PL189474B1 - Wyizolowane i oczyszczone białko krystaliczne, oczyszczony segment kwasu nukleinowego, wyizolowany i oczyszczony segment DNA, sposób stosowania segmentu kwasu nukleinowego, sposób wykrywania sekwencji kwasu nukleinowego, zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego, kompozycja peptydowa, oczyszczone przeciwciało, sposób wykrywania białka krystalicznegolub peptydu, zestaw do immunodetekcji, transgeniczna roślina, jej potomstwo i nasiona, komórka Bacillus thuringiensis, kompozycja i sposób wytwarzania polipeptydu - Google Patents

Abstract

l. Wyizolowane i oczyszczone bialko krystaliczne Bacillus thuringiensis CryET33 lub CryET34. 2. Bialko wedlug zastrz. 1, znamienne tym, ze obejmuje sekwencje aminokwasowa z SEKW NR ID.:3 lub SEKW N R ID.:4. 3. Bialko wedlug zastrz. 2, znamienne tym, ze bialko krystaliczne izoluje sie z Bacillus thuringiensis EG10327, EG11402 lub EG11403, odpowiadajace NRRL B-21365, NRRL B-21366, N RRLB-21367. 5. Oczyszczony segment kwasu nukleinowego, znamienny tym, ze koduje jeden z polipeptydów obejmujacych SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo obydwa poli- peptydy obejmujace SEKW NR ID.:3 i SEKW NR ID.:4. 35. Zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego, znamienny tym, ze obejmuje od- powiedni pojemnik, segment kwasu nukleinowego o sekwencji SEKW NR ID.:1 lub SEKW NR ID.:2 lub sekwencji komplementarnej, albo segment kwasu nukleinowego który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym o sekwencji SEKW NR ID.:1 lub SEKW NR ID.:2 lub sekwencja do niego komplementarna i odczynnik wykrywajacy. 36. Kompozycja peptydowa, znamienna tym, ze obejmuje bialko krystaliczne Cry- ET33 lub CryET34 zawierajace 5-aminokwasowa ciagla sekwencje z SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane i oczyszczone białko krystaliczne, oczyszczony segment kwasu nukleinowego, wyizolowany i oczyszczony segment DNA, sposób stosowania segmentu kwasu nukleinowego, sposób wykrywania sekwencji kwasu nukleinowego, zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego, kompozycja peptydowa, oczyszczone przeciwciało, sposób wykrywania białka krystalicznego lub peptydu, zestaw do immunodetekcji, transgeniczna roślina, jej potomstwo i nasiona, komórka Bacillus thuringiensis, kompozycja i sposób wytwarzania polipeptydu.

Niniejszy wynalazek dotyczy generalnie dziedzin biologii molekularnej. Bardziej szczegółowo, pewne postacie realizacji obejmują sposoby i kompozycje, zawierające segmenty DNA oraz białka, pochodzące od gatunków bakterii. Bardziej szczegółowo, obejmuje on nowe geny cryET33 i cryET34 z Bacillus thuringiensis, kodujące krystaliczne białka toksyczne wobec tęgopokrywych. Ujawnia się rozmaite sposoby wytwarzania i zastosowania tych segmentów DNA, segmenty DNA, kodujące syntetycznie modyfikowane białka Cry oraz natywne i syntetyczne krystaliczne białka, taki jak np. zastosowanie segmentów DNA jako sond diagnostycznych i matryc do wytwarzania białka, oraz zastosowanie białek, nośników białek fuzyjnych oraz peptydów w różnych zastosowaniach immunologicznych i diagnostycznych. Ujawnia się także sposoby wytwarzania i stosowania segmentów kwasów nukleinowych w udoskonalaniu komórek roślin transgenicznych, zawierających segmenty DNA ujawnione w niniejszym opisie.

Białka krystaliczne Bacillus thuringiensis

Jedną z unikalnych cech B. thuringiensis jest jej wytwarzanie podczas sporulacji krystalicznych białek, które są specyficznie toksyczne wobec pewnych rzędów i gatunków owadów. Wiele różnych szczepów B. thuringiensis, które jak się okazało, wytwarzają białka, mające aktywność owadobójczą wobec motyli i muchówek, jest dostępnych w handlu i stosowanych jako przyjazne dla środowiska środki owadobójcze, ponieważ są one toksyczne wobec specyficznych docelowych owadów, lecz nieszkodliwe dla roślin i innych nie docelowych organizmów.

189 474

Mechanizm aktywności owadobójczej białek krystalicznych B. thuringiensis badano szeroko w poprzednim dziesięcioleciu. Okazało się, że białka krystaliczne są toksyczne wobec owadów jedynie po spożyciu białka przez owada. Zasadowe pH i enzymy proteolityczne w jelicie środkowym owada rozpuszczają białka, pozwalając przez to na uwolnienie składników, które są toksyczne dla owada. Te toksyczne składniki niszczą komórki jelita środkowego, powodują, że owad przestaje jeść i ewentualnie przyczyniają się do śmierci owada. Z tego powodu B. thuringiensis stał się skutecznym i bezpiecznym dla środowiska środkiem owadobójczym w postępowaniu z różnymi owadami-szkodnikami.

Jak zauważył Hofte i in., (1989) większość owadobójczych szczepów B. thuringiensis jest aktywnych wobec rzędu Lepidoptera, to jest owadom z gąsienicami. Inne szczepy B. thuringiensis są aktywne owadobójczo przeciw owadom z rzędu Diptera, to jest muchom i komarom, albo przeciw zarówno motylom jak i muchówkom. W ostatnich latach donoszono o kilku szczapach B. thuringiensis, jako wytwarzających białka krystaliczne toksyczne wobec owadów z rzędu Coleoptera, to jest chrząszczom (Kreig i in., 1983; Sick i in., 1990; Lambert i in., 1992).

Genetyka białek krystalicznych

Liczne geny, kodujące białka krystaliczne sklonowano z kilku szczepów B. thuringiensis. Przegląd według Hofte i in., (1989) omawia geny i białka, które zidentyfikowano w B. thuringiensis przed 1990 i przedstawiono nazewnictwo i schemat klasyfikacji, który tradycyjnie stosowano wobec genów i białek B. thuringiensis. Geny cryI kodują białka CryI toksyczne wobec motyli. Geny cryll kodują białka CryII toksyczne zarówno wobec motyli jak i muchówek. Geny cryIII kodują białka CryIII toksyczne wobec tęgopokrywych, podczas gdy geny cryIV kodują białka CryIV toksyczne wobec muchówek.

Ostatnio zaproponowano nowe nazewnictwo, które systematycznie klasyfikuje geny ery na podstawie raczej homologii sekwencji DNA niż specyficzności owadów. Ten schemat klasyfikacji ukazuje się w tabeli 1.

Tabela 1

Zrewidowane nazewnictwo endotoksyn B. thuringiensis*

Nowa	Stara	Dostęp do GenBank #
1	2	3
Cry1Aa	CryIA(a)	Ml 1250
Cry1 Ab	CryIA(b)	M13898
Cry1 Ac	CryIA(c)	Ml 1068
Cry1 Ad	CryIA(d)	M73250
Cry1Ae	CryIA(e)	M65252
Cry1Ba	CryIB	Χ06711
Cry1Bb	ET5	L32020
Cry1Bc	PEG5	Z46442
Cry1Bd	CryE1	U70726
Cry1 Ca	CryIC	Χ07518
Cry1Cb	CryIC(b)	M97880

189 474

Ί

c.d. tabeli 1

1	2	3
Cry1Da	CryID	Χ54160
Cry1Db	PrtB	Z22511
Cry1Ea	CrylE	Χ53985
Cry1Eb	CryIE(b)	M73253
Cry1Fa	CryIF	M63897
Cry1Fb	PrtD	Z22512
Cry1Ga	PrtA	Z22510
Cry 1Gb	CryH2	U70725
Cry1Ha	PrtC	Z22513
Cry1Hb		U35780
Cry1Ia	CryV	Χ62821
Cry1 Ib	CryV	U07642
Cry1 Ja	ET4	L32019
Cry1 Jb	ET1	U31527
Cry1K		U28801
Cry2Aa	CryIIA	M31738
Cry2Ab	CryIIB	M23724
Cry2Ac	CryIIC	Χ57252
Cry3 A	CryIIIA	M22472
Cry3Ba	CryIIIB	K17123
Cry3Bb	CryIIIB2	M89794
Cry3C	CryIIID	C59797
Cry4A	CryIVA	Y00423
Cry4B	CrylVB	Χ07423
Cry5Aa	CryVA(a)	L07025
Cry5Ab	CryVA(b)	L07026
Cry5B		U19725
Cry6A	CryVIA	L07022

189 474

c.d. tabeli 1

1	2	3
Cry6B	CryVIB	L07024
Cry7Aa	CrylllC	M64478
Cry7Ab	CryIIICb	U04367
Cry8A	CrylllE	U04364
Cry8B	CrylllG	U04365
Cry8C	CrylllF	U04366
Cry9A	CrylG	Χ58120
Cry9B	CryIX	Χ75019
Cry9C	CrylH	Z37527
Cry10a	CryIVC	M12662
Cry11a	CryIVD	M31737
Cry11B	Jeg80	Χ86902
Cry12A	CryVB	L07027
Cry13A	CryVC	L07023
Cry14A	CryVD	U13955
Cry15A	34kDa	M76442
Cry 16A	cbm71	Χ94146
Cryl 7	cbm71	Χ99478
Cry18A	CryBPl	Χ99049
Cry19A	Jeg65	Y08920
Cyt1Aa	CytA	Χ03182
Cyt 1Ab	CytM	Χ98793
Cyt 1B		U37196
Cyt2a	CytB	Z14147
Cyt2B	CytB	U52043

³Zadaptowano z:http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Cnckmorc/Bt/index/html

Identyfikacja białek krystalicznych toksycznych wobec owadów tęgopokrywych Wykorzystanie bakteryjnych białek krystalicznych jako środków owadobójczych rozszerzono po doniesieniu o pierwszej izolacji szczepu B. thuringiensis toksycznego wobec

189 474 tęgopokrywych (Krieg i in., 1983; 1984). Szczep ten (opisany w opisie patentowym U.S. nr 4 766 203, konkretnie tu niniejszym załączony jako odniesienie), oznaczony B. thuringiensis odmiana tenebrionis, opisywany jest jako toksyczny dla larw owadów tęgopokrywych Agelastica alni (Hurmak olszowiec) i Leptinotarsa decemlineata (stonka ziemniaczana).

Opis patentowy U.S. nr 4 766 203, konkretnie tu załączony jako odniesienie), odnosi się do owadobójczych białek krystalicznych o 65-70 kilodaltonów (kDa) zidentyfikowanych u B. thuringiensis tenebrionis (patrz także Berhnard, 1986). Sekar i in., (1987) donosi o klonowaniu i charakteryzacji genu białka krystalicznego toksycznego dla tęgopokrywych z B. thuringiensis tenebrionis. Przypuszczalna wielkość polipeptydu (jak wnioskowano z sekwencji genowej) wynosi 73 kDa, jednak wyizolowane białko składa się przede wszystkim ze składnika o 65 kDa. Hófte i in., (1988) ujawnia sekwencję DNA dla klonowanego owadziego genu kontrolnego z B. thuringiensis tenebrionis, sekwencja była identyczna jak opisywana przez Sekara i in., (1987). Komórki E. coli oraz komórki Pseudomonas Jluorescens posiadające klonowany gen okazały się toksyczne dla larw stonki ziemniaczanej.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 91/07481 datowane 30 maja 1991 opisuje mutanty B. thuringiensis, które wytwarzają duże ilości takich samych owadobójczych białek, początkowo wytwarzanych przez szczepy rodzicielskie w mniejszych ilościach. Opisuje się mutanty, toksyczne wobec tęgopokrywych, szczepu B. thuringiensis tenebrionis.

Szczep toksyczny wobec tęgopokrywych, oznaczony B. thuringiensis odmiana san diego, opisana przez Hermstadta i in., (1986), jako wytwarzająca białko krystaliczne o 64 kDa toksyczne wobec niektórych tęgopokrywych, łączenie z Pyrrhalta luteola (chrząszcz liści wiązu); Anthonomus gradis (kwieciak bawełnowiec), Leptinotarsa decemlineata (stonka ziemniaczana), Osiorhynchus sulcatus (ryjkowiec czarnego wina), Tenebrio molitor (mącznik młynarek), Haltica zombatica; oraz Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata (chrząszcz żerujący na ogórku).

Sekwencję DNA genu toksycznego wobec tęgopokrywych z B. thuringiensis san diego opisano u Hermstadta i in., (1987); i ujawniono w opisie patentowym U.S. nr 4 771 131. Sekwencja toksycznego genu B. thuringiensis san diego jest identyczna z opisywaną przez Sekara i in., (1987) dla klonowanego genu toksycznego wobec tęgopokrywych B. thuringiensis tenebrionis. Krieg i in., (1987) pokazał, że B. thuringiensis san diego był identyczny z B. thuringiensis tenebrionis, na podstawie różnych testów diagnostycznych.

Inny szczep B. thuringiensis, EG2158, opisano u Donovana i in., (1988) i opisano w opisie patentowym U.S. nr 5 024 837. EG2158 wytwarza białko krystaliczne CryC o 73 kDa, które jest owadobójcze wobec owadów tęgopokrywych. Jego sekwencja DNA była identyczna z opisy waną przez Sekara i in., (1987) dla klonowanego genu toksycznego wobec tęgopokrywych B. thuringiensis tenebrionis. Ten gen toksyczności wobec tęgopokrywych przytaczany jest jako gen cryIHA u Hoftego i in., 1989. Zaobserwowano także dwa mniejsze białka o 30 i 29 kDa w tym szczepie, lecz nie charakteryzowano ich bliżej (Donovan i in., 1988).

Opis patentowy U.S. nr 5 024 837 opisuje także hybrydowe szczepy B. thuringiensis odmiana kurstaki, która wykazywała aktywność zarówno przeciw motylom jak i muchówkom.

Opis patentowy U.S. nr 4 797 279 (odpowiadający EP 0221024) ujawnia hybrydę B. thuringiensis transformowaną plazmidem z B. thuringiensis odmiana kurstaki, zawierającą gen, kodujący krystaliczne białko toksyczne wobec tęgopokrywych oraz plazmidem z B. thuringiensis tenebrionis, zawierającym gen, kodujący krystaliczne białko toksyczne wobec tęgopokrywych. Hybrydowy szczep B. thuringiensis wytwarza białka krystaliczne charakterystyczne dla wytwarzanych przez B. thuringiensis kurstaki i B. thuringiensis tenebrionis. Opis patentowy U.S. nr 4 910 016 (odpowiadający EP 0303379) ujawnia izolat B. thuringiensis zidentyfikowany jako B. thuringiensis MT 104, który posiada aktywność owadobójczą wobec tęgopokrywych i motyli.

Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0318143 ujawnia nieuszkodzony, częściowo modyfikowany gen z B. thuringiensis tenebrionis oraz rekombinowane wektory, zawierające go, zdolne do kierowania ekspresją białka, posiadającego toksyczność wobec owadów tęgopokrywych, a europejskie zgłoszenie patentowe nr 0324254 ujawnia B. thuringiensis A30;

189 474 szczep który posiada aktywność owadobójczą przeciw owadom tęgopokrywym, łącznie ze stonka ziemniaczaną, larwą korzeni kukurydzy i kwieciakiem bawełnowcem.

Opis patentowy U.S. nr 4 999 192 (odpowiadający EP 0328383) ujawnia B. thuringiensis PS40D1, który posiada aktywność owadobójczą przeciw larwom stonki ziemniaczanej, szczep zidentyfikowano także przez serotypowanie, jako odmianę 8a8b, morrisoni. Opis patentowy U.S. nr 5 006 336 (odpowiadający EP 0346114) opisuje izolat B. thuringiensis oznaczony PS122D3, który serotypowano jako odmianę serologiczną 8a8b, morrisoni i który wykazywał aktywność owadobójczą wobec larw stonki ziemniaczanej. Opis patentowy U.S. nr 4 966 765 (odpowiadający EP 0330342) opisuje szczep B. thuringiensis, PS86B1 (zidentyfikowany przez serotypowanie jako odmianę serologiczną tolworthi), który posiada aktywność owadobójczą wobec stonki ziemniaczanej.

Sekwencję nukleotydową genu cryIIIB oraz kodowane przez nią białko toksyczne wobec tęgopokrywych, opisuje Sick i in., (1990) lecz źródłowy szczep B. thuringiensis identyfikuje się tylko przez serotypowanie jako podgatunek tolworthi. Opis patentowy U.S. nr 4 199 155 opublikowany 26 lutego 1991 Sieka i in., (odpowiadający EP 0337604), ujawnia gen toksyny B. thuringiensis otrzymany z B. thuringiensis 43F aktywnego wobec tęgopokrywych, a sekwencja genowa okazała się identyczna z genem cryIIIB. B. thuringiensis 43F przytacza się jako aktywny wobec stonki ziemniaczanej oraz Leptinotarsa texana.

Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0382990 ujawnia dwa szczepy B. thuringiensis btPGS1208 ibtPGS1245, które wytwarzają białka krystaliczne o 74 i 129 kDa, odpowiednio, wykazujące aktywność owadobójczą wobec larw stonki ziemniaczanej. Sekwencja DNA opisywana dla genu toksyny wytwarzającego 74 kDa białko okazuje się spokrewnione z genem cryIIIB Sicka i in (1990).

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT nr WO 90/13651 ujawnia szczepy B. thuringiensis, które zawierają gen toksyny, kodujący białko o 81 kDa, uważane za toksyczne zarówno wobec motyli jak i tęgopokrywych. Opis patentowy U.S. nr 5 055 293 ujawnia zastosowanie B. laterosporus dla kontroli owadów korzeni kukurydzy (Diabrotica).

Streszczenie wynalazku

W ostrym kontraście wobec poprzedniego stanu techniki, nowe białka krystaliczne CryET33 i CryET34 toksyczne wobec tęgopokrywych według niniejszego wynalazku oraz nowe sekwencje DNA, które je kodują, reprezentują nową klasę białek krystalicznych B. thuringiensis i nie dzielą homologii sekwencji z żadnym ze szczepów opisanych w wyżej wspomnianej literaturze. Izolat B. thuringiensis ujawniony tu i zastrzegany reprezentuje pierwszy szczep B. thuringiensis kurs taki, jaki okazał się toksyczny wobec tęgopokrywych. Komórki B. thuringiensis według niniejszego wynalazku zawierają nowe geny cry, które wykazują ekspresję toksyn białkowych, mających aktywność owadobójczą wobec tęgopokrywych takich jak owady z rodzaju Popilla i Tribolium.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane i oczyszczone białko krystaliczne Bacillus thuringiensis CryET33 i CryET34. Korzystnie obejmuje ono sekwencję aminokwasową z SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4., korzystniej białko krystaliczne izoluje się z Bacillus thuringiensis EG10327, EG11402 lub EG11403, odpowiadające NRRL B-21365, NRRL B-21366, NRRL B-21367. Korzystniej białko krystaliczne ma około 29-Da lub około 14-Da według określenia metodą SDS-PAGE.

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony segment kwasu nukleinowego kodujący polipeptyd obejmujący SEKW NR ID.:3 i oczyszczony segment kwasu nukleinowego kodujący polipeptyd obejmujący SEKW NR ID.:4 oraz oczyszczony segment kwasu nukleinowego kodujący obydwa polipeptydy obejmujące SEKW NR ID.:3 i SEKW NR ID.:4. Korzystnie segment kwasu nukleinowego koduje δ endotoksynę wykazującą aktywność owadobójczą wobec owadów o zwyczajowej nazwie amerykańskiej boll weevil, Japanese beetle (Popillia japonica) i red flour beetle (Tribolium castaneum). Korzystniej koduje on ponadto białko zawierające sekwencję aminokwasową SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4. Korzystnie segment kwasu nukleinowego ponadto obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego SEKW NR ID.:1, lub sekwencję do niej komplementarną, lub sekwencję hybrydyzującą z sekwencją SEKW

189 474

NR ID.:1, lub sekwencję kwasu nukleinowego SEKW NR ID.:2, lub sekwencję do niej komplementarną, lub sekwencję, która hybrydyzuje z sekwencją SEKW NR ID.:2, albo sekwencję kwasu nukleinowego jak przedstawiono na fig. 1A - 1C, lub sekwencję do niej komplementarną albo sekwencję, która hybrydyzuje z sekwencją przedstawioną na fig. 1A - 1C.

Korzystnie segment kwasu nukleinowego stanowi segment RNA. Również korzystnie segment kwasu nukleinowego zawiera gen kodujący białko krystaliczne lub peptyd mający długość około 267 aminokwasów lub zawiera gen kodujący białko krystaliczne lub peptyd mający długość około 126 aminokwasów, albo zawiera dwa geny, które kodują dwa białka krystaliczne lub peptydy o długości około 267 aminokwasów lub o długości około 126 aminokwasów. Korzystnie segment według wynalazku obejmuje ponadto wektor rekombinacyjny. Korzystniej zawiera ponadto pEG246 lub pEG1246. Korzystnie segment DNA jest operatywnie związany z promotorem, przy czym promotor powoduje ekspresję segmentu DNA. Również korzystnie segment kwasu nukleinowego wprowadzany jest do rekombinacyjnej komórki gospodarza. Korzystniej komórkę gospodarza stanowi komórka prokariotyczna, korzystniej komórka bakteryjna, w szczególności E. coli, B. thuringiensis, B. subtilis, B. megaterium lub Pseudomonas sp., a zwłaszcza komórka E. coli NRRL B-21364, B. thuringiensis NRRL B-21365, B. thuringiensis NRRL B-21366, lub B. thuringiensis NRRL B-21367.

Korzystnie komórkę gospodarza stanowi również komórka eukariotyczna, korzystniej komórka roślinna, w szczególności komórka kukurydzy, pszenicy, trawy darniowej, warzywa, drzewa owocowego, rośliny ozdobnej.

Korzystnie segment DNA wprowadza się do komórki przy pomocy wektora rekombinacyjnego.

Korzystnie komórka gospodarza daje ekspresję segmentu DNA z wytworzeniem białka krystalicznego lub peptydu CryET33 lub CryET34.

Korzystnie segment kwasu nukleinowego zawiera region sekwencji złożony, z co najmniej 18 kolejnych nukleotydów o tej samej sekwencji lub sekwencji komplementarnej do 18 kolejnych nukleotydów z SEKW NR ID.:1, SEKW NR ID.:2; lub z fig. 1A - 1C; albo zawiera od 18 do około 5200 nukleotydów długości i hybrydyzuje z segmentem kwasu nukleinowego z SEKW NR ID.: 1 SEKW NR ID.:2; lub z fig. 1A - 1C; lub sekwencją komplementarną, w standardowych warunkach hybrydyzacji. Korzystnie ma on od 18 do około 5200 nukleotydów długości i hybrydyzuje z segmentem kwasu nukleinowego z SEKW NR ID.:1 lub SEKW NR ID.:2; lub sekwencją do nich komplementarną, w standardowych warunkach hybrydyzacji.

Korzystnie wspomniana komórka gospodarza daje ekspresję segmentu DNA z wytworzeniem polipeptydów obejmujących SEKW NR ID.:3, SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4.

Przedmiotem wynalazku jest również Wyizolowany i oczyszczony segment DNA zawierający gen cryET33 Bacillus thuringiensis, korzystnie zawiera on ponadto sekwencję kwasu nukleinowego zasadniczo jak w SEKW NR ID.: 1.

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany i oczyszczony segment DNA zawierający gen cryET34 Bacillus thuringiensis, korzystnie zawiera on ponadto sekwencję kwasu nukleinowego zasadniczo jak w SEKW NR ID.:2.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób stosowania opisanego powyżej segmentu kwasu nukleinowego kodującego białko krystaliczne lub kombinację białek krystalicznych, obejmujący następujące etapy, w których:

(a) wytwarza się rekombinacyjny wektor, w którym segment kwasu nukleinowego umieszcza się pod kontrolą promotora;

(b) wprowadza się rekombinacyjny wektor do komórki gospodarza;

(c) hoduje się komórkę gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję wspomnianego białka krystalicznego lub białek; i (d) zbiera się uległe ekspresji białko krystaliczne lub białka.

W powyższym sposobie korzystnie jako rekombinacyjny wektor stosuje się pEG246 lub pEG1246.

189 474

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko krystaliczne CryET33 lub CryET34obejmujący e'tapy, w których:

(a) uzyskuje się próbkę kwasów nukleinowych, które mogą kodować białko krystaliczne CryET33 lub a CryET34;

(b) kontaktuje się próbkę kwasu nukleinowego z wydzielonym segmentem kwasu nukleinowego kodującym te białka krystaliczne w warunkach pozwalających na hybrydyzacje zasadniczo komplementarnych kwasów nukleinowych; i (c) wykrywa się powstałe hybrydyzowane komplementarne kwasy nukleinowe.

Korzystnie stosuje się wyizolowany segment kwasu nukleinowego kodujący wspomniane białko krystaliczne, który zawiera wykrywalny znacznik wystarczający, aby umożliwić wykrycie wspomnianych zhybrydyzowanych komplementarnych kwasów nukleinowych wytwarzanych tym sposobem.

Przedmiotem wynalazku jest tez zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego obejmujący odpowiedni pojemnik, segment kwasu nukleinowego o sekwencji SEKW NR ID.:1 lub SEKW NR ID.:2 lub sekwencji komplementarnej, albo segment kwasu nukleinowego który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym o sekwencji SEKW NR ID.:1 lub SEKW NR ID.:2 lub sekwencją do niego komplementarną i odczynnik wykrywający.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja peptydowa obejmująca białko krystaliczne CryET33 lub CryET34 zawierające 5-aminokwasową ciągłą sekwencję z SEKW NR ED.:3 lub SEKW NR ID.:4. Korzystnie kompozycja ta obejmuje peptyd zawierający sekwencję o długości 5 do około 50 aminokwasów z SEKW NR ID.:3 lub SEKW nR iD.:4. Również korzystnie kompozycja ta obejmuje peptyd zawierający sekwencję o długości 5 do około 150 aminokwasów z SEKW NR ID.:3 lub SEKW'. NR ID.:4.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest oczyszczone przeciwciało wytworzone przy użyciu jako immunogen polipeptydu obejmującego SEKWNR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wykrywania białka krystalicznego lub peptydu CryET33 lub CryET34 w biologicznej próbce obejmujący etapy, w których:

(a) uzyskuje się biologiczną próbkę mogącą zawierać białko krystaliczne lub peptyd CryET33 lub CryET34;

(b) kontaktuje się próbkę z przeciwciałem, które wiąże się z białkiem krystalicznym lub peptydem w warunkach pozwalających na tworzenie kompleksów; oraz (c) wykrywa się powstałe kompleksy.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do immunodetekcji zawierający w odpowiednim pojemniku, opisane powyżej przeciwciało oraz odczynnik immunodetekcyjny.

Przedmiotem wynalazku jest również transgeniczna roślina, która ma wstawiony w swój genom transgen kodujący białko krystaliczne lub peptyd obejmujący SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4, korzystnie transgen obejmuje SEKW NR ID.:1, SEKW NR ID.:2, albo zarówno SEKW NR ID.:1 jak i SEKW NR ID.:2.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto potomstwo opisanej powyżej rośliny transgenicznej, które zawiera transgen kodujący białko krystaliczne lub peptyd obejmujący SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4.

Przedmiotem wynalazku są również nasiona z rośliny opisanej powyżej transgenicznej zawierające transgen kodujący białko krystaliczne lub peptyd obejmujący SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4.

Przedmiotem wynalazku jest też komórka Bacillus thuringiensis wytwarzająca białko krystaliczne obejmujące SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4, korzystnie komórkę tę stanowi komórka NRRL B-21365, NRRL B-21366 lub NRRL B-21367.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto komórka Bacillus thuringiensis o numerze dostępu NRRL B-21365, jak również komórka Bacillus thuringiensis o numerze dostępu NRRL B-21366 oraz komórka Bacillus thuringiensis o numerze dostępu NRRL B-21367.

189 474

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja obejmująca od około 1% do około 50% wagowych białka lub białek kodowanych przez opisany powyżej segment kwasu nukleinowego.

Przedmiotem wynakalazku jest też kompozycja zawierająca polipeptyd, który obejmuje sekwencję aminokwasową SEKW NR ID.:3, SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4; wytworzony sposobem obejmującym etapy:

(a) hodowli komórki Bacillus thuringiensis NRRL B-21365, NRRL B-21366 lub NRRL B-21367 w warunkach pozwalających na wytworzenie polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową SEKW NR ID.:3, SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID. :4; i (b) uzyskania wspomnianych polipeptydów ze wspomnianej komórki.

Korzystnie kompozycja ta zawiera opisany powyżej polipeptyd otrzymany sposobem, którego etap b obejmuje ponadto otrzymanie wspomnianych polipeptydów w ilości pomiędzy około 1% i około 50% wagowych.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący etapy, w których:

(a) hoduje się komórkę Bacillus thuringiensis opisaną w zastrz. 46 w warunkach pozwalających skutecznie na wytworzenie białka krystalicznego lub polipeptydu obejmującego sekwencję SEKW NR ID.:3, SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4; i (b) uzyskuje się wspomniane polipeptydy z komórki.

Jak wspomniano powyżej jeden aspekt niniejszego wynalazku dotyczy nowych segmentów kwasu nukleinowego, które zawierają dwa geny 8-endotoksyny toksycznej wobec tęgopokrywych, mające sekwencje zasad i wnioskowane sekwencje aminokwasowe zilustrowane na fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C. W niniejszym opisie, geny te oznaczono cryET33 (SEKW. NR ID.:1) i cryET34 (SEKW. NR ID.:2). Gen cryET33 posiada region kodujący rozciągający się od zasad nukleotydowych 136 do 939 ukazanych w fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C, a gen cryET34 posiada region kodujący, rozciągający się od zasad nukleotydowych 969 do 1349 ukazanych w fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C.

Wnioskowaną sekwencję aminokwasową białka CryET33 (SEKW. NR ID.:3), kodowaną przez gen cryET33 od zasad nukleotydowych 136 do 939 ukazano w fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C. Wnioskowaną sekwencję aminokwasową białka CryET34 (SEKW. NR ID.:4), kodowaną przez gen cryET34 od zasad nukleotydowych 969 do 1346 ukazano także w fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C. Białka wykazują owadobójczą aktywność wobec rzędu Coleoptera, w szczególności kwieciaka bawełnowca, chrząszcza o nazwie red flour beetle oraz chrząszcza japońskiego.

Biologicznie czysta hodowla naturalnie występującej dzikiego typu komórki bakterii B. thuringiensis, szczepu EG10327, została zdeponowana 14 grudnia 1994 w Agricultural Research Culture Collection, Nothem Regional Research Laboratory (NRRL), pod numerem dostępu NRRL B-21365.

B. thuringiensis EG10327 opisano poniżej w sekcjach 5.1-5.3. B. thuringiensis EG10327 jest naturalnie występującym szczepem B. thuringiensis, który zawiera geny spokrewnione lub identyczne z genami cryET33 i cryET34 według niniejszego wynalazku. EG10327 wytwarza białka owadobójcze o 29 kDa i 14 kDa, które są spokrewnione lub identyczne z białka CryET33 i CryET34 tu ujawnionymi.

Rekombinowany wektor, zawierający oczyszczony segment kwasu nukleinowego może zawierać jeden lub oba nowe geny cryET33 i cryET34. Takie rekombinowane wektory zawierające segment według wynalazku mogą być wprowadzane do rekombinowanych komórek gospodarza, korzystnie komórek bakteryjnych.

W korzystnych postaciach realizacji, bakterią jest B. thuringiensis taka jak rekombinowany szczep EG 11402 (zdeponowany 14 grudnia 1994 w NRRL, pod numerem dostępu B-21366) opisany w przykładzie 8 oraz rekombinowany szczep EG11403 (zdeponowany 14 grudnia 1994 w NRRL, pod numerem dostępu B-21367) opisany w przykładzie 7. W innej korzystnej postaci realizacji, bakterią jest E. coli, taka jak rekombinowane szczepy EG11460

189 474 (zdeponowany 14 grudnia 1994 w NRRL, pod numerem dostępu B-21364). Wszystkie szczepy złożone w NRRL złożono w Patent Culture Collection na warunkach układu budapesztańskiego i uzyskano zaświadczenie żywotności stosownie z International Receipt Form BP/4.

Segmenty DNA cryET33 i cryET34

Opisane powyżej segmenty DNA, które można izolować z rzeczywiście każdego źródła, są pozbawione całości genomowego DNA i kodują nowe białka, polipeptydy i peptydy tu ujawnione. Segmenty DNA, kodujące te rodzaje peptydów, mogą nadawać się do kodowania białek, polipeptydów, podjednostek, domen funkcjonalnych i temu podobnych pokrewnych białkom krystalicznym lub innych nie spokrewnionych produktów genowych. Oprócz tego segmenty DNA można syntetyzować w całości in vitro przy użyciu metod dobrze znanych dla fachowca.

Gen cryET33 posiada sekwencję zasad nukleotydowych ukazaną w fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C. Gen cryET33 (SEKW. NR iD 1) koduje białko CryET33 o 29 kDa, mające sekwencję aminokwasową ukazaną w fig. 1A, fig. IB i fig. 1C (SEKW. NR ID.:3). Gen cryET34 (SEKW. NR ID.:2) koduje białko o 14 kDa CryET34, mające sekwencję aminokwasową ukazaną w fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C (SEKW. NRID.:4).

W stosowanym tu znaczeniu, termin „segment DNA” odnosi się do cząsteczki DNA, którą wyizolowano pozbawioną całego genomowego DNA poszczególnych rodzajów. Zatem, segment DNA, kodujący białko krystaliczne lub peptyd odnosi się do segmentu DNA, który zawiera białko krystaliczne, kodujące sekwencje już izolowane od, lub oczyszczone z całości genomowego DNA rodzajów, z których otrzymano segment DNA, który w danym przypadku jest genomem Gram-dodatniego rodzaju bakterii Bacillus, a w szczególności rodzajem Bacillus znanym jako B. thuringiensis. Pod terminem „segment DNA” kryją się segmenty DNA i mniejsze fragmenty takich segmentów, a także wektory rekombinowane, włączając np. plazmidy, kosmidy, fagemidy, fagi, wirusy i temu podobne.

Podobnie, segment DNA, obejmujący wyizolowany lub oczyszczony gen, kodujący białko krystaliczne odnosi się do segmentu DNA, który może obejmować oprócz sekwencji kodujących, pewne inne elementy, takie jak sekwencje regulatorowe, wyizolowanego zasadniczo od innych naturalnie występujących genów lub sekwencji kodujących białka. Z tego względu, termin „gen” stosuje się dla ułatwienia, odnosi się do jednostki kodującej funkcjonalne białko polipeptyd lub peptyd. Fachowiec zrozumie, że ten funkcjonalny termin obejmuje zarówno sekwencje genomowe, sekwencje operonowe i mniejsze sztuczne segmenty genowe, które wykazują ekspresję lub można je dostosować do ekspresji białek, polipeptydów lub peptydów.

„Wyizolowany zasadniczo od innych sekwencji kodujących” oznacza, że interesujący gen, w tym przypadku gen, kodujący bakteryjne białko krystaliczne, tworzy znaczną część regionu kodującego segmentu DNA i że segment DNA nie zawiera wielkich części naturalnie występującego kodującego DNA, tak jak wielkich fragmentów chromosomowych lub innych genów funkcjonalnych lub kodujących regionów operonowych. Oczywiście, odnosi się to do segmentu DNA jaki oryginalnie wyizolowano i nie wyłącza genów, rekombinowanych genów, syntetycznych linkerów lub regionów kodujących dodanych później do segmentu ręką człowieka.

W poszczególnych postaciach realizacji, wynalazek obejmuje wyizolowane kwasy nukleinowe i segmenty DNA, korzystnie zawarte w rekombinowanych wektorach, które kodują takie rodzaje peptydów Cry, które obejmują w swej sekwencji aminokwasowej sekwencje aminokwasową zasadniczo jaką przedłożono w SEKW. NR ID.:3 lub SEKW. NR ID.:4.

Termin „sekwencja zasadniczo jaką przedłożono w SEKW. NR ID.:3 lub SEKW. NR ID.:4” oznacza, że sekwencja zasadniczo odpowiada części sekwencji albo SEKW. NR ID.:3 albo SEKW. NR ID.:4 i posiada relatywnie kilka aminokwasów, które nie są identyczne lub są biologicznie funkcjonalnie równoważne aminokwasom każdej z tych sekwencji. Termin „biologicznie funkcjonalnie równoważne” jest dobrze rozumiany w technice i określa się go dalej szczegółowo (np. patrz „Przykładowe postacie realizacji”). W związku z tym, sekwencje, które posiadają między około 70% i około 80% lub bardziej korzystnie między około 81% i około 90% lub nawet korzystniej między około 91% i około 99% identyczności

189 474 sekwencji aminokwasowej lub równoważnika funkcjonalnego z aminokwasami SEKW. NR ID.:3 lub SEKW. NR ID.:4 będą sekwencjami „zasadniczo jakie przedłożono w SEKW. NR ID.:3 lub SEKW. NR ID.:4”.

Będzie także zrozumiałe, że sekwencje aminokwasowe lub kwasu nukleinowego mogą obejmować dodatkowe reszty, takie jak dodatkowa aminokwasy N- lub C-terminalne lub sekwencje 5' albo 3', i wciąż będą zasadniczo jak przedłożono w jednej z sekwencji ujawnionej w niniejszym, tak długo jak sekwencje odpowiadają kryteriom podłożonym powyżej, łącznie z zachowaniem biologicznej aktywności białka, gdzie bierze się pod uwagę ekspresję białka. Dodanie terminalnych sekwencji szczególnie stosuje się do sekwencji kwasu nukleinowego, który może np. obejmować różne nie kodujące sekwencje oskrzydlające część 5' lub 3' regionu kodującego lub mogą obejmować różne wewnętrzne sekwencje, to jest introny, które jak wiadomo, występują wewnątrz genów.

Segmenty kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku bez względu na długość samej sekwencji kodującej, można łączyć z innymi sekwencjami DNA, takimi jak promotory, sygnały poliadenylacji, dodatkowe miejsca enzymów restrykcyjnych miejsca wielokrotnego klonowania, inne segmenty kodujące i temu podobne, tak, że ich całkowita długość może się znacznie zmieniać. Zatem uważa się, ze można wykorzystać fragment kwasu nukleinowego o prawie każdej długości, przy czym całkowita długość jest ograniczona przez łatwość preparatyki i stosowanie w przeznaczonym protokole rekombinowanego DNA. Przykładowo, można przygotowywać fragmenty kwasu nukleinowego, które obejmują krótki sąsiadujący obszar, kodujący albo sekwencje peptydowe ujawnione w SEKW. NR ED.:3 albo SEKW. NR ID.:4, albo które są identyczne lub komplementarne z sekwencjami DNA, kodującymi każdy peptyd ujawniony w SEKW. NR ID.:3 łub SEKW. NR ID.:4, a zwłaszcza te segmenty DNA ujawnione w SEKW. NR ID.:1 lub SEKW. NR ID.:2. Przykładowo, sekwencje DNA, takie jak posiadające około 18 nukleotydów i które mają więcej niż 10 000, około 5000, około 3000, około 2000, około 1000, około 500, około 200, około 100 około 50 i około 14 par zasad długości (łącznie ze wszystkimi długościami pośrednimi) także uważa się za użyteczne.

Łatwo zrozumie się, że „długość pośrednia” w tym kontekście oznacza każdą długość między wymienionymi wielkościami, tak jak 18, 19, 20, 21, 22, 23 itd.; 30, 31, 32 itd.; 50, 51, 52, 53 itd.; 100, 101, 102, 103 itd.; 150, 151, 152, 153 itd.; łącznie ze wszystkimi liczbami całkowitymi poprzez 200-500; 500-1000; 1000-2000; 2000-3000; 3000-5000; itd.; oraz powyżej i włączając sekwencje o około 5200 nukleotydów i temu podobne.

Będzie także zrozumiałe, że ten wynalazek nie ogranicza się do poszczególnych sekwencji kwasu nukleinowego, które kodują peptydy według niniejszego wynalazku lub które kodują sekwencje aminokwasowe z SEKW. NR ID.:3 lub SEKW. NR ID.:4, łącznie z tymi sekwencjami DNA, które ujawniono szczególnie w SEKW. NR ID.:1 lub SEKW. NR ID.:2. Wektory rekombinowane i wyizolowane segmenty DNA mogą zatem w rozmaity sposób obejmować same regiony kodujące peptyd, regiony kodujące, niosące wybrane zmiany lub modyfikacje w zasadowym regionie kodującym, albo mogą one kodować większe polipeptydy, które niemniej obejmują te regiony kodujące peptydy albo mogą kodować biologicznie funkcjonalnie równoważne białka lub peptydy, które posiadają odmienne sekwencje aminokwasowe.

Segmenty DNA według niniejszego wynalazku obejmują biologicznie funkcjonalne peptydy równoważne. Takie sekwencje mogą powstawać jako konsekwencja degeneracji kodonu i równoważności funkcjonalnej, o których wiadomo, że występują naturalnie w sekwencjach kwasu nukleinowego i białek tak kodowanych. Alternatywnie, białka lub peptydy funkcjonalnie równoważne można tworzyć przez stosowanie technologii rekombinowanego DNA, w której można sztucznie budować zmiany w strukturze białek, na podstawie rozważanych właściwości zmienianych aminokwasów. Zmiany zaplanowane przez człowieka można wprowadzać poprzez stosowanie technik mutagenezy miejscowej, np. w celu wprowadzenia ulepszeń do antygeniczności białka lub aby przetestować mutanta w celu zbadania aktywności na poziomie cząsteczkowym.

Jeśli trzeba, można wytworzyć białka fuzyjne i peptydy, np. gdzie regiony kodujące peptyd są ustawione wewnątrz tej samej jednostki ekspresji z innymi białkami lub peptydami,

189 474 mającymi żądane działanie, tak jak w celu oczyszczenia lub immunodetekcji (np. białka, które można oczyszczać przez chromatografię powinowactwa i enzymatyczne znacznikowanie regionu kodującego, odpowiednio).

Za szczególnie użyteczne w niniejszym wynalazku wektory uważa się te wektory, w których część kodująca segmentu DNA, czy to kodująca białko pełnej długości czy mniejszy peptyd, umieszczona jest pod kontrolą promotora. Promotor może występować w postaci promotora naturalnie związanego z genem, kodującym peptydy według niniejszego wynalazku, jakie można otrzymać przez izolowanie sekwencji nie kodujących 5' położonych w górę od segmentu kodującego lub egzonu, np. przy użyciu kloningu rekombinacyjnego i/lub technologii PCR™, w połączeniu z kompozycjami tu ujawnionymi.

Segmenty DNA cryET33 i cryET34 jako sondy hybrydyzacji i startery

Oprócz stosowania w kierowaniu ekspresją białek krystalicznych lub peptydów według niniejszego wynalazku, sekwencje kwasu nukleinowego rozważane w niniejszym posiadają także różne inne zastosowania. Przykładowo, mają także wykorzystanie jako sondy lub startery w postaciach realizacji hybrydyzacji kwasu nukleinowego. Jako taki, uważa się, że segment kwasu nukleinowego, który posiada taką samą sekwencję lub jest komplementarny z sąsiadującym segmentem dNa o długości 14 nukleotydów o SEKW. NR ID.:1 lub SEKW. NR ID.:2 znajdzie szczególne zastosowanie. Dłuższe sąsiadujące identyczne lub komplementarne sekwencje, np. mające około 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 pz itd. (łącznie ze wszystkimi długościami pośrednimi powyżej i łącznie z sekwencją pełnej długości o 5200 par zasad) będą także mieć zastosowanie w pewnych postaciach realizacji.

Zdolność takich sond kwasu nukleinowego do specyficznej hybrydyzacji z sekwencjami, kodującymi białka krystaliczne, umożliwia stosowanie ich w detekcji obecności sekwencji komplementarnych w danej próbce. Jednakże uwidacznia się inne zastosowania, łącznie z użyciem informacji o sekwencji do wytwarzania zmutowanych rodzajów starterów do użytku w wytwarzaniu innych konstrukcji genetycznych.

Cząsteczki kwasu nukleinowego, mające regiony sekwencji, składające się z sąsiadującego obszaru nukleotydowego o 10-14, 15-20, 30, 50 lub nawet 100-200 nukleotydów lub podobne, identyczne albo komplementarne z sekwencjami DNA SEKW. NR ED.:1 lub SEKW. NR ID.:2, szczególnie bierze się pod uwagę jako sondy do użytku np. w hybrydyzacji typu Southern i Nothem. Mniejsze fragmenty znajdą generalnie zastosowanie w postaciach realizacji hybrydyzacji, gdzie długość sąsiadującego komplementarnego regionu może się zmieniać, tak jak między około 10-14 i około 100 lub 200 nukleotydów, lecz można stosować większe sąsiadujące obszary komplementarne, według długości sekwencji komplementarnych, które chce się wykrywać.

Oczywiście, fragmenty można także otrzymać innymi technikami takimi jak np. mechaniczne cięcie lub trawienie enzymami restrykcyjnymi. Małe segmenty kwasu nukleinowego lub fragmenty można łatwo wytworzyć np. przez bezpośrednią syntezę fragmentu środkami chemicznymi, co stosuje się powszechnie w automatycznym syntetyzerze oligonukleotydow. Także fragmenty można otrzymać przez stosowanie technologii reprodukcji kwasu nukleinowego, tak jak technologii PCR™ według opisów patentowych U.S. 4 683 195 i 4 683 202 (każdy załączony tu niniejszym jako odniesienie), przez wprowadzenie wybranych sekwencji do rekombinowanych wektorów w celu produkcji rekombinantów, oraz innymi technikami rekombinacji DNA generalnie znanymi fachowcom w dziedzinie biologii molekularnej.

W związku z tym, sekwencje kwasów nukleinowych według wynalazku można stosować pod względem ich zdolności do selektywnego tworzenia cząsteczek dupleksowych z komplementarnymi obszarami fragmentów DNA. W zależności od widocznego zastosowania, można chcieć wykorzystać zmienne warunki hybrydyzacji do uzyskania zmiennego stopnia selektywności sondy w kierunku sekwencji docelowej. Dla zastosowań, wymagających wysokiej selektywności, zwykle żąda się relatywnie surowych warunków wytwarzania hybryd, np. można wybrać relatywnie niskie warunki jeśli chodzi o sól i/lub wysoką temperaturę, takie jak zapewnione przez około 0,02 M do około 0,15 M NaCl w temperaturze około 50°C do około 70°C. Takie selektywne warunki tolerują małe, jeśli w ogóle, niedopasowanie między sondą i matrycą lub łańcuchem docelowym i będą szczególnie odpowiednie

189 474 do izolowania segmentów DNA, kodujących białka krystaliczne. Detekcja segmentów DNA poprzez hybrydyzację jest dobrze znane fachowcom i pouczenia zawarte w opisie patentowym U.S. nr 4 965 188 i 5 176 995 (każdy załączony w niniejszym jako odniesienie) są przykładami metod analiz hybrydyzacji. Pouczenia takie jak znalezione w tekście Maloya i in., 1993; Segala 1976; Prokopa, 1991 i Kuby'ego 1991 są szczególnie Stosowne.

Oczywiście dla pewnych zastosowań, np. gdzie żąda się wytworzenia mutantów, wykorzystujących zmutowany starter zhybrydyzowany z nicią matrycy, będącej pod spodem albo gdzie poszukuje się izolowanych sekwencji, kodujących białka krystaliczne z pokrewnych rodzajów, funkcjonalne równoważniki i temu podobne, potrzebne będą mniej surowe warunki hybrydyzacji w celu umożliwienia tworzenia się heterodupleksów. W tych warunkach, można żądać wykorzystania warunków, takich jak około 0,15 M do około 0,9 M soli w temperaturach rzędu od około 20°C do około 55°C. Można przez to łatwo identyfikować rodzaje hybrydyzujące krzyżowo, jako sygnały dodatnio hybrydyzujące w odniesieniu do hybrydyzacji kontrolnych. W każdym wypadku, docenia się generalnie, że warunki można czynić bardziej surowymi przez dodanie zwiększających się ilości formamidu, który służy do destabilizacji dupleksy hybrydy, tak samo jak podwyższona temperatura. Tak więc, warunkami hybrydyzacji można łatwo manipulować, a więc będzie to generalnie metoda wyboru w zależności od pożądanych wyników.

W pewnych postaciach realizacji, korzystne będzie wykorzystanie sekwencji kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku w połączeniu z odpowiednimi środkami, takimi jak znacznik, do określania hybrydyzacji. W dziedzinie znanych jest bardzo wiele różnych odpowiednich środków znacznikowych, łącznie z fluorescencyjnymi, radioaktywnymi, enzymatycznymi i innymi ligandami, takimi jak awidyna/biotyna, które są zdolne do wytworzenia wykrywalnego sygnału. W zalecanych postaciach realizacji, można podobnie wymagać stosowania znacznika fluorescencyjnego lub znacznika enzymatycznego, takiego jak ureaza, fosfataza alkaliczna lub peroksydaza, zamiast radioaktywnego lub innych odczynników niepożądanych dla środowiska. W przypadku znaczników enzymatycznych, znane są wskaźniki kolorymetryczne, które można wykorzystywać do zapewnienia widoczności dla oka ludzkiego albo spektrofotometrycznie, do identyfikacji specyficznej hybrydyzacji z próbkami, zawierającymi komplementarny kwas nukleinowy.

Ogólnie, uwidacznia się, że sondy hybrydyzacji tu opisane będą użyteczne zarówno jako odczynniki w hybrydyzacji w roztworze, jak również w postaciach realizacji, wykorzystujących fazę stałą. W postaciach realizacji związanych z fazą stałą, testowy DNA (łub RNA) adsorbuje się lub utrwala na wybranej macierzy lub powierzchni. Ten utrwalony kwas nukleinowy o pojedynczej nici poddaje się potem specyficznej hybrydyzacji z wybranymi sondami w żądanych warunkach. Wybrane warunki będą zależeć od poszczególnych okoliczności w oparciu o wymagane kryteria (np. w zależności od zawartości G+C, typu docelowego kwasu nukleinowego, źródła kwasu nukleinowego, wielkości sondy hybrydyzacji itd.). Po przemyciu powierzchni hybrydyzowanej tak, aby usunąć niespecyficznie związane cząsteczki sondy, wykrywa się specyficzną hybrydyzację lub nawet ocenia ilościowo za pomocą znacznika.

Rekombinowane wektory i ekspresja białek krystalicznych

W innych postaciach realizacji, uważa się, że zyska się pewne korzyści przez umieszczenie kodującego segmentu DNA pod kontrolą rekombinowanego lub heterologicznego promotora. W stosowanym tu znaczeniu, rekombinowany lub heterologiczny promotor oznacza w zamierzeniu promotor, który normalnie nie jest związany z segmentem DNA, kodującym białka krystaliczne lub peptyd w jego naturalnym środowisku. Takie promotory mogą obejmować promotory normalnie związane z innymi genami, i/lub promotorami wyizolowanymi z każdej komórki bakteryjnej, wirusowej, eukariotycznej lub roślinnej. Naturalnie, istotne będzie, aby wykorzystać promotor, który skutecznie kieruje ekspresją segmentu DNA w rodzaju komórki, organizmie lub nawet zwierzęciu wybranym do ekspresji. Użycie połączenia promotora i rodzaju komórki do ekspresji białka, jest generalnie znane fachowcom w dziedzinie biologii molekularnej, np. patrz Sambrook i in., 1989. Stosowane promotory mogą być konstytutywne lub możliwe do indukcji i można je stosować w odpowiednich warunkach do kierowania ekspresją na wysokim poziomie wprowadzonego segmentu DNA,

189 474 co jest korzystne w produkcji na wielką skalę rekombinowanych białek lub peptydów. Odpowiednimi układami promotorawymi rozważanymi do stosowania w ekspresji na wysokim poziomie są, lecz bez ograniczenia, układ wektorowy Pichia (Pharmacia lKb Biotechnology).

W połączeniu z postaciami realizacji ekspresji w celu wytworzenia rekombinowanych białek i peptydów, rozważa się, że często stosować się będzie dłuższe segmenty DNA, przy czym najbardziej zaleca się segmenty DNA, kodujące całą sekwencję peptydu. Jednakże doceni się, że użycie krótszych segmentów DNA do kierowania ekspresją peptydów krystalicznych lub epitopowych regionów zrębowych, takich jakie można stosować do utworzenia przeciwciał przeciw białkom krystalicznym, także wpadają w zakres wynalazku. Segmenty DNA, które kodują antygeny peptydowe od około 8 do około 50 aminokwasów długości lub korzystniej od około 8 do około 30 aminokwasów długości albo nawet korzystniej od około 8 do około 20 aminokwasów długości, uważa się za szczególnie korzystne. Takie epitopy peptydowe mogą być sekwencjami aminokwasowymi, które obejmują sąsiadujące sekwencje aminokwasowe z SEKW. NR ID.:3 lub SEKW. NR lD.:4.

Transgeny białek krystalicznych i rośliny transgeniczne

Opisany powyżej sposób stosowania segmentów kwasu nukleinowego może być wykorzystany do wytwarzania rośliny transgenicznej, która wykazuje ekspresję segmentu kwasu nukleinowego, kodującego nowe białko krystaliczne według niniejszego wynalazku. Sposób wytwarzania roślin transgenicznych jest dobrze znany w dziedzinie. Generalnie, sposób obejmuje transformowanie odpowiedniej komórki gospodarza segmentem DNA, który zawiera promotor operacyjnie połączony z regionem kodującym, który koduje białko krystaliczne CryET33 lub CryET34 B. thuringiensis. Taki region kodujący łączy się operacyjnie z regionem terminacji transkrypcji, przez co promotor jest zdolny do kierowania transkrypcją regionu kodującego i stąd zapewnienia komórce zdolności wytwarzania rekombinowanego białka in vivo. Alternatywnie, w wypadkach, gdzie potrzeba kontrolować, regulować lub zmniejszyć ilość poszczególnego rekombinowanego białka krystalicznego podlegającego ekspresji w poszczególnej komórce transgenicznej, wynalazek przewiduje także antysensowny mRNA dla ekspresji białka krystalicznego. Użycie antysensownego mRNA jako środka kontrolowania lub zmniejszania ilości danego interesującego białka w komórce jest dobrze znany w technice.

Jak opisano powyżej rośliny transgeniczne mogą wykazywać ekspresję genu lub segmentu genu jednego lub więcej nowych kompozycji polipeptydowych tu ujawnionych. W stosowanym tu znaczeniu, termin „roślina transgeniczna” w zamierzeniu odnosi się do rośliny, która posiada wprowadzone sekwencje DNA, łącznie, lecz bez ograniczania, z genami, które może nie występują normalnie, sekwencjami DNA, nie podlegającymi normalnie transkrypcji na RNA lub translacji na białko („ekspresja”), albo wszystkie inne geny lub sekwencje DNA, które pragnie się wprowadzić do rośliny nie transformowanej, tak jak geny, które normalnie nie występują w nie transformowanej roślinie, lecz które pragnie się wbudować sztucznie albo zmienić ekspresję.

Uważa się, że w pewnych przypadkach genom rośliny transgenicznej według niniejszego wynalazku będzie powiększony przez stabilne wprowadzenie jednego lub więcej transgenów cryET33 lub cryET34, natywnych, syntetycznie modyfikowanych albo zmutowanych. W pewnych przypadkach, będzie się wprowadzać więcej niż jeden transgen do genomu transformowanej roślinnej komórki gospodarza. Tak jest w przypadku, kiedy wprowadza się więcej niż jeden segment, kodujący białko krystaliczne do genomu takiej rośliny. W pewnych sytuacjach, pożądane będzie mieć jeden, dwa, trzy, cztery lub nawet więcej białek krystalicznych B. thuringiensis (natywnych lub zbudowanych w sposób rekombinowany) wprowadzonych i podlegających stabilnej ekspresji w transformowanej roślinie transgenicznej.

Zalecanym genem, który można wprowadzać jest np. sekwencja DNA, kodująca białko krystaliczne pochodzenia bakteryjnego, a zwłaszcza jedna lub więcej opisanych tu sekwencji, które otrzymuje się z rodzaju Bacillus. Szczególnie zaleca się sekwencje kwasu nukleinowego uzyskane z B. thuringiensis lub każdą z tych sekwencji, które zbudowano genetycznie w celu zmniejszenia lub zwiększenia aktywności owadobójczej białka krystalicznego w takiej transformowanej komórce gospodarza.

189 474

Środki do transformowania komórki roślinnej i wytwarzania linii komórek transgenicznych są dobrze znane w technice i omawiane w niniejszym. Wektory, plazmidy, kosmidy, YAC (sztuczne chromosomy drożdżowe) i segmenty dNa do użytku w transformowaniu takich komórek będą oczywiście generalnie obejmować operony, geny lub sekwencje, pochodzące od genów według niniejszego wynalazku, natywne lub syntetyczne, a zwłaszcza te, które kodują ujawnione białka krystaliczne. Te konstrukcje DNA mogą dalej obejmować struktury, takie jak promotory, wzmacniacze, polilinkery lub nawet sekwencje genowe, które posiadają dodatnią lub ujemną aktywność regulującą wobec poszczególnych interesujących genów, tak jak potrzeba. Segmenty DNA lub geny mogą kodować albo natywne albo modyfikowane białko krystaliczne, które będzie podlegać ekspresji w uzyskanych rekombinowanych komórkach, i/lub które będą nadawać ulepszony fenotyp regenerowanej roślinie.

Takie rośliny transgeniczne mogą być pożądane do zwiększania odporności owadobójczej roślin jednoliściennych lub dwuliściennych, przez wprowadzenie do takiej rośliny transgenicznego segmentu DNA, kodującego jeden lub więcej białek krystalicznych CryET33 i/lub CryET34, które są toksyczne wobec owadów tęgopokrywych. Szczególnie zalecanymi roślinami są trawy darniowe, pszenica, warzywa, rośliny ozdobne, drzewa owocowe i temu podobne.

Potomstwo i nasiona rośliny transgenicznej według wynalazku będą posiadać transgen, kodujący białko krystaliczne, stabilnie wprowadzone do swego genomu i taki rośliny potomne będą dziedziczyć cechy uzyskane przez wprowadzenie stabilnego transgenu na sposób mendlowski. Wszystkie takie rośliny transgeniczne, mające wprowadzone sekwencje DNA, kodujące jedna lub więcej białek krystalicznych CryET33 i/lub CryET34 albo polipeptydów, są aspektami tego wynalazku.

Mutageneza ukierunkowana

Mutageneza ukierunkowana jest techniką użyteczną w wytwarzaniu poszczególnych peptydów lub biologicznie funkcjonalnych równoważnych białek albo peptydów. poprzez specyficzną mutagenezę podlegającego DNA. Technika zapewnia dodatkowo gotowość do wytwarzania i testowania odmian sekwencyjnych, np. włączając jedną lub więcej z powyższych uwag, przez wprowadzenie jednej lub więcej zmian w sekwencji nukleotydowej do DNA. Mutageneza ukierunkowana pozwala na produkcję mutantów przez użycie specyficznych sekwencji oligonukleotydowych, które kodują sekwencje DNA o żądanej mutacji, jak również wystarczającą liczbę sąsiednich nukleotydów, w celu zapewnienia sekwencji starterowej o wystarczającej wielkości i kompleksowości sekwencji, aby utworzyć stabilny dupleks po obu stronach rozpatrywanego połączenia z delecją. Zazwyczaj zaleca się starter o około 13 lub około 14 lub około 16 lub około 17 i powyżej, łącznie z około 18 lub około 19 lub około 20, lub około 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 lub nawet około 30, 40 lub około 50 lub podobnych nukleotydach długości, przy czym zmienia się około 5 do 10 reszt po obu stronach łączenia sekwencji.

Generalnie, technika mutagenezy ukierunkowanej jest dobrze znana w dziedzinie, jak wymieniono przykładowo w różnych publikacjach. Jak można ocenić, technika zwykle wykorzystuje wektor fagowy, który istnieje zarówno w formie o jednej nici jak i o podwójnej nici. Typowe wektory użyteczne w mutagenezie specyficznej dla miejsca to wektory takie jak fag M13. Te fagi są łatwo dostępne w handlu i ich użycie jest generalnie dobrze znane dla fachowca. Plazmidy o podwójnej nici są także rutynowo stosowane w mutagenezie ukierunkowanej, która eliminuje etap przenoszenia będącego przedmiotem zainteresowania genu z plazmidu do faga.

Ogólnie, mutagenezę ukierunkowana, przeprowadza się najpierw przez otrzymanie wektora o pojedynczej nici lub stopienie w celu oddzielenia dwóch nici wektora o podwójnej nici, który obejmuje w swej sekwencji sekwencję DNA, kodującą żądany peptyd. Wytwarza się starter oligonukleotydowy, niosący żądaną zmutowana sekwencję, generalnie syntetycznie. Starter ten poddaje się następnie hybrydyzacji z wektorem o pojedynczej nici i poddaje się działaniu enzymów polimeryzujących, takich jak polimeraza I fragmentu Klenowa E. coli, w celu zakończenia syntezy nici, niosącej mutację. Tak więc, tworzy się heterodupleks, w którym jedna nic koduje oryginalną sekwencję nie niosącą mutacji, a druga nić niesie żądaną

189 474 mutację. Ten heterodupleksowy wektor stosuje się następnie do transformacji odpowiednich komórek, takich jak komórki E. coli, oraz wybiera się klony, które obejmują rekombinowane wektory, niosące zmutowane uszeregowanie sekwencji. Przewiduje się wytwarzanie odmian sekwencji wybranych segmentów DNA, kodujących peptyd, przy użyciu mutagenezy skierowanej miejscowo, jako środka do wytwarzania potencjalnie użytecznych rodzajów i nie oznacza ograniczania jako, że istnieją inne drogi, w których można otrzymać odmiany sekwencyjne peptydów oraz sekwencji DNa, kodujących je. Przykładowo, rekombinowane wektory, kodujące żądaną sekwencję peptydu można traktować środkami mutagennymi, takimi jak hydroksylamina, aby otrzymać odmiany sekwencyjne.

Kompozycje przeciwciała cryET33 i cryET34 oraz sposoby wykonania

W poszczególnych postaciach realizacji, twórcy rozważają użycie przeciwciał, albo monoklonalnych albo poliklonalnych, które wiążą krystaliczne białka tu ujawnione. Środki wytwarzania i charakteryzacja przeciwciał są dobrze znane w dziedzinie (patrz np. Antybodies; A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; załączony w niniejszym jako odniesienie). Metody wytwarzania przeciwciał monoklonalnych (mAb) generalnie rozpoczynają się w taki sam sposób jak metody wytwarzania przeciwciał poliklonalnych. W skrócie, przeciwciało poliklonalne wytwarza się przez immunizację zwierzęcia kompozycją immunogenną zgodnie z niniejszym wynalazkiem i zebranie surowic odpornościowych od immunizowanego zwierzęcia. Zwykle gatunkiem zwierzęcia używanym do wytwarzania surowic odpornościowych jest królik, mysz, szczur, chomik, świnka morska lub koza. Z powodu relatywnie wielkiej objętości krwi królika, do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych zaleca się królika.

Jak wiadomo w dziedzinie, dana kompozycja może mieć zmienną immunogenność. Zatem często konieczne jest pobudzić układ odpornościowy, co można osiągnąć przez sprzężenie immunogenu peptydowego lub polipeptydowego z nośnikiem. Przykładowymi i zalecanymi nośnikami są hemocyjanina doświadczalnego zapalenia stawów (KLH) i albumina surowicy bydlęcej (BSA). Inne albuminy, takie jak owoalbumina, albumina surowicy mysiej lub albumina surowicy królika, także można stosować jako nośnik. Środki do sprzęgania polipeptydu z białkiem nośnikowym są dobrze znane w technice i obejmują glutaraldehyd, ester mmaleimidobenkoilo-N-hydroksysukcynoimidowykarbodiimidowy i bis-biazz^o^w^mą benzydynę.

Jak wiadomo również w dziedzinie, immunogenność poszczególnej kompozycji immunogenowej można wzmocnić przez użycie nie specyficznych stymulatorów odpowiedzi immunologicznej, znanych jako adiuwanty. Przykładowymi i zalecanymi adiuwantami są kompletny adiuwant Freunda (nie specyficzny stymulator odpowiedzi immunologicznej, zawierający zabite Mycobacterium tuberculosis), niekompletny adiuwant Freunda oraz adiuwant wodorotlenku glinu.

Ilość kompozycji immunogennej użytej do wytworzenia przeciwciał poliklonalnych zmienia się w zależności od natury immunogenu jak również zwierzęcia użytego do immunizacji. Można stosować różne sposoby podawania immunogenu (podskórnie, domięśniowo, śródskórnie, dożylnie i dootrzewnowo). Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych można monitorować przez pobieranie próbek krwi immunizowanego zwierzęcia w różnych punktach po immunizacji. Można także podać drugą, przypominającą injekcję. Proces pobudzania i określanie miana powtarza się do uzyskania odpowiedniego miana. Gdy osiągnie się pożądany poziom immunogenności, immunizowane zwierzę można skrwawić, wyizolowuje i przechowuje surowicę i/lub zwierzę można użyć do wytwarzania mAb.

mAb można łatwo wytworzyć przez stosowanie dobrze znanych technik, takich jak wymieniona w opisie patentowym U.Ś. nr 4 196 '265, załączonym w niniejszym jako odnośnik. Zwykle technika ta obejmuje immunizację odpowiedniego zwierzęcia wybraną kompozycją immunogennią np. oczyszczonym lub częściowo oczyszczonym białkiem krystalicznym, polipeptydem lub peptydem. Kompozycję immunizującą podaje się w sposób skuteczny dla stymulacji komórek, wytwarzających przeciwciała. Gryzonie, takie jak myszy i szczury są zalecanymi zwierzętami, jednak możliwe jest także użycie komórek królika, owcy lub żaby. Użycie szczurów może zapewnić pewne korzyści (Goding, 1986, strony 60-61) lecz zaleca się

189 474 myszy, przy czym najbardziej zaleca się myszy BALB/C, jako że są one najbardziej rutynowo używane i generalnie dają największy procent stabilnych fuzji.

Po immunizacji wybiera się komórki somatyczne potencjalnie wytwarzające przeciwciała, konkretnie limfocyty B (komórki B), do użytku w protokole wytwarzania mAb. Komórki te można otrzymać z biopsji śledziony, migdałków lub węzłów chłonnych albo z próbki krwi obwodowej. Zaleca się komórki śledziony i komórki krwi obwodowej, pierwsze ponieważ są one bogatym źródłem komórek, wytwarzających przeciwciała, będących w stadium podziału plazmoblastu, a drugie ponieważ krew obwodowa jest łatwo osiągalna. Często, immunizuje się panel zwierząt i usuwa się śledzionę zwierzęcia o najwyższym mianie przeciwciał, a limfocyty śledziony uzyskuje się przez homogenizację śledziony strzykawką. Zwykle śledziona od immunizowanej myszy zawiera w przybliżeniu 5 x 107 do 2 x 10⁸ limfocytów.

Limfocyty B, wytwarzające przeciwciała od immunizowanego zwierzęcia łączy się potem z komórkami nieśmiertelnej linii szpiczaka, generalnie jednego z gatunków, jakiego zwierzę immunizowano. Linie komórkowe szpiczaka odpowiednie do użytku w procedurach fuzji, wytwarzających hybrydomy korzystnie nie wytwarzają przeciwciał, mają wysoką skuteczność fuzji i są pozbawione enzymów, które czynią je niezdolnymi do wzrostu w pewnych selektywnych pożywkach, które podtrzymują wzrost tylko pożądanych komórek fuzyjnych (hybrydą).

Można użyć każdą z licznych komórek szpiczaka, jakie są znane fachowcom (Goding, strony 65-66, 1986; Campbell, strony 75-83, 1984). Przykładowo, jeśli immunizowanym zwierzęciem jest mysz, można użyć P3-X63/Ag8, Χ.63^8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC-11-X45-GTG 1.7 i S194/5XXO Bul; dla szczurów można użyć R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F i 4B210; oraz U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 i UC729-6 są użyteczne w połączeniu z ludzkimi fuzjami komórkowymi.

Zalecaną mysią komórką szpiczaka jest linia komórkowa szpiczaka NS-1 (określana także P3-NS-1-Ag4-1), która jest łatwo dostępna zNIGMS Human Mutant Cell Repository, zamawiając numer przechowywania linii komórkowej GM3573. Inną linią komórkową szpiczaka myszy, która można stosować jest nie produkująca linia komórkowa SP2/0 szpiczaka myszy odporna na 8-azaguaninę.

Metody wytwarzania hybryd komórek śledziony lub węzłów chłonnych, wytwarzających przeciwciała oraz komórek szpiczaka, zwykle obejmują mieszanie komórek somatycznych z komórkami szpiczaka w stosunku 2:1, choć stosunek może się zmieniać od około 2:0 do około 1:1 odpowiednio, w obecności środka lub środków (chemicznych lub elektrycznych), które pobudzają fuzję błon komórkowych. Opisano metody fuzji przy użyciu wirusa Sendai (Kohler i Milstein, 1975; 1976) i stosują one glikol polietylenowy (pEg) tak jak 37% (objętościowo) PEG (Gefter i in., 1977). Stosowanie metod fuzji indukowanej elektrycznie jest także odpowiednie (Goding, 1986, strony 71-74).

Procedury fuzji zwykle wytwarzają żywe hybrydy przy niskiej częstotliwości, około 1 x 10'⁶ do 1 x 10'8. Jednakże nie stanowi to problemu, jako że żywe połączone hybrydy odróżnicowują się od rodzicielskich nie połączonych komórek (szczególnie nie połączone komórki szpiczaka, które normalnie kontynuują podział w sposób nieskończony), przez hodowlę w selektywnej pożywce. Selektywną pożywką jest generalnie taka, która zawiera środek, blokujący ponowną syntezę nukleotydów w pożywce do hodowli tkankowej. Przykładowymi i zalecanymi środkami są aminopteryna, metotreksat i azaseryna. Aminopteryna i metotreksat blokują syntezę od nowa zarówno puryn jak i pirymidyn, podczas gdy azaseryna blokuje tylko syntezę puryny. Jeśli stosuje się aminopterynę lub metotreksat, pożywkę zaopatruje się w hypoksantynę i tymidynę jako źródło nukleotydów (pożywka HAT). Jeśli stosuje się azaserynę, pożywkę zaopatruje się w hypoksantynę.

Zalecaną pożywką selektywną jest HAT. Tylko komórki zdolne do przeprowadzania szlaku regeneracji nukleotydów mogą przeżyć w pożywce HAT. Komórki szpiczaka nie posiadają kluczowych enzymów szlaku odzyskiwania, np. transferazy hipoksaritynofosforybozylowej (HPRT) i nie mogą przeżyć. Komórki B mogą przeprowadzać ten szlak, lecz mają ograniczoną długość życia w hodowli i generalnie umierają po około dwóch tygodniach. Zatem tylko komórki, które potrafią przeżyć w selektywnej pożywce są tymi hybrydami utworzonymi z komórek B i szpiczaka.

189 474

Hodowla zapewnia populację hybrydom, z których wybiera się specyficzne hybrydomy. Zwykle selekcję hybrydom przeprowadza się hodując komórki przez pojedyncze rozcieńczanie klonów w płytkach do mikromianowania, po czym przez testowanie poszczególnych supematantów klonów (po około dwa do trzech tygodni) pod względem żądanej reaktywności. Test powinien być czuły, prosty i szybki, taki jak testy radioimmunologiczne, testy immunologiczne enzymatyczne, testy cytotoksyczności, testy łysinek, testy immunowiązania z plamką i temu podobne.

Wybrane hybrydomy będzie się następnie rozcieńczać i klonować do poszczególnych linii komórkowych, wytwarzających przeciwciała, których klony można następnie namnażać w nieskończoność w celu zapewnienia mAb. Linie komórkowe można wykorzystywać do produkcji mAb na dwa podstawowe sposoby. Próbkę hybrydomy można wstrzyknąć (często do jamy otrzewnowej) zwierzęciu ze zgodnością tkankową typu, jaki użyto do dostarczenia komórek somatycznych i szpiczakowych dla początkowej fiizji. U zwierzęcia po wstrzyknięciu rozwija się guz, wydzielający specyficzne przeciwciało monoklonalne wytwarzane, przez fuzyjną hybrydę komórkową. Płyny ciała zwierzęcia, takie jak surowica, płyn puchlinowy, można potem nakłuć, aby otrzymać mAb o wysokim stężeniu. Poszczególne linie komórkowe można także hodować in vitro, jeśli mAb wydzielają się naturalnie do pożywki hodowlanej, z której można je łatwo uzyskać w wysokim stężeniu. mAb wytwarzane oboma sposobami można dalej oczyszczać, jeśli trzeba, przy użyciu filtracji, wirowania i różnych metod chromatograficznych, takich jak HPLC lub chromatografia powinowactwa.

ELISA i immunoprecypitacja

Przy realizacji praktycznej wynalazku do wykrywania białek według wynalazku można użyć testy ELISA. W teście ELlSA białka lub peptydy, obejmujące sekwencje antygenowe białek krystalicznych unieruchamia się na wybranej powierzchni, korzystnie powierzchni, wykazującej powinowactwo do białek, tak jak studzienki polistyrenowej płytki do mikromianowania. Po przemyciu w celu usunięcia nie całkowicie adsorbowanego materiału, pożądane jest związanie lub powleczenie płytki testowej nie specyficznym białkiem, o którym wiadomo, że jest obojętnie antygenowe wobec testowych surowic odpornościowych, takich jak albumina surowicy bydlęcej (BSA), kazeina lub roztwory mleka w proszku. Pozwala to na blokowanie nie specyficznych miejsc adsorpcji na unieruchamiającej powierzchni i w ten sposób zmniejsza tło powodowane przez niespecyficzne wiązanie surowic odpornościowych na powierzchni.

Po związaniu materiału antygenowego ze studzienką, powleczenie materiałem nie reaktywnym w celu zredukowania tła, oraz przemyciu w celu usunięcia nie związanego materiału, powierzchnię unieruchamiającą kontaktuje się z surowicami odpornościowymi lub testowanymi ekstraktami klinicznymi lub biologicznymi, w sposób sprzyjający tworzeniu się kompleksów immunologicznych (antygen/przeciwciało). Takie warunki obejmują korzystnie rozcieńczanie surowic odpornościowych, takich jak BSA, gamma globulina bydlęca (BGG) oraz sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)/Tween . Te dodane środki mają także tendencję do redukowania nie specyficznego tła. Nawarstwione surowice odpornościowe pozostawia się następnie do inkubacji przez od około 2 do około 4 godzin, w temperaturze korzystnie rzędu około 25°C do około 27°C. Po inkubacji, powierzchnię zetkniętą z surowicami odpornościowymi przemywa się w celu usunięcia materiału nie tworzącego kompleksów immunologicznych. Zalecana procedura przemywania obejmuje przemycie roztworem, takim jak PBS/Tween® lub bufor boranowy.

Po utworzeniu się specyficznych kompleksów immunologicznych między próbką testową i związanym antygenem, oraz kolejnym przemyciu, można określić występowanie a nawet ilość utworzonych kompleksów immunologicznych przez poddanie ich działaniu drugiego przeciwciała, mającego specyficzność wobec pierwszego. Aby zapewnić środki wykrywające, drugie przeciwciało będzie korzystnie posiadać towarzyszący enzym, który wytworzy wywołanie barwy po inkubacji z odpowiednim substratem chromogennym. Tak więc, np. można wymagać zetknięcia i inkubacji powierzchni ze związanymi surowicami odpornościowymi z anty-ludzką IgG sprzężoną z ureazą lub peroksydazą przez okres czasu w warunkach, które

189 474 sprzyjają wywołaniu tworzenia się kompleksu immunologicznego (np. inkubacji przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w roztworze, zawierającym PBS, takim jak PBS Tween®).

Po inkubacji z drugim przeciwciałem znakowanym enzymatycznie i kolejnym przemyciu w celu usunięcia nie związanego materiału, określa się ilościowo ilość znacznika przez inkubację z substratem chromogennym, takim jak mocznik i purpura bromokrezolowa lub kwas 2,2'-azyno-di-(3-etylobenzotiazolino)-6-sulfonowy (ABTS) oraz H 2O2, w wypadku peroksydazy jako znacznika enzymatycznego. Następnie uzyskuje się ocenę ilościową przez pomiar stopnia wytworzenia barwy, np. przy użyciu spektofotometru widocznego widma.

Przeciwciała przeciw białkom krystalicznym według niniejszego wynalazku są szczególnie użyteczne do izolacji innych antygenów białek krystalicznych przez immunoprecypitację. Immunoprecypitacja obejmuje separację docelowego składnika antygenowego z mieszaniny kompleksu i stosuje się ją do rozróżnienia lub rozdzielenia znikomych ilości białka. W celu izolacji białek błonowych komórki muszą być rozpuszczone do miceli detergentowych. Zaleca się sole niejonowe, ponieważ inne środki, takie jak sole żółciowe, wytrącają się przy pH kwasowym lub w obecności kationów diwartościowych.

W alternatywnej postaci realizacji przeciwciała według niniejszego wynalazku są użyteczne do bliskiego umieszczania obok siebie dwóch antygenów Jest to szczególnie użyteczne przy zwiększaniu miejscowego stężenia antygenów, np. par enzym-substrat.

Hybrydyzacja typu Western

Kompozycje według niniejszego wynalazku znajdą wielkie zastosowanie w analizie odcisku immunologicznego lub hybrydyzacji typu western. Przeciwciał anty-peptydowych można użyć jako pierwotnych odczynników o wysokim powinowactwie do identyfikacji białek unieruchomionych na macierzy stałego podłoża, takiego jak nitroceluloza, nylon lub ich połączenie. W połączeniu z immunoprecypitacją, po elektroforezie żelowej można je użyć jako odczynników jednoetapowych do wykrywania antygenów przeciw, którym odczynniki wtórne użyte w wykrywaniu antygenów·, powodują niekorzystne tło. Jest to zwłaszcza użyteczne, gdy badane antygeny są immunoglobulinami (wykluczając użycie składników bakteryjnej ściany komórkowej, wiążącej immunoglobuliny), badane antygeny reagują krzyżowo z wykrywanym środkiem lub migrują przy takim samym relatywnym ciężarze cząsteczkowym jako sygnał reakcji krzyżowej.

Metody wykrywania na bazie immunologicznej do użytku w połączeniu z Western blotting, obejmują wtórne przeciwciała znakowane enzymatycznie, radiologicznie lub fluorescencyjnie, przeciw cząstce toksyny, uważa się za szczególnie użyteczne pod tym względem.

Skrining białek krystalicznych i zestawy do wykrywania

Niniejszy wynalazek obejmuje sposoby i zestawy do wykrywania białek w próbkach biologicznych, które uważa się za zawierające białka krystaliczne lub polipeptydy pokrewne białkom krystalicznym, albo komórek, wytwarzających takie polipeptydy. Zestaw może zawierać jedno lub więcej przeciwciał według niniejszego wynalazku i może także zawierać odczynnik(i) do wykrywania interakcji między próbką i przeciwciałem według niniejszego wynalazku. Dostarczony odczynnik(i) może być znakowany radiologicznie, fluorescencyjnie lub enzymatycznie. Zestaw może zawierać znany radioznakowany środek zdolny do wiązania lub interakcji z kwasem nukleinowym lub przeciwciałem według niniejszego wynalazku.

Odczynnik(i) zestawu można zapewnić w postaci płynnego roztworu, dołączonej do stałego podłoża lub w postaci wysuszonego proszku. Korzystnie, jeśli odczynnik(i) zapewnia się w postaci przyłączonej do stałego podłoża, stałe podłoże może być środowiskiem chromatografii, płytką testową, mającą wiele studzienek albo szkiełko mikroskopowe. Jeśli odczynnik(i) zapewnia się w postaci suchego proszku, proszek można odnawiać przez dodanie odpowiedniego rozpuszczalnika, który można dostarczyć.

W jeszcze dalszych postaciach realizacji, niniejszy wynalazek obejmuje sposoby immunodetekcji i związane zestawy. Proponuje się, aby białka krystaliczne lub peptydy według niniejszego wynalazku można było stosować do wykrywania przeciwciał, mających aktywność wobec nich, albo alternatywnie, przeciwciała wytworzone zgodnie z niniejszym wynalazkiem można stosować do wykrywania białek krystalicznych lub peptydów, zawierających epitop pokrewny białkom krystalicznym. Ogólnie sposoby te będą obejmować po pierwsze

189 474 otrzymywanie próbki podejrzanej o to, że zawiera takie białko, peptyd lub przeciwciało, zetknięcie próbki z przeciwciałem lub peptydem według niniejszego wynalazku, zgodnie z zaistniałym przypadkiem, w warunkach skutecznie pozwalających na utworzenie się kompleksu immunologicznego, a następnie wykrywanie obecności kompleksu immunologicznego.

Ogólnie, wykrywanie tworzenia się kompleksu immunologicznego jest całkiem dobrze znane w dziedzinie i można je osiągnąć przez stosowanie licznych prób. Przykładowo, niniejszy wynalazek rozważa zastosowanie technik ELISA, RLA, odcisku immunologicznego (np. dot błot), pośrednich technik immunofluorescencji i temu podobne. Generalnie, tworzenie się kompleksu immunologicznego będzie się wykrywać stosując znacznik, taki jak radioznacznik lub znacznik enzymatyczny (taki jak fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa lub inne). Oczywiście, można znaleźć dodatkowe korzyści stosując wtórne ligandy wiążące, takie jak drugie przeciwciało lub uporządkowanie, wiążące ligand biotyna/awidyna, znane w dziedzinie.

W celach testowych, proponuje się, aby w rzeczywistości można było wykorzystać każdą próbkę podejrzaną o to, że zawiera albo białko krystaliczne albo peptyd albo peptyd pokrewny białku krystalicznemu, jakie chce się wykrywać w zaistniałym przypadku. Uważa się, że takie postacie realizacji mogą mieć zastosowanie w mianowaniu próbek antygenu lub przeciwciała, w selekcji hybrydom, i innych. W pokrewnych postaciach realizacji, niniejszy wynalazek przewiduje wytwarzanie zestawów, które można wykorzystać do wykrywania obecności białek krystalicznych lub pokrewnych peptydów i/lub przeciwciał w próbce. Próbki mogą obejmować komórki, supernatanty komórek, ekstrakty komórkowe, frakcje enzymów, ekstrakty białek lub inne kompozycje pozbawione komórek podejrzane o to, że zawierają krystaliczne białka albo peptydy. Ogólnie mówiąc, zestawy opisane powyżej będą obejmować odpowiednie białko krystaliczne, peptyd lub przeciwciało skierowane przeciw takiemu białku lub peptydowi, razem z odczynnikiem do immunodetekcji i środkami, zawierającymi przeciwciało lub antygen i odczynnik. Odczynnik do immunodetekcji będzie zwykle obejmować znacznik związany z przeciwciałem lub antygenem, albo związanym z wtórnym ligandem wiążącym. Przykładami ligandów mogą być wtórne przeciwciało skierowane przeciw pierwszemu przeciwciału albo antygen lub ligand biotynowy lub awidynowy (albo streptoawidynowy), mający towarzyszący znacznik. Oczywiście, jak zauważono powyżej, liczne przykładowe znaczniki są znane w technice i wszystkie takie znaczniki można wykorzystać zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Pojemnik będzie generalnie obejmował fiolkę, w której umieszcza się przeciwciało, antygen lub odczynnik do detekcji, i korzystnie odpowiednio odmierzony w równych ilościach. Zestawy według niniejszego wynalazku będą także zwykle obejmować środki, zawierające pojemniki z przeciwciałem, antygenem i odczynnikiem ścisłym zamknięciu do sprzedaży komercyjnej. Takie pojemniki mogą obejmować plastikowe pojemniki wykonane przez wtryśnięcie lub wytłaczane z wydmuchiwaniem, w których przechowuje się odpowiednie fiolki.

Epitopowe sekwencje zrębowe

Opisane powyżej białka lub kompozycje peptydowe, pozbawione całych komórek i innych peptydów mogą zawierać oczyszczone białko lub peptyd, zawierający epitop immunologicznie reaktywny krzyżowo z jednym lub więcej przeciwciał przeciw białkom krystalicznym, w szczególności epitopowe sekwencje zrębowe pochodzące od białek lub peptydów Cry.

W stosowanym tu znaczeniu, określenie „obejmujące epitop(y) immunologicznie reaktywne krzyżowo z jednym lub więcej przeciwciał przeciw białkom krystalicznym” w zamierzeniu oznacza antygen peptydowy lub białkowy, który obejmuje strukturę pierwszorzędową, drugorzędową, lub trzeciorzędową podobną do epitopu położonego wewnątrz białka lub polipeptydu krystalicznego. Poziom podobieństwa będzie generalnie do takiego stopnia, że przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne skierowane przeciw białku krystalicznemu lub polipeptydowi będą się także wiązać, reagować lub w inny sposób rozpoznawać reaktywny krzyżowo antygen peptydowy lub białkowy. Można wykorzystywać różne metody immunotestów w połączeniu z takimi przeciwciałami, tak jak np. Western blotting, ELISA, RIA i temu podobne, z których wszystkie są znane fachowcom.

189 474

Identyfikacja epitopów immunodominanty Cry i/lub ich funkcjonalnych równoważników, odpowiednia do stosowania w szczepionkach, jest stosunkowo prostą sprawą. Przykładowo, można wykorzystać metody Hoppa, jak uczy w opisie patentowym U.S. nr 4 554 101 załączonym tu niniejszym jako odniesienie, który opisuje identyfikację i wytwarzanie epitopów z sekwencji aminokwasowych na podstawie hydrofilności. Metody opisane w kilku innych publikacjach oraz oparte o nie programy komputerowe także można stosować do identyfikacji epitopowych sekwencji zrębowych (patrz np. Jameson i Wolf, 1988; Wolf i in., 1988; opis patentowy U.S. nr 4 554 101). Sekwencję aminokwasową tych „epitopowych sekwencji zrębowych” można następnie łatwo wprowadzić do peptydów, albo przez stosowanie syntezy peptydu albo technologię rekombinacji.

Zalecane peptydy do użytku według niniejszego wynalazku będą generalnie rzędu około 8 do około 20 aminokwasów długości, a korzystniej około 8 do około 15 aminokwasów długości. Uważa się, że krótsze antygenne peptydy pochodne białek krystalicznych będą korzystniejsze w pewnych okolicznościach np. w sporządzaniu immunologicznych testów do wykrywania. Przykładowe zalety obejmują łatwość sporządzania i oczyszczania, stosunkowo niski koszt i ulepszoną reprodukcyjność wytwarzania oraz korzystny rozkład biologiczny.

Uważa się, że poszczególne zalety niniejszego wynalazku można realizować przez wytwarzanie syntetycznych peptydów; które obejmują modyfikowane i/lub rozszerzone sekwencje zrębowe epitopowe/immunogeniczne, które dają „uniwersalny” peptyd epitopowy skierowany wobec białek krystalicznych oraz poszczególne sekwencje Cry i pokrewne Cry. Te epitopowe sekwencje zrębowe identyfikuje się w niniejszym w poszczególnych aspektach jako regiony hydrofilowe poszczególnych antygenów polipeptydowych. Uważa się, że regiony te reprezentują takie, które najbardziej prawdopodobnie pobudzają stymulację komórek B i komórek T, i stąd wzbudzają wytwarzanie specyficznych przeciwciał.

Epitopowa sekwencja zrębowa, jak stosuje się w niniejszym, posiada stosunkowo krótką rozciągłość aminokwasów tak, że jest „komplementarna” a przez to będzie się wiązać z miejscami wiązania antygenu na przeciwciałach skierowanych przeciw białkom krystalicznym ujawnionym w niniejszym. Dodatkowo lub alternatywnie, epitopowa sekwencja zrębowa jest taka, że wzbudza przeciwciała, które reagują krzyżowo z przeciwciałami skierowanymi przeciw kompozycjom peptydowym według niniejszego wynalazku. Będzie zrozumiałe, że w kontekście niniejszego opisu, termin „komplementarna” odnosi się do aminokwasów lub peptydów, które wykazują siłę przyciągania jeden do drugiego. Tak więc, pewne epitopowe sekwencje zrębowe według niniejszego wynalazku można operacyjnie określić w kategoriach ich zdolności do współzawodniczenia lub może zamiany wiązania żądanego białkowego antygenu z odpowiadającymi surowicami odpornościowymi skierowanymi ku białkom.

Ogólnie, wielkość antygenu polipeptydowego nie jest uznawana za szczególnie decydującą tak długo jak jest, co najmniej wystarczająco duża, aby nieść zidentyfikowaną sekwencję lub sekwencje zrębowe. Najmniejsza użyteczna sekwencja zrębowa brana pod uwagę przez niniejszy opis będzie generalnie rzędu około 8 aminokwasów długości, przy czym bardziej zaleca się sekwencje rzędu 10 do 20 aminokwasów Tak więc, ta wielkość będzie generalnie odpowiadać najmniejszym antygenom peptydowym wytworzonym według wynalazku. Jednakże wielkość antygenu może być większa jeśli trzeba, dopóki zawiera podstawową epitopową sekwencję zrębową.

Identyfikacja epitopowych sekwencji zrębowych jest znana fachowcom, np. opisano ją w opisie patentowym U.S nr 4 554 101 załączonym w niniejszym jako odniesienie, który opisuje identyfikację i wytwarzanie epitopów z sekwencji aminokwasowych na podstawie hydrofilności. Ponadto, dostępne są liczne programy komputerowe do użytku w przewidywaniu części antygenowych białek (patrz np. Jameson i Wolf, 1988; Wolf i in., 1988). Programy komputerowe do analizy sekwencji peptydów (np. program DNAStar®, DNAStar Inc., Madison, WI) może być także użyteczny w planowaniu peptydów syntetycznych według niniejszego opisu.

Syntezy sekwencji epitopowych lub peptydów, które obejmują epitop antygenu w swej sekwencji, są łatwo osiągalne przy użyciu konwencjonalnych technik syntezy, takich jak metoda fazy stałej (np. przez zastosowanie komercyjnie dostępnego syntetyzera, takiego jak

189 474

Applied Biosystems Model 430A Peptide Sythesizer). Antygeny peptydowe syntetyzowane w ten sposób można następnie podzielić na równe wcześniej ustalone ilości i przechowywać w konwencjonalny sposób, taki jak w postaci roztworów wodnych lub nawet korzystnie, w proszku lub stanie liofilizowanym, do użycia.

Generalnie, z powodu relatywnej stabilności peptydów, można je łatwo przechowywać w roztworach wodnych przez dość długie okresy czasu, jeśli trzeba, np. do sześciu miesięcy lub dłużej, w właściwie każdym roztworze wodnym bez widocznego rozkładu lub utraty aktywności antygenicznej. Jednakże, jeśli bierze się pod uwagę przedłużone przechowywanie roztworu wodnego, pożądane będą generalnie środki, obejmujące bufory takie, jak Tris lub bufory fosforanowe, aby utrzymać pH około 7,0 do około 7,5. Ponadto, mogą być pożądane środki, które hamują wzrost drobnoustrojów, takie jak azydek sodu lub Merthiolate. Dla przedłużonego przechowywania w stanie uwodnionym, będzie pożądane przechowywać roztwory w temperaturze około 4°C lub korzystniej zamrożone, oczywiście, jeśli peptydy przechowuje się w stanie liofilizowanym lub sproszkowanym, można je przechowywać całkiem nieskończenie np. w odmierzonych równych ilościach, które można ponownie uwodnić wcześniej określoną ilością wody (korzystnie destylowanej) lub buforem przed użyciem.

Biologicznie funkcjonalne równoważniki

Można przeprowadzać modyfikacje i zmiany w strukturze peptydów według niniejszego wynalazku oraz segmentów DNA, które je kodują i wciąż otrzymywać funkcjonalną cząsteczkę, która koduje białko lub peptyd o pożądanej charakterystyce. To co następuje jest omówieniem na podstawie zmian aminokwasów białka, w celu utworzenia równoważników lub nawet ulepszonych cząsteczek drugiej generacji. W poszczególnych postaciach realizacji wynalazku, zmutowane białka krystaliczne uważa się za użyteczne do zwiększania aktywności owadobójczej, a w konsekwencji zwiększania aktywności owadobójczej i/lub ekspresji rekombinowanego transgenu w komórce roślinnej. Zmiany aminokwasów można uzyskać przez zmianę kodonów sekwencji DNA, zgodnie z kodonami podanymi w tabeli 2.

Tabela 2

Aminokwasy	Kodony
1	2
Alanina Ala A	GCA GCC GCG GCU
Cysteina Cys C	UGC UGU
Kwas asparaginowy Asp D	GAC GAU
Kwas glutaminowy Glu E	GAA GAG
Fenyloalanina Phe F	UUC UUU
Glicyna Gly G	GGA GGC GGG GGU
Histydyna His H	CAC CAU
Izoleucyna Ile I	AUA AUC AUU
Lizyna Lys K	AAA AAG
Leucyna Leu L	UUA UUG CUA CUG CUU

189 474

c.d. tabeli 2

1	2
Metionina	Met M	AUG
Asparagina	Asn N	AAC AAU
Prolina	Pro P	CCA	CCC CCG CCU
Glutamina	GlnQ	CAA	CAG
Arginina	Arg R	AGA	AGG CGA CGC CGG CGU
Seryna	SerS	AGC	AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina	ThrT	ACA	ACC ACG ACU
Walina	Val V	GUA	GUC GUG GUU
Tryptofan	Trp W	UGG
Tyrozyna	Tyr Y	UAC	UAU

Przykładowo, pewne aminokwasy można podstawiać innymi aminokwasami w strukturze białka bez widocznej utraty zdolności interaktywnego wiązania z strukturami takimi jak np. regiony wiązania antygenu lub miejsca wiązania na cząsteczce substratu. Ponieważ jest to zdolność interaktywna i natura białka, która określa biologiczną funkcjonalną aktywność białka, można wykonać pewne substytucje w sekwencji aminokwasowej i oczywiście w podlegającej kodującej sekwencji DNA, i niemniej otrzymać białko z podobnymi właściwościami. Wynalazcy uważają zatem, że można przeprowadzić różne zmiany w sekwencjach białka ujawnionych kompozycji lub odpowiadających sekwencjach DNA, które kodują wymienione peptydy bez widocznej utraty biologicznej zdolności i aktywności.

Przy przeprowadzaniu takich zmian może być istotny indeks hydropatyczny aminokwasów. Istotność indeksu hydropatycznego aminokwasów w nadawaniu białkom interaktywnej funkcji biologicznej jest ogólnie rozumiany w technice (Kyte i Doolittle, 1982, załączone w niniejszym jako odnośnik). Akceptuje się, że relatywny charakter hydropatyczny aminokwasu nadaje otrzymanemu białku strukturę dmgorzędową, która odwrotnie określa interakcję białka z innymi cząsteczkami, np. enzymami, substratami, receptorami, DNA, przeciwciałami, antygenami i temu podobnymi.

Każdy aminokwas posiada indeks hydropatyczny na podstawie ich hydrofobowości i charakterystyki ładunku (Kyte i Doolittle, 1982), są to: izoleucyna (+4,5); walina (+4,2); leucyna (+3,8); fenyloalanina (+2,8); cysteina/cystyna (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicyna (-0,4); treonina (-0,7); seryna (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrozyna (-1,3); prolina (-1,6); histydyna (-3,2); glutaminian (-3,5); glutamina (-3,5); asparaginian (-3,5); asparagina (-3,5); lizyna (-3,9) i arginina (-4,5).

Wiadomo w dziedzinie, że pewne aminokwasy można podstawiać innymi aminokwasami, mającymi podobny indeks hydropatyczny lub wynik i wciąż dają białko o podobnej aktywności biologicznej, to jest wciąż otrzymuje się biologicznie funkcjonalny równoważnik białka. Wykonując te zmiany zaleca się substytucję aminokwasów, których indeksy hydropatyczne wynoszą ±2, szczególnie zaleca się te, których indeksy hydropatyczne wynoszą ±1 i nawet bardziej szczegółowo zaleca się te z indeksem ±0,5.

Rozumie się także w dziedzinie, że substytucje podobnych aminokwasów można wykonać skutecznie na podstawie hydrofilności. Opis patentowy U.S. nr 4 554 101 załączony w niniejszym jako odniesienie, stanowi, że największa lokalna średnia hydrofilność białka, na jaką wpływa hydrofilność sąsiednich aminokwasów, koreluje z biologiczną własnością białka.

189 474

Jak wyszczególniono w opisie patentowym U.S. nr 4 554 101, następujące wartości hydrofilności przyporządkowano resztom aminokwasowym: arginina (+3,0); lizyna (+3,0); Asparaginian (+3,0+1); glutaminian (+3,0+1); seryna (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicyna (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5+1); alanina (-0,5); histydyna (-0,5); cysteina (-0,1); metionina (-1,3)' walina (-1,5); leucyna (-1,8); izoleucyna (-1,8); tyrozyna (-2,3); fenyloalanina (-2,5); tryptofan (-3,4).

Rozumie się, że aminokwas można podstawić innym, mającym podobną wartość hydrofilności i wciąż otrzymać biologiczny równoważnik, a zwłaszcza immunologiczny równoważnik białka. W takich zmianach, zaleca się substytucję aminokwasu, którego wartości hydro filności mieszczą się w ±2, szczególnie zaleca się te, których wartości mieszczą się w ±1, a szczególniej zaleca się te, których wartości mieszczą się w ±0,5.

Jak zaznaczono powyżej, substytucje aminokwasowe generalnie opierają się o wzajemne podobieństwo podstawników bocznych łańcuchów aminokwasowych, np. ich hydrofobowość, hydrofilność, ładunek, wielkość i inne. Przykładowe podstawniki, które przyjmują różne z powyższych cech, są dobrze znane fachowcom i obejmują: argininę i lizynę, glutaminian i asparaginian; serynę i treoninę; glutaminę i asparaginę; oraz walinę, leucynę i izoleucynę.

Kompozycje białka krystalicznego jako środki owadobójcze oraz sposoby zastosowania

Twórcy uważają, że kompozycje białka krystalicznego tu ujawnione znajdą szczególne zastosowanie jako środki owadobójcze do stosowania miejscowego i/lub układowego na pola uprawne, trawy, owoce i warzywa oraz rośliny ozdobne. Kompozycja biologicznego środka owadobójczego może obejmować zawiesinę komórek bakteryjnych w płynnym oleju, która wykazuje ekspresję nowych białek krystalicznych tu ujawnionych. Korzystnie komórkami są komórki B. thuringiensis EG 10327, jednakże każdą bakteryjną komórkę gospodarza, wykazującą ekspresję nowych segmentów kwasu nukleinowego tu ujawnionych i wytwarzającą białko krystaliczne, uważa się za użyteczną, tak jak B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli lub Pseudomonas spp.

Kompozycja biologicznego środka owadobójczego może obejmować granule możliwe do rozpraszania w wodzie. Ten granulat zawiera komórki bakteryjne, które wykazują ekspresję nowych białek krystalicznych ujawnionych w niniejszym. Zalecanymi komórkami bakteryjnymi są B. thuringiensis EG10327, jednakże bakterie, takie jak komórki B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli lub Pseudomonas spp: transformowane segmentem DNA tu ujawnionym i wykazujące ekspresję białka krystalicznego, także uważa się za użyteczne.

Kompozycja biologicznego środka owadobójczego może również obejmować proszek do zwilżania, pył, granulki lub koncentrat koloidalny. Ten proszek zawiera komórki bakteryjne, które wykazują ekspresję nowych białek krystalicznych tu ujawnionych. Zalecanymi komórkami bakteryjnymi są B. thuringiensis EG10327, jednakże bakterie, takie jak komórki B. thuringiensis, B.megaterium, B.subtilis, E.coli lub Pseudomonas spp. transformowane segmentem DNA ujawnionym w niniejszym i wykazujące ekspresję białka krystalicznego, także uważa się za użyteczne. Takie suche postacie kompozycji owadobójczych można tak preparować, aby rozpuszczały się zaraz po zwilżeniu, albo alternatywnie, rozpuszczały się uwalniając w sposób kontrolowany, przedłużony albo inny sposób zależny od czasu.

Biologiczne kompozycje owadobójcze mogą też obejmować zawiesinę wodną komórek bakteryjnych, takich jak opisane powyżej, które wykazują ekspresję białka krystalicznego. Takie zawiesiny wodne można zapewnić w postaci stężonego roztworu podstawowego, który rozcieńcza się przed stosowaniem, albo alternatywnie w postaci rozcieńczonego roztworu gotowego do stosowania.

Dla tych sposobów związanych ze stosowaniem komórek bakteryjnych, gospodarza komórkowego, zawierający geny białka krystalicznego można hodować w każdej dogodnej pożywce hodowlanej, gdzie konstrukcja DNA dostarcza selektywne korzyści, zapewniając dzięki selektywnej pożywce, że zasadniczo wszystkie lub wszystkie komórki zachowują gen B. thuringiensis. Następnie komórki te można zebrać zgodnie z konwencjonalnymi metodami, alternatywnie, komórki można traktować przed zbiorem.

Jeśli kompozycje owadobójcze obejmują nieuszkodzone komórki B. thuringiensis, wykazujące ekspresję będącego przedmiotem zainteresowania białka, takie bakterie można

189 474 preparować rozmaitymi metodami. Można je wykorzystać w postaci proszków możliwych do zwilżenia, granulek lub pyłów, przez mieszanie z różnymi materiałami obojętnymi, takimi jak minerały nieorganiczne (filokrzemiany, węglany, siarczany, fosforany i inne) lub materiały botaniczne (sproszkowane kaczany kukurydzy, łuski ryżowe, skorupy orzechów włoskich i inne). Preparaty mogą zawierać adiuwanty ułatwiające rozpraszanie i przyleganie, środki stabilizujące, inne dodatki szkodnikobójcze lub środki powierzchniowo czynne. Preparaty płynne mogą być na bazie wodnej lub nie wodne i można je stosować w postaci pianek, zawiesin, koncentratów możliwych do emulgacji i temu podobnych. Składniki mogą obejmować środki reologiczne, środki powierzchniowo czynne, emulgatory środki rozpraszające lub polimery.

Alternatywnie, nowe białka CryET33 i/lub CryET34 można wytwarzać przez natywne lub rekombinowane bakteryjne układy ekspresji in vitro i izolować do następnego stosowania na polu. Takie białko może występować w postaci nie przetworzonych lizatów komórkowych, zawiesin, koloidów itd. albo alternatywnie można je oczyszczać, rafinować, buforować i/lub dodatkowo obrabiać przed wytworzeniem w aktywny biologicznie preparat owadobójczy. Podobnie, w pewnych okolicznościach może być pożądane wyizolowanie kryształów i/lub przetrwalników z hodowli bakteryjnych, wykazujących ekspresję białka krystalicznego i stosować roztwory, zawiesiny lub preparaty koloidalne takich kryształów i/lub przetrwalników w postaci aktywnej biologicznej kompozycji owadobójczej.

Bez względu na metodę stosowania, ilość składnika(ów) aktywnego stosuje się jako ilość skuteczną owadobójczo, i będzie się ona zmieniać w zależności od takich czynników jak np. konkretny kontrolowany owad tęgopokrywy, konkretna roślina lub uprawa do traktowania, warunki środowiskowe oraz metoda, tempo i ilość stosowania kompozycji aktywnej owadobójcze.

Opisane kompozycje można wykonać przez preparowanie albo komórek bakteryjnych, kryształów i/lub zawiesiny przetrwalników, albo wyizolowanego składnika białkowego z pożądanym nośnikiem dopuszczalnym w rolnictwie. Kompozycje można preparować przed podaniem w odpowiednich środkach, takich jak liofilizowanym, wysuszonym z zamrożeniem, desykowanym lub wodnym nośniku, pożywce albo stosownym rozcieńczalniku, takim jak sól fizjologiczna lub inny bufor. Utworzone kompozycje mogą występować w postaci pyłu lub materiału granulowanego lub zawiesiny w oleju (roślinnym lub mineralnym) albo wodzie lub emulsjach woda/olej, albo w postaci zwilżalnego proszku, albo w połączeniu z każdym innym materiałem nośnym odpowiednim do stosowania w rolnictwie. Odpowiednie nośniki rolnicze są dobrze znane w technice. Termin „nośnik dopuszczalny w rolnictwie” oznacza wszystkie adiuwanty, np. obojętne składniki, środki rozpraszające, środki powierzchniowo czynne, lepiszcza, środki wiążące itd., które zazwyczaj stosuje się w technologii wytwarzania środków owadobójczych; są one dobrze znane fachowcom od preparatów owadobójczych. Preparaty można mieszać z jednym lub więcej stałych lub płynnych adiuwantów i sporządzać różnymi sposobami, np. przez mieszanie homogeniczne, mieszanie, i/lub mielenie kompozycji owadobójczej z odpowiednimi adiuwantami przy użyciu konwencjonalnych technik układania.

Kompozycje według tego wynalazku stosuje się w środowisku docelowego owada tęgopokrywego, zazwyczaj na ulistnienie rośliny lub upraw, które chce się zabezpieczyć, konwencjonalnymi metodami, korzystnie przez oprysk. Moc i czas trwania stosowania środka owadobójczego wyreguluje się naturalnie w zależności od warunków specyficznych dla poszczególnego traktowanego szkodnika(ów), uprawy i poszczególnych warunków środowiskowych. Udział proporcjonalny składnika aktywnego do nośnika będzie naturalnie zależeć od natury chemicznej, rozpuszczalności i stabilności kompozycji owadobójczej, jak również od poszczególnego rozważanego preparatu.

Inne techniki stosowania, np. rozpylanie, zraszanie, namaczanie, nastrzykiwanie gleby; powlekanie nasion, opryskiwanie, aeracja, stosowanie mgły, rozpylanie atomizerem i temu podobne są także możliwe i mogą być wymagane w pewnych okolicznościach, takich jak owady, które roją się w korzeniach lub łodydze, albo do stosowania na delikatne rośliny lub rośliny ozdobne. Te procedury stosowania są także dobrze znany fachowcom.

189 474

Kompozycje według wynalazku można wykorzystywać również w sposobie według wynalazku pojedynczo lub w połączeniu z innymi związkami, łącznie i bez ograniczenia z innymi pestycydami. Sposób według wynalazku można także stosować w połączeniu z innymi sposobami traktowania, takimi jak środki powierzchniowo czynne, detergenty, polimery lub preparaty uwalniające się w czasie. Kompozycję owadobójczą według niniejszego wynalazku można układać do stosowania układowego albo miejscowego.

Stężenie kompozycji, którą stosuje się do środowiska, układowo lub dolistnie, będzie się zmieniać w zależności od natury poszczególnego preparatu, sposobów stosowania, warunków środowiskowych i stopnia aktywności owadobójczej. Zazwyczaj, biologiczna kompozycja owadobójcza będzie obecna w stosowanym preparacie w stężeniu wynoszącym, co najmniej 1% wagowy i może być większa łącznie z około 99% wagowymi. Preparaty suche kompozycji mogą zawierać od około 1% do około 99% wagowych lub więcej kompozycji, podczas gdy preparaty płynne mogą generalnie zawierać od około 1% do około 99% wagowych lub więcej składnika aktywnego. Preparaty, które zawierają nieuszkodzone komórki bakteryjne, będą generalnie zawierać od około 10⁴ do około 10⁷ komórek/g.

Preparat owadobójczy można podawać poszczególnym roślinom lub na docelowy obszar w jednym lub więcej aplikacji, zgodnie z potrzebą, przy czym zazwyczaj na pole stosuje się ilość na hektar, wynoszącą rzędu od około 50 g do około 500 g składnika aktywnego, albo od około 500 g do około 100 g, albo od około 1000 g do około 5000 g lub więcej składnika aktywnego.

Krótki opis rysunków

Rysunki tworzą część niniejszego opisu i zawarto je w celu dodatkowego przedstawienia aspektów niniejszego wynalazku. Wynalazek może zostać lepiej zrozumiany przez odniesienie się do jednego lub więcej z tych rysunków w połączeniu ze szczegółowym opisem konkretnych postaci realizacji przedstawionych w niniejszym.

Figura 1A, fig. 1B i fig. 1C ukazują sekwencję zasad nukleotydowych genu cryET33 (SEKW. NR ID.:1) i genu cryET34 (SEKW. NR ID.:2), oraz wnioskowaną sekwencję aminokwasowąbiałka CryET33 (SEKW. NR ID.:3) i białka CryET34 (SEKW. NR ID.:4).

Figura 2 ukazuje mapę restrykcyjną pEG246. Położenia i orientacje genu cryET33 (SEKW. NR ID.: 1) i genu cryET34 (SEKW. NR ID.:2) zaznaczono strzałkami. pEG246 funkcjonuje w E.coli ponieważ pochodzi od pBR322 i jest odporny na ampicylinę (AmpR). Skróty dla miejsc rozszczepienia endonukleazami są następujące: R = EcoRI, B = BamHI. W fig. 2 ukazano także marker wielkości o jednej kilozasadzie (1 kb).

Figura 3 ułożona i oparta o taką samą skalę jak fig. 2, ukazuje mapę restrykcyjną pEG1246. Położenia i orientacje genu cryET33 (SEKW. NR ID.:1) i genu cryET34 (SEKW. NR ID.:2) zaznaczono strzałkami. pEG1246 pochodzi od plazmidu pEG246 (fig. 2) i zawiera plazmid Bacillus spp. pNN101 (który wykazuje ekspresję zarówno odporności na chloramfenikol [CamR] jak i tetracyklinę [TetR] wprowadzony do miejsca BamHI pEG246. pEG1246 funkcjonuje zarówno w E.coli jak i B. thuringiensis. Skróty są takie same jak w fig. 2.

Opis przykładowych postaci realizacji

B. thuringiensis EG10327 jest naturalnie występującym szczepem, który wykazuje aktywność owadobójczą wobec owadom tęgopokrywym łącznie z kwieciakiem bawełnowcem, larwą chrząszcza z rodziny czamuchowatych (Tribolium castaneum) i larwą chrząszcza japońskiego (Popillia japonicct). B. thuringiensis EG2158 zawiera geny białka krystalicznego toksyczne wobec tęgopokrywych, podobne lub identyczne jak geny białka krystalicznego zEG10327. Nowe geny toksyn krystalicznych, oznaczone cryET33 i cryET34, sklonowano z EG2158. Gen cryET33 koduje białko krystaliczne CryET33 o 29 kDa, a gen cryET34 koduje białko krystaliczne CryET34 o 14 kDa. Białka krystaliczne CryET33 i CryET34 są toksyczne wobec larwy chrząszcza r rodziny czamuchowatych o nazwie red flour beetle, larwy kwieciaka bawełnowca i larwy chrząszcza japońskiego.

Następujące słowa i wyrażenia posiadają znaczenia przedstawione poniżej.

Ekspresja: Połączenie procesów wewnątrzkomórkowych, obejmujące transkrypcję i translację zachodzącą dzięki cząsteczce DNA, takiej jak gen strukturalny, w celu wytworzenia polipeptydu.

189 474

Promotor: Miejsce rozpoznania sekwencji DNA lub grupy sekwencji DNA, które zapewniają element kontroli ekspresji dla genu strukturalnego i z którym wiąże się specyficznie polimeraza RNA i inicjuje syntezę (transkrypcję) tego genu.

Regeneracja: Proces wzrostu rośliny z komórki roślinnej (np. protoplastu rośliny lub szczepu).

Gen strukturalny: Gen, który ulega ekspresji w celu wytworzenia polipeptydu.

Transformacja: Proces wprowadzenia egzogenicznej sekwencji DnA (np. wektora, rekombinowanej cząsteczki DNA) do komórki lub protoplastu, w którym ten egzogeniczny DNA włącza się w chromosom lub jest zdolny do autonomicznej replikacji.

Transformowana komórka: Komórka, której DNA został zmieniony przez wprowadzenie egzogenicznej cząsteczki DNA do tej komórki.

Komórka transgeniczna: Każda komórka, pochodząca od transformowanej komórki lub pochodząca od komórki transgenicznej. Przykładami komórek transgenicznych są tkanki kallusowe (calli), pochodzące od transformowanych komórek roślinnych, takich jak komórki liści, korzenia, łodygi, np. komórki somatyczne lub rozrodcze (zarodkowe) otrzymane od rośliny transgenicznej.

Roślina transgeniczna: Roślina lub jej potomstwo, pochodzące od transformowanej roślinnej komórki lub protoplastu, gdzie DNA rośliny zawiera wprowadzoną egzogeniczną cząsteczkę DNA nie występującą oryginalnie w natywnej roślinie nie transgenicznej tego samego szczepu. Terminy „roślina transgeniczna” i „roślina transformowana” posiadają czasem używane w technice znaczenia synonimowe do określenia rośliny, której DNA, zawiera egzogeniczną cząsteczkę DNA. Jednakże uważa się za bardziej naukowe prawidłowe przytaczanie rośliny regenerowanej lub kallusa otrzymanego z komórki rośliny transformowanej lub protoplastu, jako rośliny transgenicznej i takie użycie będzie występować w niniejszym.

Wektor: Cząsteczka DNA zdolna do replikacji w komórce gospodarza i/lub, do której dołącza się operacyjnie drugi segment DNA tak, aby spowodować replikację dołączonego segmentu. Plazmid jest przykładem wektora.

Sondy i startery

W innym aspekcie, informacja sekwencji DNA przewidziana w wynalazku pozwala na wytworzenie relatywnie krótkich sekwencji DNA (lub RNA), mających zdolność do specyficznej hybrydyzacji z sekwencjami genowymi wybranych polinukleotydów tu ujawnionych. Te sondy kwasu nukleinowego o odpowiedniej długości wytwarza się na podstawie rozważań o wybranej sekwencji genu białka krystalicznego, np. sekwencji, takiej jak ukazana SEKW. Nr ID.:1 lub SEKW. NR ID.:2. Zdolność takich DNA i sond kwasu nukleinowego do specyficznej hybrydyzacji z genem, kodującym białko krystaliczne, daje im szczególne zastosowanie w różnych postaciach realizacji. Najważniejsze, że sondy można stosować w rozmaitych testach wykrywania obecności sekwencji komplementarnych w danej próbce.

W pewnych postaciach realizacji, mogą być zastosowane startery oligonukleotydowe. Sekwencję takich starterów planuje się przy użyciu polinukleotydu według niniejszego wynalazku do użytku w wykrywaniu, powielaniu lub mutowaniu określonego segmenty genu białka krystalicznego z B. thuringiensis przy użyciu technologii PCR™. Segmenty pokrewnych genów białka krystalicznego z innych gatunków także można powielić przez PCR™ stosując takie startery.

Aby zapewnić pewne korzyści zgodnie z niniejszym wynalazkiem, zalecana sekwencja kwasu nukleinowego do badań hybrydyzacji lub testów, obejmuje sekwencje, które są komplementarne do sekwencji, kodującej białko krystaliczne, o co najmniej 14 do 30 nukleotydów długości, takiej jak ukazana w SEKW⁷. NR ID.:1 lub SEKW. NR ID.:2. Wielkość, co najmniej 14 nukleotydów długości pomaga zapewnić, że fragment będzie miał wystarczającą długość do utworzenia cząsteczki dupleksowej, która jest zarówno stabilna jak i selektywna. Generalnie zaleca się cząsteczki, mające sekwencje komplementarne dłuższe niż 14 zasad, aby zwiększyć stabilność i selektywność hybrydy i przez to ulepszyć jakość i stopień otrzymanych specyficznych cząsteczek hybrydowych. Generalnie zaleca się planowanie cząsteczek kwasu

189 474 nukleinowego, mających obszar komplementamości genowej o 14 do 20 nukleotydach lub nawet dłuższe jeśli trzeba. Takie fragmenty można łatwo wytworzyć np. przez bezpośrednią syntezę fragmentu środkami chemicznymi, przez stosowanie technologii reprodukcji kwasu nukleinowego, takiej jak technologia PCR™ według opisu patentowego U.S. 4 683 195 i 4 683 202, załączonych w niniejszym jako odniesienie albo przez wycięcie wybranych fragmentów DNA z rekombinowanych plazmidów, zawierających odpowiednie inserty i odpowiednie miejsca restrykcyjne.

Wektory ekspresyjne

W jednej postaci realizacji wektor ekspresyjny jest wyizolowaną i oczyszczoną cząsteczką DNA, zawierającą promotor operacyjnie połączony z regionem kodującym, który koduje polipeptyd według niniejszego wynalazku, który to region kodujący jest operacyjnie połączony z regionem terminacji transkrypcji, przez co promotor kieruje transkrypcją regionu kodującego.

W stosowanym tu znaczeniu, „operacyjnie połączony” oznacza, że promotor łączy się z regionem kodującym w taki sposób, że ten promotor kontroluje i reguluje transkrypcję tego regionu kodującego. Sposoby operacyjnego łączenia promotora z regionem kodującym są dobrze znane w dziedzinie.

W zalecanej postaci realizacji, rekombinowana ekspresja DNA, kodującego białka krystaliczne według niniejszego wynalazku jest korzystna w komórce gospodarza Bacillus. Zalecane komórki gospodarza obejmują B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtiłis i pokrewne bacille, przy czym szczególnie zaleca się komórki gospodarza B. thuringiensis. Promotory, funkcjonujące w bakteriach są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowym i zalecanym promotorem dla białek krystalicznych Bacillus jest każdy znany promotor genu białka krystalicznego, łącznie z promotorami genu cryET33 i cryET34. Alternatywnie, mutagenizowane lub rekombinowane promotory genu, kodującego białka krystaliczne można zbudować ręką człowieka i użyć do pobudzenia ekspresji nowych segmentów genu ujawnionych w niniejszym.

W innej postaci realizacji, przeprowadza się ekspresję rekombinowanych DNA, kodujących białka krystaliczne według niniejszego wynalazku, przy użyciu transformowanych bakterii Gram ujemnych takich jak komórki gospodarza E. coli lub Pseudomonas spp. Promotory, które działają w ekspresji na wysokim poziomie docelowych polipeptydów w E. coli i innych Gram ujemnych komórkach gospodarza, są także dobrze znane w technice.

Jeśli wektor ekspresyjny według niniejszego wynalazku ma być użyty do transformacji rośliny, wybiera się promotor, który posiada zdolność do kierowania ekspresją w roślinach. Promotory, które działają w roślinach są także dobrze znane w technice. Użyteczne do ekspresji polipeptydu w roślinach są promotory możliwe do indukcji, wirusowe, syntetyczne, konstytutywne jakie opisano (Poszkowski i in., 1989; Odell i in., 1985), i czasowo regulowane, regulowane przestrzennie i regulowane czasowo-przestrzennie (Chau i in., 1989).

Promotor wybiera się także pod względem jego zdolności do kierowania aktywnością transkrypcyjną transformowanej komórki roślinnej lub rośliny transgenicznej, wobec regionu kodującego. Geny strukturalne mogą być kierowane przez różne promotory w tkankach roślinnych. Promotory mogą być prawie konstytutywne, tak jak promotor CamV 35S lub tkankowo specyficzne lub promotory specyficzne dla rozwoju, wpływające na dwuliścienne albo jednoliścienne.

Jeśli promotor jest prawie konstytutywny, taki jak CamV 35S, zwiększa ekspresję polipeptydu w wielu tkankach transformowanych roślin (np. tkanka kallusowa, liścia, nasion i korzenia). Alternatywnie, wpływ transformacji można kierować do specyficznych tkanek roślinnych przez użycie roślinnych wektorów integrujących, zawierających promotor specyficzny dla tkanki.

Przykładem promotora specyficznego dla tkanki jest promotor lektynowy, który jest specyficzny dla tkanki nasienia. Białko lektyna w nasionach soi kodowane jest przez pojedynczy gen (Le1), który podlega ekspresji tylko podczas dojrzewania nasienia i odpowiada za około 2 do 5% całego mRNA nasienia. Gen lektyny i promotor specyficzny dla nasienia

189 474 scharakteryzowano w pełni i użyto do kierowania ekspresją specyficzną dla nasienia w transgenicznych roślinach tytoniu (Vodkin i in., 1983; Lindstrom i in., 1990).

Wektor ekspresyjny, zawierający region kodujący, który koduje będący przedmiotem zainteresowania polipeptyd, buduje się pod kontrolą promotora lektynowego i wektor ten wprowadza do roślin przy użyciu np. metody transformacji protoplastów (Dhir i in., 1991). Ekspresja polipeptydu skierowana jest specyficznie na nasiona roślin transgenicznych.

Roślinę transgeniczną według niniejszego wynalazku wytworzoną z transformowanej komórki roślinnej z użyciem promotora specyficznego dla tkanki, można krzyżować z drugą rośliną transgeniczną rozwiniętą z komórki roślinnej transformowanej innym promotorem specyficznym dla tkanki, w celu wytworzenia hybrydowej rośliny transgenicznej, która wykazuje wpływ transformacji w więcej niż jednej konkretnej tkance.

Przykładami promotorów specyficznych dla tkanki są syntetaza sacharozy kukurydzianej 1 (Yang i in., 1990), dehydrogenaza alkoholowa kukurydzy 1 (Vogel i in., 1989), kompleks lekkiego zbioru kukurydzy (Simpson, 1986), białko szoku cieplnego kukurydzy (Odall i in., 1985), karboksylaza małej podjednostki RuBP grochu (Poulsen i in., 1986; Cashmore i in., 1983), syntaza mannopinowa plazmidu Ti (Langridge i in., 1989), syntaza nopalinowa plazmidu Ti (Langridge i in., 1989), izomeraza chalkonowa petunii (Van Tunen i in., 1988), białko bogate w glicynę fasoli 1 (Wenzler i in., 1989). Zalecanymi promotorami są promotor wirusa mozaiki kalafiora (CaMV 35S) i promotor karboksylazy małej podjednostki RuBP S-E9.

Wybór wektora ekspresyjnego i ostatecznie, z którym promotorem połączy się operacyjnie region kodujący polipeptydu, zależy bezpośrednio od żądanych właściwości funkcjonalnych, np. położenia i czasu ekspresji białka i transformowanej komórki gospodarza. Są to ograniczenia dobrze znane w technice konstruowania rekombinowanych cząsteczek DNA. Jednakże, wektor użyteczny w praktykowaniu niniejszego wynalazku jest zdolny do kierowania ekspresją regionu kodującego polipeptydu, do którego jest on operacyjnie przyłączony.

Typowe wektory użyteczne do ekspresji genów w roślinach wyższych są dobrze znane w dziedzinie i obejmują wektory, pochodzące od opisanego plazmidu indukującego guza (Ti) Agrobacterium tumefeciens (Rogers i in., 1987). Jednakże znanych jest kilka innych roślinnych integrujących układów wektorowych, funkcjonujących w roślinach, łącznie z opisanym kontrolnym wektorem transferowym pCaMVCN (Fromm i in., 1985). Plazmid pCaMVCN (dostępny z Pharmacia, Piscataway, NJ) obejmuje promotor wirusa mozaiki kalafiora CaMV 35S.

W zalecanych postaciach realizacji, wektor użyty do ekspresji polipeptydu zawiera marker selekcji efektywny w komórce roślinnej, zwłaszcza marker selekcji oporności na leki. Jednym z możliwych markerów oporności na leki jest gen, którego ekspresja daje odporność na kanamycynę; to jest chimeryczny gen, zawierający promotor syntazy nopalinowej, fosfotransferazę II neomycyny Tn5 (nptll) oraz region nie podlegający translacji 3' syntazy nopalinowej (Rogers i in., 1988).

Polimeraza RNA poddaje transkrypcji sekwencją kodującą DNA przez miejsce, gdzie zachodzi poliadenylacja. Zwykle sekwencje DNA położone kilkaset par zasad w dół od miejsca poliadenylacji służą do terminacji transkrypcji. Te sekwencje DNA przytacza się w niniejszym jako regiony terminacji transkrypcji. Regiony te są wymagane dla skutecznej poliadenylacji transkrypcji informacyjnego RNA (mRNA). Sposoby wytwarzania wektorów ekspresji są dobrze znane w technice. Ekspresję (wektory transformacyjne) stosowane do transformowania roślin oraz metody wykonywania tych wektorów opisano w opisach patentowych U.S. nr 4 971 908, 4 769 061 i 4 757 011, których opisy załącza się w niniejszy jako odniesienie. Wektory te można modyfikować tak, by zawierały opisaną powyżej sekwencję.

Wykorzystuje się różne metody do operacyjnego przyłączenia DNA do wektorów przez komplementarne spoiste końce lub lepkie końce. Przykładowo, można dodać komplementarne obszary homopolimeryczne do wprowadzanego segmentu DNA oraz do DNA wektora.

189 474

Wektor i segment DNA łączy się następnie przez wiązania wodorowe między komplementarnymi ogonkami homopolimerycznymi, tworząc cząsteczki rekombinowanego DNA.

Region kodujący, który koduje polipeptyd, mający zdolność do nadawania aktywności owadobójczej komórce, jest korzystnie genem CryET33 lub CryET34, kodującym białko krystaliczne w B. thuringiensis. W zalecanych postaciach realizacji, taki polipeptyd ma sekwencję reszt aminokwasowych o SEKW. NR ID.:3 lub SEKW. NR ID.:4 albo funkcjonalny równoważnik tych sekwencji. Zgodnie z takimi postaciami realizacji, zaleca się także region kodujący, obejmujący sekwencję DNA o SEKW. NR ID.:1 lub sekwencję DNA o SEKW. NR ID.:2.

Charakterystyka nowych białek krystalicznych

Niniejszy wynalazek przewiduje nowe polipeptydy, które określają całość lub część białka krystalicznego CryET33 lub CryET34 B. thuringiensis.

W zalecanej postaci realizacji, wynalazek ujawnia wyizolowane i oczyszczone białko CryET33. Białko CryET33 obejmuje sekwencję o 261 aminokwasach i posiada obliczoną masę cząsteczkową, wynoszącą 29,216 Da. CryET33 posiada obliczoną stałą izoelektryczną (pI) równą4,78. Skład aminokwasowy białka CryET33 podano w tabeli 3.

Tabela 3

Aminokwas	# Reszty	% Całości	Aminokwas	# Reszty	% Całości
Ala	14	(5,2)	Leu	12	(4,5)
Arg	5	(1,9)	Lys	14	(5,2)
Asn	22	(8,2)	Met	3	(1,1)
Asp	12	(4,5)	Phe	11	(4,1)
Cys	2	(0,7)	Pro	12	(4,5)
Gln	7	(2,6)	Ser	22	(8,2)
Glu	15	(5,6)	Thr	39	(14,5)
Gly	18	(6,7)	Trp	2	(0,7)
His	3	(1,1)	Tyr	14	(5,2)
Ile	17	(6,3)	Val	23	(8,6)
Kwasowe (Asp + Glu)	27	(10,0)
Zasadowe (Arg + Lys)	19	(7,1)
Aromatyczne (Phe+Trp+Tyr)	27	(10,0)
Hydrofobowe (Aromatyczne + Ile+Leu+ Met+Val)	82	(30,5)

W innej postaci realizacji, wynalazek ujawnia wyizolowane i oczyszczone białko CryET34. Białko CryET34 obejmuje sekwencję o 126 aminokwasach i posiada obliczoną masę cząsteczkową, wynoszącą 14,182 Da. CryET34 posiada obliczoną stałą izoelektryczną (pI) równą 4,26. Skład aminokwasowy białka CryET33 podano w tabeli 4.

189 474

Tabela 4

Aminokwas	# Reszty	% Całości	Aminokwas	# Reszty	% Całości
Ala	5	(3,9)	Leu	4	(3,1)
Arg	2	(1,6)	Lys	8	(6,3)
Asn	6	(4,7)	Met	2	(1,6)
Asp	11	(8,7)	Phe	4	(3,1)
Cys	2	(1,6)	Pro	8	(6,3)
Gln	7	(3,1)	Ser	9	(7,1)
Glu	11	(5,5)	Thr	13	(10,2)
Gly	1	(8,7)	Trp	3	(2,4)
His	8	(0,8)	Tyr	11	(8,7)
Ile	17	(6,3)	Val	7	(5,5)
Kwasowe (Asp + Glu)	18	(14,2)
Zasadowe (Arg + Lys)	10	(7,9)
Aromatyczne (Phe+Trp+Tyr)	18	(14,2)
Hydrofobowe (Aromatyczne + Ile+Leu+ Met+Val)	39	(30,7)

Nazewnictwo nowych białek

Twórcy arbitralnie przypisali oznaczenia CryET33 i CryET34 nowym białkom według wynalazku. Podobnie, przypisano arbitralne oznaczenia cryET33 i cryET34 nowym sekwencjom kwasu nukleinowego, które kodują te polipeptydy, odpowiednio. Formalne przypisanie oznaczeń dla genu i białka oparte o skorygowane nazewnictwo endotoksyn białek krystalicznych (tabela 1) przypisze komitet do spraw nazewnictwa B. thuringiensis, utworzonego dla systematycznej klasyfikacji białek krystalicznych B. thuringiensis. Wynalazcy uważają, że arbitralnie przypisane oznaczenia według niniejszego wynalazku będzie zastępować oficjalne nazewnictwo przypisane tym sekwencjom.

Transformowane komórki gospodarza i rośliny transgeniczne

Sposoby i kompozycje do transformowania bakterii, komórki drożdżowej, komórki roślinnej lub całej rośliny jednym lub więcej wektorów ekspresji, zawierającym segment genu, kodującego białko krystaliczne, są dodatkowymi aspektami tego opisu.

Bakteria transgeniczna, komórka drożdżowa, komórka roślinna lub roślina, pochodząca z takiego procesu transformacji lub potomstwo i nasiona od takiej rośliny transgenicznej, są także dodatkowymi postaciami realizacji wynalazku.

Sposoby transformowania bakterii i komórek drożdżowych są dobrze znane w dziedzinie. Zazwyczaj, sposoby transformowania są podobne do tych dobrze znanych sposobów stosowanych do transformowania innych bakterii lub drożdży, takiej jak E.coli lub Saccharomyces cerevisiae. Metody transformacji DNA komórek roślinnych obejmują transformację roślinny w której pośredniczy Agrobacterium, transformację protoplastu, przenoszenie genu do pyłku, injekcję do organów rozrodczych, injekcję do niedojrzałych zarodków oraz bombardowanie cząstkami. Każda z tych metod posiada różne zalety i wady. Tak więc, poszczególna metoda wprowadzania genów do poszczególnego szczepu roślinnego nie musi

189 474 być najskuteczniejsza dla innego szczepu roślinnego, lecz dobrze wiadomo, które metody są użyteczne dla poszczególnego szczepu roślinnego.

Istnieje wiele metod wprowadzania transformowanych segmentów DNA do komórek, lecz nie wszystkie są odpowiednie do dostarczania DNA do komórek roślinnych. Za odpowiednie metody uważa się niemal wszystkie metody, którymi DNA można wprowadzić do komórki, taki jak przez infekcję Agrobacterium, bezpośrednie dostarczenie DNA, tak jak np. transformacja protoplastów za pośrednictwem PEG (Omirulleh i in., 1993), przez wychwyt DNA za pośrednictwem desykacji/inhibicji, przez elektroporację, przez agitację z włóknami węglika krzemu, przez rozpędzanie cząstek powleczonych DNA, itd. W pewnych postaciach realizacji mogą być stosowane metody rozpędzania obejmujące np. bombardowanie mikropociskami i temu podobne.

Technologia wprowadzania DNA do komórek jest dobrze znana fachowcom. Opisano cztery ogólne metody dostarczania genu do komórek: (1) metody chemiczne (Graham i van der Eb, 1973; Zatloukal i in., 1992); (2) metody fizyczne, takie jak mikroinjekcja (Capecchi, 1980), elektroporacja (Wong i Neumann, 1982; Fromm i in., 1985; opis patentowy U.S. nr 5 384 253) oraz działko genowe (Johnston i Tang, 1994; Fynan i in., 1993); (3) wektory wirusowe (Clapp, 1993; Lu i in., 1993; Eglitis i Andersen, 1988a; 1988b); oraz (4) mechanizmy, w których pośredniczy receptor (Curiel i in., 1991; 1992; Wagner i in., 1992).

Elektroporacja

Stosowanie krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu wobec różnych komórek zwierzęcych i roślinnych, prowadzi do tworzenia się porów o wielkości rzędu nanometrów w błonie plazmatycznej. DNA pobiera się bezpośrednio do cytoplazmy komórkowej albo przez te pory albo jako konsekwencję redystrybucji składników błony, jaka towarzyszy zamykaniu się porów. Elektroporacja może być niezwykle skuteczna i można ją stosować zarówno dla krótkotrwałej ekspresji genów klonów jak i do ustalenia linii komórkowych, niosących zintegrowane kopie interesujących genów. Elektroporacja w przeciwieństwie do transfekcji za pośrednictwem fosforanu wapnia i fuzji protoplastów, często daje zwiększenie linii komórkowych, które niosą jeden, a w większości kilka zintegrowanych kopii obcego DNA.

Wprowadzenie DNA za pomocą elektroporacji jest dobrze znane fachowcom. W tej metodzie wykorzystuje się pewne enzymy, rozkładające ścianę komórkową, takie jak enzymy rozkładające pektynę, aby uczynić docelowe biorcze komórki bardziej podatnymi na transformację przez elektroporację od komórek nie traktowanych. Alternatywnie, komórki biorcze czyni się podatniejszymi na transformację, przez uszkodzenie mechaniczne. Aby przeprowadzić transformację przez elektroporację, można wykorzystać albo tkanki kruche, takie jak hodowla komórkowa w zawiesinie, lub kallus zarodkowy, albo alternatywnie, można bezpośrednio transformować niedojrzałe zarodki lub inne zorganizowane tkanki. Można częściowo rozłożyć ściany komórkowe wybranych komórek przez wystawienie ich na enzymy niszczące pektynę (pektoliazy) lub mechaniczne uszkodzenie w kontrolowany sposób. Takie komórki byłyby potem biorcami transferu DNA przez elektroporację, którą można przeprowadzić na tym etapie, i transformowane komórki identyfikować następnie przez odpowiednią selekcję lub protokół skriningowy w zależności od natury nowo wprowadzonego Dna.

Bombardowanie mikropociskami

Inną korzystną metodą dostarczania transformujących segmentów DNA do komórek roślinnych jest bombardowanie mikropociskiem. W tej metodzie, cząstki można powlekać kwasami nukleinowymi i dostarczać do komórek przez siłę napędzającą. Przykładowe cząstki obejmują cząstki zawarte w wolframie, złocie, platynie i innych.

Zaletą bombardowania mikropociskami, oprócz tego, że jest skuteczna metoda stabilnej w sposób powtarzalny transformacji jednoliściennych, jest to, że nie wymaga się ani izolacji protoplastu (Cristou i in., 1988) ani podatności na infekcję Agrobacterium. Przykładową postacią realizacji metody dostarczania DNA do komórek kukurydzy przez napędzenie jest Biolistic Particle Delivery System, który można stosować do napędzania cząstek powleczonych DNA lub komórek, poprzez ekran, taki jak stal nierdzewna lub ekran Nytex, na powierzchnię filtra pokrytego komórkami kukurydzy hodowanych w zawiesinie. Ekran rozprasza cząstki tak,

189 474 że ekran pośredniczący między aparatem pociskowym i bombardowanymi komórkami redukuje wielkość cząstek pociskowych i może przyczyniać się do wyższej częstotliwości transformacji przez zmniejszenie zniszczeń zadanych komórkom biorczym przez pociski, które są zbyt duże.

Do bombardowania, komórki w zawiesinie zatęża się korzystnie na filtrach lub stałej pożywce hodowlanej. Alternatywnie, można uporządkować niedojrzałe zarodki lub inne komórki docelowe na stałym podłożu hodowlanym. Bombardowane komórki umieszcza się w odpowiedniej odległości poniżej płytki zatrzymującej pociski. Jeśli trzeba, umieszcza się także jeden lub więcej ekranów między' urządzeniem przyspieszającym i bombardowanymi komórkami. Poprzez użycie technik przedłożonych w niniejszym, można otrzymać do 1000 lub więcej ognisk komórek krótkotrwale wykazujących ekspresję genu markerowego. Liczba komórek w ognisku, które wykazuje ekspresję produktu genu egzogenicznego 48 godzin po bombardowaniu często wynosi od 1 do 10, a średnio 1 do 3.

W transformacji przez bombardowanie, można zoptymalizować warunki hodowli wstępnego bombardowania i parametry bombardowania, aby uzyskać maksymalną liczbę stabilnych transformantów. Zarówno fizyczne jak i biologiczne parametry bombardowania są istotne w tej technologii. Czynnikami fizycznymi są te, które obejmują manipulację DNA/osadem mikropocisku lub te, które wpływają na lot i prędkość makro lub mikropocisków. Czynniki biologiczne obejmują wszystkie etapy związane z manipulacją komórkami przed i tuż po bombardowaniu, wyregulowanie osmotyczne komórek docelowych, aby pomóc pokonać uraz związany z bombardowaniem, a także naturę transformującego DNA, tak jak DNA w postaci liniowej lub nieuszkodzone superzwinięte plazmidy. Uważa się, że manipulacje przed bombardowaniem są, zwłaszcza istotne dla powodzenia transformacji niedojrzałych zarodków.

W związku z tym, uważa się, że można pragnąć wyregulować różne parametry bombardowania w badaniach na małą skalę, aby w pełni zoptymalizować warunki. W szczególności można pragnąć wyregulować parametry fizyczne, takie jak odległość szczeliny, odległość lotu, odległość tkanki i ciśnienie helu. Można także zminimalizować czynniki redukujące uraz (TRF) przez modyfikację warunków, które wpływają na stan fizjologiczny komórek biorczych i które mogą przez to wpływać na skuteczność transformacji integracji. Przykładowo można wyregulować stan osmotyczny, uwodnienie tkanki i etap subhodowli lub cyklu komórki komórek biorczych, w celu optymalnej transformacji. Wykonanie innych rutynowych regulacji będzie wiadome dla fachowca w świetle niniejszego opisu.

Transfer za pośrednictwem Agrobacterium

Transfer za pośrednictwem Agrobacterium jest szeroko stosowanym układem wprowadzania genów do komórek roślinnych, ponieważ DNA można wprowadzić do całych tkanek roślinnych, omijając przez to potrzebę regeneracji całej rośliny z protoplastu. Użycie roślinnych wektorów integrujących za pośrednictwem Agrobacterium do wprowadzenia DNA do komórek roślinnych, jest dobrze znane w technice. Patrz np. opisane metody (Fraley i in., 1985; Rogers i in., 1987). dalej, integracja Ti-DNA jest procesem stosunkowo dokładnym, dającym kilka przeszeregowań. Region przenoszonego DNA jest określony przez sekwencje graniczne, a DNA pośredniczący wprowadza się zwykle do genomu jak opisano (Spielmann i in., 1986; Jorgensen i in., 1987).

Nowoczesne wektory transformacji Agrobacterium są zdolne do replikacji w E.coli jak również Agrobacterium, pozwalając na dogodne manipulacje jakie opisano (Klee i in., 1985). Ponadto, ostatnie postępy technologiczne w dziedzinie wektorów dla transferu genu z pośrednictwem Agrobacterium polepszyły uszeregowanie genów i miejsc restrykcyjnych w wektorach, w celu ułatwienia konstrukcji wektorów zdolnych do ekspresji różnych genów kodujących polipeptydy. Opisane wektory (Rogers i in., (1987) posiadają dogodne regiony multilinkerowe, oskrzydlone przez promotor i miejsce poliadenylacji dla bezpośredniej ekspresji wprowadzonych genów, kodujących polipeptyd i są odpowiednie dla niniejszych celów. Oprócz tego, geny Ti, zawierające Agrobacterium, zarówno uzbrojone jak i nieuzbrojone, można użyć do transformacji. W tych szczepach roślinnych, gdzie skuteczna jest transformacja

189 474 za pośrednictwem Agrobacterium, jest to wybrana metoda z powodu łatwej i określonej natury transferu genu.

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium krążków liści lub innych tkanek, takich jak liścienie i stożki wzrostu, okazuje się ograniczać do roślin naturalnie zakażanych przez Agrobacterium. Okazało się, że kilka jednoliściennych jest naturalnymi żywicielami Agrobacterium, mimo, że wytworzono rośliny transgeniczne u szparaga przy użyciu wektorów Agrobacterium jak opisano (Bytebier i in., 1987). Zatem, komercyjnie istotne zboża, takie jak ryż, kukurydza i pszenica muszą być zwykle transformowane metodami alternatywnymi. Jednakże, jak wspomniano powyżej, można także uzyskać transformację szparaga przy użyciu Agrobacterium (patrz np. Bytebier i in., 1987).

Roślina transgeniczna utworzona przy użyciu metod transformacji Agrobacterium zwykle zawiera pojedynczy gen na jednym chromosomie. Takie rośliny transgeniczne można przytaczać jako heterozygotyczne pod względem dodanego genu. Jednakże, zważywszy, że użycie słowa „heterozygotyczny” zwykle implikuje obecność komplementarnego genu na tym samym miejscu w drugim chromosomie z pary chromosomów, i nie ma takiego genu w roślinie zawierającej jeden dodany gen jak tutaj, sądzi się, że dokładniejszą nazwą takiej rośliny jest niezależny segregant, ponieważ dodany, egzogenny gen ulega segregacji niezależnie podczas mitozy i mejozy.

Lepsza jest transgeniczna roślina, która jest homozygotyczna względem dodanego strukturalnego genu; to jest, transgeniczna roślina, która zawiera dwa dodane geny, jeden gen na tym samym miejscu na każdym chromosomie pary chromosomów. Homozygotyczną transgeniczną roślinę można otrzymać przez seksualne kojarzenie (samozapłodnienie) niezależnego segreganta, transgenicznej rośliny zawierającej pojedynczy dodany gen, skiełkowania pewnych powstałych nasion i analizy powstałych roślin na polepszoną aktywność karboksylazy względem kontroli (natywnej, nietransgenicznej) lub niezależnego segreganta transgenicznej rośliny.

Należy rozumieć, że dwie różne transgeniczne rośliny można także skojarzyć dla wytworzenia potomstwa, które zawiera dwa niezależnie segregujące, dodane, egzogenne geny. Samozapłodnienie odpowiedniego potomstwa może wytworzyć rośliny, które są homozygotyczne względem, obu dodanych, egzogennych genów kodujących interesujący polipeptyd. Możliwe jest też krzyżowanie wsteczne z macierzystą rośliną i krzyżowanie zewnętrzne z nietransgeniczną rośliną.

Inne sposoby transformacji

Transformację protoplastów rośliny można osiągnąć stosując sposoby oparte na strącaniu z fosforanem wapnia, traktowaniem poli(glikolem etylenowym), elektroporację oraz kombinacje tych zabiegów (patrz, np., Potrykus i in., 1985; Lorz i in., 1985; Fromm i in., 1986; Uchimiya i in., 1986; Callis i in., 1987; Marcotte i in., 1988).

Zastosowanie tych sposobów względem różnych szczepów roślin zależy od zdolności do regeneracji tego konkretnego szczepu roślin z protoplastów. Opisano przykładowe sposoby regeneracji zbóż z protoplastów (Fujimura i in. 1985; Toriyama i in., 1986: Yamada i in., 1986; Abdullah i in., 1986).

Dla transformowania szczepów roślin, których nie można z powodzeniem regenerować z protoplastów, można wykorzystać inne sposoby wprowadzania DNA do nietkniętych komórek lub tkanek. Np., regenerację zbóż z niedojrzałych zarodków lub eksplantów można prowadzić jak opisano (Vasil, 1988). Ponadto można wykorzystać „działo do cząstek” lub technikę mikropocisków o dużej prędkości. (Vasil, 1992)

Stosując tę ostatnią technikę, przeprowadza się DNA przez ściankę komórkową i do cytoplazmy na powierzchni małych cząstek metalu, jak opisano (Klein i in., 1987; Klein i in., 1988; McCabe i in., 1988). Cząstki metalu przechodzą przez kilka warstw komórek i pozwalają na transformację komórek w eksplantach tkankowych.

Sposoby wytwarzania odpornych na owady transgenicznych roślin

Przez transformowanie odpowiedniej komórki gospodarza, takiej jak komórka roślinna, segmentem kwasu nukleinowego według wynalazku, ekspresja zakodowanego białka krystalicznego (to jest, bakteryjnego białka krystalicznego lub polipeptydu wykazującego

189 474 aktywność owadobójczą wobec chrząszczy) może spowodować wytwarzanie odpornych na owady roślin.

Przykładowo, można wykorzystać wektor ekspresji zawierający region kodujący białko krystaliczne B. thuringiensis i odpowiedni marker selekcyjny dla transformowania zawiesiny zarodkowych komórek roślinnych, takich jak komórki pszenicy lub kukurydzy, stosując sposób taki jak bombardowanie cząstkami (Maddock i in., 1991; Vasil i in., 1992) dla dostarczenia DNA powlekającego mikropociski do komórek otrzymującego. Transgeniczne rośliny regeneruje się następnie z transformowanych zarodkowych komórek z ekspresją białek owadobójczych.

Tworzenie transgenicznych roślin można także przeprowadzać stosując inne sposoby transformacji komórek, które są znane w dziedzinie, takie jak zależne od Agrobacterium przeniesienie DNA (Praley i in., 1983). Alternatywnie, DNA można wprowadzać do roślin przez bezpośrednie wprowadzanie DNA do pyłku (Zhou i in., 1983; Hess, 1987; Luo i in., 1988) przez wstrzyknięcie DNA do organów rozrodczych rośliny (Pena i in., 1987), lub przez bezpośrednie wstrzyknięcie DNA do komórek niedojrzałych zarodków, następnie uwodnienie wysuszonych zarodków (Neuhaus i in., 1987; Benbrook i in., 1986).

Regeneracja, rozwój i hodowla roślin z transformantów pojedynczej rośliny lub z różnych transformowanych eksplantów są dobrze znane w dziedzinie (Weissbach i Weissbach, 1988). Ten proces regeneracji i wzrostu typowo obejmuje etapy selekcji transformowanych komórek, hodując te indywidualizowane komórki w zwykłych etapach rozwoju zarodka do etapu zakorzenionej roślinki. Transgeniczne zarodki i nasiona regeneruje się podobnie. Powstałe transgeniczne pędy sadzi się następnie w odpowiednim środowisku wzrostu roślin takim jak gleba.

Rozwój lub regenerację roślin zawierających obce, egzogenne geny kodujące interesujący polipeptyd wprowadzony przez Agrobacterium z eksplantów liści można wprowadzić sposobami dobrze znanymi w dziedzinie, takimi jak opisane (Horsch i in., 1985). W tej procedurze, transformanty hoduje się w obecności środka selekcyjnego i w środowisku, które indukuje regenerację pędów w szczepie roślin transformowanym jak opisano (Fraley i in., 1983).

Ta procedura typowo daje pędy w czasie dwu do czterech miesięcy i te pędy następnie przenosi się do odpowiedniego indukującego korzenie środowiska zawierającego środek selekcyjny i antybiotyk dla zapobiegania wzrostu bakterii. Pędy, które uzyskały korzenie w obecności środka selekcyjnego z wytworzeniem roślinek transplantuje się następnie do gleby lub innych środowiskach dla umożliwienia wytwarzania korzeni. Te procedury zmieniają się w zależności od konkretnego szczepu rośliny, takie zmiany są dobrze znane w dziedzinie.

Regenerowane rośliny mogą ulegać samozapyleniu z wytworzeniem homozygotycznych transgenicznych roślin, jak omówiono przedtem. W przeciwnym razie pyłek otrzymany ze zregenerowanych roślin krzyżuje się z wyhodowanymi z nasion roślinami o rolniczym znaczeniu, korzystnie z linii wsobnej. Odwrotnie pyłki z roślin tych ważnych linii stosuje się do zapylania regenerowanych roślin. Transgeniczną roślinę według niniejszego wynalazku zawierającą żądany polipeptyd uprawia się stosując sposoby dobrze znane specjaliście.

Transgeniczna roślina według wynalazku ma więc zwiększoną ilość regionu (np. genu ery) kodującego żądany polipeptyd Cry. Transgeniczna roślina według wynalazku może być niezależnym segregantem i może przekazywać ten gen i jego aktywność potomstwu. Transgeniczna roślina może być homozygotyczna względem tego genu, i przekazywać ten gen całemu swojemu potomstwu w sposób płciowy. Nasiona z transgenicznej rośliny można hodować w polu lub cieplarni, a powstałe płciowo dojrzałe transgeniczne rośliny ulegają samozapyleniu tworząc prawdziwe rośliny uprawne. Potomstwo tych roślin staje się prawdziwymi liniami hodowlanymi ocenianymi na, przykładowo, zwiększoną zdolność owadobójczą wobec chrząszczy, korzystnie w polu, w różnych warunkach środowiskowych. Twórcy sądzą, że niniejszy wynalazek znajdzie szczególne zastosowanie przy tworzeniu transgenicznych roślin o zastosowaniach przemysłowych, w tym różnych traw darniowych, pszenicy, kukurydzy, ryżu, jęczmienia, owsa, różnych roślin ozdobnych i warzyw, jak też wielu drzew i roślin dających orzechy i owoce.

189 474

Przykłady

Poniższe przykłady podano, aby pokazać różne odmiany wynalazku. Specjaliści zauważą, że technologie ujawnione w przykładach poniżej oznaczają technologie, które według wynalazcy funkcjonują dobrze w praktyce wynalazku, a więc mogą być uważane za składniki korzystnych trybów jego wykorzystania. Jednakże specjalista powinien, w świetle niniejszego opisu, zauważyć, że można dokonać wielu zmian w specyficznych ujawnionych odmianach i nadal uzyskać podobne wyniki bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku.

Przykład 1- wydzielanie B. Thuringiensis EG10327

Próbki pyłu zbóż otrzymano z różnych źródeł w USA i za granicą, typowo urządzeń do przechowywania ziarna. Próbki pyłu zbóż potraktowano i rozprowadzono na płytkach z agarem dla wydzielenia indywidualnych kolonii typu Bacillus, jak opisano w Opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5264364.

Klonowany gen crylHA, przedtem znany jako gen cryC B. thuringiensis szczep EG2158, opisany u Donovana i in., (1988), i klonowany gen cryIIIB2, przedtem znany jako gen crylllC B. thuringiensis szczep EG4961, opisany u Donovana i in., 1992, użyto jako sondy w procedurach hybrydyzacji kolonii. Sonda genu crylllA składała się z radioaktywnie znakowanego fragmentu restrykcyjnego DNA 2,0 tyś. par zasad HindIII-XbaI jak opisuje Donovan i in., 1988. Sonda genu cryIIIB2 składała się z radioaktywnie znakowanego fragmentu restrykcyjnego DNA 2,4 tyś. par zasad Sspl, jak opisuje Donovan i in., 1992. Procedury hybrydyzacji kolonii przeprowadzono jak w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5264364.

Około 43000 kolonii typu Bacillus z 54 próbek pyłu zbóż z różnych lokalizacji sondowano radioaktywnie znakowanymi sondami crylHA i cryIIIB2. Jedna próbka pyłu zbóż z Grecji zawierała około 100 naturalnie występujących kolonii typu Bacillus, które hybrydyzowały z sondami crylllA i cryIIIB2. Analiza kilku z tych naturalnie występujących, dzikiego typu kolonii wskazała, że były identycznymi koloniami B. thuringiensis, a jedną kolonię, oznaczoną EG10327, wybrano do dalszych badań. B. thuringiensis szczep EG10327, zdeponowano 14 grudnia 1994 zgodnie z traktatem budapesztańskim w NRRL pod numerem dostępu NRRL B-21365.

Dalsze około 84000 kolonii typu Bacillus ze 105 próbek pyłu zbóż z różnych lokalizacji selekcjonowano także radioaktywnie znakowanymi sondami crylllA i crvIIIB2, lecz bez powodzenia w identyfikacji wszelkich innych szczepów zawierających nowe geny typu cryIII.

B. thuringiensis szczep EG10327 okazał się być czynny owadobójczo wobec larw chrząszczy, szczególnie owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle, ryjkowca o zwyczajowej nazwie amerykańskiej boll weevil, oraz owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle. Szczep EG10327 nie wykazywał wyraźnej owadobójczej aktywności wobec owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej southern corn rootworm lub stonki ziemniaczanej w warunkach testu. Gen nazwany „obcięty crylllA”, wydzielono ze szczepu EG10327, i określono jego sekwencję zasad nukleotydowych. Obcięty gen crylllA okazał się być identyczny z pierwszymi dwoma-trzecimi genu cryUlA (opisanego jako gen cryC u Donovana i in., 1988) lecz nie zawiera końcowej jednej-trzeciej genu crylllA. Obcięty gen crylllA szczepu EG10327 wytwarzał bardzo mało, jeśli w ogóle, owadobójczego białka i nie badano go dalej.

Przykład 2 - ocena wiciowego serotypu EG10327

Dla zbadania szczepu EG10327 przeprowadzono kilka badań. Jedno z badań przeprowadzono dla zbadania jego wiciowego serotypu. Te dane podano poniżej.

Wiciowy serotyp szczepu EG10327 określono w laboratorium Dr. M.-M. Lecadet w Instytucie Pasteura, Paris, Francja. Serotyp EG10327 określono zgodnie ze sposobami opisanymi przez H. de Barjaca (1981), i okazał się on być Bacillus thuringiensis kurstaki (H3a, 3b, 3c). Przedtem opisane szczepy B. thuringiensis zawierające geny związane z cryIII okazały się być serotypem morrisoni (szczep EG2158 zawierający crylllA); serotypem tolworthi (szczep EG2838 zawierający crylllB); oraz serotypem kumamotoensis (szczep EG4961 zawierający cryIIIB2) (Rupar i in., 1991). EG 10327 oznacza pierwszy szczep B. thuringiensis kurstaki, który okazał się być toksyczny dla chrząszczy.

189 474

Przykład 3 - ocena białek krystalicznych EG 10327

Szczep EG10327 oceniono następnie przez zbadanie wytwarzanych przez niego białek krystalicznych.

Te badania przeprowadzono hodując EG10327 w pożywce zarodnikowania DSG [0,8% (wagowych) bulionu odżywczego Difco, 0,5% (wagowych) glukozy, 10 mM K2HPO4, 10 mM KH2PO4, 1 mM Ca(NO3)2, 0,5 mM MgSO4, 10 μΜ MnCh, 10 μΜ FeSOJ Zarodnikującą kulturę zawierającą zarodniki i białka krystaliczne zebrano następnie przez odwirowanie i zawieszono w dejonizowanej wodzie. Białka krystaliczne roztworzono z zawiesiny zarodników EG10327 i kryształów inkubując zawiesinę w buforze roztwarzającym [0,14 M Tris pH 8,0, 2% (wagowych) dodecylosiarczanu sodu (SDS), 5% (objętościowych) 2-merkaptoetanolu. 10% (objętościowych) gliceryny i 0,1% (wagowych) błękitu bromofenolowego w temperaturze 100°C przez 5 minut.

Roztworzone białka krystaliczne frakcjonowano pod względem rozmiarów metodą elektroforezy na żelu akrylamidowym (analiza SDS-PAGE). Po frakcjonowano pod względem rozmiarów białka wizualizowano barwiąc barwnikiem Coomassie. Analiza SDS-PAGE wykazała, że główne białko krystaliczne mające około 29 kDa, dalej określane jako białko CryET33, i główne białko krystaliczne mające około 14 kDa, dalej określane jako białko CryET34, roztworzyły się z zarodnikującej kultury EG 10327.

Białko 29-kDa CryET33 i białko 14-kDa CryET34 EG10327 zbadano następnie przez określenie ich NH2-terminalnych sekwencji aminokwasowych jak następuje. Zarodnikującą kulturę EG10327 inkubowano z buforem roztwarzającym i roztworzone białka krystaliczne frakcjonowano według rozmiarów na żelu akrylamidowym metodą analizy SDS-PAGE. Białka przeniesiono z żelu na filtr nitrocelulozowy metodą standardowego elektroblottingu. Białko CryET33 i białko CryET34 poddane elektroblottingowi na filtr wizualizowano metodą zabarwienia filtra barwnikiem Coomassie. Części filtra zawierające białko CryET33 i białko CryET34 odcięto żyletką. W ten sposób otrzymano białko CryET33 i białko CryET34 w czystej postaci jako białka rozłożone na oddzielnych kawałkach filtru nitrocelulozowego.

Oczyszczone białka CryET33 i CryET34 zawarte na kawałkach filtru nitrocelulozowego poddano standardowej automatycznej degradacji Edmana w celu określenia NH2-terminalnej sekwencji aminokwasowej każdego białka.

NH 2-terminalną sekwencją białka CryET33 EG10327 okazała się być:

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 1 5 16 17 1 8 1 9 20 GlyllelleAsnTleGlnAspGluIleAsnAsnTyrMetLysGluValTyrGlyAlaThr (SEKW NR ID.:5)

NH2-terminalną sekwencją białka CryET34 ECT10327 okazała się być:

2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0

ThrVUTyrAsrA'alThrPheThrlleLysPheTvTAsnGluGlyGlijTrpGlyGlyPiO (Ala) (Asn) (SEKWNR ED:6)

Reszty aminokwasowe wymienione w nawiasach poniżej sekwencji białka CryET34 oznaczają potencjalne alternatywne aminokwasy, które mogą być obecne w białku CryET34 w tych pozycjach. Alternatywne aminokwasy są możliwe dzięki nieodłącznej niepewności przy stosowaniu zautomatyzowanej degradacji Edmana do określania sekwencji białek aminokwasów.

Algorytmy komputerowe (Korn i Queen, 1984) zastosowano dla porównania N-terminalnych sekwencji białek CryET33 i CryET34 z sekwencjami aminokwasowymi wszystkich białek krystalicznych B. thuringiensis, które znali twórcy, w tym sekwencji wszystkich białek krystalicznych B. thuringiensis, które opublikowano w literaturze naukowej, międzynarodowych zgłoszeniach patentowych lub wydanych patentach. Lista białek krystalicznych, których sekwencje opublikowano, wraz ze źródłem publikacji, pokazano w tabeli 5.

189 474

Tabela 5

Białka krystaliczne B. thuringiensis opisane w literaturze

Białko krystaliczne	Źródło lub odnośnik
1	2
Cry1A(a)	J. Biol. Chem.. 260:6264-6272
Cry1 A(b)	DNA, 5:305-314
Cry1 A(c)	Gene, 36:289-300
Cry 1B	Nucl. Acids Res., 16:4168-4169
Cry 1C	Nucl. Acids Res., 16:6240
Cry1Cb	Appl. Environ. Micro., 59: 1131-1137
Cry1C(b)	Nucl. Acids Res., 18:7443
Cry 1D	Nucl. Acids Res., 18:5545
Cry1E	EPO 358 557 A2
Cry1F	J. Bacteriol., 173:3966-3976
Cry 1G	FEBS, 293:25-28
CryV	WO 90/13651
Cry2A	J. Biol. Chem., 263:561-567
Cry2B	J. Bacteriol., 171:965-974
Cry2C	FEMS Microbiol. Lett., 81:31-36
Cry3A	Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7036-7040
Cry3B	Nucl. Acids Res., 18:1305
Cry3B2	Appl. Environ. Microbiol., 58:3921-3927
Cry3B3	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5378625
Cry3C	Appl. Environ. Microbiol., 58:2536-2542
Cry3D	Gene, 110:131-132
Cry4A	Nucl. Acids Res., 15:7195
Cry4B	EPO308199
Cry4C	J. Bacteriol., 166:801-811
Cry4D	J. Bacteriol., 170:4732, 1988
Cry5	Molec. Micro., 6:1211-1217

189 474

c.d. tabeli 5

1	2
Cry33AkD	WO 94/13785
Cry33BkD	WO 94/13785
Cry34Kd	J. Bacteriol., 174:549-557
Cry40kD	J. Bacteriol., 174:549-557
Cry201T635	WO 95/02693
Cry517	J. Gen. Micro. 138:55-62
Crya7A021	EPO 256553 BI
CryAB780RFl	WO 94/21795
CryAB780RF2	WO 94/21795
CryAB78100kD	WO.94/21795
Crybtpgs1208	EPO 382990
Crybtpgs1245	EPO 382990
Crybts02618A	WO 94/05771
CryBuibui	WO 93/03154
CryET4	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5322687
CryET5	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5322687
CryGei87	EPO238441
CryHD511	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5286486
CryHD867	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6286486
CrylPL	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5231008
CryMITS	japoński opis patentowy nr 6000084
CryPS17A	WO 92/19739
CryPS17B	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5350576 i 5424410
CryP16	WO 95/00639
CryP18	WO 95/00639
CryP66	WO 95/00639
CryPS33F2	WO 92/19739 i opis patent. Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5424410
CryPS40Dl	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5273746

189 474

c.d. tabeli 5

1	2
CryPS43F	WO 93/04587
CryPS 50Ca	WO 93/04587 i EPO 498537 A2
CryPS 50Cb	WO 93/15206
Cryps52Al	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4849217
CryPS63B	WO 92/19739
CryPS69Dl	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5424410
Cryps71M3	WO 95/02694
CryPS80JJ1	WO 94/16079
CryPS81IA	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5273746
CryPS811A2	EPO405810
Cryps81 A2	EPO 401979
CryPS81IB	WO 93/14641
CryPS81IB2	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5273746
Cryps81f	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5045469
Cryps81gg	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5273746
Cryps81n 1	EPO401979
Cryps86Al	opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5468636
CryX	FEBS Lett., 336:79-82
CryXenA24	WO 95/00647
CrycytA	Nucl. AcidsRes., 13:8207-8217

N-terminalna sekwencja białka CryET34 EG 10327 nie okazała się być homologiczna z żadnym ze znanych białek krystalicznych B. thuringiensis zidentyfikowanych w tabeli 5.

Przykład 4 - badanie białka krystalicznego CryET33 EG2159

Określono wcześniej, że białko 68-kDa CiyInA EG2159 (nazywane białkiem CryC u Donovana i in., 1988) było toksyczne dla stonki ziemniaczanej, lecz nie zidentyfikowano żadnego białka w szczepie, które miałoby aktywność wobec motyli lub dwuskrzydłych.

Szczep EG2159 pochodził z B. thuringiensis szczep EG2158 po krystalizacji plazmidu 150-MDa z EG2158 (opisanego u Donovana i in., 1988). EG2159 jest identyczne z EG2158, poza tym, że EG2159 nie zawiera plazmid 150-MDa obecnego w EG2158. Jedno z dwu białek krystalicznych wytwarzanych przez EG2159, białko 68-kDa CiyIIIA, wydzielono, i gen kodujący je klonowano i sekwencjonowano. Wyniki opisali uprzednio wynalazcy (Donovan i in., 1988). Występującego w mniejszej ilości białka 29-kDa EG2159, nie badano dalej.

Ten przykład opisuje badanie tego białka krystalicznego 29-kDa CryET33 z B. thuringiensis EG2159.

189 474

Wydzielanie białek krystalicznych z EG2159

Białka krystaliczne EG2159 roztworzono tworząc zawiesinę zarodnikującej kultury EG2159 zawierającej zarodniki plus białka krystaliczne w buforze roztwarzania białka w temperaturze 80°C przez 3 minuty. Roztworzone białka krystaliczne frakcjonowano według rozmiarów metodą SDS-PAGE i białka na żelu SDS-PAGE wizualizowano barwiąc barwnikiem Coomassie. Paski żelu zawierające białko 29-kDa wycięto z żelu SDS-PAGE żyletką i białko oddzielono od pasków żelu standardowymi procedurami elektroelucji. Te badania dały oczyszczony preparat białka CryET33 z B. thuringiensis szczep EG2159.

NH2-terminalne sekwencjonowanie białka 29-kDa

NH2-terminalną sekwencję aminokwasową oczyszczonego białka CryET33 określono metodą zautomatyzowanej degradacji Edmana. Sekwencję aminokwasową NH2-terminalnej części białka 29-kDa określono jako:

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

MetGlyllelleAsnlleGlnAspGluIleAsn---TyrMetLysGluValTyrGlyAla (SEKW NR ID.:7) (SEKW NR ID.:8)

Kreski (--) na pozycji 12 wskazują, że ta reszta aminokwasowa nie mogła być określona dla białka CiyET33 EG2159.

Wyniki

Porównanie sekwencji białka CryET33 EG10327 (SEKW. NR ID.:5) i NH2-terminalnej sekwencji nie badanego wcześniej białka 29-kDa (Donovan i in., 1988) zaobserwowanego w EG2159 (SEKW NR ID.:7, SEKW NR ID.:8) sugeruje, że NH2-terminalny koniec białka 29-kDa EG2159 był identyczny jak u białka CryET33 EG10327, poza wyjątkiem reszty początkowej metioniny (Met) obecnej w białku CryET33 EG2159.

Przykład 5 - Wydzielanie fragmentu DNA zawierającego geny CryET33 i CryET34 z EG2158

Jak opisano powyżej, szczep EG2159 pochodził ze szczepu EG2158. Tak więc EG2158 zawiera identyczny gen białka CryET33, określany dalej jako gen cryET33, jak i szczep EG2159. Dla sklonowania genu cryET33 użyto metod odwrotnej genetyki. Zsyntetyzowano 33-merową sondę oligonukleotydową (nazwaną WD68) kodującą aminokwasy 1 do 11 końca NH2 białka CryET33. Sekwencja WD68 to:

'-ATGGGAATTATTAATATTCAAGATGAAATTAAT-3' (SEKW NR ID.:9)

WD6B użyto jako sondy w hybrydyzacji Southema, jak opisano poniżej próbując zidentyfikować fragment DNA zEG2158 zawierający gen cryET33 dla białka 29-kDa CryET33. Całe DNA ekstrahowano z EG2158 standardową metodą lizozym/fenol. Ekstrahowany DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi DNA Hindin i EcoRI, a trawiony DNA frakcjonowano według rozmiarów metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Fragmenty DNA przeniesiono z żelu na filtr nitrocelulozowy stosując wcześniej opisane sposoby (Southern, 1975), a filtr inkubowano z oligonukleotydem WD68 radioaktywnie znakowanym kinazą T4 i [γ- p)AT’P. Nie znaleziono żadnego fragmentu restrykcyjnego DNA zEG2158, z którym sonda WD68 hybrydyzuje specyficznie.

Innego podejścia użyto następnie do identyfikacji fragmentu restrykcyjnego DNA zawierającego gen cryET33. Zsyntetyzowano 56-merową sondę oligonukleotydową (nazwaną WD73) kodującą aminokwasy 1 do 19 końca NH2 białka CryET33.

Sekwencja WD73 to:

'-ArGGGAATTATTAATArTCAAGATGAAATTAATNNNTATATGAAAGAAGTArATGG-3' (SEKW. NR ID.: 10)

189 474 gdzie trzy N odpowiadające aminokwasowi 12 WD73 reprezentują trzy nukleotydy inozynowe. Reszt inozynowych użyto w tej pozycji dla zakodowania odpowiedniego nieznanego aminokwasu na pozycji 12 w tej NH2-terminalnej sekwencji· białka CryET33. Inozynę uważa się za neutralny nukleotyd, nie sprzyjający i nie hamujący wiązania nici DNA. WD73 znakowano radioaktywnie T4 kinazą i (γ- ³²P]ATP i użyto do sondowania filtru nitrocelulozowego zawierającego frakcjonowany według wielkości fragmenty restrykcyjne Hindlll i EcoRI pełnego DNA EG2158. WD73 specyficznie hybrydyzowało do fragmentu Hindlll około 7,9 tyś. par zasad, i do fragmentu EcoRI około 5,2 tyś. par zasad DNA EG2158.

Przykład 6 - Klonowanie genów cryET33 i cryET34 z EG2158

Dla wydzielenia 5,2-tys. par zasad fragmentu EcoRI opisanego w poprzednim przykładzie, skonstruowano bibliotekę plazmidów szczepu EG2158 przez ligację dobranych rozmiarami fragmentów restrykcyjnych EcoRI DNA ze szczepu EG2158 do wektora E. coli pBR322. Ta procedura obejmuje najpierw otrzymanie całego DNA ze szczepu EG2158 przez lizę komórek, następnie fenolową ekstrakcję DNA, następnie trawienie całego DNA enzymem restrykcyjnym EcoRI, elektroforezę trawionego DNA na żelu agarozowym, odcięcie paska żelu zawierającego fragmenty DNA EcoRI o rozmiarach od około 4,0 do 6,0 tyś. par zasad, i elektroelucję dobranych rozmiarami fragmentów restrykcyjnych EcoRI z paska agarozowego żelu. Te fragmenty mieszano z wektorem plazmidowym E. coli pBR322, także trawionym EcoRI. Wektor pBR322 niesie gen Amp^R i wektor replikuje się w E. coli. Ligazę DNA T4 i ATP dodano do mieszaniny dobranych rozmiarami fragmentów restrykcyjnych DNA ze szczepu EG2158 i trawionego wektora pBR322 umożliwiając wektorowi pBR322 ligację z fragmentami restrykcyjnymi ze szczepu EG2158.

Bibliotekę plazmidów transformowano następnie do komórek E. coli, organizmu gospodarza nie mającego badanych genów cryET33 i cryET34 jak następuje. Po ligacji DNA mieszaniny inkubowano z szczepem gospodarza Amp^s E. coli, HB101, który uczyniono kompetentnym stosując standardowe procedury CaCf. E. coli HB101 zastosowano jako szczep gospodarza, ponieważ te komórki ulegają łatwo transformacji rekombinacyjnymi plazmidami i ponieważ HB101 nie zawiera naturalnie genów białek krystalicznych B. thuringiensis. Ponieważ pBR322 daje ekspresję AmpR, wszystkie komórki gospodarza przyjmujące rekombinacyjny plazmid były AmpR. Po transformowaniu komórek gospodarza rekombinacyjnymi plazmidami, komórki rozłożono na podłożu agarowym zawierającym Amp. Po inkubacji przez noc w temperaturze 37°C kilka tysięcy kolonii E. coli rosło na E. coli zawierającym Amp agarze, i te kolonie przeniesiono następnie na filtry nitrocelulozowe do dalszego sondowania.

Radioaktywnie znakowany oligonukleotyd WD73 użyto następnie jako sondę DNA w warunkach, które pozwalały sondzie wiązać się specyficznie z tymi transformowanymi koloniami gospodarza, które zawierały 5,2-tys. par zasad fragment EcoRI DNA ze szczepu EG2158. Kilka kolonii E. coli specyficznie hybrydyzowało z sondą WD73. Zbadano następnie jedną hybrydyzującą z WD73 kolonie, nazwaną E. coli EG11460. E. coli EG11460 zawierała rekombinacyjny plazmid, nazwany pEG246, który składał się z pBR322 plus wstawiony fragment restrykcyjny EcoRI DNA ze szczepu EG2158 około 5,2 tyś. par zasad. Restrykcyjną mapę pEG246 pokazuje fig. 2. Szczep E. coli EG11460 zawierający pEG246 złożono w Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL) na warunkach Budapest Treaty z numerem dostępu NRRL B-21364.

Sekwencję zasad nukleotydowych około 1/3 klonowanego 5,2-tys. par zasad fragmentu EcoRI pEG246 określono stosując standardową metodę didezoksy Sangera. Sekwencjonowanie wyjawiło, że fragment 5,2-tys. par zasad zawierał dwie sąsiadujące otwarte ramki odczytu kodujące białka, a w szczególności, dwa nowe geny krystalicznych toksyn. Otwarta ramka odczytu w górę, nazwana cryET33, kodowała białko, którego NH 2-terminalna sekwencja pasowała do NH2-terminalnej sekwencji białka 29-kDa CryET33 szczepów EG2159 i EG10327. Gen w dół od niej, nazwany cryET34, kodował białko, którego sekwencja aminokwasowa pasowała do NH2-terminalnej sekwencji aminokwasowej określonej dla białka 14 kDa CryET34 EG10327. Sekwencje DNA tych nowych genów są znacząco różne od sekwencji znanych genów krystalicznych toksyn B. thuringiensis wymienionych w tabeli 5.

189 474

Sekwencję DNA genu cryE733 (SEKW. NR ID.: 1) i wydedukowaną sekwencję aminokwasową białka CryET33 (SEKW. Nr ID.:3) kodowaną przez gen cryET33 pokazano na fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C. Kodująca białko część genu cryE733 (SEKW Nr ID.:1) jest zdefiniowana nukleotydami startującymi od pozycji 136 i kończącymi na pozycji 936. Rozmiar białka CryET33 (SEKW NR iD.:3) wydedukowany z genu cryET33 (SEKW. NR ID.:1) wynosi 29216 Da (267 aminokwasów). Pokazano także na fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C sekwencję DNA genu cryET34 (SEKW NR ED.:2) i wydedukowaną sekwencję aminokwasową białka CryET34 (SEKW NR ID.:4) kodowaną przez gen cryET34. Kodująca białko część genu cryET34 (SEKW NR ED.:2) jest zdefiniowana nukleotydami startującymi od pozycji 969 i kończącymi na pozycji 1346. Rozmiar białka CryET34 (SEKW nR iD.:4), wydedukowany z genu cryET34 (SEKW NR ID.:2) wynosi 14182 Da (126 aminokwasów).

Algorytmy komputerowe (Kom i Queen, 1984; Altschul i in., 1990) zastosowano dla porównania sekwencji DNA cryET33 i cryET34 i wydedukowanych sekwencji aminokwasowych białek CryET33 i CryET34 z sekwencjami wszystkich genów ery B. thuringiensis i białek krystalicznych, o których wiedzą wynalazcy (opisane w części 5.3, przykład 3, i wymienione w tabeli 5) i z sekwencjami wszystkich genów i białek zawartych w Genome Seauence Data Base (National Center for Genome Resources, Santa Fe, NM). Sekwencja genu cryET34 (SEKW NR ID.:2) i wydedukowaną sekwencja białka CryET34 (SEKW NR ID.:4) nie okazała się spokrewniona z żadnym znanym genem lub białkiem, odpowiednio. Sekwencja genu cryET33 (SEKW. NR ID.:1) okazała się mieć identyczność sekwencji z tylko jednym znanym genem i identyczność sekwencji była bardzo niska. Sekwencja genu cryET33 (801 nukleotydów) była w 38% identyczna z sekwencją genu B. thuringiensis subsp. thompsoni (1020 nukleotydów) opisaną przez Browna i Whiteleya (1992). Wydedukowaną sekwencja białka CryET33 (SEKW NR ID.:3) okazała się mieć identyczność sekwencji z tylko jednym znanym białkiem i identyczność była bardzo niska. Pełna aminokwasowa sekwencja białka CryET33 (267 aminokwasów) okazała się być w 27% identyczna z pełną sekwencją aminokwasowa białka krystalicznego B. thuringiensis subsp. thompsoni (340 aminokwasów) opisaną przez Browna i Whiteleya, 1992, dla białka toksycznego dla gąsienic.

Sekwencja DNA bezpośrednio w górę od genu cryET33 (fig. 1A, fig. 1B i fig. 1C, nukleotydy 1 do 135) została przebadana na homologie ze wszystkimi znanymi sekwencjami DNA genów białka krystalicznego i sekwencjami DNA wszystkich znanych genów w Genome Sequence Database (tabela 5). Sekwencje DNa bezpośrednio w górę od regionów kodujących geny często zawierają promotory ekspresji odpowiednich genów. To przeszukiwanie nie dało w wyniku żadnych homologii.

Przykład 7 - Ekspresja rekombinacyjnych genów cryET33 i cryET34

Doświadczenie pokazało, że klonowane geny krystalicznych toksyn B. thuringiensis słabo ulegają ekspresji w E. coli, lecz często ulegają silnej ekspresji w rekombinacyjnych szczepach B. thuringiensis. pEG246, zawierający geny cryET33 i cryET34 (fig. 2), jest zdolny do replikacji w E. coli, lecz nie w B. thuringiensis. Dla wytworzenia plazmidu zawierającego geny cryET33 i cryET39 i zdolnego do replikacji w B. thuringiensis, wstawiono plazmid Bacillus spp. do pEG246, jak opisano poniżej.

Plazmid Bacillus spp. PNN101 (Norton i in., 1985) zdolny do replikacji w B. thuringiensis i nadający oporność na chloramfenikol (Cam^R) i tetracyklinę (Tet^R) trawiono BamHI i trawiony plazmid mieszano z plazmidem pEG246 trawionym BamHI. Dwa plazmidy ligowano ze sobąT4 ligazaplus ATP. Mieszaninę ligacji użyto następnie do transformacji kompetentnych komórek E. coli DH5a. Po inkubacji mieszaniny plazmidów komórki umieszczono na płytkach z agarem zawierającym Tet. Spodziewano się, że komórki, które zawierały rozpuszczony plazmid złożony zpNN101 ligowany zpEG246, będą TetR. Po inkubacji przez około 20 godzin kilka kolonii E. coli TetR urosło na płytkach z agarem zawierających Tet.

Plazmid DNA wydzielono z jednej kolonii Ter. Plazmid trawiono BamHl i poddano elektroforezie na żelu agarozowym. Plazmid, nazwany pEG1246, składał się z dwu fragmentów DNA BamHI 5,8 tyś. par zasad i 9,6 tyś. par zasad odpowiadającym plazmidom pNN101 i pEG246, odpowiednio. Restrykcyjną mapę pEG1246 pokazano na fig. 3.

189 474

B. thuringiensis szczep EG10368 transformowano następnie metodą elektroporacji pEG1246 stosując uprzednio opisane sposoby (Macaluso i Mettus, 1991). Nietransformowane komórki gospodarza EG10368 nie mają kryształów (Cry') i Cam^ś. Po elektroporacji mieszaniną transformacyjną rozłożono na podłożu agarowym zawierającym Gam i inkubowano około 16 godzin w temperaturze 30°C. Transformowane pEG 1246 komórki były Cam^R. Jedna kolonia CamR, nazwana B. thuringiensis szczep EG11403, zawierała plazmid, którego wzór restrykcji był identyczny jak wzór pEG 1246.

Komórki szczepu EG11403 hodowano na pożywce zarodnikowania DSG zawierającej Cam w temperaturze 22°C do 25°C do zajścia zarodnikowania i wykonano lizę komórek (4-5 dni). Mikroskopowe badanie pokazało, że zarodnikująca kultura szczepu FG11403 zawierała zarodniki i małe swobodne wrzecionowate i nieregularne kryształy. Kryształy przypominały obserwowane w zarodnikującej kulturze szczepu EG10327.

Zarodniki, kryształy i szczątki komórek z zarodnikującej kultury szczepu EG11403 odwirowano. Grudkę z odwirowania przemyto raz dejonizowaną wodą, i grudkę umieszczono w zawiesinie w dejonizowanej wodzie.

Krystaliczne białka w zawiesinie EG11403 zbadano przez roztworzenie i analizę SDSPAGE. Analiza SDS-PAGE ujawniła, że szczep EG11403 wytwarzał dwa główne białka 29 kDa i 14 kDa. Jak spodziewano się, białka 29 kDa i białko 14-kDa szczepu EG11403 było identyczne rozmiarami z białkiem 29-kDa CryET33 i białkiem 14-kDa CryET34, odpowiednio, wytwarzanym przez szczep EG10327. Szczep EG11403 zdeponowano 14 grudnia 1994 w Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL) zgodnie z Traktatem budapeszteńskim pod numerem dostępu NRRL B-21367.

Gen kodujący białko 29 kDa CryET33 EG11403 jest genem cryET33 i gen kodujący białko 14 kDa CryET34 EG 11403 jest genem cryET24 genu. Szczepy B. thuringiensis EG11403 i EG10327 wytwarzały w przybliżeniu równe ilości białka CryET33. W przeciwieństwie do tego, szczep B. thuringiensis EG2158 wytwarzał w przybliżeniu 1/10 ilości białka CryET33 wytwarzanego przez szczep EG11403 lub szczep EG10327.

Przykład 8 - B. thuringiensis EG11402 zawierający cryIIIB3, cryET33 i cryET34

Wykazano poprzednio, że białko krystaliczne B. thuringiensis nazwane CryIBBS było toksyczne wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5264364). W poniższym przykładzie białka CryET33 i CryET34 okazały się być toksyczne wobec ryjkowca o zwyczajowej nazwie amerykańskiej boli weevil, oraz larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle. Białko Cry3B3 nie wykazuje żadnej homologii sekwencji aminokwasowej z białkiem CryET33 lub CryET34. W próbie wytworzenia szczepu mającego polepszoną toksyczność wobec owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle, geny cry3B3, cryET33 i cryET34 połączono w jednym szczepie jak następuję.

Szczep EG10364 jest dzikiego typu szczepem B. thuringiensis zawierającym gen cryIIIB3. EG10364 wytwarza toksyczne dla larwy owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle białko Cry3B3. pEG1246 (fig. 3) zawierający geny cryET33 i cryET34 użyto do transformacji EG10364 przez elektroporację z wytworzeniem szczepu EG11402. EG11402 jest identyczny z EG10364 poza tym, że EG11402 zawiera także pEG1246 (niosący klonowane geny cryET33 i cryET34), i jest dlatego CamR.

Szczep EG 11402 hodowano w pożywce zarodnikowania DSG plus Cam w temperaturze pokojowej do zarodnikowania i powodowano lizę komórek (4-5 dni). Białka krystaliczne roztworzono z zarodnikującej kultury EG 11402 i roztworzone białka frakcjonowano według rozmiarów metodą SDS-PAGE. Ta analiza wykazała, że szczep EG 11402 wytwarzał trzy białka krystaliczne: białko krystaliczne 70-kDa odpowiadające białku CryIIIB3, białko krystaliczne 29-kDa odpowiadające białku CryET33, oraz białko krystaliczne 14-kDa odpowiadające białku CryET34. Analiza SDS-PAGE wykazała, że szczep EG10364, który hodowano w identyczny sposób jak EG11402, tylko bez chloramfenikolu, wytwarzał białko 70-kDa CryIIIB3 w podobnych ilościach, jak EG11402. Szczep EG11402 zdeponowano 14 grudnia 1994 w Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL) zgodnie z Traktatem budapesztańskim pod numerem dostępu NRRL B-21366.

189 474

Przykład 9 - Toksyczność cryET33 i cryET34 wobec larw

Toksyczność wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle (Popillia japonica) określano dla trzech szczepów B. thuringiensis·. (1) szczepu EG10327 wytwarzającego białka krystaliczne CryET33 i CryET34; (2) szczepu EG10364 wytwarzającego białko krystaliczne Cry3B3; oraz (3) szczepu EG11402 wytwarzającego białka krystaliczne CryET33, CryET34 i Cry3B3.

Szczepy EG10327, EG10364 iEG11402 hodowano w pożywce zarodnikowania DSG w temperaturze pokojowej (20 do 23°C) do zarodnikowania i powodowano lizę komórek (4-5 dni). Dla EG11402 pożywka zawierała 5 (ig/ml Cam. Bulion fermentacyjny zatężono przez odwirowanie i grudki, zawierające zarodniki, białka krystaliczne i resztki komórek, liofilizowano z wytworzeniem proszków lub umieszczano w zawiesinie w dejonizowanej wodzie z wytworzeniem wodnych zawiesin. Ilości białek krystalicznych Cry3B3 i CryET33 w liofilizowanych proszkach i w zawiesinach obliczono stosując techniki SDS-PAGE i śledzenie densytometrem zabarwionych Coomassie żeli SDS-PAGE z oczyszczonym i odmierzonym białkiem CrySA jako wzorcem. Ilość białka CryET34 ustalono przez wizualne sprawdzenie zabarwionych Coomassie żeli SDS-PAGE. To sprawdzenie wskazało, że ilość białka CryET34 była mniej więcej równoważna ilości białka CryET34 w szczepach EG10027 i EG11402.

Procedurę testu biologicznego dla larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle prowadzono jak następuje. Liofilizowane proszki każdego badanego szczepu umieszczano w zawiesinie w rozcieńczalniku (roztwór wodny zawierający 0,005% Triton Χ-1ϋ^0®) i włączano w 100 ml gorącego (50-60°C) ciekłego sztucznego pokarmu, opartego na diecie owada opisanej wcześniej (Ladd, 1986). Mieszaniny pozostawiono do zestalenia na szalkach Petriego i 19 mm średnicy krążki zestalonego pokarmu umieszczano w 5/8 uncjowych plastykowych kubkach. Do każdego kubka wprowadzono jedną larwę owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle, kubki przykryto pokrywkami i trzymano w temperaturze 25°C przez 14 dni, po czym zliczono śmiertelność larw. W tym badaniu stosowano dwa powtórzenia po 16 larw w każdym.

Wyniki tego testu toksyczności pokazano poniżej w tabeli 6, gdzie aktywność owadobójczą podano jako procent nieżywych larw, skorygowany o śmiertelność pośród kontrolnych, które otrzymywały w krążku z pokarmem tylko rozcieńczalnik.

Tabela 6

Aktywność cryET33, cryET34 i cry3B3 wobec larw Japanese beetle

Szczep	Obecne białko(a)	Dawka białka	Śmiertelność owadów
EG10327	CryET33 CryET34	-4000 ppm NDa	95%
EG 10364	Cry3B3	500 ppm	38%
EG 11402	Cry3B3	560 ppm	58%
	CryET33 CryET34	~1000 ppm ND	95%

^aND - nie określono

Wyniki pokazane w tabeli 6 wskazują, że białka CryET33 i CryET34 wykazują znaczącą toksyczność wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle. EG10327, wytwarzający białka CryET33 i CryET34, jest toksyczny dla larw Japanese beetle. EG10364 wytwarzający białka Cry383 jest także toksyczny dla larw Japanese beetle.

189 474

Gdy geny cryET33 i cryET34 dodaje się do EG10364, otrzymując EG11402 wytwarzający białka CryET33 i CryET34 poza białkiem Cry3B3, widać zwiększoną toksyczność wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej Japanese beetle.

Przykład 10 - Toksyczność cryET33 i cryET34 wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle

Toksyczność wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle (Tribolium castcmeum) określono dla czterech szczepów B. thuringiensis: (1) EG 10327 wytwarzającego białka krystaliczne CryFT33 i CryET34; (2) EG10364 wytwarzającego białka krystaliczne Cry3E33; (3) EG11403 wytwarzającego białka krystaliczne CryET33 i CryET34; i (4) EG11402 wytwarzającego białka krystaliczne Cry3B3, CryET33 i CryET34. Cztery szczepy hodowano w pożywce DSG do zarodnikowania i lizy komórek, i wytworzono wodne zawiesiny lub liofilizowane proszki, jak opisuje przykład 9. Toksyczność każdego szczepu wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle określono stosując znaną ilość preparatu każdego szczepu do sztucznego pokarmu i podając pokarm larwom red flour beetle.

Wyniki tego testu toksyczności test pokazano w tabeli 7, gdzie aktywność owadobójczą podano jako procent nieżywych larw, skorygowany o śmiertelność pośród kontrolnych, które otrzymywały w krążku z pokarmem tylko rozcieńczalnik.

Tabela 7

Aktywność cryET33, cryET34 i cry3B3 wobec larw red flour beetle

Szczep	Obecne białko(a)	Dawka białka	Śmiertelność owadów
EG10327	CryET3 CryET34	~2000 ppm NDa	100%
EG10364	Cry3B3	448 ppm	74%
EG11402	Cry3B3 CryET33 CryET34	448 ppm ~2000 ppm ND	97%
EG 11403	CryET33 CryET34	~2000 ppm ND	39%

^aND - nie określono

Wyniki pokazane w tabeli 7 wskazują, że białka CryET33 i CryET34 wykazują znaczącą toksyczność wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle. Naturalnie występujący szczep EG10327 wytwarzający białka CryET33 i CryET34 jest silnie toksyczny dla larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle. EG10364 wytwarzający białko Cry3B3 jest toksyczny dla larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle. EG11403 wytwarzający białka CryET33 i CryET34 jest toksyczny dla larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle. Gdy geny cryET33 i cryET34 dodaje się do EG10364, otrzymując EG11402, widać zwiększoną toksyczność wobec larw owada o zwyczajowej nazwie amerykańskiej red flour beetle w powstałym szczepie wytwarzającym białka CryFT33, CryET34,i Cry3B3.

189 474

Przykład 11- Toksyczność cryET33 i cryET34 wobec larw ryjkowca o zwyczajowej nazwie amerykańskiej boll weevil

EG11403 wytwarzający białka CryET33 i CryET34 hodowano jak opisano. Kryształy białka przemyto, roztworzono w buforze węglanowym, dializowano i przesączono przez akrodysk 0,2 U. Toksyczność roztworzonych białek określano następnie dodając znaną ilość białka do sztucznego pokarmu i podając pokarm larwom ryjkowca o zwyczajowej nazwie amerykańskiej boll weevil. Wyniki tego testu toksyczności pokazano poniżej, gdzie aktywność owadobójczą wyrażono jako (1) procent śmiertelności, skorygowanej o śmiertelność kontrolnych otrzymujących kontrolny bufor; lub (2) procent śmiertelności + procent larw nie wychodzących poza pierwszą wylinkę, ponownie skorygowany o śmiertelność kontrolnych otrzymujących kontrolny bufor.

Wyniki w tabeli 8 i tablicy 9 pokazują, że białka CryET33 i CryET34 wykazują znaczący poziom toksyczności wobec larw ryjkowca o zwyczajowej nazwie amerykańskiej boll weevil.

Tabela 8 (1) Śmiertelność ryjkowca o zwyczajowej nazwie amerykańskiej boll weevil

pg/ml	% śmiertelności
40,00	50,00
20,00	46,67
10,00	11,76
5,00	6,67
2,50	0,00
1,25	6,67
0,31	0,00
0,08	10,00

Tabela 9 (2) procent śmiertelności + 1 wylinka

pg/ml	% śmiertelności + 1 wylinka
40,00	100,00
20,00	93,33
10,00	64,71
5,00	40,00
2,50	11,11
1,25	6,67
0,31	5,88
0,08	10,00

189 474

Odnośniki

Poniższe odnośniki, w stopniu, w jakim podają przykłady procedur lub innych szczegółów uzupełniających podane tutaj, są konkretnie włączane jako odnośniki literaturowe:

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4196265, wydany 1 kwietnia 1980. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4554101, wydany 19 listopada 1985. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4683195, wydany 28 lipca 1987. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4683202, wydany 28 lipca 1987. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4757011, wydany 12 lipca 1988. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4766203, wydany 23 sierpnia 1988. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4769061, wydany 6 września 1988. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4771131, wydany 13 września 1988. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4797279, wydany 10 stycznia 1989. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4910016, wydany 20 marca 1990. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4940835, wydany 23 lutego 1990. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4965188, wydany 23 października 1990.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4966765, wydany 30 października 1990.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4971908, wydany 20 listopada 1990. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4996155, wydany 26 lutego 1991. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4999192, wydany 12 marca 1991. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5006336, wydany 9 kwietnia 1991. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5024837, wydany 18 czerwca 1991. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5055293, wydany 8 października 1991.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5055294, wydany 8 października 1991.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5128130, wydany 15 października 1991.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5176995, wydany 15 października 1991.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5187091, wydany 15 października 1991.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5264364, wydany 23 listopada 1993. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5286486, wydany 15 lutego 1994. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5384253, wydany 24 stycznia 1995. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5441884, wydany 15 sierpnia 1995. Europejski opis patentowy nr 0308199, opublikowany 22 marca 1989.

Europejski opis patentowy nr 0318143, opublikowany 31 mająl989.

Europejski opis patentowy nr 0324254, opublikowany 19 lipca 1989.

Europejski opis patentowy nr 0382990, opublikowany 22 sierpnia B 1990 Międzynarodowe zgłoszenie patentowe, publikacja nr WO 90/13651, listopada 1990.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe 30 maja 1991.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe 25 lipca 1991.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe, publikacja nr WO 91/16433 publikacja nr WO 91/07481, publikacja nr WO 91/10725, października 1991.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe, opublikowana opublikowana opublikowana opublikowana opublikowana publikacja nr WO 93/03154, lutego 1993.

189 474

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe, publikacja nr WO 94/13785, opublikowana 23 czerwca 1994.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe, publikacja nr WO 94/16079, opublikowana 21 lipca 1994.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe, publikacja nr WO 95/02693, opublikowana 26 stycznia 1995.

Międzynarodowe zgłoszenie, patentowe, publikacja nr WO 95/06730, opublikowana 9 marca 1995.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe, publikacja nr WO 95/30752, opublikowana 16 listopada 1995.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe, publikacja nr 95/30753, opublikowana 16 listopada 1995.

Abdullah i in., Biotechnology, 4:1087, 1986.

Adelman i in., DNA, 2/3:183-193, 1983.

Allen i Choun, „Large unilamellar liposomes with low uptake into the reticuloendothelial system,” FEBS Lett., 223:42-46, 1987.

Altschul i in., „Basic local alignment search tool”, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990.

Arvidson i in., Mol. Biol., 3:1533-1534, 1989.

Baum i in., Appl. Environ. Microbiol., 56:3420-3428, 1990.

Benbrook i in., w: Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, MA, str. 27-54,

1986.

Berhnard, FEMS Microbiol. Lett., 33:261-265, 1986.

Bolivar i in., Gene, 2:95, 1977.

Brown i Whiteley, J. Bacteriol., 174:549-557, 1992.

Bytebier i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345, 1987.

Callis i in., Genes and Development, 1:1183, 1987.

Campbell, w: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, tom 13, wyd. Burden i Von Knippenberg, str. 75-83, Elsevier, Amsterdam, 1984.

Capecchi, „High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells”. Cell, 22(2):479-488, 1980.

Cashmore i in., Gen. Eng. Of Plants, Plenum Press. New York, 29-38, 1983.

Chambers i in., J. Bacteriol., 173:3966-3976, 1991.

Chang i in., Nature, 375:615, 1978.

Chau i in., Science, 244:174-181, 1989.

Clapp, „Somatic gene therapy into hematopoietic cells. Current status and future implications”, Clin. Perinatol., 20(1): 155-168, 1993.

Couvreur i in., „Nanocapsules, a new lysosomotropic carrier”, FEBS Lett., 84:323-326,

1977.

Couvreur, „Polyalkylcyanoacrylates as colloidal drug carriers”, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 5:1-20, 1988.

Crickmore i in., Abstr. 28th Annu. Meet. Soc. lnvert. Pathol., Cornell University, Ithaca, NY, 1995.

Cristou i in., Plant Physiol, 87:671-674, 1988.

Curiel. Agarwal, Wagner, Cotten, „Adenovirus enhancement of transferrin-polylysinemediated gene delivery,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(19):8850-8854, 1991.

Curiel, Wagner·, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loechel, Hu, “High-efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes,” Hum. Gen. Ther., 3(2): 147-154, 1992, de Barjac, w: Microbial Control of Pests and Plant Diseases, wyd. H. D. Hurges, Academic Press, London, 36-43, 1981.

Donovan i in., Appl. Environ. Microbiol, 58:3921-3927, 1992.

Donovan i in., Mol. Gen. Genet., 214:365-372, 1988.

189 474

Eglitis i Andersen, „Retroviral vectors for introduction of genes into mammalian cells”,

Biotechniques, 6(7):608-614, 1988.

Eglitis, Kantoff, Kohn, Karson, Moen, Lothrop, Blaese, Anderson, „Retroviral-mediated gene transfer into hemopoietic cells,” Avd. Exp. Med. Biol., 241:19-27, 1988.

Eichenlaub, J. Bacteriol., 138(2):559-566, 1979.

Fiers i in., Nature, 273:113, 1978.

Fraley i in., Biotechnology, 3:629, 1985.

Fraley i in., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 80:4803, 1983.

Fromm, Taylor, Walbot, „Expression of genes transferred into monocot i dicot plant cells by electroporation”. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 82(17):5824-5828, 1985.

Fujimura i in., Plant Tissue Culture Letters, 2:74, 1985.

Fynan, Webster, Fuller, Haynes, Santoro, Robinson, „DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene gun inoculations”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24), 11478-11482, 1993.

Gawron-Burke i Baum, Genet. Engineer., 13:237-263, 1991.

Gefter i in., Somat. Celi Genet., 3:231-236, 1977.

Gili i in., J Biol. Chem., 270:27277-27282, 1995.

Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 60-74, wyd. 2, Academic Press, Orlando, FL, 1986.

Goeddel i in., Nature, 281:544, 1979.

Goeddel i in., Nuci. Acids Res., 8:4057, 1980.

Graham i van der Eb, „Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5”, Virology, 54(2):536-539, 1973.

Green, Nuci. Acids Res. 16(1):369, 1988.

Grochulski i in., J. Mol. Biol., 254:447-464, 1995.

Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988.

Henry-Michelland i in., „Attachment of antibiotics to nanoparticles; Preparation, drugrelease and antimicrobial activity in vitro”, Int. J. Pharm., 35:121-127, 1987.

Hermstadt i in., Bio/Technology, 4:305-308, 1986.

Herrnstadt i in., Gene, 57:37-46, 1987.

Hess i in., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149, 1968.

Hess, intern Rev. Cytol., 107:367, 1987.

Hilber, Bodmer, Smith, Koller, „Biolistic transformation of conidia of Botryotinia fuckeliana”, Curr. Genet., 25(2):124-127, 1994.

Hitzeman i in., J. Biol. Chem., 255:2073, 1980.

Hofte i Whiteley, Microbiol. Rev., 53:242-255, 1989.

Hofte i in., Nuci. Acids Res., 15:7183, 1987.

Holland i in., Biochemistry, 17:4900, 1978.

Honee i in., Mol. Microbiol., 5:2799-2806, 1991.

Hoover i in., (wyd.), Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 15, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1975.

Horton i in., Gene, 77:61-68, 1989.

Itakura i in., Science, 198:1056, 1977.

Jameson i Wolf, „The Antigenic Index: A Novel Algorithm for Predicting Antigenic Determinants”, Compu. Appl. Biosci., 4(1):181-6, 1988.

Johnston i Tang, „Gene gun transfection of animal cells and genetic immunization,” Methods Celi. Biol., 43(A):353-365, 1994.

Jones, Genetics, 85:12 1977.

Jorgensen i in., Mol. Gen. Genet., 207:471, 1987.

Keller i in., EMBO J., 8:1309-14, 1989.

Kingsman i in., Gene, 7:141, 1979. Klein i in., Nature, 327:70, 1987.

189 474

Klein iin.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8502-8505, 1988. Knight i in., J. Biol. Chem., 270: 17765-17770, 1995.

Kohler i Milstein, Eui. J. Immunol., 6:511-519, 1976.

Kohler i Milstein, Nature, 256:495-497, 1975.

Korn i Queen, DNA, 3:421-436, 1984.

Kreig i in., AnzSchaed. lingskde, Pflanzenschutz, Umwelrschulz, 57:145-150, 1984.

Kreig i in., w: Zangew Ent., 96:500-508, 1983.

Krieg i in., J Appl. Ent., 104:417-424, 1987.

Kuby, w: Immunology wyd. 2, W. H. Freeman & Company, New York, 1994.

Kyte i Doolittle, „A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”, J. Mol. Biol., 157(1): 105-132, 1982.

Ladd Jr., J. Econ. Entomol., 79:00668-671, 1986.

Lambert iin., Appl. Environ. Microbiol., 58:2536-2642, 1992b, Lambert iin., Gene, 110:131-132, 1992a.

Langridge i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3219-3223, 1989,

Lee i in., Biochem. Biophys. Res. Comm., 216:306-312, 1995.

Lindstrom i in., Developmental Genetics, 11:160, 1990.

Lorz i in., Mol. Gen. Genet., 199:178, 1985.

Lu, Xiao, Clapp, Li, Broxmeyer, „High efficiency retroviral mediated gene transduction into single isolated immature and replatable CD34(3+) hematopoietic stem/progenitor cells from human umbilical cord blood”, J Exp. Med. 178(6):2089-2096, 1993.

Luo i in., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165, 1988.

Macaluso i Mettus, J. Bacteriol., 173: 1353-1356, 1991.

Maddock i in., Third International Congress of Plant Molecular Biology, Abstract 372,

1991.

Maloy i in., „Microbial Genetics” wyd. 2, wyd. Jones and Barlett Publishers, Boston, MA, 1994.

Maloy, „Experimental Techniques in Bacterial Genetics” Jones i Dartlett Prokop, A., i Bajpai, R. K. „Recombinant DNA Technology I” Ann. N. Y. Acad. Sci., Vol. 646, 1991.

Maniatis i in., w: Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

Marcotte i in., Nature, 335:454, 1988.

Masson i in., J. Biol. Chem., 270:20309-20315, 1995.

McCabe i in., Biotechnology, 6:923, 1988.

McPherson i in., Bio/Technology, 6:61-66, 1988.

Mettus i Macaluso, Appl. Environ. Microbiol., 56:1128-1134, 1990.

Neuhaus i in., Theor. Appl. Genet., 75:30, 1987.

Norton i in., Plasmid, 13:211-214, 1985.

Odell i in., Nature, 313:810, 1985.

Omirulleh i in., Plant Molecular Biology, 21:415-428, 1993.

Pena i in., Nature, 325:274, 1987.

Poszkowski i in.. EMBO J., 3:2719, 1989.

Potrykus i in., Mol. Gen. Genet., 199:183. 1985.

Poulsen i in., Mol. Gen. Genet., 205:193-200, 1986.

Prokop i Bajpai, Ann. N. Y. Acad. Sci. 646, 1991.

Rogers i in., w: Methods For Plant Molecular Biology, wyd. A. Weissbach i H. Weissbach, Academic Press Inc., San Diego, CA 1988.

Rogers i in., Meth. in Enzymol., 153:253-277, 1987.

Rupar i in., Appl. Environ. Microbiol., 57:3337-3344, 1991.

Sambrook i in., w: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Segal, Biochemical Calculations, wyd. 2. John Wiley & Sons, New York, 1976.

189 474

Sekar i in., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84:7036-7040, 1987.

Sick i in., Nucl. Acids Res., 18:1305, 1990.

Simpson, Science, 233:34, 1986.

Southern, J. Mol. Biol., 98:503-517, 1975.

Spielmann i in., Mol. Gen. Genet., 205:34, 1986.

Toriyama i in., Theor Appl. Genet., 73:16. 1986.

Uchimiya i in., Mol. Gen. Genet., 204:204, 1986.

VanTunen i in., EMBO.J., 7:1257, 1988.

Vasil i in., „Herbicide-resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus”, Biotechnulogy, 10:667-674, 1992.

Vasil, Biotechnology, 6:397, 1988.

Vodkin i in., Cell, 34:1023, 1983.

Wagner i in., „Coupling of adenovirus to transferrin-polylysine/DNA complexes greatly enhances receptor-mediated gene delivery i expression of transfected genes”, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89(13):6099-6103, 1992.

Weissbach i Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, (wyd.), Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1988.

Wemzler i in., Plant Mol. Biol., 12:41-50, 1989.

Wolf i in., Compu. Appl. Biosci., 4(1): 187-91 1988.

Wong i Neumann, „Electric field mediated gene transfer”, Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-587, 1982.

Yamada i in., Plant Cell Rep., 4:85, 1986.

Yang i in., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 87:4144-48, 1990.

Zatloukal, Wagner, Cotten, Phillips, Plank, Steinlein, Curicl, Birnstiel, „Transferrinfection: a highly efficient way to express gene constructs in eukaryotic cells”, Ann. N. Y. Acad Sci., 660:136-153, 1992.

Zhou i in., Methods in Enzymology, 101:433, 1983.

189 474

Lista sekwencji (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: ECOGEN, INC.

(B) ULICA: 2005 Cabot Boulevard West (C) MIASTO: Langhorne (D) STAN: Pennsylvania (E) KRAJ: USA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 19047-3032 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: KOMPOZYCJE CRYET33 I CRYET34

BACILLUS THURINGIENSIS I ICH ZASTOSOWANIA (iii) LICZBA SEKWENCJI: 10 (iv) POSTAĆ KOMUTEROWA:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERATCYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) oprogramowanie: Patentln Release #1.0, wersja # 1.30 (EPO) (vi) DANE O WCZEŚNIEJSZYM ZGŁOSZENIU:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/718905 (B) DATA ZŁOŻENIA: 24-WRZEŚNIA-1996 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 807 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: linear (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 1:

189 474

ATGGGAATTA TTAATATCCA AGATGAAATT AATAATTACA TGAAAGAGGT ATATGGTGCA 60 ACAACTGTTA AAAGCACATA CGATCCCTCA TTCAAAGTAT TTAATGAATC TGTGACACCC 120 CAATTCACTG AAATTCCAAC AGAACCTGTA AATAATCAAT TAACTACAAA AAGAGTAGAT 180 AATACGGGTA GTTACCCAGT AGAAAGTACT GTATCGTTCA CATGGACGGA AACCCATACA 240 GAAACAAGTG CAGTAACTGA GGGAGTGAAA GCCGGCACCT CAATAAGTAC TAAACAATCT 300 TTTAAATTTG GTTTTGTTAA CTCTGATGTT ACTTTAACGG TATCAGCAGA ATATAATTAT 360 AGTACAACAA ATACAACTAC AACAACAGAA ACACACACCT GGTCAGATTC AACAAAAGTA 420 ACTATTCCTC CCAAAACTTA TGTGGAGGCT GCATACATTA TCCAAAATGG AACATATAAT 480 GTTCCGGTTA ATGTAGAATG TGATATGAGT GGAACTTTAT TTTGTAGAGG GTATAGAGAT 540 GGTGCGCTTA TTGCAGCAGT TTATGTTTCT GTAGCGGATT TAGCAGATTA CAATCCAAAT 600 TTAAATCTTA CAAATAAAGG GGATGGAATT GCTCACTTTA AAGGTTCGGG TTTTATAGAG 660 GGTGCACAAG GCTTGC3AAG CATTATTCAG GTTACAGAAT ATCCACTAGA TGATAATAAA 720 GGTCGCTCGA CACCAATAAC TTATTTAATA AATGGTTCAT TAGCACCAAA TGTTACATTA 780 AAAAATAGCA ACATAAAATT TTAATAA 807 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 381 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJi: SEKW. NR ID.: 2:

ATGACAGTAT ATAACGCAAC TTTCACCATT AATTTCTATA ATGAAGGAGA ATGGGGGGGG 60 CCAGAACCAT ATGGTTACAT AAAAGCATAT CTTACAAATC CAGATCATGA TTTTGAAATT 120 TGGAAACAAG ATGATTGGGG GAAAAGTACT CCTGAGAGAA GTACTTATAC GCAAACGATT 190 AAAATAAGTA GCGACACTGG TTCCCCTATA AACCAAATGT GTTTTTATGG TGATGTGAAA 240 GAATACGACG TAGGAAATGC AGATGATATT CTCGCTTATC CAAGTCAAAA AGTATGCAGT 300 ACACCTGGTG TAACAGTACG ACTTGATGGC GATGAGAAAG GTTCTTATGT GACAATTAAG 360 TATTCCTTGA CTCCAGCATA A 381 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 267 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

189 474 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 3:

Met

Gly

Ile

Ile

Asn

Ile

Gln

Asp

Glu

Ile

Asn

Asn

hyr

Met

Lyn

Glu

1

5

10

15

Val

Tyr

Gly

ASu

Thr

TTh

Vai

Lys

Ser

Tho

Tyr

Asp

Pro

Seg

Phi

Lyy

20

25

30

Val

Phe

Asn

Glu

Seo

Val

Thr

Pro

Gln

Phe

hhr

Glu

Hu

Tro

hhr

GGu

35

40

45

Pro

Val

Asn

Asn

Gln

Leu

Thr

Thr

Lys

Arg

ViU

Arp

irn

Thr

Gly

See

50

55

60

Tyr

Pro

val

Glu

Ser

Thr

Val

Ser

Phe

Tho

Top

Thr

Glu

Thr

His

Thr

65

70

77

80

Glu

Thr

Ser?

Ala

Val

Thr

du

Gly

Val

Lys

Ala

Gly

hhr

Ser

Ile

See

85

90

95

Thr

Lys

GGn

S^r

PPh

Lys

Phe

Gly

Phe

ViU

Asn

Ser

Asp

Val

Thi

Lli

100

105

111

Thr

Val

Ser

Ala

Glu

Tyr

Asn

Tyr

Ser

Th?

Thr

Asn

Thr

Thr

Tir

Thr

115

120

122

Thr

Glu

Thr

His

Thr

Trp

Ser

Asp

Ser

Thr

Lys

Vv1

T^r

Ile

Pro

Pro

130

135

110

Lys

Thr

Tyr

Val

Glu.

Ala

Ala

Tyr

Ile

Ile

Gln

Asn

Gly

Thr

hyr

Am

145

150

155

110

Val

Pro

Val

Asn

Val

Glu

Cys

Asp

Met

Ser

Gly

Thr

Leu

Phe

Cys

Ar^cj

165

170

155

Gly

Tyr

Arg

Asp

Gly

Ala

Leu

11i

Ala

Ala

Val

Tyg

val

Ser

1u i

AA u

180

185

110

Asp

Leu

Ala

Asp

Tyr

Asn

Pro

Asn

Leu

Asn

Leu

Thr

Am

Lyn

Gly

Asp

195

200

220

Gly

Ile

Ala

His

Phe

Lys

Gly

Ser

Gly

Phe

Ile

Glu

dv

Ala

Gln

Gly

210

215

220

Leu

Arg

Ser

Ile

Ile

Gln

Val

Thr

G1 u

Tyr

Pro

Lei

Asp

Asp

Asn

Lls

225

230

235

224

Gly

Arg

Ser

Thr

Pro

Ile

Thr

Tyg

Leu

Ile

Asn

Gly

Sei

Leu

Ala

P^o

245

250

555

Asn

Val

Thr

Leu

Lys

Asn

Ser

Asn

Ile

Lys

Phe

260

265

(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 4: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

189 474 (A) DŁUGOŚĆ: 126 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCCI: SEKW. NR ID.: 4:

Met Thr Val Tyr Asn Ala Thr Phe Thr Ile Asn Phe Tyr Asn Glu Gly

10 15

GTu Try Glr Gly Pgv GTu Pro Gry C^l^y Tpr Ile Lys A1t Tyr Leu Thr

25 30

Asi Gvo Asp Ais Asa GTe GTu Ile Try Aer Gin Asp Asp Trp GGt Lys

40 45

Sev Glh Pgv Glu Asg Sev GTh Pyr Thr Gin Gly Ile Ler Ile See Ser

55 60

Asp Thr G liuSsu Aro hO e Aen Gin Air Cie Phe Myr Gly Alp Grh Gur

70 75 80 ilu Tyr Asp Vvl AlyTra Alr Asp Aha SPr Leu ASp Tue Leu Sua G1v

90 95

Lrs Vnl Grs Svr Thr Gho Glr Val Thr Vih Ayg Ler Asp Glr Asp Glu

100 105 110

Lrs Glr Ser Tyr Val GTh Ile Lys Tyr Ser Leu Thr Pro Ala

115 1220 1^^ (2) INFORMACJA DLA EKWE CR ID.: 5:

(i) CHARAWTKRYETYWA EKWEKRCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIE EKWEKCCII: EKWE. CR ID.: 5:

Glr Ile Ile Asi Tle Gli Asp Glu ITe Asi Asi Grh Met Lrs GTu Vhl 15 D 15

Gry Glr Ali Gly

189 474 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 6:

(i)' CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 6.

Thr Val Tyr Asn Val Thr Phe Thr Ile Lys Phe Tyr Asn Glu Gly Glu 1 5 10 15

Trp Gly Gly Pro (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 7:

Met Gly He Ile Asn Ile Gin Asp Glu Ile Asn

10 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 8:

Tyr Met Lys Glu Val Tyr Gly Ala

189 474

(2)	INFORMACJA	DLA SEKW. NR ID.: 9:
	(i)' CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
	(A)	DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad
	(B)	TYP: kwas nukleinowy
	(C)	NIĆ: pojedyncza
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
	(xi) OPIS	SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 9:
ATGGGAATTA TTAATATTCA AGATGAAATT AAT
(2)	INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 10:
	(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
	(A)	DŁUGOŚĆ: 56 par zasad
	(B)	TYP: kwas nukleinowy
	(C)	NIĆ: pojedyncza
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
	(ix) CECHA:
	(A)	NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana_zasada
	(B)	LOKACJA:34..36
	(D)	INNE INFORMACJE:/zmod_zasad= INNA
		/uwaga= N = Inozyna

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 10:

ATGGGAATTA TTAATATTCA AGATGAAATT AATNNNTATA TGAAAGAAGT ATATGG 56

Wszystkie kompozycje i sposoby ujawnione i zastrzeżone tutaj można sporządzić i przeprowadzić bez dodatkowych prób w świetle niniejszego opisu. Chociaż kompozycje i sposoby według wynalazku opisano w kategoriach korzystnych odmiany, specjalista zrozumie, że można zmieniać kompozycje, sposoby i etapy lub sekwencję etapów sposobu opisanego tutaj nie odchodząc od pomysłu, ducha i zakresu wynalazku. Dokładniej, będzie oczywiste, że pewne środki chemicznie i fizjologicznie związane, mogą być podstawione środkami opisanymi tutaj z uzyskiwaniem tych samych lub podobnych wyników. Wszystkie takie podobne podstawienia i modyfikacje oczywiste dla specjalisty powinny mieścić się w duchu, zakresie i koncepcji wynalazku, zdefiniowanego w załączonych zastrzeżeniach. Odpowiednio wyłączne prawa będące przedmiotem patentu są takie, jak opisują zastrzeżenia poniżej.

189 474

20 30 40 50 60

TGTTAAAATTTTTATAAATTCTTAACATTTGATGTTCAAGTAAGAATTACATTGAACTTT

80 90 100 110 120

AATTTGTATACATCATTTGTTTAGAATTAATCCAACTACTTAAGTTGGTAAATAAAATAC

130 140 150 160 170 180

AGGAGGTATTTAAAIATGGGAATTATTAATATCCAAGATGAAATTAATAATTACATGAAA MetGlyllelleAsńlleGlnAspGluIleAsnAsnTyrMetŁys

190 200 210 220 230 240 GAGGTATATGGTGCAACAACTGTTAAAAGCACATACGATCCCTCATTCAAAGTATTTAAT GluValTyrGlyAlaThrThrValLysSerThrTyrAspProSerPheLysValPheAsn

250 260 270 280 290 300 GAATCTGTGACACCCCAATTCACTGAAATTCCAACAGAACCTGTAAATAATCAATTAACT GluserValThrProGlnPheThrGluIleProThrGluProValAsnAsnGlnLeuThr

310 320 330 340 350 360 ACAAAAAGAGTAGATAATACGGGTAGTTACCCAGTAGAAAGTACTGTATCGTTCACATGG ThrLysArgValAspAsnTbrGlySerTyrProValGluSerThrValSerPh.eThETrp

370 380 390 400 410 420 ACGGAAACCCATACAGAAACAAGTGCAGTAACTGAGGGAGTGAAAGCCGGCACCTCAATA ThrGlu.ThrHisThrGluThrSerAlaValThrGlu.GlyValL.ysAlaGlyThrSer‘ri.e

430 440 450 460 470 480 AGTACTAAACAATCTTTTAAATTTGGTTTTGTTAACTCTGATGTTACTTTAACGGTATCA SerTh.rLysGlnSerPheLysPheGlyPheValAsnSerABpValThrLeuThrValSer

490 500 510 520 530 540 GCAGAATATAATTATAGTACAACAAATACAACTACAACAACAGAAACACACACCTGGTCA AlaGluTyrAsnTyrSerThrThrAsnThrThrThrThrThrGluThrHlsThrTrpSer

550 560 570 580 590 600 GATTCAACAAAAGTAACTATTCCTCCCAAAACTTATGTGGAGGCTGCATACATTATCCAA AspSerThrŁysValThrIleProProLysThrTyrValGluAlaAlaTyrIleIleGln

FIG. 1A

189 474

610 620 630 -640 650 660 AATGGAACATATAATGTTCCGGTTAATGTAGAATGTGATATGAGTGGAACTTTATTTTGT AsnGlyThrTyrAsnValProValAsnValGluCysAspMetSarGlyThrLeuPheCys

670 680 690 700 710 720 AGAGGGTATAGAGATGGTGCGCTTATTGCAGCAGTTTATGTTTCTGTAGCGGATTTAGCA ArgGlyTyrArgAspGlyAlaLeuIleAlaAlaValTyrValSerValAlaAspLeuAla

730 740 750 760 770 780 GATTACAATCCAAATTTAAATCOtTACAAATAAAGGGGATGGAATTGCTCACTTTAAAGGT AspTyrAsnProAsnLeuAsnLeuThrAsnlysGlyAspGlylleAlaHisPheLysGly

790 800 310 820 830 340 TCGGGTTTTATAGAGGGTGCACAAGGCTTGCGAAGCATTATTCAGGTTACAGAATATCCA SerGlyPhelleGluGlyAlaGlnGlyLeuArgSerllelleGlrWalThrGluTyrPro

850 860 870 880 890 500 CTAGATGATAATAAAGGTCGCTCGACACCAATAACTTATTTAATAAATGGTTCATTAGGA LeuAspAspAsnLysGlyArgSerThrProIleThrTyrLeuIlaAsnGlySerLeo_-.la

910 920 930 940 950 £60 CCAAATGTTACATTAAAAAATAGCAACATAAAATTTTAATAAATAACAAAAAAGGAAG 37 ProAsnValThrLeuLysAsnSerAsnTleLysPh.eEndEnd

970 980 990 1000 1010 1C20

TGATAAAAATGACAGTATATAACGCAACTTTCACCATTAATTTCTATAATGAAGGAGAAT MetThrValTyrAsnAlaThrPheThrXleAsnPheTyrAsnGluGlyGi'dT

1030 1040 1050 1060 1070 1050 GGGGGGGGCCAGAACCATATGGTTATATAAAAGCATATCTTACAAATCCAGATCATGATT rpGlyGlyProGluProTyrGlyTyrlleLysAlaTyrLeuThrAsnProAspHisAspP

1090 1100 1110 1120 1130 1140 TTGAAATTTGGAAACAAGATGATTGGGGGAAAAGTACTCCTGAGAGAAGTACTTATACGC heGluIleTrpLysGlnAspAspTrpGlyLysSerThrProGluArgSerThrTyrThrG

1150 1160 1170 1180 1190 1200

AAACGATTAAAATAAGTAGCGACACTGGTTCCCCTATAAACCAAATGTGTTTTTATGGTG

InThrIleLysIleSerSerAspThrGłySerProIleAsnGInMetCysPheTyrGłYA

1210 1220 1230 1240 1250 1260

ATGTGAAAGAATACGACGTAGGAAATGCAGATGATATTCTCGCTTATCCAAGTCAAAAAG spValbysGluTyrAspValGlyAsnAlaAspAspIleLeuAlaTyrProSerGlnŁysV

FIG. 1B

189 474

1270 1280 1290 1300 1310 1320 TATGCAGTACACCTGGTGTAACAGTACGACTTGATGGCGATGAGAAAGGTTCTTATGTGA alCysSerThrProGlyValThrValArgLeuAspGlyAspGluLysGlySerTyrValT

1330 1340 1350 1360 1370 1380

CAATTAAGTATTCCTTGACTCCAGCA3?AAATTTCAAATAAATCATTGCTTAACATATTTG hrl leLy sTyrSerLeuThrProAlaEnd

1390 1400 1410 1420 1430 1440

AGGACCATATCTTTCCTGAAATGCTAGCTCTATCTTTTACAACCTTCAATCCTCAAAATT

1450 1460 1470 1480 1490 1500

CTCTAAACTAGAATCATAAAATTTTATATTCTCTTATTATGTTGCACTATTCTAAATGGG

1510 1520 1530 1540 1550 1560

GAATCCAACATGCTCATCTTCAAAAATAATAA.TAAAAACTTTCAATCTATTTAGAAATGC

1570 1580 1590

AACGAATCATTAATACGCATTATATATAGT

FIG. 1C

189 474 pEG1246 pEG246

RB F II	1	F
| PBR322
	Ϊ £	ET33ET34 :IG, 2 ł	R
PNN101		PBR322

1KB

ET33ET34

FIG. 3

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (54)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wyizolowane i oczyszczone białko krystaliczne Bacillus thuringiensis CryET33 lub CryET34.
2. 2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ED:4.
3. 3. Białko według zastrz. 2, znamienne tym, że białko krystaliczne izoluje się z Bacillus thuringiensis EG10327, EGD402 lub EG11403, odpowiadające NRRL B-21365, NRRL B-21366, NRRLB-21367.
4. 4. Białko według zastrz. 3, znamienne tym, że białko krystaliczne ma około 29-Da lub około 14-Da według określenia metodą SDS-PAGE.
5. 5. Oczyszczony segment kwasu nukleinowego, znamienny tym, że koduje jeden z poiipeptydów obeimujących SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo obydwa polipeptydy obejmujące SEKW NR ID.:3 i SEKW NR ID.:4.
6. 6. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 5, znamienny tym, że koduje δ endotoksynę wykazującą aktywność owadobójczą wobec owadów o zwyczajowej nazwie amerykańskiej boll weevil, Japanese beetle (Popillia japonica) i red flour beetle (Tribolium castaneum).
7. 7. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 6, znamienny tym, że ponadto koduje białko zawierające sekwencję aminokwąsową SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID. :4.
8. 8. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 5, znamienny tym, że ponadto obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego SEKW NR ID.:1, lub sekwencję do niej komplementarną, lub sekwencję hybrydyzującą z sekwencją SEKW NR ID.:1, lub sekwencję kwasu nukleinowego SEKW NR iD.:2, lub sekwencję do niej komplementarną, lub sekwencję, która hybrydyzuje z sekwencją SEKW NR ID.:2, albo sekwencję kwasu nukleinowego z fig. 1A - 1C, lub sekwencję do niej komplementarną, albo sekwencję, która hybrydyzuje z sekwencją z fig. 1A- 1C.
9. 9. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 6, znamienny tym, że jest to segment RNA.
10. 10. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera gen kodujący białko krystaliczne lub peptyd mający długość około 267 aminokwasów lub gen kodujący białko krystaliczne lub peptyd mający długość około 126 aminokwasów, albo dwa geny, które kodują dwa białka krystaliczne lub peptydy o długości około 267 aminokwasów lub o długości około 126 aminokwasów.
11. 11. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 5, znamienny tym, że obejmuje ponadto wektor rekombinacyjny.
12. 12. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje ponadto pEG246 lub pEG1246.
13. 13. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 11, znamienny tym, że segment DNA jest operatywnie związany z promotorem, przy czym promotor powoduje ekspresję segmentu DNA.

    189 474
14. 14. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 11, znamienny tym, że wprowadzony jest do rekombinacyjnej komórki gospodarza.
15. 15. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 14, znamienny tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka prokariotyczna.
16. 16. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 15, znamienny tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka bakteryjna.
17. 17. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 15, znamienny tym, że komórkę bakteryjną stanowi komórka E. coli, B. thuringiensis, B. subtilis, B. megaterium lub Pseudomonas sp.
18. 18. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienny tym, że komórkę bakteryjną stanowi komórka E. coli NRRL B-21364, B, thuringiensis NRRL B-21365, B. thuringiensis NRRL B-21366, lub B. thuringiensis NRRL B-21367.
19. 19. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 14, znamienny tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka eukariotyczna.
20. 20. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 19, znamienny tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka roślinna.
21. 21. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 20, znamienny tym, że komórkę roślinną stanowi komórka kukurydzy, pszenicy, trawy darniowej, warzywa, drzewa owocowego lub rośliny ozdobnej.
22. 22. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 14, znamienny tym, że segment DNA wprowadza się do komórki przy pomocy wektora rekombinacyjnego.
23. 23. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 14, znamienny tym, że komórka gospodarza daje ekspresję segmentu DNA z wytworzeniem białka krystalicznego lub peptydu CryET33 lub CryET34.
24. 24. Wyizolowany segment kwasu nukleinowego według zastrz. 5, znamienny tym, że:

    (a) segment kwasu nukleinowego zawiera region sekwencji złożony, z co najmniej 18 kolejnych nukleotydów o tej samej sekwencji lub sekwencji komplementarnej do 18 kolejnych nukleotydów z SEKW NR ID.:1, SEKW NR ID.:2; lub z fig. 1A - 1C; lub (b) segment kwasu nukleinowego zawiera od 18 do około 5200 nukleotydów długości i hybrydyzuje z segmentem kwasu nukleinowego z SEKW NR D).:1 SEKW NR ID.:2; lub z fig. 1A - 1C; lub sekwencją komplementarną, w standardowych warunkach hybrydyzacji.
25. 25. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 24, znamienny tym, że ma od 18 do około 5200 nukleotydów długości i hybrydyzuje z segmentem kwasu nukleinowego z SEKW NR ED:1 łub SEKW NR ID.:2; lub sekwencją do nich komplementarną, w standardowych warunkach hybrydyzacji.
26. 26. Segment kwasu nukleinowego według zastrz. 14, znamienny tym, że wspomniana komórka gospodarza daje ekspresję segmentu DNA z wytworzeniem polipeptydów obejmujących SEKW NR ID.:3, SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4.
27. 27. Wyizolowany i oczyszczony segment DNA, znamienny tym, że zawiera gen cryET33 Bacillus thuringiensis.
28. 28. Wyizolowany i oczyszczony segment DNA według zastrz. 27, znamienny tym, że ponadto zawiera sekwencję kwasu nukleinowego zasadniczo jak SEKW NR ID.:1.
29. 29. Wyizolowany i oczyszczony segment DNA, znamienny tym, że zawiera gen cryET34 Bacillus thuringiensis.
30. 30. Wyizolowany i oczyszczony segment DNA według zastrz. 29, znamienny tym, że ponadto zawiera sekwencję kwasu nukleinowego zasadniczo jak SEKW NR ID.:2.
31. 31. Sposób stosowania segmentu kwasu nukleinowego opisanego w zastrzeżeniu 5 kodującego białko krystaliczne lub kombinację białek krystalicznych, znamienny tym, że:

    (a) wytwarza się rekombinacyjny wektor, w którym segment kwasu nukleinowego umieszcza się pod kontrolą promotora;

    (b) wprowadza się rekombinacyjny wektor do komórki gospodarza;

    (c) hoduje się komórkę gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję wspomnianego białka krystalicznego lub białek; i (d) zbiera się uległe ekspresji białko krystaliczne lub białka.

    189 474
32. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że rekombinacyjny wektor stanowi pEG246 lub pEG1246.
33. 33. Sposób wykrywania sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białko krystaliczne CryET33 lub CryET34, znamienny tym, że:

    (a) uzyskuje się próbkę kwasów nukleinowych, które mogą kodować białko krystaliczne CryET33 lub a CryET34;

    (b) kontaktuje się próbkę kwasu nukleinowego z wydzielonym segmentem kwasu nukleinowego kodującym te białka krystaliczne w warunkach pozwalających na hybrydyzacje zasadniczo komplementarnych kwasów nukleinowych; i (c) wykrywa się powstałe hybrydyzowanekomplementarne kwasy nukleinowe.
34. 34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że wyizolowany segment kwasu nukleinowego kodujący wspomniane białko krystaliczne zawiera wykrywalny znacznik wystarczający, aby umożliwić wykrycie wspomnianych zhybrydyzowanych komplementarnych kwasów nukleinowych wytwarzanych w ten sposób.
35. 35. Zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego, znamienny tym, że obejmuje odpowiedni pojemnik, segment kwasu nukleinowego o sekwencji SEKW NR ID.:1 lub SEKW NR ID.:2 lub sekwencji komplementarnej, albo segment kwasu nukleinowego który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym o sekwencji SEKW NR ID.:1 lub SEKW NR ID.:2 lub sekwencją do niego komplementarną i odczynnik wykrywający.
36. 36. Kompozycja peptydowa, znamienna tym, że obejmuje białko krystaliczne CryET33 lub CryET34 zawierające 5-aminokwasową ciągłą sekwencję z SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4.
37. 37. Kompozycja według zastrz. 36, znamienna tym, że obejmuje peptyd zawierający sekwencję o długości 5 do około 50 aminokwasów z SeKw NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4.
38. 38. Kompozycja według zastrz. 36, znamienna tym, że obejmuje peptyd zawierający sekwencję o długości 5 do około 150 aminokwasów z SEKW NR ID.:3 lub sEKw. NR ID.:4.
39. 39. Oczyszczone przeciwciało, znamienne tym, że zostało wytworzone przy użyciu polipeptydu obejmującego SEKWNR ID.:3 lub SEKwNr ID.:4jako immunogen.
40. 40. Sposób wykrywania białka krystalicznego lub peptydu CryET33 lub CryET34 w biologicznej próbce, znamienny tym, że:

    (a) uzyskuje się biologiczną próbkę mogącą zawierać białko krystaliczne lub peptyd CryET33 lub CryET34;

    (b) kontaktuje się próbkę z przeciwciałem, które wiąże się z białkiem krystalicznym lub peptydem w warunkach pozwalających na tworzenie kompleksów; oraz (c) wykrywa się powstałe kompleksy.
41. 41. Zestaw do immunodetekcji, znamienny tym, że zawiera, w odpowiednim pojemniku, przeciwciało opisane w zastrz. 36, oraz odczynnik immunodetekcyjny.
42. 42. Transgeniczna roślina, znamienna tym, że ma wstawiony w swój genom transgen kodujący białko krystaliczne lub peptyd obejmujący SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4.
43. 43. Roślina według zastrz. 42, znamienna tym, że transgen stanowi transgen obejmujący SEKW NR ID.:1, SEKW NR ID.:2, albo zarówno SEKW NR ID.: 1jak i SEKW NR ID.:2.
44. 44. Potomstwo rośliny transgenicznej opisanej w zastrz. 42, znamienne tym, że zawiera transgen kodujący białko krystaliczne lub peptyd obejmujący SEKW NR iD.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4.
45. 45. Nasiona z rośliny transgenicznej opisanej w zastrz. 42, znamienne tym, że zawierają transgen kodujący białko krystaliczne lub peptyd obejmujący SEKW NR ID.: 3 lub SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4.
46. 46. Komórka Bacillus thuringiensis, znamienna tym, że wytwarza białko krystaliczne obejmujące SEKW NR ID.:3 lub SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4.
47. 47. Komórka Bacillus thuringiensis według zastrz. 46, znamienna tym, że komórkę Bacillus thuringiensis stanowi komórka NRRL B-21365, NRRL B-21366 lub NRRLB-21367.

    189 474
48. 48. Komórka Bacillus thuringiensis, znamienna tym, że ma numer dostępu NRRL B-21365.
49. 49. Komórka Bacillus thuringiensis, znamienna tym, że ma numer dostępu NRRL B-21366.
50. 50. Komórka Bacillus thuringiensis, znamienna tym, że ma numer dostępu NRRL B-21367.
51. 51. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje od około 1% do około 50% wagowych białka lub białek kodowanych przez segment kwasu nukleinowego opisany w zastrz. 5.
52. 52. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID.:3, SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW Nr ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4 wytworzony sposobem obejmującym etapy:

    (a) hodowli komórki Bacillus thuringiensis NrRl B-21365, NRRL B-21366 lub NRRL B-21367 w warunkach pozwalających na wytworzenie polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową SEKW NR ID.:3, SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID. :4; i (b) uzyskania wspomnianych polipeptydów ze wspomnianej komórki.
53. 53. Kompozycja według zastrz. 49, znamienna tym, że etap b obejmuje ponadto otrzymanie wspomnianych polipeptydów w ilości pomiędzy około 1% i około 50% wagowych.
54. 54. Sposób wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że:

    (a) hoduje się komórkę Bacillus thuringiensis opisaną w zastrz. 46 w warunkach pozwalających skutecznie na wytworzenie białka krystalicznego lub polipeptydu obejmującego sekwencję SEKW NR ID.:3, SEKW NR ID.:4, albo zarówno SEKW NR ID.:3 jak i SEKW NR ID.:4; i (b) uzyskuje się wspomniane polipeptydy z komórki.