PL188826B1 - Wyizolowane kwasy nukleinowe, wyizolowane DNA, wektory obejmujące kwasy nukleinowe, komórki gospodarza obejmujące kwas nukleinowy, przeciwciała wiążące polipeptyd i polipeptyd - Google Patents

Wyizolowane kwasy nukleinowe, wyizolowane DNA, wektory obejmujące kwasy nukleinowe, komórki gospodarza obejmujące kwas nukleinowy, przeciwciała wiążące polipeptyd i polipeptyd

Info

Publication number
PL188826B1
PL188826B1 PL97330313A PL33031397A PL188826B1 PL 188826 B1 PL188826 B1 PL 188826B1 PL 97330313 A PL97330313 A PL 97330313A PL 33031397 A PL33031397 A PL 33031397A PL 188826 B1 PL188826 B1 PL 188826B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
kim
thr
val
cheese
Prior art date
Application number
PL97330313A
Other languages
English (en)
Other versions
PL330313A1 (en
Inventor
Michele Sanicola-Nadel
Joseph V. Bonventre
Catherine A. Hession
Takaharu Ichimura
Henry Wei
Richard L. Cate
Original Assignee
Biogen
Gen Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26690881&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL188826(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen, Gen Hospital Corp filed Critical Biogen
Publication of PL330313A1 publication Critical patent/PL330313A1/xx
Publication of PL188826B1 publication Critical patent/PL188826B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)

Abstract

1. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujacy sekwencje nukleotydowa kodujaca polipeptyd zawierajacy aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7. 2. Wyizolowany kwas nukleinowy wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze polipep- tyd obejmuje ponadto domene Fc Ig. 3. Wyizolowany DNA obejmujacy nukleotydy 278-1147 SEK NR ID:6 albo se- kwencje DNA komplementarna do nukleotydów 278-1147 SEK NR ID:6. 4. Wyizolowany kwas nukleinowy wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze obejmuje SEK ID NR: 6 albo sekwencje komplementarna do SEK NR ID:6. 5. Wektor obejmujacy kwas nukleinowy, który zawiera sekwencje nukleotydowa kodujaca polipeptyd obejmujacy aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7. 6. Wektor obejmujacy kwas nukleinowy, który zawiera sekwencje nukleotydowa kodujaca polipeptyd obejmujacy SEK NR ID:7. 13. Wyizolowany DNA obejmujacy sekwencje nukleotydowa kodujaca polipeptyd, który zawiera aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7. PL

Description

Przedmiotem wynalazku są wyizolowane kwasy nukleinowe, wyizolowane DNA, wektory obejmujące kwasy nukleinowe, komórki gospodarza obejmujące kwas nukleinowy, przeciwciała wiążące kolikektyd i polipeptyd. W szczególności wynalazek dotyczy białek, które podlegają regulacji w górę w tkankach uszkodzonych bądź ulegających regeneracji, jak również kwasów nukleinowych kodujących te białka. Rozwiązania według wynalazku mogą być wykorzystane do otrzymywania kompozycji terapeutycznych i w sposobach leczenia.
Dynamiczne przekształcanie architektury tkankowej zachodzi w czasie rozwoju i w czasie naprawy tkanek po urazie. W ceiu badania tego procesu, skupiliśmy się na modelu uszkodzenia nerek, spowodowanym urazem w wyniku niedotlanienia-reperfuzji.
Nerka zdolna jest do naprawy uszkodzenia nabłonka kanalika ^oksyma^ego przez złożoną serię zdarzeń, które obejmują śmierć komórkową, proliferację przeżywających komórek nabłonka kanalika proksymalnego, tworzenie słabo zróżnicowanego nabłonka regeneracyjnego na obnażonej błonie podstawnej oraz różnicowanie nabłonka regeneracyjnego w ceiu utworzenia w pełni funkcjonalnych komórek nabłonka kanalika prokedm2lnego (Wallin i wsp., Lab. kwest. 66:474-484, 1992; Witzgall i wsp., Mol. Cell. Biol. 13:1933-1942, 1944; Ichimura i wsp., Am. J. Physiol. 269:F653-662, 1995; Thadhani i wsp., N. Engl. J. Med. 334:1448-1460, 1996). Sugerowano udział w tym procesie naprawczym czynników wzrostu, takich jak IGF, EGF i HGF, podobnie jak cząsteczki adhezyjnej komórek nabłonkowych ICAM-1. Jednakże mechanizmy, dzięki którym komórki nabłonka kanalikowego ulegają odtworzeniu nie są wciąż zrozumiane.
W celu identyfikacji cząsteczek zaangażowanych w proces uszkodzenia i naprawy nabłonka kanalikowego, przeanalizowaliśmy różnicę w populacjach mRNA pomiędzy nerkami uszkodzonymi/regenerującymi a normalnymi przy zastosowaniu reprezentatywnej analizy różnicowej (ang. Representational difference analysis, RDA). RDA jest metodą opartą na PCR, służącą do subtrakcji, która dostarcza fragmentów cDNA specyficznego dla docelowej tkanki bądź komórki poprzez powtarzalną subtrakcję i amplifikację (Hubank i Schutz, Nuci. Acids Res. 22:5640-5648, 1994).
W ogólności wynalazek dotyczy Cząsteczek Związanych z Uszkodzeniem Nerki (ang. Kidney Injury-relatad Molecules, określanych w dalszej części opisu jako „KIM”), które podlegają regulacji w górę w tkance nerkowej po uszkodzeniu nerki. Białka i peptydy KIM, jak również ich agoniści i antagoniści oraz ich odpowiedniki są użyteczne w różnych zastosowaniach terapeutycznych.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany DNA obejmujący nuklaotydy 278-1147 SEK NR ID:6 albo sekwencję DNA komplementarną do nukleotydów 278-1147 SEK NR ID:6. Korzystnie wyizolowany DNA według wynalazku obejmuje SEK ID NR:6 albo sekwencję komplementarną do SEK NR ID:6.
W innej postaci wykonania przedmiotem wynalazku jest wyizolowany DNA obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą kolipaptyd, który zawiera aminokwasy 1--290 SEK NR ID:7.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nuMeotydową kodującą pollkaktyd zawierający aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7. Korzystnie, kwas nukleinowy według wynalazku koduje pollkaktyd obejmujący ponadto domenę Fc Ig.
Ponadto, przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą białko fuzyjne, które zawiera aminokwasy 21-290 SEK ID NR:7 oraz region Fc immunoglobuliny.
Przedmiotem wynalazku jest także kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący ssaczy polipeptyd KIM1 pozbawiony sekwencji sygnałowej KIM1, przy czym ssaczy polipeptyd KIM1 wybrany jest z grupy składającej się z SEK NR ID:3 oraz SEK NR ID:7.
188 826
Korzystnie kwas nukleinowy według wynalazku koduje polipeptyd, który jest ponadto pozbawiony domeny przezbłonowej.
W niniejszym opisie opisano również oczyszczone i wyizolowane cząsteczki DNA, o sekwencji nukleotydów jak podano w SEK NR ID:1, SEK NR ID:2 i SEK NR ID:4 oraz nici komplementarne do tych sekwencji, cząsteczki DNA, które hybrydyzują w ostrych warunkach z wyżej wspomnianymi cząsteczkami DNA oraz cząsteczki DNA, które, gdyby nie degeneracja kodu genetycznego, hybrydyzowałyby z dowolną spośród cząsteczek DNA zdefiniowanych powyżej. Te cząsteczki DNA mogą być rekombinowane i mogą być funkcjonalnie połączone z sekwencją kontroli ekspresji.
Przedmiotem wynalazku jest wektor obejmujący kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor obejmujący kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący SEK NR ID:7.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest wektor obejmujący kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7, przy czym polipeptyd obejmuje ponadto domenę Fc Ig.
Przedmiotem wynalazku jest również wektor obejmujący kwas nukleinowy będący wyizolowanym DNA, który zawiera nukleotydy 278-1147 SEK NR ID:6 albo sekwencję DNA komplementarną do nukleotydów 278-1147 SEK NR ID:6.
Przedmiotem wynalazku jest wektor obejmujący kwas nukleinowy będący wyizolowanym DNA, który zawiera SEK NR ID:6 albo sekwencję DNA komplementarną wobec SEK NRID:6.
Niniejszym opisano również wektory zawierające oczyszczoną i wyizolowaną cząsteczkę DNA, o sekwencji nukleotydów podanej w SEK NR ID:1, SEK NR ID:2, albo SEK NR ID:4, albo jedną z innych cząsteczek DNA zdefiniowanych powyżej. Wektor ten może być biologicznie funkcjonalnym plazmidem albo wirusowym wektorem DNA.
Przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza obejmująca kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7. Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza obejmująca kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7, przy czym polipeptyd obejmuje ponadto domenę Fc Ig. Ponadto przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza obejmująca kwas nukleinowy będący DNA, który zawiera nukleotydy 278-1147 SEK NR ID:6 albo sekwencję DNA komplementarną wobec nukleotydów 278-1147 SEK NR ID:6.
Niniejszym opisano również prokariotyczne albo eukariotyczne komórki gospodarza, w sposób stabilny transformowane albo transfekowane wektorem dowolnym z wyżej wymienionych wektorów oraz metodę wytwarzania produktu polipeptydowego KIM, kodowanego przez dowolną z wyżej wymienionych cząsteczek DNA. Sposób ten obejmuje hodowlę, w odpowiednich warunkach hodowlanych, prokariotycznych albo eukariotycznych komórek gospodarza transformowanych albo trasfekowanych cząsteczką DNA w sposób, pozwalający na ekspresję cząsteczki DNA, oraz odzyskiwanie polipeptydowego produktu ekspresji.
Rozwiązania według wynalazku dotyczą oczyszczonego i wyizolowanego ludzkiego białka KIM, jak również sposobu wytwarzania produktu polipeptydowego, mającego część bądź całość pierwszo rzędowej konformacji strukturalnej oraz biologiczną aktywność białka KIM.
Tak więc przedmiotem wynalazku jest polipeptyd obejmujący aminokwasy 21-290 SEK NR ID:7. Korzystnie polipeptyd według wynalazku jest kodowany przez kwas nukleinowy obejmujący SEK ID NR:6 albo sekwencję komplementarną do SEK NR ID:6.
Białka KIM mogą mieć sekwencję aminokwasów, stanowiącą SEK NR ID:3, SEK NR ID:5, SEK NR ID:7, albo wariant SEK NR ID:3, SEK NR ID:5, SEK NR ID:7, albo mogą być oczyszczonym i wyizolowanym białkiem, kodowanym przez SEK NR ID:1 SEK NR ID:2, SEK NR ID:4 albo SEK NR ID:6. Białka te mogą być zasadniczo wolne od innych białek ludzkich. Warianty tych białek, takie jak rozpuszczalne warianty albo białka fuzyjne zostały również opisane w niniejszym opisie. Białka fuzyjne KIM mogą zawierać immunoglobulinę, toksynę, związek dający się uwidocznić albo radionuklid.
188 826
Wynalazek dotyczy również swoistego przeciwciała monoklonalnego przeciwko opisanym powyżej białkom KIM. Tak więc przedmiotem wynalazku jest przeciwciało wiążące polipeptyd obejmujący aminokwasy 21-290 SEK NR ID:7. W kolejnej postaci wykonania, przeciwciało według wynalazku wiąże polipeptyd obejmujący aminokwasy 21-290 SEK NR ID:7. Korzystnie dowolne z wyżej wymienionych przeciwciał według wynalazku jest skoniugowane z immunoglobuliną toksyną, związkiem dającym się uwidocznić lub radionuklidem.
W niniejszy opisie, przedstawiono również kompozycje farmaceutyczne zawierające terapeutycznie skuteczną ilość białka KIM albo przeciwciała anty-KIM, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Dzięki rozwiązaniom według wynalazku można realizować metody diagnostyczne, takie jak stwierdzanie obecności albo przebiegu zdrowienia uszkodzonych nerek przez pomiar stężenia KIM w moczu, surowicy albo osadzie moczu chorych cierpiących na albo o podwyższonym ryzyku rozwoju choroby nerek. Wynalazek umożliwia również leczenie pacjentów terapeutycznie skutecznymi ilościami KIM, wariantów KIM, analogów KIM, białek fuzyjnych KIM, agonistów KIM i przeciwciał na KIM albo ligandy KIM. Niniejszym opisano również inne terapeutyczne związki do których należą ligandy KIM, przeciwciała anty-KIM oraz białka fuzyjne ligandów KIM. Związki te mogą być użyteczne w metodach terapeutycznych, które albo stymulują, albo wyhamowują odpowiedzi komórkowe, które zależne są od funkcji KIM.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają hamowanie wzrostu produkujących KIM komórek nowotworowych przez kontaktowanie tych komórek z białkiem fuzyjnym ligandu KIM oraz toksyną albo radionuklidem, albo z przeciwciałem anty-KIM skoniugowanym z toksyną albo radionuklidem. Podobnie, wzrost komórek nowotworowych, w których zachodzi ekspresja ligandu KIM, może zostać zahamowany przez zetknięcie tych komórek z białkiem fhzyjnym KIM i toksyną albo radionuklidem, albo z przeciwciałem anty-ligand KIM skoniugowanym z toksyną albo radionuklidem.
Poniżej opisano również sposoby terapii genowej wykorzystujące rozwiązania według wynalazku. Dotyczą one sposobu leczenia chorego ze schorzeniem nerek, sposobu promowania wzrostu nowej tkanki u chorego oraz sposobu promowania przeżycia uszkodzonej tkanki u chorego, obejmującego podanie choremu wektora, który zawiera DNA obejmujący sekwencję nukleotydową SEK NR ID: 1 SEK NR ID:2, SEK NR ID:4 albo SEK NR ID:6.
Rozwiązania według wynalazku są również użyteczne do obrazowania tkanek in vitro, czy też in vivo. Jeden z takich sposobów polega na nacelowaniu związku dającego się uwidocznić, na komórkę, w której zachodzi ekspresja białka o SEK NR ID:3, SEK NR ID:5 albo SEK NR ID:7, i obejmuje kontaktowanie komórki z przeciwciałem według wynalazku albo z białkiem fuzyjnym zawierającym białko jak opisane powyżej, sprzężone ze związkiem dającym się uwidocznić. Dla metod in vivo, komórka jest w organizmie chorego, a białko albo przeciwciało monoklonalne podaje się choremu.
Opisane tutaj metody diagnostyczne mają na celu identyfikowanie uszkodzenia lub regeneracji komórek nerkowych u chorego, poprzez porównanie poziomu ekspresji jednej spośród SEK NR ID: 1, SEK NR ID:2, SEK NR ID:4 albo SEK NR ID:6 w komórkach nerkowych pacjenta z kontrolnym poziomem ekspresji tej sekwencji w kontrolnych komórkach nerkowych. Inny sposób polega na identyfikacji regulacji w górę (wzrostu) SEK NR ID:1, SEK NR ID:2, SEK NR ID:4 albo SEK NR ID:6 w komórkach i obejmuje kontaktowanie komórek z sondą antysensowną i pomiar hybrydyzacji z RNA wewnątrz komórki.
Alternatywnie metoda diagnostyczna może polegać na oszacowaniu obecności albo stężenia cząsteczki według wynalazku w moczu, surowicy, albo w innych płynach ustrojowych, albo w osadzie moczu albo w próbkach tkanek. Cząsteczka związana z uszkodzeniem, której pomiar poziomu wykonuje się, może być skorelowana z obecnością, stopniem albo przebiegiem procesu patologicznego. Korelacja ta może być wykorzystywana do oceniania skuteczności reżimu terapeutycznego.
Krótki opis rysunków
Figura przedstawia sekwencję nukleotydową szczurzego klonu cDNA 3-2 z prawdopodobną ramką odczytu 615 do 1535.
Figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydową szczurzego klonu cDNA 1-7 z prawdopodobną ramką odczytu 145 do 1065.
188 826
Figura 3 przedstawia sekwencję nukleotydową szczurzego klonu cDNA 4-7 z prawdopodobną ramką odczytu 107 do 1822.
Figura 4 przedstawia sekwencję cDNA i wydedukowaną sekwencję aminokwasów ludzkiego klonu HI3-10-85 z prawdopodobną. ramką odczytu 1 do 1002. Górna linia przedstawia sekwencję cDNA (SEK NR ID:6), a dolna linia przedstawia wydedukowaną sekwencję aminokwasów (SEK NR ID:7).
Figura 5 przedstawia porównanie BESTFIT sekwencji nukleotydów ludzkiego klonu HI3-10-85 ze szczurzym klonem 3-2.
Geny KIM zostały zidentyfikowane przez analizę różnicy w ekspresji mRNA pomiędzy regenerującymi a normalnymi nerkami przy zastosowaniu reprezentatywnej analizy różnicowej (RDA). RDA jest opartą o PCR metodą subtrakcji, która daje fragmenty cDNA specyficzne dla komórki albo tkanki docelowej poprzez powtarzaną subtrakcję i amplifikację. Reprezentację cDNA z nerki dorosłego szczura 48 godzin po niedotlenieniu poddaje się subtrakcji z próbką z normalnej (operowanej bez wcześniejszej procedury doświadczalnej) nerki dorosłego szczura. W tej procedurze, sekwencje, które są wspólne zarówno dla po niedokrwiennej jak i normalnej próbki nerki zostają usunięte, pozostawiając te sekwencje, które w .sposób znaczący ulegają ekspresji tylko w uszkodzonej tkance nerkowej. Takie geny kodują białka, które mogą być terapeutycznie korzystne dla chorób nerek albo zaangażowane w proces uszkodzenia. Uzyskano, zsekwencjonowano i scharakteryzowano kilka klonów; Klony poddano następnie badaniu na ich wzorce ekspresji w czasie naprawy, rozwoju nerki oraz na rozkład tkankowy przy pomocy analizy metodą northem oraz hybrydyzacj i RNA in situ.
Numery identyfikacyjne sekwencji
Sekwencjom nukleotydów i aminokwasów, powoływanym w opisie, nadano następujące numery identyfikacyjne sekwencji:
SEK NR ID: 1 - sekwencja nukleotydów insertu szczurzego cDNA 3-2
SEK NR ID:2 - sekwencja nukleotydów insertu szczurzego cDNA 1-7
SEK NR ID:3 - sekwencja aminokwasów szczurzego KIM-1, kodowanego przez szczurze cDNA3-2 i 1-7
SEK NR ID:4 - sekwencja nukleotydów insertu szczurzego cDNA 4-7
SEK NR ID:5 - sekwencja aminokwasów kodowana przez insert cDNA 4-7
SEK NR ID:6 - sekwencja nukleotydów ludzkiego cDNA klonu H13-10-85
SEK NR ID:7 - sekwencja aminokwasów kodowana przez ludzki cDNA klonu HI 3-10-85 „Białko KIM”, stosowane tu synonimowo z „KIM”, jest białkiem kodowanym przez mRNA, które podlega wybiórczej regulacji w górę po uszkodzeniu nerki. Jedna z interesujących grup białek KIM zawiera te, które kodowane są przez mRNA, które ulega wybiórczej regulacji w górę w dowolnym momencie w ciągu jednego tygodnia po dowolnym urazie, którego wynikiem jest uszkodzenie tkanki nerkowej. Przykładowo, taką regulację w górę można zidentyfikować między innymi 10 godzin, 24 godziny, 48 godzin lub 96 godzin po urazie. Przykłady typów urazów obejmują urazy powstałe w wyniku niedokrwiennych, toksycznych i innych typów uszkodzenia.
„Agonista KIM” jest to cząsteczka, która może swoiście wywoływać odpowiedź komórkową, zwykle wywoływaną przez interakcję KIM z ligandem KIM. Agonista KIM może być wariant KIM, albo przeciwciało swoiste dla KIM, albo rozpuszczalna forma ligandu KIM.
„Antagonista KIM” jest to cząsteczka, która może swoiście wiązać się z ligandem KIM albo z KIM, tym samym blokując albo w inny sposób hamując wiązanie KIM z ligandem KIM. Wiązanie antagonisty blokuje albo hamuje odpowiedzi komórkowe, które w innej sytuacji byłyby wyzwalane przez związanie ligandu KIM a KIM albo z agonistą KIM. Przykłady antagonistów KIM obejmują pewne warianty KIM, białka fuzyjne KIM i swoiste przeciwciała na ligand KIM albo KIM.
„Ligand KIM” jest to dowolna cząsteczka, która w sposób niekowalencyjny i swoisty wiąże się z białkiem KIM. Takim ligandem może być białko, peptyd, steroid, przeciwciało, pochodna aminokwasowa albo inny typ cząsteczki, w dowolnej postaci, w tym występującej naturalnie, wytworzonej przez rekombinację albo w inny sposób zsyntetyzowanej. Ligand KIM może być w dowolnej postaci, w tym rozpuszczalnej, związanej z błoną, albo jako część konstruktu fuzyjnego z immunoglobuliną, kwasem tłuszczowym albo innymi grupami. Ligand
188 826
KIM może być integryną. Związany z błoną ligand KIM może działać jako receptor, który po związaniu albo skojarzeniu z KlM, wyzwala odpowiedź komórkową. W pewnych interakcjach, KIM może kojarzyć się z więcej niż jednym ligandem KIM albo może kojarzyć się z ligandem KIM jako część kompleksu z jedną bądź więcej innymi cząsteczkami albo kofaktorami. W sytuacji, w której zarówno KIM jak i ligand KIM są związane z błonami komórkowymi, KIM może kojarzyć się i reagować z ligandem KIM, który jest związany z tą samą komórką co KIM, albo może kojarzyć się i reagować z ligandem KIM, związanym z drugą komórką. Tam, gdzie wiązanie KIM zachodzi pomiędzy cząsteczkami związanymi z różnymi komórkami, te dwie komórki mogę być takie same albo różne pod względem ich typu komórkowego albo pochodzenia, fenotypowego albo metabolicznego stanu, albo typu bądź stopnia odpowiedzi komórkowej (np. wzrost, różnicowanie albo apoptoza) na dany bodziec. „Wiązanie KIM” odnosi się do kontaktowania i związania się KIM z ligandem KIM.
Przez „współliniowe ułożenie sekwencji” rozumie się umiejscowienie jednej sekwencji, nukleotydowej lub aminokwasowej, z inną sekwencją, w ceiu umożliwienia porównania sekwencji odpowiednich części jednej z drugą. Przykład tej procedury poddany jest w Needleman i wsp. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). Sposób ten można dogodnie przeprowadzić przy pomocy programów komputerowych takich jak program Align (DNAstar, Inc.). Dla specjalisty jest zrozumiałe, że homologiczne albo funkcjonalnie równoważne sekwencje obejmują funkcjonalnie równoważne układy reszt cysternowych z zachowanym szkieletem cysternowym, w tym insercje i delecje aminokwasów-; które zmieniają liniowy układ tych cystein, ale materialnie nie utrudniają ich współoddziaływania w zwiniętej strukturze białka. Dlatego też, wewnętrzne luki i insercje aminokwasów w sekwencjach-kandydatach pomija się dla celów obliczenia poziomu homologii albo identyczności sekwencji aminokwasowych pomiędzy sekwencjami kandydatami a sekwencjami odniesienia. Jedną z cech często używanych w ustalaniu homologii białek jest podobieństwo liczby i umiejscowienia reszt cysternowych pomiędzy jednym białkiem a drugim.
„Antysensowne DNA” odnosi się do sekwencji chromosomalnego DNA, które ulega transkrypcji.
„Sonda antysensowna” jest sondą, która zawiera przynajmniej część antysensownego DNA dla kwasu nukleinowego stanowiącego przedmiot zainteresowania.
Przez „klonowanie” rozumie się zastosowanie technik rekombinacji in vitro w ceiu wstawienia danego genu albo innej sekwencji DNA do cząsteczki wektora. W ceiu udanego sklonowania pożądanego genu konieczne jest zastosowanie metod wytwarzania fragmentów DNA, dla połączenia fragmentów z cząsteczkami wektora, dla wprowadzenia złożonej cząsteczki DNA do komórki gospodarza, w której może ona replikować, albo dla wybrania klonu mającego gen docelowy spośród przyjmujących komórek gospodarza.
Przez „cDNA” rozumie się komplementarne albo skopiowane DNA, wytworzone z matrycy RNA przez działanie zależnej od RNA polimerazy DNA (odwrotnej transkryptazy). W ten sposób „klon cDNA”oznacza dwuniciową sekwencję DNA, komplementarną do stanowiącej przedmiot zainteresowania cząsteczki RNa, przenoszonej w wektorze.
Przez „bibliotekę cDNA” rozumie się zbiór zrekombinowanych cząsteczek DNA, zawierających inserty cDNA, które razem stanowią reprezentację cząsteczek mRNA obecnych w całym organizmie albo tkance, zależnie od źródła matryc RNa. Taka biblioteka cDNA może być przygotowana znanymi metodami opisanymi na przykład w Maniatis i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p. wyżej. Ogólnie, RNA najpierw izoluje się z komórek organizmu, z którego genomu dany gen ma być klonowany. Linie komórkowe obejmują linie komórkowe ssaków, a w szczególności człowieka. Alternatywnie, RNA może być wyizolowane z komórki nowotworowej, pochodzącej z nowotworu zwierzęcego, a korzystnie z nowotworu ludzkiego. W ten sposób można przygotować bibliotekę na przykład z ludzkiego nowotworu nadnerczy albo można też zastosować inny nowotwór.
Używany tu termin „polimorfizm DNA” odnosi się do stanu, w którym dwie albo więcej różnych sekwencji nukleotydowych może istnieć w danym miejscu w DNA.
„Wektor ekspresyjny” obejmuje wektory, które zdolne są do ekspresji zawartych w nich sekwencji DNA, tj. sekwencje kodujące są funkcjonalnie połączone z innymi sekwencjami, zdolnymi do wpływu na ich ekspresję. Wynika z tego, choć nie zawsze jest to stwierdzone
188 826 wyraźnie, że te wektory ekspresyjne muszą ulegać replikacji w organizmach gospodarzy, albo jako episomy albo jako integralna część chromosomalnego DNA. Użytecznym, ale niekoniecznym, elementem skutecznego wektora ekspresyjnego jest sekwencja kodująca znacznik, która jest sekwencją kodującą białko, które powoduje właściwość fenotypową (taką jak oporność na tetracykliny) komórek zawierających białko, która pozwala na łatwą identyfikację tych komórek. W sumie, „wektorowi ekspresyjnemu” nadaje się definicję funkcjonalną i tym terminem objęta jest dowolna sekwencja DNA, która jest zdolna do przeprowadzenia ekspresji konkretnego zawartego w niej DNA, jako iż zastosowana jest do wyszczególnionej sekwencji. Ponieważ obecnie takie wektory są często w postaci plazmidów, zatem „plazmid” i „wektor ekspresyjny” są często stosowane zamiennie. Jednakże, istnieją inne postaci wektorów ekspresji, które służą równoważnym funkcjom i które mogą z czasem stać się znane w stanie techniki.
Przez „pochodną funkcjonalną” rozumie się „fragmenty”, „warianty”, „analogi” albo „pochodne chemiczne” cząsteczki. „Fragment” cząsteczki, odnosi się do dowolnego polipeptydowego podzbioru cząsteczki. „Wariant” takich cząsteczek odnosi się do występującej naturalnie cząsteczki, zasadniczo podobnej albo do całej cząsteczki albo do jej fragmentu. „Analog” cząsteczki odnosi się do nie występującej w naturze cząsteczki, zasadniczo podobnej albo do całej cząsteczki albo jej fragmentu.
Termin „gen” oznacza polinukleotydową sekwencję kodującą peptyd.
Przez termin „homogeny” rozumie się, gdy odnosi się do peptydu albo sekwencji DNA, że pierwszorzedowa struktura cząsteczkowa (tj. sekwencja aminokwasów albo nukleotydów) zasadniczo wszystkich cząsteczek obecnych w rozważanej kompozycji jest identyczna.
„Wyizolowany” odnosi się do białka albo do dowolnego genu kodującego dowolne takie białko, które są zasadniczo wolne od innych białek albo genów, odpowiednio, albo innych zanieczyszczeń, z którymi mogłyby być normalnie znajdowane w naturze, i jako takie istnieją w postaci nie znajdowanej w naturze.
Termin „znacznik” odnosi się do grupy cząsteczkowej, dającej się wykrywać i obejmuje na przykład, ale nie wyłącznie, izotopy radioaktywne, enzymy, środki luminescencyjne i barwniki.
Termin „sonda” odnosi się do ligandu o znanych własnościach, zdolnego do wybiórczego wiązania się z docelowym antyligandem. Stosowany w odniesieniu do kwasów nukleinowych, termin „sonda” dotyczy nici kwasu nukleinowego, mającego sekwencję zasad komplementarną do nici docelowej.
Termin „rekombinowane komórki gospodarza” odnosi się do komórek, które zostały stransformowane wektorami skonstruowanymi przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA. Według niniejszej definicji, przeciwciało, albo jego modyfikacja wytwarzane przez rekombinowaną komórkę gospodarza jest dzięki tej transformacji w większych ilościach niż w tak małych, a często poniżej ilości wykrywalnych, jakie wytwarzałby przez gospodarz niestransformowany.
Przez „zasadniczo czyste” rozumie się dowolne białko, albo dowolny gen kodujący takie białko, które są zasadniczo wolne od innych białek i genów, odpowiednio, albo od innych zanieczyszczeń, z którymi mogłyby być normalnie znajdowane w przyrodzie i jako takie istnieją w postaci nie spotykanej w przyrodzie.
O cząsteczce mówi się, iż jest „zasadniazo podobna” do irmej cz^gsteczki, jcżeii seżwencja aminokwasów w obu cząsteczkach jest zasadniczo taka sama, i jeżeli obie cząsteczki posiadają podobną aktywność biologiczną. Zatem, przy założeniu, że dwie cząsteczki posianą podobną aktywność, uważa się je za warianty, gdyż termin ten stosowany jest tu nawet, jeżeli jedna z cząsteczek zawiera dodatkowe reszty aminokwαeowe nie znajdowane w innej, albo jeżeli sjewencja aminokwasów nie jest identyczna. W niniejszym anisie stosuje się określenie, iż cząsteczka jest „chemicżpą pochodną” innej cząsteczki, gdy zawiera dodatkowe grupy chemiczne, nie stanowiące normalnie części cząsteczki. Takie grupy mogą polepszać rozpuszczalność cząsteczki, absorpcję, biologiczny czas półtrwania itp. Grupy te mogą alternatywnie zmpiejjżoć toksyczność cząsteczki, eliminować albo osłabić wszelkie działanie nienożądope cząsteczki itp. Grupy zdolne do wywoływania takich efektów opisano na przykład w Remington^ Phormoceuticol Sciences, wy”. 16, Mack Publishing Co., Faston, Penn. (1980).
188 826
Przez „wektor” rozumie się cząsteczkę DNA, pochodzącą z plazmidu albo bakteriofaga, do której można wstawić albo wklonować fragmenty DNA. Wektor zawierać będzie jedno albo więcej unikalnych miejsc restrykcyjnych i może być zdolny do autonomicznej replikacji w określonym organizmie gospodarza albo nośnika, tak że sklonowana sekwencja jest reprodukowalna.
Niniejszym przedstawiono cDNA o SEK NR ID:1, SEK NR ID:2, SEK NR ID:4 albo SEK NR ID:6, jak również sekwencje, które obejmują sekwencje SEK NR ID:1, SEK NR ID:2, SEK NR ID: 4 albo SEK NR ID:6 oraz pochodne tych sekwencji. Opisano również wektory, liposomy i inne nośniki, które zawierają te sekwencje albo ich pochodne. Przedstawione zostały również białka transkrybowane z SEK NR ID.l, SEK NR ID:2, SEK NR ID:4 albo SEK NR ID:6, w tym, nieograniczająco, białka o SEK NR ID:3, SEK NR ID:5 albo SEK NR ID:7 oraz ich pochodne i warianty.
Jedno z wykonań wynalazku dotyczy rozpuszczalnych wariantów białka KIM, które jest zwykle syntetyzowane jako białko związane z błoną i które ulega regulacji w górę po uszkodzeniu. Wariantom rozpuszczalnym brakuje przynajmniej części odcinka przezbłonowego albo wewnątrzbłonowego natywnego białka KIM. W pewnych przykładach, rozpuszczalnemu wariantowi brak jest całego odcinka przezbłonowego albo wewnątrzbłonowego natywnego białka KIM. Warianty rozpuszczalne obejmują białka fuzyjne, które zawierają pochodne białek KIM, którym brakuje przynajmniej części odcinka przezbłonowego albo wewnątrzbłonowego natywnego białka KIM. Należą tu wszystkie typy białek fuzyjnych KIM, szczególnie te, które zawierają formy cząsteczki his-tag, Ig-tag i myc-tag. Te fuzje KIM mogą mieć właściwości, które są terapeutycznie korzystne, takie jak zwiększony okres półtrwania, nadawane przez Ig-tag. Do tej kategorii należą również białka fuzyjne, które zawierają części wybranych domen białka KIM.
Warianty mogą różnić się od występującego w przyrodzie białka KIM pod względem sekwencji aminokwasów, albo w inny sposób, który nie obejmuje sekwencji, bądź też sekwencjami aminokwasów i w inny sposób równocześnie. Warianty sekwencji aminokwasowej wytwarza się, gdy jeden bądź więcej aminokwasów z występującego w przyrodzie białka KIM zastąpi się innym naturalnym aminokwasem, pochodną aminokwasów albo nienatywnym aminokwasem. Warianty obejmują występujące w przyrodzie białko KIM, albo biologicznie aktywne fragmenty występującego w przyrodzie białka KIM, których sekwencje różnią się od sekwencji dzikiego typu substytucją jednego albo więcej konserwatywnych aminokwasów, które zwykle mają minimalny wpływ na drugorzędową strukturę i hydrofobową naturę białka albo peptydu. Warianty mogą również mieć sekwencje, które różnią się jedną bądź wieloma niekonserwatywnymi substytucjami, delecjami albo insercjami aminokwasów, które nie znoszą aktywności biologicznej białka KIM. Substytucje konserwatywne zwykle obejmują substytucję jednego aminokwasu na inny o podobnych cechach, takie jak substytucje wewnątrz następujących grup: walina, glicyna; glicyna, alanina; walina, izoleucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; oraz fenyloalanina, tyrozyna. Do niepolamych (hydrofobowych) aminokwasów należą alanina, leucyna, izoleucyna, walina, prolina, fenyloalanina, tryptofan i metionina. Do polarnych obojętnych aminokwasów należą glicyna, seryna, treonina, cysteina, tyrozyna, asparagina i glutamina. Do naładowanych dodatnio (zasadowych) aminokwasów należą arginina, lizyna i histydyna. Do ujemnie naładowanych (kwaśnych) aminokwasów należą kwas asparaginowy i kwas glutaminowy.
Inne substytucje konserwatywne mogą być wzięte z poniższej tabeli, a jeszcze inne opisane zostały przez Dayhoffa w Atlas of Protein Seąuence and Structure (1988).
188 826
Tabela 1
Konserwatywne zastąpienia aminokwasów
Dla Aminokwasu Kod Zastąp dowolnym spośród
Alanina A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina R D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Om, D-Om
Asparagina N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Kwas asparaginowy D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Cysteina C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamina Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kwas glutaminowy E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
Glicyna G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp
Izoleucyną I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucyna L D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lizyna K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, D-Ile, D-Om
Metionina M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenyloalanina F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 albo 5-fenyloprolina, cis 3,4 albo 5-fenyloprolina
Prolina P D-Pro, kwas L-I-tioazolidyno-4-karboksylowy, kwas D- albo L-l-oksazolidyno-4-karboksylowy
Seryna S D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O) D-Met (O), Val, D-Val
Treonina T D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O), D-Met (O), Val, D-Val
Tyrozyna Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Walina V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
Innymi wariantami są te z modyfikacjami, które zwiększają stabilność peptydu. Takie warianty mogą na przykład zawierać jedno albo więcej wiązań niepeptydowych (które zastępują: wiązania peptydowe) w sekwencji peptydowej. Należą do nich również: warianty, które zawierają reszty inne niż naturalnie występujące L-aminokwasy, takie jak D-aminokwasy albo nie występujące w przyrodzie albo syntetyczne aminokwasy takie jak beta lub gamma aminokwasy i warianty cykliczne. Włączenie D-zamiast L-aminokwasów do polipeptydu może zwiększyć jego odporność na proteazy. Patrz np. opis patentowy USA 5,219,990.
Ogólnie, substytucjami, po których można oczekiwać, iż wywołają zmiany we własnościach funkcjonalnych polipeptydów KIM są te, w których: (i) reszta hydrofilowa, np.. seryna albo treonina, zastąpiona jest resztą hydrofobową, np. leucyną, izoleucyną, fenyloalaniną albo alaniną; (ii) reszta cysteiny zastąpiona jest przez (albo zastępuje) inną resztę; (iii) reszta posiadająca elektrododatni łańcuch boczny, np. lizyna, arginina albo histydyna, zastąpiona jest przez (albo zastępuje) resztę, mającą elektroujemny ładunek, np. kwas glutaminowy albo kwas
188 826 asparaginowy; albo (iv) reszta, posiadająca duży łańcuch boczny, np. fenyloalaniną, zastąpiona jest przez (albo zastępuje) inną nie posiadającą takiego łańcucha bocznego, np. glicynę.
Peptydy według wynalazku mogą być również modyfikowane przez różne zmiany takie, jak insercje, delecje i substytucje, konserwatywne lub niekonserwatywne, tam gdzie takie zmiany mogą dostarczyć pewnych korzyści z ich zastosowania. Istotnym aspektem są również warianty składania genów
Warianty z substytucjami aminokwasów, które są mniej konserwatywne, mogą również dawać pożądane pochodne, np. powodując zmiany ładunku, konformacji i innych właściwości biologicznych. Takie substytucje obejmowałyby na przykład zastąpienie reszty hydrobowej resztą hydrofitową, substytucję innej reszty cysteiną albo proliną, substytucję reszty mającej duży łańcuch boczny resztą mającą mały łańcuch boczny albo substytucję reszty mającej sumaryczny ładunek ujemny resztą mającą sumaryczny ładunek dodatni. Gdy wynik danej substytucji nie daje się przewidzieć z pewnością, pochodne można łatwo przetestować według opisanych tu sposobów w ceiu określenia obecności albo nieobecności pożądanych cech.
Warianty obejmują białka i peptydy o sekwencjach aminokwasów, o przynajmniej osiemdziesięcioprocentowej homologii z białkiem KIM. Korzystnie homologia sekwencji wynosi przynajmniej dziewięćdziesiąt procent, albo przynajmniej dziewięćdziesiąt pięć procent. Dla celów określania homologii długość sekwencji porównywanych będzie wynosić na ogół przynajmniej 8 reszt aminokwasowych, zwykle przynajmniej 20 reszt aminokwasowych. Warianty związków zawierają również dowolne białko, które: 1) ma sekwencję aminokwasów, która jest przynajmniej w czterdziestu procentach homologiczna z białkiem KIM według wynalazku, jak również które 2) po umieszczeniu w optymalnym układzie współliniowym z sekwencją KIM (jak przedstawiono na fig. 5 dla ludzkiego i szczurzego KIM-1) ma przynajmniej 80% swych reszt cysternowych ułożonych współliniowo z cysteinami w białku KIM według wynalazku.
Tak jak możliwe jest zastąpienie podstawników szkieletu, możliwe jest również zastąpienie grup funkcyjnych, które związane są ze szkieletem grupami charakteryzującymi się podobnymi cechami. Te zastąpienia początkowo będą konserwatywne, tj. grupa zastępująca będzie miała w przybliżeniu ten sam rozmiar, kształt, hydrofobowość i ładunek co grupa początkowa. Pozasekwencyjne modyfikacje mogą obejmować na przykład, tworzenie chemicznych pochodnych in vivo lub in vitro części występującego w przyrodzie białka KIM, jak również zmiany w acetylacji, metylacji, fosforylacji, karboksylacji lub glikozylacji.
W zakresie wynalazku są również środki, które swoiście wiążą się z białkiem, albo fragmentem białka. Do środków tych należą ligandy, których szczególnym przykładem są przeciwciała (w tym monoklonalne, jednołańcuchowe, dwułańcuchowe, fragmenty Fab i inne, natywne, ludzkie, humanizowane, prymatyzowane albo chimeryczne). Dodatkowe opisy tych kategorii środków znajdują się w zgłoszeniu patentowym PCT 95/16709, którego opis jest tu włączony przez odniesienie.
Procedury doświadczalne
Wytwarzanie RNA z niedokrwionej i normalnej nerki dorosłego szczura
Uszkodzone przez niedotlenienie nerki dorosłego szczura wytwarza się jak opisano przez Witzgalla i wsp. (J. Clin. Invest. 93:2175-2188, 1944). W skrócie, tętnicę i żyłę nerkową z jednej nerki dorosłego szczura rasy Sprague-Dawley zaciska się na 40 minut, a następnie poddaje reperfuzji. Uszkodzone nerki pobiera się od szczura po 24 godzinach i po 48 godzinach po reperfuzji. Pobiera się również nerki od niepoddanych procedurze doświadczalnej, normalnych dorosłych szczurów rasy Sprague-Dawley.
Całkowity RNA przygotowuje się z tych narządów według protokołu Glisina i wsp. (Biochemistry 13: 2633, 1974). W skrócie, pobrane narządy umieszcza się natychmiast w buforze GNC (4M tiocyjanianu guanidyny, 0,5% SDS, 25 mM cytrynianu sodu, 0,1% odpieniacza Sigma) i rozbija na lodzie przy pomocy politronu. Pozostałość komórkową usuwa się przez wirowanie przy niskiej prędkości w wirówce klinicznej, a płyn supematantu umieszcza na poduszce z 5,7 M CsCl, 25 mM octanu sodu, 1 mM EDTA. RNA peletuje się przez poduszkę w wirówce SW40Ti przy 22K przez 15 godzin. RNA ponownie zawiesza się w jałowej wodzie poddanej obróbce DEPC, wytrąca dwukrotnie za pomocą 1/10 objętości 3M octanu
188 826 sodu i 2,5 objętości EtOH. PoliA+ RNA izoluje się przy użyciu zestawu do oczyszczania mRNA (Pharmacia, nr katalogowy 27-9258-02).
2. Metoda Reprezentatywnej Analizy Różnicowej (RPA) w celu wyizolowania fragmentów 1-7. 3-2 i 4-7 RPA
Dwuniciowe cDNA syntetyzuje się z poliA+ RNA z nerek nie poddanych procedurze doświadczalnej i z nerek w 48 godzin po niedokrwieniu, przy użyciu zestawu Gibco BRL „Superscript Choice™ System cDNA Synthesis Kit”, nr katalogowy 18090. Pierwszą nić syntetyzuje się z użyciem oligo dT jako startera i stosując odwrotną transkryptazę Superscript II™. Drugą nić wytwarza się przy użyciu polimerazy I DNA E. Coli i RNAzy H, a następnie polimerazy DNA T4 przy zastosowaniu polecanych przez BRL warunków.
Analizę RDA przeprowadza się zasadniczo jak opisano przez Kubanka i Schatza (Nucleic Acid Research 22: 5640-48, 1994). W skrócie, cDNA nerki w 48 godzin po niedokrwieniu trawi się enzymem restrykcyjnym Dpn II i poddaje ligacji z oligonukleotydami R-Bgl-12/24 (patrz odniesienie do dokładnej sekwencji). Amplifikacje PCR (przeprowadzaną z użyciem polimerazy Taq Perkin-Elmer i ich odpowiedniego buforu PCR) zligowanego z linkerem cDNA wykorzystuje się do wytworzenia reprezentacji początkowej. Ten produkt PCR określa się jako „amplikon testowy” (ang. tester amplicon). Tę samą procedurę wykorzystuje się do wytworzenia „ampłikonu napędowego” (ang. driver amplicon) z cDNA nerki szczura nie poddanego procedurze doświadczalnej.
Hybrydyzację testowego i napędowego ampłikonu, po której następuje wybiórcza amplifikacja przeprowadza się trzy razy w celu wytworzenia Produktu Różnicowego Jeden (ang. Differential Product, DPI), Dwa (DP2) i Trzy (DP3). Wytworzenie produktu DPI przeprowadza się jak opisano przez Kubanka i Schatza (Nucleic Acid Research 22:5640-48, 1994). Produkty DP2 i DP3 wytwarza się również jak opisano przez Kubanka i Schatza (id.) z tym wyjątkiem, że stosunki napęd:test zmieniają się na 5 333:1 dla DP2 i 40 000:1 albo 4 000:1 dla DP3.
Trzy produkty RDA wklonowuje się z DP3 do wektora klonowania pUC 18: produkt RDA 1-7 (252bp), gdy DP3 wytworzono przy zastosowaniu stosunku 40 000:1 i produkt RDA
3-2 (445 bp) oraz 4-7 (483bp), gdy DP3 wytworzono przy zastosowaniu stosunku 4 000:1. Fragmenty DNA poddaje się subklonowaniu przy zastosowaniu zestawu Pharmacia Sureclone™ (nr katalogowy 27-9300-01) w celu naprawy końców fragmentów PCR przy pomocy enzymu Klenowa i dla ułatwienia ligacji tępych końców fragmentów do wektora pUC18.
3. Analiza Northern
PoliA- RNA (2,5 (.g) z nerki normalnego dorosłego szczura (nie poddanego procedurze doświadczalnej), z nerki dorosłej w 48 godzin po uszkodzeniu niedokrwiennym i z nerki 18dniowego płodu poddaje się elektroforezie i Northern Blottingowi (Cate, Celi 45:685, 1986) na błonę GeneScreen™ (Dupont). Hybrydyzację w buforze PSB (50 mM Tris 1,5, IM NaCl, 0,1% pirofosforan Na, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA, 1% SDS), zawierającym 10% siarczan dekstranu i 100 pg/ml tRNA, przeprowadza się w 65 °C przy zastosowaniu trzech różnych sond: produkt RDA 1-7, produkt RDA 3-2 i produkt RDA 4-7. Wszystkie są wyznakowane radioizotopowo przy użyciu zestawu do znakowania z losowymi starterami Pharmacia „Ready to Go™” (nr katalogowy 27-9251-01). Produkty RDA 1-7, 3-2 i 4-7 hybrydyzują z mRNA obecnymi we wszystkich trzech próbkach, ale najintensywniej z mRNA w próbkach RNA nerki w 48 godzin po niedokrwieniu.
Analiza Northern blot tkanek dorosłego szczura wskazuje, iż gen 1-7 ulega ekspresji na bardzo niskich poziomach w normalnej dorosłej nerce, jądrze, śledzionie i płucu. Gen 3-2 ulega ekspresji w wątrobie, nerce, śledzionie i mózgu. Gen 4-7 ulega ekspresji w śledzionie, nerce, płucu, jądrze, sercu, mózgu, wątrobie i mięśniu szkieletowym. Obecność mRNA o różnych rozmiarach w pewnych tkankach w błocie 1-7 i 3-2 wskazuje, iż pierwotny produkt transkrypcji genu 1-7 i genu 3-2 może podlegać alternatywnemu składaniu i/lub poliadenylacji.
4. Izolacja klonów cDNA 3-2 i 4-7
Bibliotekę cDNA wytwarza się z 4 pg poliA+ RNA z nerki w 48 godzin po uszkodzeniu niedokrwiennym przy zastosowaniu odczynników z zestawów BRL Superscript Choice™ System for cDNA synthesis oraz Stratagene™ Lambda Zap II cloning kit (nr katalogowy 236201), według protokołów zalecanych przez wytwórców.
188 826
105 klonów przesiewa się z produktem RDA 3-2 jako sondą (znakowaną. przy zastosowaniu losowych starterów jak opisano powyżej). Wybiera się osiem dodatnich klonów, a cztery się wybiera losowo dla wtórnej analizy w celu uzyskania czystych łysinek fagowych. Po trzeciorzędowym przesianiu, izoluje się cztery czyste klony fagowe. Sklonowane inserty z faga izoluje się przez procedurę wycięcia in vivo według zestawu Stratagana™ Lambda Zap II kit. Największy insert, około 2,6 kb (określany jako klon cDNA 3-2) poddaje się sekwencjonowaniu DnA. Sekwencję insertu (SEK NR ID: 1) przedstawiono na fig. 1. Klon cDNA
3-2 (E. Coli K-12, SOLRp3-7#3-l) zdeponowano jako ATCC Nr 98061. Sekwencja klonu cDNA 3-2 jest identyczna jak klonu 1-7 cDNA (SEK NR ID:2), z tym wyjątkiem, że nukletydy 136-605 SEK NR ID:1 stanowią insercję. A zatem, SEK Nr ID:2 stanowi wariant składania względem SEK NR ID:1. Klon 1-7 (E Coli K-12, SOLRpl-7#3-l) zdeponowano jako ATCC Nr 98060.
5 klonów przesiewa się z produktem RDA 1-7 jako sondą (znakowaną, przy zastosowaniu losowych starterów jak opisano powyżej). Wybiera się osiem dodatnich klonów, a cztery wybiera się losowo dla wtórnej analizy w celu uzyskania czystych łysinek f2rogdch. Po trzeciorzędowym przesianiu, izoluje się cztery czyste klony fagowe. Sklonowane inserty z faga izoluje się przez procedurę wycięcia in vivo według zestawu Stratagene™ Lambda Zap II kit. Największy insert, około 2,0 kb (określany jako klon cDNA 1-7) poddaje się sekwencjonowaniu DNA; sekwencje insertu (SEK NR ID: 2) przedstawiono na fig. 2.
105 klonów przesiewa się z produktem RDA 4-7 jako sondą (znakowaną, przy zastosowaniu losowych starterów jak opisano powyżej i hybrydyzowaną w PSB w 65°C). Wybiera się osiem dodatnich klonów, a cztery wybiera się losowo dla wtórnej analizy w ceiu uzyskania czystych łysinek fagowych. Po wtórnym przesianiu, izoluje się dwa czyste klony fagowe. Sklonowane inserty z faga izoluje się przez procedurę wycięcia in vivo według zestawu Stratagene™ Lambda Zap II kit. Największy insert, około 2,4 kb (określany jako klon cDNA 4-7) poddaje się sekwencjonowaniu DNA. Sekwencję insertu, SEK NR ID:4, przedstawiono na fig. 3. Klon cDNA 4-7 (E. coli K-12, SOLRp4-7#1-1) zdeponowano jako ATCC nr 98062.
5. Charakteryzacja klonów cDNA 1-7, 3-2 i 4-7
A.) Sekwencje DNA i białek:
Sekwencja cDNA 3-2 (fig. 1; SEK NR ID:1) zawiera otwartą ramkę odczytu 307 aminokwasów (fig. 1, SEK NR ID:3). Sekwencja sygnałowa 21 aminokwasów wywnioskowana została z analizy Von Heijne (Von Haijne i wsp., Nuci. Acid Res. 14:14683 (1986)), a przezbłonowy region około 235-257 aa wskazuje na to, iż produkt 3-2 jest białkiem powierzchni komórki.
Sekwencja 1-7 cDNA (fig. 2; SEK NR ID:2) zawiera otwartą ramkę odczytu 307 aminokwasów, która jest identyczna z otwartą ramką odczytu zawartą w 3-2 cDNA (SEK NR ID:3). Sekwencja 4-7 cDNA (fig. 3; SEK NR ID:4) zawiera otwartą ramkę odczytu 572 aminokwasów (SEK NR ID:5). Region krsezblonowd jest umieszczony w przybliżeniu w aminokwasach 501-521. B). Analiza in situ mRNA 1-7, 3-2 i 4-7 w nerkach dorosłego szczura z przeciwnej strony i po niedokrwieniu:
Hybrydyzację in situ przeprowadza się według matody opisanej przez Fincha i wsp., Dev. Dynamics 203: 223-240, 1995. Wróc^za zarównp pomenogrwieao2nak i sazegiwstronne nerki utrwala się przez perfuzję 4% paraformaldehydem w PBS. Nerki następnie utrwala się przez noc w 4°C i poddaje obróbce. Skrawki parafinowe poddaje się deparafinizacji i uwodnieniu, utrwala w 4% karaform2ldehddzle w PBS, trawi protainazą K, ponownie utrwala i poddaje acetylacji bezwodnikiem octowym w buforze tioetanolaminowym. Skrawki następnie odwadnia się i hybrydyzuje z wyznakowanymi 32P rybosondami w 55°C przez noc, przy użyciu wyznakowanych 33P rybosond wytworzonych z produktów 3-2 RDA albo 1-7 RDA subWonowanych w miejsce BamHl pGEM-llZ. Po hybrydyzacji, skrawki przemywano w bardzo ostrych warunkach (2 X SSC, 50% formamid w 65°C). W końcu skrawki odwodniono, pokryto emulsją (NBT-2) autoradiograficzną i eksponowano przynajmniej przaz tydzień. Ziarna srebra wywołano i skrawki zabarwiono kontrastowo błękitem toluiddnowdm i wykonano mikrofotografie.
Analiza ekspresji mRNA 1-7 i 3-2 przez hybrydyzację in situ wskazuje, iż geny te ulegają znacznej regulacji w górę w uszkodzonych komórkach nerki w porównaniu z ich ekspresją
188 826 w skrawkach normalnej nerki. Obserwuje się ekspresję w komórkach regenerujących kory i zewnętrznego rdzenia, z których większość wydaje się być komórkami kanalika proksymalnego. Analiza wzorca ekspresji RNA 4-7 in situ ujawnia również obfitą ekspresję tego genu w nerce uszkodzonej niedokrwieniem w porównaniu z normalną dorosłą nerką. Miejscem ekspresji wydają się być komórki naciekające.
6. Izolacia ludzkiego klonu cDNA, który krzyżowo hybrydyzuje ze szczurzym 3-2 cDNA
Wyznakowaną J2P sondę DNA, zawierającą nukleotydy 546-969 insertu klonu 3-2, przedstawionego na fig. 1 wytwarza się i wykorzystuje do przesiewowego badania biblioteki cDNA lambda gtlO ludzkiej wątroby płodowej (Clontech Catalog #HL5003a). 1 X 106 łysinek poddaje się przesiewowi w duplikacie przy zastosowaniu standardowych warunków, jak opisano powyżej, ale temperatura dla przesiewu wynosiła 55°C. Dla przemywania w bardzo ostrych warunkach, filtry przemywano w 2 X SSC w 55°C. Zidentyfikowano pięćdziesiąt dodatnich fagów i oczyszczono łysinki oraz przygotowano DNA. Fagowe DNA poddaje się analizie Southern przy zastosowaniu tej samej sondy co poprzednio. Filtr Southern błot poddaje się ostatecznemu płukaniu 0,5 X SSC w 55°C. Dwa klony identyfikuje się jako dodatnie. Insert klonu HI3-10-85 sekwencjonuje się i znajduje się region, który koduje białko o wysokim stopniu identyczności z białkiem 3-2 przedstawionym na fig. 3.
Sekwencja nukleotydowa (SEK NR ID:6) i przewidywana sekwencja aminokwasowa (SEK NR ID:7) ludzkiego białka spokrewnionego z 3-2 przedstawione są na fig. 4. Jak wykazano analizą najlepszego dopasowania, przedstawioną na fig. 5, ludzkie białko spokrewnione z 3-2 jest w 43,8% identyczne i w 59,1% podobne do szczurzego białka 3-2. Obydwa zawierają domeny I-gG, mucynową, przezbłonową i cytoplazmatyczną. Sześć cystein w obrębie domen IgG obydwu białek jest zachowanych.
7. Wytwarzanie białka fuzyjnego KIM-1 Ig
Białko fuzyjne zewnątrzkomórkowej domeny KIM i regionu Fc immunoglobuliny (Ig) jest użytecznym narzędziem do badania cząsteczkowej i komórkowej biologii uszkodzonej/regenerującej nerki oraz jest cząsteczką terapeutyczną. W ceiu wytworzenia białka fuzyjnego KIM Ig z zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego i szczurzego białka KIM-1, fragment cDNA zewnątrzkomórkowej domeny KIM-1 poddano amplifikacji metodą PCR i wklonowano w wektor ekspresyjny Biogen, pCA125, dla przejściowej ekspresji w komórkach COS. Wektor ekspresyjny pCA125 wytwarza białko fuzyjne, które ma strukturę z genu wklonowanego przy końcu N i regionu Fc ludzkiej Ig przy końcu C. Komórki COS zostały stransfekowane plazmidami SJR 103 albo 104; plazmidy te wyrażają białko fuzyjne, które zawiera sekwencje ludzkiego KIM 263-1147 (SEK NR lD:6; sJr 103) albo sekwencje szczurzego KIM 599-1319 (SEK NR ID: 1; SJR 104) zewnątrzkomórkowej domeny sfuzowane z regionem Fc ludzkiej Ig. Komórki te hodowano w 10% FBS w DMEM w fabryce komórkowej (Nunc, Naperyille, II). Dwa do trzech dni po transfekcji, medium zbierano, zagęszczano przy użyciu koncentratora Amicon, a białko fuzyjne oczyszczano przy zastosowaniu kolumny Białko A Sefaroza. Po oczyszczeniu, czystość białka fuzyjnego oceniono metodą SDS-PAGE. Diagnostyczne zastosowania związków według wynalazku
Przeciwciała anty-KIM, które swoiście wiążą się z białkiem SEK NR ID:3, SEK NR ID:5 albo SEK nR ID:7 albo ich fragmentem, są użyteczne w kilku metodach diagnostycznych. Środki te mogą być wyznakowane wykrywalnymi znacznikami, takimi jak substancje nieprzezroczyste fluoroskopowo albo radiograficznie, i podane pacjentowi w celu umożliwienia zobrazowania tkanek, które wykazują ekspresję białka KIM. Środki te mogą również być związane z substancjami, takimi jak peroksydaza chrzanowa, które można zastosować jako barwniki immunocytochemiczne w ceiu umożliwienia zobrazowania obszarów komórek dodatnich względem białka KIM na skrawkach histologicznych. Swoiste przeciwciało mogłoby być stosowane samo w ten sposób, a miejsca, gdzie jest związane można by obrazować w teście kanapkowym, przy zastosowaniu przeciwciała antyimmunoglobulinowego, które samo związane jest z wykrywalnym znacznikiem.
Swoiste przeciwciała na białko KIM są również użyteczne w ceiu zmierzenia obecności albo stężenia KIM w próbkach tkanek albo płynów ustrojowych. Takie stężenia mogą być związane z różnymi stanami chorobowymi. Szczególnie ciekawy jest sposób diagnozowania uszkodzenia nerki, albo monitorowania procesu naprawy nerki, przez pomiar stężenia KIM
188 826 albo fragmentów KIM w moczu, osoczu albo surowicy chorego. Podobnie, KIM można zmierzyć w osadzie moczu, w szczególności w pozostałościach komórkowych w osadzie moczu. Odlewy komórek kanalików nerkowych, które mogą być obecne w osadzie moczu u chorych z trwającą chorobą nerek, mogą zawierać podwyższone poziomy białka KIM i mRNA.
Swoiste przeciwciała wobec białka KIM mogą być również związane z podłożami stałymi, takimi jak kulki albo naczynia, i stosowane do usunięcia ligandu z roztworu, dla pomiaru lub dla oczyszczenia i scharakteryzowania białka albo jego właściwości (takich jak modyfikacje potranslacyjne). Taka charakterystyka białka KIM chorego może być użyteczna w identyfikowaniu szkodliwych mutantów albo w obróbce defektów, które przeszkadzają w funkcji KIM i związane są z nienormalnymi fenotypami u pacjenta. Każda z tych technik jest rutynowa dla osób biegłych w dziedzinie immunologii.
Dodatkowe metody obrazowania wykorzystują KIM albo fragmenty KIM, sfuzowane z dającymi się uwidaczniać grupami, dla diagnostycznego obrazowania tkanek, które wykazują ekspresję ligandów KIM, w szczególności nowotworów.
Dalsze techniki diagnostyczne oparte są na wykazaniu regulacji w górę mRNA KIM w tkankach, jako wskaźniku procesów związanych z uszkodzeniem. Technikę tę testowano i stwierdzono jej działanie w modelu urazu niedokrwiennego u szczurów, jak następuje.
W ceiu określenia, czy ilość białka KIM-1 zwiększa się po urazie, zbadaliśmy homogenaty nerek przeciwstronnych i poniedokrwiennych w 24 i 48 godzin po zaciśnięciu przez 40 minut nerkowej tętnicy i żyły jednej nerki każdego szczura. Homogenat nerkowy oceniano pod kątem obecności białka KIM-1. Analiza Western biot identyfikuje trzy białka wykrywane przez dwa różne przeciwciała po urazie niedokrwiennym, które nie są wykrywalne w homogenatach z przeciwstronnych nerek, które nie były wystawione na uraz niedokrwienny. Ciężary cząsteczkowe prążków wynoszą około 40 kDa, 50 kDa i 70-80 kDa. Trzy rodzaje białek wykrywanych metodą western blotting mogłyby reprezentować glikozylowane formy tego samego białka, przy założeniu obecności potencjalnych miejsc glikozylacji związanych z N i O. Fakt, iż każde z tych białek reaguje z dwoma różnymi zestawami poliklonalnych przeciwciał wspiera teorię, iż są one związane z KIM-1 i nie są prążkami krzyżowej reakcji. Potwierdzenie tego przewidywania wynika z częściowego cięcia CNBr trzech białek, które ujawniło, iż mają one wspólne fragmenty cięcia CNBr. Ponieważ wydaje się, iż cytoplazmatyczna domena białka KIM-lnie zawiera żadnych głównych modyfikacji potranslacyjnych, dwa najmniejsze produkty trawienia (4,7 kDa i 7,4 kDa) wykrywane przy pomocy przeciwciał skierowanych przeciwko cytoplazmatycznej domenie KIM-1 powinny mieć ten sam rozmiar dla trzech różnych prążków białkowych KIM-1, jeżeli pochodzą z tego samego białka. Zaobserwowaliśmy, iż białka KIM1 40 kDa i 70-80 kDa dają fragmenty migrujące przy przewidywanym rozmiarze. Trawienie prążka białka 50 kDa dało również ten sam C-końcowy peptyd prążka oznaczeniowego.
Sekwencja KIM-lwykazuje dwa prawdopodobne miejsca N-glikozylacji oraz domenę mucynową, gdzie O-glikozylacja mogłaby pokrywać łańcuch polipeptydowy. Trzy prążki KIM-1 wykrywane w nerce poniedokrwiennej mogłyby odpowiadać wariantom glikozylacyjnym tego samego białka rdzeniowego. De-N-glikozylacja przy użyciu PNGazy F spowodowała przesunięcie wszystkich trzech prążków do niższego ciężaru cząsteczkowego, co odpowiada utracie około 3 kDa, wskazując, iż wszystkie trzy białka sąN-glikoz.ylowane. Różnice w O-glikozylacji mogłyby wyjaśniać różnice w rozmiarach tych trzech prążków. Terapeutyczne zastosowania związków według wynalazku
Metody terapeutyczne wykorzystują wybiórcze promowanie albo hamowanie odpowiedzi komórkowych, które są zależne od wiązania KIM. Tam, gdzie zarówno KIM jak i ligand KIM są związane z błoną, i są wyrażane w różnych komórkach, przewodzenie sygnału może zachodzić w komórce wykazującej ekspresję KIM, w komórce wykazującej ekspresję ligandu KIM albo w obydwu.
Odpowiedź wyzwalana przez związanie KIM w komórce wykazującej ekspresję ligandu KIM może być wytwarzana przez kontaktowanie komórki z egzogennym KIM, białkami fuzyjnymi KIM albo przeciwciałami aktywującymi przeciwko ligandowi KIM, in vitro lub in vivo. Ponadto, odpowiedzi komórki wykazującej ekspresję ligandu KIM, które w innej sytuacji byłyby wyzwalane przez endogenne KIM, można byłoby blokować przez kontaktowa16
188 826 nie komórki wykazującej ekspresję ligandu KIM z antagonistą ligandu KIM (np. przeciwciałem antagapistycżnym, które wiąże się z ligan”em KIM) albo przez kontaktowanie endogennego KIM z przeciwciałem anty-KIM albo inną cząsteczką wiążącą KIM, która zapobiega skutecznej ligacji KIM z ligan”em KIM.
Podobnie, odpowiedzi wyzwalane przez ligację KIM z komórką wykazującą ekspresję KIM, mogą być promowane albo hamowane przez związki egzogenne. No przykład, odpowiedź wyzwalana przez KIM w komórce wykazującej ekspresję KIM może być wytworzona przez kontaktowanie tej komórki z rozpuszczalnym Ugandem KIM albo pewnymi przeciwciałami aktywującymi anty-KIM. Ponadto, odpowiedzi komórki wykazującej ekspresję KIM, które w innej sytuacji byłyby wyzwalane przez interakcję z endogennym ligandem KIM można byłoby blokować przez kontaktowanie komórki wykazującej ekspresje KIM z antagonistą KIM (np. przeciwciałem blokującym, które wiąże się z KIM w sposób, który zapobiega skutecznemu, wytwarzającemu sygnał związaniu KIM) albo przez kontaktowanie endogennego ligandu KIM z przeciwciałem aptyligand KIM albo inną cząsteczką wiążącą ligand KIM, która zapobiega skutecznej ligacji i KIM z ligandem KIM.
To, które z interwencji opisanych powyżej są użyteczne dla poszczególnych zastosowań terapeutycznych, zależy od odpowiedniego mechanizmu etiologicznego albo procesu patologicznego, który ma być zahamowany, albo medycznie pożądanego procesu, który ma być ułatwiany, jak to jest oczywiste dla osób biegłych w dziedzinie medycyny. No przykład, tam gdzie wicżapie KIM powoduje pożądany wzrost komórek, utrzymywanie zróżnicowanego fenotypu, odporność na apontożę, wywoływaną przez różne uszkodzenia, albo inne medycznie korzystne odpowiedzi, zastosować można jedną z wyżej opisanych interwencji, które ułatwiają odpowiedź wyzwalaną przez związanie. Alternatywnie, jedna z interwencji hamujących może być użyteczna tam, gdzie wiązanie KIM wywołuje nienożądope konsekwencje, takie jak wzrost nowotworowy, szkodliwa utrata funkcji komórkowej, podatność na onoptożę, albo ułatwienie zjawisk zapalnych.
Poniżej przedstawiono przykłady opisanych uprzednio metod terapeutycznych. Jednym z zastosowań terapeutycznych związków spokrewnionych z KIM jest leczenie chorego z chorobą nerek, ułatwianie wzrostu nowej tkanki u pacjenta, albo ułatwianie przeżycia uszkodzonej tkanki u pacjento, i obejmuje ono etap podawania pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości białka KIM, albo kompozycji farmaceutycznej, która zawiera takie białko. Białkiem stosowanym w tych metodach może być fragment białka KIM o pełnej długości, rozpuszczalne białko ligan” KIM albo fragment fuzyjny, albo ogonista KIM. Metody te można również praktykować przez podanie choremu terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała, albo kompozycji farmaceutycznej, która zawiera agonistę przeciwciała. Białko KIM można podać równocześnie z terapeutycznie skuteczną ilością drugiego związku, który wywiera medycznie pożądany efekt wspomagający. Choć ”o interesujących tkanek ”la tych meto” może należeć dowolna tkanka, do korzystnych tkanek należą tkanka nerkowa, wątroby, nerwowa, sercowa, żołądka, jelita cienkiego, rdzenia kręgowego albo płuca. Szczególne schorzenia nerek, które mogą być z pozytywnym skutkiem leczone przy pomocy związków według wynalazku, obejmują ostrą niewydolność nerek, ostre zapalenie nerek, przewlekłą niewydolność nerek, zespół nerczycowy, defekty kanalików nerkowych, przeszczepy nerek, uszkodzenie toksyczne, uszkodzenie z niedotlenienia oraz uraz.
Do defektów kanalików nerkowych należą te o naturze dziedzicznej albo nabytej, takie jak wielatorbielawate zwyrodnienie nerek, torbielowatość rdzenia nerek i rdzeniowa nerka gąbczasta. Lista ta nie jest ograniczona i może obejmować wiele innych chorób nerek (patrz np., Harrisan's Principles of Internal Medicipei wy”. 13, 1994, które zawarte jest tu przez odniesienie). Obiektami sposobu mogą być ludzie.
Interwencja terapeutyczna służąca zahamowaniu wzrostu niepożądanej tkanki wykazującej ekspresję ligandu KIM u chorych obejmuje etap podawania choremu terapeutycznie skutecznej ilości antagonisty KIM (np. przeciwciała antaganistyczpego, które wiąże się z ligandem KIM) albo przez podanie skutecznej farmaceutycznie ilości przeciwciała anty-KIM albo innej cząsteczki wiążącej KIM, która blokuje wiązanie KIM z tkanką wykazującą ekspresję ligandu KIM. W interesującym z tego punktu wi”zepia wykonaniu, antagonista KIM albo
188 826 przeciwciało anty-KIM mogą być zastosowane terapeutycznie w celu zahamowania albo zablokowania wzrostu nowotworów, których wzrost zależy od białka KIM.
Możliwe jest również uśmiercanie komórek nowotworowych wykazujących ekspresję ligandu KIM, albo hamowanie ich wzrostu, przez kontaktowanie tych komórek z białkiem fuzyjnym KIM i toksyny albo radionuklidu, albo przeciwciałem anty-ligand KIM skoniugowanym z toksyną albo radionuklidem. Komórka może być w organizmie chorego, a białko albo sprzężone przeciwciało podaje się pacjentowi.
Metoda nacelowywania toksyny albo radionuklidu na komórkę wykazującą ekspresję KIM obejmuje kontaktowanie komórki z białkiem fuzyjnym, zawierającym ligand KIM oraz toksynę albo radionuklid, albo z przeciwciałem anty-KIM skoniugowanym z toksyną albo radionuklidem. Możliwe jest również zatrzymywanie wzrostu komórki nowotworowej, która wykazuje ekspresję KIM, przez kontaktowanie komórki z białkiem fuzyjnym ligandu KIM i toksyny albo radionuklidu albo z przeciwciałem anty-KIM sprzężonym z toksyną albo radionuklidem; komórka może być w organizmie chorego, a białko podaje się choremu.
Stosowany tu termin „chory” oznacza dowolnego ssaka, któremu można podać KIM. Osobniki szczególnie nadające się do leczenia obejmują ludzi, jak również inne niż ludzie naczelne, owce, konie, bydło, kozy, świnie, psy, koty, króliki, świnki morskie, chomiki, gerbile, szczury i myszy, jak również narządy, nowotwory i komórki pochodzące albo pobrane od tych gospodarzy. Zastosowanie związków według wynalazku w terapii genowej.
Geny KIM, w tym również kwasy nukleinowe według wynalazku, wprowadza się do uszkodzonej tkanki, albo do tkanki, gdzie pożądany jest wzrost stymulowany. Taka terapia genowa stymuluje produkcję białka KIM przez transfekowane komórki, ułatwiając wzrost komórek i/lub przeżycie komórek, które wykazują ekspresję białka KIM.
W szczególnym wykonaniu terapii genowej, gen kodujący białko KIM może być wprowadzony do docelowej tkanki nerkowej. Białko KIM ulegałoby stabilnej ekspresji i stymulowało wzrost tkanek, podział albo różnicowanie, albo mogłoby potencjalizować przeżycie komórek. Ponadto, gen KIM może być wprowadzany do komórki docelowej przy zastosowaniu różnych dobrze znanych sposobów, które wykorzystują strategie oparte na wirusach albo bezwirusowe.
Do metod bezwirusowych należą elektroporacja, fuzja błonowa z liposomami, bombardowanie o wysokiej prędkości mikropociskami okrytymi DNA, inkubacja z precypitatem fosforanowo-wapniowo-DNA, transfekcja za pośrednictwem DEAE-dekstranu oraz bezpośrednia mikroiniekcja do pojedynczych komórek. Na przykład, gen KIM może być wprowadzony do komórki przez koprecypitację z fosforanem wapnia (Pillicer i wsp., Science, 209:1414-1422 (1980); mechaniczną mikroiniekcję i/lub akcelerację cząstek (Anderson i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77:5399-5403 (1980); oparty o liposomy transfer DNA (np. transfekcję za pośrednictwem LIPOFECTIN - Fefgner i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 471-477, 1987; Gao i Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: 280-285, 1991; transfekcję za pośrednictwem DEAE Dekstranu; elektroporację (opis patentowy USA nr 4,956,288); albo metody oparte na polilizynie, w których DNA jest skoniugowany w celu dostarczenia DNA preferencyjnie do hepatocytów wątroby (Wolff i wsp., Science, 247: 465-468, 1990; Curiel i wsp., Human Gene Therapy 3:147-154, 1992).
Komórki docelowe mogą być transfekowane genami przez bezpośredni transfer genu. Patrz np. Wolff i wsp., „Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In Vvo, Science, 247: 1465-68, 1990. W wielu przypadkach, pożądana będzie transfekcja za pośrednictwem wektora. Każdy ze znanych sposobów służący do umieszczania sekwencji polinukleotydowych w wektorze może być zastosowany (patrz na przykład, Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989; oraz Ausbel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992, z których obydwa są tu włączone przez odniesienie). Aktywacja promotora może być swoista tkankowo albo wzbudzana przez produkt metaboliczny albo podawaną substancję. Do takich promotorów/wzmacniaczy należą, ale nie wyłącznie, natywny promotor ligandu c-ret, natychmiastowy/wczesny promotor/wzmacniacz cytomegalowirusa (Karasuyama i wsp., J. Exp. med., 169: 13, 1989); promotor ludzkiej beta-aktyny (Gunning i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 84:4831, 1987; wzbudzany glukokortykoidami promotor obecny w długiej terminalnej sekwencji powtarzał18
188 826 nej mysiego, wirusa nowotworu sutka (MMTV LTR) (Klessig i wsp., Mol. Cell. Biol., 4:1345, 1984); długie powtarzalne sekwencje terminalne wirusa mysiej białaczki Moloneya (MuLV LTR)(Weiss i wsp., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY 1985); promotor wczesnego regionu SV40 (Bemoist i Chambón, Nature, 290:304, 1981); promotor wirusa mięsaka Rousa (RSV) (Yamamoto i wsp., Cell., 22:787, 1980); promotor kinazy tymidynowej wirusa Hermes simplex (HSV) (Wagner i wsp., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 78: 1441, 1981); promotor adenowirusowy (Yamada i wsp., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 82:3527, 1985).
Geny KIM można również wprowadzać za pomocą swoistych wektorów wirusowych do zastosowania w układach przenoszenia genów, które są obecnie dobrze ustalone. Patrz na przykład: Madzak i wsp., J. Gen. Virol., 73:1533-36, 1992) (papovavirus SV40); Berner i wsp., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-61, 1992 (adenowirus); Hoffman i wsp., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 92:10099-10103, 1995 (bakulowirus); Moss i wsp., Curr.T op. Microbiol. Immunol., 158:25-38,1992 (wirus krowianki); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:97-123, 1992 (wirus związany z adenowirusem); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-93, 1992 (wirus herpes simplex (HSV) i wirus Epsteina-Barr (EBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1-24, 1992 (retrowirus); Brandyopadhay i wsp., Mol. Cell. Biol., 4:749-754, 1984 (retrowirus); Miller i wsp., Nature 357:455-450, 1992 (retrowirus); Andersen, Science, 256:808-813, 1992 (retrowirus), Current Protocols In Molecular Biology: Rozdziały 9.10-9.14 (Ausbel i wsp., red.), Greene Publishing Associates, 1989, z których wszystkie są włączone w niniejszym przez odniesienie.
Korzystnymi wektorami są wirusy DNA, do których należą adenowirusy (korzystnie wektory oparte na Ad-2 albo Ad-5), bakulowirus, wirusy herpes (korzystnie wektor oparty na wirusie herpes simplex) oraz parwowirusy (korzystnie wektory oparte na parwowirusach „defektywnych” albo nieautonomicznych, bardziej korzystnie wektory oparte na wirusie związanym z adenowirusem, najkorzystniej wektory oparte na AAV-2). Patrz np., Ali i wsp., Gene Thi^e^npy 1:367-384, 1994; opis patentowy USA Nr 4,797,368 i 5,399,346 i dyskusja poniżej.
Wybór szczególnego układu wektorowego do przenoszenia, na przykład sekwencji KIM będzie zależeć od wielu czynników. Jednym z ważnych czynników jest natura docelowej populacji komórkowej. Choć wektory retrowirusowe były intensywnie badane i stosowane w wielu zastosowaniach terapii genowej, nie nadają się one na ogół do zakażania komórek, które się nie dzielą, ale mogą być użyteczne w terapii nowotworów złośliwych, gdyż tylko one integrują, się i przeprowadzają ekspresję swych genów w komórkach replikujących. Są one użyteczne w podejściach ex vivo i są atrakcyjne pod tym względem z uwagi na ich stabilną integrację z genomem komórki docelowej.
Adenowirusy są eukariotycznymi wirusami DNA, które mogą być modyfikowane w celu wydajnego dostarczenia terapeutycznego albo reporterowego transgenu do wielu typów komórek. Ogólnie adenowirusy typów 2 i 5 (odpowiednio, Ad2 i Ad5), które powodują choroby dróg oddechowych u ludzi, podlegają obecnie opracowaniu dla terapii dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) i mukowiscydozy (CF). Tak Ad2 jak i Ad5 należą do podklasy adenowirusów, które nie są związane z ludzkimi nowotworami złośliwymi. Wektory adenowirusowe są zdolne do zapewnienia niezwykle wysokich poziomów dostarczania transgenu do praktycznie wszystkich typów komórek, niezależnie od ich stadium mitotycznego. Wysokie miana (1013 jednostek tworzenia łysinek/ml) wirusa rekombinowanego można łatwo wytworzyć w komórkach 293 (transformowana adenowirusem, komplementarna ludzka linia komórkowa z nerki płodowej: ATCC CRL1573) i przechowywać w stanie zamrożenia przez długie okresy bez znacznych strat. Wydajność tego układu w dostarczaniu terapeutycznego transgenu in vivo, który uzupełnia brak równowagi genetycznej wykazano w zwierzęcych modelach różnych chorób. Patrz Watanabe, Atherosclerosis, 36:261-268, 1986; Tanzawa i wsp., FEBS Letters 118(1):81-84, 1980; Golasten i wsp., New Engl. J. Med. 309:288-296, 1983; Ishibashi i wsp., J. Clin. Inbvest. 92:883-893, 1993; oraz Ishibashi i wsp., J. Clin. Invest. 93: 18891893, 1994. z których wszystkie włączono w niniejszym przez odniesienie. Rzeczywiście, rekombinowany. defektywny, replikacyjnie adenowirus, kodujący cDNA dla regulatora przezbłonowego mukowiscydozy (CFTR) dopuszczono do użytku w przynajmniej dwóch badaniach klinicznych mukowiscydozy u ludzi. Patrz np., Wilson, Nature 365:691-692, 1993. Dal188 826 szym wsparciem dla bezpieczeństwa adenowirusów rekombinowanych dla terapii genowej jest duże doświadczenie żywych szczepionek adenowirusowych w populacjach ludzkich.
Rekombinowąne, defektywne replikacyjnie adenowirusy pierwszej generacji, które opracowano dla terapii genowej DMD i innych dziedzicznych chorób zawierają delecje całości regionu Ela i części Elb. Ten replikacyjnie defektywny wirus hoduje się w komórkach 293, zawierających funkcjonalny gen adenowirusa Ela, który dostarcza współdziałającego białka Ela. Wirusy z delecćąEl zdolne są do replikacji i produkcji zakaźnych wirusów w komórkach 293, które dostarczają produktów genów regionu Ela i Elb w konfiguracji trans. Otrzymany wirus jest zdolny do zakażania wielu typów komórek i może doprowadzać do ekspresji wprowadzonego genu (przy założeniu iż przenosi on swój własny promotor), ale nie może replikować się w komórce, która nie przenosi DNA regionu El, chyba, że komórka zostanie zakażona z bardzo wysoką wielokrotnością infekcji. Adenowirusy mają tę zaletę, iż mają szeroki zakres gospodarzy, mogą zakażać spoczynkowe albo terminalnie zróżnicowane komórki, takie jak neurony i wydają się zasadniczo nieonkogenne. Adenowirusy nie wydają się integrować z genomem gospodarza. Ponieważ istnieją pozachromosomalnie, ryzyko mutagenezy przez insercję jest znacznie zmniejszone. Ali i wsp., supra, na str. 373. Rekombinowąne adenowirusy (rAdV) wytwarzają bardzo wysokie miana, cząstki wirusowe są w miarę stabilne, poziomy ekspresji wysokie i może być zakażony szeroki zakres komórek. Ich naturalnymi komórkami gospodarzami jest nabłonek dróg oddechowych, tak że są one użyteczne dla terapii raka płuc.
Transfer za pośrednictwem bakulowirusa ma kilka zalet. Transfer genów za pomocą bakulowirusa może zachodzić w komórkach replikujących i niereplikujących i może zachodzić w komórkach nerek, jak również w hepatocytach, komórkach nerwowych, śledziony, skóry i mięśnia. Bakulowirus nie ulega replikacji i nie jest patogenny dla komórek ssaków. Ludzie nie posiadają wcześniej istniejących przeciwciał na rekombinowanego bakulowirusa, które mogłyby zablokować infekcje. Dodatkowo, bakulowirus zdolny jest do przyjmowania i przenoszenia bardzo dużych insertów DNA.
Wirusy związane z adenowirusami (AAV) również stosowano jako wektory do somatycznej terapii genowej. AAV jest małym, jednoniciowym (ss) wirusem DNA o prostej organizacji genomu (4-7 kb), co czyni go idealnym substratem dla inżynierii genetycznej. Dwie otwarte ramki odczytu kodują serię polipeptydów rep i cap. Polipeptydy rep (rep78, rep68, rep62 i rep 40) zaangażowane są w replikację, odzyskiwanie i integrację genomu AAV. Białka cap (VP 1, VP2 i VP3) tworzą kapsyd wirionu. Otwarte ramki odczytu rep i cap przy końcach 5' i 3' otaczaaą odwrócone sekwencje powtórzeń terminalnych o długości 145 bp (ITR), z których pierwsze 125 bp zdolne jest do tworzenia struktur typu dupleks w kształcie Y lub T. Dla opracowywania wektorów AAV ważne jest, iż całe domeny rep i cap można wyciąć i zastąpić terapeutycznym albo reporterowym transgenem. Patrz B.J. Carter, w Handbook of Paryoyiruses, red., P. Tijsser. CRC Press, str. 155-168 (1990). Wykazano, iż sekwencje ITR stanowią minimalną sekwencję wymaganą dla replikacji, odzyskiwania, pakowania i integracji genomu AAV.
Wirusy związane z adenowirusami (AAV) mają znaczny potencjał w terapii genowej. Cząstki wirusowe są bardzo stabilne, a rekombinowąne AAV (rAAV) mają charakterystykę „lekopodobną”, polegającą na tym, że rAAV można oczyścić przez peletowanie albo przez wirowanie w gradiencie CsCl. Są one stabilne cieplnie i mogą być liofilizowane na proszek i ponownie uwadniane do pełnej aktywności. Ich DNA stabilnie integruje się z chromosomami tak, że ekspresja jest długoterminowa. Zakres ich gospodarzy jest szeroki i AAV nie powoduje żadnej znanej choroby tak, że rekombinowąne wirusy nie są toksyczne.
Po wprowadzeniu do komórki docelowej, stanowiące przedmiot zainteresowania sekwencje można zidentyfikować metodami konwencjonalnymi, takimi jak hybrydyzacja kwasów nukleinowych przy użyciu sond, zawierających sekwencje, które są homologiczne/ komplementarne do wprowadzonych sekwencji genów wektora. W innym podejściu, sekwencja(e) można zidentyfikować przez obecność albo brak funkcji genu „znacznikowego” (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki i temu podobne), spowodowany przez wprowadzenie wektora ekspresji do komórki docelowej.
188 826
Skład i podawanie
Opisane powyżej związki formułuje się według standardowej praktyki, takiej jak przygotowanie w podłożu nośnikowym. Termin „nośnik dopuszczalny farmaceutycznie” oznacza jeden bądź wiele składników organicznych lub nieorganicznych, naturalnych albo syntetycznych, z którymi łączy się zmutowany protoonkogen albo zmutowaną onkoproteinę w ceiu ułatwienia jej podawania. Do nadających się nośników należy jałowa sól fizjologiczna, choć inne wodne i bezwodne izotoniczne jałowe roztwory i jałowe zawiesiny znane jako farmaceutycznie dopuszczalne znane są osobom przeciętnie biegłym w stanie techniki. Pod tym względem, termin „nośnik” obejmuje liposomy i białko HIV-1 tat (patrz Chen i wsp., Anal. Biochem. 227:168-175, 1995) jak również dowolne wektory plazmidowe i wirusowe.
Dowolny z peptydów według wynalazku lub wyżej opisanych białek może być stosowany w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Odpowiednie kwasy i zasady, które zdolne są do tworzenia soli z polipeptydami znane są dobrze specjalistom i obejmują nieorganiczne i organiczne kwasy i zasady.
Związek według wynalazku podawany jest choremu w ilości terapeutycznie skutecznej, co oznacza ilość związku, która wytwarza medycznie pożądany rezultat albo wywiera wpływ na leczoną chorobę. Skuteczna ilość związku według wynalazku zdolna jest do polepszenia albo opóźnienia postępu stanu chorobowego, zwyrodnieniowego albo uszkodzenia. Skuteczna ilość może być określona indywidualnie i będzie oparta, częściowo na rozważeniu fizycznych właściwości chorego, leczonych objawów i poszukiwanych wyników. Skuteczna ilość może być określona przez osobę przeciętnie biegłą w stanie techniki przy zastosowaniu takich czynników i przy zastosowaniu nie więcej niż rutynowego doświadczenia.
Układ dostarczania liposomalnego dla związków według niniejszego wynalazku może być dowolnym z różnych pęcherzyków jednowarstwowych, pęcherzyków wielowarstwowych, albo stabilnych pęcherzyków plurilamelamych i może być przygotowany i podany według sposobów znanych specjalistom, na przykład według informacji z opisów patentowych USA Nr 5169637, 4762915, 5000958 albo 5185154. Dodatkowo, może być pożądane przeprowadzenie ekspresji nowych polipeptydów według wynalazku, jak również wybranych innych polipeptydów, jako lipoprotein, w ceiu wzmocnienia ich wiązania się z liposomami. Jako przykład, leczenie ostrej niewydolności nerek u ludzi zamkniętym w liposomach białkiem KIM może być przeprowadzone in vivo przez wprowadzenie białka KIM do komórek, potrzebujących takiego leczenia przy użyciu liposomów. Liposomy można podawać przez cewnik do tętnicy nerkowej. Rekombinowane białko KIM oczyszcza się, na przykład z komórek CHO przez chromatografię immunopowinowactwa albo inną dogodną metodą, następnie miesza się z liposomami i wbudowuje w nie z wysoką wydajnością. Zamknięte białko może być testowane in vitro jeśli chodzi o wpływ na stymulowanie wzrostu komórek.
Związki według wynalazku można podawać w dowolny sposób, który jest medycznie dopuszczalny. Może to obejmować wstrzyknięcia, drogami pozajelitowymi, takimi jak dożylna, donaczyniowa, dotętnicza, podskórna, domięśniowa, doguzowa, dootrzewnowa, dokomorowa, do przestrzeni nadtwardówkowej, albo inne, taki jak doustna, donosowa, dospojówkowa, doodbytnicza albo miejscowa. Zakresem wynalazku jest również objęte podawanie z uwalnianiem podtrzymywanym, metodami takimi jak wstrzyknięcia depot albo rozkładające się implanty. Dostarczanie umiejscowione rozważa się w szczególności, metodami takimi jak dostarczanie przez cewnik do jednej bądź wielu tętnic, takich jak tętnica nerkowa albo naczynie zaopatrujące umiejscowiony guz.
Aczkolwiek powyższy wynalazek opisano szczegółowo w ilustrujących go przykładach w ceiu lepszego zrozumienia, dla specjalisty w tej dziedzinie oczywiste będzie, iż można wprowadzać pewne zmiany i modyfikacje, nie wykraczając poza zakres wynalazku, który ograniczony jest jedynie załączonymi zastrzeżeniami.
188 826
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Michele Sanicola-Nadel
Jospeh V. Bonventre Catherine A. Heasion Takaharu Ichimura Henry Wei
Richard L. Cate (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: MODULATORY REGENERACJI TKANEK (iii) LICZBA SEKWENCJI: 7 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:
(A) ADRESAT: Biogen, Inc.
(B) ULICA: 14 Cambridge Center (C) MIASTO: Cambridge (D) STAN: MA (E) PAŃSTWO: USA (F) KOD POCZTOWY: 02142 (v) POSTAĆ DO ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP MEDIUM: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Wersja #1.30 (vi) DANE BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA: 23-MAJA-1997 (C) KLASYFIKACJA (vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/018,228 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 24-MAJA-1996 (viii) INFORMACJA O RZECZNIKU/AGENCIE:
(A) NAZWISKO: Levine, Leslie M.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 35,245 (C) NUMER REFERENCYJNY/DOKUMENTACYJNY: AO10 PCT CIP (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) TELEFON: (617) 679-2810 (B) TELEFAX: (617) 679-2838 (2) INFORMACJA O SEK NR ID: 1:
(i) CHARAKKTRRSTYKA SEKWWNCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2566 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna
188 826 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 615..1535 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: χ;
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT 6 0
CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 12 0
CTCTACGGAT CTAAGGTTTG GATCTGTACC CAGTGCTTTT TTAGGTGTCT TTAGACATTT 180
CTCAGGAAGA TGTAGTCTCT GTCACCATGT GTGGCTGAAT TCTAGCTCAG TCCATCTTAT 24 0
TGTGTTTAAG GTAGTTGAAG TTTAGGAACC AACCAGTATG TCTCTGAGCA GAAGAGTACA 300
GTGTCCATCT TGAGGACAAG CTCATCTTTA CCATTAGAGG GCTGGCCTTG GCTTAGATTC 360
TACCGAGAAC ATACTCTCTA ATGGCTGCCC TCAGTTTTCT CTGTTTGCTG TCTTATTTGT 42 0
GTCATGGCCA GAAGTCATAT GGATGGCTCT ATGTGAGCAA GGACCCAGAT AGAAGAGTGT 4 80
ATTTGGGGGA ACAGGTTGCC CTAACAGAGA GTCCTGTGGG ATTCATGCAG TCAGGATGAA 54 0
GACCTGATCA GACAGAGTGT GCTGAGTGCC ACGGCTAACC AGAGTGACTT GTCACTGTCC 600
TTCAGGTCAA CACC ATG GTT CAA CTT Leu CAA GTC TTC ATT TCA GGC CTC Leu CTG Leu 650
Met 1 Val Gin Gin 5 Val Phe Ile Ser Gly 10
CTG CTT CTT CCA GGC TCT GTA GAT TCT TAT GAA GTA GTG AAG GGG GTG 698
Leu Leu Leu Pro Gly Ser Val Asp Ser Tyr Glu Val Val Lys Gly Val
15 20 25
GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACT TAC TCA ACA CGT GGA GGA 746
Val Gly His Pro Val Thr Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Arg Gly Gly
30 35 40
ATC ACA ACG ACA TGT TGG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT TCT AGT TGT 794
Ile Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr Ser Ser Cys
45 50 55 60
CAA AAT ATA CTT ATT TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC ACC TAT CGG AGC 842
Gin Asn Ile Leu Ile Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Val Thr Tyr Arg Ser
65 70 75
AGC GGT CGA TAC AAC ATA AAG GGG CGT ATT TCA GAA GGA GAC GTA TCC 890
Ser Gly Arg Tyr Asn Ile Lys Gly Arg Ile Ser Glu Gly Asp Val Ser
80 85 90
188 826
TTG ACA ATA GAG Glu AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG TAT TGT TGC 938
Leu Thr Ile 95 Asn Ser Val Asp 100 Ser Asp Ser Gly Leu 105 Tyr Cys Cys
CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG ACC TTT TCA 988
Arg Val 110 Glu lie Pro Gly Trp 115 Phe Asn Asp Gln Lys 120 Met Thr Phe Ser
TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA AGA CCC ACA 1034
Leu 125 Glu Val Lys Pro Glu 130 Ile Pro Thr Ser Pro 135 Pro Thr Arg Pro Thr 140
ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA ACA AGA TCC 1082
Thr Thr Arg Pro Thr 145 Thr Thr Arg Pro Thr 150 Thr lie Ser Thr Arg 155 Ser
ACA CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT CCA ACA CCA 1130
Thr His Val Pro 160 Thr Ser Thr Arg Val 185 Ser Thr Ser Thr Pro 170 Thr Pro
GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC •nCT ACA TTT TAT GCC CAT 1178
Glu Gin Thr 175 Gln Thr His Lys Pro 180 Glu lie Thr Thr Phe 185 Tyr Ala His
GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT CCT GCA GAC 1228
Glu Thr 190 Thr Ala Glu val Thr 195 Glu Thr Pro Ser Tyr 200 Thr Pro Ala Asp
TGG AAT GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT AAT CAC ACT 1274
Trp 205 Asn Gly Thr Val Thr 210 Ser Ser Glu Glu Ala 215 Trp Asn Asn His Thr 220
GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT AAG GGC TTC 1322
Val Arg lie Pro Leu 225 Arg Lys Pro Gln Arg 230 Asn Pro Thr Lys Gly 235 Phe
TAT GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTG CTG CTG!. CTG CTG CTT GCG AGC 1370
Tyr Val Gly Met 240 Ser Val Ala Ala Leu 245 Leu Leu Leu Leu Leu 250 Ala Ser
ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG ATG GGC TCT 1418
Thr Val Val 255 Val Thr Arg Tyr lie 280 lie lie Arg Lys Lys 285 Met Gly Ser
CTG AGC TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT TTG CAG AAC 14β8
Leu Ser 270 Phe Val Ala Phe His 275 Val Ser Lys Ser Arg 280 Ala Leu Gln Asn
GCA GCG ATT GTG CAT CCC CGA GCT GAA GAC AAC ATC TAC ATT ATT GAA 1514
Ala 285 Ala lie Val His Pro 290 Arg Ala Glu Asp Asn 295 lie Tyr lie lie Glu 300
1565
GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG TGGGGCCTTC Asp Arg Ser Arg Gly Ala Glu
305
188 826
TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTOATT TCACAGAGTA AAATACCCAT TCCAGCTCCT 1625
GGGAOATTTT gtgttttggt TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT CTACCCTGTA 1685
TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA attcttgtat CAGCAACACC TCAGTGTCTC 1745
CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA acattttaga AGTTTGTGTT TCCTTTTGTC 1805
TTGGTAATAC aagatttta TCTTGTTTAT TAAAACCATT AATGAOAGGG 1865
GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT TCATGATTGT 1925
GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG GGCAAAATCA 1985
TGGGAGCATG GAGGTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG TCTAATGCCA 2045
CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGOAAATA TGATCATTTA TTATGCAGTT 2105
GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAGGA GGAGAG3TTA CCATGGTGAG TGGACCAGGC 2165
ACACATCAOG GGAAGAAAAC AATOGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC CATTTCCACT 2225
CCACTTCTGT CTTGATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG AATTAGGTGC 2285
AOGGAOOAGA CGTGCAGAAA COAAAGAGGA AAGAAAGGAG ASAGAGCAGO ACACAGGCTT 2345
TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC gggtttcctt 2405
CAGACTTCTA AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT TTATTTTTAA aattatttca 2465
GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA TATTTTGTTT 2525
GCTAAGAAGT AAAAAAAAAA AAAAAAAOTC OACGCGGCCG C 2566
(2) INFORMACJA O SEK NR ID: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2084 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: .COS (B) POŁOŻENIE: 145..1065 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 2:
GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT
188 826
CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 120
CTCTACGGAT CTAAGGTCAA CACC ATG GTT CAA CTT CAA GTC TTC ATT TCA 171
Met Val Gin Leu Gin Val Phe Ile Ser
S
GGC Gly .10 CTC CTG CTG Leu CTT CTT CCA GGC TCT GTA GAT TCT TAT GAA GTA GTG Val 25 219
Leu Leu Leu Leu Pro 15 Gly Ser Val Asp 20 Ser Tyr Glu Val
AAG GGG GTG GTG GGT CAC CCT GTC ACA ATT CCA TGT ACT TAC TCA ACA 267
Lys Gly Val Val Gly His Pro Val Thr Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Thr
30 35 40
CGT GGA GGA ATC ACA ACG ACA TGT TQG GGC CGG GGG CAA TGC CCA TAT 315
Arg Gly Gly Ile Thr Thr Thr Cys Trp Gly Arg Gly Gin Cys Pro Tyr
45 50 55
TCT AGT TGT CAA AAT ATA CTT ATT TGG ACC AAT GGA TAC CAA GTC ACC 363
Ser Ser Cys Gin Asn Ile Leu Ile Trp Thr Asn Gly Tyr Gin Val Thr
60 65 70
TAT CGG AGC AGC GGT CGA TAC AAC ATA AAG GGG CGT ATT TCA GAA GGA 411
Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr Asn Ile Lys Gly Arg Ile Ser Glu Gly
75 80 85
GAC GTA TCC TTG ACA ATA GAG AAC TCT GTT GAT AGT GAT AGT GGT CTG 459
Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser Gly Leu
90 95 100 105
TAT TGT TGC CGA GTG GAG ATT CCT GGA TGG TTC AAC GAT CAG AAA ATG 507
Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gin Lys Met
110 115 120
ACC TTT TCA TTG GAA GTT AAA CCA GAA ATT CCC ACA AGT CCT CCA ACA 555
Thr Phe Ser Leu Glu Val Lys Pro Glu Ile Pro Thr Ser Pro Pro Thr
125 130 135
AGA CCC ACA ACT ACA AGA CCC ACA ACC ACA AGG CCC ACA ACT ATT TCA 603
Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Ser
140 145 150
ACA AGA TCC ACA CAT GTA CCA ACA TCA ACC AGA GTC TCC ACC TCT ACT 651
Thr Arg Ser Thr His Val Pro Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr
155 160 165
CCA ACA CCA GAA CAA ACA CAG ACT CAC AAA CCA GAA ATC ACT ACA TTT 699
Pro Thr Pro Glu Gin Thr Gin Thr His Lys Pro Glu Ile Thr Thr Phe
170 175 180 185
TAT GCC CAT GAG ACA ACT GCT GAG GTG ACA GAA ACT CCA TCA TAT ACT 747
Tyr Ala His Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr
190 195 200
188 826
CCT GCA GAC TGG AAT GGC ACT GTG ACA TCC TCA GAG GAG GCC TGG AAT 795
Pro Ala Asp Trp Asn Gly Thr Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn
205 210 215
AAT CAC ACT GTA AGA ATC CCT TTG AGG AAG CCG CAG AGA AAC CCG ACT 843 Asn His Thr Val Arg lle Pro Leu Arg Lys Pro Gln Arg Asn Pro Thr
220 225 230
AAG GGC TTC TAT GTT GGC ATG TCC GTT GCA GCC CTG CTG CTG CTG CTG 891
Lys Gly Phe Tyr Val Gly Met Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu
235 240 245
CTT GCG AGC ACC GTG GTT GTC ACC AGG TAC ATC ATT ATA AGA AAG AAG 939
Leu Ala Ser Thr Val Val Val Thr Arg Tyr Ile Ile Ile Arg Lys Lys
250 255 260 265
ATG GGC TCT CTG AGC TTT GTT GCC TTC CAT GTC TCT AAG AGT AGA GCT 9B7
Met Gly Ser Leu Ser Phe Val Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala
270 275 280
TTG CAG AAC GCA GCG ATT GTG CAT CCC CG» GCT GAA GAC AAC ATC TAC 1035
Leu Gln Asn Ala Ala lle Val His Pro Arg Ala Glu Asp Asn lle Tyr
285 290 295
ATT ATT GAA GAT AGA TCT CGA GGT GCA GAA TGAGTCCCAG AGGCCTTCTG 1085 lle Ile Glu Asp Arg Ser Arg Gly Ala Glu
300 305
TGGGGCCTTC TGCCTGGGAT TACAGAGATC GTGACTOATT TCACAGAGTA AAATACCCAT 1145
TCCAGCTCCT GGGAGATTTT GTGTTTTGGT TCTTCCAGCT GCAGTGGAGA GGGTAACCCT 1205
CTACCCTGTA TATGCAAAAC TCGAGGTTAA CATCATCCTA ATTCTTGTAT CAGCAACACC 1265
TCAGTGTCTC CACTCACTGC AGCGATTCTC TCAAATGTGA ACATTTTAGA AGTTTGTGTT 1325
TCCTTTTGTC CATGTAATCA TTGGTAATAC AAGiAATTTTA TCTTGTTTAT TAAAACCATT 1385
AATGAGAGGG GAATAGGAAT TAAAAGCTGG TGGGAAGGGC CTCCTGAATT TAGAAGCACT 1445
TCATGATTGT GTTTATCTCT TTTATTGTAA TTTGAAATGT TACTTCTATC CTTCCCAAGG 1505
GGCAAAATCA TGGGAGCATG GAWTTTTAA TTGCCCTCAT AGATAAGTAG AAGAAGAGAG 1565
TCTAATGCCA CCAATAGAGG TGGTTATGCT TTCTCACAGC TCTGGAAATA TGATCATTTA 1625
TTATGCAGTT GATCTTAGGA TGAGGATGGG TTTCTTAOGA GGAGAGGTTA CCATGGTGAG 1685
TGGACCAOGC ACACATCAGG GGAAGAAAAC AATGGATCAA GGGATTGAGT TCATTAGAGC 1745
CATTTCCACT CCACTTCTGT CTTOATGCTC AGTGTTCCTA AACTCACCCA CTGAGCTCTG 18 05
AATTAGGTGC AGGGAGGAGA CGTGCAGAAA CGAAAGAGGA AAGAAAGGAG AGAGAGCAGG 1865
ACACAGGCTT TCTGCTGAGA GAAGTCCTAT TGCAGGTGTG ACAGTGTTTG GGACTACCAC 1925
188 826
GGGTTTCCTT CAGACTTCTA AGTTTCTAAA TCACTATCAT GTGATCATAT TTATTTTTAA 1905
AATTATTTCA GAAAGACACC ACATTTTCAA TAATAAATCA GTTTGTCACA ATTAATAAAA 2045
TATTTTGTTT GCTAAGAAGT AAAAAGTCGA CGCGGCCGC 2084
(2) INFORMACJA O SEK NR ID: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 307 aminokwasów (B) TYP: kwas nukleinowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI:SEK NR ID: 3:
Met 1 Val Gln Leu Gln 5 Val Phe Ile
Gly Ser Val Asp 20 Ser Tyr Glu Val
Val Thr Ile 35 Pro Cys Thr Tyr Ser 40
Cys Trp 50 Gly Arg Gly Gln Cys 55 Pro
Ile 65 Trp Thr Asn Gly Tyr 70 Gln Val
Asn Ile Lys Gly Arg 85 Ile Ser Glu
Asn Ser Val Asp 100 Ser Asp Ser Gly
?ro Gly Trp 115 Phe Asn Asp Gln Lys 120
Pro Glu 130 Ile Pro Thr Ser Pro 135 Pro
Thr 145 Thr Thr Arg Pro Thr 150 Thr Ile
Thr Ser Thr Arg Val 165 Ser Thr Ser
Thr His Lys Pro 180 Glu Ile Thr Thr
Ser Gly 10 Leu Leu Leu Leu Leu 15 Pro
Val 25 Lys Gly Val Val Gly 30 His Pro
Thr Arg Gly Gly Ile 45 Thr Thr Thr
Tyr Ser Ser Cys 60 Gln A3n Ile Leu
Thr Tyr Arg 75 Ser Ser Gly Arg Tyr 80
Gly Asp 90 val Ser Leu Thr Ile 95 Glu
Leu 105 Tyr Cys Cys Arg val 110 Glu Ile
Met Thr Phe Ser Leu 125 Glu Val Lys
Thr Arg Pro Thr 140 Thr Thr Arg Pro
Ser Thr Arg 155 Ser Thr His Val Pro 160
Thr Pro 170 Thr Pro Olu Gln Thr 175 Gln
Phe 185 Tyr Ala His Glu Thr 190 Thr •Ala
188 826
Glu Val Thr 195 Glu Thr Pro Ser Tyr Thr Pto Ala Asp Trp Asn Gly Thr
200 205
Val Thr Ser Ser Glu Glu Ala Trp Asn Asn His Thr Val Arg Ile Pro
210 215 220
Leu Arg Lys Pro Gin Arg Asn Pro Thr Lys Gly Phe Tyr Val Gly Met
225 230 235 240
Ser Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Thr Val Val Val
245 2S0 255
Thr Arg Tyr Ile He Ile Arg Lys Lys Met Gly Ser Leu Ser Phe Val
260 265 270
Ala Phe His Val Ser Lys Ser Arg Ala Leu Gin Asn Ala Ala Ile Val
275 280 285
His Pro Arg Ala Glu Asp Asn Ile Tyr He Ile Glu Asp Arg Ser Arg
290 295 300
Gly Ala Glu
305
(2) INFORMACJA 0 SEK NR ID: 4 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2303 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 107..1822 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 4:
GCGOCCGCGT CGACTCGCAG GAGGCCGGCA CTCTGACTCC TGGTGGATGG GACTAGGGAG 60
TCAGAGTCAA GCCCTGACTG GCTGAGGGCG GGCGCTCOGA GTCAGC ATG GAA AGT US
Met Glu Ser
CTC TGC Leu Cys GGG GTC CTG OTA TTT CTG CTG CTG GCT GCA GOA CTG CCG CTC Leu 163
Gly Val Leu Val Phe 10 Leu Leu Leu Ala Ala 15 Gly Leu Pro
5
CAG GCG GCC AAG CGG TTC CGT GAT GTG CTG GGC CAT GAG CAG TAT CCG 211
Gin Ala Ala Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Gly His Glu Gin Tyr Pro
25 30 35
188 826
GAT CAC ATG AGG GAG AAC AAC CAA TTA CGT GGC TGG TCT TCA GAT GAA Ser Asp Glu 50 259
Asp His Met Arg Glu Asn Asn 40 Gln Leu Arg 45 Gly Trp Ser
AAT GAA TGG GAT GAA CAG CTG TAT CCA GTG TGG AGG AGG GGA GAG GGC 307
Asn Glu Trp Asp Glu Gln Leu Tyr Pro Val Trp Arg Arg Gly Glu Gly
55 60 65
AGA TGG AAG GAC TCC TGG GAA GGA GGC CGT GTG CAG GCA GCC CTA ACC 355
Arg Trp Lys Asp Ser Trp Glu Gly Gly Arg Val Gln Ala Ala Leu Thr
70 75 80
AGT GAT TCA CCG GCC TTG GTG GGT TCC AAT ATC ACC TTC GTA GTG AAC 403
Ser Asp Ser Pro Ala Leu Val Gly Ser Asn Ile Thr Phe Val Val Asn
85 90 95
CTG GTG TTC CCC AGA TGC CAG AAG GAA GAT GCC AAC GGC AAT ATC GTC 451
Leu Val Phe Pro Arg Cys Gln Lys Glu Asp Ala Asn Gly Asn Ile Val
100 105 110 115
TAT GAG AGG AAC TGC AGA AGT GAT TTG GAG CTG GCT TCT GAC CCG TAT 499
Tyr Glu Arg Asn Cys Arg Ser Asp Leu Glu Leu Ala Ser Asp Pro Tyr
120 125 130
GTC TAC AAC TGG ACC ACA □GG GCA GAC GAT GAG GAC TGG GAA GAC AGC 547
Val Tyr Asn Trp Thr Thr Gly Ala Asp Asp Glu Asp Trp Glu Asp Ser
135 140 145
ACC AGC CAA GGC CAG CAC CTC AGG TTC CCC GAC GGG AAG CCC TTC CCT 595
Thr Ser Gln Gly Gln His Leu Arg Phe Pro Asp Gly Lys Pro Phe Pro
150 155 160
CGC CCC CAC GGA CGG AAG AAA TGG AAC TTC GTC TAC GTC TTC CAC ACA 643
Arg Pro Hi3 Gly Arg Lys Lys Trp Asn Phe Val Tyr Val Phe His Thr
165 170 175
CTT GGT CAG TAT TTT CAA AAG CTG GGT CGG TGT TCA GCA CGA GTT TCT 691
Leu Gly Gln Tyr Phe Gln Lys Leu Gly Arg Cys Ser Ala Arg Val Ser
180 185 190 195
ATA AAC ACA GTC AAC TTG ACA GTT GGC CCT CAG GTC ATG GAA GTG ATT 739
Ile Asn Thr Val Asn Leu Thr Val Gly Pro Gln Val Met Glu Val Ile
200 205 210
GTC TTT CGA AGA CAC GGC CGG GCA TAC ATT CCC ATC TCC AAA GTG AAA 787
Val Phe Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Val Lys
215 220 225
GAC GTG TAT GTG ATA ACA GAT CAG ATC CCT ATA TTC GTG ACC ATG TAC 835
Asp Val Tyr Val Ile Thr Αβρ Gln Ile Pro Ile Phe Val Thr Met Tyr
230 235 240
CAG AAG AAT GAC CGG AAC TCG TCT GAT GAA ACC TTC CTC AGA GAC CTC 8B3
Gln Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu Arg Asp Leu
245 250 255
188 826
ccc ATT TTC TTC GAT GTC CTC ATT CAC GAT CCC AGT CAT TTC Phe CTC Leu AAC Asn 275 931
Pro 260 lie Phe Phe Asp Val 265 Leu Ile His Asp Pro 270 Ser His
TAC TCT GCC ATT TCC TAC AAG TGG AAC TTT GGG GAC AAC ACT GGC CTG 979
Tyr Ser Ala Ile Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn Thr Gly Leu
280 285 290
TTT GTC TCC AAC AAT CAC ACT TTG AAT CAC ACG TAT GTG CTC AAT GGA 1027
Phe Val Ser Ąsn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val Leu Asn Gly
295 300 305
ACC TTC AAC TTT AAC CTC ACC GTG CAA ACT GCA GTG CCG GGA CCA TGC 1075
Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gin Thr Ala Val Pro Gly Pro Cys
310 315 320
CCC TCA CCC ACA CCT TCG CCT TCT TCT TCG ACT TCT CCT TCG CCT GCA 1123
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser Pro Ala
325 330 335
TCT TCG CCT TCA CCC ACA TTA TCA ACA CCT AGT CCC TCT TTA ATG CCT 1171
Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser Leu Met Pro
340 345 350 355
ACT GGC CAC AAA TCC ATO GAG CTG AGT GAC ATT TCC AAT GAA AAC TGC 1219
Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp Ile Ser Asn Glu Asn Cys
360 3.65 370
CGA ATA AAC AGA TAT GGT TAC TTC AGA GCC ACC ATC ACA ATT GTA GAT 1267
Arg Ile Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr Ile Thr Ile Val Asp
375 380 385
GGA ATC CTA GAA GTC AAC ATC ATC CAG GTA GCA GAT GTC CCA ATC CCC 1315
Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gin Val Ala Asp Val Pro Ile Pro
390 395 400
ACA CCG CAG CCT GAC AAC TCA CTG ATG GAC TTC ATT GTG ACC TGC AAA 1363
Thr Pro Gin Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe Ile Val Thr Cys Lys
405 410 415
GGG GCC ACT CCC ACG GAA GCC TGT ACG ATC ATC TCT GAC CCC ACC TGC 1411
Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cya Thr Ile Ile Ser Asp Pro Thr Cys
420 425 430 435
CAG ATC GCC CAG AAC AGG GTG TGC AGC CCG GTG GCT GTG GAT GAG CTG 1459
Gin Ile Ala Gin Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Ala Val Asp Glu Leu
440 445 450
TGC CTC CTG TCC GTG AGG AGA GCC TTC AAT GGG TCC GGC ACG TAC TGT 1507
Cya Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr Cys
455 460 465
GTG AAT TTC ACT CTG GGA GAC GAT GCA AGC CTG GCC CTC ACC AGC GCC 1555
Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala Leu Thr Ser Ala
470 475 480
188 826
CTG ATC TCT ATC CCT GGC AAA GAC CTA GGC TCC CCT CTG AGA ACA GTG 1603
Leu Ile Ser Ile Pro Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro Leu Arg Thr Val
4B5 490 495
AAT GGT GTC CTG ATC TCC ATT GGC TGC CTG GCC ATG TTT GTC ACC ATG 1651
Asn Gly Val Leu He Ser Ile Gly Cys Leu Ala Met Phe Val Thr Met
500 505 510 515
GTT ACC ATC TTG CTG TAC AAA AAA CAC AAG ACG TAC AAG CCA ATA GGA 16 99
Val Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Lys Hia Lys Thr Tyr Lys Pro Ile Gly
520 525 530
AAC TGC ACC AGG AAC GTG GTC AAG GGC AAA GGC CTG AGT GTT TTT CTC 1747
Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu Ser Val Phe Leu
535 540 545
AGC CAT GCA AAA GCC CCG TTC TCC CGA GGA GAC CGG GAG AAG GAT CCA 1795
Ser His Ala Lys Ala Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu Lys Asp Pro
550 555 560
CTG CTC CAG GAC AAG CCA TGG ATG CTC TAAGTCTTCA CTCTCACTTC 1842
Leu Leu Gin Asp Lys Pro Trp Met Leu
565 570
TGACTGGGAA CCCACTCTTC TGTGCATGTA TGTOAGCTGT GCAGAAGTAC ATGACTGGTA 1902
GCTGTTGTTT TCTACGGATT ATTGTAAAAT GTATATCATG GTTTAGGGAG CGTAGTTAAT 1962
TGGCATTTTA GTGAAGGGAT GGGAAGACAG TATTTCTTCA CATCTGTATT GTGGTTTTTA 2 022
TACTGTTAAT AGGGTGGGCA CATTGTGTCT GAAGGGGGAG GGGGAGGTCA CTGCTACTTA 2062
AGGTCCTAGG TTAACTGGGA GAGGATGCCC CAGGCTCCTT AGATTTCTAC ACAAGATGTG 2142
CCTGAACCCA GCTAGTCCTG ACCTAAAGGC CATGCTTCAT CAACTCTATC TCAGCTCATT 2202
GAACATACCT GAGCACCTGA TGGAATTATA ATGGAACCAA GCTTGTTGTA TGGTGTGTGT 2262
GTGTACATAA GATACTCATT AAAAAGACAG TCTATTAAAA A 2 3 03 (2) INFORMACJA O SEK NR ID: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 572 aminokwasy (B) TYP: kwas nukleinowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 5:
Met Glu Ser Leu Cys Gly Val Leu Val Phe Leu Leu Leu Ala Ala Gly
188 826
Leu Pro Leu Gln 20 Ala Ala Lys Arg Phe 25 Arg Asp Val Leu Gly 30 His Glu
Gln Tyr Pro 35 Asp His Met Arg Glu 40 Asn Asn Gln Leu Arg 45 Gly Trp Ser
Ser Asp 50 Glu Asn Glu Trp Asp 55 Glu Gln Leu Tyr Pro 60 Val Trp Arg Arg
Gly 65 Glu Gly Arg Trp Lys 70 Asp Ser Trp Glu Gly 75 Gly Arg Val Gin Ala 80
Ala Leu Thr Ser Asp 8S Ser Pro Ala Leu Val 90 Gly Ser Asn Ile Thr 95 Phe
Val Val Asn Leu 100 Val Phe Pro Arg Cys 105 Gln Lys Glu Asp Ala 110 Asn Gly
Asn Ile Val 115 Tyr Glu Arg Asn Cys 120 Arg Ser Asp Leu Glu 125 Leu Ala Ser
Asp Pro 130 Tyr Val Tyr Asn Trp 135 Thr Thr Gly Ala Asp 140 Asp Glu Asp Trp
Glu 145 Asp Ser Thr Ser Gln 150 Gly Gin His Leu Arg 155 Phe Pro Asp Gly Lys 160
Pro Phe Pro Arg Pro 165 His Gly Arg Lys Lys 170 Trp Asn Phe Val Tyr 175 Val
Phe His Thr Leu 180 Gly Gin Tyr Phe Gln 1B5 Lys Leu Gly Arg Cys 190 Ser Ala
Arg Val Ser 195 He Asn Thr Val Asn 200 Leu Thr Val Gly Pro 205 Gln Val Met
Glu Val 210 Ile Val Phe Arg Arg 215 Hia Gly Arg Ala Tyr 220 Ile Pro Ile Ser
Lys 225 Val Lys Asp Val Tyr 230 Val Ile Thr Asp Gin 235 Ile Pro Ile Phe Val 240
Thr Met Tyr Gln Lys 245 Asn Asp Arg Asn Ser 250 Ser Asp Glu Thr Phe 255 Leu
Arg Asp Leu Pro 260 Ile Phe Phe Asp Val 265 Leu Ile His Asp Pro 270 Ser His
Phe Leu Aan 275 Tyr Ser Ala Ile Ser 280 Tyr Lys Trp Asn Phe 285 Gly Asp Asn
Thr Gly Leu Phe Val Ser Asn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val 290 295 300
188 826
Leu Asn Gly Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val 315 Gln Thr Ala Val Pro 320
305 310
Gly Pro Cys Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro
325 330 335
Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser
340 345 350
Leu Met Pro Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp Ile Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Cys Arg Ile Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr Ile Thr
370 375 380
Ile Val Asp Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gln Val Ala Asp Val
385 390 395 400
Pro Ile Pro Thr Pro Gln Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe Ile Val
405 410 415
Thr Cys Lys Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cys Thr Ile Ile Ser Asp
420 425 430
Pro Thr Cys Gln Ile Ala Gln Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Ala Val
435 440 445
Asp Glu Leu Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly
450 455 460
Thr Tyr Cys Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala Leu
465 470 475 480
Thr Ser Ala Leu Ile Ser Ile Pro Gly Lys ASp Leu Gly Ser Pro Leu
485 490 495
Arg Thr Val Asn Gly Val Leu Ile Ser Ile Gly Cys Leu Ala Met Phe
500 505 510
Val Thr Met Val Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr Lys
515 520 525
Pro Ile Gly Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu Ser
530 535 540
Val Phe Leu Ser Kis Ala Lys Ala Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu
545 550 555 560
Lys Asp Pro Leu Leu Gln Asp Lys Pro Trp Met Leu
565 570
(2) INFORMACJA O SEK NR ID: 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1795 par zasad
188 826 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 278..1279 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 6:
GCGGCCGCGT CGACGAAGCT GGGAAGTCAG GGGCTGTTTC TGTGGGCAGC TTTCCCTGTC 60
CTTTGGAAGG CACAGAGCTC TCAGCTGCAG GGAACTAACA GAGCTCTGAA GCCGTTATAT 120
OTGGTCTTCT CTCATTTCCA GCAGAGCAGG CTCATATGAA TCAACCAACT GGGTGAAAAG 180
ATAAGTTGCA ATCTGAGATT TAAGACTTGA TCAGATACCA TCTGGTGGAG GGTACCAACC 240
AGCCTGTCTG CTCATTTTCC TTCAGGCTGA TCCCATA ATG CAT CCT CAA GTG GTC 295
Met His Pro Gln Val Val 1 5
ATC TTA AGC CTC ATC CTA CAT CTG GCA GAT TCT GTA GCT GGT TCT GTA 343
Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp Ser Val Ala Gly Ser Val
10 15 20
AAG GTT GGT GGA GAG GCA GGT CCA TCT GTC ACA CTA CCC TGC CAC TAC 391
Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys Kis Tyr
25 30 35
AGT GGA GCT GTC ACA TCA ATG TGC TGG AAT AGA GGC TCA TGT TCT CTA 439
Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys Ser Leu
40 45 50
TTC ACA TGC CAA AAT GGC ATT GTC TGG ACC AAT GGA ACC CAC GTC ACC 487
Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His Val Thr
55 60 65 70
TAT CGG AAG GAC ACA CGC TAT AAG CTA TTG GGG GAC CTT TCA AGA AGG 535
Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser Arg Arg
75 80 85
GAT GTC TCT TTG ACC ATA GAA AAT ACA GCT GTG TCT GAC AGT GGC GTA 583
Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Ser Gly Val
90 9S 100
TAT TGT TGC CGT GTT GAG CAC CGT GGG TGG TTC AAT GAC ATG AAA ATC 631
Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met Lys Ile
105 110 115
188 826
ACC GTA Thr Val TCA Ser TTG Leu GAG Glu ATT GTG CCA CCC AAG GTC ACG ACT ACT CCA ATT 679
Ile Val 125 Pro Pro Lys Val Thr 130 Thr Thr Pro lle
120
GTC ACA ACT GTT CCA ACC GTC ACG ACT GTT CGA ACG AGC ACC ACT GTT 727
Val 135 Thr Thr Val Pro Thr 140 Val Thr Thr Val Arg 145 Thr Ser Thr Thr Val 150
CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCA ACG ACA ACT GTT CCA ACA ACA ATG AGC 775
Pro Thr Thr Thr Thr 155 Val Pro Thr Thr Thr 160 Val Pro Thr Thr Met 165 Ser
ATT CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCG ACG ACA ATG ACT GTT TCA ACG ACA 823
lie Pro Thr Thr 170 Thr Thr Val Pro Thr Thr 175 Met Thr Val Ser 180 Thr Thr
ACG AGC GTT CCA ACG ACA ACG AGC ATT CCA ACA ACA ACA AGT GTT CCA 871
Thr Ser Val 185 Pro Thr Thr Thr Ser 190 lie Pro Thr Thr Thr 195 Ser Val Pro
GTG ACA ACA ACG GTC TCC ACC TTT GTT CCT CCA ATG CCT TTG CCC AGG 919
Val Thr 200 Thr Thr Val Ser Thr 205 Phe Val Pro Pro Met 210 Pro Leu Pro Arg
CAG AAC CAT GAA CCA GTA GCC ACT TCA CCA TCT TCA CCT CAG CCA GCA 967
Gin 215 Asn His Glu Pro Val 220 Ala Thr Ser Pro Ser 225 Ser Pro Gin Pro Ala 230
GAA ACC CAC CCT ACG ACA CTG CAG GGA GCA ATA AGG AGA GAA CCC ACC 1015
Glu Thr His Pro Thr 235 Thr Leu Gin Gly Ala 240 Ile Arg Arg Glu Pro 245 Thr
AGC TCA CCA TTG TAC TCT TAC ACA ACA GAT GGG AAT GAC ACC GTG ACA 1063
Ser Ser Pro Leu 250 Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp 2S5 Gly Asn Asp Thr 260 Val Thr
GAG TCT TCA GAT GGC CTT TGG AAT AAC AAT CAA ACT CAA CTG TTC CTA 1111
Glu Ser Ser 265 Asp Gly Leu Trp Asn 270 Asn Asn Gin Thr Gin 275 Leu Phe Leu
GAA CAT AGT CTA CTG ACG GCC AAT ACC ACT AAA GGA ATC TAT GCT GGA 1159
Glu His 280 Ser Leu Leu Thr Ala 285 Asn Thr Thr Lys Gly 290 He Tyr Ala Gly
GTC TGT ATT TCT GTC TTG GTG CTT CTT GCT CTT TTG GOT GTC ATC ATT 1207
Val 295 Cys Ile Ser Val Leu 300 Val Leu Leu Ala Leu 30S Leu Gly Val lie lie 310
GCC AAA AAG TAT TTC TTC AAA AAG GAO OTT CAA CAA CTA AQA CCC CAT 1255
Ala Lya Lys Tyr Phe 315 Phe Lys Lys Glu Val 320 Gin Gin Leu Arg Pro 325 His
AAA Lya TCC Ser TGT Cys ATA Ile 330 CAT His CAA Gin AGA Arg GAA Glu TAGTCCCTGG AAACATAGCA AATGAACTTC 1309
188 826
TATCTTGGCC ATCACAGCTG TCCAGAAGAG GGGAATCTGT CTTAAAAACC AGCAAATCCA 1369
ACGTGAGACT TCATTTGGAA GCATTGTATG ATTATCTCTT GTTTCTATGT TATACTTCCA 1429
AATGTTGCAT TTCCTATGTT TTCCAAAGGT TTCAAATCGT GGGTTTTTAT TTCCTCCGTG 1469
GGGAAACAAA GTGAGTCTAA CTCACAGGTT TAGCTGTTTT CTCATAACTC TGGAAATGTG 1549
ATGCATTAAG TACTGGATCT CTGAATTGGG GTAGCTGTTT TACCAGTTAA AGAGCCTACA 1609
ATAGTATGGA ACACATAGAC ACCAGGGGAA GAAAATCATT TGCCAGGTGA TTTAACATAT 1669
TTATGCAATT TTTTTTTTTT TTTTTGAGAT GGAGCTTTGC TCTTGTTGCC CAGGCTGGAG 1729
TGCGATGGTG AAATCTCGGC TCACTGTAAC CTCCACCTTC CGGGTTCAAG CAATTCTCCC 1789
GTCGAC 1795
(2) INFORMACJA O SEK NR ID:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 334 aminokwasy (B) TYP: kwas nukleinowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 7:
Met 1 His Pro Gln Val 5 Val Ile Leu Ser Leu 10 Ile Leu His Leu Ala 15 Asp
Ser Val Ala Gly 20 Ser Val Lys Val Gly 25 Gly Olu Ala Gly Pro 30 Ser Val
Thr Leu Pro 35 Cys His Tyr Ser Gly 40 Ala Val Thr Ser Met 45 Cys Trp Asn
Arg Gly 50 Ser Cys Ser Leu Phe 55 Thr Cys Gin Asn Gly 60 Ile Val Trp Thr
Asn 65 Gly Thr His Val Thr 70 Tyr Arg Lys Asp Thr 75 Arg Tyr Lys Leu Leu 80
Gly Asp Leu Ser Arg B 5 Arg Asp Val Ser Leu 90 Thr Ile Glu Asn Thr 95 Ala
Val Ser Asp Ser 100 Gly Val Tyr Cys Cys 10S Arg Val aiu His Arg 110 Gly Trp
Phe Asn Asp 115 Met Lys Ile Thr Val 120 Ser Leu •Glu Ile Val 125 Pro Pro Lys
188 826
Val Thr Thr Thr Pro Ile Val Thr 130 135
Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr 145 150
Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro 165
Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser 180
Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr 195 200
Pro Met Pro Leu Pro Arg Gln Asn 210 215
Ser Ser Pro Gln Pro Ala Glu Thr 225 230
Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser 245
Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser 260
Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His 275 280
Lys Gly Ile Tyr Ala Gly Val Cys 290 295
Leu Leu Gly Val Ile Ile Ala Lys 305 310
Gln Gln Leu Arg Pro His Lys Ser 325
Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val 140
Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr 155 160
Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr 170 175
Val Pro Thr Thr Thr Ser Ile Pro 185 190
Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro 205
His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro 220
His Pro Thr Thr Leu Gln Gly Ala 235 240
Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp 250 255
Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn 265 270
Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr 285
Ile Ser Val Leu Val Leu Leu Ala 300
Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val 315 320
Cys Ile His Gln Arg Glu 330
188 826
GCGGCCGCGTCGACGGTGCCTGTGAGTAAATAGATCAGGGTCTCCTTCAC 50
AGCACATTCTCCAGGAAGCCGAGCAAACATTAGTGCTATTTTACCCAGGA 100
101 GGAAATCTAGGTGTAGAGAGCTCTACGGATCTAAGGTTTGGATCTGTACC 150
151 CAGTGCTTTTTTAGGTGTCTTTAGACATTTCTCAGGAAGATGTAGTCTCT 200
201 GTCACCATGTGTGGCTGAATTCTAGCTCAGTCCATCTTATTGTGTTTAAG 250
251 GTAGTTGAAGTTTAGGAACCAACCAGTATGTCTCTGAGCAGAAGAGTACA 300
301 GTGTCCATCTTGAGGACAAGCTCATCTTTACCATTAGAGGGCTGGCCTTG 350
351 GCTTAGATTCTACCGAGAACATACTCTCTAATGGCTGCCCTCAGTTTTCT 400
401 CTGTTTGCTGTCTTATTTGTGTCATGGCCAGAAGTCATATGGATGGCTCT 450
451 ATGTGAGCAAGGACCCAGATAGAAGAGTGTATTTGGGGGAACAGGTTGCC SCO
501 CTAACAGAGAGTCCTGTGGGATTCATGCAGTCAGGATGAAGACCTGATCA 550
551 GACAGAGTGTGCTGAGTGCCACGGCTAACCAGAGTGACTTGTCACTGTCC 600
601 TTCAGGTCAACACCATGGTTCAACTTCAAGTCTTCATTTCAGGCCTCCTG 650
MVQLQVFISGLL
651 CTGCTTCTTCCAGGCTCTGTAGATTCTTATGAAGTAGTGAAGGGGGTGGT 700
LLLPGSVDSYEVVKGVV
701 GGGTCACCCTGTCACAATTCCATGTACTTACTCAACACGTGGAGGAATCA 750
G Η P V T I PCTYSTRGGIT
751 CAACGACATGTTGGGGCCGGGGGCAATGCCCATATTCTAGTTGTCAAAAT ΘΟΟ
TTCWGRGQCPYS3CQN
801 ATACTTATTTGGACCAATGGATACCAAGTCACCTATCGGAGCAGCGGTCG 850
ILIWTNGYQVTYRSSGR
51 ATACAACATAAAGGGGCGTATTTCAGAAGGAGACGTATCCTTGACAATAG 900
YNIKGRISEGDVSLTIE
901 AGAACTCTGTTGATAGTGATAGTGGTCTGTATTGTTGCCGAGTGGAGATT 950
NSVDSDSGLYCCRVE I
951 CCTGGATGGTTCAACGATCAGAAAATGACCTTTTCATTGGAAGTTAAACC 1000
PGWFNDQKM?FSLEVKP
01 AGAAATTCCCACAAGTCCTCCAACAAGACCCACAACTACAAGACCCACAA 1050
EIPTSPPTRPTTTRPTT
1051 CCACAAGGCCCACAACTATTTCAACAAGATCCACACATGTACCAACATCA 1100
TRPTTI STRSTHVPTS
FIG. 1a
188 826
1101 ACCAGAGTCTCCACCTCTACTCCAACACCAGAACAAACACAGACTCACAA 1150
TRVSTSTPTPEQTQTHK
1151 ACCAGAAATCACTACATTTTATGCCCATGAGACAACTGCTGAGGTGACAG 12 00
PEITTFYAHETTAEVTE
1201 AAACTCCATCATATACTCCTGCAGACTGGAATGGCACTGTGACATCCTCA 12 50
TPSYTPADWNG7VTSS
1251 GAGGAGGCCTGGAATAATCACACTGTAAGAATCCCTTTGAGGAAGCCGCA 1300
EEAWNNHTVRIPLRKPQ
1301 GAGAAACCCGACTAAGGGCTTCTATGTTGGCATGTCCGTTGCAGCCCTGC 1350
RNPTKGFYVGMSVAALL
1351 TGCTGCTGCTGCTTGCGAGCACCGTGGTTGTCACCAGGTACATCATTATA 1400 llllastvvvtry: i i
1401 AGAAAGAAGATGGGCTCTCTGAGCTTTGTTGCCTTCCATGTCTCTAAGAG 1450
RKKMGSLSFVAFKVSKS
1451 TAGAGCTTTGCAGAACGCAGCGATTGTGCATCCCCGAGCTGAAGACAACA 1500
RALQNAAIVH?RAEDNI
1501 TCTACATTATTGAAGATAGATCTCGAGGTGCAGAATGAGTCCCAGAGGCC 1550
YIIEDRSRGAE '
1551 TTCTGTGGGGCCTTCTGCCTGGGATTACAGAGATCGTGACTGATTTCACA 1600
1601 GAGTAAAATACCCATTCCAGCTCCTGGGAGATTTTGTGTTTTGGTTCTTC 15 50
1651 CAGCTGCAGTGGAGAGGGTAACCCTCTACCCTGTATATGCAAAACTCGAG 1700
1701 GTTAACATCATCCTAATTCTTGTATCAGCAACACCTCAGTGTCTCCACTC 1750
51 ACTGCAGCGATTCTCTCAAATGTGAACATTTTAGAAGTTTGTGTTTCCTT 180G
1801 TTGTCCATGTAATCATTGGTAATACAAGAATTTTATCTTGTTTATTAAAA 1850
1851 CCATTAATGAGAGGGGAATAGGAATTAAAAGCTGGTGGGAAGGGCCTCCT 190C
1901 GAATTTAGAAGCACTTCATGATTGTGTTTATCTCTTTTATTGTAATTTGA 1950
1951 AATGTTACTTCTATCCTTCCCAAGGGGCAAAATCATGGGAGCATGGAGGT 2000
2001 TTTAATTGCCCTCATAGATAAGTAGAAGAAGAGAGTCTAATGCCACCAAT 2050
2051 AGAGGTGGTTATGCTTTCTCACAGCTCTGGAAATATGATCATTTATTATG 2100
2101 CAGTTGATCTTAGGATGAGGATGGGTTTCTTAGGAGGAGAGGTTACCATG 2150
2151 GTGAGTGGACCAGGCACACATCAGGGGAAGAAAACAATGGATCAAGGGAT 2200
2201 TGAGTTCATTAGAGCCATTTCCACTCCACTTCTGTCTTGATGCTCAGTGT 2250
2251 TCCTAAACTCACCCACTGAGCTCTGAATTAGGTGCAGGGAGGAGACGTGC 2300
FIG. 1b
188 826
2301 AGAAACGAAAGAGGAAAGAAAGGAGAGAGAGCAGGACACAGGCTTTCTGC 2350 2351 TGAGAGAAGTCCTATTGCAGGTGTGACAGTGTTTGGGACTACCACGGGTT 24 00 2401 TCCTTCAGACTTCTAAGTTTCTAAATCACTATCATGTGATCATATTTATT 2450 2451 TTTAAAATTATTTCAGAAAGACACCACATTTTCAATAATAAATCAGTTTG 2500 2501 TCACAATTAATAAAATATTTTGTTTGCTAAGAAGTAAAAAAAAAAAAAAA 2550 2551 AAGTCGACGCGGCCGC 2566
FIG. 1c
GCGGCCGCGTCGACGGTGCCTGTGAGTAAATAGATCAGGGTCTCCTTCAC 50
AGCACATTCTCCAGGAAGCCGAGCAAACATTAGTGCTATTTTACCCAGGA ICO
101 GGAAATCTAGGTGTAGAGAGCTCTACGGATCTAAGGTCAACACCATGGTT 150
Μ V
151 CAACTTCAAGTCTTCATTTCAGGCCTCCTGCTGCTTCTTCCAGGCTCTGT 200
QLQVFISGLLLLLPGSV
201 AGATTCTTATGAAGTAGTGAAGGGGGTGGTGGGTCACCCTGTCACAATTC 250
DSYEVVKGVVGHPVTIP
251 CATGTACTTACTCAACACGTGGAGGAATCACAACGACATGTTGGGGCCGG 300
CTYSTRGGITTTCWGR
01 GGGCAATGCCCATATTCTAGTTGTCAAAATATACTTATTTGGACCAATGG 3 50
GQCPYSSCQNILIWTNG
51 ATACCAAGTCACCTATCGGAGCAGCGGTCGATACAACATAAAGGGGCGTA 4 0 0 yqvtyrssgrynikgr;
401 TTTCAGAAGGAGACGTATCCTTGACAATAGAGAACTCTGTTGATAGTGAT 4 SC
SEGDVSLTIENSVDSD
451 AGTGGTCTGTATTGTTGCCGAGTGGAGATTCCTGGATGGTTCAACGATCA 500
SGLYCCRVE I P G W F N □ Q
501 GAAAATGACCTTTTCATTGGAAGTTAAACCAGAAATTCCCACAAGTCCTC 550
KMTFSLEVKPEXPTSPP
551 CAACAAGACCCACAACTACAAGACCCACAACCACAAGGCCCACAACTATT 600
TRPTTTRPTTTRPTTI
601 TCAACAAGATCCACACATGTACCAACATCAACCAGAGTCTCCACCTCTAC 650
S?RSTHVPTSTRVSTST
651 TCCAACACCAGAACAAACACAGACTCACAAACCAGAAATCACTACATTTT 700
PTPEQTQTHKPEITTFY
701 ATGCCCATGAGACAACTGCTGAGGTGACAGAAACTCCATCATATACTCCT 750
AHETTAEVTETPSYTP
751 GCAGACTGGAATGGCACTGTGACATCCTCAGAGGAGGCCTGGAATAATCA 800 adwngtvtsseeawnnh
801 CAC7GTAAGAATCCCTTTGAGGAAGCCGCAGAGAAACCCGACTAAGGGCT 850
T V R I PLRKPO. RNPTKGF
851 TCTATGTTGGCATGTCCGTTGCAGCCCTGCTGCTGCTGCTGCTTGCGAGC 900
YVGMS VAALLLLLLAS
901 ACCGTGGTTGTCACCAGGTACATCATTATAAGAAAGAAGATGGGCTCTCT 950
TVVVTRYI I IRKKMGSL
FIG. 2a
188 826
GAGCTTTGTTGCCTTCCATGTCTCTAAGAGTAGAGCTTTGCAGAACGCAG
SFVAFHVSKSRALQNAA
CGATTGTGCATCCCCGAGCTGAAGACAACATCTACATTATTGAAGATAGA ivhpraedn;yiiedr
TCTCGAGGTGCAGAATGAGTCCCAGAGGCCTTCTGTGGGGCCTTCTGCCT S R G A E .
GGGATTACAGAGATCGTGACTGATTTCACAGAGTAAAATACCCATTCCAG
CTCCTGGGAGATTTTGTGTTTTGGTTCTTCCAGCTGCAGTGGAGAGGGTA
ACCCTCTACCCTGTATATGCAAAACTCGAGGTTAACATCATCCTAATTCT
TGTATCAGCAACACCTCAGTGTCTCCACTCACTGCAGCGATTCTCTCAAA
TGTGAACATTTTAGAAGTTTGTGTTTCCTTTTGTCCATGTAATCATTGGT
AATACAAGAATTTTATCTTGTTTATTAAAACCATTAATGAGAGGGGAATA
GGAATTAAAAGCTGGTGGGAAGGGCCTCCTGAATTTAGAAGCACTTCATG
ATTGTGTTTATCTCTTTTATTGTAATTTGAAATGTTACTTCTATCCTTCC
CAAGGGGCAAAATCATGGGAGCATGGAGGTTTTAATTGCCCTCATAGATA
AGTAGAAGAAGAGAGTCTAATGCCACCAATAGAGGTGGTTATGCTTTCTC
ACAGCTCTGGAAATATGATCATTTATTATGCAGTTGATCTTAGGATGAGG
ATGGGTTTCTTAGGAGGAGAGGTTACCATGGTGAGTGGACCAGGCACACA
TCAGGGGAAGAAAACAATGGATCAAGGGATTGAGTTCATTAGAGCCATTT
CCACTCCACTTCTGTCTTGATGCTCAGTGTTCCTAAACTCACCCACTGAG
CTCTGAATTAGGTGCAGGGAGGAGACGTGCAGAAACGAAAGAGGAAAGAA
AGGAGAGAGAGCAGGACACAGGCTTTCTGCTGAGAGAAGTCCTATTGCAG
GTGTGACAGTGTTTGGGACTACCACGGGTTTCCTTCAGACTTCTAAGTTT
CTAAATCACTATCATGTGATCATATTTATTTTTAAAATTATTTCAGAAAG
ACACCACATTTTCAATAATAAATCAGTTTGTCACAATTAATAAAATATTT
TGTTTGCTAAGAAGTAAAAAGTCGACGCGGCCGC 2084
FIG. 2b
188 826
GCGGCCGCGTCGACTCGCAGGAGGCCGGCACTCTGACTCCTGGTGGATGG 50
GACTAGGGAGTCAGAGTCAAGCCCTGACTGGCTGAGGGCGGGCGCTCCGA 100
101 GTCAGCATGGAAAGTCTCTGCGGGGTCCTGGTATTTCTGCTGCTGGCTGC 150
MESLCGVLVFLLLAA
151 AGGACTGCCGCTCCAGGCGGCCAAGCGGTTCCGTGATGTGCTGGGCCATG 200
GLPLQAAKRFRDVLGHE
201 AGCAGTATCCGGATCACATGAGGGAGAACAACCAATTACGTGGCTGGTCT 250
QYPDHMRENNQLRGWS
251 TCAGATGAAAATGAATGGGATGAACAGCTGTATCCAGTGTGGAGGAGGGG 300
SDENEWDEQLYPVWRRG
301 AGAGGGCAGATGGAAGGACTCCTGGGAAGGAGGCCGTGTGCAGGCAGCCC 350
EGRWKDSWEGGRVQAAL
51 TAACCAGTGATTCACCGGCCTTGGTGGGTTCCAATATCACCTTCGTAGTG 4 0 C tsdspalvgsn:tfvv
401 AACCTGGTGTTCCCCAGATGCCAGAAGGAAGATGCCAACGGCAATATCGT 450
NLVF?RCQKEDANGNIV
451 CTATGAGAGGAACTGCAGAAGTGATT7GGAGCTGGCTTCTGACCCGTATG 500
YERNCRSDLELASDPYV
501 TCTACAACTGGACCACAGGGGCAGACGATGAGGACTGGGAAGACAGCACC 550
YNWTTGADDEDWEDST
551 AGCCAAGGCCAGCACCTCAGGTTCCCCGACGGGAAGCCCTTCCCTCGCCC 500
SQGQHLRFPDGK?FPRP
601 CCACGGACGGAAGAAATGGAACTTCGTCTACGTCTTCCACACACTTGGTC 650
HGRKKWNFVYVFHTLGQ
651 AGTATTTTCAAAAGCTGGGTCGGTGTTCAGCACGAGTTTCTATAAACACA 700
YFQKLGRCSARVS-INT
701 GTCAACTTGACAGTTGGCCCTCAGGTCATGGAAGTGATTGTCTTTCGAAG 750
VNLTVGPQVMEVIVFRR
751 ACACGGCCGGGCATACATTCCCATCTCCAAAGTGAAAGACGTGTATGTGA 800
HGRAYI PI SKVKDVYVI
801 TAACAGATCAGATCCCTATATTCGTGACCATGTACCAGAAGAATGACCGG 850
TDQIPIFVTMYQKNDR
851 AACTCGTCTGATGAAACCTTCCTCAGAGACCTCCCCATTTTCTTCGATGT 900
NSSDETFLRDLPIFFDV
901 CCTCATTCACGATCCCAGTCATTTCCTCAACTACTCTGCCATTTCCTACA 950
LIHDPSHFLNYSAISYK
FIG. 3a
188 826
AGTGGAACTTTGGGGACAACACTGGCCTGTTTGTCTCCAACAATCACACT
WNFGDNTGLFVSNNHT
TTGAATCACACGTATGTGCTCAATGGAACCTTCAACTTTAACCTCACCGT
LNHTYVLNGTFNFNLTV
GCAAACTGCAGTGCCGGGACCATGCCCCTCACCCACACCTTCGCCTTCTT
QTAVPGPCPSPTPSPSS
CTTCGACTTCTCCTTCGCCTGCATCTTCGCCTTCACCCACATTATCAACA
STSPSPASSPSPTLST
CCTAGTCCCTCTTTAATGCCTACTGGCCACAAATCCATGGAGCTGAGTGA
PSPSLMPTGHKSMELSD
CATTTCCAATGAAAACTGCCGAATAAACAGATATGGTTACTTCAGAGCCA
ISNENCRINRYGYFRAT
CCATCACAATTGTAGATGGAATCCTAGAAGTCAACATCATCCAGGTAGCA I T I V D G I L Ξ V N I I Q V A
GATGTCCCAATCCCCACACCGCAGCCTGACAACTCACTGATGGACTTCAT DVPIPTPQPDNSLMDF 1
TGTGACCTGCAAAGGGGCCACTCCCACGGAAGCCTGTACGATCATCTCTG
VTCKGATPTEACTIISD
ACCCCACCTGCCAGATCGCCCAGAACAGGGTGTGCAGCCCGGTGGCTGTG
PTCQIAQNRVCSPVAV
GATGAGCTGTGCCTCCTGTCCGTGAGGAGAGCCTTCAATGGGTCCGGCAC
DELCLLSVRRAFNGSGT
GTACTGTGTGAATTTCACTCTGGGAGACGATGCAAGCCTGGCCCTCACCA
YCVNFTLGDDASLALTS
GCGCCCTGATCTCTATCCCTGGCAAAGACCTAGGCTCCCCTCTGAGAACA A L I S I PGKDLGSPLRT
GTGAATGGTGTCCTGATCTCCATTGGCTGCCTGGCCATGTTTGTCACCAT
VNGVLISIGCLAMFVTM
GGTTACCATCTTGCTGTACAAAAAACACAAGACGTACAAGCCAATAGGAA
VTILLYKKHKTYKPIGN
ACTGCACCAGGAACGTGGTCAAGGGCAAAGGCCTGAGTGTTTTTCTCAGC
CTRNVVKGKGLSVFLS
CATGCAAAAGCCCCGTTCTCCCGAGGAGACCGGGAGAAGGATCCACTGCT
HAKAPFSRGDREKDPLL
CCAGGACAAGCCATGGATGCTCTAAGTCTTCACTCTCACTTCTGACTGGG Q D K P W M L
AACCCACTCTTCTGTGCATGTATGTGAGCTGTGCAGAAGTACATGACTGG
1000
1050
1100
1150
1200
1250
1300
1350
1400
1450
1500
1550
160C
1650
1700
1750
1800
1850
1900
FIG. 3b
188 826
TAGCTGTTGTTTTCTACGGATTATTGTAAAATGTATATCATGGTTTAGGG
AGCGTAGTTAATTGGCATTTTAGTGAAGGGATGGGAAGACAGTATTTCTT
CACATCTGTATTGTGGTTTTTATACTGTTAATAGGGTGGGCACATTGTGT
CTGAAGGGGGAGGGGGAGGTCACTGCTACTTAAGGTCCTAGGTTAACTGG
GAGAGGATGCCCCAGGCTCCTTAGATTTCTACACAAGATGTGCCTGAACC
CAGCTAGTCCTGACCTAAAGGCCATGCTTCATCAACTCTATCTCAGCTCA
TTGAACATACCTGAGCACCTGATGGAATTATAATGGAACCAAGCTTGTTG
TATGGTGTGTGTGTGTACATAAGATACTCATTAAAAAGACAGTC7ATTAA
AAA 2303
1950
2000
2050
2100
2150
2200
2250
2300
FIG. 3c
188 826
ATGCATCCTCAAGTGGTCATCTTAAGCCTCATCCTACATCTGGCAGATTC
MHPQVVI1SLILHLADS
TGTAGCTGGTTCTGTAAAGGTTGGTGGAGAGGCAGGTCCATCTGTCACAC
VAGSVKVGGEAGPSVT1.
TACCCTGCCACTACAGTGGAGCTGTCACATCAATGTGCTGGAATAGAGGC
PCHYSGAVTSM.CWNRG tcatgttctctattcacatgccaaaatggcattgtctggaccaatggaac
SCSLFTCQNGIVWTNGT
CCACGTCACCTATCGGAAGGACACACGCTATAAGCTATTGGGGGACCTTT
HVTYRKDTRYKLLGDLS
CAAGAAGGGATGTCTCTTTGACCATAGAAAATACAGCTGTGTCTGACAGT
RRDVSLTIENTAVSE5
GGCGTATATTGTTGCCGTGTTGAGCACCGTGGGTGGTTCAATGACATGAA
GVYCCRVEHRGWFNDMK
AATCACCGTATCATTGGAGATTGTGCCACCCAAGGTCACGACTACTCCAA
I TVSLEIVP?KVTTTPI
TTGTCACAACTGTTCCAACCGTCACGACTGTTCGAACGAGCACCACTGTT
VTTV?TVTTVRTSTTV
CCAACGACAACGACTGTTCCAACGACAACTGTTCCAACAACAATGAGCAT PTTTTVPTTTVPTTMS 1
TCCAACGACAACGACTGTTCCGACGACAATGACTGTTTCAACGACAACGA
PTTTTVPTTMTVSTTTS
GCGTTCCAACGACAACGAGCATTCCAACAACAACAAGTGTTCCAGTGACA
VPTTTSIPTTTSV?VT
ACAACGGTCTCTACCTTTGTTCCTCCAATGCCTTTGCCCAGGCAGAACCA
TTVSTFVPPMPLPRQNK
TGAACCAGTAGCCACTTCACCATCTTCACCTCAGCCAGCAGAAACCCACC
EPVATSPSSPQPAETHP
CTACGACACTGCAGGGAGCAATAAGGAGAGAACCCACCAGCTCACCATTG TT. LQGAIRREPTSSPL
TACTCTTACACAACAGATGGGAATGACACCGTGACAGAGTCTTCAGATGG
YSYTTDGNDTVTESSDG
CCTTTGGAATAACAATCAAACTCAACTGTTCCTAGAACATAGTCTACTGA
LWNNNQTQLFLEHSLLT
CGGCCAATACCACTAAAGGAATCTATGCTGGAGTCTGTATTTCTGTCTTG
ANTTKGIYAGVCISVL
FIG. 4a
188 826
901 GTGCTTCTTGCTCTTTTGGGTGTCATCATTGCCAAAAAGTATTTCTTCAA 950
VLLALLGVI IAKKYFFK
951 AAAGGAGGTTCAACAACTAAGACCCCATAAATCCTGTATACATCAAAGAG 1000
KEVQQLRPHKSCIHQRE
1001 AA 1002
FIG. 4b
MHPQWILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYS..GAVTSMCWN 48 = = ||.j = 1 = 1 | : : | | . : | | -|..||:|| || | : : | . | |'
VQLQVFISGLLLLLPGSVDSYEWKGWGHPVTIPC?YSTRGGITTTCWG 51
RGSCSLFTCQNGIVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVS 98 il I-· -II! = = 1111 = 1111---11- = ! =| iMIIIIl·· I 52 RGQCPYSSCQNILIWTNGYQVTYRSSGRYNIKGRISEGDVSLTIENSVDS 101
DSGVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIV?PKVTTT?1VTTVPTVTTVRTST 143
ΊΜΙΗΙΙ -11111 1 = 1-111= I -=-11102 DSGLYCCRVEIPGWFNDQKMTFSLEVKP................EIPTSP 135
149 TVPTTTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVPTTMTVSTTTSVPTTTSIPTTTSVP 198 •••III 1111 111=1 1 -1 = ··!! .1.-1-!- -I : ,
136 PTRPTTTRPTTTRPTTIS.....TRSTKVPTSTRVSTSTPTPEQTQTHXP 180
199 VTTTVSTFVPPMPLPRQNHE?VATS?SSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSS 246 -II- 11--1- ---I
181 EITTFYA...........HETTAEVTETP..................... 198
249 PLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFL3HSLLTANTTKGIYAGVGIS 298 111-.: :....11:: |||: | .- | | | | | .
199 ...SYTPADWNGTVTSSEEAWNNHTVRIPLiRKP..QRN?TKGFYVGMSVA 243
299 VLVLLALLGVIIAKKY . FFKKEVQQLR............PHKSCIHQRE 334 ,l:|| | |. · = -- = -,244 ALLLLLIASTVWTRYIIIRKKMGSLSFVAFHVSKSRALQNAAIVHPRA 292
FIG. 5
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (21)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd zawierający aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7.
  2. 2. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd obejmuje ponadto domenę Fc Ig.
  3. 3. Wyizolowany dNa obejmujący nukleotydy 278-1147 SEK NR ID:6 albo sekwencję DNA komplementarną do nukleotydów 278-1147 SEK NR ID:6.
  4. 4. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje SEK ID nR: 6 albo sekwencję komplementarną do SEK NR ID:6.
  5. 5. Wektor obejmujący kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7.
  6. 6. Wektor obejmujący kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący SEK NR ED:7.
  7. 7. Wektor obejmujący kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7, przy czym polipeptyd obejmuje ponadto domenę Fc Ig.
  8. 8. Wektor obejmujący kwas nukleinowy będący wyizolowanym DNA, który zawiera nukleotydy 278-1147 SEK NR ID:6 albo sekwencję DNA komplementarną do nukleotydów 278-1147 SEK NR ID:6.
  9. 9. Wektor obejmujący kwas nukleinowy będący wyizolowanym DNA, który zawiera SEK NR ID:6 albo sekwencję DNA komplementarną wobec SEK NR ID:6.
  10. 10. Komórka gospodarza obejmująca kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7.
  11. 11. Komórka gospodarza obejmująca kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7, przy czym polipeptyd obejmuje ponadto domenę Fc Ig.
  12. 12. Komórka gospodarza obejmująca kwas nukleinowy będący DNA, który zawiera nukleotydy 278-1147 SEK NR ID:6 albo sekwencję DNA komplementarną wobec nukleotydów 278-1147 SEK NRID:6.
  13. 13. Wyizolowany DNA obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który zawiera aminokwasy 1-290 SEK NR iD:7.
  14. 14. Kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd obejmujący ssaczy polipeptyd KlM1 pozbawiony sekwencji sygnałowej KlM1, przy czym ssaczy polipeptyd KIM1 wybrany jest z grupy składającej się z SEK NR ID:3 oraz SEK NR ID:7.
  15. 15. Kwas nukleinowy według zastrz. 14, znamienny tym, że kodowany polipeptyd ponadto jest pozbawiony domeny przezbłonowej.
  16. 16. Kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową kodującą białko fuzyjne obejmujące aminokwasy 21-290 SEK ID NR: 7 oraz region Fc immunoglobuliny.
  17. 17. Przeciwciało wiążące polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-290 SEK NR ID:7.
  18. 18. Przeciwciało wiążące polipeptyd obejmujący aminokwasy 21- 290 SEK NR ID:7.
  19. 19. Przeciwciało według zastrz. 17 albo 18, znamienne tym, że jest skoniugowane z immunoglobuliną, toksyną, związkiem dającym się uwidocznić lub radionuklidem.
  20. 20. Polipeptyd obejmujący aminokwasy 21-290 SEK NR ID:7.
    188 826
  21. 21. Polipeptyd według 20, znamienny tym, zemst kodowany przez kwas nukleinowy obejmujący SEK ID NR:6 albo sekwencję komplementarną do SEK NR ID:6.
PL97330313A 1996-05-24 1997-05-23 Wyizolowane kwasy nukleinowe, wyizolowane DNA, wektory obejmujące kwasy nukleinowe, komórki gospodarza obejmujące kwas nukleinowy, przeciwciała wiążące polipeptyd i polipeptyd PL188826B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1822896P 1996-05-24 1996-05-24
US2344296P 1996-08-23 1996-08-23
PCT/US1997/009303 WO1997044460A1 (en) 1996-05-24 1997-05-23 Modulators of tissue regeneration

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL330313A1 PL330313A1 (en) 1999-05-10
PL188826B1 true PL188826B1 (pl) 2005-04-29

Family

ID=26690881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97330313A PL188826B1 (pl) 1996-05-24 1997-05-23 Wyizolowane kwasy nukleinowe, wyizolowane DNA, wektory obejmujące kwasy nukleinowe, komórki gospodarza obejmujące kwas nukleinowy, przeciwciała wiążące polipeptyd i polipeptyd

Country Status (26)

Country Link
US (4) US6664385B1 (pl)
EP (2) EP0907735B9 (pl)
JP (3) JP4602482B2 (pl)
CN (1) CN1147584C (pl)
AT (1) ATE318903T1 (pl)
AU (1) AU712289B2 (pl)
BG (1) BG64678B1 (pl)
BR (1) BR9709115A (pl)
CA (1) CA2257851C (pl)
CZ (1) CZ295936B6 (pl)
DE (1) DE69735364T3 (pl)
DK (1) DK0907735T5 (pl)
EA (1) EA004402B1 (pl)
EE (1) EE04817B1 (pl)
ES (1) ES2258793T5 (pl)
HU (1) HU226205B1 (pl)
IL (1) IL127162A (pl)
IS (1) IS2636B (pl)
NO (2) NO327597B1 (pl)
NZ (1) NZ336467A (pl)
PL (1) PL188826B1 (pl)
PT (1) PT907735E (pl)
SI (1) SI0907735T2 (pl)
SK (1) SK285461B6 (pl)
TR (1) TR199802421T2 (pl)
WO (1) WO1997044460A1 (pl)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2258793T5 (es) * 1996-05-24 2010-01-25 Biogen Idec Ma Inc. Moduladores de la regeneracion tisular.
WO1998053071A1 (en) * 1997-05-23 1998-11-26 Biogen, Inc. Modulators of tissue regeneration
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
CN101818145A (zh) 1998-03-20 2010-09-01 联邦科学和工业研究组织 控制基因表达
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1160321A1 (en) * 2000-05-31 2001-12-05 Sanofi-Synthelabo Kidney Injury Novel Gene-1: Isolation and therapeutic applications
ATE425249T1 (de) * 2000-06-16 2009-03-15 Biogen Idec Inc Renale regulatorische elemente und deren verwendung
US6812002B2 (en) 2000-08-30 2004-11-02 Pfizer Inc. Osteoactivin protein and nucleic acids encoding the same, compositions and methods of stimulating bone differentiation
DK1401869T3 (da) 2001-06-01 2008-04-28 Biogen Idec Inc Molekyler og fremgangsmåder til inhibering af udskillkelse af kim 1
US8709412B2 (en) 2001-06-29 2014-04-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modulation of TIM receptor activity in combination with cytoreductive therapy
US7553939B2 (en) * 2001-06-29 2009-06-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes and methods of use thereof
AU2003228336B2 (en) * 2002-03-19 2009-07-30 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
EP2025345A1 (en) * 2002-12-30 2009-02-18 Biogen Idec MA Inc. KIM-1 antagonists and use to modulate immune system
WO2004084823A2 (en) * 2003-03-19 2004-10-07 Abgenix, Inc. Antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen and uses thereof
DE602004022150D1 (de) * 2003-03-27 2009-09-03 Childrens Hosp Medical Center Verfahren und kit zum nachweis des frühstadiums einer nierentubuluszellenverletzung
CA2565701A1 (en) 2004-05-06 2005-11-17 Jonathan M. Barasch Ngal for reduction and amelioration of ischemic and nephrotoxic injuries
US20050272101A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-08 Prasad Devarajan Method for the early detection of renal injury
RU2283666C9 (ru) * 2004-05-14 2007-03-10 Бизяев Алексей Вячеславович Средство для активации восстановления структуры и функции поврежденных тканей и органов
US20060003345A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 Pfizer Inc RNA bioassay
ES2818028T3 (es) * 2004-12-20 2021-04-09 Antibodyshop As Determinación de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) como marcador diagnóstico para trastornos renales
KR101213894B1 (ko) 2005-03-02 2012-12-20 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｔｈ2 매개성 병태를 치료하기 위한 ｋｉｍ-1 항체
US20070037232A1 (en) * 2005-03-31 2007-02-15 Barasch Jonathan M Detection of NGAL in chronic renal disease
US20080090304A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Barasch Jonathan Matthew Diagnosis and monitoring of chronic renal disease using ngal
EP1957115B8 (en) 2005-11-10 2014-03-05 Celldex Therapeutics, Inc. Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
PL2035835T3 (pl) 2006-05-30 2012-05-31 Antibodyshop As Sposoby szybkiej oceny ciężkości urazu
WO2008017306A1 (en) * 2006-08-07 2008-02-14 Antibodyshop A/S Diagnostic test to exclude significant renal injury
WO2008113363A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-25 Bioporto Diagnostics A/S Diagnostic test for renal injury
US8846036B2 (en) 2007-10-19 2014-09-30 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian NGAL and uses thereof
US20090297479A1 (en) * 2008-03-28 2009-12-03 Kiyoshi Ariizumi Dc-hil conjugates for treatment of t-cell disorders
NZ610356A (en) * 2008-08-28 2015-03-27 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CA2735590A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ607703A (en) 2008-10-21 2014-09-26 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2010048347A2 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CN102264230B (zh) 2008-11-10 2014-12-10 阿斯图特医药公司 用于诊断和预后肾损伤和肾衰竭的方法和组合物
MX2011005379A (es) * 2008-11-22 2011-06-09 Astute Medical Inc Metodos y composiciones para diagnosis y prognosis de lesion renal y falla renal.
PT2391653E (pt) * 2009-01-28 2015-02-13 Ind Tech Res Inst Biomarcadores associados a nefropatia
US9229010B2 (en) 2009-02-06 2016-01-05 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CA2770393A1 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CA2770382A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2496942B1 (en) 2009-11-07 2017-03-22 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
JP5763098B2 (ja) 2009-12-20 2015-08-12 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物
PT2666872T (pt) 2010-02-05 2016-07-08 Astute Medical Inc Processos e composições para o diagnóstico e o prognóstico de lesões renais e de insuficiência renal
EP3070474A3 (en) 2010-02-26 2016-12-07 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2011149962A1 (en) 2010-05-24 2011-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
NZ605698A (en) 2010-06-23 2015-03-27 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
IN2012MN02812A (pl) 2010-06-23 2015-05-22 Astute Medical Inc
CN103491969A (zh) * 2011-02-09 2014-01-01 拉维沃公司 恢复和重建肠道微生物群的合生素组合物
ES2734494T3 (es) 2011-12-08 2019-12-10 Astute Medical Inc Métodos y usos para el diagnóstico de una lesión renal y de una insuficiencia renal
EP2925337B1 (en) 2012-11-21 2019-07-03 The Trustees of Columbia University in the City of New York Mutant ngal proteins and uses thereof
TR201807542T4 (tr) 2013-01-17 2018-06-21 Astute Medical Inc Böbrek hasarı ve böbrek yetmezliği teşhisi ve prognozuna yönelik metotlar ve bileşimler.
US10420337B2 (en) 2013-03-15 2019-09-24 Lifeline Scientific, Inc. Transporter with a glucose sensor for determining viability of an organ or tissue
US10265424B2 (en) * 2014-03-04 2019-04-23 Trust-Biosonics, Inc. Molecular imaging contrast agents and uses thereof
EP3465201A4 (en) 2016-06-06 2020-08-26 Astute Medical, Inc. MANAGEMENT OF ACUTE KIDNEY DAMAGE USING INSULINOMIMETIC GROWTH FACTOR BINDING PROTEIN 7 AND TISSUE METALLOPROTEINASE 2 INHIBITOR

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB9122820D0 (en) * 1991-10-28 1991-12-11 Wellcome Found Stabilised antibodies
CA2118508A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1995021922A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Abbott Laboratories Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
US5622861A (en) * 1994-08-05 1997-04-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA encoding hepatitis A virus receptor
WO1996006159A1 (en) * 1994-08-18 1996-02-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Unique associated kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US6069230A (en) * 1994-11-10 2000-05-30 Promega Corporation High level expression and facile purification of proteins, peptides and conjugates for immunization, purification and detection applications
US6066322A (en) * 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
ES2258793T5 (es) * 1996-05-24 2010-01-25 Biogen Idec Ma Inc. Moduladores de la regeneracion tisular.
ATE425249T1 (de) * 2000-06-16 2009-03-15 Biogen Idec Inc Renale regulatorische elemente und deren verwendung
DK1401869T3 (da) * 2001-06-01 2008-04-28 Biogen Idec Inc Molekyler og fremgangsmåder til inhibering af udskillkelse af kim 1
US7838220B2 (en) * 2001-06-29 2010-11-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes associated with immune disease
US7553939B2 (en) * 2001-06-29 2009-06-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University T cell regulatory genes and methods of use thereof
US7215871B2 (en) * 2001-07-27 2007-05-08 Thomson Licensing Changing a playback speed for video presentation recorded in a field structure format
US7687454B2 (en) * 2001-12-03 2010-03-30 The University Of British Columbia Effectors of innate immunity determination
US7470428B2 (en) * 2002-01-30 2008-12-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods related to TIM-3, a Th1-specific cell surface molecule
AU2003228336B2 (en) * 2002-03-19 2009-07-30 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
EP2025345A1 (en) * 2002-12-30 2009-02-18 Biogen Idec MA Inc. KIM-1 antagonists and use to modulate immune system
TW200539890A (en) * 2004-03-12 2005-12-16 Brigham & Womens Hospital Methods of modulating immune responses by modulating tim-1, tim-2 and tim-4 function
KR20070037570A (ko) * 2004-03-24 2007-04-05 텔로스 파마슈티칼스 인코포레이티드 백신에 대한 면역반응을 향상시키는 보강제로서의 조성물및 이의 사용 방법

Also Published As

Publication number Publication date
NZ336467A (en) 2000-10-27
BG102967A (bg) 2000-05-31
SK160998A3 (en) 1999-07-12
JP4316640B2 (ja) 2009-08-19
DE69735364D1 (de) 2006-04-27
AU712289B2 (en) 1999-11-04
EA004402B1 (ru) 2004-04-29
ES2258793T5 (es) 2010-01-25
SI0907735T2 (sl) 2010-01-29
CZ381398A3 (cs) 1999-05-12
US20070141590A1 (en) 2007-06-21
PL330313A1 (en) 1999-05-10
ES2258793T3 (es) 2006-09-01
EP0907735B1 (en) 2006-03-01
JP4602482B2 (ja) 2010-12-22
IL127162A (en) 2007-07-24
DK0907735T4 (da) 2009-12-21
BG64678B1 (bg) 2005-11-30
NO327597B1 (no) 2009-08-31
HUP9902770A3 (en) 2001-09-28
JP2001505761A (ja) 2001-05-08
JP2008067701A (ja) 2008-03-27
EE04817B1 (et) 2007-04-16
CZ295936B6 (cs) 2005-12-14
CN1147584C (zh) 2004-04-28
CN1223685A (zh) 1999-07-21
ATE318903T1 (de) 2006-03-15
US20050089868A1 (en) 2005-04-28
DK0907735T3 (da) 2006-06-26
IL127162A0 (en) 1999-09-22
PT907735E (pt) 2006-06-30
DE69735364T3 (de) 2010-05-06
HU226205B1 (en) 2008-06-30
US6664385B1 (en) 2003-12-16
NO20090945L (no) 1999-01-25
EP0907735B2 (en) 2009-10-07
EA199801044A1 (ru) 1999-04-29
NO985427L (no) 1999-01-25
DE69735364T2 (de) 2006-11-30
EP0907735B9 (en) 2010-05-19
IS2636B (is) 2010-06-15
DK0907735T5 (da) 2010-06-14
SI0907735T1 (sl) 2006-08-31
CA2257851C (en) 2011-11-15
US20060286031A1 (en) 2006-12-21
AU3567697A (en) 1997-12-09
EP0907735A1 (en) 1999-04-14
IS4902A (is) 1998-11-20
HK1021746A1 (en) 2000-06-30
NO985427D0 (no) 1998-11-20
TR199802421T2 (xx) 1999-02-22
WO1997044460A1 (en) 1997-11-27
HUP9902770A2 (hu) 1999-12-28
SK285461B6 (sk) 2007-02-01
CA2257851A1 (en) 1997-11-27
BR9709115A (pt) 1999-08-03
EE9800409A (et) 1999-06-15
JP2009039111A (ja) 2009-02-26
EP1655367A1 (en) 2006-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL188826B1 (pl) Wyizolowane kwasy nukleinowe, wyizolowane DNA, wektory obejmujące kwasy nukleinowe, komórki gospodarza obejmujące kwas nukleinowy, przeciwciała wiążące polipeptyd i polipeptyd
KR100587556B1 (ko) 신경 및 신장 증식을 자극하기 위한 ＲＥＴ리간드（ＲｅｔＬ)
US6861509B1 (en) Antibodies to Ret and RetL3
KR100498530B1 (ko) 조직재생조절물질
KR100554901B1 (ko) 신경및신장증식을자극하기위한RET리간드(RetL)
MXPA98009812A (en) Modulators of the regeneration of the tej
HK1021821A1 (en) Ret ligand 3 (retl3) for stimulating neural and renal growth
HK1021821B (en) Ret ligand 3 (retl3) for stimulating neural and renal growth
HK1101184A (en) Ret ligand (retl) for stimulating neural and renal growth
CA2496906A1 (en) Ret ligand (retl) for stimulating neural and renal growth