PL190228B1 - Sposób modyfikowania kwitnienia w roślinach - Google Patents
Sposób modyfikowania kwitnienia w roślinachInfo
- Publication number
- PL190228B1 PL190228B1 PL98336852A PL33685298A PL190228B1 PL 190228 B1 PL190228 B1 PL 190228B1 PL 98336852 A PL98336852 A PL 98336852A PL 33685298 A PL33685298 A PL 33685298A PL 190228 B1 PL190228 B1 PL 190228B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- ath1
- plants
- flowering
- plant
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 47
- 101150111419 ATH1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 138
- 101100433747 Arabidopsis thaliana ABCA2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 101100288148 Arabidopsis thaliana KNAT5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 101100135611 Arabidopsis thaliana PAP12 gene Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 101150002428 Atoh1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 101100057132 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) ATC1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 125
- 102100029373 Transcription factor ATOH1 Human genes 0.000 claims abstract description 124
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 21
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 151
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 36
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 34
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 26
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 24
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 22
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 22
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 22
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 8
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 6
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 6
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 6
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 6
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000007330 shade avoidance Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 4
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 102220623459 Pentraxin-4_H10E_mutation Human genes 0.000 description 4
- 108010067965 Phytochrome B Proteins 0.000 description 4
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 4
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 3
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000051 Plastocyanin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 241001164374 Calyx Species 0.000 description 2
- 229920002160 Celluloid Polymers 0.000 description 2
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 2
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 101150048253 PHYA gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000679 Phytochrome Proteins 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 101150081158 crtB gene Proteins 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003898 horticulture Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000002015 leaf growth Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 101150110490 phyB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000005082 stem growth Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700002450 Arabidopsis KNAT5 Proteins 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021538 Chard Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000208150 Geraniaceae Species 0.000 description 1
- RSQSQJNRHICNNH-UHFFFAOYSA-N Gibberellin A4 Natural products OC(=O)C1C2(CC3=C)CC3CCC2C2(OC3=O)C1C3(C)C(O)CC2 RSQSQJNRHICNNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHDWSDSMWJQURA-UHFFFAOYSA-N Gibberellin A51 Natural products C12CCC(C3)C(=C)CC23C(C(O)=O)C2C3(C)C(=O)OC21CC(O)C3 HHDWSDSMWJQURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000986989 Naja kaouthia Acidic phospholipase A2 CM-II Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 1
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- GOOXRYWLNNXLFL-UHFFFAOYSA-H azane oxygen(2-) ruthenium(3+) ruthenium(4+) hexachloride Chemical compound N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.[O--].[O--].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Ru+3].[Ru+3].[Ru+4] GOOXRYWLNNXLFL-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000003028 elevating effect Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009970 fire resistant effect Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- RSQSQJNRHICNNH-NFMPGMCNSA-N gibberellin A4 Chemical compound C([C@@H]1C[C@]2(CC1=C)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@@]2(OC3=O)[C@H]1[C@@]3(C)[C@@H](O)CC2 RSQSQJNRHICNNH-NFMPGMCNSA-N 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000021217 seedling development Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000008511 vegetative development Effects 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
1 . Sposób modyfikowania kwitnienia w roslinach, znamienny tym, ze obejmuje transformowanie roslin konstruktem zawierajacym pelna albo czesciowa sekwencje DNA kodujaca produkt ATH1 pod kontrola promotora dzialajacego w roslinach. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób modyfikowania kwitnienia w roślinach obejmujący transformowanie roślin konstruktem zawierającym pełną albo częściową sekwencję DNA kodującą produkt ATH1 pod kontrolą promotora działającego w roślinach. Rośliny różnią się od zwierząt. Ciało dojrzałej rośliny tworzy się postembrionalnie przez ciągłą aktywność merystemów wierzchołkowych pędu i korzenia. Merystem wierzchołkowy pędu tworzy się w czasie embriogenezy rośliny i razem z liścieniami, hipokotylem, korzeniem zarodkowym i merystemem korzeniowym wytycza podstawowy plan budowy rośliny.
Merystem wierzchołkowy korzenia powstaje jako zgrupowanie około stu komórek i jest źródłem całej nadziemnej części rośliny7. W czasie wegetatywnej fazy rozwoju rośliny merystem ten daje początek liściom (rozeta), łodydze i spoczynkowym merystemom bocznym. Po tym następuje tworzenie się kwiatostanów drugorzędowych, liści łodygowych i ostatecznych merystemów kwiatowych po indukcji kwitnienia. Kwitnienie obejmuje kompleks oddziaływań produktów genów, które regulują zmianę tożsamości merystemu pędu. Czynnikami określającymi poziomy ekspresji tych genów są genotyp i bodźce środowiskowe, takie jak fotoperiod, temperatura i jakość światła. W dużej mierze jest nadal nieznane, w jaki sposób jest uzyskiwana ta zmiana pod wpływem bodźców.
Jednym z najważniejszych zdarzeń w cyklu życiowym rośliny jest decyzja wejścia w fazę rozrodczą. Szeroki zakres sygnałów środowiskowych i endogennych kontroluje przejście z fazy wegetatywnej do fazy rozrodczej. Ważnymi sygnałami są długość dnia, temperatura (wernalizacja), dostępność wody i czynników odżywczych oraz szereg fitohormonów, a w szczególności giberelin (GA). Sygnały te indukują zmianę tożsamości wegetatywnego merystemu wierzchołkowego, zwaną przejściem do kwitnienia i to przejście stanowi o powstaniu merystemu kwiatowego. Podczas gdy produktem wegetatywnego merystemu wierzchołkowego są zawiązki liści, merystem kwiatowy wytwarza zawiązki, które różnicują się w kwiatostany drugorzędowe w czasie wczesnego wzrostu generatywnego i w kwiaty później w tym stadium. W badaniach dotyczących hodowli roślin, kontrola tych procesów stanowi najważniejszy problemem dla wielu roślin uprawnych. Ma to szczególne znaczenie dla roślin rozetowych, takich jak sałata, szpinak i burak cukrowy, u których następuje szybkie wydłużanie łodygi (wystrzeliwanie) po przejściu do kwitnienia, co czyni uprawę bezużyteczną.
Przejście od wzrostu wegetatywnego do reproduktywnego jest krytycznym etapem rozwojowym, a ponieważ jest to pierwszy etap rozmnażania płciowego, ma ogromne znaczenie w rolnictwie, ogrodnictwie i hodowli roślin. Rolnicy mogą chcieć przyspieszyć lub opóźnić czas kwitnienia lub całkowicie mu zapobiec: przykładowo w celu zapobiegania „wystrzeliwaniu” np. u sałaty lub buraka cukrowego. Lepsze zrozumienie biologii molekularnej kwitnienia
190 228 roślin umożliwi jego kontrolowanie lub wpływanie nań w różny sposób, dostarczając rolnictwu ważnych praktycznych korzyści.
W publikacji PCT W096/14414, ujawniono zastosowanie genu Constans (CO) do modyfikowania mechanizmów kwitnienia.
Niniejszy wynalazek proponuje sposób wpływania na przejście roślin od wzrostu wegetatywnego do reproduktywnego przez dostarczenie transformowanych roślin, w których przejście jest opóźnione lub przyspieszone przez ekspresję specyficznych transgenów wpływających na ten proces. Takie geny mogą być wyrażane konstytutywnie lub wyrażane jedynie w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne, na przykład środowiskowe lub chemiczne.
ATH1 jest genem Arabidopsis thaliana zawierającym homeobox. Gen ten jest opisany przez Quaedvlieg i wsp., w Plant Celi 7, 117-129, 1995 (włączone tu jako odniesienie): jego sekwencja jest podana w fig. 1 w tej publikacji. Został on wyizolowany z kolekcji czynników transkrypcyjnych indukowanych światłem. Podlega ekspresji w młodych siewkach i kwiatach. Poziomy mRNA ATH1 w etiolowanych siewkach są bardzo zależne od światła (fitochrom) i wykazują również adaptację świetlną.
Obecnie ustaliliśmy, że produkt białkowy ATH1 jest zaangażowany w zmianę rozwojową od wzrostu wegetatywnego do generatywnego. W rezultacie badań nad ATH1::GUS i wstępnych badań nad 35S::ATH1 wywnioskowaliśmy, że ATH1 pełni funkcję w przemianie wegetatywnego merystemu wierzchołkowego w merystem kwiatowy. Konkretnie, ATH1 działa jako antygiberelina, przez represję syntezy GA lub możliwe szlaku odpowiedzi na GA: ilustruje to Przykład 6.
Nasze badania nad konstruktami ATH1::GUS wykazały, że w młodych, rosnących na świetle siewkach ATH1 jest wyrażany we wszystkich trzech warstwach merystemu wierzchołkowego pędu i zawiązkach liści. W młodych, ciągle rozwijających się liściach, ATH1 podlega ekspresji w tkance naczyniowej. Ekspresja ta zanika w liściach rozwiniętych. Ekspresja ATH1 w merystemie jest w znacznej mierze ograniczona do wegetatywnej fazy rozwoju. Jak tylko Arabidopsis zaczyna kwitnąć (zmiana rozwoju wegetatywnego na generatywny) i merystem wierzchołkowy pędu staje się merystemem kwiatowym, ekspresja ATH1 w merystemie obniża się. W czasie fazy kwitnienia ATH1 jest wytwarzany na niskim poziomie w rozwijającej się tkance naczyniowej łodygi. Później w rozwoju rośliny, kiedy pojawiają się kwiaty, ATH1 ulega ekspresji w różnych częściach młodej rośliny (dno kwiatowe, działka kielicha lub tkanka naczyniowa pręcika). Nasza hipoteza, że ATH1 jest zaangażowany w kontrolowanie przemiany faz od wzrostu wegetatywnego do generatywnego, jest dalej potwierdzona przez fenotypy czasu kwitnienia przy nadekspresji ATH1 w formie sensownej i antysensownej. Rośliny ektopikalnie wyrażające antysensowny ATH1 wykazują fenotyp wczesnego kwitnienia; przeciwnie, większość roślin przenoszących konstrukty do nadekspresji sensownego ATH1 są późno kwitnące. Mała część roślin przenoszących konstrukty do nadekspresji jest, na skutek obniżenia ATH1 przez kosupresję, wczesno kwitnąca, tak jak w przypadku nadekspresji antysensownego ATH1, a fenotyp tych roślin przypomina mutanta terminal flower (Shannon i MeeksWagner, 1991) i fenotypy przy nadekspresji LEAFY (Weigel i Nilsson, 1995), APETALA 1 (Mandel i Yanowski, 1995) i CONSTANS (Putteril i wsp., 1995). W oparciu o te wyniki, w połączeniu z danymi dla ATH1::GUS, wywnioskowaliśmy, że ATH1 jest zaangażowany w kontrolowanie fazy przejścia od wzrostu wegetatywnego do generatywnego u Arabidopsis thaliana i prawdopodobnie jest genem regulującym czas kwitnienia.
W konsekwencji, przejście można promować przez hamowanie ekspresji genu ATH1, bądź tez opóźniać lub zapobiegać mu przez promowanie takiej ekspresji.
Przedmiotem wynalazku jest sposób modyfikowania kwitnienia roślin, który obejmuje transformowanie roślin konstruktem zawierającym pełną albo częściową sekwencję DNA kodującą produkt ATH1 pod kontrolą promotora działającego w roślinach.
Korzystnie proces kwitnienia w roślinach jest promowany przez transformowanie roślin konstruktem, który hamuje wytwarzanie białka ATH1, korzystniej konstrukt jest przystosowany do ekspresji antysensownego RNA do RNA wytwarzanego przez gen ATH1.
W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku proces kwitnienia w roślinach jest opóźniany przez transformowanie roślin konstruktem, który promuje wytwarzanie zrekombinowanego białka ATH1.
190 228
Stosowanie sekwencji do hamowania albo promowania ekspresji genu jest całkiem dobrze poznane. Pełna sekwencja genu, pod kontrolą promotora, który działa efektywnie w roślinie, będzie generalnie dawać nadekspresję produktu genu, prowadząc do wzmocnienia efektu działania wytwarzanego w ten sposób białka. Czasami poziom produktu genu jest obniżany: zjawisko to jest nazywane „kosupresją”. Obniżenie poziomu produktu genu uzyskuje się również generalnie przez zastosowanie mutacji dominujących negatywnych lub przez odwrócenie orientacji sekwencji genu w stosunku do promotora tak, że wytwarzany jest „antysensowny” informacyjny RNA.
Konstrukt DNA stosowany w sposobie według wynalazku może być konstruktem „antysensownym” wytwarzającym RNA „antysensowny” lub konstruktem „sensownym” (kodującym, co najmniej część funkcjonalnego białka) wytwarzającym RNA „sensowny”. RNA „antysensowny” jest sekwencją RNA, która jest komplementarna do sekwencji zasad w odpowiadającym mu mRNA: komplementarna w tym znaczeniu, że każda zasada (lub większość zasad) w sekwencji antysensownej (czytanej w kierunku 3' do 5) ma zdolność do tworzenia par z odpowiadającymi zasadami (G z C, A z U) w sekwencji mRNA czytanej w kierunku od 3' do 5'. Taki antysensowny RNA może być wytwarzany w komórce przez transformowanie odpowiednim konstruktem genowym zorganizowanym tak, aby wytwarzać transkrypt, którego co najmniej część sekwencji jest komplementarna do co najmniej części nici kodującej odpowiedniego genu (lub sekwencji DNA wykazującej do niej zasadniczą homologię). „RNA sensowny” jest sekwencją RNA, która jest zasadniczo homologiczna do co najmniej części odpowiadającego jej konstruktu DNA w prawidłowej orientacji, tak aby wytwarzać transkrypt o sekwencji identycznej z co najmniej częścią nici kodującej odpowiedniego genu (lub sekwencji DNA wykazującej do niego zasadniczą homologię). Odpowiednie konstrukty sensowne można zastosować do hamowania ekspresji genu (jak opisano w Międzynarodowym zgłoszeniu patentowym W001/08299) lub konstrukt sensowny kodujący i wyrażający funkcjonalne białko można transformować do rośliny w celu nadprodukcji białka.
Konstrukty DNA stosowane w sposobie według wynalazku mogą zawierać sekwencję zasad o długości co najmniej 10 zasad (korzystniej co najmniej 35 zasad) do transkrypcji do RNA.
Teoretycznie nie istnieje żadna górna granica dla sekwencji zasad - może być ona tak długa, jak odpowiednie mRNA wytwarzane przez komórkę, ale dla wygody na ogół będzie wystarczało zastosowanie sekwencji o długości pomiędzy 100 i 1000 zasad. Wytwarzanie takich konstruktów jest opisane bardziej szczegółowo poniżej.
Jako źródło sekwencji zasad DNA do transkrypcji, można zastosować odpowiedni cDNA lub DNA genomowy albo syntetyczny polinukleotyd. Izolowanie odpowiednich sekwencji ATH1 z Arabidopsis jest opisane w Quaedvlieg i wsp., powyżej; podobne metody można zastosować do izolowania sekwencji ATH1 z innych roślin. Mogą mieć one większy lub mniejszy stopień homologii z sekwencjami ATH1 z Arabidopsis. Można w ten sposób otrzymać sekwencje kodujące kompletne lub zasadniczo kompletne białko. Sekwencje DNA odpowiedniej długości można wyciąć w celu ich użycia za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych. Kiedy stosuje się genomowy DNA jako źródło częściowej sekwencji zasad do transkrypcji, możliwe jest zastosowanie zarówno regionów intronowych, jak i eksonowych lub kombinację obydwu. W celu otrzymania konstruktu odpowiedniego do modyfikowania ekspresji ATH1 w komórkach roślinnych, można zastosować sekwencję cDNA taką, jaką znajduje się w cDNA dla białka lub sekwencję genu, jaka znajduje się w chromosomie rośliny. Zrekombinowane konstrukty DNA można wytworzyć przy zastosowaniu standardowych technik. Przykładowo, sekwencję DNA do transkrypcji można wytworzyć przez traktowanie wektora zawierającego taką sekwencję enzymem restrykcyjnym w celu wycięcia odpowiedniego fragmentu. Sekwencję DNA do transkrypcji można również wytworzyć przez przyłączenie i ligację syntetycznych oligonukleotydów lub przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu wytworzenia odpowiednich miejsc restrykcyjnych na każdym końcu. Sekwencję DNA klonuje się następnie do wektora za promotorem i przed terminatorem. Jeżeli wymagany jest DNA antysensowny, klonowanie przeprowadza się tak, aby wycięta sekwencja była odwrócona w stosunku do swojej orientacji w nici, z której została wycięta.
W konstrukcie wyrażającym RNA antysensowny nić, która poprzednio była nicią matrycową staje się nicią kodującą i odwrotnie. Konstrukt będzie zatem kodował RNA o sekwencji
190 228 zasad, która jest komplementarna do części albo całej sekwencji mRNA dla białka. A zatem dwie nici RNA są komplementarne nie tylko w swojej sekwencji zasad, ale również orientacji (5' do 3').
W konstrukcie wyrażającym RNA sensowny, nici, matrycowa i kodująca, zachowują przeznaczenie i orientację wyjściowego genu roślinnego. Konstrukty wyrażające RNA sensowny kodują RNA z sekwencją zasad, która jest homologiczna do części albo całej sekwencji mRNA. W konstruktach, które wyrażają funkcjonalne białko, cały region kodujący genu jest połączony z sekwencjami kontrolującymi transkrypcję zdolnymi do ekspresji w roślinach.
Przykładowo, konstrukty stosowane w sposobie według wynalazku mogą być wytworzone jak następuje. Odpowiedni wektor zawierający pożądaną sekwencję zasad do transkrypcji (taki jak klon cDNA pATHl) traktowany jest enzymem restrykcyjnym w celu wycięcia tej sekwencji. Otrzymaną w ten sposób nić DNA klonuje się (jeśli trzeba, w odwrotnej orientacji) w drugim wektorze zawierającym pożądaną sekwencję promotorową i pożądaną sekwencję terminatorową. Odpowiednie promotory obejmują promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora i promotor genu poligalakturonazy pomidora (Bird i wsp., 1988, Plant Molecular Biology. 11:651-662) oraz inne promotory roślinne regulowane w rozwoju. Odpowiednie sekwencje terminatorowe obejmują taką sekwencję z genu syntazy nopalinowej Agrobacterium tumefaciens (koniec 3' nos).
W konstrukcie DNA stosowanym w sposobie według wynalazku region inicjacji transkrypcji może pochodzić z dowolnego promotora działającego w roślinach. Region inicjacji transkrypcji może być usytuowany tak, aby uzyskać transkrypcję sekwencji DNA kodującej mRNA, które jest komplementarny do odpowiednio dużego ciągu zasad w mRNA kodującym białko ATH1 (czyniąc konstrukt DNA pełnym lub częściowym konstruktem antysensownym).
Regionem inicjacji transkrypcji (lub promotorem) działającym w roślinach może być promotor konstytutywny (taki jak promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora) lub promotor indukowany lub regulowany w rozwoju, zależnie od wymagań. Przykładowo, może być pożądane modyfikowanie aktywności białka na pewnych etapach rozwoju rośliny. Zastosowanie konstytutywnego promotora będzie wpływać na poziomy i funkcje białka we wszystkich częściach rośliny, podczas gdy zastosowanie promotora specyficznego dla tkanki umożliwi bardziej selektywną kontrolę ekspresji genu i związanych z tym funkcji. A zatem RNA antysensowny lub sensowny jest wytwarzany jedynie w narządzie, w którym jego działanie jest wymagane.
Konstrukty DNA stosowane w sposobie według wynalazku można wstawiać do roślin w celu regulowania ekspresji genu ATH1 prowadząc do modyfikacji cech roślin (w szczególności kwitnienia). W zależności od natury konstruktu, wytwarzanie produktu genu ATH1 może być zwiększane lub zmniejszane, bądź przez cały czas, bądź w określonym stadium życia rośliny. Generalnie, jak można się spodziewać, wytwarzanie białka jest zwiększane jedynie przez konstrukty, które wyrażają RNA homologiczny do zasadniczo kompletnych endogennych mRNA dla białka. Sensowne konstrukty pełnej długości mogą również hamować ekspresję białka. Konstrukty zawierające niekompletną sekwencję DNA, krótszą niż sekwencja odpowiadająca kompletnemu genowi, generalnie hamują ekspresję genu i wytwarzanie białek niezależnie od tego, czy są zorganizowane do ekspresji RNA sensownego czy antysensownego.
Konstrukt DNA stosowany w sposobie według wynalazku transformuje się do docelowej komórki roślinnej. Docelowa komórka roślinna może być częścią całej rośliny lub może być izolowaną komórką lub częścią tkanki, którą można regenerować do całej rośliny. Docelową komórkę roślinną można wybrać z dowolnego gatunku roślin jednoliściennych lub dwuliściennych. Rośliny mogą pochodzić z transformowanej komórki roślinnej przez regenerację transformantów i przez wytwarzanie kolejnych pokoleń potomstwa transformantów.
Konstrukty stosowane w sposobie według wynalazku można stosować do transformowania dowolnej rośliny przy zastosowaniu odpowiedniej techniki transformacji w celu wytworzenia roślin według wynalazku. Zarówno komórki roślin jednoliściennych, jak i dwuliściennych można transformować wieloma sposobami znanymi w tej dziedzinie. W wielu przypadkach takie komórki roślinne (szczególnie wtedy, kiedy są to komórki roślin dwuliściennych), można hodować w celu zregenerowania całej rośliny, która następnie rozmnaza się dając kolejne pokolenia zmodyfikowanych genetycznie roślin. Można zastosować dowolną
190 228 odpowiednią metodę transformacji roślin. Przykładowo, rośliny dwuliścienne, takie jak pomidor i melon można transformować przy zastosowaniu technologii plazmidu Ti Agrobacterium, takiej jak opisana przez Bevan (1984, Nucleic Acid Research, 12:8711-8721) lub Fillatti i wsp. (Biotechnology, Czerwiec 1987, 5:726-730). Tak stransformowane rośliny można rozmnażać płciowo albo przez hodowle komórkowe lub tkankowe. Rośliny jednoliścienne można transformować przy zastosowaniu działa genowego. Inne sposoby transformacji roślin obejmują mikrowstrzyknięcie i elektroporację.
Przykłady genetycznie zmodyfikowanych roślin według wynalazku obejmują zboza, przykładowo ryz i kukurydzę, pszenicę, jęczmień, owies i zyto. Innymi ważnymi produktami nasiennymi są rzepak oleisty (kanola), burak cukrowy, słonecznik, soja i sorgo. Większość roślin uprawnych hoduje się corocznie z nasion i wytwarzanie nasion dowolnego rodzaju zalezy od zdolności rośliny do kwitnienia, do jej zapylenia i wytworzenia nasion. Kontrola czasu kwitnienia jest istotna w ogrodnictwie. Rośliny ogrodnicze, których kwitnienie może podlegać kontroli, obejmują sałatę, cykorię, warzywa z rodzaju Brassica włączając w to kapustę, brokuły, kalafior; oraz goździki i pelargonie.
Główną właściwością zmodyfikowanych roślin uzyskanych sposobem według wynalazku jest wczesne lub opóźnione kwitnienie. Genotypy, w których wytwarzanie białka ATH1 jest hamowane generalnie kwitną wcześnie; genotypy, w których jest on stymulowany kwitną późno. Można obserwować również inny wpływ na fenotyp, np. karłowacenie np. u tytoniu.
Kontrolowanie czasu kwitnienia może być użyteczne z kilku powodów. Przykładowo, kwitnienie można kontrolować w celu dostarczenia kwiatów lub owoców w czasie najbardziej odpowiednim do sprzedaży. Przy wytwarzaniu hybryd, można koordynować kwitnienie męskich i żeńskich rodziców. Najdogodniej jest dokonać tego przez zastosowanie indukowalnych promotorów genów, odpowiadających na bodźce zewnętrzne, na przykład zastosowanie związków chemicznych. Przykładem takiego promotora jest promotor genu izoformy II
S-transferazy glutationowej, aktywowany przez zastosowanie znanego czynnika zabezpieczającego przed herbicydem (Wo 93/01294 dla ICI).
Kontrola wystrzeliwania może być ekonomicznie ważna dla wielu gatunków roślin uprawnych. Przykładowo, w przypadku buraka cukrowego ogromne zastosowanie będzie miało wytwarzanie odmian, które mają zmniejszoną tendencję do wystrzeliwania po zadziałaniu zimnem. Przetwórnie będą mogły wydłużyć w czasie okres aktywności, ze znaczącymi oszczędnościami w ogólnych kosztach. Odmiany oporne na wystrzeliwanie mogłyby być siane bardzo wcześnie w sezonie (luty), a nawet poprzedniego roku jesienią (zakładając, ze zimowe przymrozki nie stanowią problemu). Ponadto, odmiany, w których wystrzeliwanie jest zwiększone mogą być szybciej hodowane: krzyżowanie można przeprowadzać corocznie zamiast raz na dwa lata jak dotychczas.
Wczesnokwitnący słonecznik mógłby zwiększyć zasięg geograficzny. Można by go hodować bardziej na północ (na północ od Paryża) i możliwe w bardziej suchych regionach, np częściach Hiszpanii, unikając okresów suszy późnym latem.
W przypadku warzyw, wystrzeliwanie można kontrolować na przykład dla sałaty i cykorii. Umożliwiłoby to łatwiejsze hodowanie rośliny uprawnej w czasie lata. Istniejące odmiany mają tendencję do gwałtownego wystrzeliwania w warunkach letnich. W przypadku traw zredukowanie (lub brak) wystrzeliwania jest korzystne dla typów paszowych (poprawia jakość karmy) i typów rekreacyjnych (lepsza jakość trawników).
Czasami korzystne jest kontrolowanie ekspresji transgenu w czasie tak aby zatrzymać ją po rozpoczęciu się kwitnienia albo hamować naturalnie występujące geny aż do czasu rozpoczęcia kwitnienia. Można tego dokonać przez zastosowanie promotora ATH1 do kontrolowania ekspresji transgenu lub transkrypcji DNA homologicznego do naturalnego genu. A zatem dalszą odrębną częścią wynalazku jest dostarczenie konstruktu DNA zawierającego promotor ATH1 połączony z heterologicznym DNA w taki sposób, że powoduje jego transkrypcję w komórkach roślinnych; oraz komórki roślinne transformowane takimi konstruktami dNa.
ATH1 podlega ekspresji w wegetatywnym merystemie wierzchołkowym i obniżenie tej ekspresji koreluje z przejściem do kwitnienia. Wymuszona konstytutywna ekspresja ATH1 prowadzi w rezultacie do dramatycznej represji przejścia do kwitnienia zarówno u Arabidopsis, jak i u tytoniu: a zatem w przypadku Arabidopsis wystrzeliwanie jest opóźnione.
190 228
Odwrotnie, represja ATH1 prowadzi w rezultacie do fenotypu wczesnego kwitnienia. Nasze wyniki sugerują, ze ATH1 rozciąga swoją funkcję na modulowanie biosyntezy lub odpowiedzi na GA. Spodziewamy się, ze gen ATH1 będzie stanowił podstawę szczególnie użytecznego systemu kontrolowania wystrzeliwania.
Długość dnia i przejście do kwitnienia
Przejście do kwitnienia zostało szczególnie dobrze zbadane u Arabidopsis thaliana. Ten gatunek stał się modelowym systemem do badania przejścia do kwitnienia: na poziomie genetycznym przez izolację mutantów czasu kwitnienia, na poziomie molekularnym przez klonowanie genów, których produkty biorą udział w kontrolowaniu przejścia do kwitnienia. Arabidopsis jest typową rośliną rozetową, w której liście wegetatywne są ściśle upakowane na skutek zredukowanego wydłużania się międzywęźli. Po przejściu do kwitnienia nowo utworzone międzywęźla gwałtownie się wydłużają („wystrzeliwanie”). W większości ekotypów Arabidopsis długość dnia ma największe znaczenie przy wyznaczaniu przejścia do kwitnienia. Arabidopsis jest fakultatywną rośliną długiego dnia (LD, ang. Long Day), co oznacza, że przejście do kwitnienia jest przyspieszane przez długie dni (cykl 16 godzin światła/8 godzin ciemności), ale nie stanowi to bezwzględnego wymagania. W warunkach długiego dnia (LD) przejście do kwitnienia jest zapoczątkowywane szybko i tworzy się jedynie kilka rozetowych liści (~7 liści 16-20 dnia dla ekotypu Col-0). W czasie hodowli w warunkach krótkiego dnia (SD, ang. Short Day), np. 8 godz. światła/l 6 godz. ciemności, przejście do kwitnienia trwa duzo dłużej (~60 dni) i tworzą się pełne rozetki liściowe, które mają ponad ~30 liści w rozetce (ekotyp Col-0).
Kwas giberelinowy (GA) i przejście do kwitnienia
Wiadomo od dawna, że działanie giberelinami promuje przejście do kwitnienia u wielu gatunków roślin. Większość gatunków, u których zastosowanie GA może indukować kwitnienie, to rośliny długiego dnia lub wymagające zimna i wiele z nich normalnie rośnie w formie rozet w warunkach braku indukcji. Ponadto, kilka doświadczeń sugeruje, że poziom endogennych GA ma udział w kontrolowaniu przejścia do kwitnienia: warunki, które indukują przejście do kwitnienia mogą wywierać wpływ przez podniesienie poziomu endogennych GA prawdopodobnie w obrębie albo w pobliżu merystemu wierzchołkowego.
Mutanty Arabidopsis defektywne w biosyntezie GA (seria GA) lub niewrażliwe na ten hormon (seria GAI) wykazują fenotyp późnego kwitnienia w warunkach braku indukcji, a ponadto poważnie zaburzony mutant GAI-3 jest również późno kwitnący w warunkach indukcji (Wilson i wsp., 1992).
Udział GA w kontrolowaniu przejścia do kwitnienia przez ATH1
Testowaliśmy, czy egzogenny GA może przezwyciężyć hamujący efekt konstytutywnej ekspresji ATH1 u tytoniu. Najwyraźniej, opryskiwanie GA miało zdolność do „ratowania” fenotypu wczesnego kwitnienia u roślin tytoniu konstytutywnie wyrażających ATH1. Udział GA wykazano również przez fenotyp obniżonego wydłużania międzywęźli roślin tytoniu konstytutywnie wyrażających ATH1. Odkrycia te sugerują, że ATH1 działa jako represor biosyntezy Ga, lub, alternatywnie, odpowiedzi na GA. Dominujący wpływ nadekspresji ATH1 na przejście do kwitnienia w kombinacji z odwracaniem tego efektu przez endogennie dodawane GA sugerują wiele zastosowań u różnych roślin uprawnych. Jest to szczególnie interesujące, ponieważ deregulacja ekspresji ATH1 nie prowadzi do plejotropowych fenotypów, a odwrócenie fenotypu jest całkowite. Całkowite odratowanie oznacza, że nie będzie problemu dotyczącego rozmnażania albo powielania transformantów ATH1, a zatem utrzymywanie linii transgenicznych, co może być poważnym problemem dla mutantów kwitnienia, jest proste. Stosując przemianę GA, rośliny można przywracać do rozwoju typu dzikiego w dowolnym momencie, rośliny kwitną normalnie i normalnie powstają nasiona.
Możliwe jest również hamowanie nadekspresji ATH1 w roślinach zmodyfikowanych genetycznie uzyskanych sposobem według wynalazku przez traktowanie roślin gibereliną, na przykład gibereliną A3 lub A4/A7.
Wzrost indeksu zbiorów
Kiedy rośliny rosną blisko siebie, występuje syndrom unikania cienia, w którym rośliny reagują na promieniowanie dalekiej czerwieni odbijane od sąsiadów. Najbardziej widocznym
190 228 tego wynikiem jest szybki i dramatyczny wzrost tempa wzrostu łodyg i ogonków liściowych przy wzroście liści, wytwarzanie narządów spichrzowych i rozwój reproduktywny. Wiadomo, ze przez nadekspresję genów phyA w tytoniu można przezwyciężyć odpowiedź unikania cienia, prowadząc do zwiększonego indeksu zbiorów (Robson i wsp., 1996). Indeks zbiorów wyraża się jako biomasa liści w proporcji do całej biomasy. Nadekspresja ATH1 w tytoniu powoduje obniżenie wzrostu łodyg, natomiast wzrost i liczba liści pozostają niezmienione, a nawet zmniejszone w porównaniu do typu dzikiego. Fenotypy nadekspresji ATH1 i nadekspresji phyA są podobne, co sugeruje możliwość zastosowania nadekspresji ATH1 do zwiększenia indeksu zbiorów dla roślin uprawnych.
Wynalazek będzie dalej opisany w odniesieniu do następujących przykładów i doświadczeń, które ilustrują niektóre aspekty niniejszego wynalazku; oraz w odniesieniu do rysunków, gdzie:
Figura 1 przedstawia sekwencję DNA dla cDNA ATH1;
Figura 2 jest diagramem plazmidu pWP90;
Figura 3 jest diagramem plazmidu pMOG23;
Figura 4 jest diagramem plazmidu pVDH275;
Figura 5 jest wykresem słupkowym przedstawiającym karłowacenie powodowane przez konstytutywną ekspresję ATH1 w roślinach tytoniu w wieku 90 dni;
Figura 6 jest wykresem pokazującym wpływ działania giberelin na wysokość roślin tytoniu z nadekspresj ąATH1;
Figura 7 jest wykresem słupkowym przedstawiającym czas kwitnienia (jako liczbę tworzonych liści rozetowych) dla roślin ze zmniejszoną i zwiększoną ekspresją ATH1 w porównaniu z Arabidopsis typu dzikiego (ekotyp C24).
Metody ogólne
Materiał roślinny i warunki wzrostu
Używanymi genotypami Arabidopsis thaliana typu dzikiego były Columbia i C24. GenATH1 jest położony na chromosomie 4 pomiędzy markerami mi431 (96,9 cM) i 06455 (97,9 cM). Arabidopsis thaliana Columbia stosowano w doświadczeniach z transformacją roślin przy zastosowaniu protokołu infiltracji pod próżnią, natomiast Arabidopsis thaliana C24 stosowano w doświadczeniach z transformacją roślin przy zastosowaniu protokołu dla transformacji korzeni.
Rośliny hodowano w pomieszczeniu hodowlanym w świetle fluorescencyjnym z 16 godzinnym okresem świetlnym, po którym następował 8 godzinny okres ciemności w stałej temperaturze 22°C.
W celu pomiaru czasu kwitnienia, nasiona namaczano i umieszczano w 4°C na 4 dni w celu przełamania okresu spoczynkowego i siano do gleby. Kiełkujące siewki zwykle przykrywano pokrywą przez pierwsze 1-2 tygodnie w celu zapobiegania wysychaniu.
Transformacja roślin Arabidopsis
Binarne konstrukty zawierające chimerowe geny ATH1-GUS i geny 35S-antysensowny ATH1 transformowano do Arabidopsis thaliana ekotyp C24 przy zastosowaniu metody transformacji korzeni za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens według Valvekens i wsp. (1988). Transformanty selekcjonowano na pożywce zawierającej 50 mg/l kanamycyny.
Binarne konstrukty zawierające chimerowe geny 35S-ATH1 transformowano do Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia przy zastosowaniu protokołu infiltracji pod próżnią (Bent i wsp. (1994); Betchold i wsp. (1993)) z pewnymi modyfikacjami. Rośliny hodowano oddzielnie w 5,5 cm naczyniach. Rośliny transformowano po pojawieniu się pierwszych strąków na drugorzędowych pędach kwiatowych.
900 ml hodowli Agrobacterium tumefaciens zawierających odpowiedni konstrukt hodowano przez noc przed dniem infiltracji, komórki zbierano przez wirowanie i zawieszano w równiej objętości pożywki do infiltracji, zawierającej 2% zamiast 5% sacharozy. Rośliny infiltrowano przez zanurzenie całych rozetek i pędów kwiatowych na 10 minut pod ciśnieniem 100 mm Hg.
Nasiona transformantów selekcjonowano na pożywce zawierającej 50 mg/l kanamycyny'.
190 228
Przykład 1 Analiza ekspresji ATH1 Izolacja całkowitego RNA
Całkowity RNA z roślin izolowano według De Vries i wsp. (1988) z pewnymi niewielkimi modyfikacjami: (1) tkankę roślinną mielono w ciekłym azocie w obecności połowy objętości mieszaniny fenol/bufor do ekstrakcji i ogrzewano w 65°C w łaźni wodnej i (2) RNA wytrącano etanolem/octanem sodu przed i po wytrąceniu LiCl.
Analiza ochrony przed RNAazą
Fragment HindIII-XhoI z fagmidu ATH1 sklonowano w pBlu-scriptSK(-) (Stratagene) i strawiono Hindlll w celu wytworzenia matrycy dla polimerazy RNA T7. Sonda RNA ATH1 chroniła fragment 140 nukleotydów. Sondę RNA zsyntetyzowano przy zastosowaniu polimerazy RNAT7 (Pharmacia) i buforu opisanego przez producenta, z tą różnicą, że użyto 160 pCi [32p] ujp (gQQ cj/mujjnoi) Ochronę przed RNAzą wykonano przy zastosowaniu 10 pg całkowitego RNA i 10 pg tRNA według protokołu opisanego przez Sambrook i wsp. (1989). Strawiona mieszanina zawierała 600 jedn./ml RNazy Tl (Gibco BRL) i 20 pg/ml RNazy A (Boehringer). Hybrydy RNA:RNA analizowano przez elektroforezę w żelach do sekwencjonowania (6% poliakryloamid/7 M mocznik) i uwidaczniano przez autoradiografię.
Wytwarzanie chimerowych konstruktów ATH1-GUS
Wyizolowano fragment Spel-Ncol zawierający około 1300 nukleotydów z sekwencji promotora ATH1. Po wypełnieniu końców w miejscu Ncol przez polimerazę Klenowa fragment ten wstawiono do pojedynczych miejsc Smal/Xbal binarnego wektora pBilOl.l, który zawierał gen GUS (Jefferson i wsp., 1987), tworząc fuzję translacyjną pomiędzy promotorem ATH1 i genem GUS. Białko kodowane przez ten chimero wy gen składa się z 42 aminokwasów ATH1 połączonych z białkiem GUS. Binarny konstrukt został nazwany tH1.4. tH1.4 transformowano do kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Gelvin i Schilperoort, 1988). Linie Arabidopsis (ekotyp C24) transformowano jak opisano poniżej.
Lokalizacja in situ aktywności GUS w liniach Arabidopsis thaliana transgenicznych pod względem ATH1 -GUS
Siewki i tkanki roślinne zbierano i barwiono przez 1 do 16 godzin w 37°C w roztworze zawierającym 0,5 mg/ml X-Gluc (Biosynth AG) rozpuszczonego w N-dimetyloformamidzie, 0,1% Triton Χ-100, 0,5 mM K4Fe(CN)6-H2O, 0,5 mM K3Fe(CN)6 i 50 mM bufor fosforanowy, pH 7,2.
Po barwieniu X-Gluc, tkanki roślinne utrwalano przez noc w roztworze zawierającym 1% glutaraldehyd i 4% formaldehyd w 50 mM fosforanie sodu pH 7,2. Następnie siewki odwadniano w kolejnych etapach: w 10%, 30%, 50%, 70%, 90% i 2 x 100% etanolu. Tkanki dużych roślin zatapiano wstępnie w 1% agarozie (Sigma). Infiltrację i zatapianie w Technovite 7100 (Kulzer, Hereaus) wykonywano zgodnie z instrukcją producenta. Skrawki 4 μΜ sporządzano przy zastosowaniu urządzenia obrotowego Reichert-Jung 1140 z jednorazowym stalowym nożem Adams. Skrawki barwiono 0,1% czerwienią rutenową (Sigma) w wodzie destylowanej przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i fotografowano w Zeiss Axioskop przy zastosowaniu błony Kodak Professional Ektar 25.
Siewki utrwalano i odwadniano jak wyżej. Technovit 7100 infiltrowano przez 1 dzień. Siewki przenoszono następnie do konstrukcji z folii celuloidowej (Amvois), taśmy dwustronnie klejącej, folii, dwustronnej taśmy. W ostatnich trzech warstwach wycinano centralny region w celu umieszczenia w nim siewek. Następnie nanoszono siewki w roztworze Technovitu 7100 i centralny region nakrywano inną folią. Po spolimeryzowaniu przez noc w temperaturze pokojowej otrzymano plastykową płytkę zawierającą siewki. W celu uzyskania skrawków zatopionych w płytce siewek, usuwano materiał folii celuloidowych i płytkę cięto wzdłuż przekroju podłużnego odpowiednich regionów siewek. Sporządzanie skrawków, barwienie i fotografowanie wykonywano jak opisano powyżej.
Lokalizacja ekspresji ATH1
Ekspresję genu ATH1 analizowano przy zastosowaniu analizy ochrony przed RNAzą (Quaevlieg i wsp., 1995). Wysokie poziomy mRNA ΑΤΉ1 wykrywano w czasie wczesnego rozwoju siewek (dni 2-6) oraz w kwiatach dojrzałych roślin Arabidopsis. Lokalizację komór10
190 228 kową ekspresji genu ATH1 określano przez wprowadzenie chimerowego konstruktu ATH1-GUS tH1.4 do Arabidopsis thaliana. Różne tkanki barwiono X-gluc oraz sporządzono preparaty całej rośliny i skrawki tkanek dla uwidocznienia aktywności GUS (patrz poniżej).
Ekspresja ATH1 w czasie rozwoju wegetatywnego
Wierzchołek wzrostu 5-dniowej siewki hodowanej na świetle jest płaski i składa się z dwuwarstwowej tuniki otaczającej leżący pod nią korpus. W tym stadium, merystem ma zapoczątkowane zawiązki pierwszej pary liściowej (Mischke i Brown, 1965).
W roślinach transformowanych tH1.4, wysokie poziomy aktywności GUS były obecne w wierzchołkach pędów. Przekroje wierzchołka pędu pokazały, że wysoka aktywność GUS jest widoczna we wszystkich trzech warstwach merystemu wierzchołkowego pędu i rozciąga się przez region podwierzchołkowy, sięgając dalej, tam gdzie wiązka naczyniowa hipokotyla rozgałęzia się do liścieni. Wysokie aktywności GUS były również obecne w zawiązkach pierwszej pary liści.
Ekspresja ATH1 w czasie przejścia do kwitnienia i rozwoju kwiatostanu.
Wyjściowo, w czasie fazy kwitnienia, merystem wierzchołkowy pędu rozwija się w łodygę, liście łodygowe i wtórne kwiatostany. W miarę rozwoju kwiatostanu, merystem kwiatowy wytwarza zawiązki kwiatów. W roślinach transformowanych tH1.4, aktywność GUS obniżała się w merystemie kwiatowym w czasie fazy przejścia. W merystemie nie było wykrywalnej aktywności GUS. Niskie poziomy aktywności GUS były obecne w strefie żeberka. Później, kiedy pojawiały się kwiaty, aktywność GUS była obecna w różnych częściach młodych kwiatów (dno kwiatowe, działka kielicha lub tkanka naczyniowa pręcika).
Przykład 2
Konstrukcja fuzji promotorów z otwartą ramką odczytu ATH1 cDNA ATH1 sklonowano do unikalnych miejsc restrykcyjnych EcoRI/XhoI do dobrze znanego i komercyjnie dostępnego wektora pBluescript SK(-) (Stratagene).
2.1. Fuzja promotora 35S z CaMV z otwartą ramką odczytu ATH1
Fragment BamHI/SnaBI zawierający 1573 nukleotydy sekwencji cDNA ACTH1 (miejsce BamHI zostało utworzone przez mutagenezę PCR, 35 nukleotydów za miejscem startu translacji) wyizolowano i wstawiono do pojedynczych miejsc do klonowania BamHI/SmaI w wektorze pWP90, który zawiera podwójny promotor 35S CaMV i terminator NOS (patrz fig. 2), uzyskując w rezultacie fuzję transkrypcyjną pomiędzy podwójnym promotorem 35S CaMV i cDNAATH1. Konstrukt ten, nazwany cH1.24, przecięto następnie enzymami restrykcyjnymi SstI/EcoRV, po czym uzyskaną w rezultacie wstawkę SstI/EcoRV wstawiono do pojedynczych miejsc restrykcyjnych BamHI/SmaI w wektorze binarnym pMOG23 (patrz fig. 3). Binarny konstrukt nazwano tH1.2. tH1.2 transformowano do kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens pGV2260 (Caplan i wsp., 1985). Linie Arabidopsis (ekotyp Col-0) transformowano przy zastosowaniu infiltracji pod próżnią tak, jak opisano poniżej.
2.2 Konstuowanie fuzji promotora 35S z CaMV z antysensownaramkąATH1
Fragment EcoRI/SnaBI zawierający około 1830 nukleotydów sekwencji cDNA ACTH1 wyizolowano i wstawiono do pojedynczych miejsc do klonowania Smal/EcoRI w wektorze pWP90 (patrz fig. 2), uzyskując w rezultacie fuzję transkrypcyjną pomiędzy podwójnym promotorem 35S CaMY i antysensowną ramką ATH1. Uzyskany konstrukt nazwano cH1.22. Wstawkę EcoRV/SstI z cH1.22 sklonowano następnie w pojedynczych miejscach restrykcyjnych Smal/SacI binarnego wektora pMOG23 (MOGEN)(patrz Fig. 3). Ten binarny konstrukt, nazwany tH 1.1, transformowano do kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Linie Arabidopsis (ekotyp C24) transformowano tak, jak opisano poniżej.
2.3. Fuzja promotora szoku cieplnego z otwartą ramką odczytu ATH1
Przez mutagenezę PCR, utworzono dodatkowe miejsce BamHI w pTT19, wektorze zawierającym promotor, lider i 77 nukleotydów sekwencji kodującej genu szoku cieplnego Hspl8.2 z Arabidopsis thaliana (Takahashi i Komeda, 1989). Dodatkowe miejsce BamHI jest zlokalizowane w niepodlegającym translacji liderze w pozycji nukleotydowej -710 od startu translacji Hsp18.2.
Przez trawienie restrykcyjne BamHI usunięto niepodlegający translacji lider 5' i 77 nukleotydów sekwencji kodującej Hsp18.2. Pozostały konstrukt nazwano bezliderowym pTT19.
190 228
Fragment HindIII/BamHI tego bezliderowego pTT19, zawierający jedynie sekwencję promotorowąHsp18.2, połączono z fragmentem BamHI/EcoRI zawierającym całą sekwencję cDNA ATH1, co dało w rezultacie fuzję transkrypcyjną promotora Hsp.18.2 z niepodlegającym translacji liderem i sekwencją kodującą. Miejsca BamHI i EcoRI utworzono przez mutagenezę PCR, w wyniku czego powstało miejsce restrykcyjne BamHI na początku sekwencji cDNA ATH1 i miejsce restrykcyjne EcoRI zaraz za kodonem stop TAA. Otrzymany w rezultacie fragment HindIII/EcoRI wstawiono do pojedynczych miejscach restrykcyjnych HindIII/EcoRI wektora pWP90 (patrz fig. 2) i ten nowy konstrukt strawiono następnie częściowo enzymami restrykcyjnymi HindIII i EcoRV.
Największy fragment HindIII/EcoRV wstawiono następnie do binarnego wektora pBIN 19 przeciętego HindIII/SmaI (Frisch i wsp., 1995). Konstrukt ten nazwano HspH1.
Wykonano również fuzję transkrypcyjną pomiędzy promotorem Hsp18.2 i sekwencją kodującą ATH1 bez sekwencji liderowej. Dodatkowe miejsce BamHI w cDNAATH1 utworzono przez mutagenezę PCR bezpośrednio przed startem translacji. Trawienie tego miejsca BamHI w połączeniu z trawieniem pojedynczego miejsca Xhol w cDNAATHI daje w rezultacie fragment o długości około 680 nukleotydów, zawierający sekwencję kodującą ATHI. Ten fragment złożony z 680 nukleotydów został zamieniony na fragment o długości około 980 nukleotydów, który tworzy się po trawieniu HspHl enzymami restrykcyjnymi BamHI/XhoI. Rezultatem tego jest HspHIB, fuzja transkrypcyjna pomiędzy bezliderową sekwencją kodującą ATH1 i promotorem HspI8.2.
Zarówno HspH1, jak i HspH1B transformowano do kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Linie Arabidopsis (ekotyp C24) transformowano tak, jak opisano poniżej.
2.4 Fuzja promotora plastocyjaniny grochu z otwartą ramką odczytu ATH1
Fuzję transkrypcyjną pomiędzy promotorem plastocyjaniny grochu i sekwencją kodującą ATH1 można utworzyć przez wstawienie sekwencji kodującej ATHI do pojedynczych miejsc restrykcyjnych BamHI i SaII pVDH275 (Pwee i Gray, 1993; Last i Gray, 1989) (patrz również fig. 4). W sekwencji kodującej ATH1 dodatkowe miejsce Sali (bezpośrednio przed startem ATG w ATH1) i BamHI (bezpośrednio po sygnale stop TAA w ATH1) można utworzyć przez metagenezę PCR. Otrzymany w rezultacie konstrukt, w którym sekwencja kodująca ATH1 jest wstawiona pomiędzy promotor plastocyjaniny grochu i terminator nos można transformować do komórek Agrobacterium tumefaciens, a następnie dokonać transformacji roślin.
Wprowadzenie dodatkowych kopii ATH1 do Arabidopsis
Dodatkowe kopie ATH1 można wprowadzić do roślin Arabidopsis przez transformowanie ich dodatkowymi loci ATH1 zawierającymi promotor ATH1 i sekwencję kodującą ATH1. Można tego dokonać przez fuzję fragmentu SnaBI/Ncol cDNAATH1 o wielkości około 1000 nukleotydów z fragmentem restrykcyjnym SstI/EcoRI cDNAATHI o wielkości około 250 nukleotydów z pBI101.1, zawierającym terminator nos Agrobacterium (Jefferson i wsp., 1987). Otrzymany w rezultacie fragment można połączyć z fragmentem restrykcyjnym Ncol o wielkości około 3,5 kb z genomowego klonu ATH1 (Quaedvlieg i wsp., 1995). Utworzony w ten sposób fragment NcoI/EcoRI o wielkości około 4750 nukleotydów zawierający promotor ATHI, sekwencję kodującą ATH1 i terminator nos, można wstawić do wektora do klonowania pMTL23 przeciętego NcoI/EcoRI (Chambers i wsp., 1988). Fragment restrykcyjny StuI/EcoRI otrzymanego w rezultacie konstruktu można następnie wstawić do binarnego wektora pMOG23, transformować do komórek Agrobacterium, a następnie dokonać transformacji roślin.
Przykład 3
Wpływ' na cechy kwitnienia przez zastosowanie fuzji genowej promotor 35S CaMV/ATH1. Pomiar czasu kwitnienia
Czas kwitnienia mierzono przez liczenie liczby liści, włączając w to liścienie, w rozecie w czasie pojawiania się pączka kwiatowego. Uprzednio wykazano ścisłą korelację pomiędzy liczbą liści i czasem kwitnienia (Koorneef i wsp., 1991; Bagnall (1993)).
Nadekspresja ATH1 prowadzi do opóźnienia kwitnienia
190 228
W celu uzyskania dalszej wiedzy o roli ATH1 w rozwoju rośliny, sekwencję cDNA ATH1 pełnej długości przyłączono do konstytutywnego promotora 35S wirusa mozaiki tytoniu i utworzony w ten sposób chimerowy gen 35S:ATH1 transformowano do Arabidopsis ekotyp Col-0 stosując metodę infiltracji pod próżnią. Otrzymano w ten sposób sześć niezależnych pierwotnych transformantów.
Wszystkie te transgeniczne linie krzyżowano wsobnie. Z każdej niezależnej linii transgenicznej 40 odrębnych nasion poddano kiełkowaniu w glebie i sprawdzano pod kątem zmienionych fenotypów w porównaniu z roślinami typu dzikiego. Cztery spośród sześciu linii wykazywało fenotyp zmieniony pod względem czasu kwitnienia. W trzech z tych linii wszystkie rośliny miały opóźnione kwitnienie (około 14 liści rozetowych do czasu kwitnienia w porównaniu do 10 liści rozetowych u roślin typu dzikiego Col-0). W pozostałych liniach około 85% roślin wykazywało ten sam fenotyp opóźnionego kwitnienia, podczas gdy 15% roślin wykazywało fenotyp wczesnego kwitnienia (po około 7 liściach rozetowych), jak wykazano, na skutek braku RNA ATH1. Te wcześnie kwitnące rośliny wykazywały również fenotyp terminal flower, często z niekompletnymi kwiatami i zmutowanymi narządami kwiatowymi.
Przykład 4
Wczesne kwitnienie przez ekspresją antysensownego ATH1.
Podobnie jak ektopowa nadekspresja ATH1, hamowanie funkcji genu ATH1 może być również zastosowane do wpływania na czas kwitnienia. Hamowanie funkcji genu odbywa się przez konstytutywną nadekspresję antysensownego ATH1.
Antysensowny pełnej długości cDNA ATH1 połączono z konstytutywnym promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora i utworzony w ten sposób chimerowy gen 35S.'antysensowny ATH1 transformowano do Arabidopsis ekotyp C24 stosując protokół transformacji korzeniowej według Valvekens. Otrzymano dwadzieścia dwa niezależne transformaty i wszystkie krzyżowano wsobnie. Z każdej linii 10 odrębnych nasion poddano kiełkowaniu w glebie i sprawdzano pod kątem zmienionych fenotypów w porównaniu z roślinami typu dzikiego C24. W pięciu z tych linii rośliny wykazywały fenotyp wczesnego kwitnienia: kwitnienie rozpoczynało się po utworzeniu od sześciu do dziesięciu liści rozetowych w porównaniu do około dwudziestu liści u roślin typu dzikiego.
Przykład 5
Zmiana czasu kwitnienia u Nicotiana tabacum przez nadekspresję ATH1
Tak jak u Arabidopsis, ektopowa nadekspresja cDNA ATH1 (kierowana przez promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora) w tytoniu (Nicotiana tabacum cv. Samsun) prowadzi również do opóźnienia w czasie kwitnienia w porównaniu z roślinami tytoniu typy dzikiego. W roślinach tytoniu 35S..ATH1 czas kwitnienia był opóźniony o tygodnie lub miesiące. Rośliny te były również karłowate. Ta cecha karłowacenia, podobnie jak fenotyp kwitnienia, jest wyraźnie skorelowany z poziomem ekspresji transgenu. W najcięższych przypadkach, rośliny nie kwitły wcale i osiągały jedynie jedną piątą normalnej wysokości, podczas gdy w mniej poważnych przypadkach rośliny miały opóźnione kwitnienie o jedynie tydzień lub dwa i osiągały około czterech piątych normalnej wysokości. Liczba i kształt liści były normalne we wszystkich transformowanych roślinach.
Przykłady 6-8
Następujące przykłady ilustrują wpływ GA na transgeniczne rośliny według wynalazku. Jak zaznaczono powyżej, nadekspresja ATH1 efektywnie hamuje wystrzeliwanie (indukcję kwiatów). Postawiliśmy hipotezę, że ATH1 może być represorem syntezy GA lub szlaku odpowiedzi na GA (sądzimy, ze pierwszej). Następujące przykłady przedstawiają i przemawiają za tą hipotezą.
Metody ogólne
Rośliny tytoniu (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) transformowano przy zastosowaniu procedury dysków liściowych (Horsch i wsp., 1985). Transgeniczne rośliny selekcjonowano na pożywce MS (Murashige i Skoog, 1962) zawierającej 300 mg/ml kanamycyny i 2% sacharozę. Po przeniesieniu do gleby, rośliny hodowano w szklarni w 22°C w warunkach świetlnych 16 godzin światła dziennego, kiedy trzeba uzupełnianego światłem sztucznym. Wpływ giberelin (GA) testowano przez stosowanie na liście (opryskiwanie) 100 mM GA3
190 228 w roztworze zawierającym 100 ml/l Tritonu Χ-100. Rośliny kontrolne opryskiwano roztworem zawierającym jedynie Triton Χ-100. Opryskiwanie rozpoczynano 60 dni po zasiewie, kiedy rośliny typu dzikiego miały wysokość około 2,5 cm i kontynuowano w odstępach 3 do 4 dni. Wysokość roślin mierzono, co 3 do 4 dni i kontynuowano do czasu wystąpienia kwitnienia, co określano na podstawie pojawienia się zawiązków kwiatowych.
Przykład 6
Konstytutywna nadekspresja sensownego ATH1 prowadzi do opóźnionego kwitnienia
6.1 Nadekspresja ATH1 w tytoniu
W celu uzyskania konstytutywnej nadekspresji genu ATH1 w transgenicznych roślinach, jego region kodujący umieszczono pod kontrolą promotora 35S CaMV i otrzymany w rezultacie konstrukt transformowano do tytoniu (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN). Otrzymano czterdzieści niezależnych roślin opornych na kanamycynę, z których jedynie pięć wykazywało wykrywalną ekspresję transgenu. Poziomy mRNA ATH1 były zróżnicowane od wysokiego u roślin HME#4, #10, #30 do średniego/niskiego poziomu u roślin H10E#35 i #37. W zależności od poziomu ekspresji ATH1, kwitnienie u tych roślin było opóźnione od tygodni do miesięcy w porównaniu z roślinami typu dzikiego, które kwitną po 3-5 miesiącach w zależności od sezonu. W najpoważniejszym przypadku (H10E#4) rośliny nigdy nie kwitły do czasu zestarzenia się (>15 miesięcy po wysianiu). Rośliny H10E#10 i #35, które wykazywały wysoką ekspresję ATH1, kwitły po 15 miesiącach, podczas gdy rośliny wykazujące średnią/niską ekspresję, H10E#35 i #37 nie kwitły do 6 miesięcy. Podobnie jak zmieniony fenotyp kwitnienia, rośliny z nadekspresją ATH1 wykazywały zmniejszony wzrost łodygi, prowadzący w rezultacie do karłowacenia roślin. Występuje tu wyraźna korelacja pomiędzy stopniem karłowatości wzrostu i poziomem ekspresji transgenu (patrz fig. 5). W najpoważniejszym przypadku rośliny osiągały jedynie jedną piątą swojej normalnej wysokości. Liczba liści wykazywała zróżnicowanie od dwukrotnie wyższej od typu dzikiego do normalnej we wszystkich transgenach.
6.2 Nadekspresję ATH1 można odwrócić przez GA3
Fenotyp nadekspresji ATH1 można odwrócić do fenotypu typu dzikiego przez zastosowanie GA3. Stosowanie GA3 na liście wobec roślin tytoniu z Przykładu 6.1 (opryskiwanie 100 mM GA3 z przerwami trzy-czterodniowymi) prowadzi w rezultacie do całkowitego przywrócenia długości łodyg typu dzikiego (fig. 6). Dotyczyło to również fenotypu późnego kwitnienia (dane nie pokazane).
Przykład 7
Nadekspresja ATH1 u Arabidopsis
W celu uzyskania dalszych danych odnośnie roli ATH1 w rozwoju rośliny, pełnej długości cDNA ATH1 połączono z konstytutywnym promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora i chimerowy gen 35S:ATH1 transformowano do Arabidopsis ekotyp Col-0 stosując metodę infiltracji pod próżnią. Otrzymano w ten sposób sześć niezależnych pierwotnych transformantow i wszystkie transgeniczne linie krzyzowano wsobnie. Z każdej niezależnej linii transgenicznej 40 odrębnych nasion poddano kiełkowaniu w glebie i sprawdzano pod kątem zmienionych fenotypów w porównaniu z roślinami typu dzikiego. Cztery spośród sześciu linii wykazywało fenotyp zmieniony pod względem czasu kwitnienia. Nasiona z tych roślin nie kiełkowały dobrze, a jeżeli miało to miejsce, rośliny zatrzymywały się na etapie siewek. Obydwa efekty można było odwrócić przez przeniesienie roślin do pożywki hodowlanej zawierającej 10-5 M GA3 i hodowanie ich na tej pożywce przez trzy dni. Po odratowaniu i przeniesieniu do gleby rośliny rozwijały się normalnie, z wyjątkiem fenotypu późnego kwitnienia. W warunkach krótkiego dnia, rośliny transgeniczne tworzą znacznie więcej liści rozetowych (ilości wegetatywnych) niż rośliny typu dzikiego (około 40 liści rozetowych i 100 dni po wykiełkowamu, a rośliny nadal nie kwitną, w porównaniu do około 30 liści rozetowych przed kwitnieniem dla roślin typu dzikiego). W warunkach LD w większości tych roślin następuje częściowa rewersja wzrostu generatywnego do wegetatywnego, widoczna przez tworzenie się napowietrznych rozetek (liści wegetatywnych) na łodydze kwiatostanowej. Rośliny (ekotyp C24) zawierające dodatkową kopię cDNA ATH1 pod kontrolą promotora genu szoku cieplnego Hspl8.2 (rośliny HspHiB) również wykazywały fenotyp późnego kwitnienia. Nawet bez szoku cieplnego (wiadomo, ze ten promotor ma również podstawową aktywność bez indukcji) rośliny zawierające ten konstrukt kwitną znacznie później w warunkach LD niż rośliny typu
190 228 dzikiego (30,5 liści rozetowych wytworzonych w typie dzikim wobec 61 liści rozetowych wytworzonych w roślinach HspHlB-patrz fig. 7).
Przykład 8
Wczesne kwitnienie przez ekspresją antysensownego ATH1
Tak jak ektopiczna nadekspresja ATH1, zaburzenie funkcji genu ATH1 może również rzucić światło na funkcję ATH1 w rozwoju rośliny. Zaburzenie funkcji genu uzyskano przez konstytutywną nadekspresję antysensownego ATH1. Antysensowny pełnej długości cDNA ATH1 połączono z konstytutywnym promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora i chimerowy gen 35S:antysensowny ATH1 transformowano do Arabidopsis ekotyp C24 stosując transformację korzeniową według Valvekens. Otrzymano dwadzieścia dwa niezalezne transformaty i wszystkie krzyzowano wsobnie. Z każdej linii 10 odrębnych nasion poddano kiełkowaniu w glebie i sprawdzano pod kątem zmienionych fenotypów w porównaniu z roślinami typu dzikiego C24. W pięciu z tych linii rośliny wykazywały fenotyp wczesnego kwitnienia: kwitnienie rozpoczynaiło się po utworzeniu od sześciu do dziesięciu liści rozetowych w porównaniu do około trzydziestu liści w roślinach typu dzikiego (patrz fig. 7).
Przykład 9
Odpowiedź unikania cienia
Kiedy rośliny rosną blisko siebie, objawia się syndrom unikania cienia, w którym rośliny reagują na obniżone stosunki świetlne czerwień/daleka czerwień powodowane przez filtrowanie światła czerwonego przez baldachim liści. Prowadzi to w rezultacie do szybkiego i dramatycznego zwiększenia tempa wzrostu łodyg i. ogonków liściowych przy wzroście liści, wytwarzania narządów spichrzowych i rozwoju reproduktywnego, powodując w ten sposób zwiększenie indeksu zbiorów (gdzie indeks zbiorów jest wyrażany jako biomasa liści w proporcji do całej biomasy).
Uważa się, że w odpowiedź unikania cienia odbywa się głównie za pośrednictwem fitochromu B i wykazano, ze nadprodukcja fitochromu eliminuje odpowiedź unikania cienia, prowadząc w rezultacie do wzrostu indeksu zbiorów tytoniu rosnącego na polach (Robson i wsp., 1996).
Brak fitochromu B prowadzi również do utraty odpowiedzi unikania cienia i w warunkach indukcji prowadzi to do zmniejszenia wydłużania się łodygi w porównaniu z warunkami nieindukcyjnymi.
W laboratorium, sytuacje powodujące odpowiedź unikania cienia można naśladować przez dodawanie różnych natężeń strumienia światła dalekiej czerwieni (Frc) do stałego światła białego (Wc). W tych warunkach rośliny Arabidopsis typu dzikiego (C24 wt) wykazują typową odpowiedź unikania cienia (wydłużone hipokotyle przy Wc + Frc w porównaniu z długością hipokotyli przy tylko Wc, podczas gdy mutanty receptora fitochromu B, u których nie ma odpowiedzi unikania cienia, wykazują odpowiedź przeciwną (zmniejszenie długości hipokotyli). Rośliny z antysensownym AtHl również wykazują zmniejszenie długości hipokotyli, a w przypadkach najpoważniejszych u roślin z antysensownym AtHl (takich, jak AtHl#3) to zmniejszenie jest podobne, jak w nasionach mutantów phyB. A zatem można wnioskować, że podobnie jak brak aktywnego fitochromu B, utrata Athl prowadzi w rezultacie do utraty odpowiedzi unikania cienia.
Analiza unikania cienia u roślin z antysensownym AtHl (takich, jak AtHl), roślin C24 typu dzikiego (C24 wt) i mutantów fotoreceptora (phyB) jest przedstawiona poniżej. Siewki hodowano przez 2 dni przy ciągłym białym świetle, a następnie 4 dni w tych samych warunkach świetnych lub 4 dni przy świetle białym uzupełnionym daleką czerwienią. Długość hipokotyli mierzono po 6 dniach wzrostu. Uzyskano następujące wyniki.
| C24wt | Wc Wc+Frc | = długość hipokotyla = długość hipokotyla | 5.5 mm 7.5 mm |
| PhyB | Wc | = długość hipokotyla | 9,5 mm |
| Wc+Frc | = długość hipokotyla | 7,3 mm | |
| Antysensowny | Wc | = długość hipokotyla | 9,0 mm |
| Athl #3 | Wc+Frc | = długość hipokotyla | 5,0 mm |
| Antysensowny | Wc | = długość hipokotyla | 9,8 mm |
190 228
Athl#7 Wc+Frc = długość hipokotyla
Antysensowny Wc - długość hipokotyla
Athl#23 Wc+Frc = długość hipokotyla
8,0 m 7,,5 mm 7,0 imn
Cytowana literatura:
Bagnall, 1993: Ann. Bot. 71-83
Bechtold i wsp., 1993: C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199
Bent i wsp., 1994: Sciece 265:1856-1960
Caplan i wsp., 1985: J. Bacteriology 161:655-664
Chambers i wsp., 1988: Gene 68:139-149
Frisch i wsp., 1995: Plant Mol. Biol. 27:405-409
Gelvin i Schilperoot, 1988: Plant Molecular Biology Manual:
Dordrecht: Kluwer AcademicPublisher.
Jefferson i wsp., 1987: EMBO J. 6:3901-3907 Koomeef i wsp., 1991: Mol, Gen. Genet. 229:57-66 Last i Gray, 1989: Plant Mol. Biol. 12:655-666 Mandel i Yonowski, 1985: Nature 377:523-524 Putteril i wsp., 1995: Cell 80:847-857 Pwee i Gray, 1993: Plant J. 3:437-449 Quaedvlieg i wsp., 1995: The Plant Cell 7:117-129 Shannon i Meeks-Wagner, 1991: The Plant Cell:877-892 Takahashi i Komeda, 1989: Mol. Gen. Genet. 219:365 Takahashi i wsp., 1992: Plant J. 2:751-761 Weigel i Nilsson, 1995: Nature 377:495-500
Horsch, R., Fry, F., Hoffman, N., Eichholtz, D., Rogers, S. i Fraley, R. (1985). A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227, 1229-1231. Murshige, T. i Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15,473-479.
Robson, P.R.H., McCormac, A.C., Irvine, A.S., i Smith, H. (1996). Genetic engineering of harvest index in tobacco through overexpression of a phytochrome gene. Nature Biotechnology 14 (8), 995-998.
Wilson, R.N., Heckman, J.W., i Sommerville, C.R. (1992). Gibberellin is requred for flowering in Arabidopsis thaliana under short days. Plant. Phys. 100, 403-408.
190 228
| o | P | O | P | o | P | o | O o | U o < | ζ O | U | O | P o | p 0 |
| CM | o | GD | P | TT | O | o | <£ vo | < CM C | J <X> | p | < 0 | < Ό | |
| r-ł | α | t-4 | α | CM | P | co | 15 co | £ -u* | P | m | 3 Ό | O V£> |
P ο η o < m H H (J
Ρ i~) rC
| P | 0 | P | ||||
| O | 0 | P | 0 | P | O | |
| Γ- | u | <n | P | en | P | uo |
| r-M | 0 | CM | P | CM | 0 | co |
| υ | ||||||
| < | P | 2 | ||||
| P | u | |||||
| Λ | P | P | ||||
| 5 | P | 5 | ||||
| P | O |
o
P
P
P o
o o
in o
•tr
| 0 | s | 0 | 2 | 0 |
| ro | 3 | en | u | uo |
| uo | α | uo | P | Ό |
| p | P | |||
| < | α | |||
| P | < | |||
| 0 | u | |||
| P | u | |||
| 0 | P | |||
| o | 0 | |||
| O | u | 0 | u | 0 |
| CM | 2 | 00 | P | «j· |
| uo | 0 | UO | 0 | VO |
| u | 0 | |||
| P | P | |||
| u | 2 | |||
| P | U | |||
| P | P | |||
| u | o | |||
| P | 0 | |||
| 0 | < | O | P | O |
| r-t | U | r— | u | Γ0 |
| U0 | P | m | υ | \o |
| < | P | |||
| P | u |
| «£ | u | 2 u |
| 2 | 2 | □ u |
| 0 | u | |
| P | 2 | 0 ρ |
| < | P | < 0 |
| P | o | 2 P |
| P | P 2 |
U
| P | P | P | |
| <L | 0 | u | |
| P | 2 | P | |
| 2 | <J3 | u | 0 |
| 3 | O | P | P |
| P | U | P | P |
| < | e> | u | 0 |
| O κ | £ 0 f | £ O | O | 0 | H 0 | 0 | 0 | O | O |
| uo « | £ r-ł l | J c~ | P | en | < en | 0 | m | P | |
| CM Ł | 3 co * | £ ro | U | U | P | UO | ro |
(J
P
| P | O | 0 | P |
| U | P | 0 | P |
| O | P | u | P |
ί 5 3
670 680 690 700 710 720
TTTCAGGCATTTTCAGGTGTAGTTGGTCCAAGTGAACCAATGATGTCTACATTCGGTGAA o
U190 228
730 740 750 760 770 7Θ0
GAAGATTTCCCGTTTCTAATTTCGAATAAAAGAAACAATGAGCTTTCATTGAGTCTTGCA
790 800 810 820 830 840
TCAGATGTTTCTGATGAATGCTCGGAGATAAGTCTTTGTGCAGCTACAAGATTAGCCTCA
| O | Ε- | O | u | O | E- | O | u | O | E- | o | < | o | o | u | O | |
| o | υ | KO | u | CM | E- | GO | u | •<5· | < | o | E— | UD | 2 | CM | E- | GD |
| Ε- | cn | u | o | E- | O | u | r-4 | 3 | CN | < | CN | (J | n | ro | ||
| υ | u | rH | U | r-ł | u | r—4 | u | r“ł | E- | «Η | U | rH | Ε- | r-4 | ||
| E- | E- | U | E- | E- | Ε- | υ | ||||||||||
| E- | e- | u | 3 | E- | U | υ | ε- | |||||||||
| E- | E- | < | u | U | U | U | υ | |||||||||
| U | < | u | u | Ε- | U | U | E- | |||||||||
| U | u | E- | Ε- | υ | < | u | -< | |||||||||
| rii | Ε- | E- | υ | E- | E- | E- | 2 | |||||||||
| O | rf? | o | υ | O | O | O | O | < | o | O | E- | O | E- | O | ||
| cn | U | E- | <—1 | < | Γ- | n | U | CTs | 3 | »n | E- | I—< | Γ- | |||
| CD | Ε- | CTi | < | o | Ε- | o | E- | «Η | U | r-4 | E- | CN | U | co | E- | ΓΟ |
| υ | Ε- | t—ł | υ | r*ł | «ί | rS | U | r-1 | E- | r- | U | i“H | r-4 | |||
| υ | U | < | u | |||||||||||||
| £- | < | Ε- | Ε- | 3 | u | |||||||||||
| £- | E- | υ | υ | < | u |
U
O
EEU
EE-
| O | u | o t | 9 o | u | O | 3 | O |
| CD | u | -<3* tfC | < o | KO | Ε- | CM | |
| CD | < | cn fi | c O | U | o | Ο | rM |
| < | 5 r-t | E- | tH | U | cH |
| H | E- | u | H | |||||
| E- | fi | |||||||
| U | 3 | |||||||
| Ε- | ε- | u | E- | |||||
| υ | υ | u | E- | |||||
| E- | Ε- | kC | U | |||||
| O | E- | O | υ | o | 2 | o | E- | O |
| r- | E- | ro | < | a\ | U | in | E- | |
| CD | & | cn | u | CD | o | o | E- | r—C |
s u
ευ §
Ε-»
Ś
Ευ ś
ίo
CD
E<
E—
O
U
U
EE6
H
U <
§
I
CN
O < O E- m E- tH u
O UD E- co
| O | E- | O | < | O |
| co | cn | 3 | m | |
| CM | 3 | CM | CO | |
| r”4 | < | rM | 3 | rH |
| E- | Ε- | |||
| E- | υ |
o
UD o
CN
O
CD
O ο
o o
UD o
CN
O
CO
| CD | u | cn | cn | Ę- | O | E- | r4 | e- | 1—4 | E- | CN | CM | co | ||||
| o | 2 | f-— | «£ | r-4 | E- | r-4 | r- | rH | H | 3 | |||||||
| ε- | E- | 2 | E- | 3 | U | E- | |||||||||||
| u | υ | E- | 3 | u | Ε- | < | 3 | ||||||||||
| o | o | 2 | 2 | u | Ε- | υ | E- | ||||||||||
| E- | o | 3 | 3 | *< | υ | u | E- | 3 | |||||||||
| e- | E- | u | E- | Ε- | u | E- | U | u | |||||||||
| u | E- | Ε- | E- | υ | E- | E- | E- | ||||||||||
| O | E- | O | e- | o | υ | o | E- | O | E- | O | O | u | O | E- | O | E- | |
| m | E- | r-4 | r*- | u | r> | e- | cn | < | m | t—1 | u | Π- | U | <n | |||
| OD | U | <n | u | o | u | o | 3 | »—4 | 2 | CN | E- | CM | U | co | Ε- | ||
| U | < | Ε- | y | r-4 | u | i-4 | u | r- | E- | tH | E- | rM | Ο | ||||
| E- | υ | 2 | u | E- | O | E- | ε- | ||||||||||
| E- | < | u | E- | E- | U | E- | υ | ||||||||||
| U | U | E- | E- | E- | U | U | U | E- | |||||||||
| u | 2 | 2 | E- | E- | e- | U | |||||||||||
| 2 | U | U | U | E- | 3 | U | 3 | ||||||||||
| u | d | U | 2 | U | U | E- | < | u |
1390 1400 1410 1420 1430 1440
LD
U_
190 228
TGCCTTCTTCAGCAGCTGAAACGAAAGAACCATCAGATTTGGAGACCTCAACGAGGTTTG
1450 1460 1470 1480 1490 1500 o
uj m
| o | Eh | O | Eh | O | Eh | o | 0 | O | 0 |
| CN | CO | Eh | Eh | o | Ej | UJ | Eh | ||
| UJ | Eh | UJ | 0 | 0 | co | co | H | ||
| ,-1 | 0 | rH | Eh | rH | Eh | i—1 | U | r-1 | Eh |
| U | 0 | U |
| O L | 9 O | O | |
| m < | ł | r- | |
| in c | ς ko | < | u> |
| r—·4 | J rH | H | r-1 |
g g
| H | Ej | |||
| H | *£ | |||
| 0 | 0 | |||
| 0 | 0 | |||
| O | 0 | O | 0 | O |
| ««ł· | £h | O | 0 | vo |
| m | 0 | U) | <* | UJ |
| rH | rH | rH | ||
| g | 0 | |||
| 0 | Eh | |||
| < | < | |||
| E-J | Eh | |||
| 0 | ||||
| O | Eh | O | 0 | O |
| m | 0 | oj | 0 | 11Ί |
| m | 0 | m | < | UJ |
| rH | < | rH | Eh | rH |
| H | Eh | |||
| 0 | 0 | |||
| Eh | 0 | |||
| Eh | 0 | |||
| 0 | 0 | |||
| Ej | 0 | |||
| O | o | 0 | O | |
| CU | 0 | CD | 0 | Ό· |
| m | tn | H | UJ | |
| rH | rH | rH |
| O | Eh | O | Η | O | O | < O | Eh | O |
| rH | H | r— | .0 | n | 0 OJ | < in | H | rH |
| m | < | ŁD | 0 | UJ | Eh U> | 0 r~ | Eh | CD |
| rH | 0 | r-ł | Eh | rH | < rH | 0 rH | 0 | rH |
(C-D.)
O
LL
190 228 cc
CL <
O _ CD -° CL £
Cl n <
Z
O
T °
Mb
| CsJ | *- 18033 |
| lisj | |
| ΙΌ | H?Luę |
| u_ _ | ieqx IIIPUIH |
l°MX
Λ«Ο33
IMdS ludy p I isg L
190 228
Bglll
ś
UJ hi z
as
X
X
X
E rt m
E to c
CL
SC
O
LL.
<
“3 o
z
ILI
X o
u
UJ
UJ w
o o
<
<
ΙΟ <
o ω
Hu o
<
o <
i— u
ł<
u o
t— <
o o
<
o o
o a
<_>
o
ΙΟ a
<
ΙΟ o
I— u
<
<
o ω
m
Sacl
190 228
FIC.4
- ' c m o O —
X CL .O rc JZ XI x in x c
190 228 <
ιη
L3
LL.
(wo) ιολαοι q$oxosam
190 228
190 228
FIG. 7
CZAS KWITNIENIA W TRANSGENACH ATH1
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (4)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób modyfikowania kwitnienia w roślinach, znamienny tym, ze obejmuje transformowanie roślin konstruktem zawierającym pełną albo częściową sekwencję DNA kodującą produkt ATH1 pod kontrolą promotora działającego w roślinach.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze proces kwitnienia w roślinach jest promowany przez transformowanie roślin konstniktem, który hamuje wytwarzanie białka ATHł.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że konstrukt jest przystosowany do ekspresji antysensownego RNA do RNA wytwarzanego przez gen ATH1.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces kwitnienia w roślinach jest opóźniany przez transformowanie roślin konstruktem, który promuje wytwarzanie zrekombinowanego białka ATH1.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9709789.3A GB9709789D0 (en) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | Plant gene constructs and their use |
| GBGB9727458.3A GB9727458D0 (en) | 1997-12-30 | 1997-12-30 | Plant gene constructs and their use |
| PCT/IB1998/000821 WO1998051800A1 (en) | 1997-05-14 | 1998-05-14 | Plant gene constructs and their use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL336852A1 PL336852A1 (en) | 2000-07-17 |
| PL190228B1 true PL190228B1 (pl) | 2005-11-30 |
Family
ID=35788248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98336852A PL190228B1 (pl) | 1997-05-14 | 1998-05-14 | Sposób modyfikowania kwitnienia w roślinach |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL190228B1 (pl) |
-
1998
- 1998-05-14 PL PL98336852A patent/PL190228B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL336852A1 (en) | 2000-07-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6887708B1 (en) | Plant control genes | |
| US6265637B1 (en) | Genetic control of flowering | |
| US6670526B1 (en) | Arabidopsis ESD4 gene and method to control flowering time | |
| Kubigsteltig et al. | Structure and regulation of the Arabidopsis thaliana allene oxide synthase gene | |
| ES2263214T3 (es) | Gen rht del trigo para el control genetico del crecimiento y desarrollo vegetal. | |
| JPH078278A (ja) | 植物の形質転換に使用し得るキメラ遺伝子においてターミネーター領域として作用し得る単離ｄｎａ配列 | |
| WO2009021448A1 (fr) | Gène régulateur de la hauteur d'une plante et ses utilisations | |
| EP2647646B1 (en) | Nucleic acid sequences and peptides/proteins of the FT family providing flower-repressing properties in tobacco and transgenic plants transformed therewith | |
| JP2002531083A (ja) | 植物の成長および収穫量を増大させる方法 | |
| JP2009540822A (ja) | 植物の構造及び成長を調節するための植物クロマチンリモデリング遺伝子の使用 | |
| CN104278053B (zh) | 一种提高植物耐旱能力的方法 | |
| US8026413B2 (en) | EMP4 gene | |
| Liu et al. | Overexpression of millet ZIP-like gene (SiPf40) affects lateral bud outgrowth in tobacco and millet | |
| EP0981621B1 (en) | Process for modifying the flowering of plants | |
| KR101261980B1 (ko) | 애기장대 유래의 ｍｙｂ52 유전자 및 이의 용도 | |
| US5861542A (en) | Gene controlling floral development and apical dominance in plants | |
| PL190228B1 (pl) | Sposób modyfikowania kwitnienia w roślinach | |
| CZ401499A3 (cs) | Konstrukce rostlinných genů a jejich použití | |
| JP2003310071A (ja) | 増強されたストレス耐性を有する遺伝子組換え植物 | |
| JP2009201422A (ja) | 硫黄欠乏応答性シス因子およびその利用 | |
| CN121294492A (zh) | 转录因子cga1在提高植物光合速率及生物量中的用途 | |
| JP2001037484A (ja) | メロンエチレン受容体遺伝子のプロモーター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification | ||
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20060514 |