, ze przeciwcialo anty-4- -1BB jest jednolancuchowym peptydem wiazacym obejmujacym regiony wiazace antygen lub regiony determinujace dopasowane, które wiaza sie specyficznie do regionu pozakomórkowej domeny 4-1BB nie zaangazowanego w wiazanie liganada 4-1BB do 4-1BB. 6 . Kompozycja farmaceutyczna do zwiekszania rozwoju cytotoksycznosci komórek T w gospodarzu, zawierajaca czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik lub adju- want, znamienna tym, ze jako czynnik aktywny zawiera skuteczna dawke przeciwciala anty-4-1 BB specyficznie wiazacego sie z regionem proksymalnym pozakomórkowej domeny 4-1BB nie zaangazowym w wiazanie liganda 4-1BB do 4-1BB. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała anty-4-1BB i kompozycja leku.

4-1BB jest indukującym się receptorem komórek T, który należy do superrodziny receptora czynnika wzrostu nerwu. Ten nowy antygen jest ekspresjonowany na powierzchni zaktywowanych komórek T śledziony i grasicy. Domena pozakomórkowa tych przezbłonowych białek typu I jest homologiczna do członków superrodziny receptora czynnika wzrostu nerwu. Domena cytoplazmatyczna zawiera homologiczną sekwencję do miejsca wiązania dla specyficznej dla komórki T kinazy tyrozynowej p56^lck.

Rola 4-1BB in vivo pozostaje niejasna, jakkolwiek coraz więcej dowodów wskazuje zaangażowanie ich jako cząstek sygnałowych w aktywacji komórki T. Na przykład, sieciowanie 4-1BB z przeciwciałem monoklonalnym 53A2 na anty-CD3-stymulowanych komórkach T daje w wyniku 2 do 10-krotne wzmocnienie proliferacji komórek T (Pollok i wsp. J. Immunol. 151:1255 (1993)). Ponadto, Zhou i wsp. (Immunol. Letters 41:177-184 (1994)) wykazali, że ekspresja 4-1BB zachodzi na aktywowanych jelitowych wewnątrz-epitelialnych limfocytach T, i że aktywowane IELS wyzwalane przez monoklonalne przeciwciało anty-4-1BB mogło wzmacniać poziom cytotoksyczności IEL przeciwko komórkom hybrydomy wydzielającym anty-CD4. Sieciowanie przeciwciał anty-4-1BB także wzmagało proliferację IELS.

Zidentyfikowano, co najmniej dwóch kandydatów ligandów 4-1BB. Chalupny i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10360-10364 (1992)) stosował rozpuszczalne 4-1BB immunoglobulinowe białko fuzyjne (4-1BB Rg) w celu zademonstrowania, że 4-1BB wiąże się do

188 749 pozakomórkowej matrycy białkowej (EMC). Goodwin i wsp. (Eur. J. Immunol. 23:2631 (1993)) opisali izolowanie cDNA liganda mysiego 4-1BB (4-1-BB-L) to jest członka wyłaniającej się rodziny ligandów z C-terminalną homologią aminokwasową, która to grupa obejmuje TNF, limfotoksynę (LT)-alfa i beta, CD40-L, CD27-L, CD30-L, i Fas-L.

Ludzki analog (hu4-lBB) mysiego 4-1BB i ludzki analog (hu4-l-BB-L) mysiego 4-1-BB-L były sklonowane (Alderson i wsp. Eur. J. Immunol. 24:2219-2227 (1994)). Zarówno monoklonalne przeciwciała w stosunku do hu4-lBB jak i transfekowane przy pomocy hu4-1BB-L komórki indukowały silną odpowiedź proliferacyjną w jednocześnie stymulowanych mitogenem komórkach T.

Dlatego też istnieje potrzeba wytworzenia antagonistów dla 4-1BB oraz wytworzenia środka medycznego, którym możnaby zwalczać stany patologiczne związane z terapią immunosupresyjną.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała anty-4-lBB do wytwarzania kompozycji leku do leczenia chorób i stanów patologicznych związanych z terapią immunosupresyjną przez tłumienie odpowiedzi immunologicznej na antygen.

Korzystnie przeciwciało anty-4-lBB jest przeciwciałem monoklonalnym.

Bardziej korzystnie przeciwciało anty-4-lBB jest ludzkim przeciwciałem.

Najbardziej korzystnie przeciwciało anty-4-lBB jest jednołańcuchowym peptydem wiążącym obejmującym regiony wiążące antygen lub regiony determinujące dopasowane, które wiążą się specyficznie do regionu pozakomórkowej domeny 4-1BB nie zaangażowanego w wiązanie liganada 4-1BB do 4-1BB.

Korzystnie stany patologiczne obejmują zapalenie jelit, stwardnienie rozsiane, cukrzycę autoimmunologiczną, reumatoidalne zapalenie stawów, chorobę gospodarza z przeszczepem, toczeń rumieniowaty układowy oraz raka.

Przedmiotem wynalazku jest także, kompozycja farmaceutyczna do zwiększania rozwoju cytotoksyczności komórek T w gospodarzu, zawierająca czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub adjuwant, charakteryzująca się tym, że jako czynnik aktywny zawiera skuteczną dawkę przeciwciała anty-4-lBB specyficznie wiążącego się z regionem proksymalnym pozakomórkowej domeny 4-1BB nie zaangażowym w wiązanie liganda 4-1BB do 4-1BB.

Korzystnie kompozycja charakteryzuje się tym, że zawiera monoklonalne przeciwciało 1D8; ewentualnie także korzystnie kompozycja zawiera monoklonalne przeciwciało 3E1, lub monoklonalne przeciwciało 3H3.

Zastosowanie leku z przeciwciałem anty-4-lBB według wynalazku, obejmujące podawanie gospodarzowi skutecznej dawki pozwala na tłumienie humoralnej odpowiedzi pierwszego rzędu i drugiego rzędu na antygen w gospodarzu.

Kompozycja zawierająca przeciwciało anty-4-lBB, hamuje odpowiedź przeciwciała w czerwonych krwinkach owcy in vivo.

Przy pomocy zastosowania według wynalazku blokowana jest zależna od komórek T odpowiedź immunologiczna w gospodarzu.

Wzmocnione może też zostać limfocytowe zabijanie komórek raka u gospodarza.

Innym aspektem działania leku zawierającego przeciwciało anty-4-lBB może być przyspieszenie rozwoju cytotoksycznych komórek T w gospodarzu.

Podając gospodarzowi skuteczną ilości przeciwciała anty-4-lBB można osiągnąć wyleczenie gospodarza posiadającego chorobę autoimmunologiczną komórek T.

Figura 1 jest graficznym przedstawieniem wiązania mysiego liganda dla 4-1BB do unieruchomionego 4-1BB.

Figura 2 jest graficznym przedstawieniem blokowania wiązania 4-1BB do jego liganda przez monoklonalne przeciwciała anty-4-lBB (mAb).

Figura 3 jest graficznym przedstawieniem ekspresji 4-1BB w aktywowanych komórkach T jako funkcja czasu po stymulacji. Kółka przedstawiają poziom mRNA 4-1BB. Kwadraty przedstawiają poziom receptora 4-1BB na powierzchni aktywowanych komórek T linii DO. 11.10.

188 749

Figura 4 jest graficznym przedstawieniem jednoczesnej stymulacji komórek T przez optymalną dawką monoklonalnego przeciwciała 145.2C11 anty-CD3 i monoklonalnych przeciwciał anty-4-l'BB.

Figura 5 jest graficznym przedstawieniem farmakokinetyki monoklonalnego przeciwciała 1D8 anty-4-lBB. Każdy symbol przedstawia inną mysz.

Figura 6 jest graficznym przedstawieniem hamowania odpowiedzi pierwszego i drugiego rzędu przeciwko owczym krwinkom czerwonym powodowanym przez przeciwciała anty-4-lBB.

Figura 7 jest graficznym przedstawieniem hamowania generowania cytotoksyczności komórki T przez przedstawiciela anty-4-lBB.

Figura 8 jest graficznym przedstawieniem ustępowania raka P815 po leczeniu przy pomocy mAb dla 4-1BB.

Figura 9 jest graficznym przedstawieniem długiego czasu przeżycia myszy z puchliną brzuszną spoⁱ^^o<ńc^^waian₁P815 po leczeniu mAb anty-4-lBB.

Figura 10 jest graficznym przedstawieniem efektu zubożenia w CD4 i CD8 na indukowane 1D8 odrzucenie komórek raka P815.

Figura 11 jest graficznym przedstawieniem leczenia myszy otrzymujących dożylnie podawane komórki mięsaka AG104.

Figura 12 (A-C) przedstawia (A) hamowanie generowania in vivo odpowiedzi CTC podczas GvHD; (B) przyspieszenie likwidowania splenocytów BDFi, w którym pośredniczy CTC, przez mAbs anty-4-lBB; i (C) podwyższenie procentowej ilości komórek CD8+ T u myszy poddanych GvHD.

Figura 13 jest graficznym przedstawieniem likwidowania aktywowanych mysich komórek T przez immunotoksynę anty-4-lBB-PE40.

Figura 14 jest graficznym przedstawieniem zdolności przeciwciał anty-4-lBB do blokowania rozwoju doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu.

Leczenie immunosupresyjne jest powszechnie stosowane w kontroli zapaleń, leczenia raka i przeszczepianiu narządów. Tradycyjne leczenie, takie jak stosowanie hormonów korowonadnerczowych i ich induktorów, hormonów adrenokortykotropowych, czynników chemoterapeutycznych i leczenia naświetlaniem może dawać w wyniku niespecyficzną immunosupresję i niedobór odporności. Zatem ta szczególna potrzeba wymaga istnienia alternatywnych dróg indukowania immunosupresji. Przeciwciała według niniejszego wynalazku dostarczają możliwości do preferencyjnego ukierunkowywania szczególnych polipeptydów, to znaczy na 4-1BB, których ekspresja zachodzi w komórkach T.

Termin „4-1BB” jaki zastosowano w niniejszym opisie oznacza białko powierzchniowe mysie 4-1BB i homologi tego białka obecne u innych gatunków włączając człowieka. Jakkolwiek pewna homologia sekwencji aminokwasowej spodziewana jest pomiędzy homologami u różnych gatunków, stopień tej homologii może być tak niski jak 50%. Dlatego homologi 4-1BB są definiowane jako białka przezbłonowe, których ekspresja zachodzi na aktywowanych komórkach T mających co najmniej 50% homologii sekwencji aminokwasowej do mysiego 4-1BB. Ponadto allele 4-1BB i homologi 4-1BB z podstawnikami konserwatywnymi i postacie rozpuszczalne homologów 4-1BB są włączone w tę definicję 4-1BB.

Termin „odpowiedź humoralna” tak jak użyto w niniejszym opisie oznacza reakcję immunologiczną, która może być przeniesiona z surowicy w typowy sposób wynikająca z obecności specyficznego przeciwciała. Termin odpowiedź immunologiczna „pierwszego rzędu” i „drugiego rzędu” odnosi się do odpowiednio pierwszej ekspozycji na antygen i kolejnych ekspozycji na antygen. Typowo, w humoralnej odpowiedzi immunologicznej, główną klasą przeciwciała w czasie wczesnej odpowiedzi pierwszego rzędu (to jest w czasie pierwszego tygodnia) jest IgM, podczas gdy IgG jest główną klasą przeciwciała w odpowiedzi drugiego rzędu.

Przeciwciała monoklonalne w niniejszym wynalazku mogą być jakiejkolwiek klasy, ale korzystnie są to IgG lub IgM.

Do podawania ludziom na przykład, jako składnik kompozycji do leczenia in vivo monoklonalnme przeciwciała mogą być ludzkimi przeciwciałami w celu zminimalizowania immunogeniczności będąc zasadniczo przeciwciałami w czystej postaci. Przez „zasadniczo

188 749 ludzki” rozumie się, że część immunoglobulinowa kompozycji zawiera zwykle, co najmniej 70% sekwencji ludzkiego przeciwciała, korzystnie, co najmniej 80% ludzkiego przeciwciała, i najbardziej korzystnie, co najmniej 90 - 95% lub więcej sekwencji ludzkiego przeciwciała. Kiedy odnosi się to do „przeciwciała” rozumie się przez to że sekwencje nie-immunoglobulinowe ewentualnie mogą być obecne w tej cząsteczce tak długo jak ta cząsteczka utrzymuje zdolność wiązania 4-1BB.

Może być pożądanym przeniesienie regionów wiążących antygenu (na przykład F(ab')2, zmiennych lub hyperzmiennych (decydujących o komplementamości) regionów), nieludzkich przeciwciał monoklonalnych, takich jak z mysiego monoklonalnego przeciwciała, które było wytworzone do ludzkiego homologu 4-1BB, do ludzkich stałych regionów (Fc) lub regionów ramki stosując technikę rekombinacji DNA, wytwarzając tym sposobem zasadniczo ludzką cząsteczkę. Metody takie są ogólnie znane w stanie techniki i są opisane w, na przykład opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki No. 4,816,397, publikacji EP 173,494 i 239,400, które są włączone do niniejszego opisu przez zacytowanie. Alternatywnie, można izolować sekwencję DNA, która koduje ludzkie monoklonalne przeciwciało lub jego część, które wiąże się specyficznie z 4-1BB, skriningiem biblioteki DNA komórek ludzkich B, zgodnie z ogólnym protokołem określonym przez Huse i wsp., Science 246:1275-1281 (1989), i opisane w publikacji WO 90/14430, włączona w niniejszy opis przez zacytowanie i następnie klonowanie i amplifikację sekwencji, które kodują to przeciwciało (lub jego wiążący fragment) o pożądanej specyficzności. W jeszcze innej postaci ujawnienia mogą być wytworzone, polipeptydy o pojedynczym łańcuchu, które wiążą się do 4-1BB. Te pojedynczo łańcuchowe polipeptydy mogą być wytwarzane przez klonowanie i łączenie zmiennych regionów łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała monoklonalnego, które wiąże się z 4-1BB. Sposoby wytwarzania polipeptydów pojedynczo łańcuchowych są opisane w szczegółach w np. opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki No. 4,946,778, który jest włączony do niniejszego opisu przez cytowanie.

Stosowane w opisie terminy „leczenie” lub „traktowanie zawierają: (1) zapobieganie niepożądanym objawom lub stanom patologicznym zachodzącym w osobniku, który może być predestynowany do tych niepożądanych symptomów lub stanów patologicznych, ale który nie był dotąd diagnozowany jako posiadający te objawy; (2) hamowanie niepożądanych objawów lub stanów patologicznych, to znaczy zatrzymanie ich rozwoju; lub (3) polepszanie lub łagodzenie niepożądanych symptomów lub stanów patologicznych, np. powodując ustępowanie tych niepożądanych symptomów lub stanów patologicznych. Ilość kompozycji według wynalazku, która spełnia którykolwiek z tych celów jest określana jako „ilość skuteczna” i jest przeznaczona do tego aby obejmować zastosowanie profilaktyczne i terapeutyczne tej kompozycji.

Przeciwciała anty-4-lBB są użyteczne w zapobieganiu lub leczeniu chorób lub stanów patologicznych wynikających z terapii immunosupresyjnych, włączając w to, ale nie ograniczając do choroby zapalenia jelit, stwardnienia rozsianego, cukrzycy autoimmunologicznej, reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby gospodarza z przeszczepem, tocznia rumieniowatego układowego, innych chorób autoimmunologicznych komórki T, i raka.

Monoklonalne przeciwciała lub inne związki użyteczne w niniejszym wynalazku mogą być włączone jako składniki kompozycji farmaceutycznych zawierających terapeutyczną lub profilaktyczną ilość, co najmniej jednego monoklonalnego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego z farmaceutycznie skutecznym nośnikiem.

Do przygotowywania kompozycji farmaceutycznych taki nośnik farmaceutyczny użyteczny w niniejszych sposobach powinien być użyty, który jest jakąkolwiek substancją kompatybilną, nietoksyczną odpowiednią do dostarczania pacjentowi tych przeciwciał lub ich wiążących fragmentów lub związków terapeutycznych określonych zgodnie z ujawnionymi w niniejszym zgłoszeniu sposobami. Sterylna woda, alkohol, tłuszcze; maści, obojętne ciała stałe i nawet liposomy mogą być zastosowane jako nośnik. Adjuwanty akceptowalne farmaceutycznie (czynniki buforujące, czynniki dyspersujące) mogą także być włączone do kompozycji farmaceutycznej. Przeciwciała i ich kompozycje farmaceutyczne są szczególnie użyteczne do podawania pozajelitowego, na przykład dożylnego, dotętniczego, domięśniowego lub podskórnego. Jakkolwiek użyteczne są także donosowe lub inne aerozolowe preparaty. Stężę6

188 749 nie związku takiego jak przeciwciało w preparacie do podawania może bardzo się wahać, np. od mniej niż około 0,5%, zwykle, co najmniej 1%, do 15% lub 20% wagowych lub więcej, i będzie wybrane w pierwszym rzędzie opierając się na objętości płynu, lepkości itd., korzystnie do wybranych szczególnych sposobów podawania. Obecne sposoby przygotowywania kompozycji do podawania będą znane lub oczywiste dla fachowca w tej dziedzinie, i są opisane bardziej szczegółowo w na przykład, Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985), który jest włączony tutaj przez zacytowanie.

Związki według wynalazku użyteczne do hamowania odpowiedzi immunologicznej na antygen lub antygeny mogą być podawane dla stosowania profilaktycznego lub do leczenia. W leczeniu profilaktycznym kompozycje są podawane pacjentom, którzy prawdopodobnie byli wystawieni na szczególny antygen lub antygeny, takich jak u pacjentów otrzymujących przeszczep tkanki (włączając transfuzję krwi lub surowicy) lub związki immunogeniczne takie jak antybiotyki. Podawanie związków według wynalazku może być dokonane przed ekspozycją na ten antygen lub antygeny lub w tym samym czasie. W celu zapobieżenia ponownemu zachorowaniu i ich następstwom, kompozycje mogą być podawane w dziennym, tygodniowym lub innym harmonogramie prowadzenia terapii. Reżim leczenia będzie zależał także od dawkowania i jego skuteczności, zamierzonego zastosowania i ogólnego stanu zdrowia pacjenta. Lekarz internista, stomatolog lub inny specjalista w dziedzinie zdrowia będzie dobierał zakres dawki i sposób podawania, to znaczy długotrwale i jednorazowe lub wielokrotne podawanie.

W zastosowaniu terapeutycznym, związki według wynalazku są podawane pacjentowi już cierpiącemu z powodu niepożądanych objawów lub schorzenia, w skutecznej ilości, co najmniej częściowego tłumienia odpowiedzi immunologicznej na antygen(y). Dostateczna ilość do spełnienia tego warunku jest definiowana jako „dawka skuteczna terapeutycznie”. Skuteczne ilości do stosowania będą zależały od zastosowanego związku, drogi podania, ostrości niepożądanych objawów lub stanów patologicznych i ogólnego stanu zdrowia pacjenta. Oznaczenie skutecznej ilości związku według wynalazku do stłumienia odpowiedzi immunologicznej na antygen można ocenić znanymi w stanie techniki metodami. Na przykład spadek ilości immunoglobuliny specyficznej dla antygenu i przez to wydajności kompozycji może być monitorowana przez różnorodność dobrze znanych diagnostycznych procedur in vitro.

Antygen (lub antygeny), na które pacjent jest wystawiony jest korzystnie zależny od komórek T. Większość antygenów jest zależnych od komórek T, to znaczy wymagają komórek T w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej. Zależne od komórek T antygeny są typowymi dużymi polimerycznymi cząsteczkami z wielokrotnymi, powtarzającymi się determinantami antygenowymi. Często, zależne od komórek T antygeny mają właściwości mitotyczne.

W kolejnej postaci wynalazku, przeciwciała anty-4-lBB według wynalazku mogą być stosowane w chromatografii powinowactwa w celu oczyszczenia polipeptydów 4-1BB, takich jak pozakomórkowy region 4-1BB, rozpuszczalne postacie 4-1BB, i fuzje 4-1BB do innych molekuł takich jak immunoglobuliny. Przeciwciała anty-4-lBB według wynalazku mogą być znakowane cząsteczką reporterową, taką jak fluoresceina, alkaliczna fosfataza, i podobne, i stosowane do wizualizacji obecności 4-1BB na powierzchni komórki. Przeciwciała znakowane izotopowe mogą być stosowane do zliczenia ilości 4-1BB na komórkach. W innej postaci przeciwciała anty-4-lBB w niniejszym wynalazku mogą być stosowane w badaniach kompetencji z ligandami 4-1BB.

Następujące przykłady są przedstawione jako ilustracje nieograniczające wynalazku.

Przykłady

I. Protokoły immunizacji i skriningu

Do immunizacji i skriningu (Europejski opis patentowy EP O 595 659 włączony w całości przez cytowanie) konstruowano białka fuzyjne składające się z części pozakomórkowej cząstki mysiej 4-1BB i z regionu stałego ludzkiej immunoglobuliny (Ig). Białko fuzyjne 4-lBBIg zawierało miejsce do rozszczepienia przez proteazę trombiny pomiędzy częścią 4-1BB a Ig tej cząstki. W celu immunizacji białko fuzyjne było rozszczepione przez trombinę, następnie przepuszczone przez kolumnę z białkiem A w celu usunięcia niestrawionego białka

188 749 i fragmentów Ig. Do immunizacji stosowany był materiał niezwiązany otrzymany w wyniku tej procedury, który zawierał poszczególne paski ujawnione w analizie SDS-PAGE.

Stosując immunizowane komórki śledziony i mysią linię komórkową AG8 szpiczaka (Kearney i wsp. J. Immunol. 123:1548-1550 (1974)) jako partnera do fuzji, generowano i wybierano szczuro-mysie hybrydomy stosując standardowe techniki. Przeciwciała otrzymywano z dwóch oddzielnych fuzji. mAbs 3B8 i 1D8 były wytwarzane z fuzji po dwóch iniekcjach do łapy 20 pg białka w adjuwancie RIBI (RIBI Immunochemical) szczurom Sprague-Dawley na dzień 0 i 3; w dniu 10 szczury otrzymywały trzecią injekcję do poduszek łap zwierzęcia 20 pg białka w PBS i na 13 dzień drenujący podkolanowy węzeł chłonny usuwano i przeprowadzaną fuzję. Pozostałe mAbs były wytwarzane w następnej fuzji komórek śledziony następujących po 4 dootrzewnowych 20 pg białka w RIBI przez okres 5 miesięcy. Dożylna iniekcja z 30 pg wykonana była 17 i 3 dnia przed fuzją.

II. Charakterystyka przeciwciał anty-4-1BB

Przeciwciała były najpierw identyfikowane przez specyficzne wiązanie do fuzji 4-1BBIg w standardowym teście ELISA. Specyficzność przeciwciał była oceniona na podstawie dodatkowych kryteriów: (1) wiązanie do komórek COS z ekspresją pełnej długości cząstki 4-1BB ale nie transfekowanych mock kontrolnych komórek COS; (2) wiązanie do linii komórek hybrydomy DO-11-10 T, które były aktywowane w celu uzyskania ekspresji 4-1BB (aktywacja przez 12 godzin przez 10 ng/ml PMA i Ionomycyną, 0,5 pg/ml). Izotypem przeciwciała 3B8 jest szczurza IgM podczas, gdy inne przeciwciała wszystkie są izotypu IgG2a jak określono stosując specyficzny dla izotypu reagent z peroksydazą (Zymed) w teście ELISA z białkiem 4-1BBIg.

III. Oczyszczanie przeciwciał

3B8 mAb (IgM) był oczyszczony z wykorzystaniem powinowadztwa na kolumnie anty-łańcuchowi kappa (mAb RG7 (ATCC T1B 172)). mAb było eluowane buforem Immunopure Ig Elution Buffer (Pierce) i następnie dializowane wobec soli buforowanej fosforanem (PBS). Oczyszczony materiał RG7 nie zawierał pewnych wolnych lekkich łańcuchów, które oczyszczono łącznie z nienaruszonym przeciwciałem. Wszystkie inne przeciwciała były oczyszczone na białku G (Gammabind Plus, Pharmacia). Bufor Immunopure Ig Elution Buffer stosowano do eluowania przeciwciała. Wyeluowane przeciwciało dializowano przed zastosowaniem wobec PBS.

IV. Hamowanie wiązania liganda 4-1BB do białka 4-1BB przez mAbs

Do badania hamowania wiązania liganda do cząsteczki 4-1BB stosowano rozpuszczalne białko fuzyjne składające się z pozakomórkowej części liganda 4-1BB z końcem karboksylowym i pozakomórkowej części mysiego CD8 z końcem aminowym jako środek zastępczy. DNA kodujący pozakomórkową domenę mysiego liganda 4-1BB (reszty 104-309) były generowane w reakcji polimerazy łańcuchowej (PCR) stosując primer upstream zawierający miejsce BamHI (5'-GCGGCGGATCCCCGCACCGAGCCTCGGCCAGCG-3') i primer downstream zawierający miejsce XbaI (5'-CGCTCTAGAGGATAGTTCTCATTCCCATGG-3'). Fragment DNA mysiego liganda 4-1BB klonowano w ramce odczytu w wektorze CDM7(B-) zawierającym pozakomórkową domenę CD8 i następujące po niej miejsce BamHI. Cząsteczka ta będzie oznaczona tutaj jako ligand 4-1BB (4-1-BBL). Zdolność tego anty-4-lBB mAbs do blokowania wiązania liganda do cząsteczki 4-1BB była oceniona w teście ELISA i układach prób opartych o komórkę. 4-1-BBL oczyszczano na kolumnie powinowactwa anty-CD8 stosując mAb 53,6 (ATCC TIB 105) poprzez eluowane 40% glikolem propylenowym/60% 50 mM Tris (pH 7,0)/1,25 M (NHfjaSO^ i dializowano wobec buforowanej fosforanem soli (PBS). Oczyszczony materiał migrował jako przeważający szeroki pasek o oznaczonym ciężarze cząsteczkowym 55,000 w redukującym SDS-PAge. Kiedy oceniono filtrację żelową HPLC otrzymano 3 piki. Przeważający pik miał ciężar cząsteczkowy oznaczony jako 300,000.

Badania próby ELISA na hamowanie wiązania 4-1BBL było przeprowadzone jak opisano poniżej. Białko 4-lBBIg było otoczkowane na studzienkach ELISA przy 0,1 pg/ml w PBS w ciągu nocy w 4°C, blokowane rozpuszczalnikiem próbkowym (Genetic System) i inkubowane z oczyszczonym przeciwciałem przez 1 godzinę. Następnie dodawano ligand i mieszanina mAbs i liganda inkubowano przez jedną dodatkową godzinę. Płytki przemywano i inkubowano z biotynylowanym mAb 53,6 (anty-CD8), i następnie z konjugatem streptoawidyna8

188 749 peroksydaza chrzanowa (HRPO). Hamowanie wiązania było wykazywane przez zmniejszenie sygnału w ELISA. Miareczkowanie wiązania liganda do 4-1BBIg pokazano na figurze 1. Kontrolne mysie białko fuzyjne gp39-CD8 nie wiązało 4-1BB podczas gdy ligand 4-1BB wiązał się specyficznie do 4-1BB w sposób zależny od dawki. Zdolność mAbs do blokowania wiązania liganda do 4-1BBIg w podobnie uformowanym teście ELISA pokazano na figurze 2.

V. Aktywacja komórek DO-11-10 w celu wywołania ekspresji białka 4-1BB

Hybrydoma komórki T DO-11-10 była aktywowana w celu wywołania ekspresji cząsteczki

4-1BB przez traktowanie jej PMA (10 ng/ml) i ionomycyną (0,5 pg/ml) w różnych okresach czasowych, po których mierzono ekspresję mRNA 4-1BB lub ekspresję 4-1BB na powierzchni komórki za pomocą odpowiednio analizy Northern lub analizy FACS (figura 3). Nietraktowane komórki nie wiązały się do białka 4-1BBL. Aktywowane komórki wiązały białko 4-1BBL ale nie wiązały podobnego konstruktu białka fuzyjnego gp39 i Lyta2a (Hollenbaugh i wsp. EMBO J. 11(12) : 4313-4321 (1992)). Przeciwciała anty-4-1BB 1D8 i 3B8 wiążą tylko komórki DO-11-10 wtedy, gdy linia komórkowa była aktywowana. Wstępna inkubacja tego mAbs z komórkami DO-11-10 mogłaby blokować następne wiązanie 4-1BBL. Wiązanie 4-1BBL do komórek było ocenione stosując skonjugowaną surowicę odpornościową anty-CD8 mAb (53,6) (Biosource).

W dalszych doświadczeniach badano zdolność przeciwciał anty-4-1BB do pobudzenia jednoczesnej stymulacji komórki T. Stymulacja spoczynkowych komórek T suboptymalnymi dawkami anty-CD3 mAb 145.2C11 i 10 pg/ml anty-4-lBB mAbs wzmacniało proliferację 2,5-8 krotnie powyżej jedynie 145.2C11 (figura 4). Istniała tutaj tylko niewielka korelacja pomiędzy powinowactwem wiązania lub zdolnością do blokowania wiązania liganda a zdolnością mAbs do jednoczesnej stymulacji komórek T.

VI. Hamowanie rozwoju odpowiedzi przeciwciała anty-SRBC przez przeciwciała anty-4-1BB 1D8 i 3B8

Farmakokinetyka 1D8 anty-4-1BB mAb była badana po iniekcji dożylnej (i.v.) 250 mg/mouse. Próbki surowicy zbierano rozpoczynając od 8 dnia i kończąc w dniu 42 i analizowano w odniesieniu do mAb anty-4-1BB. Wyniki pokazane na figurze 5 wykazywały, że okres półtrwania 1D8 był 7 dni. Wyniki te pokazują także, że anty-szczurza IgG (anty-1 D8) nie była generowana w tych zwierzętach. Okres półtrwania 3B8 szczurzego przeciwciała IgM wynosił 6,5 godz. (dane nie przedstawione).

Grupy składające się z 5 myszy poddawano iniekcji i.v. antygenem zależnym od komórki T krwinek czerwonych owcy (SRBC) i 250 mg albo 1D8 lub 3B8. Dalsze iniekcje przeciwciała były podane każdego drugiego dnia przez 6 dni. Próbki surowicy były pobierane z każdej myszy okresowo do 7 tygodnia i badane w odniesieniu do miana anty-SRBC. W 7 tygodniu myszy otrzymywały drugą porcję SRBC ale dalej nie podawano mAb anty-4-1BB. Próbki surowicy zbierano ponad okres dwutygodniowy i mierzono na obecność przeciwciał anty-SRBC. Zarówno 1D8 i 3B8 blokowały zarówno pierwsze jak i drugie obciążenie SRBC (figura 6). Doświadczenia te, szczególnie wyniki z 3B8 wskazują, że to traktowanie prowadzi do długotrwałego braku reaktywności.

VII. Hamowanie generowania cytotoksycznych komórek T

W celu określenia, czy ekspresja 4-1BB jest ważna dla innych efektorowych funkcji komórki T, mierzono zdolności mAb 1D8 i wielu pochodnych mAbs z drugiej fuzji do zmiany generowania CTL w czasie ostrego schorzenia gospodarza po przeszczepie (GvHD). Komórki T śledziony izolowano z myszy BDFi(H-2^db) 10 dni po injekcji i.v. 10⁷ komórkami T śledziony C57BL/6(H-2b). Po 5 dniach ekspansji w hodowli komórkowej rekombinowanych mysich IL-2(R&D Systems) przy 2-10 ng/ml, żywe komórki T były badane na toksyczność w stosunku do znakowanych ^Cr Iad (P815) albo Iab (EL4) . Wyniki na fig. 7 pokazują, że komórki T śledziony traktowane kontrolnym mAb lub PBS skutecznie zabijają cele będące komórkami niosącymi odpowiedzi haplotyp MHC klasy II (Iad) w stosunku tak niskim jak 3:1. W przeciwieństwie do nich, komórki T śledziony z myszy po injekcji 1D8 nie były zdolne do zabijania aż do osiągnięcia stosunku E:T wynoszącego 50:1, i nawet wtedy zabijanie było zredukowane o 75%. Podobne wyniki otrzymane były w odniesieniu do mAb 22B6. O ile mAb 3E1 był całkowitym inhibitorem mAb to 21E5 był mniej skuteczny w hamowaniu generowanie/przeżywalność CTL. Nie obserwowano zabijania na celach EL-4(Iab) (dane nie przedstawione). Obserwacje te nie mogą być wytłumaczone obecnością anty-4-lBB mAb w hodowli, ponieważ dodanie takich przeciwciał do prób CTL nie blokowało zabijania CTL.

188 749

Badania mikroskopowe hodowanych komórek T przed dodaniem ich do celów ujawniło całkowity brak aktywowanych komórek, wiele małych spoczynkowych żywych komórek i znaczącą ilość komórek apoptotycznych lub martwych, które były nieobecne w hodowli kontrolnej.

VIII. Wzmocnienie generowania CTL podczas GvHD in vivo

Z opisanych powyżej badań myszy GvHD traktowane anty-4-1BB mAbs nie nadawały się do demonstrowania aktywności CTLanty-odpowiedniemu celowi w czasie 5 dni hodowli in vitro z IL-2 lub bez IL-2 (dane nie przedstj^r^wion;), podczas gdy myszy kontrolne rozwijały znaczące odpowiedzi CTL w obecności IL-2. Obserwacja ta była zadziwiająca, ponieważ znaczne niszczenie komórek rakowych CTL indukowane przez 1D8 było zgodne ujawnione w odrębnych modelach raka in vivo w chorobie zarówno przerzutowej jak i nieprzerzutowej (figury 8, 9, 10 i 11). Ponadto, rozmiar śledziony usuwanej z myszy GvHD traktowanych anty-4-1BB był powiększony 2-3-krotnie w stosunku do prawidłowych śledzion jak w myszach kontrolnych Ab. Aby wyjaśnić tę paradoksalną obserwację eksperymenty GvHD były powtórzone jak poprzednio, ale tym razem aktywność CTL była oceniona natychmiast po chirurgicznym usunięciu śledziony, eliminując in vitro ekspansję CTL IL-2. Wyniki tego eksperymentu są znacząco różne od wyników przedstawionych powyżej. Na fig. 12A można zobaczyć, że dwa anty-4-1BB mAbs. 1D8 i 22B6, każdy o którym wiadomo, że wiąże się do innego regionu cząsteczki 4-1BB wzmacnia aktywność CTL prawie czterokrotnie powyżej obserwowanej w kontrolnych zwierzętach GvHD. W przeciwieństwie do tego mAb 21E5 miało nie znaczący efekt na generowanie CTL podczas, gdy mAb 3E1, jeden z najsilniejszych blokerów wiązania liganda całkowicie hamował rozwój CTL. Bardzo mocny wpływ zarówno mAbs 1D8 i 22B6 na wzmocnienie rozwoju aktywności CTL jest dalej pokazany na fig. 12B, która pokazuje znaczną redukcję ilości całkowicie żywych splenocytów otrzymanych z myszy traktowanych tymi dwoma przeciwciałami. Ponadto, analiza fenotypowa splenocytów ujawniła, że procentowa ilość komórek T CD8+ wzrastała do 30% całkowitej ilości komórek u myszy traktowanych 1D8 mAb (fig. 12C), podczas gdy myszy GvHD po injekcji 6E9, izotypowano porównywalne z kontrolą nie wiążącą lub takimi które nie otrzymują przeciwciała miały 5% do 8% komórek T CD8 . Badania mapowani a epitopu mAb s anty-dCBB stosując fuzyjne białka 4-1BB, w których swapping domeny był prowadzony wykazywały, że jedynie 1D8 mAb było związane do aroksymdlnego regionu pozakomórkowej domeny cząsteczki 4-1-BB nie połączonego z wiązaniem 4-1BBL (dane nie pokazane).

IX. Wzmocmerne rrPΛopys cyZotoPsyzznyzą komórek T

W tych doświadczeniach przeciwciała monpklρaalne anty-4-1BB stosowane były do wzmocnienia rozwoju cytotoksyczności komórek T, które następnie zabijały zarówno słabe i nie immunogenne guzy, które są wysoko przerzutowe.

Figura 8 przedstawia wyniki z doświadczenia, w którym w grupie pięciu myszy Balb/C wstrzyknięto podskórnie 10⁵P815 komórek guza komórek tucznych w dniu 0. Myszy kontrolne otrzymywały anty-ludzkie CD5 mAb 10.2. Jakkolwiek mysz, której podawano albo 1D8 albo 3E1 (anty-4-1BB) mAbs szybko odrzucały swoje guzy. Injekcję przeciwciałem były wykonane dnia 3 i 6, 400 mg/mysz dootrzewnowo.

Figura 9 przedstawia długą przeżywdlaość myszy, które otrzymały guza P815 i były traktowane 1D8 mAb.

Dane przedstawione na figurze 10 obrazują, że zmniejszenie ilości CD4 lub CD8 pozytywnych komórek T z myszy, które otrzymały raka P815 oraz mAb 1D8 były nie zdolne do odrzucenia guza. Nie ograniczając się do żadnej teorii wyniki te sugerują, że zarówno CD4 i CD8 są wymagane dla efektywności mAb 1D8.

Dane przedstawione na figurze 1 i obrazują, że nie immpapgeaiczaz mięsak AG104 może być zabity poprzez zdindukowdae CTL na drodze stymulacji mAb 1D9. W tej grupie doświadczeń 10 myszom Balb/C wstrzykiwano podskórnie 10⁵ komórek raka AG104. Przeciwciała mpaoklpaαlae wstrzykiwano podskórnie 3 i 6 dnia jak opisano powyżej. Do dnia 60 90% tych myszy przeżywało. Wynik ten jest szczególnie godny uwagi, jako że ten model guza jest bardzo agresywny.

X. Zabijanie aktywowanych mysich komórek T

W doświadczeniu tym immunotoksyna dnty-4-1BB-PE40 była generowana przez klonowanie zmiennych regionów mAb 1D8, z której konstruowano pojedynczy łańcuch F_v. Ten

188 749

SFy był następnie stosowany do generowania immunotoksyny SFy-PE40 (Sięgali i wsp., Drug. Dev. Res., 34:210-219 (1995). Immunotoksyna ta była pokazana w próbach FACS do wiązania jedynie 4-1BB+ aktywowanych komórek. Wyniki na figurze 13 obrazują, że to immunotoksyna specyficznie zabija aktywowane komórki T 4-1BB+ w sposób zależny od dawki podczas, gdy kontrolna immunotoksyna nie zabija.

XI. Blokowanie rozwoju EAE

Następujące doświadczenie wykorzystuje mysio mysi model autoimmunizacji, to znaczy rozwój doświadczalnego autoimmunologicznego (lub alergicznej) zapalenia mózgu (EAE) (patrz na przykład, Alvord, G.C. Jr., ed. Experimental Allergic Encephalomyelitis: A Useful Model for Multiple Sclerosis, Liss, NY (1984).

Samicom myszy PL x SJL/F1 wstrzyknięto w dniu 0 śródskórnie 100 pl zasadowego białka mielinowego mózgu królika w proporcji 1 mg/ml w całkowitym adiuwancie Freunda. 200 pi roztworu 1 pg/ml (PBS) toksyny krztuśca podano i.v.

Grupie ośmiu myszy wstrzyknięto i.v. w dniu 0, 2 i 4 200 (ig roztworu 1 mg/ml PBS zawierającego jedno z następujących przeciwciał monoklonalnych (wszystkie pochodzące od szczura i będące izotypu IgC-G); (a) kontrolne mAb 6E9 (szczurze mAb anty-ludzkie gp39); (b) mAb anty-4-1BB 3E1; (c) mAb anty-4-1BB 3H3. Myszy były analizowane pod względem rozpoczęcie EAE obserwując paraliż ogona, po którym następował paraliż tylnej kończyny, (po którym to etapie zwierzęta były uśmiercane z powodów humanitarnych).

Zdolności przeciwciał anty-4-1BB do blokowania rozwoju EAE są przedstawione przez dane zobrazowane na figurze 14.

Jakkolwiek niniejszy wynalazek dla jasności zrozumienia został opisany w pewnych szczegółach w postaci ilustracji i przykładu, jest oczywistym, że pewne zmiany i modyfikacje mogą być stosowane w praktyce w zakresie dołączonych zastrzeżeń.

Wszystkie odnośniki przytoczone tutaj są włączone przez cytowane w całości do wszystkich zastosowań.

188 749

FIG.2

MAb anty 4-1BB blokujące wiązanie liganda przy równowadze [liganda] 0,1 ng/ml

[mAb], pg/ml

188 749

FIG. 3 mRNA 4-1BB i ekspresja białka

Czas stymulacji w godzinach

188 749

FIG. 4 mAbs anty 4-1BB jednocześnie stymulują indukowaną przez anty-CD3 proliferację komórki T

[145.2C11], ng/ml

188 749

FIG. 5

Farmakokinetyka mAb 1D8 anty 4-1BB

dni

188 749

FIG. 6

Hamowanie pierwszorzędowej i drugorzędowej odpowiedzi Ab anty-SRBC przez mAbs anty 4-1BB

KB | , f |

A 3 6 9 12 tygodnie mAb 0-6 dni 250ągx4/mysz

188 749

FIG. 7 mAbs anty 4-BB hamują rozwój parentalf-^» F odpowiedzi CTL w GvHD ⁴

Efektor: Stosunek celów

188 749

FIG, 8

Regresja guza P815 po traktowaniu przez Mab na 4-1BB

Dni po inokulacji guza

ID8

3EI

10.2

FIG. 9

Długotrwale przeżywanie myszy obciążonych rakiem puchliny P815 po traktowaniu anty MAB 4-1BB

188 749

FIG. 10

Efekt zmniejszenia CD4 i CD8 w indukowanym przez 1D8 odrzucaniu P815

Dni po inokulacji guza

FIG. 11

Leczenie podawanego i.v. mięsaka AG 104

188 749 wzmacianie generowania in vlvo przez anty-ΙΒΒ mAbs cytotoksyczności komórek T w czasie odpowiedzi GvBD

FIG. 12A mAbs anty-4-ΙΒΒ wzmacniają odpowiedź GvHD in vivo

FIG. 12B

Całkowita ilość splenocytów/3 śledziony

Odpowiedź GvHD in vivo: % C08⁺Donor komórek T w dniu 10

Nietraktowane

ne*

JSSSESBES

FIG. 12C o i io u M :5 % coa⁺ C57BL/6 komórek T

I

188 749

FIG. 13

Immunotoksyna 1D8sFv-PE40 zabija aktywowane przez 4-1BB Balb/c komórki T

[mAb], ng/ml

188 749

FIG. 14 mAbs anty-4-ΙΒΒ blokują rozwój EAE

dni

188 749

FIG. 1

Badanie ELISA wiązania 4-1BBL-CD8 do mysiego 4-1 BB-Ig

Ligand 4-1BB, pg/ml

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie przeciwciała anty-4-1BB do wytwarzania kompozycji leku do leczenia chorób i stanów patologicznych związanych z terapią immunosupresyjną przez tłumienie odpowiedzi immunologicznej na antygen.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało anty-4-1BB jest przeciwciałem monoklonalnym.
3. Zastosanie według zastrz. 2, znamienne tym, że przeciwciało anty-4-1BB jest ludzkim przeciwciałem.
4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że przeciwciało anty-41BB jest jednołańcuchowym peptydem wiążącym obejmującym regiony wiążące antygen lub regiony determinujące dopasowane, które wiążą się specyficznie do regionu pozakomórkowej domeny 4-1BB nie zaangażowanego w wiązanie liganada 4-1BB do 4-1BB.
5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że stany patologiczne obejmują zapalenie jelit, stwardnienie rozsiane, cukrzycę autoimmunologiczną, reumatoidalne zapalenie stawów, chorobę gospodarza z przeszczepem, toczeń rumieniowaty układowy oraz raka.
6. Kompozycja farmaceutyczna do zwiększania rozwoju cytotoksyczności komórek T w gospodarzu, zawierająca czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub adjuwant, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera skuteczną dawkę przeciwciała anty-4-1BB specyficznie wiążącego się z regionem proksymalnym pozakomórkowej domeny 4-1BB nie zaangażowym w wiązanie liganda 4-1BB do 4-1BB.
7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera monoklonalne przeciwciało 1D8.
8. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera monoklonalne przeciwciało 3E1.
9. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera monoklonalne przeciwciało 3H3.

***