PL190351B1

PL190351B1 - Chimeryczny łańcuch L, chimeryczny łańcuch H, chimeryczne przeciwciało monoklonalne, polipeptyd, łańcuch L humanizowanego przeciwciała, łańcuch H humanizowanego przeciwciała, humanizowane przeciwciało, DNA, rekombinowany wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała chimerycznego, sposób wytwarzania przeciwciała humanizowanego, kompozycja farmaceutyczna, czynnik

Info

Publication number: PL190351B1
Application number: PL97332460A
Authority: PL
Inventors: Koh Sato; Yuji Wakahara; Naohiro Yabuta
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2005-11-30
Also published as: PL332460A1

Abstract

1. Chimeryczny lancuch L obejmujacy region C lancucha L przeciwciala ludzkiego i region V lancucha L mysiego przeciwciala monoklonalnego przeciwko ludzkiemu bialku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze region V lancucha L obejmuje se- kwencje aminokwasowa jak pokazana na Id. Sekw. Nr: 45 3. Chimeryczny lancuch H obejmujacy region C lancucha H przeciwciala ludzkiego i region V lancucha H mysiego przeciwciala monoklonalnego przeciwko ludzkiemu bialku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze region V lancucha H obejmuje se- kwencje aminokwasowa jak pokazana na Id. Sekw. Nr: 46. 4 Chimeryczny lancuch H wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze regionem C jest lancuch C?l. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest chimeryczny łańcuch L, chimeryczny łańcuch H, chimeryczne przeciwciało monoklonalne, polipeptyd, łańcuch L humanizowanego przeciwciała, łańcuch H humariizowanego przeciwciała, humanizowane przeciwciało, DNA, rekombinowany wektor, transformant, sposób wytwarzania przeciwciała chimerycznego, sposób wytwarzania przeciwciała humanizowanego, kompozycja farmaceutyczna, czynnik.

Niniejszy wynalazek dotyczy ludzko/mysich przeciwciał zawierających region zmienny (region V) mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko białku spokrewnionemu z parathormonem i region stały (region C) ludzkiego przeciwciała; humanizowanego przeciwciała, w którym do ludzkiego przeciwciała przeszczepiono regiony określające komplementarność

190 351 regionów V łańcucha lekkiego (łańcuch L) i łańcucha ciężkiego (łańcuch H) mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko białku spokrewnionemu z parathormonem, łańcuchów L i H wymienionego przeciwciała, jak również polipeptydu zawierającego region V tworzącego łańcuch H i L wymienionego przeciwciała

Niniejszy wynalazek dotyczy również DNA zawierającego sekwencję zasad kodującą wymienione powyżej przeciwciało, a zwłaszcza jego region V i DNA kodujące łańcuch L i H zawierający region V. Następnie niniejszy wynalazek odnosi się do rekombinowanego wektora obejmującego wymienione DNA i gospodarza transformowanego wymienionym wektorem

Następnie niniejszy wynalazek dotyczy procesów wytwarzania chimerycznych i humanizowanych przeciwciał przeciwko PTHrP. Dalej, niniejszy wynalazek odnosi się do kompozycji farmaceutycznej i czynnika zawierającego jako aktywny składnik przeciwciało przeciwko PTHrP do zmniejszenia hiperkalcemii albo poprawiającego stan hipofosfatemii.

Podstawa wynalazku

Hiperkalcemia związana z nowotworem złośliwym jest poważnym, skomplikowanym objawem występującym u 5 do 20% wszystkich pacjentów cierpiących na nowotwory złośliwe i uważa się, ze jest końcowym objawem nowotworu złośliwego pewnie prowadzącym do zgonu, jeśli jest pozostawiony bez leczenia. Kontrolowanie hiperkalcemii może znacząco wpłynąć na rokowanie i QOL (jakość życia) pacjenta; i przez to będzie odgrywało znaczącą klinicznie rolę.

Generalnie hiperkalcemię pacjentów cierpiących na złośliwą chorobę nowotworową ogólnie dzieli się na HHM (hormonalna hiperkalcemia nowotworowa) opartą na hormonalnych czynnikach nowotworowych wywołujących resorpcje kości i lOh (miejscowa hiperkalcemia osteolityczna) oparta na miejscowym działaniu czynników, które są przekazywane lub naciekają kość. W przypadku hHm uważa się, że hiperkalcemię wywołuje resorpcja kości i rozpad tkanki kostnej powodujący zwiększony przepływ wapnia w połączeniu ze zmniejszoną zdolnością nerek do wydalania wapnia (S. Wada i N. Nagata, Internal Medicine, 69, 644-648)

Uważa się, ze hiperkalcemia wywołuje objawy, gdy stężenie wapnia w surowicy przekroczy 12 mg/dl, tymi nie charakterystycznymi objawami są anoreksja (brak apetytu), nudności i wymioty obserwowane we wczesnych stadiach choroby u pacjentów cierpiących na nowotwór złośliwy. Gdy dochodzi do pogłębienia hiperkalcemii, zmniejszenie zdolności zagęszczania moczu zależne od uszkodzenia dalszego kanalika nerkowego prowadzi do nadmiernego oddawania moczu (poliurii), anoreksji i nudnościom towarzyszy odwodnienie związane z niewystarczającym przyjmowaniem wody.

Wśród czynników hormonalnych wywołujących hiperkalcemię związaną z nowotworem złośliwym Moseley J.M. i in znaleźli białko spokrewnione z parathormonem (określane tutaj jako „PTHrP”), które jest zasadniczo podobne do parathormonu (PTH) jako czynnik humoralny wywołujący HHM: Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1987), 84,5048-5052.

Następnie, izolowano gen kodujący PTHrP (Suva L. J. i in., Science (1987) 237, 893) i dzięki alternatywnemu składaniu genu i temu, ze we krwi są obecne różne fragmenty powstałe w wyniku degradacji całkowitej cząsteczki PTHrP stało się jasne, że istnieją trzy rodzaje ludzkiego PTHrP posiadające 139, 141 i 173 aminokwasy: Baba H. Clinical Calcium (1995) 5, 229-223. W cząsteczce PTHrP 8 aminokwasów 13-to aminokwasowego końca N jest identycznych z PTH i można również wywnioskować, ze miejsce aminokwasowe od pozycji 14 do pozycji 34 ma strukturę przestrzenną podobną do PTH; tak więc PTH i PTHrP wiążą się ze wspólnym receptorem PTI ι/PTHrP przynajmniej regionem N-końcowym; Jueppner H. i in., Science (1991) 254, 1024-1026; Abou-Samra, A-B. i in, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 2732-2736.

Onisnie się, że PTHrP jest produkowany przez różnorodne tkanki nowotworowe i stało się oczywiste, ze jest produkowany nie tylko w nowotworach, PTHrP jest również produkowany od okresu płodowego do dojrzałości w różnych prawidłowych tkankach, w tym w skórze, ośrodkowym układzie nerwowym, macicy, łożysku, gruczole sutkowym w trakcie laktacji, tarczycy, przytarczycach, nadnerczach, wątrobie, w nerkach i pęcherzu moczowym Burtis WJ., Clin Chem. (1992) 38, 2171-2183; Stewart A.F. & Broadus A.E., J. Clin. Endocrinol (1991) 71, 1410-1414. Następnie, uważa się, ze PTHrP odgrywa ważną rolę w metabolicznej

190 351 regulacji gospodarki wapniowej, która jest utrzymywana na wysokim poziomie od okresu płodowego do okresu noworodkowego, w przeciwieństwie do organizmu matki

Wiadomo, ze receptory PTH/PTHrP są obecne przede wszystkim w kościach i nerkach (C. Shigeno, Clinical Calcium (1995) 5, 355-359) i wiązanie PTHrP do receptorów aktywuje rozliczne wewnątrzkomórkowe układy przekaźnictwa sygnału. Jeden z nich jest cyklazą adenylową, a inny fosfolipazą C. Aktywacja cyklazy adenylowej zwiększa stężenie wewnątrzkomórkowego cAMP aktywującego kinazę białkową A. Fosfolipaza C rozszczepia 4,5-bifosfonianfosfatydyloinozytolu, co powoduje powstanie 1,4,5-tnfosfonianu inozytolu i diacyloglicerolu. Białko G jest włączone w te szlaki przekazywania sygnału: Coleman, D.T. i in., Biochemical mechanisms of parathyroid hormane action. W „The parathyroids” (Bilezkian J.P i in ), Raven Press, Nowy Jork (1994) str. 239.

PTHrP przez te szlaki przekazywania sygnału wywołuje obserwowaną w HHM hiperkalcemię, hipofosfatemię, zmniejsza nerkową zdolność wychwytu fosforanów, zwiększa nerkowe wydzielanie cAMP i podobnych.

Tak więc staje się jasne to, ze PTHrP jest ściśle związane z hiperkalcemią towarzyszącą nowotworom złośliwym. W leczeniu hiperkalcemii związanej z chorobą nowotworową stosuje się kalcytoninę, związki sterydowe, indometacynę, nieorganiczne sole fosforowe, bifosfoniany i temu podobne, jak również uzupełnianie płynów. Jednakże, czynniki te mogą wykazywać zmniejszenie efektów swojego działania w trakcie nieprzerwanego podawania, pewne poważne skutki uboczne lub spowolnienie występowania efektów swojego farmakologicznego działania; skutkiem tego bardzo oczekiwane jest zastosowanie czynników lub leków wykazujących lepsze efekty terapeutyczne i mniej skutków ubocznych

Z drugiej strony nowym podejściem do leczenia hiperkalcemii związanej z nowotworem złośliwym, o którym donosi Kukreja S.C. i in., jest podawanie myszom bezgrasiczym, którym w celu wywołania hiperkalcemii wszczepiono ludzkie komórki raka płuc lub krtani surowicy neutralizującej PTHrP, które wywołało zmniejszenie stężenia wapnia i poziomu cAMP w moczu J Clin. Invest. (1988) 82, 1798-1802. Kanji Sato i in. donoszą, że podanie nagim myszom, którym przeszczepiono ludzki nowotwór produkujący PTHrP przeciwciał przeciwko PTHiP(1-34) powoduje zmniejszenie hiperkalcemii i znaczne wydłużenie okresu przeżycia myszy: J. Bone & Mine. Res. (1993) 8, 849-860. Następnie ujawniona publikacja japońskiego zgłoszenia patentowego nr 4-228089 ujawnia mysio/ludzkie przeciwciała chimeryczne przeciwko ludzkiemu PTHrP(1-34). W WO 96/22790 również ujawniono przeciwciała mysio/ludzkie lecz nie przedstawiono żadnej specyficznej sekwencji.

Mysie przeciwciała monoklonalne są wysoce immunogenne (czasami określane jako „antygenowe”) u ludzi, co ogranicza leczniczą kliniczną wartość mysich przeciwciał monoklonalnych u ludzi. Na przykład, mysie przeciwciało po podaniu ludziom może być metabolizowane jako obca substancja; tak więc okres półtrwania mysiego przeciwciała jest u ludzi stosunkowo krótki i jego oczekiwane efekty działania nie są dostatecznie wyrażone. Następnie, poziom ludzkich anty-mysich przeciwciał (HAMA) rosnący w odpowiedzi na podanie mysiego przeciwciała może powodować odpowiedź immunologiczną, która jest uciążliwa i niebezpieczna dla pacjenta, taką jak choroba posurowicza i inne reakcje alergiczne W związku z tym mysie przeciwciała monoklonalne nie mogą być często podawane ludziom

W celu rozwiązania tych problemów tworzone są sposoby zmniejszania immunogenności przeciwciał niepochodzących od ludzi, na przykład przeciwciał pochodzących od myszy. Jednym z tych sposobów jest wytworzenie przeciwciała chimerycznego, w którym region zmienny (region V) pochodzi z mysiego przeciwciała monoklonalnego, a region stały (region C) pochoWobec tego, ze powstałe przeciwciało chimeryczne posiada cały region zmienny oryginalnego mysiego przeciwciała, należy oczekiwać, że przeciwciało chimeryczne będzie wiązać się z antygenem z taką samą swoistością jak oryginalne przeciwciało mysie. Następnie takie przeciwciało chimeryczne ma znacząco zmniejszoną proporcję sekwencji aminokwasowej pochodzącej od zwierzęcia nie będącego człowiekiem, tak więc należy oczekiwać, ze posiada niższą immunogenność w porównaniu z oryginalnym przeciwciałem mysim

190 351

Pomimo, ze przeciwciało chimeryczne wiąże się z antygenem identycznie jak oryginalne mysie przeciwciało wykazując niższą immunogenność, to może wywołać pewne odpowiedzi immunologiczne na mysi region zmienny· LoBuglio A.F i in., Proc Natl Acad. Sci USA, 86, 4240-4224, 1989

Drugi sposób zmniejszenia immunogenności mysich przeciwciał jest ciągle bardziej skomplikowany, lecz oczekuje się dalszego większego zmniejszenia potencjalnej immunogenności mysich przeciwciał. W tym sposobie, jedynie regiony warunkujące komplementarność (CDR) regionu zmiennego mysiego przeciwciała są wszczepiane do ludzkiego regionu zmiennego w celu uzyskania „przekonstruowania” ludzkiego regionu zmiennego Jeśli jest to konieczne częściowa sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego podpierającego CDR w regionie zmiennym mysiego przeciwciała może zostać wszczepiona do ludzkiego regionu zmiennego w celu stworzenia struktury CDR w przekonstruowanym ludzkim regionie zmiennym bardziej podobnej do struktury oryginalnego mysiego przeciwciała.

Następnie, te humanizowane, przekonstruowane regiony zmienne są łączone z ludzkimi regionami stałymi. W ostatecznie przekonstruowanym humanizowanym przeciwciele częściami pochodzącymi z sekwencji aminokwasowej nie pochodzącej od człowieka są jedynie CDR i bardzo małe części FR. CDR są zbudowane z hiperzmiennej sekwencji aminokwasowej i nie wykazują żadnej gatunkowo-swoistej sekwencji. Tak więc, humanizowane przeciwciała zawierające mysie CDR nie posiadają dłużej silniejszej immunogenności niz występujące w przyrodzie ludzkie przeciwciała zawierające ludzkie CDR.

W odniesieniu do humanizowanych przeciwciał dalsze odniesienia należy czynić w stosunku do Riechmann L. i in., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye M. i in., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough C.A. i in., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Maeda H. i in , Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Gorman S.D. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest P.r. i in., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co M.S. i in., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter P. i m., Proc. Natl Acad Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992, Co M.S. i m., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; i Sato K. i m., Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

Mimo, że jak to wcześniej wspomniano oczekuje się, że humanizowane przeciwciała będą przydatne w celach leczniczych to nie są znane żadne humanizowane przeciwciała przeciwko PTHrP, ani nawet sugerowane w powyższych odnośnikach. Następnie nie ma żadnych standaryzowanych środków ogólnie możliwych do zastosowania wobec jakiegokolwiek przeciwciała w sposobie wytwarzania humanizowanych przeciwciał; do wytworzenia humanizowanego przeciwciała wykazującego wystarczającą aktywność wiążącą i neutralizującą wobec swoistego antygenu konieczne są różne środki i sposoby: patrz na przykład, Sato, K. i in., Cancer Res, 53, 851-856, 1993.

Ujawnienie wynalazku

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie ludzko/mysich przeciwciał zawierających region zmienny (region V) mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP i region stały (region C) ludzkiego przeciwciała; humanizowanego przeciwciała, w którym do ludzkiego przeciwciała przeszczepiono regiony określające komplementarność regionów V łańcucha lekkiego (łańcuch L) i łańcucha ciężkiego (łańcuch H) mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP; łańcuchów L i H wymienionego przeciwciała; jak również polipeptydu zawierającego region V tworzącego łańcuch H i L wymienionego przeciwciała.

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie DNA zawierającego sekwencję zasad kodującą wymienione powyżej przeciwciało, a zwłaszcza jego region V i DNA kodujące łańcuch L i H zawierający region V. Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie rekombinowanego wektora obejmującego wymienione DNA i gospodarza transformowanego wymienionym wektorem. Następnie celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobów wytwarzania chimerycznych i humanizowanych przeciwciał przeciwko PTHrP Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie przeciwciała przeciwko PTHrP posiadającego znaczną aktywność neutralizującą. Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie kompozycji farmaceutycznej i czynnika zawierającego jako

190 351 aktywny składnik przeciwciało przeciwko PTHrP do zmniejszenia hiperkalcemii albo poprawiającego stan hipofosfatemii lub zasadowicy.

Jako wynik energicznych badań, których zamiarem było osiągnięcie wyżej wymienionych cclów wynalazcy uzyskali sukces, przeciwciało, w którym immunogenność mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko PTHrP jest zmniejszona u ludzi, tak więc cele niniejszego wynalazku osiągnięto.

Niniejszy wynalazek dotyczy uzyskania chimerycznego łańcucha L zawierającego region C ludzkiego przeciwciała i region V mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP. Region V łańcucha L obejmuje taki region, który zawiera jedną sekwencję aminokwasowąjak pokazano w Id. Sekw. nr 45 i region C obejmujący region CX.

Niniejszy wynalazek dotyczy uzyskania chimerycznego łańcucha H zawierającego region C łańcucha H ludzkiego przeciwciała i region V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP. Region V łańcucha H obejmuje taki region, który zawiera jedną sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 46 i region C obejmujący region Cyl.

Następnie niniejszy wynalazek dotyczy chimerycznego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP zawierającego wymieniony chimeryczny łańcuch L i wymieniony chimeryczny łańcuch H

Dalej, niniejszy wynalazek obejmuje polipeptyd zawierający region V łańcucha L humanizowanego przeciwciała obejmujący regiony zrębowe 1 do 4 regionu V łańcucha L ludzkiego przeciwciała i regiony określające komplementamość 1 do 3 regionu V łańcucha L mysiego monoklonalnego przeciwciała przeciwko PTHrP. Regiony określające komplementamość 1 do 3 obejmują odpowiednio takie regiony zawierające sekwencje aminokwasowe jak pokazano w Id. Sekw. nr 59-61; regiony zrębowe 1 do 3 obejmują takie, które pochodzą odpowiednio z regionów zrębowych 1 do 3 ludzkiego przeciwciała HSU03868 i region zrębowy 4 obejmujący taki, który pochodzi z regionu zrębowego 4 ludzkiego przeciwciała S25755, lub regiony zrębowe 1 do 3 obejmujące identyczne regiony z odpowiednimi regionami zrębowymi 1 do 3 ludzkiego przeciwciała HSU03868 i region zrębowy 4 obejmujący identyczny region z regionem zrębowym 4 ludzkiego przeciwciała S25755.

Termin „identyczny” oznacza, że regiony zrębowe ludzkiego przeciwciała wykorzystanego w przeciwciele humanizowanym mogą posiadać delecje, wymieniony i/lub dodany aminokwas(y) wymagane do utworzenia regionów określających komplementamość mysiego przeciwciała monoklonalnego takich, ze przeciwciało humanizowane powinno posiadać aktywność równoważną, do tej którą posiada mysie przeciwciało monoklonalne.

Tak więc, niniejszy wynalazek odnosi się do polipeptydu obejmującego region V łańcucha L humanizowanego przeciwciała, w którym w regionach zrębowych aminokwasy 36 i 49 są odpowiednio tyrozyną i kwasem asparginianowym zgodnie z zaleceniami Kabat'a (Kabat E.A i in , US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991).

Niniejszy wynalazek dotyczy również polipeptydu obejmującego region V łańcucha L humanizowanego przeciwciała zawierający sekwencję aminokwasową jak pokazano, w którymkolwiek z Id. Sekw'. nr 48-51.

Następnie, niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydu obejmującego region V łańcucha L humanizowanego przeciwciała, w którym w regionach zrębowych aminokwasami 45 i 87 są według zalecenia Kabat'a odpowiednio lizyna i izoleucyna.

Dalej, niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydu obejmującego region V łańcucha L humanizowanego przeciwciała zawierającego sekwencję aminokwasowąjak pokazano, w którymkolwiek z Id. Sekw'. nr 52-55

Niniejszy wynalazek dotyczy następnie polipeptydu obejmującego region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała zawierającego regiony zrębowe 1 i 4 reginu V łańcucha H ludzkiego przeciwciała i regiony określające komplementamość 1 do 3 regionu V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP Regiony określające komplementamość 1 do 3 obejmują takie regiony, które zawierają odpowiednio sekwencje aminokwasowe jak pokazano w Id Sekw. nr 62-64, regiony zrębowe 1 do 4 obejmujące takie

190 351 regiony, które pochodzą z regionów zrębowych 1-4 ludzkiego przeciwciała należącego do ludzkiej podgrupy III (Ludzka Podgrupa III (HSG IE), Kabat E.A i in., US Dept Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991), bardziej szczegółowo takie, które pochodzą odpowiednio z regionów zrębowych 1 do 4 ludzkiego przeciwciała S31679 albo takie, które są identyczne z regionami zrębowymi odpowiednio 1 do 4 ludzkiego przeciwciała S31679

Również niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydu obejmującego region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała zawierającego sekwencję aminokwasowąjak pokazano wid. Sekw. nr 56

Niniejszy wynalazek również dotyczy łańcucha L humanizowanego przeciwciała przeciwko PTHrP obejmującego polipeptyd zawierający region V łańcucha L wymienionego przeciwciała humanizowanego i polipeptydu zawierającego region C łańcucha L ludzkiego przeciwciała. Region C obejmuje region CX, regiony zrębowe 1 do 3 zawierające takie regiony, które są identyczne z odpowiednio regionami zrębowymi 1 do 3 ludzkiego przeciwciała HSU03868, region zrębowy 4 zawierający region, który jest identyczny z regionem zrębowym 4 ludzkiego przeciwciała S25755 i sekwencję aminokwasową regionów określających komplementarność 1 do 3 zawierających takie, które reprezentowane są odpowiednio przez Id. Sekw. nr 59-61.

Następnie, niniejszy wynalazek również dotyczy łańcucha H humanizowanego przeciwciała przeciwko PTHrP obejmującego polipeptydy zawierające region C łańcucha H i region V łańcucha H wymienionego ludzkiego przeciwciała. Region C obejmuje region Cyl, regiony zrębowe 1 do 4 zawierające takie regiony, które pochodzą z regionów zrębowych 1 do 4 pochodzących od ludzkiego przeciwciała należącego do HSGIII, regiony określające komplementarność 1 do 3, które zawierają sekwencje aminokwasowe pokazane odpowiednio w Id. Sekw. nr 62-64

Niniejszy wynalazek następnie dotyczy DNA obejmującego sekwencję zasad kodującą region V łańcucha L albo region V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP Region V łańcucha L i region V łańcucha H zawiera te regiony, które obejmują odpowiednio sekwencję aminokwasową pokazaną w Id. Sekw. nr 45-46, DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą region V łańcucha L zawierającą sekwencję reprezentowaną przez Id. Sekw nr 65 i DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą region V łańcucha H zawierającą sekwencję reprezentowaną przez Id. Sekw. nr 57.

Według wynalazku DNA obejmuje sekwencje zasad kodujące polipeptydy określone powyżej.

Następnie, niniejszy wynalazek dotyczy również DNA kodującego wymienione chimeryczne łańcuchy L i H. DNA kodujący wymieniony łańcuch L obejmuje, na przykład DNA zawierający sekwencję zasad jak pokazano w Id Sekw. nr 65 i DNA kodujący wymieniony łańcuch H obejmujący sekwencję zasad takąjak pokazano w Id. Sekw. nr 57.

Dalej, niniejszy wynalazek również dotyczy DNA obejmującego sekwencje zasad kodujące region V łańcucha L albo region V łańcucha H wymienionego humanizowanego przeciwciała. DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą region V łańcucha L obejmuje taką sekwencję, która zawiera sekwencję zasad jak pokazano, w którymkolwiek Id. Sekw. nr 66-74 i DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą region V łańcucha H, który zawiera sekwencję zasad takąjak reprezentowana jest przez Id. Sekw. nr 58.

Niniejszy wynalazek również dotyczy DNA dla regionu V łańcucha L humanizowanego przeciwciała zawierającego sekwencję zasad kodującą sekwencję aminokwasowąjak pokazano, w którymkolwiek z Id. Sekw. nr 47-55. Wymieniony DNA obejmuje taką sekwencję zasad jak pokazano, w ktory^nkolwiek z Id Sekw. nr 66-74.

Następnie niniejszy wynalazek dotyczy DNA dla regionu V łańcucha H humanizowanego przeciwciała kodującego sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw nr 56. Wymieniony DNA obejmuje taką sekwencję zasad jak pokazano, w którymkolwiek z Id. Sekw nr 58.

Niniejszy wynalazek odnosi się do rekombinowanego wektora obejmującego jeden z wymienionych DNA.

190 351

Niniejszy wynalazek dotyczy następnie komórki gospodarza transformowanej wymienionym rekombinowanym wektorem.

Niniejszy wynalazek odnosi się również do sposobu wytwarzania chimerycznego albo humanizowanego przeciwciała przeciwko białku spokrewnionemu z ludzkim parathormonem obejmującego hodowanie wymienionych transformantów i zbieranie chimerycznych i humanizowanych przeciwciał przeciwko białku spokrewnionemu z ludzkim parathormonem z powstałej hodowli

Następnie niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej albo czynnika zmniejszającego hiperkalcemię albo poprawiającego stan hipofosfatemii obejmującego jako składnik aktywny wymienione humanizowane przeciwciało. Podniesiony poziom wapnia we krwi jest wywoływany przez nowotwory złośliwe, hipofosfatemia jest często obserwowana u pacjentów cierpiących na hiperkalcemię związaną z nowotworem złośliwym Tak więc przeciwciało według niniejszego wynalazku może być stosowane w leczeniu nowotworów złośliwych albo do zmniejszenia objawów hiperkalcemii albo hipofosfatemii. Korzystnie hipofosfatemiąjest krzywica hipofosfatemiczna oporna na wit. D. Nowotwory złośliwe obejmują lecz nie są ograniczone do, przynajmniej jednego wybranego z grupy składającej się z raka trzustki, płuc, gardła, krtani, języka, dziąseł, przełyku, żołądka, dróg żółciowych, sutka, nerek, pęcherza moczowego, macicy i prostaty i chłoniaka złośliwego. Czynnik do hamowania hiperkalcemii według niniejszego wynalazku może być stosowany w dowolnym nowotworze złośliwym, który wywołuje hiperkalcemię.

Niniejszy wynalazek zostanie szczegółowo opisany poniżej.

1. Proddkcja mysich przeeiwciał monokłonalnych przeeiwko PTThP

Mysie przeciwciała mnynklnyalye przeciwko PTHpP można wytworzyć przez przygotowanie hybrydom poprzez fuzję komórkową między komórkami szprheaka i komórkami produkującymi przeciwciała pochodzącymi od zwierząt immuniznwayyhh antygenem i poprzez wybieranie klonów uzyskanych hybrydom wytwarzających przeciwciała swoiście hamujące aktywność PTHrP.

(1) Przygotowanie antygenów

PTHrP wykorzystany do immuyieacJr zwierząt zawiera peptydy mające w całości lub w części amianOwasową sekwencję PTHpP wytworzoną technologią reknmbinnwayegn DNA albo syntezą chemiczną, PTHrP pochodzi z supernatantów komórek nowotworów wywołujących hiperkalcemię. Na przykład, jako antygen można wcknrecstać peptyd [PTHrP(l-34)J obejmujący od 1 do 34 aminokwasu znanego PTHzP (Kemp B.E. i in., Science 91987) 238, 1568-1570) Ludzkie PTHrP(l-34) posiada sekwencję aminokwasową jak pokazano wid. Sekw. op 75

Powstałe PTHpP połączono z białkiem nośnikowym takim jak l^zeog^^^, po czym nastąpiło dodanie adiuwanta Może być dodany każdy aaruwayt, w tym kompletne i niekompletne aaikwantc Freuyaa (2) [.mmuyieacJa i zbieranie komórek produkujących przeciwciała

Powyżej powstały antygen podaje się ssakom, takim jak myszy, szczury, konie, małpy, króliki, kozy albo owce. Immuyizacaę można przeprowadzić każdą ze znanych metod, obejmujących iniekcje dożylne, podskórne i dootrzewnowe. Odstępy pomiędzy imekcjami immuaieacyaycml nie są w szczególny sposób określone i mogą wynosić od kilku dni do kilku tygodni, korzystnie od 4 do 21 dm.

Dwa lub trzy dni po końcowej lmmunieacJi zbierane są komórki wytwarzające przeciwciała Komórki wytwarzające przeciwciała obejmują komórki śledziony, węzłów chłonnych i obwodowe komórki krwi; generalnie wykorzystywane są komórki śleaz.inny. Wielkość pojedynczej dawki antygenu wykorzystywanego do lmmualzacJl wynosi 100 Jg na mysz.

(3) Określenie miana przeciwciał

W celu określenia poziomu napnwreazl immunologicznej rmmuniznwancch zwierząt i wybrania interesujących hybrydom z komórek poddanych fuzji komórkowej, mierzy się poziom przeciwciał we krwi immunrznwancch zwierząt albo miano przeciwciał w supematancie komórek produkujących przeciwciała.

190 351

Znane są metody określania przeciwciał, obejmują one EIA (badanie immunologiczneenzymatyczne), RIA (badanie radio-immunologiczne) i ELISA (enzymatyczny test immunoabsorbcyjny).

(4) Fuzja komórkowa

Komórki szpiczaka wykorzystywane do fuzji z komórkami produkującymi przeciwciała obejmują linie komórkowe pochodzące od różnych zwierząt takich jak myszy, szczury i ludzie i zwykle są dostępne specjalistom. Przydatnymi i wykorzystywanymi liniami komórkowymi są te, które wykazują lekooporność, są niezdolne do przeżycia w wybiórczej pożywce takiej jak pożywka HAT w stanie nie poddanym fuzji i są zdolne do przeżycia w niej w stanie fuzji Generalnie wykorzystuje się linie komórkowe oporne na 8-azaguaninę, które nie mająhipoksantyno-guanino-fosforybozylotransferazy i nie mogą rosnąć w pożywce hipoksantyno-aminopteryno-tymidynowej (HAT).

Odpowiednie komórki szpiczaka, które można wykorzystać obejmują różnorodne znane linie komórkowe takie jak P3 (P3x63Ag8 653) (J. Immunol. (1979) 123:1548-1550); P3x63Ag8U 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7); NS-1 (Kohler G i Milstein C , Eur. J. Immunol. (1976) 6:511-519); MPC-11 (Margulies D.H. i in., Cell (1976) 8.405-415); SP2/0 (Shulman, M. i in., Nature (1978) 276:269-270), FO (de St. Groth, S.F. i in., J. Immunol. Methods (1980) 35:1-21); S194 (Trowbridge I.S., J. Exp. Med. (1978) 148.313-323) i R210 (Galfre G i in., Nature (1979) 277:131-133).

Komórki produkujące przeciwciała można uzyskać z komórek śledziony, komórek węzłów chłonnych albo podobnych. Śledzionę, węzeł chłonny lub podobną tkankę ekstachuje się lub usuwa z któregokolwiek z wyżej wymienionych zwierząt, a następnie miażdży tkanki Uzyskany zmiażdzony materiał tkankowy zawiesza się w pożywce lub buforze, takim jak PBS, DMEM albo ROM11640, filtruje przez stalowe sito lub podobne i wiruje w celu uzyskania pożądanych komórek produkujących przeciwciała.

Następnie wymienione komórki szpiczaka i komórki produkujące przeciwciała poddano fuzji komórkowej.

Fuzję komórkową można przeprowadzić przez doprowadzenie do skontaktowania się komórek szpiczaka i komórek produkujących przeciwciała w stosunku od 1:1 do 110 w pożywce do hodowli komórek zwierzęcych, takiej jak MEM, DMEM, albo RPME-1640 w obecności przyspieszacza fuzji w temperaturze od 30°C do 37°C przez 1 do 15 minut W celu przyspieszenia fuzji komórkowej można użyć każdego przyspieszacza fuzji albo wirusa, takiego jak glikol polietylenowy o średniej masie cząsteczkowej od 1000 do 6000, polialkohol winylowy albo wirus Sendai. Fuzję komórek produkujących przeciwciała i komórek szpiczaka można również przeprowadzić w dostępnym na rynku aparacie do fuzji komórkowych, który wykorzystuje stymulację elektryczną taką jak elektroporacja.

(5) Wybranie i klonowanie hybrydom

Hybrydomy będące przedmiotem zainteresowania wybierane są z komórek po fuzji komórkowej, na przykład metodą wykorzystującą wybiórczy wzrost komórek na swoistych pożywkach

Tak więc, zawiesinę komórkową rozcieńcza się odpowiednią pożywką i wysiewa na płytki do mikromiareczkowania. Wybiórczą pożywkę taką jak pożywka HAT dodaje się do każdej studzienki i inkubuje, w trakcie czego dokładnie wymienia się wybiórczą pożywkę na nową

Tak więc, hodowane komórki zbierane sąjako hybrydomy.

Hybrydomy te są następnie badane przesiewowo metodą rozcieńczeń granicznych, sorterem komórkowym aktywowanym fluorescencją albo innymi metodami. Na końcu uzyskuje się hybrydomy wytwarzające monoklonalne przeciwciała.

(6) Zbieranie przeciwciał monoklonalnych

Sposoby zbierania przeciwciał monoklonalnych z uzyskanych hybrydom obejmują tradycyjne hodowle komórkowe i metody tworzenia wysięków otrzewnowych.

W metodzie hodowli komórkowej, hybrydomy są hodowane w pożywce do hodowli komórek zwierzęcych, takiej jak pożywka RPMI-1640 zawierająca od 10 do 20% płodowej surowicy bydlęcej, pożywka MEM albo pożywka bezsurowicza, w typowych warunkach (tj 37°C, 5% CO2) przez 2 do 14 dni, z supernatantu zbierane są przeciwciała.

190 351

W metodzie tworzenia wysięków otrzewnowych, hybrydomy są wszczepiane dootrzewnowo temu samemu gatunkowi ssaka jak ssak, z którego pochodzą komórki szpiczaka, tak więc hybrydomy rosną obficie. Po 1 do 4 tygodni zbierane są płyn wysiękowy lub surowica.

Gdy konieczne jest oczyszczenie przeciwciał uzyskanych tymi metodami wybiera się albo łączy znane metody takie jak, precypitacja siarczanem amonu, chromatografia jonowymienna i chromatografia powinowactwa.

2. Ktoistnunwunc: przeciwciał chimerycznych (1) Klonowanie DNA zawierającego sekwencję zasad kodującą region V mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP.

(i) Przygotowanie mRNA

W celu sklonowania DNA zawierającego sekwencję zasad kodującą region V mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP zebrane hybrydomy traktuje się w sposób typowy, na przykład, ultrawirowaniem guanidynowym (Chirgwin J.M i m., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) albo metodą AGPC (Chomczyński P. i in., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156-159) aby uzyskać całkowite RNA, z którego otrzymuje się mRNA przy użyciu kolumny wirowniczej z Oligo(dT)-celulozą dołączoną do zestawu do oczyszczania mRNA (Pharmacia). Można również wykorzystać zestaw do oczyszczania mRNA Quick Prep (Pharmacia AB) bez potrzeby ekstrakcji całkowitego RNA.

(u) Przygotowalnie i amplifikacja cDNA

Z mRNA uzyskanego jak w punkcie (i) powyżej, każde cDNA regionów V łańcuchów L i H syntetyzuje się wykorzystując odwrotną transkryptazę. W syntezie cDNA, starter Oligo-dt albo inny odpowiedni starter, który hybrydyzuje z regionem C łańcucha L albo H, na przykład można zastosować starter MHC2 mający sekwencję zasad takąjak pokazano w Id. Sekw. nr 1.

W syntezie cDNA, wymienione mRNA i starter są mieszane i reakcja jest przeprowadzana w obecności odwrotnej transkryptazy w np. 52°C przez 30 minut.

Amplifikację cDNA obu łańcuchów L i H można przeprowadzić metodą PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) opartą na metodzie 5'-RACE (Frohman M.A. i in, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky A. i in., Nucleic Acids Res , 17, 2919-2932, 1989) wykorzystując zestaw 5'-Ampli FINDER RACE (CLONTECH Inc.). Tak więc, Ampli FINDER Anchor (Id. Sekw. nr 42) jest przyłączany do końca 5' cDNA syntetyzowanego powyżej i przeprowadzane jest PCR dla DNa zawierających sekwencje zasadowe kodujące regiony V łańcucha L i H. (tutaj, DNA zawierające sekwencję zasad kodującą region V łańcucha L jest czasami nazywany w uproszczeniu jako „DNA dla region V łańcucha L” lub DNA kodujące region V łańcucha L”. Również odnosi się to do regionu V łańcucha H, regionu C itd.).

Starter, który może być użyty do amplifikacji DNA regionu V łańcucha L zawiera na przykład, starter kotwiczący (Id. Sekw. nr 2) i startery utworzone z zakonserwowanych sekwencji regionu stałego łańcucha LA (region C λ) mysich przeciwciał, takie jak starter MLC mający sekwencję zasad takąjak pokazano w Id. Sekw. nr 4. Starter, który może być użyty do amplifikacji DNA regionu V łańcucha H zawiera na przykład, starter kotwiczący (Id. Sekw. nr 2) i starter MHC-G1 (Id. Sekw-·. nr 3) (S.T Jones i in., Biotechnology, 9, 88, 1991).

(iii) Oczyszczanie DNA i określanie sekwencji zasad

Produkty PCR są poddawane elektroforezie na żelu agarozowym zgodnie z typowymi procedurami wycinania interesujących fragmentów DNA, które są następnie odzyskiwane, oczyszczane i poddawane ligacji z wektorem DNA.

Oczyszczanie DNA można przeprowadzić wykorzystując dostępne na rynku zestawy takie jak GENECLEAN II; BIO1O1. Znanym wektorem DNA, który może być tutaj użyty do piζχπυΰζ,υιπα 11 agnicniu w unn, j νοι 11α ruau puvi 7 αιυυ ijiucdviipi.

Wymienione DNA 1 wektor DNA są ligowane przy użyciu znanego zestawu do ligacji (Takara Shuzo) w celu uzyskania wektora rekombinowanego. Powstały rekombinowany wektor wprowadza się do np. Escherichu coli JM109 i wybierane są kolonie oporne na ampicylinę, tak więc wektor DNA jest przygotowywany znanymi metodami: J. Sambrook 1 in., „Molecular Cłoning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Po trawieniu wektora DNA enzymem(ami) restrykcyjnym(i) znanymi metodami, takimi jak metoda dideoksy: J. Sambrook

190 351 i in., „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 określana jest sekwencja zasad pożądanego DNA W niniejszym wynalazku można zastosować urządzenie do automatycznego sekwencjonowania (DNA Sequencer 373A,; ABI Inc.).

(iv) Regiony określające komplementarność

Regiony V łańcucha L i H tworzą miejsce wiązania antygenu i ich cała struktura wykazuje pewne wspólne wzajemne podobieństwo. Cztery części ich regionów zrębowych (FR) są połączone przez trzy regiony superzmienne, lub regiony określające komplementarność (CDR). Sekwencja aminokwasową FR jest stosunkowo dobrze zakonserwowana, podczas gdy zmienność sekwencji aminokwasowej regionu CDR jest bardzo duża: Kabat E.A. i in., „Sequence of Proteins of Immunological Interest” US Dept. Health and Human Services, 1983.

Wiele części czterech FR ma strukturę arkusza β, w wyniku czego trzy CDR tworzą pętlę. CDR mają czasami częściową strukturę arkusza β. Tak więc, trzy CDR są utrzymywane przestrzennie w bardzo bliskiej odległości jedne od drugich przez FR, co tworzy miejsce wiązania antygenu łącznie z trzema CDR w sparowanych regionach.

W związku z tym, w celu znalezienia wzajemnej homologii regiony CDR można znaleźć przez wzajemne porównanie sekwencji aminokwasowych regionów zmiennych mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP i bazy danych sekwencji aminokwasowych przeciwciał przygotowanej przez Kabat'a i in. („Sequence of Proteins of Immunological Mterest” US Dept. Health and Human Services, 1983).

(2) Konstruowanie wektora ekspresyjnego przeciwciała, chimerycznego

Najpierw klonowane są fragmenty DNA kodujące regiony V łańcucha L i H mysiego przeciwciała monoklonalnego (tutaj czasami łańcuch L i H przeciwciała nazywany jest „mysim łańcuchem L” itd. dla mysich przeciwciał i „ludzkim łańcuchem H” itd dla ludzkich przeciwciał), DNA kodujący mysie regiony V i DNA kodujący regiony stałe ludzkiego przeciwciała są poddane ligacji i wyrażane w celu uzyskania przeciwciał chimerycznych przeciwko ludzkiemu PTHrP.

Typowe metody wytwarzania przeciwciał chimerycznych obejmują ligowanie mysiej sekwencji liderowej i sekwencji regionu V obecnych w sklonowanym cDNA z juz istniejącą w wektorze ekspresyjnym komórki ssaka sekwencją kodującą region C ludzkiego przeciwciała. Alternatywnie mysia sekwencja liderowa i już obecna w sklonowanym cDNA sekwencja regionu V są poddawane ligacji z sekwencją kodującą regionu C ludzkiego przeciwciała, po czym następuje ligacja z wektorem ekspresyjnym komórki ssaka.

Polipeptyd zawierający region C ludzkiego przeciwciała może być którymkolwiek z regionów C łańcucha L albo H ludzkiego przeciwciała w tym na przykład, Cyl, Cy2, Cy3 albo Cy4 ludzkich łańcuchów H albo CX lub Ck łańcuchów L.

W celu wytworzenia przeciwciała chimerycznego najpierw konstruowane są dwa wektory ekspresyjne, w ten sposób, ze budowane są: wektor ekspresyjny zawierający DNAKodujący region V mysiego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L pod Kontrolą regionu kontrolującego ekspresję takiego jak układ wzmacniacz/promotor i wektor ekspresyjny zawierający DNA Kodujące region V mysiego łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H pod Kontrolą regionu Kontrolującego ekspresję takiego jak układ wzmacniacz/promotor. Następnie, Komórki gospodarza, takie jak Komórki ssaka są poddawane Ko-transformacji z tymi wektorami ekspresyjnymi i w celu produkowania przeciwciał chimerycznych hoduje się transformowane Komórki in vitro i in vivo; patrz, na przykład, WO91/16928.

Alternatywnie, do pojedynczego wektora ekspresyjnego wprowadza się mysią sekwencję liderową obecną w sklonowanym cDNA i DNA Kodujące region V mysiego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L jak również mysią sekwencję liderową obecną w sklonowany/m cDNA i DNA Kodujące o ngn \/ v wcisrro la ncucKa a, i romn-n C,ι^ύΙκιππ Jłńcucłh W

AlUijIU ' * · N ' » A i-3 A -.A A A W^AWAA V AAAJ L>IV£,V HA*XVUvi»U A A A AW^AWAA A U»Vk *_j AAA νφ V» 4 ΜΧΧ V U.Vi It* AA (patrz, na przykład, WO94/11523) i otrzymany wektor wykorzystuje się do transformowania Komórki gospodarza; następnie, w celu produkowania pożądanych przeciwciał chimerycznych hoduje się transformowane Komórki gospodarza in vitro i in vivo.

(i) Produkcja łańcucha H przeciwciała chimerycznego

Wektor do ekspresji łańcucha H chimerycznego przeciwciała można uzyskać przez wprowadzenie cDNA zawierającego sekwencję zasad Kodującą region V mysiego łańcucha H

190 351 (określane tutaj również jako „cDNA regionu V łańcucha H”) do odpowiedniego wektora ekspresyjnego zawierającego genomowe DNA obejmujące sekwencję zasad kodującą region C ludzkiego łańcucha H (określane tutaj również jako „genomowe DNA regionu C łańcucha H”) albo cDNA kodujące ten region (określane tutaj również jako „cDNA regionu C łańcucha H”). Region C łańcucha H obejmuje, na przykład, regiony Cyl, Cy2, Cy3 albo Cy4.

(i-a) Konstrukcja wektora ekspresyjnego chimerycznego łańcucha H zawierającego genomowy DNA kodujący region C łańcucha H

Wektory ekspresyjne mające genomowy DNA kodujący region C łańcucha H, a zwłaszcza te, które kodują region Cyl, obejmują, na przykład HEF-PMhgy 1 (WO92/19759) i DHFR- AE-RVh-PMl-f (WO92/19759).

Gdy cDNA kodujący mysi region V łańcucha H zostanie wprowadzony do tych wektorów ekspresyjnych, to odpowiednia sekwencja zasad może zostać wprowadzona do tego cDNA metodą PCR. Na przykład PCR może być przeprowadzone z wykorzystaniem startera PCR, który jest zaprojektowany tak, ze dany DNA posiada sekwencję rozpoznającą dla przydatnego enzymu restrykcyjnego na swoim końcu 5' i sekwencję zgodności Kozaka bezpośrednio przed kodonem początkowym w celu poprawienia skuteczności transkrypcji, jak również startera PCR, który jest zaprojektowany tak, ze dane cDNA posiada sekwencję rozpoznającą dla przydatnego enzymu restrykcyjnego na swoim końcu 3' i donorowe miejsce wiązania w celu prawidłowego związania pierwotnych produktów transkrypcyjnych genomowego DNA by pozwolić mRNA na wprowadzenie tych odpowiednich sekwencji zasad do wektora ekspresyjnego.

Po tym jak konstruowane cDNA kodujący mysi region V łańcucha H traktowany jest odpowiednim enzymem(ami) restrykcyjnym(i), włącza się go do danego wektora ekspresyjnego w celu stworzenia wektora ekspresyjnego chimerycznego łańcucha H zawierającego genomowe DNA kodujące region C łańcucha H (region Cyl).

(i-b) Konstrukcja wektora ekspresyjnego chimerycznego łańcucha H zawierającego cDNA obejmujący sekwencję zasad kodującą łańcuch H.

Wektory ekspresyjne mające cDNA kodujący region C łańcucha H, takie jak region Cy 1, mogą być konstruowane w następujący sposób: mRNA wytwarza się z komórek CHO, do których wprowadzono wektor ekspresyjny DHFR- AE-RWi-PMl-f (patrz WO92/19759) zawierający DNA kodujący region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 i genomowy DNA Cyl regionu C łańcucha H ludzkiego przeciwciała (N Takahashi i in., Celi, 29, 671-679 91982)) i wektor ekspresyjny RVl-PMla (patrz WO92/19759) obejmujący genomowy DNA kodujący region V łańcucha L humanizowanego przeciwciała PM1 i genomowy DNA regionu C łańcucha Lk ludzkiego przeciwciała; cDNA kodujący region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 i cDNA kodujący region C łańcucha H (Cyl) ludzkiego przeciwciała są klonowane z wykorzystaniem metody RT-PCR i poddawane ligacji z wektorem ekspresyjnym komórki zwierzęcej, który traktowano odpowiednimi enzymem(ami) restrykcyjnym(i) w celu skonstruowania pożądanego wektora ekspresyjnego.

Gdy cDNA kodujący mysi region V łańcucha H poddaje się bezpośredniej ligacji z cDNA kodującym Cyl regionu C łańcucha H ludzkiego przeciwciała odpowiednie sekwencje zasad mogą zostać wprowadzone z wykorzystaniem PCR do fragmentu zawierającego cDNA kodujący region V łańcucha H Na przykład PCR można przeprowadzić wykorzystując starter PCR, który jest zaprojektowany tak, ze wymieniona sekwencja cDNA ma na końcu 5' sekwencję rozpoznającą dla przydatnego enzymu restrykcyjnego i sekwencję zgodności Kozaka bezpośrednio przed kodonem początkowym w celu poprawienia skuteczności transkrypcji, jak również PCR, który jest zaprojektowany tak, ze dane cDNA posiadają sekwencję rozpoznającą dla przydatnego enzymu restrykcyjnego na swoim końcu 3’ w celu bezpośredniej ligacji do Cyl regionu C łańcucha H, tak aby wprowadzić te odpowiednie sekwencje zasad do danego cDNA.

Tak więc skonstruowany cDNA kodujący mysi region V łańcucha H traktuje się odpowiedmm(i) enzymem(ami) restrykcyjnym (i), poddaje ligacji z cDNA kodującym dany Cyl regionu C łańcucha H i włącza do wektora ekspresyjnego takiego jak pCOSl albo pCHOl w celu zbudowania wektora ekspresyjnego zawierającego cDNA kodujący chimeryczny łańcuch H.

190 351 (ii) Produkcja łańcucha L przeciwciała chimerycznego

Wektor do wyrażania łańcucha L przeciwciała chimerycznego można uzyskać przez poddanie ligacji cDNA kodującego mysi region V łańcucha L i genomowy DNA albo cDNA kodujący region C łańcucha L ludzkiego przeciwciała i wprowadzenie do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Region C łańcucha L obejmuje na przykład, łańcuch κ i łańcuch λ.

(ii-a) Konstrukcja wektora ekspresyjnego zawierającego cDNA kodujący chimeryczny łańcuch LA

Gdy wektor ekspresyjny zawierający cDNA kodujący mysi region V łańcucha L zostanie zbudowany, to odpowiednia sekwencja zasad może zostać wprowadzona do tego wektora ekspresyjnego metodą PCR. Na przykład PCR może być przeprowadzone z wykorzystaniem startera PCR, który jest zaprojektowany tak, że dane cDNA ma sekwencję rozpoznawaną przez przydatny enzym restrykcyjny na swoim końcu 5' i sekwencję zgodności Kozaka w celu poprawienia skuteczności transkrypcji, jak również startera PCR, który jest zaprojektowany tak, ze dane cDNA posiada sekwencję rozpoznającą dla przydatnego enzymu restrykcyjnego na swoim końcu 3’, w celu bezpośredniego zligowania Cyl regionu C łańcucha H aby wprowadzić odpowiednie sekwencje zasad do wymienionego cDNA.

Cała sekwencja zasad cDNA kodującego region C ludzkiego łańcucha Ι!λ, może zostać zsyntetyzowana przy wykorzystaniu syntetyzera DNA lub zbudowana z wykorzystaniem metody PCR Wiadomo, ze region C ludzkiego łańcucha Lλ, posiada przynajmniej cztery różne izotypy i każdy izotyp może zostać wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego Na przykład, w oparciu o poszukiwanie homologii z regionami C łańcucha Lλ sklonowanych mysich przeciwciał monoklonalnych został znaleziony i wykorzystany do zbudowania wektora ekspresyjnego izotyp Mcg+Ke+Oz- fragmentu regionu C ludzkiego łańcucha L λ, (nr dostępu Χ57819) (PDariavach i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987). By zbudować cDNA taki jak Mcg+Ke+Oz- znanego regionu C ludzkiego łańcucha Τλ zaprojektowano następujące cztery startery jak pokazano w Id. Sekw'. nr 11-14. Startery MBClHGP1 (Id. Sekw. nr 11) i MBClHGP3 (Id. Sekw. nr 13) mają sekwencję DNA sensowną, a startery MBC1HGP2 (Id Sekw. nr 12) i MBClHGP4 (Id. Sekw'. nr 14) mają sekwencję DNAantysensowną, gdzie każdy starter posiada od 20 do 23 bp sekwencji komplementarnej na każdym z ich końców.

MBClHGPS (Id. Sekw·'. nr 15) i MBClHGPR (Id. Sekw. nr 16) są zwane starterami zewnętrznymi mają sekwencje homologiczne odpowiednio zMBCIHGP1 i MBClHGP4 i każdy posiada sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie enzymy restrykcyjne. Metodą PCR połączono cztery startery do zsyntetyzowania cDNA pełnej długości i dodano startery zewnętrzne w celu amplifikacji cDNA. Połączenie metodą PCR oznacza, ze MBClHGP1 i MBClHGP2 albo MBClHGP3 i MBClHGP4 są przyłączone przez ich sekwencje komplementarne w celu zsyntetyzowania fragmentu MBClHGP1-MBClHGP2 i fragmentu MBClHGP3-MBClHGP4 i każdy fragment jest ponownie przyłączony przez swoją sekwencję komplementarną w celu zsyntetyzowania cDNA pełnej długości kodującego region C ludzkiego łańcucha Lλ.

Tak zbudowany cDNA kodujący region C ludzkiego łańcucha i powyższy skonstruowany cDNA regionu V mysiego łańcucha L mogą zostać poddane ligacji pomiędzy miejscami dla odpowiednich enzymów restrykcyjnych i włączone do wektora ekspresyjnego takiego jak pCOS1 albo pCHO1 w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego zawierającego cDNA kodujący łańcuch LA przeciwciała chimerycznego.

(ii-b) Konstrukcja wektora ekspresyjnego zawierającego cDNA kodujący chimeryczny łańcuch Lk.

Gdy wektor ekspresyjny zawierający cDNA kodujący mysi region V łańcucha L zostanie zbudowany, to odpowiednia sekwencja zasad może zostać wprowadzona do tego wektora ekspresyjnego metodą PCR. Na przykład PCR może być przeprowadzone z wykorzystaniem startera PCR, który jest zaprojektowany tak, ze dane cDNA posiada sekwencję rozpoznającą dla odpowiedniego enzymu restrykcyjnego na swoim końcu 5' i sekwencję zgodności Kozaka w celu poprawienia skuteczności transkrypcji, jak również startera PCR, który jest zaprojektowany tak, ze dane cDNA posiada sekwencję rozpoznającą dla przydatnego

190 351 enzymu restrykcyjnego na swoim końcu 3', w celu wprowadzenia tych odpowiednich sekwencji zasad do wymienionego cDNA.

DNA kodujący region C ludzkiego łańcucha Lk, który może zostać poddany ligacji z DNA kodującym region V mysiego łańcucha L może zostać skonstruowany z, na przykład HEF-PM1k-gk zawierającego genomowe DNA (patrz WO92/19759).

Sekwencje rozpoznające dla odpowiednich enzymów restrykcyjnych mogą zostać wprowadzone przy użyciu metody PCR, do końców 5' i 3' DNA kodującego region C łańcucha Lk i DNA kodujący region V mysiego łańcucha L, skonstruowany jak powyżej i DNA Kodujący region C łańcucha Lk mogą zostać poddane ligacji między sobą i włączone do wektora ekspresyjnego takiego jak pCOS1 albo pCHO1 w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego zawierającego cDNA kodujący łańcuch Lk przeciwciała chimerycznego.

3. Produucja przeciwciał humanizowanych (1) Poszukiwanie homologii z ludzkimi przeciwciałami.

W celu wytworzenia humanizowanych przeciwciał, w których CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego jest przeszczepione do ludzkiego przeciwciała pożądane jest istnienie dużej homologii pomiędzy FR mysiego przeciwciała monoklonalnego a FR ludzkiego przeciwciała. Zgodnie z tym porównuje się regiony V łańcuchów L i H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP i regiony V wszystkich znanych przeciwciał, których struktura została określona z wykorzystaniem Protein Data Bank. Dalej są one jednocześnie porównywane z ludzkimi podgrupami przeciwciał (HSG: Ludzkie podgrupy) sklasyfikowanymi przez Kabat'a i in. w oparciu o długości FR przeciwciała, homologię aminokwasów i podobne: Kabat E A. i in , US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991

Regiony V ludzkiego łańcucha H mogą zostać sklasyfikowane do HSG I do III według Klasyfikacji HSG Kabat'a i in. i regiony V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP wykazują 82,7% homologię ze zgodną sekwencją HSG III Z drugiej strony regiony V ludzkiego łańcucha LZ można sklasyfikować do HSG I do IV według klasyfikacji HSG Kabat'a i in. i regiony V łańcucha LZ mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko PTHrP nie wykazują dużej homologii ze zgodnymi sekwencjami regionów V ludzkiego łańcucha LZ należącego do którejkolwiek z podgrup.

Gdy mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu PTHrP jest humanizowane pożądane jest zastosowanie w celu zbudowania humanizowanego przeciwciała regionu V ludzkiego łańcucha H należącego do HSG III i posiadającego największą homologię, albo regionu V ludzkiego łańcucha H posiadającego strukturę FR, Która odpowiada wzorowi strukturalnemu (Chothia C. i in., J Mol. Biol., 196, 901-917, 1987), jako region V ludzkiego łańcucha H. Ponadto, jeśli nie ma sekwencji zgodności z wysokim stopniem homologii w podgrupach regionów V ludzkiego łańcucha LZ, pożądane jest zastosowanie do zbudowania humanizowanego przeciwciała regionu V ludzkiego łańcucha L Z, z najwyższym stopniem homologii zarejestrowanego w Protein Data Bank.

(2) Projektowanie DNA kodującego region V humanizowanego przeciwciała

Pierwszym etapem projektowania DNA kodującego region V humanizowanego przeciwciała jest wybranie regionu V ludzkiego przeciwciała jako podstawy projektowania.

W niniejszym wynalazku można zastosować w humanizowanym przeciwciele FR regionu V ludzkiego przeciwciała wykazującego z regionem V mysiego przeciwciała homologię większą niż 80%. FR regionu V łańcucha H jaKo fragment identycznego FR może obejmować FR pochodzące z takich, które należą do podgrupy HI, jak S31.679: NBRF-PDB, Cusmier AM. i in, Eur J Immunol., 23, 110-118, 1993. Następnie, FR regionu V łańcucha L jaKo nląpimnumó no nr^nrlzłori n-o rrmonf 11 UgjlllVllU

X X <X-« z ludzkiego przeciwciała HSU03868 (GEN-BANK, Deftos M. i in., Scand. J. Immunol., 39, 95-103, 1994) i FR4 pochodzące z ludzkiego przeciwciała S25755 (NBRF-PDB).

Ludzkie przeciwciało S31679 sklonowano z biblioteki cDNA ludzkich wątrób płodowych, podczas gdy ludzkie przeciwciało HSU03868 sklonowano jako nowy gen regionu V ludzkiego łańcucha L Z.

190 351 (3) Przygotowanie polipeptydów zawierających region V humanizowanego przeciwciała

W humanizowanym przeciwciele według niniejszego wynalazku region C i regiony zrębowe (FR) regionu V danego przeciwciała pochodzą od ludzi a regiony określające komplementarność (CDR) regionu V pochodzą od myszy (fig. 1). Polipeptyd zawierający region V humanizowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku można wytworzyć przy użyciu metody PCR sposobem zwanym przeszczepianiem CDR tak długo jak fragment dNa ludzkiego przeciwciała będzie dostępny jako matryca. „Przeszczepianie CDR” odnosi się do sposobu, w którym wytwarza się fragment DNA kodujący CDR pochodzący od myszy i zamienia się z CDR ludzkiego przeciwciała jako matrycą.

Jeśli nie można wykorzystać jako matrycy fragmentu DNA ludzkiego przeciwciała, sekwencja zasad zarejestrowana w bazie danych może zostać zsyntetyzowana w syntetyzerze DNA i DNA regionu V humanizowanego przeciwciała może być wytworzony metodą PCR. Dalej, jeśli jedynie sekwencja aminokwasowa jest zarejestrowana w bazie danych, cała sekwencja zasad może zostać wywnioskowana z sekwencji aminokwasowej na podstawie podstaw wiedzy o wykorzystaniu kodonu w budowie przeciwciał jak to opisuje Kabat E.A. i in., US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991 Ta sekwencja zasad jest syntetyzowana w syntetyzerze DNA i DNA regionu V humanizowanego przeciwciała może zostać wytworzony metodą PCR i wprowadzony do odpowiedniego gospodarza, po czym następuje jego wyrażanie w celu produkcji pożądanego polipeptydu.

Poniżej opisano ogólne procedury przeszczepiania CDR metodą PCR, podczas gdy dostępny jest fragment DNA ludzkiego przeciwciała jako matryca.

(i) Przeszczepianie CDR

Zakładamy, ze DNA kodujący region V obejmuje DNA kodujące FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4, które są połączone ze sobą w taki sposób jak to pokazano na fig. 2.

Po pierwsze syntetyzuje się fragmenty DNA pochodzące od myszy odpowiadające odpowiednim CDR. CDR 1 do 3 syntetyzuje się na podstawie sekwencji zasad wcześniej sklonowanych regionów V mysiego łańcucha H i L. Startery do przeszczepiania B i E syntetyzuje się tak, ze starter B powinien posiadać sekwencję hybrydyzującą z mysim CDR1 i ludzkim przeciwciałem FR2 w kierunku sensownym, a starter E powinien mieć sekwencję hybrydyzującą zCDR1 i ludzkim przeciwciałem FR1 w kierunku antysensownym (fig. 2 (1)). Podobnie syntetyzowane są startery do przeszczepiania C i F i startery D i G. Następnie synetyzowane są również odpowiednie startery zwane „starterami zewnętrznymi” i odpowiadające A i H na fig. 2 (1), które mogą hybrydyzować z regionami odpowiednio powyżej FR1 i poniżej FR4. Izolację i ekstrakcję starterów do przeszczepiania można przeprowadzić według znanych procedur: Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Następnie, pierwsze PCR przeprowadza się z wykorzystaniem startera do przeszczepiania E i zewnętrznego startera A, starterów do przeszczepiania B i F, starterów do przeszczepiania C i G, jak również startera do przeszczepiania D i zewnętrznego startera H w wyniku czego powstają odpowiednio fragmenty A-E, B-F, C-G i D-H (fig. 2 (2)).

Ponieważ regiony powyżej startera do przeszczepiania B i część regionu poniżej startera do przeszczepiania E zostały zaprojektowane tak by nakładały się jedne na drugie (To samo odnosi się do startera do przeszczepiania C i F, jak również do D i G), fragmenty te mogą przyłączać się w reakcji PCR do odpowiednich sekwencji komplementarnych w reakcji w odpowiednich warunkach temperaturowych i łączyć się w postać DNA mającego długość od A do H. Po tym jak uzyska się fragment DNA kodujący region V mogą zostać dodane startery zewnętrzne A i H i można przeprowadzić następną reakcję PCR w celu uzyskania DNA kodującego region V humanizowanego przeciwciała, w którym FR 1 do 4 pochodzą od człowieka, a CDR 1 do 3 pochodzą od myszy Następnie ten DNA może zostać włączony do odpowiedniego gospodarza w celu uzyskania ekspresji, a przez to pożądanego polipepydu (fig 2 (3)).

190 351 (ii) KonstrunoJa DNA i weAtora ckdpreeojnoeo koguj ącego region eg namanizowanegc łańcucha H

W omeJsecm wcyalaeOu, całą sekwencję zasad DNA kodującego region V łańcucha H ludzkiego przeciwciała, którą użyto jłkn matrycę dla przeciwciała humanizowanego można escytetcenwać w syytetceeree DNA i skonstruować metodą PCR, mimo ze to DNA nie jest dostępne w środowisku naturalnym.

Regin V łańcucha H mysiego przeciwciała mnynOlnnalnegn przeciwko ludzkiemu PTHrP wykazuje wysoką homologię zS31679 należącym do ludzkiej podgrupy III. W celu wcknrzystama tego ludzkiego przeciwciała jakn matrycy do konstruowania DNA kodującego region V humanizowanego łańcucha H użyto, na przykład czterech starterów jak pokazano w Id. Sekw nr 23-26. Startery MBClHGPl (Id. Sekw. nr 23) i MBClHGP3 (Id. Sekw. nr 24) mają sekwencje DNA sensowne, aMBClHGP2 (Id. Sekw. op 25) i MBC1HGP4 (Id. Sekw. nr 26) mają sekwencje DNA antysensnwye. Zostały eaprnaektnwaye tak aby posiadały 15 do 21 bp sekwencji komplementarnej na każdym z ich końców.

Startery zewnętrzne MBClHVS1 (Id. Sekw. no 27) i MBClHVR1 (Id. Sekw. no 28) mają sekwencje homologiczne napnwiedyin z MBClHGPl iMBClHGP4 i każdy posiada sekwencję rozpoznawaną przez odpowiednie enzymy restrykcyjne. Metodą PCR połączono cztery startery do esyntetcenwayla cDNA pełnej długości i dodano startery zewnętrzne w celu amplifikacji cDNA „Połączenie metodą PCR” obejmuje tutaj przyłączanie MBC1HGP1 i MBG1HGP2 albo MBC1HGP3 i MBC1HGP4 przez ich sekwencje komplementarne w celu esyntetyenwania fragmentu MBC1HGP1-MBC1HGP3 i fragmentu MBC1HGP2-MBC1HGP4 i każdy fragment jest ponownie przyłączony przez swoją sekwencję komplementarną w celu escytetcenwania pełnej długości DNA regionu V humanizowanego łańcucha H.

Region C łańcucha H ludzkiego przeciwciała może być każdym regionem C ludzkiego łańcucha H, na przykład Cyl, Cy2, Cy3 albo Cy4.

DNA regionu V łańcucha H humanizowanego przeciwciała zbudowanego jak opisano powyżej można poddać ligacji z DNA każdego regionu C łańcucha H ludzkiego przeciwciała, na przykład z regionem Cyl ludzkiego łańcucha H. Jak wspominano w sekcji „Produkcja łańcucha H pizeciwciała chimerycznego” DNA regionu V łańcucha H można traktować odpowiednim enzymem restrykcyjnym i poddawać ligacj z DNA kodującym region C ludzkiego łańcucha H pod kontrolą regionu kontrolującego ekspresję takiego jak układ wzmahmace/promotor w celu wytworzenia wektora ekspresyjnego eawierająhegn DNA regionu V humanizowanego łańcucha H i regionu C ludzkiego łańcucha H.

(in) Konstrukcja DNA i wektora ekspresyjnego kodującego region V humanizowanego łańcucha I,

W niniejszym wynalazku, całą sekwencję zasad DNA kodującego region V łańcucha L ludzkiego przeciwciała, którą użyto aakn matrycę dla przeciwciała humaoiznwaoegn można escatetcenwać w scytetyzeree DNA i skonstruować metodą PCR, mimo ze DNA regionu V łańcucha L jest niedostępne tak jak w przypadku DNA kodującego region V łańcucha H.

W celu skonstruowania DNA regionu V humanizowanego łańcucha L używając JaOn matrycy ludzkiego przeciwciała SU03868 wykazującego największą hnmnlnglę z regionem V łańcucha L mysiego przeciwciała mnnnOlnyalyegn przeciwko PTHrP, wykorzystano cztery startery, takie jak na przykład pokazano w Id Sekw. op 29-32. Startery MBC1LGP1 (Id. Sekw. nr 29) i MBC1LGP3 (Id Sekw. nr 30) mają sekwencje DNA sensowne, aMBClLGP2 (Id Sekw. nr 31) i MBC1LGP4 (Id. Sekw. no 32) mają sekwencje DNA Antcsensnwye. Zostały zaprojektowane tak aby posiadały 15 do 21 bp sekwencji komplementarnej na każdym z ich l<nń oAmr

Startery zewnętrzne MBC1LVS1 (Id. Sekw. no 33) i MBC1LVR1 (Id. Sekw. no 34) mają sekwencje homologiczne odpowiednio z MBC1LGP1 i MBC1LGP4 i każdy posiada sekwencję rozpoznawaną przez odpowiednie enzymy restrykcyjne. Metodą PCR połączono cztery startery do escntetcznwayia cDNA pełnej długości i dodano startery zewnętrzne w celu ampllflOacji cDNA „Połączenie metodą PCR” obejmuje tutaj przyłączanie MBC1LGP1 i MB-C1LGP3 albo MBC1LGP2 i MBC1LGP4 przez ich sekwencje komplementarne

190 351 w celu zsyntetyzowania fragmentu MBC1HLP1-MBC1HLP3 i fragmentu MBC1LGP2MBC1LGP4 i każdy fragment jest ponownie przyłączony przez swoją sekwencję komplementarną w celu zsyntetyzowania pełnej długości DNA regionu V humanizowanego łańcucha H

Region C łańcucha L ludzkiego przeciwciała może być każdym regionem C ludzkiego łańcucha L, na przykład CA, albo Ck.

DNA regionu V łańcucha L humanizowanego przeciwciała zbudowanego jak opisano powyżej można poddać ligacji z DNA każdego regionu C łańcucha L ludzkiego przeciwciała, na przykład z regionem CA ludzkiego łańcucha L. DNA regionu V łańcucha L można traktować odpowiednim enzymem restrykcyjnym i poddawać ligacji z DNA kodującym region C ludzkiego łańcucha LA, pod kontrolą regionu kontrolującego ekspresję takiego jak układ wzmacniacz/promotor w celu wytworzenia wektora ekspresyjnego zawierającego DNA regionu V humanizowanego łańcucha L i regionu C ludzkiego łańcucha LA.

Nawet, jeśli polipeptyd zawierający region V humanizowanego przeciwciała można wytworzyć tak jak to powyżej opisano, nie jest w sposób oczywisty jasne czy ten polipeptyd będzie wykazywał, czy tez nie będzie wykazywał aktywności jako przeciwciało, takiej jak wiązanie lub aktywność neutralizująca skierowana przeciwko swojemu antygenowi. Szczególnie w przypadku łańcucha L, ponieważ region V łańcucha L mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP pochodzi z bardzo rzadkiego genu V λχ, może być konieczne sprawdzenie występowania aktywności lub jej braku przez połączenie z humanizowanym łańcuchem H i wyrażenie go w komórce zwierzęcej takiej jak COS-7.

Skutecznie potwierdzającym sposobem wyjaśnienia, które FR w regionie V humanizowanego przeciwciała może odpowiadać za wiązanie i aktywność neutralizującą humanizowanego przeciwciała może być skonstruowanie hybrydowego regionu V (Othomo T. i in., Molecular Immunology, 32, 407-416, 1995) i potwierdzenie skuteczności. W celu wyjaśnienia, który aminokwas regionu V łańcucha L humanizowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku powinien zostać zmutowany celem uzyskania jednego regionu wykazującego aktywność, konstruowany jest DNA, w którym fragment regionu FR humanizowanego przeciwciała poddaje się rekombinacji z fragmentem regionu FR pochodzącego od myszy i każdy region ocenia się pod kątem humanizacji.

Jak pokazano na fig. 3, przeciwciało posiadające polipeptyd zawierający rekombinowany region V, w którym FR1 i FR2 pochodzą z przeciwciała ludzkiego, a FR3 i FR4 pochodzą z przeciwciała mysiego (takie przeciwciało posiadające rekombinowany fragment określa się jako „przeciwciało hybrydowe”), wytwarza się przeciwciało hybrydowe, w którym jedynie FR1 pochodzi od człowieka i przeciwciało hybrydowe, w którym jedynie FR2 pochodzi od człowieka. Każdy z DNA kodujących te przeciwciała hybrydowe wprowadza się do wektora hybrydowego i przeciwciała hybrydowe są czasowo wyrażane w celu sprawdzenia występowania aktywności przeciwciała

Wykorzystując ten sposób wynalazcy zbadali polipeptydy zawierające regiony V łańcucha L odpowiedzialne za wiązanie antygenu i działania neutralizujące i w końcu stwierdzili, ze należy zastąpić konkretne aminokwasy w FR2 i FR3.

Tak więc, w niniejszym wynalazku wytworzony został polipeptyd obejmujący region V, w którym taki(e) aminokwas(y) jest/są zmutowane (np. wymienione).

Po pierwsze, wyżej wspomnianą metodą wszczepiania CDR przygotowano polipeptyd obejmujący region V posiadający sekwencję aminokwasową jako podstawę, do której wprowadza się mutację(e) aminokwasu(ów). Ten podstawowy polipeptyd obejmuje sekwencje aminokwasowąjak pokazano w Id. Sekw. nr 47 i jest określany jako wersja a (w tabeli 1).

‘łastępnie, wytwarza się z wersji a jako podstawy różne warianty fragmentów, w których zmutowano jeden lub więcej aminokwasów FR.

Wprowadzenie mutacji można przeprowadzić przez zaprojektowanie startera oligonukleotydowego (starter mutagenny) kodującego aminokwas stanowiący pożądaną mutację i przeprowadzenie PCR z wykorzystaniem tego startera.

Tak więc, wytwarza się polipeptydy zawierające regiony V (wersje b do t), w których swoisty(e) aminokwas(y) w FR2 i FR3 jest/są zmutowany(e) (b do t w tabeli 1)

190 351

Table 1

MBC IL PEP	FRl 1 2 3 123456789012345678901234567890 EYOLYESGGDLYKPGGSLKLSCAASGFTFS	CDF 12345 SYGMS
S31679	* ***** QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS	SYAMH
hMBCl-H. pep		SYGMS

MBC Η. PEP

S31679 hMBCl-H. pep

FR2

67890123456789 WIRQTPDKRLEWVA * ♦ ♦ Ψ

WVRQAPGKGLEWVA

CDR2

6

012A3456789012345

TISSGGSYTYYPDSYKG

YISYDGSNKYYADSYKG

TISSGGSYTYYPDSYKG

FR3	CDR3	FR4
	7 8 9	10	11
	67890123456789012ABC345678901234	567890Λ12	34567890123
MBC H. PEP	RFTISRDNAKNTLYLOMSSLKSEDTAMFYCAR	OTTMTYFAY	WGOGTLYTYSA
	* *****		*
S31679	RFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAYYYCAR	ESRGDY	WGQGTLVTVSS
hMBCl-H. pep		OTTMTYFAY

FRl	CDRl	FR2	CDR2
	1 2	3	4	8
	12345678901234567890123	4667A8901234	867800123468789	01234ABCDS6
MBC L. PEP	QLVLTQSSS-ASFSLCASAKLTC	TLSSOHSTYTIE	YYOOOPLKPPKYYMD	LKOOGSHSTCD
	* ♦ ♦		* *****
HSU03868 hMBCl-L. pep a	QLVLTQSPS-ASASLGASVKLTC	TLSSGHSSYAIA TLSSOHSTYTIE	WHOOOPEKGPRYLMK	LNSOGSHSKGD LKODGSHSTGD

b - - -p-d d

e f

h i

j k

tn n

o

P q

-Y- -Y- -Y-K—— -Y-K-D -Y-K-V— -Y-K-Y-0 -Y-D -Y-V— -Y-Y-D -Y-κ- -Y-K—D -γ-_D -Y-K-Y-D -Y-Y-D 190 351 c d tabeli 1

	FR3	CDR3	FR4
	6 7 8	9	10 11
	78901234567890123456789012345678	9012345ABCD67	890123456A7890
UBC L PEP	GIPDRFSGSSSGADRYLSISNIOPEDEAMYIC 4 4 44 4 4 4	GVGBTIKEQPVYV	FGGGTKVTVLGQP
HSU03868 hMBCl-L pep	GIPDRFSGSSSGAERYLTISSLOSEDEADYYC	OTtGTGI GVGOT1KEQPVYV	-L-

a b

c d

a f

g h

i j

k α

n o

P q

r s

t

-j_

-1_ p-1_

IIIIII-L-L-L-L-_L-L-L-_L-L-L-L-L-_L-L-L-L-L-L-L-LDNA kodujący każdą z wersji regionu V łańcucha L humanizowanego przeciwciała skonstruowanego jak powyżej może zostać paddany ligacji z DNA któregokolwiek z regionów C łańcucha L ludzkiego przeciwciała, takigo jak region CA. ludzkiego łańcucha L Tak więc, jest on traktowany odpowiednim enzymem restrykcyjnym i poddawany ligacji z DNA kodującym region C ludzkiego łańcucha LA, pod kontrolą regionu kontrolującego ekspresję, takiego jak układ wzmacniacz/promotor w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego obejmującego DNA kodujący każdą z wersji regionu V humanizowanego przeciwciała i DNA kodujący region C ludzkiego łańcucha LA.

Do pojedynczego wektora ekspresyjnego można wprowadzić DNA kodujący region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała i region C ludzkiego łańcucha H, jak to wcześniej skonstruowano i DNA kodujący region V humanizowanego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L jak to ujawniono w W094/11523, wektory te mogą zostać wykorzystane do transformacji komórek gospodarza i aby produkować pożądane przeciwciało humanizowane można hodować transformowane komórki gospodarza in vivo i in vitro.

4. Produkcja przeciwciał chimerycznych i przeciwciał humanizowanych

Aby wytworzyć przeciwciała chimeryczne i humanizowane należy przygotować dwa wyżej wspomniane wektory ekspresyjne. Tak więc, w odniesieniu do przeciwciała chimerycznego konstruuje się wektor ekspresyjny zawierający DNA kodujący region V mysiego łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H pod kontrolą regionu kontrolującego ekspresję, takiego jak układ wzmacniacz/promotor i wektor ekspresyjny obejmujący DNA kodujący region V mysiego łańcucha L i region C luuddego łańcucha L pod kontrolą regionu kunlrolującego ekspresję, takiego jak układ wzmacniacz/promotor. W odniesieniu do przeciwciała humanizowanego konstruuje się wektor ekspresyjny zawierający DNA kodujący region V humanizowanego łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H pod kontrolą regionu kontrolującego ekspresję, takiego jak układ wzmacniacz/promotor i wektor ekspresyjny obejmujący DNA kodujący region V humanizowanego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L pod kontrolą regionu kontrolującego ekspresję, takiego jak układ wzmacniacz/promotor.

190 351

Następnie, komórki gospodarza takie jak komórki ssaka są ko-transformowane z tymi wektorami ekspresyjnymi i powstałe komórki transformowane są hodowane w celu produkcji chimerycznych albo humanizowanych przeciwciał in vitro i in vivo (patrz, na przykład W091/16928)

Alternatywnie, DNA kodujący regiony V i C łańcucha H i DNA kodujący regiony V i C łańcucha L można poddać ligacji z pojedynczym wektorem i transformować do odpowiednich komórek gospodarza w celu produkcji przeciwciał. Tak więc, w ekspresji przeciwciała chimerycznego do pojedynczego wektora ekspresyjnego takiego jak ujawniono np. w WO94/11523 wprowadza się DNA kodujący mysią sekwencję liderową obecną w sklonowanym cDNA, region V mysiego łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H, jak również DNA kodujący mysią sekwencję liderową, region V mysiego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L. W ekspresji przeciwciała humanizowanego do pojedynczego wektora ekspresyjnego takiego jak ujawniono np. w WO94/11523 wprowadza się DNA kodujący region V humanizowanego łańcucha H i region C ludzkiego łańcucha H i DNA kodujący region V humanizowanego łańcucha L i region C ludzkiego łańcucha L. Taki wektor wykorzystuje się do transformowania komórek gospodarza i komórki transformowane są hodowane w celu produkcji, będących przedmiotem zainteresowania chimerycznych albo humanizowanych przeciwciał in vitro i in vivo.

Chimeryczne albo humanizowane przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania, produkowane przez hodowlę transformantów transformowanych DNA kodującym wymienione chimeryczne albo humanizowane przeciwciała, można izolować ze środowiska zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego i oczyszczać w celu uzyskania jednorodności

Izolację i oczyszczanie chimerycznych i humanizowanych przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania według niniejszego wynalazku można przeprowadzić wykorzystując kolumnę agarozy z białkiem A, lecz również można przeprowadzić każdym sposobem stosowanym w izolacji i oczyszczaniu typowych białek a zatem nie są one ograniczone. Na przykład, różnorodne metody chromatograficzne, ultrawirowanie, odsalania i dializę można ewentualnie wybrać albo połączyć w celu izolacji i oczyszczania chimerycznych albo humanizowanych przeciwciał.

Można zastosować każdy układ ekspresyjny w celu wyprodukowania przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych przeciwko ludzkiemu PTHrP według niniejszego wynalazku Na przykład, komórki eukariotyczne obejmujące komórki zwierzęce takie jak ustalone linie komórkowe ssaków, komórki grzybów i pleśni, komórki drożdży, komórki prokariotyczne obejmujące komórki bakteryjne takie jak komórki Escherichia coli. Korzystnie, przeciwciało chimeryczne albo humanizowane według niniejszego wynalazku jest wyrażane w komórkach ssaków takich jak komórki COS i CHO.

Można wykorzystać każdy typowy promotor przydatny do ekspresji w komórkach ssaczych. Na przykład, korzystne jest zastosowanie bezpośredniego wczesnego promotora ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV) Przykłady wektorów ekspresyjnych zawierające promotor HCMV obejmują HCMV-VH-HCyl i HCMV-VL-HCK pochodzące zpSV2neo (WO92/19759).

Dodatkowo, w niniejszym wynalazku można zastosować promotory do ekspresji genu w komórkach gospodarza obejmujące promotory wirusowe, takie jak promotor retrowirusa, wirusa guza mieszanego ślinianek myszy, adenowirusa i wirusa małpiego (SV) 40 i promotory pochodzące z komórek ssaczych, takie jak promotor ludzki czynnik-1 α wydłużania łańcucha polipeptydowego (HEF-1a). Na przykład, promotor SV40 można prosto zastosować według metody Mulhgan'a i in. (Nature, 277, 108, 1979); metodę Mizushimy S. i in. (Nusleid Acids research, 18, 5322, 1990) łatwo zastosować z promotorem HEF-kx.

Przydatny tutaj początek replikacji obejmuje te pochodzące z SV40, wirusa guza mieszanego ślinianek myszy, adenowirusa albo bydlęcego wirusa brodawek (BPV). Następnie, wektor ekspresyjny może obejmować gen dla fosfotransferazy APH (3') II albo I (neo), kinazy tymidynowej (TK), fosforybozylotransferazy ksantyno-guaninowej E. coli (Ecogpt) albo reduktazy soli kwasu dihydrofohowego (DHFR) jako wybiórczego markera wzrastającej liczby kopii genu w układzie komórki gospodarza.

190 351

5. Ocenianie wiązania antygenu i aktywności neutralizującej chimerycznych i humanizowanych przeciwciał (1) Oznaczanie stężenia przeciwciała

Stężenie otrzymanego oczyszczonego przeciwciała można przeprowadzić metodą ELISA.

Płytki ELISA do określania stężenia przeciwciała przygotowuje się w następujący sposób: 100 μί koziego przeciwciała IgG przygotowanego w stężeniu np. 1 pg/ml unieruchamia się w każdej studzience 96-studzienkowej płytki ELISA (np. Maxisorp, NUNC). Po zablokowaniu 200 μί rozcieńczonym buforem (na przykład 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween20, 0,02% NaN3, 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA), pH 7,2) do każdej studzienki dodawano stopniowo rozcieńczanego supematantu komórek COS-7 albo CHO, w których ekspresjonowano chimeryczne, hybrydowe albo humanizowane przeciwciało, albo dodawano oczyszczone chimeryczne, hybrydowe lub humanizowane przeciwciało, dodawano 100 μί skonjugowanego z fosfatazą alkaliczną koziego przeciwciała przeciwko ludziom i następnie dodawano 1 mg/ml roztworu substratu (Sigma 104, kwas p-mtrofenylofosforowy, SIGMA), po czym mierzono absorbancję przy 405 nm czytnikiem mikropłytek (Bio Rad). Oczyszczone Hu IgGIZ, (The Binding Site) można wykorzystać jako standard do określenia stężeń.

(2) Oznaczanie zdolności wiązania antygenu

Płytki ELISA do oznaczania zdolności wiązania antygenu przygotowuje się w następujący sposób: 100 μί ludzkiego PTHrP przygotowanego w stężeniu 1 pg/ml unieruchamia się w każdej studzience 96-studzienkowej płytki ELISA. Po zablokowaniu 200 μί rozcieńczonym buforem do każdej studzienki dodawano stopniowo rozcieńczanego supematantu komórek COS-7 albo CHO, w których ekspresjonowano chimeryczne, hybrydowe albo humanizowane przeciwciało, albo dodawano oczyszczone chimeryczne, hydrybowe lub humanizowane przeciwciało, dodawano 100 μί skonjugowanego z fosfatazą alkaliczną koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG i następnie dodawano 1 mg/ml roztworu substratu (Sigma 104, kwas p-mtrofenylofosforowy, SIGMA), po czym mierzono absorbancję przy 405 nm czytnikiem mikropłytek (Bio Rad).

(3) Oznaczanie aktywności neutralizującej

Oznaczanie aktywności neutralizującej mysich, chimerycznych i humanizowanych przeciwciał można przeprowadzić np. wykorzystując komórki linii komórkowej ROŚ 17/2,8-5 szczurzego mięsaka kości (Sato K. i in., Acta Endocrinology, 116, 113-120, 1987). Komórki ROSI7/2,8-5 stymuluje się 4 mM hydrokortyzonem w celu pobudzenia receptora PTH/PTHrP. Enzym rozkładający cAMP hamuje się 1 mM izobutylo-1-metylo ksantyną (ΙΒΜΧ, SIMGA). Mysie, chimeryczne albo humanizowane przeciwciało, którego aktywność neutralizująca jest oznaczana miesza się z taką samą ilością PTHrP( 1-34) i powstała mieszanina każdego przeciwciała i PTHrP(l-34) jest dodawana do każdej studzienki. Zdolność neutralizującą mysiego, chimerycznego albo humanizowanego przeciwciała można określić mierząc ilość wyprodukowanego przez komórki linii komórkowej ROSI7/2,8-5 szczurzego mięsaka kości cAMP w odpowiedzi na stymulację PTHrP.

(4) Analiza kinetyczna oddziaływań pomiędzy PTHrP i przeciwciałem przeciwko PTHrP

W niniejszym wynalazku, kinetyki oddziaływań pomiędzy PTHrP i przeciwciałem przeciwko PTHrP można analizować wykorzystując różnorodne środki i procedury Konkretnie stosując analizą Scatcharda i czujnik powierzchniowego rezozonansu plazmowego zwany BLACÓRE (wynaleziony i wprowadzony na rynek przez Pharmacia Biotech) mierzy się stałe dysocjacji, współczynniki stałych dysocjacji i współczynniki stałych asocjacji. Analiza z wykorzystaniem czujnika powierzchniowego rezozonansu plazmowego zwanego BLACORE zostanie opisana poniżej jako jeden z przykładów.

rodsrawowa struktura BIACORE obejmuje źródło światła, pryzmat, czujnik i mikropasaz Praktycznie, ligand jest unieruchamiany w końcówce czujnika typu kasetowego, do którego wstrzykiwana jest badana substancja. Gdy występuje pomiędzy nimi jakiekolwiek powinowactwo, związana ilość jest mierzona metodą optyczną.

Zasadą wykrywania jest zjawisko zwane powierzchniowym rezozonansem plazmowym Błysk światła wprowadza się w przestrzeń pomiędzy szkłem a błoną metalową tak, aby pojawiło się całe jego odbicie, wykorzystuje się błysk światła pod pewnym kątem w celu

190 351 wzbudzenia plazmonu powierzniowego i słumienia. Kąt różni się zależnie od zmian stężenia roztworu w Kontakcie z błoną metalową (czujnikiem). BIACORE bada te zmiany.

W aparacie BIACORE zmiany te są zwane sygnałem rezonansowym (sygnał SPR) t zmiana 0,1 stopnia to 1000 RU (jednostek rezonansowych). 1000 RU odpowiada zmianie wiązania około 1 ng białka na cienkim, złotym czujniku o powierzchni 1 mm². Dla białka zmiana 50 RU (50 pg) może być w pełni zmierzona.

Zmierzone sygnały przenosi na krzywą wiązania zwaną sensorogramem komputer dołączony do BIACORE, która jest rysowana na ekranie komputera w czasie rzeczywistym: Natsume T. i in., (1995) Expenmental medicine, 13, 563-569; Karlsson R. i in., (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240.

6. Kompozycja farmafautyczna ΐ zzy nnik zmniejszający Ιήρο^Ι^ικίς zzwi eriyący przeciwciało przeciwko PTHrP albo przeciwciało humanizowane jaKo składnik czynny

Efekt leczniczy humanizowanego przeciwciała na PTHrP można potwierdzić podając przeciwciało przeciwko PTHrP albo przeciwciało humanizowane zwierzęciu z objawami hi^^^ζώ i mierząc wskaźnik hlpyrkylcymii. U zwierząt z objawami i pacjentów cierpiących na hiperkαlcymię często obserwuje się hipofosfytymię, przeciwciała według zlzlejszygo wynalazku można również zastosować do zmniejszenia objawów hipoCosCatymil.

Przeciwciało stosowane w niniejszym wynalazku jest przeciwciałem przeciwko PTHrP w tym ludziom, chimerycznym i albo przeciwciałem humanizowanym przeciwko PTHrP o stałej dysocjacji, stałym współczynniku dysocjacji i stałym współczynniku asocjacji. Przeciwciało będzie neutralizować aktywność PTHrP przez wiązanie się z PTHrP i korzystnie obejmuje humanizowane przeciwciało #23-57-137-1. Sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 zostanie opisany w przykładzie 1 do 3.

Przeciwciało stosowane w zizlejszym wynalazku można oczyścić do stanu wysokiej czystości każdą kombinacją typowych sposobów oczyszczania takich jak odsalanie, filtracja żelowa wykorzystująca HPLC itd., chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem Kolumny z białkiem A itd Rozpoznanie PTHrP przez te oczyszczone przeciwciała można z dużą dokładnością potwierdzić którymkolwiek z typowych testów immunologicznych takich jak test radioimmunologiczny (RIA), test immunoenzymatyczny (ELA, ELISA) albo badaniem immuzoCluoryycyzcyJ nym.

Zwierzęta z objawami hipyrkalcemii, które można wykorzystać obejmują model zwierzęcy przygotowany w taki sposób, ze komórki nowotworowe produkujące PTHrP wszczepiono zwierzęciu doświadczalnemu z osłabioną lub zniesioną obroną immunologiczną. Trαnsplaztoąαzy komórki nowotworowe korzystnie pochodzące od człowieka obejmują, na przykład komórki ludzkiego raka trzustki PAN-7. Zwierzę z osłabioną lub zniesioną obroną immunologiczną, któremu wszczepia się komórki nowotworowe obejmuje myszy nagie albo myszy SCID. Zmziejszyniy hiperKalcemii można ocenić obserwując stężenie wapnia we krwi, zmniejszenie masy ciała albo zmniejszenie aktywności ruchowej w jednostce czasu i określenie stopnia poprawy.

Kompozycja farmaceutyczna i czynnik zmniejszający hipyrkalcymię zawierają jako składnik czyimy według wynalazku przeciwciało albo humanizowane przeciwciało przeciwko PTHrP i zogą być podawane pozajelitowo ogólnoustrojowo albo miejscowo. Można wybrać na przykład, wstrzyKnięcie dożylne obejmujące wlew dożylny, wstrzyknięcie domięśniowe, wstrzyknięcie dootrzewnowe albo wstrzyknięcie podskórne. Sposób podawania można prawidłowo wybrać, uzależniając go od wieku pacjenta i nasilenia choroby. Skuteczną pojedynczą dawkę irybr ilzracn f) A1 rlo 1 ΟΠΠ mrr no ριλτόπι mol·

AIVlVk)U* WW X WV X \J W *XV* ikg) VI yŁAłl U V/X«Xli

LU V/X«xlcx. L nivi rum, c naty νίΠΑν

Ką dla rycJyzty zoże być od 5 do 10000 zg/organizm, korzystnie od 50 do 1000 zg/organizz.

Kompozycja farmaceutyczna i czynnik zmniejszający hipyrKalcemię zawierające przeciwciało albo przeciwciało humanizowane przeciwko PTHrP jako składnik czynny zogą dalej zawierać farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i/lub dodatki zylyżzy od drogi podawania Przykłady takich nośników i dodatków mogą obejmować wodę, farmaceutycznie dopuszczalne

190 351 rozpuszczalniki organiczne, kolagen, polialkohol winylowy, poliwinylopirolidon, polimer karboksywinylowy, sól sodową karboksymetylocelulozy, poli (sól sodową akrylanu), sól sodową argimanu, dekstran rozpuszczalny w wodzie, sól sodową karboksymetyloskrobii, pektynę, metylocelulozę, etylocelulozę, gumę ksantanową, gumę arabską, kazeinę, żelatynę, agar, diglicerynę, glicerynę, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, wazelinę, parafinę, alkohol stearylowy, kwas stearynowy, albuminę ludzkiej surowicy (HSA), manntol, sorbitol, laktozę i czynnki powierzchniowo czynne dopuszczalne jako dodatki farmaceutyczne. Stosowane dodatki można odpowiednio wybrać z powyższych zarówno pojedynczo, jak i w kombinacji i me są one do nich ograniczone.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku można szeroko stosować w hiperkalcemii związanej z różnymi nowotworami (nowotworami złośliwymi). Nowotwory te nie są szczególnie ograniczone i obejmują nie tylko pojedyncze nowotwory, lecz również kombinacje i kumulacje nowotworów. Nowotwory mogą na przykład obejmować nowotwory trzustki, płuc, gardła, krtani, języka, dziąseł, przełyku, żołądka, dróg żółciowych, sutka, nerek, pęcherza moczowego, macicy i prostaty i chłoniaka złośliwego.

Krótki opis rysunków

Figura 1 stanowi schemat pokazujący przeciwciało według wynalazku;

Figura 2 stanowi schemat „przeszczepiania” CDR;

Figura 3 stanowi ilustrację określania FR i CDR regionu V;

Figura 4 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała,

Figura 5 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała,

Figura 6 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała,

Figura 7 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała;

Figura 8 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała;

Figura 9 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała,

Figura 10 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała;

Figura 11 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności wiązania antygenu przez przeciwciała,

Figura 12 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności neutralizacji przez przeciwciała humanizowane;

Figura 13 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności neutralizacji przez przeciwciała humanizowane;

Figura 14 jest wykresem pokazującym wyniki pomiaru aktywności neutralizacji przez przeciwciała humanizowane;

Figura 15 jest wykresem pokazującym skuteczność przeciwciał według wynalazku w modelu zwierząt hiperkalcemicznych;

Figura 16 jest wykresem pokazującym skuteczność przeciwciał według wynalazku w modelu zwierząt hiperkalcemicznych;

Figura 17 jest wykresem pokazującym skuteczność przeciwciał według wynalazku w modelu zwierząt hiperkalcemicznych;

Figura 18 jest wykresem pokazującym skuteczność przeciwciał według wynalazku w modelu zwierząt hiperkalcemicznych;

Figura 19 jest wykresem z sensora, pokazującego unieruchamianie PTHrP na końcu sensora,

Figura 20 jest wykresem pokazującym wyniki analizy kinetycznej przeciwciała według wynalazku,

190 351

Figura 21 jest wykresem pokazującym wyniki analizy kinetycznej przeciwciała według wynalazku;

Figura 22 jest wykresem pokazującym wyniki analizy kinetycznej przeciwciała według wynalazku,

Figura 23 jest wykresem pokazującym wyniki analizy kiyetchzyej przeciwciała według wynalazku;

Figura 24 jest wykresem pokazującym wyniki analizy kinetycznej przeciwciała według wynalazku,

Figura 25 jest wykresem pokazującym wyniki badania wpływu przeciwciała humanizowanego według wynalazku na fraOhyjae wydajanie fosforanów;

Figura 26 jest wykresem pokazującym wyniki badania wpływu przeciwciała humayienwanego według wynalazku na stężenie fosforanów w osoczu;

Figura 27 jest fotografią pokazującą widnheye objawy kJinlczye modelu hlperkaJcemll u myszy, wywołanej podaniem przeciwciała przeciwko PTHrP według wynalazku (morfologia żywego zwierzęcia);

Figura 28 jest fotografią pokazującą wianczye objawy kharceae modelu hipeokalcemii u myszy, wywołanej podaniem przeciwciała przeciwko PTHrP według wynalazku (morfologia żywego zwierzęcia);

Figura 29 jest wykresem pokazującym zmianę w czasie spontanicznej aktywności zwierzęcia z modelową hlperkaJcemlą po podaniu przeciwciała przeciwko PTHrP według wynalazku w porównamu ze zwierzęciem kontrolnym, któremu podano sól fizjologiczną;

Figura 30 jest wykresem pokazującym zmianę w czasie temperatury ciała zwierzęcia z modelową 1ι^ιΌ3ΐοοιοίί) po podaniu przeciwciała przeciwko PTHrP według wynalazku w porównamu ze zwierzęciem kontrolnym, któremu podano sól fizjologiczną; i

Figura 31 jest wykresem pokazującym zmianę w czasie pH kowi zwierzęcia z modelową hicerkalhemlą po podaniu przeciwciała przeciwko PTHrP według wynalazku w porównaniu ze zwierzęciem kontrolnym, któremu podano sól fieanJngrheaą.

Pozy kład

Poniżej wynalazek ncisayc zostanie bardziej szczegółowo w odniesieniu do ponizszych przykładów, które nie mają w zamierzeniach ngraarhZAĆ zakresu wynalazku.

Przykład namesieyia 1

Tworzenie hybrydoma wytwarzającej mysie crzehiwciałn οόμ^οαΙ^ przeciwko PTHrP (1-34)

Hybrydoma zdolne do wytwarzania przeciwciała mnnnklnyalnegn przeciwko ludzkiemu PTHrH (1-34), #23-57-154 i #23-57-137-1, wytworzono zgodnie ze sposobem opisanym przez Kanji Sato (Sato i in., J. Bone Miner. Res. 8:849-860, 1993).

Jako lmmuyngen zastosowano PTHrP (1-34) (Peniysula), z którym sprzęgnięto tyoenglnbuhnę jako białko nośnikowe przy użyciu karbodiimidu (Ι^ϊοο). PTHrP (1-34) sprzęgnięty z tcpenglobuliyą aiaJiznwayn w celu otrzymania roztworu o zawartości białka równej 2 |χ_^/γο1 Powstały roztwór zmieszano z adiuwantem Freund^ (ϋβ^) w stosunku 1 · 1 otrzymując emulsję. W celu immunlenwayla myszy, emulsję wstrzyknięto 16 samicom myszy BALB/c podskórnie w grzbiet i dootrzewnowo w ilości równej 100 ag/IyCse. Wstrzyknięcie powtórzono 11 razy. W odniesieniu do aaiuwaytu, kompletny adiuwant Freundd zastosowano do pierwszej ^οιτο^^ι, zaś do knleaachh lmmuyleacal stosowano niekompletny adruwaat Freund^.

U każdej z lmmumznwaycch myszy badano miano przeciwciał w surowicy w następujący sposóbOd każdej z myszy pobierano koew z żyły ogonowej i poddawano wirowaniu w celu otrzymania surowicy Surowicę rozcieńczano buforem RIA, mieszano z PTHpP (1-34) zyakowayym ¹²⁵I i poddano oznaczeniu aktywności wiązania. Myszom, u których stwierdzono zadowalające. wysokie miaan przeciwciał wstrzyknięto dootrzewnowo PTHrP (1-34) bez białka nośnikowego w dawce 50 pg/mysz w celu końcowej rmmuyrzacar.

Trzy dni po końcowej rmmuylzacjr myszy zabito i wycięto ich śledziony. Następnie, scleynhctc poddano fuzji z linią komórkową szpiczaCa P3x63Ag8U.l zgodnie ze znaną

190 351 konwencjonalną metodą, stosując 50% glikol polietylenowy 4000. Wytworzonymi w ten sposób komórkami poddanymi fuzji zaszczepiono 85 studzienek płytki 96-studzienkowej w ilości 2x10 /studzienkę. Badanie przesiewowe hybrydoma przeprowadzono stosując pożywkę HAT w następujący sposób.

Badanie przesiewowe przeprowadzono przez stwierdzenia obecności w nadsączu przeciwciał rozpoznających PTHrP w odniesieniu do studzienek, w których obserwowano wzrost komórek w pożywce HAT metodą RIA na podłożu stałym. Hybrydoma zebrano ze studzienek, w których stwierdzono zdolność wiążącą przeciwciał przeciwko PTHrP Otrzymane w ten sposób hybrydoma zawieszono w pozywee RPMI 1640 zawierającej 15% FCS z dodatkiem OPI (Sigma), a następnie rozrzedzano przez rozcieńczanie graniczne, otrzymując w ten sposób dwa rodzaje klonów hybrydoma, #23-57-154 i #23-57-137-1 wykazujących silną zdolność wiązania PTHrP (1-34).

Klon hybrydoma #23-57-154, który oznaczono „hybrydoma mysio-mysia #23-57-154 zdeponowano na zasadach Traktatu Budapeszteńskiego 15 sierpnia, 1996, w National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japonia (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japonia), pod numerem dostępu FERM BP-5631.

Przykład 1

Klonowanie DNA kodującego region V mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP(1-34)

Klonowanie DNA kodującego region V mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP (1-34) otrzymanego wyżej, #23-57-137-1, przeprowadzono w następujący sposób.

(1) Preparowanie mRNA mRNA wytworzono z hybrydoma #23-57-137-1 stosując Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech) w następujący sposób.

Komórki hybrydoma #23-57-137-1 otrzymane jak wyżej homogenizowano buforem ekstrakcyjnym i ekstrahowano mRNA stosując oligo(dI)-Cellulose Spun Column, według instrukcji producenta zestawu. Roztwór ekstrakcyjny poddano precypitacji etanolem w celu otrzymania precypitatów mRNA. Precypitaty mRNA rozpuszczono w buforze elucyjnym.

(2) Preparatyka i amplifikacja cDNA genu kodującego region V mysiego łańcucha H.

(i) Klonowanie cDNA dla regionu V łańcucha H przeciwciała #23-57-137-1

DNA kodujący region V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP klonowano metodą 5'-RACE (Frohman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85.8998-9002, Belavsky i m., Nucl Acids Res. 17:2919-2932, 1989). Sposób ten przeprowadzono stosując zestaw 5'-Ampli FINDER RACE (Clonetech) według instrukcji producenta W tym sposobie, starterem stosowanym do syntezy cDNA był starter MHC2 (Id. Sekw. nr 1), który można poddać hybrydyzacji z regionem C mysiego łańcucha H. Około 2 pg mRNA jak otrzymany wyżej, który był matrycą zmieszano z 10 pmolami startera MHC2. Powstałą mieszaninę poddano reakcji z odwrotną transkryptazą w 52°C przez 30 minut tworząc cDNA, który był komplementarny z mRNA.

Produkt zmieszano z 6N NaOH w celu hydrolizy mRNA (w 65°C przez 30 minut), a następnie poddano precypitacji etanolem w celu wyizolowania precypitatów cDNA Wyizolowany w ten sposób cDNA poddano ligacji z Ampli FINDER Anchor (Id Sekw. nr 42) na końcu 5', przez poddanie reakcji z ligazą RNA T4 w 37°C przez 6 godzin i dodatkowo w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Jako starterów do amplifikacji cDNA metodą PCR, zastosowano starter kotwiczący (Id. Sekw. nr 2) i starter MHC-G1 (Id. Sekw. nr 3) (Jones i in., Biotechnology 9:88, 1991).

Roztwór PCR 50 ilb zsttocowarnwnt tvrn cnsobhip awunrrał IOimMΛ ^rio_Cl^1 β ,λ mM KCl, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCl₂, 2,5 jednostki TaKaRa Taq (Takara Shuzo), 10 pmoli startera kotwiczącego i 1 pl mieszaniny reakcyjnej cDNA z którym poddano ligacji starter MHC-Gl i starter Ampli FINDER Anchor, który przykryto 50 pl oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli PCR stosując urządzenie Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) i cykl temperaturowy po 45 sekund w 94°C, 45 sekund w 60°C i 2 minuty w 72°C

190 351 (ii) Klonowanie cDNA dla regionu V łańcucha L przeciwciała #23-57-137-1

DNA Kodujący region V łańcucha L mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu PTHrP klonowano metodą 5'RACE (Frohman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85.8998-9002; BelavsKy i in., Nuci. Acids Res. 17:2919-2932, 1989). Sposób ten przeprowadzono stosując zestaw 5'-Ampli FINDER RACE (Clonetech) według instrukcji producenta W tym sposobie, starterem stosowanym do syntezy cDNA był starter oligo-dT, który można poddać hybrydyzacji z regionem C mysiego łańcucha H. OKoło 2 μg mRNA jaK otrzymany wyżej, który był matrycą zmieszano z 10 pmolami startera MHC2. Powstałą mieszaninę poddano reakcji z odwrotną transKryptazą w 52°C przez 30 minut tworząc cDNA, Który był komplementarny z mRNA. Produkt zmieszano z 6N NaOH w celu hydrolizy mRNA (w 65°C przez 30 minut), a następnie poddano precypitacji etanolem w celu wyizolowania precypitatów cDNA. Wyizolowany w ten sposób cDNA poddano ligacji z Ampli FINDER Anchor na końcu 5', przez poddanie reakcji z ligazą RNA T4 w 37°C przez 6 godzin i dodatkowo w temperaturze pokojowej przez 16 godzin.

Jako starterów do amplifikacji cDNA metodą PCR, zastosowano starter MLC (Id. SeKw nr 4) zaprojektowany w oparciu o zakonserwowaną sekwencję regionu C łańcucha λ, mysiego łańcucha L, a następnie syntetyzowany na urządzeniu 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). Roztwór PCR (100 pl) zastosowany w tym sposobie zawierał 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCl₂, 2,5 jednostki AmpliTaq (PerKinElmer), 50 pmoli startera Kotwiczącego i 1 pl mieszaniny reakcyjnej cDNA, z którym poddano ligacji starter MLC (Id. SeKw. nr 4) i starter Ampli FINDER Anchor, który przykryto 50 pl oleju mineralnego. Przeprowadzono 35 cykli PCR stosując urządzenie Thermal Cycler Model 480J (PerKin Elmer) i cykl temperaturowy po 45 sekund w 94°C, 45 sekund w 60°C i 2 minuty w 72°C.

(3) Oczyszczanie i fragmentacja produktu PCR

Każdy z amplifikowanych fragmentów DNA opisanych wyżej rozdzielono stosując elektroforezę na 3% żelu agarozowym NuSieve GTG (FMc Bio. Products). Dla Każdego z regionów V łańcucha H i regionu V łańcucha L, wycięto frakcję żelu zawierającą fragment DNA wielkości, odpowiednio, około 550 bp. Każdą z otrzymanych frakcji żelu poddano oczyszczeniu DNA stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101) według instruKcji producenta. Oczyszczony DNA precypitowano z roztworu etanolem, a następnie rozpuszczano w 20 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCL (pH 7,4) i 1 mM EDTA. 1 pl wytworzonego w ten sposób roztworu DNA trawiono enzymem restrykcyjnym XmaL (New England Biolabs) w 37°C przez godzinę i dodatkowo enzymem EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę. Mieszaninę trawienną poddano eKstraKcji fenolem i chloroformem, a następnie poddano precypitacji etanolem w celu zebrania DNA.

W ten sposób, otrzymano DNA kodujący region V łańcucha H i DNA kodujący region V łańcucha L, z których oba miały sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI na końcu 5' i sekwencję rozpoznawaną przez XmaI na Końcu 3'.

Każdy z fragmentów DNA EcoRI-Xmal zawierający, odpowiednio, DNA kodujący region V łańcucha H i DNA Kodujący region V mysiego łańcucha L poddano reakcji z wektorem pUC19, Który trawiono EcoRI i XmaI w 16°C przez godzinę stosując zestaw do ligacji DNA ver 2 (Takara Shuzo) według instrukcji producenta. Mieszaninę ligacyjną (10 pl) dodano do 100 pl roztworu zawierającego Kompetentne komórki E. coli JM 109 (Nippon Gene). Mieszaninę komórek pozostawiono przez 15 minut na lodzie, w 42°C przez minutę, a następnie przez minutę na lodzie. Komórki zmieszacie z 300 pl pożywki SOC (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, SambrooK i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i inKubowano w 37°C przez 30 minut. Powstałą zawiesinę komórek rozsmarowano na pożywce LB albo 2xYT z agarem (Molecular Cloning: A Laboratory Mirnual, Sambrook i m,, Cod Sprrng Harbor L aboratGiy Press, 1989) z dodatkiem 100 albo 50 pg/ml ampicyliny, 0,1 mM. IPTG i 20 pg/ml X-gal i inKubowano w 37°C przez noc. W ten sposób wytworzono transformanty E. coli.

Transformanty hodowano przez noc w 2 ml pożywki LB albo 2xYT z dodatkiem 100 albo 50 pg/ml ampicyliny w 37°C, a następnie preparowano plazmidowy DNA stosując Plasmid Extracter PI-100@ (Karabou) albo zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Otrzymany w ten sposób plazmidowy DNA poddano weryfikacji pod względem sekwencji DNA.

190 351 (4) Sekwencjonowanie cDNA kodującego region V mysiego przeciwciała

Sekwencja regionu kodującego cDNA niesionego przez plazmid określono przy użyciu urządzenia DNA Sequencer 373A (ABI, Perkin Elmer) stosując Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer) Tę sekwencję DNA określono przez potwierdzenie sekwencji zasad w obu kierunkach stosując startery M13 Primer M4 (Takara Shuzo) (Id Sekw. nr 5) i M13 Primer RV (Takara shuzo) (Id. Sekw. nr 6).

Otrzymane w ten sposób plazmidy, które zawierały cDNA kodujący reglom V mysiego łańcucha H i cDNA kodujący region V mysiego łańcucha L pochodzące z hybrydoma #23-57-137-1 oznaczono, odpowiednio, „MBC1HO4” albo „MBC1L24”.

Sekwencje (obejmujące odpowiednie sekwencje aminokwasowe) DNA kodującego region V łańcucha H i DNA kodującego region V łańcucha L mysiego przeciwciała #23-57-137-1 (odpowiednio niesione przez MBC1HO4 i MBC1H24) pokazano, odpowiednio, na Id. Sekw. nr 57 i 65. Oba polipeptydy dla fragmentu V łańcucha H i fragmentu V łańcucha L przetłumaczono począwszy od 58 zasady (kodującej glutaminę) w sekwencjach DNA pokazanych jako Id Sekw. nr 57 i 65. Sekwencje aminokwasowe dla regionu V łańcucha H i regionu V łańcucha L pokazano, odpowiednio, jako Id. Sekw. nr 46 i 45.

E coli zawierające plazmid MBClHO4 i E. coli zawierające plazmid MBClL24 oznaczono, odpowiednio, jako ,Escherichia coli JM 109 (MBClHO4)” i „Escherichia coli JM 109 (MBClL24)”. Te szczepy E. coli zdeponowano na zasadach Traktatu Budapeszteńskiego 15 sierpnia, 1996, w National Institute of Bioscience and Human-technology, Agency for Industrial Science and Technology, Japonia (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japonia), pod numerem dostępu, odpowiednio, FERM BP-5628 dla Escherichia coli JM109 (MBClHO4) i FERM BP-5627 dla Escherichia coli JM109 (MBC1L24) (5) Określanie CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego #23-57-137-1 przeciwko ludzkiemu PTHrP.

Ogólne wzory regionu V łańcucha H oraz regionu V łańcucha L są do siebie podobne Oznacza to, ze obie struktury mają cztery regiony zrębowe połączone trzema regionami hiper-zmiennymi (tj. regionami zapewniającymi komplementamość (CDR)). Sekwencje aminokwasowe regionów zrębowych są względnie zakonserwowane, podczas gdy sekwencje aminokwasowe regionów CDR wykazują niezwykle silną mutagenność (Kabat i in., Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1983).

Na podstawie powyższych faktów, CDR określono przez poszukiwanie homologii sekwencji aminokwasowych regionu V mysiego przeciwciała monoklonalnego przez odniesienie do bazy danych sekwencji aminokwasowych przeciwciał, ustanowionej przez Kabat'a i in.

Sekwencje aminokwasowe CDR 1-3 w regionie V łańcucha L pokazano, odpowiednio, w Id. Sekw. nr 59-61, zaś sekwencje aminokwasowe CDR 1-3 regionu V łańcucha H pokazano, odpowiednio, w Id. Sekw. nr 62-64

Tabela 2

Region V	Id Sekw. nr	CDR1	CDR2	CDR3
Region V łańcucha H	57	31-35	50-66	99-107
Region V łańcucha L	65	23-34	50-60	93-105

Przykład 2

Konstruowanie przeciwciała chimerycznego (1) Konstruowanie łańcucha H przeciwciała chimerycznego (i) Konstruowanie regponu V łańcucha H

Klonowany cDNA kodujący region V mysiego łańcucha H zmodyfikowano metodą PCR w celu połączenia go z wektorem ekspresyjnym niosącym genomowy DNA dla regionu Cy l ludzkiego łańcucha H. Starter stosowany „poniżej”, MBC1-S1 (Id. Sekw·'. nr 7) zaprojektowano

190 351 w taki sposób, ze mógł on hybrydyzować z DNA kodującym region końca 5' sekwencji Udarowej regionu V i posiadał obie sekwencje zgodności Kozak'a (Kozak i in., J. Mol. Biol 196'947-950, 1987) i sekwencje hiper-zmienne HindIII. Starter „powyżej”, MBC1-a (Id. Sekw nr 8) zaprojektowano w taki sposób, żeby hybrydyzował z DNA kodującym region 3' regionu J i miał obie sekwencje donorowe składania i sekwencję rozpoznawaną przez BamHI Reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq i dołączony bufor. Roztwór PCR (50 ul) obejmował 0,07 ug plazmidu MBClHO4 jako matrycę DNA, 50 pmoli MBC1-a i 50 pmoli MBC1-S1, jako startery, 2,5 jednostki TaKaRa Ex Taq i 0,25 um dNTP w buforze, który pokryto 50 ul oleju mineralnego. Przeprowadzono 35 cykli PCR stosując urządzenie Thermal Cycler Model 480J (Perkin Elmer) i cykl temperaturowy po 1 minucie w 94°C, minucie w 55°C i 2 minuty w 72°C. Każdy z amplifikowanych fragmentów DNA otrzymanych rozdzielono stosując elektroforezę na 3% żelu agarozowym NuSieve GTG (FMC Bio Products).

Następnie, fragment żelu agarozowego zawierającego fragment DNA wielkości 437 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta Oczyszczony DNA zebrano przez precypitację etanolem i rozpuszczono w 20 ul roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mol EDTA. 1pl powstałego roztworu DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i HindIII (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę. Mieszaninę trawienną ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie precypitowano etanolem w celu zebrania DNA.

Otrzymany fragment DNA HindIII-BamHI, który zawierał DNA kodujący region V mysiego łańcucha H klonowano do wektora pUC19, który trawiono HindIII i BamHI. Powstały plazmid sekwencjonowano na urządzeniu DNA Sequencer 373A (Perkin Elmer) z użyciem startera M13 Pnmer M4 i M13 Primer RV oraz zestawu Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer). Plazmid zawierający DNA o prawidłowej sekwencji zasad kodujących region V mysiego łańcucha H pochodzącego z hybrydoma #23-57-137-1 i posiadający sekwencję rozpoznawaną przez HindIII i sekwencję Kozak'a w regionie 5' i sekwencję rozpoznawaną przez BamHI na końcu 3', oznaczono „MBC1H/pUC19”.

(ii) KonstKionv^^^i^ie regionu V łańcucaa H stosowanego do wytwarzania mysi oludzkiego chimerycznego łańcucha H typu c DNA

DNA kodujący region V mysiego łańcucha H skonstruowanego w opisany wyżej sposób zmodyfikowano metodą PCR w celu połączenia go z cDNA regionu Cy1 ludzkiego łańcucha H Starter wsteczny MBC1HVS2 (Id. Sekw. nr 9) zastosowany do modyfikacji regiony V łańcucha H zaprojektowano w taki sposób, ze zastępował drugi aminokwas (tj. asparaginę) sekwencji kodującej początkową część sekwencji liderowej regionu V glicyną i zawierał sekwencję zgodności Kozak'a) Kozak i in., J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987) i sekwencje rozpoznawane przez HindIII i EcoRI. Starter „naprzód” MBC1HVR2 (Id. Sekw. nr 10) zastosowany do modyfikacji regionu V łańcucha H zaprojektowano w taki sposób aby hybrydyzował z sekwencją DNA kodującą region 3' regionu J, kodując region 5' regionu C i zawierając sekwencję rozpoznawane przez ApaI i SmaI.

Reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) i dołączony bufor. Roztwór PCR (50 (.1) obejmował 0,6 ug plazmidu MBC1H/pUC19 jako matrycę DNA, 50 pmoli MBC1HVS2 i 50 pmoli MBC1HVR2 jako startery, 2,5 U TaKaRa Ex Taq i 0,25 mM dNTP w buforze, co pokryto 50 ul oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°C. Amplifikowane fragmenty w reakcji PCR rozdzielono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stosując 1% agarozę Sea Kem GTG (FMC Bio. Products). Następnie, fragment żelu ^^VR;miięy oiagom/tu k/ansi wicmusni njf up w—i Ltdguicui 17ΑΝ/Λ. bLUbUjć^c

GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta. Oczyszczone fragmenty DNAprecypitowano etanolem i rozpuszczono w 20 ul roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

pl powstałego roztworu DNA trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i SmaI (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę. Mieszaninę trawienną ekstrahowano fenolem i chloroformem i precypitowano etanolem w celu odzyskania DNA. Otrzymane fragmenty DNA

190 351

EcoRI-SmaI, które zawierały DNA kodujący Peginy V mysiego łańcucha H Olnynwayn do wektora pUC19, który precapnwaan przez trawienie EcoRI i SmaI. Powstały plazmid sekwencJnynwaan na urządzeniu DNA Seguencer 373A (Perkin Elmer) stosując startery M13 Primer M4 i M13 Primer RV oraz zestaw Dye Terminator Cycle Seguencing Kit (PerCin Elmer) Plazmid, który zawierał DNA o prawidłowej sekwencji zasad kodującej region V mysiego łańcucha H pochodzącego z hybrydoma #23-57-137-1 i posiada sekwencję rnzcnznawayą przez HmdIII oraz sekwencję Kozak'a na końcu 5' oraz sekwencję rozpoznawaną przez ApaI i SmaI na końcu 3' oznaczono jako „MBC1Hv/pUC19”.

(in) Konstruowanie wektora ekspresyjnego dla łańcucha H przeciwciała chimerycznego cDNA zawierający reglny Cyl łańcucha H lude01egn przeciwciała wytworzono w następujący sposób mRNA wytworzono z komórek CHO, do których wcrnwaaznnn wektor ekspresyjny DHFR-AE-RVh-PM-1-f (patrz WO 92/19759) kodujący geanmnwe DNA reginau V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 oraz regionu C łańcucha H ludzkiego przeciwciała IgG1 oraz wektor ekspresyjny RV1-PM1a (patrz WO 92/19759) kodujący gennmnwe DNA regionu V łańcucha L humanizowanego przeciwciała PM1 oraz region C łańcucha κ przeciwciała ludzkiego. Stosując otrzymany w ten sposób mRNA, Olnanwaan cDNA zawierający reginy V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 oraz regrnn Cyl przeciwciała ludzkiego przy użyciu PCR, a następnie klnynwayn do plazmidu pUC19 w miejscu HindIn-BamHI. Plazmid Olnynwayc badano na sekwencję DNA i prawidłowy plazmid określono jako „pRVh-PMlfcDNA”.

Wektor ekspresyjny DHFR-AE-RVh-PM-1-f, który posiadał delecję miejsca HmdIII pomiędzy promotorem Sv40 i genem DHFR oraz miejsce EcoRI pomiędzy promotorem EF-1a i regionem V łańcucha H przeciwciała humanizowanego PM1 wctwnpznan w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego dla cDNA zawierającego regrno V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 oraz regionu Cyl przeciwciała ludzkiego.

Otrzymany plazmid cRVh-PM1f-cDNA trawlnyn BamHI, stępiano fragmentem Kunowa, i dalej trawinyn HiridIn w celu otrzymania tępo zakończonego fPagmentu HmdIII-BamHI Ten fragment HindIn-BamHI poddano ligacar z miejscem HmdIII i EcoRI wektora ekspresyjnego DHFR-AE-RVh-PM-1-f, który trawiono HmdIII i BamHI do konstruowania wektora ekspresyjnego RVh-PMlf-cDNA zawierająhegn cDNA kodujący regino V łańcucha H humanizowanego przeciwciała PM1 i pegrno Cyl przeciwciała ludzkiego.

Wektor ekspresyjny RVh-PM1f-cDNA zawierał cDNA kodujące regino V łańcucha H przeciwciała PM1 i regrny Cyl przeciwciała luazkiegn trawiono ApaI i BamHI i pobrano fragment DNA zawierający regino C łańcucha H. Powstały fragment DNA wprowadzono do plazmidu MBCJHv/pUC19, który trawrnon ApaI i BamHI. Wytworzony w ten sposób plazmid oznaczono „MBC1HcDNA/pUC19”. Plazmid ten zawierał cDNA kodujące regrno V łańcucha H przeciwciała mysiego i re/wn Cyl przeciwciała ludzkiego i posiada sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI i HindIII na końcu 5' i sekwencję rozpoznawaną przez BamHI na końcu 3'.

Plazmid MBOHcDNApUC^ trawiono EcoRI i BamHI w celu otrzymania DNA kodującego łańcuch H przeciwciała chimerycznego. Powstały fragment DNA wprowadzono do wektora ekspresyjnego pCOS1, który tpawrnon EcoRI i BamHI. Wektor ekspresyjny dla przeciwciała chimerycznego oznaczono „MBC1HcDNA/pCOS1”. Następnie, sOnostounwaon wektor ekspresyjny pCOS1 stosując HEF-PMh-gG1 (patrz, WO 92/19759) przez usunięcie z mego genu przeciwciała przy użyciu EcoRI i SmaI, a następnie poddanie ligacji z Adapterem EhnRI-NntI-BamHI (Takara Shuzo) ^stcnjLzeola plazmidu Co ekspresji w kno.órkahh CHO, plazmid MDCtHcDNApUC19 trawiono EcoRI i BamHI w celu otrzymami DNA kodującego łańcuch H przeciwciała chimerycznego który następnie wcrowadenon Co plazmidu ekspresyjnego pCHO1, który trawiono EcoRI i BamHI. Plazmid ekspresyjny dla przeciwciała hhimers'he.oego nenacenon „MBC1HcDNApCHO1”. Wektor ekspresyjny pCHO1 sknostPunwaon stosując DHFR-AE-rvH- PM-1-f (patrz WO92/19759) przez usunięcie z oregn genu przeciwciała przy użyciu trawienia EcoRI i SmaI, a następnie ligację Co Adaptera EcnRI-NntI-BamHI (Takara Shuzo).

190 351 (2) Konstruowanie regionu C łańcucha lekkiego L (i) Wytwarzanie wektora klonowania

W celu skonstruowania wektora pUC19 zawierającego region C ludzkiego łańcucha L, wytworzono wektor pUC19 z usuniętym miejscem HindIII. 2 pg wektora pUC19 trawiono 20 pl roztworu reakcyjnego zawierającego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCk, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindIII (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę. Powstałą mieszaninę trawienną ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie poddano precypitacji etanolem w celu zebrania pożądanego DNA.

Zebrany DNA poddano reakcji w 50 pl roztworu reakcyjnego obejmującego 50 mM Tns-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCfe, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 0,5 mM dNTP i 6 U fragmentu Klenowa (Gibco BRL) w temperaturze pokojowej przez 20 minut, co daje tępe końce DNA. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie poddano precypitacji etanolem w celu zebrania pożądanego DNA.

Wektorowy DNA poddano reakcji w 10 pl roztworu reakcyjnego obejmującego 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCT, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% poliglikol etylenowy 8000 i 0,5 U ligazy DNA T4 (Gibco BRL) w 16°C przez 2 godziny w celu religacji wektorowego DNA. 5 pl roztworu reakcyjnego dodano do 100 pl roztworu zawierającego kompetentne komórki E. coli JM 109 (Nippon Gene). Mieszaninę komórek pozostawiono przez 30 minut na lodzie, w 42°C przez minutę, a następnie przez minutę na lodzie. Komórki zmieszano z 500 pl pożywki SOC i inkubowano w 37°C przez godzinę. Powstałą zawiesinę komórek rozsmarowano na pożywce 2xYT z agarem (z dodatkiem 50 pg/ml ampicyliny), którą stosowano z i X-gal na powierzchni (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, i wsp. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i inkubowano w 37°C przez noc. W ten sposób wytworzono transformanty E. coli.

Transformanty hodowano przez noc w pożywce 2xYT z dodatkiem 50 pg/ml ampicyliny w 37°C. Plazmidowy DNA preparowano stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Otrzymany w ten sposób plazmidowy DNA trawiono HindIII. Plazmid, co do którego stwierdzono, ze posiada miejsce HindIII określa się jako „pUC19AHindIII” (ii) Konstruowanie DNA kodującego region C łańcucha X, ludzkiego łańcucha L

Wiadomo było, że region C łańcucha X łańcucha L ludzkiego przeciwciała obejmuje przynajmniej cztery izotypy Mcg+Ke+Oz-, Mcg-Ke-Oz-, Mcg-Ke-Oz+ i Mcg-Ke+Oc- (Dariavah i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9074-9078,1987). Przeprowadzono poszukiwanie regionów C łańcucha X łańcucha L ludzkiego przeciwciała homologiczny do regionu C łańcucha X mysiego łańcucha L #23-57-137-1 oparte na bazie danych EMBL. W wyniku, stwierdzono, ze izotyp Mcg+Ke+Oz- (Nr dostępu Χ57819 (Dariavah i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9074-9078, 1987) łańcucha X ludzkiego przeciwciała wykazało najwyższą homologię z regionem C łańcucha X łańcucha L mysiego #23-57-137-1 i wykazywało 64,4% homologię w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej i 73,4% homologii w odniesieniu do sekwencji DNA.

Następnie, przeprowadzono konstruowanie DNA kodującego region C łańcucha X łańcucha L ludzkiego przeciwciała metodą PCR. Wszystkie startery syntetyzowano stosując urządzenie 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). Syntetyzowano startery HLAMB1 (Id. Sekw nr 11) i HLAMB3 (Id. Sekw. nr 13) o sensownej sekwencji DNA oraz HLAMB2 (Id Sekw. nr 12) i HLAMB4 (Id. Sekw. nr 14) o antysensownej sekwencji DNA, przy czym każdy ze starterów zawierał sekwencję komplementarną długości 20-23 bp na obu końcach.

Zewnętrzne startery HLAmBs (Id. Sekw. nr 15) i HLAMBR (Id. Sekw. nr 16) miały sekwencję komplementarną, odpowiednio, ze starterami HLAMB1 i HLAMB4, ale zawierały sekwencje rozpoznawane przez, odpowiednio, EcoRI, HindIII i BlnI oraz EcoRI. W pierwszej t-ooLnii rpolzoiP Τ-ΓΤ Δ NAR 1 _ΐ-ΤΤ i Ϊ-ΓΤ ΔΚΛΤί^-Τ-ΤΤ ΔΑΛΏζΙ T^Q rżeniu reakcjr, oba wyniki zmieszano w równych ilościach i połączono kolej ną reakcją PCR. Do powstałego produktu dodano zewnętrzne startery HLAMBS i HLAMBR. Mieszaninę reakcyjną poddano trzeciej reakcji PCR w celu amplifikacji DNA pełnej długości.

Reakcje PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) według instrukcji producenta. W pierwszej reakcji PCR zastosowano albo 100 pl roztworu z reakcji obejmującego 5 pmoli HLAMB1, 0,5 pmoli HLAMB2 i 5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), lub

190 351 roztwór reakcyjny zawierający 0,5 pmoli HLAMB 4 i 5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), na które nawarstwiono 50 μ) oleju mineralnego i przeprowadzono 5 cykli reakcji PCR stosując program obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C. W drugiej reakcji PCR, zastosowano mieszaninę 50 μl każdego z roztworów reakcyjnych, na które nawarstwiono 50 μl oleju mineralnego i przeprowadzono trzy cykle reakcji PCR stosując program obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C. W trzeciej reakcji PCR zastosowano roztwór reakcyjny, do którego dodano 50 pmoli każdego ze starterów zewnętrznych HLAMBS i HLAMBR i przeprowadzono 30 cykli PCR stosując program obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C.

Otrzymany w trzeciej reakcji PCR fragment DNA poddano elektroforezie przy użyciu 3% agarozy o niskiej temperaturze krzepnięcia (NuSieve GTG, FMC), zebrano i oczyszczono z żelu stosując zestaw GENECLEAN II (BIO1 01) według instrukcji producenta.

Otrzymany w ten sposób fragment DNA trawiono 20 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCL, 1 mM DTT, 100 mm NaCl i 8 U EcoRI (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę. Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie precypitowano etanolem otrzymując DNA. DNA zebrano i rozpuszczono w 8 jj1 roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA).

0,8 μg plazmidu pUC19 AHindIII trawiono EcoRI w taki sam sposób jak opisany wyżej Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie precypitowano etanolem otrzymując pUC19 AHindIII. Plazmid zebrano i rozpuszczono w 50 μl roztworu zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCE i fosfatazę alkaliczną (E coli C75, Takara Shuzo) w 37°C przez 30 minut, w celu defosforylacji plazmidu (tj. traktowanie BAP). Roztwór reakcyjny poddano ekstrakcji fenolem i chloroformem i precypitacji etanolem otrzymując DNA, Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie precypitowano etanolem otrzymując DNA. DNA zebrano i rozpuszczono w 10 μl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA).

μ! plazmidu pUC10 AHindIII traktowanego BAP zmieszano z 4 μl DNA otrzymanego w opisanych wyżej reakcjach PCR poddając je ze sobą ligacji z użyciem zestawu do ligacji DNA ver. 2 (Takara Shuzo). Powstały plazmid wprowadzono do kompetentnych komórek E coli, JM 109, otrzymując transformanty. Transformanty hodowano przez noc w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 μg/m! ampicyliny. Z komórek oczyszczono plazmid stosując zestaw QLAprep Spin Plasmid Kit (QLAGEN).

W odniesieniu do opisanego wyżej plazmidu, potwierdzono sekwencję DNA. W celu określenia sekwencji DNA zastosowano urządzenie 373A DNA Sequencer (ABI) i startery „M13 Primer M4” i „M13 Primer RV” (Takara Shuzo). W wyniku stwierdzono, że klonowany DNA ma delecję wielkości 12 bp. Plazmid zawierający DNA oznaczono „c AA/pUC19”. Następnie, w celu wytworzenia części, wytworzono startery HCLMS (Id. Sekw. nr 17) i HCLMR (Id. Sekw·'. nr 18) i rekonstruowano prawidłowy DNA stosując metodę PCR.

Przeprowadzono pierwszą reakcję PCR z użyciem plazmidu C AA/pUC19, zawierającego DNA z delecją jako matrycę, a następnie z użyciem starterów HLAMBS i HCLMS albo starterów HCLMS i HLAMB4. Każdy z produktów reakcji PCR oczyszczono. W drugiej reakcji PCR, produkty PCR połączono ze sobą. Do produktu dodano zewnętrzne startery HLAMBS i HLAMB4, a następnie przeprowadzono trzecią reakcję PCR w celu amplifikacji DNA pełnej długości.

W pierwszej reakcji PCR zastosowano 100 μl roztworów reakcyjnych obejmujących 0,1 μg cAA/pUC19 jako matrycę, zastosowano po 50 pmoli każdego ze starterów HLAMBS i HCLMR albo 50 pmoli każdego ze starterów HCLMS i HLAMB4 oraz 5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), nawarstwiono 50 μl oleju mineralnego i przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C.

Produkty PCR, HLAMBS-HCLMR (236 bp) i HCLMS-HLAMB4 (147 bp) poddano elektroforezie stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze krzepnięcia w celu wyizolowania fragmentu DNA. Fragment DNA zebrano i oczyszczono z żelu stosując zestaw GENECLEAN II (BIO1O1). W drugiej reakcji PCR, zastosowano 20 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 40 ng oczyszczonego fragmentu DNA i 1 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), nawarstwiono 25 μl

190 351 oleju mineralnego i przeprowadzono 5 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°Ć i 1 minutę w 72°C.

W trzeciej reakcji PCR, zastosowano 100 μΐ roztworu reakcyjnego zawierającego 2 μΐ roztworu reakcyjnego otrzymanego w drugiej reakcji PCR, 50 pmoli każdego z zewnętrznych starterów HLAMBS i HLAMB4 i 5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), nawarstwiono 50 μΐ oleju mineralnego i przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C, otrzymując fragment DNA długości 357 bp (trzeci produkt PCR). Fragment DNA poddano elektroforezie stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze krzepnięcia w celu wyizolowania fragmentu DNA. Fragment DNA zebrano i oczyszczono z zelu stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101).

0,1 pg fragmentu DNA trawiono EcoRI, a następnie klonowano do plazmidu pUC19 AHind III, który traktowano BAP. Powstały plazmid wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli JM 109 otrzymując transformanty. Tak wytworzone transformanty hodowano przez noc w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 pg/ml ampicyliny. Z frakcji komórkowej oczyszczano plazmid stosując zestaw QIAgen Spin Plasmid Kit (QUIAGEN).

Sekwencję DNA otrzymanego plazmidu potwierdzano stosując startery Ml3 Primer M4 (Takara Shuzo) i Ml3 Primer RV (Takara Shuzo) przy użyciu urządzenia DNA Sequencer 373A (ABI; Perkin Elmer). Plazmid zawierający prawidłową sekwencję DNA bez dełecji oznaczono „CX/pUC19”.

(iii) Konstruowanie DNA kodującego ludzki łańcuch L, region C łańcucha κ

Fragment DNA kodujący region C łańcucha κ łańcucha L klonowano z plazmidu HEF-PMlk-gk (WO 92/19759) metodą PCR. Starter HKAPS (Id. Sekw nr 19) zaprojektowano w taki sposób, ze zawierał sekwencje rozpoznawane przez EcoRI, Hmdin i Blnl, zaś starter wsteczny HKAPA (Id. Sekw. nr 20) zaprojektowano w taki sposób, ze zawierał sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI, przy czym oba syntetyzowano na urządzeniu 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI).

Reakcję PCR przeprowadzono stosując 100 pl roztworu reakcyjnego obejmującego 0,1 pg plazmidu HEF-PMlkgk jako matrycę, 50 pmoli każdego ze starterów HKAPS i HKAPA oraz 5 U TaKaRa Ex Taq, na co nawarstwiono 50 pl oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 60°C i 1 minutę w 72°C Amplifikowane fragmenty w reakcji PCR wielkości 360 bp rozdzielono przez elektroforezę na zelu agarozowym, stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze krzepnięcia i oczyszczono fragment DNA stosując GENECLEAN II (BIO101).

Fragment DNA trawiono EcoRI i klonowano do plazmidu pUC19 AHindUI, który traktowano BAP. Powstały plazmid wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli, JM 109 i hodowano przez noc w pożywce 2xYT z dodatkiem 50 pg/ml ampicyliny w 37°C Plazmidowy DNA preparowano stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

Otrzymany w ten sposób plazmidowy DNA sekwencjonowano z użyciem startera Ml3 Primer M4 i Ml 3 Primer RV przy użyciu urządzenia 373A DNA Sequencer (ABI). Plazmid o potwierdzonej prawidłowej sekwencji zasad oznaczono „CK/pUC19” (3) Konstruowanie wektora ekspresyjnego łańcucha L chimerycznego przeciwciała

Konstruowano łańcuch L chimerycznego przeciwciała #23-57-137-1. DNA kodujący region V łańcucha L chimerycznego przeciwciała #23-57-137-1 poddano ligacji w miejscach Hin<4TTT i Blnl występujących tuz przed regionem C ludzkiego przeciwciała, każdego z plazmidów CA/pUC19 iCx/pUC19 otrzymując w ten sposób wektory pUC19 zawierające DNA kodujący region V łańcucha L i region C łańcucha κ łańcucha L chimerycznego przeciwciała #23-57-137-1. Każdy z powstałych wektorów trawiono EcoRI wycinając EcoRI DNA kodującego łańcuch L przeciwciała chimerycznego i klonowano DNA do wektora ekspresyjnego HEF.

DNA kodujący region V łańcucha L przeciwciała #23-57-137-1 klonowano z plazmidu MBC1L24 metodą PCR. Startery indywidualnie syntetyzowano stosując 394 DNA/RNA Synthesizer (ABI). Starter wsteczny MBCCHL1 (Id. Sekw. nr 21) zaprojektowano tak, ze zawierał sekwencje zgodności Kozak'a (Kozak i in., J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987) zaś starter MBCCHL3 (Id. Sekw. nr 22) zaprojektowano tak, że zawierał sekwencje rozpoznawane przez Bgll i EcoRI.

190 351

Przeprowadzono reakcję PCR stosując 100 pl roztworu reakcyjnego obejmującego 10 zM Tns-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 0,25 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCh, 2,5 jednostki AmpliTaq (Perkln-Elmyr), 0,1 pg MBC1L24, 50 pmoli każdego ze starterów MBCCHL1 i MBCCHL3, Który przykryto 50 pl oleju mineralnego. Przeprowadzono 30 cykli PCR stosując cykl temperaturowy po 45 sekund w 94°C, 45 sekund w 60°C i 2 minuty w 72°C

Fragment DNA wielkości 444 bp poddano elektroforezie z użyciem żelu agarozowego, stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze Krzepnięcia i oczyszczono fragment DNA stosując GENECLEAN II (BIO 101). Oczyszczony fragment DNA rozpuszczono w 20 pl roztworu zawierającego 10 zM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA. 1 pl produktu PCR trawiono w 20 pl roztworu reakcyjnego obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCh, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 8 U HindIII (Takara Shuzo) i 8 U EcoRI w 37°C przez godzinę. Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie precypitowyzo etanolem otrzymując DNa. DNA zebrano i rozpuszczono w 8 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA).

pg plazmidu pUC19 trawiono HindIII i EcoRI w taki sam sposób jak opisany wyżej. Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie prycypitowazo etanolem otrzymując trawiony plazmid. Plazmid traktowano BAP (fosfatazą alkaliczną, E. coli C75; TaKara Shuzo), ekstrahowano fenolem i chloroformem i precyzowano etanolem. DNA zebrano i rozpuszczono w 10 pl roztworu zawierającego 10 zM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

pl plazmidu pUC10 traktowanego BAP zmieszano z 4 pl produktu PCR w celu ligacji przy użyciu zestawu do ligacji DNA ver. 2 (Takara Shuzo). Uzyskany plazmid wprowadzono do Kompetentnych komórek E. coli JM 109 (N^pon Gyzy) w sposób opisany powyżej otrzymując trazsCorzazt. Tak wytworzone trαzsformynty mocowano przez noc na pożywce 2xYT zawierającej 50 pg/zl ampicyliny w 37°C Uzyskany trazsformαzt hodowano przez noc w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 pg/ml ampicyliny w 37°C. Z frakcji komórkowej oczyszczano plazmid stosując zestaw piAgen Spin Plaszid Kit (QUIAGEN). Po określeniu sekwencji DNA, potwierdzono, ze plazmid za właściwą sekwencję DNA i oznaczono „CHL/pUC19”.

pg Każdego z plazmidów CZ/pUC19 i Ck/pUC19 trawiono w 20 pl roztworu reakcyjnego obejmującego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindIII i 2 U BlnI w 37°C przez godzinę. Roztwór trawienny ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie rrecypitowazo etanolem, otrzymując DNA. DNA traktowano BAP w 37°C prze 30 minut, a następnie ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie rrycypitoąyzo etanolem. Produkt rozpuszczono w 10 pl roztworu obejmującego 10 mM TrisHCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA pl plazmidu CHL/pUC19, który zawierał DNA kodujący region V łańcucha L przeciwciała #23-57-137-1 trawiono HindIII i BlnI w opisany wyżej sposób. Fragment DNA wielkości 409 bp poddano elektroforezie stosując 3% agarozę o niskiej temperaturze Krzepnięcia i zebrano i oczyszczono stosując zestaw GENECLEAN II. Fragment DNA rozpuszczono w 10 pl roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

pl DNA dla regionu V łańcucha L klonowano do 1 pl plazmidów traktoąyzyrh BAP CZ/pUC19 albo ck/pUC19 i wprowadzano do komrytentyaych komórek El. coli, JM 109, otrzymując trαzsformantj'. Transformyzty hodowano przez noc w 3 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 pg/ml ampicyliny. Z komórek oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Otrzymany w ten sposób plazmid oznaczono ,,MBC1T(Z)/'pUC19’’ albo „MBC1L(K)/pUC 19”.

i/·*/·* O T

MBC1L (Z-)/pUC19 i MBC1L(k)/pUC19 trawiono Ec dawano elektroforezie przy użyciu 3% agarozy o niskiej temperaturze Krzepnięcia Fragment DNA o wielkości 743 bp izolowano i oczyszczono z żelu stosując zestaw GENECLEAN II (BIO 101). po czym rozpuszczono w 10 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCL (pH 7,4)

K ażdy . - — j z plazzidów • r ..........

od_- zM EDTA

2,7 pg wektora ekspresyjnego, plazmidu HEF-PM1K-gk trawiono EcoRI i ekstrahowano fenolem i chloroformem, a następnie precypltowazo etanolem otrzymując DNA. Fragment

190 351

DNA traktowano BAP a następnie poddano elektroforezie przy użyciu 1% agarozy o niskiej temperaturze krzepnięcia i oczyszczono DNA wielkości 6561 bp z żelu stosując zestaw GENECLEAN II (BlO101). DNA zebrano i rozpuszczono w 10 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

Wektor HEF preparowano i traktowano BAP, po czym 2 pl wektora HEF traktowanego BAP zmieszano z 3 pl fragmentu EcoRI plazmidu MbC1( λ )/pUC19 albo MBC1L(k)/pUC19 w celu ich ligacji. Produkt ligacji wprowadzono do kompetentnych komórek E coli, JM109, otrzymując transformanty. Transformanty hodowano przez noc w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 pg/ml ampicyliny'. Z komórek oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QLAGEN).

Plazmidowy DNA oczyszczony w ten sposób trawiono w 20 pl roztworu zawierającego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 mM KCl, 8 U HindIII (TaKara Shuzo) i 2 U Pvul (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę. W tej reakcji trawienia założono, ze jeżeli fragment DNA zostanie wprowadzony do wektora w prawidłowej orientacji, to otrzyma się fragment 5104/2195 bp, podczas gdyby fragment DNA wprowadzono do wektora w odwrotnej orientacji, to da to fragment wielkości 4387/2926 bp. W oparciu o te założenia, plazmidy, w Których fragment wprowadzono w prawidłowej orientacji oznaczono „MBC1L(()/neo” i „MBC1L(K)/neo”.

(4) Transfekcja komórek COS-7

Wytworzone jaK wyżej plazmidy ekspresyjne poddano przejściowej ekspresji przy użyciu Komórek COS-7, w celu zbadania przeciwciała chimerycznego pod względem wiązania neutralizacji aktywności przeciwko antygenowi.

Przejściową ekspresję przeciwciała chimerycznego osiągnięto przez połączenie plazmidów MBC1HcDNA/pCOSl i MBC1L(Zj/noo albo plzzmidów MB3CIHcDNA//pCOSl MBBC1L(K)/neo przy użyciu urządzenia Gene Pulser (B^RaT) w celu kotransfekowama Każdej z kombinacji plazmidów do komórek COS-7. Tzn. do 0,8 ml zawiesiny komórek, w Której Komórki COS-7 zawieszono w PBS(-) w gęstości 1x10⁷ KomóreK/ml, dodano 10 pg Każdego z plazmidowych DNA. Powstały roztwór poddano pulsowi przy napięciu 1500 V i pojemności pF powodując eleKtroporację. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej Komórki zawieszono w pożywce DMEM zawierającej 2% surowicę płodową cielęcą Ultra Low IgG (Gibco), a następnie hodowano stosując 10 cm szalki w inkubatorze CO₂. Po hodowli przez 72 godziny, nadsącz hodowlany zebrano i odwirowano w celu usunięcia resztek Komórkowych i dostarczono jako próbkę do testu ELISA.

W tej procedurze, oczyszczanie przeciwciał chimerycznych z nadsączu hodowlanego komórek COS-7 przeprowadzono przy użyciu zestawu Affigel Protein A MAPSII(Bio Rad) według instruKcji producenta.

(5) Test ELISA (i) OKreślenie stężenia przeciwciał

Płytkę ELISA do oznaczania stężenia przeciwciał przygotowano w następujący sposób. Studzienki płytki 96-studzlenKownj do ELISA (MaxisOTp, NUNC) pokryto 100 pl roztworu zawierającego Kozie przeciwciało przeciwko ludzkim IgG (TAGO) przygotowanym w buforze do pokrywania (0,1 M NaHCOj, 0,02 NaNj) w stężeniu 1 pg/ml, a następnie blokowano 200 pl buforu do rozcieńczania (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN₂, 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA); pH 7,2). Do każdej ze studzienek dodano nadsącz hodowlany Komórek COS-7, w którym ulegały ekspresji przeciwciała chimeryczne albo oczyszczone przeciwciała chimeryczne w stopniowych rozcieńczeniach. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 100 pl roztworu koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (TAGO). Po inkubac,i w temperaturze pokojowej przez godzinę i płukaniu PBS-Tween 20, do Każdej ze studzienek dodano 1 mg/ml roztworu substratu („Sigma 104”, kwas p-nltrofenylofosforoó-·y, Sigma). Mierzono absorbancję roztworu przy długości fali równej 405 nm stosując Microplate Reader (Bio Rad). Jako standard stosowano oczyszczane Hu IgG1( (The Binding Site).

(ii) Określanie zdolności wiązania antygenu

Płytkę ELISA do oznaczania wiązania przeciwciał przygotowano w następujący sposób

190 351

Każdą ze studzienek płytki 96-studzienkoweA pokryto 100 pl roztworu obejmującego ludzki PTHrP (1-34) (Peptide Research Institute) przygotowanego w buforze o stężeniu 1 pg/ml, a następnie zablokowano 200 pl buforu do blokowania. Do każdej ze studzienek dodano nadsącz hodowlany komórek COS-7, w których wyrażano przeciwciała chimeryczne albo oczyszczone przeciwciała chimeryczne, w stopniowym rozcieńczeniu. Po inkubacji w temperaturze pokojowej i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 100 pl roztworu koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (TAGO) Po inkubacji w temperaturze pokojowej i płukaniu PBS-Tween 20 do każdej ze studzienek dodano 1 mg/ml roztworu substratu („Sigma 104”, kwas p-nitrofenylofosforooy, Sigma) Mierzono absorbancję roztworu przy długości fali równej 405 nm stosując Microplate Reader (Bio Rad).

W wyniku stwierdzono, ze przeciwciało chimeryczne ma zdolność wiązania ludzkiego PTHrP (1-34) jak również ma prawidłową strukturę klonowanego regionu V przeciwciała mysiego (fig 4). Stwierdzono również, ze nie występują różnice w zdolności wiązania PTHrP (1-34) pomiędzy przeciwciałem chimerycznym, w którym region C łańcucha L ma łańcuch X, a takim, w którym region C łańcucha L ma łańcuch k. Stąd, skonstruowano region C łańcucha L przeciwciała humanizowanego z zastosowaniem łańcucha X łańcucha L przeciwciała humanizowanego (6) Ustalenie stabilnie transformowanej linii komórkowej CHO

W celu ustalenia stabilnych transformantów dla przeciwciała chimerycznego, opisany wyżej plazmid ekspresyjny wprowadzono do komórek CHO (DXB11).

Ustalenie stabilnych transformantów przeciwciała chimerycznego przeprowadzono przy użyciu kombinacji plazmidów ekspresyjnych komórek CHO, MBSlHcDNA/pCHO1 i MBC1L^ )/neo albo plazmidów ekspresyjnych dla komórek CHO, MBC1HcDNApCHO1 i MBC1L(k)/neo. Te kombinacje plazmidów kotransfekowano pojedynczo do komórek CHO metodą elektroporacji stosując Gene Pulser (Bio Rad). Każdy z wektorów ekspresyjnych cięto enzymem restrykcyjnym PvuI w celu otrzymania liniowego DNA. Powstały DNA zbierano przez ekstrakcję fenolem i chloroformem, a następnie precypitację etanolem. Wytworzone w ten sposób plazmidy ekspresyjne poddano elektroporacji. 10 pg każdego z plazmidowych DNA dodano do 0,8 ml zawiesiny komórek zawierającej komórki CHO w PBS(-) w gęstości 1x10⁷ komórek/ml Powstałą mieszaninę poddano pulsowi o napięciu 1500 V i pojemności 25 pF. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej komórki zawieszono w pożywce MEM-α (Gibco) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco). Powstałą zawiesinę hodowano w trzech płytkach 96-studzienkowych (Falcon) w inkubatorze CO2. Następnego dnia po rozpoczęciu hodowli, pożywkę zastąpiono pożywką wybiórczą (pożywka MEM-α z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco) i 500 pg/ml genetycyny (siarczan G418, Gibco) bez rybonukleozydów albo dez.oksyrybonukleozydów. Po zastąpieniu pożywki selektywnej świeżą pożywką, przed i po dwóch tygodniach hodowli komórki obserwowano pod mikroskopem Gdy zaobserwowano wzrost komórek komórki badano na ilość wytwarzanych przeciwciał w teście ELISA Wśród komórek zebrano wybiórczo te, które wytwarzały większe ilości przeciwciał

Skalowanie w górę hodowli stabilnych transformantów dla ustalonych przeciwciał przeprowadzono w butelkach obrotowych stosując pożywkę MEM z dodatkiem 2% płodowej surowicy cielęcej Ultra Low IgG1 bez rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów. 3 i 4 dnia hodowoh, nadsącze hodowlane zebrano 1 filtrowano przez 0,2 pm filtr z hodowli (Millipore) w celu usunięcia resztek komórkowych.

Następnie, przeprowadzono oczyszczanie przeciwciał chimerycznych z nadsączu hodowli komórek CHO przy użyciu kolumny Poros Protein A Column (PerSeptive Biosystems) na ConSep LC100 (Millipore) według instrukcji producenta. Oczyszczone przeciwciała chimeryczne dostarczono jako próbki do określenia aktywności neutralizującej oraz do badania skuteczności hiperkslcemiczrego modelu zwierzęcego. Stężenie i aktywność wiązania oczyszczonych przeciwciał chimerycznych przeciwko antygenowi określono tym samym układem

ELISA.

190 351

Przykład 3

Konstruowanie przeciwciał ludzkich (1) Konstruowanie łańcucha H przeciwciała humanizowanego (i) Konstruowanie regionu V łańcucha H

Łańcuch H przeciwciała #23-57-137-1 wytworzono techniką przeszczepiania CDR przy użyciu PCR. Do wytwarzania łańcucha H humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 (wersja „a”) o FR pochodzących z ludzkiego przeciwciała S31679 (NMRF-PDB; Cuisinier i in., Eur J. Immunol 23:110-118, 1993), zastosowano następujące sześć rodzajów starterów PCR' startery przeszczepiania CDR: MBC1HGP1 (Id. Sekw. nr 23) i MBC1HGP3 (Id. Sekw. nr 24 (zawierające sekwencję sensowną DNA) i MBC1HGP2 (Id. Sekw·; nr 25) i MBC1HGP4 (Id. Sekw. nr 26) (zawierające sekwencję antysensowną DNA), które wszystkie obejmowały sekwencję komplementarną o długości 15-21 bp na ich obu końcach, i startery zewnętrzne· MBC1HVS1 (Id. Sekw'. nr 27) i MBC1HVR1 (Id. Sekw nr 28), obejmujące homologię ze starterami przeszczepiania CDR, odpowiednio, MBC1HGP1 i MBC1HGP4

Startery przeszczepiania CDR MBC1HGP1, MBC1HGP3, MBC1HGP2 i MBC1HGP4 wyizolowano stosując zdenaturowany mocznikiem żel poliakryloamidowy (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i ekstrahowano z frakcji żelu metodą kruszenia i moczenia (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) w następujący sposób.

nmol każdego ze starterów przeszczepiania CDR wyizolowano 6% denaturowanym żelem poliakryloamidowym w celu otrzymania fragmentu DNA. Z powstałych fragmentów DNA zidentyfikowano przez naświetlenie UV fragmenty o pożądanej wielkości na płytce z żelem krzemionkowym, a następnie zebrano metodą kruszenia i moczenia. Produkt rozpuszczono w 20 μl roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA. Reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo). Roztwór reakcyjny (100 μ^ zastosowany w reakcji PCR obejmował 1 μl każdego ze wspomnianych starterów przeszczepiania CDR MBC1HGP1, MBC1HGP3, MBC1HGP2 i MBC1HGP4, 0,25 mM dNTP i 2,5 U TaKaRa Ex Taq w buforze. Przeprowadzono pięć cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°C. Do produktu reakcji dodano zewnętrzne startery MBC1HVS1 i MCB1HVR1 po 50 pmoli. Stosując tę mieszaninę reakcyjną przeprowadzono dodatkowe 30 cykli reakcji PCR stosując ten sam cykl temperaturowy. Amplifikowany w ten sposób fragment DNA wyizolowano przez elektroforezę na żelu agarozowym z użyciem 4% agarozy NuSieve GTG (FMC Bio. Products).

Fragment agarozy zawierający fragment DNA wielkości 421 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta Oczyszczony w ten sposób fragment DNA precypitowano etanolem i rozpuszczano w 20 μl roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) pil mM EDTA. Mieszaninę reakcyjną zastosowano do klonowania fragmentu DNA do plazmidu pUC19, który przygotowano przez trawienie BamHI i HindIU, a następnie określano sekwencję zasad plazmidu. Plazmid o prawidłowej sekwencji oznaczono „hMGCHv/pUC19”.

(ii) Konstruowanie regionu V łańcucha H cDNA humanizowanego łańcucha H

W celu ligacji cDNA regionu C C yl humanizowanego łańcucha H region V łańcucha H konstruowano według powyższego etapu metodą PCR. W tym sposobie zaprojektowano wsteczny starter MBC1HVS2 w taki sposób, aby hybrydyzował z sekwencją kodującą region 5' sekwencji liderowej regionu V i posiadał sekwencję Kozak'a (Kozak i in., J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987) i sekwencje rozpoznawane przez HindIU i EcoRI. Starter MBC1HVR2 zastosowany do modyfikowania DNA regionu V łańcucha H zaprojektowano w taki sposób, żeby hybrydyzował z obiema sekwencjami DNA kodującymi region 3’ regionu J oraz sekwencją DNA kodującą region 5’ regionu C i niósł sekwencje rozpoznawane przez ApaI i SmaI.

Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) i dołączonego bufom Roztwór reakcyjny zastosowany do reakcji PCR obejmował 0,4 μg hMBCHv/pUC19 jako matrycę DNA, 50 pmoli każdego z MBC1HVS2 i MBC1HVR2 jako startery, 2,5 U TaKaRa Ex Taq i 0,25 mM dNTP w buforze. Przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°C. Amplifikowane

190 351 fragmenty w reakcji PCR rozdzielono przez elektroforezę na żelu agarozowym, stosując 3% agarozę NuSieve (FMC Bio. Products).

Następnie, fragment żelu zawierający fragment DNA wielkości 456 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta Oczyszczone fragmenty DNA precypitowano etanolem i rozpuszczono w 20 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) pl mM EDTA. Mieszaninę reakcyjną PCR zastosowano do klonowania fragmentu DNA do plazmidu pUC19, który przygotowano przez trawienie plazmidu EcoRI i SmaI; następnie określano sekwencję DNA powstałego plazmidu. Plazmidowy DNA, który zawiera DNA kodujący region V łańcucha H pochodzący z hybrydoma #23-57-137-1 i zawiera sekwencje rozpoznawane przez EcoRI i HindIII oraz sekwencję Kozaka na końcu 5' i sekwencje rozpoznawane przez ApaI i SmaI na końcu 3' oznaczono „hMBC1Hv/pUC19”.

(2) Konstruowanie wektora ekspresyjnego łańcucha H przeciwciała humanizowanego

Plazmid RVh-PM1f-cDNA zawierający sekwencję cDNA łańcucha H przeciwciała hPM1 trawiono ApaI i BamHI w celu otrzymania fragmentu DNA zawierającego sekwencję zasad regionu C łańcucha H.

Fragment DNA wprowadzono do plazmidu hMBC1Hv/pUC19, który preparowano przez trawienie plazmidu ApaI i BamHI. Preparowany w ten sposób plazmid oznaczono „hMBC1HcDNApUC19”. Plazmid ten zawierał DNA kodujący region V łańcucha H humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 oraz DNA kodujący region Cy1 łańcucha C łańcucha H i posiadał sekwencje rozpoznające EcoRI i HindIII w regionie 5' i sekwencje rozpoznające BamHI w regionie 3' Sekwencję zasad oraz odpowiadającą sekwencję aminokwasową wersji „a” humanizowanego łańcucha H w plazmidzie hMBC1HcDNA/pUC19 pokazano w Id Sekw. nr 58 i Id. Sekw nr 56

Plazmid hMBC1HcDNA/pUC19 trawiono EcoRI i BamHI otrzymując fragment DNA zawierający sekwencję zasad kodującą łańcuch H. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu ekspresyjnego pCOS1, który preparowano przez trawienie plazmidu EcoRI i BamHI. Otrzymany w ten sposób plazmid ekspresyjny dla przeciwciała humanizowanego oznaczono „hMBC 1 HcDNA/pCOS 1 ”

W celu wytworzenia plazmidu do ekspresji w komórkach CHO, plazmid hMBC1HcDNApUC19 trawiono EcoRI i BamHI otrzymując fragment DNA zawierający sekwencję zasad kodującą łańcuch H. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu ekspresyjnego pCHO1, który preparowano przez trawienie plazmidu EcoRI i BamHI. Otrzymany w ten sposób plazmid ekspresyjny dla przeciwciała humanizowanego oznaczono „hMBC1HcDNApCHO1” (3) Konstruowanie hybrydowego regionu zmiennego łańcucha L (i) Wytworzenie przeciwciała hybrydowego FR1,2/FR3,4

Skonstruowano DNA kodujący łańcuch L, w którym rekombinowano regiony FR z regionami z przeciwciała humanizowanego i mysiego przeciwciała (chimerycznego) i badano region pod kątem jego przydatności do humanizacji. W tym etapie, wytworzono hybrydowe przeciwciało zawierające FR1 i FR2 pochodzące z przeciwciała ludzkiego i FR3 i FR4 pochodzące z przeciwciała mysiego, przez wykorzystanie miejsca restrykcyjnego Af1II obecnego w CDR2 pg każdego z plazmidów MBC 1 L(X)/neo i hMBC1L(k) neo trawiono w 100 pil roztworu reakcyjnego obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCF, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 0,01% (wag./obj.) BSA i 10 U AfHI (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na 2% żelu agarozowym o niskiej temperaturze krzepnięcia i zebrano fragmenty DNA wielkości 6282 bp (określone jako „cl”) i 1022 bp (określane jako h1”) o oczyszczono ż zcls otosąjS.c GEEJECEAAN II (BIOIO.).

pg fragmentu c1 i h1 poddano traktowaniu BAP. Fragment DNA ekstrahowano fenolem i chloroformem, zebrano przez precypitację etanolem, rozpuszczono w 10 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

pl traktowanych BAP c 1 i h1 fragmentów DNA zmieszano z 4 pl fragmentów DNA h2 i c2, w celu ligacji (w 4°C przez noc). Produkt ligacji wprowadzono do kompetentnych komórek E coli JM 109 otrzymując transformanty. Transformanty hodowano w 2 ml 2xYT

190 351 zawierającej 50 pg/ml ampicyliny Z fOakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw ęIAprep Spis Plasmid Kit (QIAGEN).

Plazmidowy DNA trawiono w 20 pl roztworu reakcyjnego obejmującego 10 mM TrisHCl (pH 7,5), 10 mM MgCL, 1 mM DTT, 2 U ApaLI (Takaoa Shuzo) i 8 U BamHI (Takara Shuzo) albo HiodIII (Takaoa Shuzo) przez godzinę w 37°C. W tym etapie erdeotcfrknwaon plazmid oa podstawie oczekiwania, ze jeżeli fragment c1-h2 uległ prawidłowej ligacji w plazmidzie, powiona ona dać fragmenty toawienoe ApaLI wielkości 5560/1246/498 bp, zaś trawienie BamHI/HioCni fragmenty 7134/269 bp.

Wektor ekspresyjny kodujący hybrydowy łańcuch L przeciwciała ludzko FRJ,2/mysiegn FR3,4 neoacennn „h/mMBClL(λ)/nen”. Z drugiej strony, można było nie otrzymać klonu h1-c1. StąC, przeprowadzono rekombinację wektora pUC, a następnie Olnanwaare Co wektora HEF. Jako matrycę DNA zastosowano plazmid hMBC1Lak/pUC19, Itóźyp zawieraj DNA kodujący regrny V łańcucha H humanizowanego przeciwciała nie zawierający zastąpień αοιο!.)kwasowych i plazmid hMBC1LdZ/pUC19, który iNA/O ncUajhcy e/gion V łaccccła L przeciwciała hcmaoiznwaaegn obejmującego zastąpienia amiookwasowe w pozycji 91 w FR3 (tj amiyn0was or 87 według definicji Kabata), tyrozyny przez ienJeuccaę.

pl OażCego z plazmidów MBC1L(X)/pUC19, hMBC1LaX/pUC19 i hMBC1LCX/pUC19 trawlnon w 30 pl roztworu reakcyjnego nbeam_aąhegn 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1mMDTT,50 mM NaCl, 0,01 % (wag/obj.)BSA, 16UHmdIIIi 4UAfHI w37°C przez godzinę Roztwór reakcyjny poddano elektrotnreere przy użyciu 2% żelu agaroenwegn o niskiej temperaturze krzepnięcia; a następnie oczyszczono następujące fragmenty DNA stosując zestaw GENECLEAN II (BIO1-1): Fragment DNA wielkości 215bp z plazmidu MBdL(Z)/pUC19 (określany jako „c2”) albo fragment DNA wielkości 3218 bp z każCe/o z plazmidów irMBC1Lak/pUC19 i hMBC1LCZ/pUC19MBC (nOoeśJaac tu jako ha1’ i hdP).

Każdy z fragmentów Ca1' i hd1' cnddayn h/acji z fOa/mentem c2' i wprowadzono do kompetentnych komórek E. coli JM 109 ntozcm_aąi traysfoomanty'. Traosformanty Cndnwaon w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 pg/ml ampricJmy. Z frakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spio Plasmid Kit (QIAGEN). Powstałe plazmidowe DNA zawierające fragment haF i hd1' oznaczono „m/hMBC1LaX/pUC19’ ’ i ,,014^/030^0-/pUC19”.

Każdy z tych plazmidów „m/hMBC1Lak/pUC19” i „m/hMBC1Laλ/pUCI9” trawiono EcoRI Foa/meot DNA wielkości 743 bp poddano elektroforezie przy użyciu 2% żelu agaroenwegn o niskiej temperaturze krzepnięcia, a następnie zebrano i oczyszczono z żelu przy użyciu zestawu GENECLEAN II (BIO101). Produkt rozpuszczono w 20 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA.

pl fragmentu DNA zmieszano z 1 pl wyżej wspomnianego traOtnwaoegn BAP wektora HEF w celu ligacji. Produkt ligacji wprowadzono Co kompetentnych komórek E coli JM109 otrzymując traosformanty. Transfnrmaaty hndnwaan w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 p//ml ampicyliny Z frakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw Q1Acrep Spio Plasmid Kit (QiAGEN).

Plazmidowy DNA oczyszczono i trawiono w 20 pl roztworu reakcyjnego nbeamuJącegn 20 mM Tris-HCI (41 8,5), 10 mM MgCh, 1 mM DTT, 100 mM KC1, 8 U HindIII (Takara Shuzo) i 2 U PvcI (Takaoa Shuzo) w 37°C przez goCzioę. Na tym etapie, plazmidowy DNA identyfikowano w oparciu o oczekiwanie, ze jeżeli foagmeot DNA został wcrowadznoy do plazmidu w prawidłowej orientacji, to trawienie powinno dawać fragmenty 5104/2195 bp, podczas gdy fragment DNA jest wprowadzony Co plazmidu w odwrotnej orientacji, trawienie Caje fragmenty 4378/2926 bp. Otrzymane plazmidy były wektorami ekspresyjnymi knacaącymi lah^ena^l j Οΰ^ΐ o 0^^ tOyOry esy jogu oiyaiu u c.1,1 ivnuuz,Ricgu rKj,-t·, cuic ijziiauzuntp jako wektory ekspresyjne „m/hMBCILak/neo” i „m/hMBClLdk/neo”.

(ii) WytWarzwAiz p^dwcia! habη/docanC FR P/FR2

Przeciwciało hybrydowe FR1/FR2 preparowano w taki sam sposób jak opisany wyżej pozc użyciu miejsca restrykcyjnego SoaBI obecnego w CDR1.

pg każdego z plazmidów MBC.1L(L yneo i mMBC1L(I )/neo trawrnnn w 20 pl roztworu reakhyJoegn obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM MgCL, 1 mM DTT,

190 351 mM NaCl, 0,01 % (wag./obj.) BSA i 6U SnaBI (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę Produkt reakcj i dalej trawiono w 50 pl roztworu reakcyjnego obejmującego 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), mM MgCh, 1 mM DTT, 100 mM KC1,0,01% (wag./obj.) BSA i 6 U Pvul w 37°C przez godzinę.

Produkt reakcji poddano elektroforezie przy użyciu 1,5% żelu agarozowego o niskiej temperaturze krzepnięcia, a następnie zebrano i oczyszczono fragmenty DNA wielkości 4955 bp i 2349 bp przy użyciu zestawu GENECLEAN II(BIO101). Fragmenty DNA otrzymane z plazmidu MBC1L (X)/neo oznaczono „ml” (4955 bp) i „m2” (2349 bp), zaś fragmenty DNA otrzymane z plazmidu h/inMBCT I..(L)/neo oznaczono ’ (4955 bp) i ,,bm2’ ’ (2349 bp)

Każdy z fragmentów DNA rozpuszczono w 40 pl roztworu zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) pl mM EDTA.

pl każdego z fragmentów ml i hm1 poddano ligacji z 4 pl każdego z fragmentów hm2 i m2, a następnie wprowadzono do kompetentnych komórek E coli, JM109 otrzymuj;.!c transformanty. Transformanty hodowano w 2 ml pożywki 2xYT zawierającej 50 pg/ml ampicyliny Z frakcji komórkowej oczyszczono plazmid stosując zestaw QIAprep Spin Plasmid Kit (QLAGEN)

Plazmidowy DNA trawiono w 20 pl roztworu reakcyjnego zawierającego 10 mM TrisHCl (pH 7,5), 10 mM MgCF, 1 mm dTt i 8U ApaI (Takara Shuzo) albo 2 U ApalI (Takara Shuzo) w 37°C przez godzinę

Plazmidy (m1-hm2 i hm1-m2) identyfikowano w oparciu o fakt, ze gdy fragmenty DNA zostaną połączone w plazmidzie w prawidłowej orientacji, trawienie plazmidu (m1-hm2) ApaI i ApaLI powinno dać, odpowiednio, fragment 7304 bp i fragmenty 5560/1246/498 bp, zaś trawienie plazmidu (hm1-m2) przy użyciu ApaI i ApaLI powinno dać, odpowiednio, fragmenty 6538/766 bp i fragment 3535/2Ó25/1C46)498 bp.

Wektor ekspresyjny kodujący łańcuch ł przeciwciała hybrydowego ludzko FR1/mysiego FR2,3,4 oznaczono „hmmMBClL(λ)/neo”, aa) wekto) ^Jkprreyyń^y koduąący łańcuch L pzzeciwciała hybrydowego mysio FR1 /ludzki FSZ/mysiego FR3,4 oznaczono „mhmMBClL(λ yneo” (4) Konstruowanie łańcucha L przeciwciała humanizowanego

Łańcuch L humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 wytworzono przez przeszczepienie CDR przy użyciu metody PCR. Tzn. preparowano łańcuch L humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 (wersja „a”), które zawierało FR1, FR2 i FR3 pochodzące z przeciwciała ludzkiego HSU03868 (Gen-Bank, Deftos i in., Scand. J. Immunol. 39.95-103, 1994) i FR4 pochodzący z ludzkiego przeciwciała S25755 (NBRF-PDB) przy użyciu sześciu rodzajów starterów

Startery przeszczepiania CDR, MBC1LGP1 (Id. Sekw-'. nr 29) i MBC1LGP3 (Id. Sekw nr 30), o sekwencji DNA erneowneJ, startery przeszczepiania CDR MBC1LGP2 (Id. Sekw. nr 31) iMBC1LGP4 (Id. Sekw. nr 32), oba o sekwencji DNA antceeneowneJ, przy czym wszystkie startery przeszczepiania CDR mające sekwencję komplementarną długości 15-21 bp na obu końcach; startery zewnętrzne MBC1LVSI (Id. Sekw. nr 33) i MBC1L\^/R1 (Id. Sekw. nr 34) o homologii ze starterami przeszczepiania CDR, odpowiednio, MBC1LGP1 i MBC1LGP4.

Startery przeszczepiania CDR MBC1LGP1, MBC1LGP3, MBC1LGP2 iMBC1LGP4 wyizolowano stosując zdrnaturowanc mocznikiem żel poliaercloamidowc (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) i ekstrahowano z frakcji żelu metodą kruszenia i moczenia (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

nmol każdego ze starterów przeszczepiania CDR wyizolowano 6% denaturowanym żelem poliakryloamidowym w celu otrzymania tragmentu DNA. Z powstałych fragmentów DNA zidentyfikowano przez naświetlenie UV fragmenty o pożądanej wielkości na płytce z żelem krzemionkowym, a następnie zebrano metodą kruszenia i moczenia Produkt rozpuszczono w 20 pl roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA

Reakcję PCR przeprowadzono stosując TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) z buforem. Roztwór reakcyjny (100 pl) zastosowany w reakcji PCR obejmował 1 pl każdego ze wspomnianych

190 351 starterów przeszczepiania CDR MBC1LGP1, MBC1LGP3, MBC1LGP2 iMBC!LGP4, 0,25 mM dNTP i 2,5 U TaKaRa Ex Taq w buforze. Przeprowadzono pięć cykli reakcji PCR stosując cykl obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°C. Do produktu reakcji dodano zewnętrzne startery MBC1LVS1 i MBC1LVR1 po 50 pmoli. Stosując tę mieszaninę reakcyjną przeprowadzono dodatkowe 30 cykli reakcji PCR stosując ten sam cykl temperaturowy. Amplifikowany w ten sposób fragment DNA wyizolowano przez elektroforezę na zelu agarozowym z użyciem 4% agarozy NuSieve GTG (FMC Bio. Products).

Fragment agarozy zawierający fragment DNA wielkości 421 bp wycięto i oczyszczono fragment DNA stosując zestaw GENECLEAN II (BIO101) według instrukcji producenta. Oczyszczony w ten sposób fragment DNA precypitowano etanolem i rozpuszczano w 20 μί roztworu obejmującego 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 mM EDTA. Mieszaninę reakcyjną zastosowano do klonowania fragmentu DNA do plazmidu pUC 19, który przygotowano przez trawienie BamHI i HindIII, a następme określano sekwencję zasad plazmidu Plazmid o prawidłowej sekwencji oznaczono „hMBCL/pUC19”. Jednakże, w plazmidzie tym stwierdzono, ze aminokwas w pozycji 104 (aminokwas numer 96 według Kabata) CDR4 został zastąpiony przez argininę. W celu skorygowania tego aminokwasu do tyrozyny, zaprojektowano starter MBC1LGP10R (Id. Sekw. nr 35). Następnie, przeprowadzono reakcję PCR przy użyciu TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) z buforem. Roztwór reakcyjny (100 μί) zastosowany do reakcji PCR zawierał 0,6 μg plazmidu hMBCL/pUC19 jako matryca DNA, 50 pmoli każdego ze starterów MBC1LVS1 iMBCILGPlOR, 2,5 U TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) i 0,25 mM dNTP w buforze, na co nawarstwiono olej mineralny. Przeprowadzono 30 cykli reakcji PCR stosując cykl temperaturowy obejmujący 1 minutę w 94°C, 1 minutę w 55°C i 1 minutę w 72°Ć. Amplifikowany w ten sposób fragment DNA wyizolowano przez elektroforezę na 3% zelu agarozowym NuSieve GTG (FMC Bio. Products).

Fragment DNA długości 421 bp wycięto i oczyszczono przy użyciu zestawu Geneclean II według instrukcji producenta. Mieszaninę reakcyjną do PCR zastosowano do klonowania fragmentu DNA do plazmidu pUC19, który trawiono stosując BamHI i HindIII.

Sekwencję DNA plazmidu określano stosując M13 Primer M4 i M13 Primer RV. W wyniku, potwierdzono, ze plazmid ma prawidłową sekwencję. Następnie plazmid trawiono Hindin i Blnl, i wyizolowano fragment DNA wielkości 416 bp przez elektroforezę na 1% zelu agarozowym Fragment DNA oczyszczono stosując zestaw Genecleanll według instrukcji producenta, a następnie wprowadzono do plazmidu CX/pUC, który trawiono HindIII i Blnl Powstały plazmid oznaczono „hMBClLaX/pUC19”. Plazmid ten trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego humanizowany łańcuch L. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu pCOSl, w taki sposób, ze kodon początkowy humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EFla. Otrzymany plazmid oznaczono „hMBClLaλ/pCOSl” Sekwencja DNA (w tym odpowiadająca mu sekwencja aminokwasowa) wersji „a” humanizowanego łańcucha L pokazana jest na Id. Sekw. nr 66. Sekwencja aminokwasowa wersji „a” pokazana jest na Id Sekw. nr 47.

Wersję „b” przygotowano przy użyciu technik mutagenicznego wprowadzania metodą PCR. Wersję „b” zaprojektowano w taki sposób, ze zastępowała aminokwas w pozycji 43, glicynę (aminokwas nr 43 według definicji Kabata) proliną i aminokwas w pozycji 49, lizynę (aminokwas nr 49 według definicji Kabata) kwasem asparaginowym. Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem plazmidu hMBClLak/pUC19 jako matrycy i startera mutagenicznego MBC1LGP5R (Id. Sekw. nr 36) oraz startera MBC1LVS1 Fragment DNA trawiono BamHI i Hindlll, po czym trawiony fragment klonowano w miejsce BamHI-HmdlEI pUC19. Po sekwencjonowaniu, plazmidowy DNA otrzymano przez trawienie HindIII i ΑίΙΠ, zaś powstały fragment poddano ligacji z plazmidem hMBC!La,X/pUC19, który trawiono HindIII i ΑΠΙΙ

Otrzymany plazmid oznaczono „hMBClLbX/pUC19”. Ten plazmidowy DNA trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA obejmującego DNA kodujący humanizowany łańcuch L Fragment DNA wprowadzono do plazmidu pCOSl w taki sposób, ze kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EFla. Otrzymany w ten sposób plazmid oznaczono „hMBClLbX/pUC19”.

190 351

Wersję „c” wytworzono przy użyciu techniki mutagenicznego wprowadzania metodą PCR Wersję „c” zaprojektowano w taki sposób, ze zastępowała aminokwas w pozycji 84, serynę (aminokwas nr 80 według definicji Kabata) proliną. Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem plazmidu hMBC 1 Ln/JpUCl 9 aako matrycy muragrnizrnego MBC1LGP6S (Id. Sekw. nr 37) oraz startera M13 Primer Rv. Fragment DNA trawiono BamHI i HindIII, po czym trawiony fragment klonowano w miejsce BamHI-HindIII pUC19. Po sekwenyjknowsniu, plazmidowy DNA otrzymano przez trawienie BstPI i Akr51HI. Otrzymany plazmid oznaczono „hMBC1Lyλ/pUC19”. Ten plazmidowy DNA trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA obejmującego DNA kodujący humanizowany łańcuch L. Fragment DNA wprowadzono do plazmidu pCOS 1 w taki sposób, ze kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1a. Otrzymany w ten sposób plazmid oznaczono „hMBC1Lc//pCOS1”

Wytworzono również wersje „d”, „e” i „f’ stosując technikę wprowadzania mutagericzsegk metodą PCR. Każdą z wersji „d”, „e” i „f ’ zaprojektowano w taki sposób, aby zastępowała aminokwas w pozycji 91, tyrozynę (aminokwas nr 87 według definicji Kabata) izoleuccną w wersji, odpowiednio, „a”, „b” i „y” Dla każdej wersji „d”, „e” i „f o przeprowadzono reakcję PCR z użyciem plazmidu hMBCHa/l/pUCłO (<1So wrrsi i d), hMBOEbX/pUCi9 (dla wersji e) i hMBClLci/pUCH (dla wersji f) jako matrycy i startera mutagenicznego MBC1LGP11R (Id Sekw. nr 38) oraz startera M-S1 (Id. Sekw nr 44). Po sekwenysonowαniu fragment DNA trawiono BamHI i HindIII, a następnie subklknkwark do pUC19, który był preparowany przez trawienie pUC19 BamHI i HindIII. Po rekwencskrkwaniu, plazmid trawiono HindIII i BlnI, po czym trawiony fragment klonowano w miejsce BamHI-HindIII do plazmidu C//pUC19. Otrzymane wten sposób plazmidy oznaczono. kkdpowiedmo. „hMBC1d//pUC19”, „hMBC1Leλ/pPC19” i „hMBU1Lfλ/pUU19”. Każdy z plazmidów trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego humanizowany łańcuch L Fragment DNA wprowadzono w miejsce EcoRI plazmidu pCOS1 w taki sposób, ze kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położone był poniżej promotora EF1a Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono, odpowiednio, „hMBC1Ld//pCOS1”, „hMBC 1Le//pCOS1” i „hMBC1Lf//pCOS1”

Wytworzono również wersje „g” i „h” stosując technikę wprowadzania mutagenicznego metodą PCR. Każdą z wersji „g” i „h” zaprojektowano w taki sposób aby zastępowała aminokwas w pozycji 36, histedenę (aminokwas nr 36 według definicji Kabata) izoleuceną w wersji, odpowiednio, „a” i „d”. Dla każdej wersji „g” i „h” przeprowadzono reakcje PCR z użyciem plazmidu hMBU1Lαλ/pUC19 jako matrycy ¹ startera mutagenicznego MBC1LGP9R (Id Sekw nr 39) oraz startera M13 Primer Rv. Po sekwenySonowamu fragment DNA trawiono BamHI i HindIII, po czym trawiony fragment klonowano w miejsce BamHI-HindIII C//pUC19 Używając tego plazmidu jako matrycy przeprowadzono reakcję PCR z użyciem startera MBC1LGP13R (Id. Sekw. nr 40) iMBC1LVS1. Otrzymane fragment PCR trawiono ApaI i HindIII i wprowadzono do plazmidów hMBC1La//pUC19 i hMBC1Ld//pUC19, które trawiono ApaI i HindIII. Określono sekwencję DNA otrzymanych plazmidów. Plazmidy o potwierdzonej sekwencji oznaczono, odpowiednio „hMBC1Lg//pUC19” i „hMBC1Lh//pUC19”. Każdy z tych plazmidów trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego humanizowany łańcuch L. Fragment DNA wprowadzono w miejsce EcoRI plazmidu pCOS1 w taki sposób, ze kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1a. Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono, odpowiednio, „hMBC1Lg//-pCOS1” i „hMBC 1Lhλ/pUOSl”

Wytworzono również wersje hnikę otrwiiiar» fooVi

UUVl-> - -----dzania mutagen^nego metodą PCR. Przeprowadzono reakcję PCR z użyciem plazmidu hMBC'’1 Ea/JpUJd 9 ^Εο maCrycy i startia-a muragrmzrneko MBC1LGΡlSS(Id. SeOw. nr41 ) oraz startera V1RV(/) (Id. Sekw. nn 43) Powstały fragment trawiono ApaI i BlnI i klonowano do plazmidu hMBC1Lg//pUC19, który trawiono ApaI i BlanI. Określono sekwencję DNA ktnzcmarcyh plazmidów i selekcjonowano klony, do których wprowadzono mutację. Otrzymane plazmidy oznaczono, odpowiednio, „hMBC1Lx//pUC19 (x= i, j, k, l, m, n albo o)”

190 351

Każdy z tych plazmidów trawiono EcoRI w celu otrzymania fragmentu DNA kodującego humanizowany łańcuch L. Fragment DNA wprowadzono w miejsce EcoRI plazmidu pCOS1 w taki sposób, ze Kodon początkowy dla humanizowanego łańcucha L położony był poniżej promotora EF1a Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono „hMBC1LxZ/pCOS1 (x= i, j, k, l, m, z albo o)” Sekwencje DNA (w tym odpowiadające sekwencje amlzoKąyyowe) wersji ,j”, „l”, „m” i „o” pokazano na, odpowiednio, Id. Sekw. nr 67, 68, 69 i 70, sekwencje aminoKwasowe tych wersji pokazano, odpowiednio, na Id. Sekw. nr 48, 49, 50 i 51.

Wersję „p”, „q”, „r”, „s” i „t” są zmodyfikowaną postacią wersji, odpowiednio, „i”, ,j”, „z”, „l” i „o”, w których aminokwas w pozycji 87, tyrozynę, zastąpiono izoleucyną. Wersje te wytworzono przez zastosowanie miejsca restrykcyjnego Aor51MI w FR3 w celu zastąpienia wersji „h” wersjami „i”, ,j”, „z”, „l” i „o”, w następujący sposób. Z plazmidu ekspresyjnego hMBC1 Εχλ/pCOS 1 (x= i, j, m, 1 afoo o) sunnięto Egzemi yys1yκkvJZvy Aor1 1HI (114 pp) zawierający CDR3, część FR3 i cały FR4. Pozostałą część plazmidu ekspresyjnego poddano ligacji z fragmentem restrykcyjnym Aor51HI (514 bp) zawierającym CDR3, część fR3 i cały FR4 w taki sposób, ze aminokwas w pozycji 91, tyrozynę, zastąpiono izoleucyną (aminokwas 87 w numeracji Kabata). Oznaczono sekwencje powstałych plazmidów i wyselekcjonowano klozv Każdej z wersji „i”, ,j”, „z”, „l” i „o”, w Których aminokwas 91, tyrozynę, zastąpiono izo|yucyzą (aminokwas 87 w numeracji Kabata). Wersje odpowiadające wersjom „i”, ,j”, „m”, „l” i „o” oznaczono, odpowiednio, „p”, „q”, „s”, „r” i „t”, zaś plazmidy dla tych wersji oznaczono, odpowiednio „hMBC1LxZ/pCOS1 (x = p, q, s, r albo t). Sekwencje DNA (w tym odpowiadające iz sekwencje ammokwasowe) wersji „q”, „r”, „s” i „t”, pokazano, odpowiednio, jako Id. SeKw. nr 71, 72, 73 i 74. Sekwencje amiaokwayowe tych wersji pokazano jako, odpowiednio, Id. Sekw. nr 52, 53, 54 i 55.

Plazzid hMBC1EqE/pCOS 1 tyąwtzno HintUII i EcoRI, αι^^ρή e ldznąwzno do pkzzidu pUC19 przez trawienie plazmidu HianIII i EcoRI. Otrzymany w ten sposób plazmid oznaczono „hMBC1LqZ/pUC19”.

Pozycje zastąpionych aminokwasów w każdej z wersji huzyalzcąanygc łańcucha L Kyzαnc w tabeli 3 poniżej

Tabela 3

Wersja	36	43	45	47	49	80	87
1	2	3	4	5	6	7	8
a
b		P			D
c						P
d							I
e		P			D		I
f						P	I
g	Y
h	Y					T i
1	Y		K
J	Y		K		D
k	Y		K	V

190 351 c d tabeli 3

1	2	3	4	5	6	7	8
1	Y		K	V	D
m	Y				D
n	Y		V
0	Y		V	D
P	Y		K				I
q	Y		K		D		I
r	Y				D		I
s	Y		K	V	D		I
t	Y			V	D		I

W powyższej tabeli 3 wielkie litery oznaczają następujące aminokwasy Y tyrozyna; P prolina, K lizyna, V walina, D kwas asparaginowy i I izoleucyna

Szczep E. coli zawierający plazmid hMBC1HcDNA/pUC19 i szczep E coli zawierający plazmid hMBC1Lq^Ap^l^C19 onnaczono „Eccerrichia coli JMK)9 (WBBClHcDNA/pUC19ł” i ,Escherichia coli JM 109 (hMBC1Iqlλ/pUC19) ” i zdenonowono a a asnanach Traktatu Buaapeszteńskiego 15 sierpnia, 1996, w National Institute of B^cience and Humao-teahnology, Agency for Industnal Science and Technology Japonia (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, ibaragi-ken, Japonia), pod numerem dostępu FERM BP-5629 dla Escherichia coli JM109 (hMBC1HcDNA/pUB19) i FERM BP-5630 dla Escherichia coli JM109 (hMBClLqλ/pUC19).

(5) Transfekcja do komórek COS-7

W celu określenia aktywności wiązania antygenu i aktywności neurraliznayjoej przeciwciała hybrydowego i humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1 opisane wyżej plazmidy ekspresyjne poddawano przemijającej ekspresji w komórkach COS-7. W celu przemijającej ekspresji łańcucha ł przeciwciała hybrydowego, każdą z poniższych kombinacji plazmidów knatransfekowano do komórek COS-7 przez elektroporację stosując urządzenie Gene Pulser (Bio Rad):

hMBC1HcDNA/pCOSl ih/iMBSaLGneneo ; MBdHcDNA/pCOSl imhMffiCLLaλ/neo; hMBC1HcDNA/pCOS1 r m/hMBC1LdA/neor hMBB1Laλ/n<n>i hMBClHcDNA/pCOS1 i hmmMBC1L(A )/neo; i hMBB1HcDNA/pBOS1 i mhmMBC1L(λ)/oen. W tym celu, do 0,8 ml zawiesiny komórek, w której komórki COS-7 zawieszono w PBS(-) w gęstości 1x10 ł komórek/ml, dodano 10 μg każdego z plncmlUowyah DNA. Powstały roztwór poddano pulsowi przy napięciu 1500 V i pojemności 2 μF powodując elektroporację. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej komórki zawieszono w pożywce DMEM zawierającej 2% surowicę płodową cielęcą Ultra Low IgG (Gibco), a następnie hodowano stosując 10 cm szalki w inkubatorze CO2 Po hodowli przez 72 godziny, oaUsaco hodowlany zebrano i odwirowano w celu usunięcia resztek komórkowych i dostarczono jako próbkę do testu ELISA.

W celu przemijającej ekspresji humanizowanego przeciwciała #23-57-137-1, kombinację plazmidów (iMBC 1 HcDNA/pCCSS i aktor hM BC1LxA/pCOS 1 pr = a -1i raanffekownno do komórek COS-7 stosując urządzenie Gene Pulser (Bio Rad) w taki sam sposób jak opisany wyżej dla przeciwciała hybrydowego. Otrzymany nasącz hodowlany dostarczono jako próbkę do testu ELISA.

W tej procedurze, oczyszczaolf przeciwciał chimerycznych z nadsączu hodowlanego komórek COS-7 przeprowadzono przy użyciu zestawu Affigel Protein A MAPSII(Bio Rad) według instrukcji producenta.

190 351 (6) Test ELISA (i) Określenie stężenia przeciwciał

Płytkę ELISA do oznaczania stężenia przeciwciał przygotowano w następujący sposób. Studzienki płytki 96-rtudcieokowes do ELISA (Maxisorp, NUNC) pokryto 100 pl roztworu zawierającego kozie przeciwciało przeciwko ludzkim IgG (TAGO) przygotowanym w buforze do pokrywania (0,1 M NaHCO3, 0,02 NaNs) w stężeniu 1 pg/ml, a następnie blokowano 200 pl buforu do rozcieńczania (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA); pH 7,2). Do każdej ze studzienek dodano nad^z hodowlany komórek COS-7, w którym ulegały ekspresji przeciwciała chimeryczne albo oczyszczone przeciwciała chimeryczne w stopniowych rozcieńczeniach. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 100 pl roztworu koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (TAGO). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez godzinę i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 1 mg/ml roztworu substratu („Sigma 104”, kwas p-nitrofenylofosforowy, Sigma). Mierzono absorbancję roztworu przy długości fali równej 405 nm stosując Microplate Reader (Bio Rad). Jako standard stosowano oczyszczane Hu IgG1X, (The Binding Site).

(ii) Określanie zdolności wiązania antygenu

Płytkę ELISA do oznaczania wiązania przeciwciał przygotowano w następujący sposób. Każdą ze studzienek płytki 96-studzienkowej pokryto 100 pl roztworu obejmującego ludzki PTHrP (1-34) (Peptide Research Institute) przygotowanego w buforze o stężeniu 1 pg/ml, a następnie zablokowano 200 pl buforu do blokowania. Do każdej ze studzienek dodano nadsącz hodowlany komórek COS-7, w których wyrażano przeciwciała chimeryczne albo oczyszczone przeciwciała chimeryczne, w stopniowym rozcieńczeniu. Po inkubacji w temperaturze pokojowej i płukaniu PBS-Tween 20, do każdej ze studzienek dodano 100 pl roztworu koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (TAGO). Po inkubacji w temperaturze pokojowej' i płukaniu PBS-Tween 20 do każdej ze studzienek dodano 1 mg/ml roztworu substratu („Sigma 104”, kwas p-nitrofenylofosforowy, Sigma). Mierzono absorbancję roztworu przy długości fali równej 405 nm stosując Microplate Reader (Bio Rad).

(7) Potwierdzenie aktywności (i) Badanie humanizowanego łańcucha H

Stwierdzono, ze przeciwciało obejmujące wersję „a” humanizowanego łańcucha H i chimeryczny łańcuch L wykazuje ten sam poziom aktywności wiązania PTHrP, co przeciwciało chimeryczne (patrz, fig. 5). Wynik ten sugeruje, ze humanizacja regionu V łańcucha H została osiągnięta satysfakcjonująco dzięki wersji „a”. Stąd, wersję „a” humanizowanego łańcucha H dostarczono jako łańcuch H przeciwciała humanizowanego w następującym doświadczeniu (ii) Aktywność przeciwciała hybrydowego (ii-a) Przeciwciało hybrydowe FR1,2/FR3,4

Gdy łańcuchem L był h/mMBC1Ld(L), przeciwciało nie wykazywało aktywności wiązania antygenu. Jednakże, gdy łańcuchem L przeciwciała hybrydowego był m/hMBC1Lak, albo m/hMBC1Ld λ, przeciwciało wykazywało ten sam poziom aktywności wiązania antygenu, co przeciwciało chimeryczne #23-57-137-1 (fig. 6). Wyniki te wskazują, ze FR3 i FR4 są przydatne do przeciwciała humanizowanego, ale istnieje reszta aminokwasową, którą należy zastąpić w FR1 i FR2 (ii-b) Przeciwciało hybrydowe FR1/FR2

Gd

DryGowego był uuuiunBC1L(/v), przeciwciało mc wyΑ/ΓΟΓΊ T SA \

...........iryi I V»-łrł>· iuiivuvnvm JLj p/A £^VV1 »ł C1U1U llj ‘ kazywało aktywności wiązania antygenu. Jednakże, gdy łańcuchem L przeciwciała hybrydowego był hmmMBC1l#U), pzzeciwciało wykazywało ten sam poziom aktywno^cc i wiązania antygenu, co przeciwciało chimeryczne #23-57-137-1 (fig. 7). Wyniki te sugerują, ze FR1 jest przydatny do przeciwciała humanizowanego, ale istnieje reszta (reszty) aminokwasowe, które należy zastąpić w FR2.

190 351 (iii) Aktywność przeciwciała humłnllzowłmego

Przeciwciało humanizowane, w którym jako łańcuch L zastosowano wersje od „a” do „t” badano na aktywność wiązania antygenu W wyniku stwierdzono, ze przeciwciała humanizowane z łańcuchami L wersji J”, „l”, m”, „o”, „q”, „r”, „s” i „t” wykazywały ten sam poziom aktywności wiązania PTHrP, co przeciwciało chimeryczne (fig. 8-11) (8) Ustaleme stabilnie transformowanej Unii komórkowej CHO

W celu ustalenia stabilnych transformantów dla przeciwciała chimerycznego, opisany wyżej plazmid ekspresyjny wprowadzono do komórek CHO (DXB11)

Ustalenie stabilnych traneformαntów przeciwciała chimerycznego przeprowadzono przy użyciu kombinacji plazmidów ekspresyjnych komórek CHO, hMBC1HcDNA>'pCHO1 i hMBClLmk/pCOS1; hMBC1HcDNA)pCHO1 i hMBC1Lqk/pCOSl; iMBBC lHcDNA/pCHO1 i hMBC1L^/pCOS1. Te kombinacje plazmidów kotranefekowano pojedynczo do komórek CHO metodą rleetroporacJl stosując Gene Pulser (Bio Rad). Każdy z wektorów ekspresyjnych cięto enzymem restrykcyjnym PvuI w celu otrzymania liniowego DNA. Powstały DNA zbierano przez ekstrakcję fenolem i chloroformem, a następnie prrcypitację etanolem. Wytworzone w ten sposób plazmidy ekeprescjnr poddano elretroporacjl. 10 pg każdego z plazmidowych DNA dodano do 0,8 ml zawiesiny komórek zawierającej komórki CHO w PBS(-) w gęstości 1x10⁷ komórek/ml. Powstałą mieszaninę poddano pulsowi o napięciu 1500 V i pojemności 25 pF. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej komórki zawieszono w pożywce MEM-α (Gibco) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco). Powstałą zawiesinę hodowano w trzech płytkach 96-studzienedwcch (Falcon) w inkubatorze CTT Następnego dnia po rozpoczęciu hodowli, pożywkę zastąpiono pożywką wybiórczą (pożywka MEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco) i 500 pg/ml grnrtcccnc (siarczan G418, Gibco) bez rybonukleozydów albo dezoksyrybonuk^^i^^w Po zastąpieniu pożywki selektywnej świeżą pożywką, przed i po dwóch tygodniach hodowli komórki obserwowano pod mikroskopem. Gdy zaobserwowano wzrost komórek komórki badano na ilość wytwarzanych przeciwciał w teście ELISA. Wśród komórek zebrano wybiórczo te, które wytwarzały większe ilości przeciwciał.

Skalowanie w górę hodowli stabilnych traneformantów dla ustalonych przeciwciał przeprowadzono w butelkach obrotowych stosując pożywkę MEM z dodatkiem 2% płodowej surowicy cielęcej Ultra Low IgG1 bez rcbonuklrozcdów i dezokeyrybonuklrozcdów. 3 i 4 dnia hodowli, nadsącze hodowlane zebrano i filtrowano przez 0,2 pm filtr z hodowli (Milliporr) w celu usunięcia resztek komórkowych. Następnie, przeprowadzono oczyszczanie przeciwciał chimerycznych z nadsączu hodowli komórek CHO przy użyciu kolumny Poros Protein A Column (PerSeptive Bioscetems) na ConSrp LC100 (Millipore) według instrukcji producenta. Oczyszczone przeciwciała chimeryczne dostarczono jako próbki do określenia aktywności neutralizującej oraz do bedanie skuteczności hiprrkalcrmicznego modelu zwierzęcego. Stężenie i aktywność wiązania oczyszczonych przeciwciał chimerycznych przeciwko antygenowi określono tym samym układem ELISA.

Przykład 4

Określanie aktywności neutralizującej

Określenie aktywności neutralizującej przeciwciała mysiego, przeciwciała chimerycznego 1 przeciwciała humanizowanego przeprowadzono przy użyciu komórek linii ezpiczekα szczurzego ROS17/2.8-5. Komórki ROS17/2,8-5 hodowano w pożywce Ham'aF-12 (Gibco) z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (Gibco) przy użyciu inkubatora CO2. Komórki ROS17/2.8-5 zaszczepiono do każdej ze studzienek płytki 96-etudzienkoweJ w gęstości eomórele)1ÓÓ pl/studzienkę i hodowano przez 1 dzień Pożywkę hodowlaną zastąpiono pożywF 1 i Gi.’c x - x

o) ) z dcdaeklnm 4 ιμΠ yyroekGlcyznuu 1 10θ)ι srtHvCcy łoodGWCj ciclcze’ , Po hodowaniu przez 3 do 4 dni, komórki płukano 260 pl pożywki Ham'a F-12 (Gibco), a następnie dodano 80 pl pożywki Ham^ F-12 z dodatkiem 1 mM izdbutclo-1-mrtcldkeantync (IBMX, Sigma), 10% surowicy płodowej cielęcej i 10 mM HEPES Powstałą mieszaninę inkubdweno w 37°C przez 30 minut.

Przeciwciało mysie, przeciwciało chimeryczne i przeciwciało humanizowane badane na aktywność neutralizującą uprzednio rozcieńczono w następujących grupach: [10 pg/ml,

Iz o U o rv» ’ o X XCX1XA XX

190 351

3,3 gg/ml, 1,1 gg/ml i 0,37 gg/ml], [10 gg/ml, 2 gg/ml, 0,5 gg/ml i 0,01 gg/ml] oraz [10 gg/ml, 5 gg/ml, 1,25 gg/ml, 0,63 gg/ml i 0,31 gg/ml] Każdą z rozcieńczonych próbek przeciwciała zmieszano z równoważną objętością 4 ng/ml PTHrP (1-34) 80 gl powstałego roztworu dodano do Każdej ze studzienek. Stężenie Końcowe Każdego z przeciwciał stało się ćwiartką stężenia powyższego przeciwciała, zaś stężenie PTHrH (1-34) wyniosło 1 ng/ml. 10 minut po traktowaniu w temperaturze pokojowej, nadsącze hodowlane pobrano, zaś pozostałość płukano PBS trzykrotnie. Z powyższego, ekstrahowano cAMP z komórek przy użyciu 10 gl 0,3% HHC-95% etaaolu, a nnstępme obdarowóso ppzz uuyciu uurzdhema wwaeer et aapirator w celu usunięcia HCL-etanolu Pozostałość rozpuszczono w 120 gl buforu EIA dołączonego do zestawu cAMP EIA (Cayman Chemical's) w celu ekstrahowania cAMP. Poziom cAMP ozosczsob przy użyciu zestawu cAMP EIA Kit (Caym^ Chemicals) według instrukcji producenta. W wyniku stwierdzono, że wśród przeciwciał humanizowanych posiadających wersje łańcucha L wykazujących ten sam poziom aktywności wiązania antygenu, co przeciwciało chimeryczne, te, Które posiadają wersje łańcucha L „q”, „r”, „s” i „t”, w Których tyrozynę w pozycji 91 zastąpiono izoleucyną, wykazywały aktywność neutralizującą najbliższą z aktywnością przeciwciała chimerycznego, a zwłaszcza te o wersji łańcucha L „q” wykazywały najsilniejszą aktywność neutralizującą (fig. 12 do 14).

Przykład 5

Badanie skuteczności farmakologicznej na modelu zwierząt z hiperKalcemią.( 1)

Przy użyciu modelu zwierzęcego hlpnzKalcnmll (ludzkiego nowotworu prznszcznplbongo na mysz nagą) badano skuteczność terapeutyczną wobec hiperkalcnmll przeciwciał przeciwko PTHrP chimerycznych i humanizowanych o łańcuchu L wersji „m”, „r” i „q”.

Jako model zwierzęcy hlperkslcemil zastosowano myszy nagie, którym przeszczepiono ludzkiego raka trzustki PAN-7 (zakupione z Central Institute for Experimental Animals). Wiadomo, ze myszy nagie, Którym przeszczepiono ludzkiego raka trzustki PAN-7 wykazują zwlększbon stężenie wapnia we krwi w miarę powiększania się wielkości guza i rozwija się hiperKalcnmls, Której towarzyszy, przykładowo, zmniejszenie ciężaru ciała i spontaniczna aktywność. W tym przykładzie, efekt terapeutyczny przeciwciała chimerycznego i przeciwciała humanizowanego według wynalazku wobec hipnzKalcnmll wywołanej przez ludzkiego raka trzustki PAN-7 badano przez pomiar ciężaru ciała i stężenia wapnia we krwi zwierząt badanych

Pasaż ludzkiego raka trzustki PAN-7 przeprowadzono z użyciem BA-BZc-nu/nu (Nippon Charles River) in vivo. Do badania skuteczności farmakologicznej zakupiono 5-tygodmbwn samce myszy BALB/c (Nippon Charles River) i aKllmatyzbwano je przez tydzień, i gdy osiągnęły wiek 6 tygodni przygotowano je do doświadczenia. Model hiperKalcemii u myszy wytworzono i podzielono grupy w następujący sposób. Pasazowmy raK trzustki PAN-7 wycięto, a następnie pocięto drobno na 3 mm Kostki. Powstałe fragmenty nowotworu wtzczeplbob podsKórnie myszom w ilości jednego na mysz. Dwa do trzech tygodni po przeszczepie, gdy potwierdzono, ze objętość guza u każdej z myszy stała się wystarczająco duża, uśzehnibob stężenie wapnia we krwi i ciężar ciała u poszczególnych grup, zaś myszy zastosowano jako model zwierzęcy hiperkalcemii.

Badanie skuteczności terapeutycznej wobec hiperKalcemii przeprowadzono w następujący sposób. Każdej z myszy hipnrkalcnmiczoych pbhsob przez żyłę ogonową pojedynczą dawkę przeciwciała chimerycznego albo przeciwciała humanizowanego o wersji łańcucha L „m” albo „r”, przeciwko PTHrP pohaob w ilości 10 do 30 gg na mysz. Pojedynczą dawkę przeciwciała humanizowanego z łańcuchem L w wersji „q” podawano każdej z hipnrkalcnmicznych myszy w dawce 20 albo 60 gg na mysz. W dniu 1, 4 albo 7 oraz 11 po pbhsolk każdej z myszy zmierzono stężenie wapnia we Krwi i zbadano ciężar ciała, w celu zmierzenia skuteczności fszmaKblogicznee przeciwciał. Objętość guza oznaczono przez pomiar średnicy większej (a mm) i średnicy mniejszej (b mm) guza i obliczenie z użyciem obu średnic, według równania Galanfa [ab2/2]. Stężenie wapna we krwi obliczono jaKo stężenie wapnia zjonlzowaoego we krwi pełnej przez pobranie krwi od każdej z myszy przez splot oczodołowy, stosując probówkę i umieszczając próbkę w automatycznym urządzeniu 643 Automatic Ca2+/pH ιοι^ζ (CIBA-CORNING).

190 351

W wyniku stwierdzono, ze podawanie przeciwciała chimerycznego i przeciwciał huzanizowaavch o , wersjach łańcucha L „z”, „r” i „q”, prowadzi do gwałtownej poprawy w odaiesiyniu do ciężaru ciała i stężenia wapnia we krwi oraz do długotrwałej poprawy stanu pacjenta. Wynik ten pokazuje, ze przeciwciała chimeryczne i humanizowane według wynalazku są przydatne do leczenia hipyrkαlcemi towarzyszącej nowotworom (patrz, fig. 15 i 16).

Przykład 6

Badanie skuteczności farzaKologicznej na zwierzęcym modelu hiperkalcymii (2)

Stosując zwierzęcy model hipyrkalcemil (ludzki nowotwór przeszczepidav na mysz nagą), przeciwciało chimeryczne i humanizowane z wersją „q” łańcucha L przeciwko PTHrP badano pod względem ich skuteczności terapeutycznej wobec hlpyrkalcemil w następujący sposób.

Badanie skuteczności terapeutycznej wobec hlpyrkalcemii przeprowadzono w następujący sposób. Każdej z myszy z modelem hiryrkalcymii podano pojedynczą dawkę przeciwciała chimerycznego albo humanizowanego z wersją „q” łańcucha L przeciwko PTHrP, przez żyłę ogonową w dawce 10 albo 30 pg/mysz. W dniu 1, 3, 7 i 11 po podaniu, krew każdej z myszy badano pod względem stężenia wypzia i badano ciężar ciała w celu stwierdzenia skuteczności farmykcldgiczaej przeciwciał. Stężenie wapnia we krwi obliczono jako stężenie wapnia zjozlzoąαaygd w krwi pełnej przez pobranie krwi od każdej z myszy przez splot oczodołowy; stosując probówkę i umieszczając próbkę w automatycznym urządzeniu 643 Automatic Cy2/rH an^zer (CIBA-CORNING).

W wyniku stwierdzono, ze w zwierzęcym modelu hiperkalcemii z ludzkim rakiem trzustki PAN-7, podawanie przeciwciała chimerycznego albo humanizowanego z wersją „q” łańcucha L prowadzi do gwałtownej poprawy w odniesieniu do ciężaru ciała i stężenia wapnia we krwi oraz do zachowania poprawy stanu osobnika przez czas dłuższy. Wynik ten pokazuje, ze przeciwciała chimeryczne i humanizowane według wynalazku są przydatne do leczenia hiperkalcemi towarzyszącej nowotworom (patrz, fig. 17).

Przykład 7

Badanie skuteczności farzaKologicznej na modelu zwierząt z hiperkalcemią(3)

Przy użyciu modelu zwierzęcego hiperKalcemii (ludzkiego raka płuc LC-6 przeszczepionego na zysz nagą) badano skuteczność terapeutyczną wobec hiperkalcemii przeciwciał chimerycznych i humanizowanych o łańcuchach L wersji „q” przeciwko PTHrP.

JaKo model zwierzęcy hiperkalcemii zastosowano myszy nagie, którym przeszczerionc ludzkiego raka płuc LC-6 (zakuploay z Central Irnstitute for Experimyatαl Animals) Wiadomo, ze myszy nagie, którym przeszczepicac ludzkiego raKa płuc LC-6 wykazują zwiększone stężenie wapnia we krwi a w miarę powiększania się wielkości guza rozwija się hiperkalcemia, której towarzyszy, przykładowo, zmniejszenie ciężaru ciała i spdatynlczaa aktywność

W tym przykładzie, efekt terapeutyczny przeciwciała chimerycznego i przeciwciała humanizowanego według wynalazku wobec hipyrkalcyzii wywołanej przez ludzkiego raka płuca LC-6 badano przez pomiar ciężaru ciała i stężenia wapnia we krwi zwierząt badanych.

Pasaż ludzkiego raka płuc LC-6 przyrrcąanzcao z użyciem BALB/c-nu/nu (Nippoz Charles River) in vivo. Do badania skuteczności farmakologicznej zakupioad r-tvgonnldwe samce myszy BALB/c Charles River) i aklizatyzdwαao je przez tydzień, i gdy osiągnęły wiek 6 tygodni przygotowano je do doświadczenia. Model hiperkalcemii u myszy wytworzono i podzielono grupy w następujący sposób. Pyyαżowαay raK płuc LC-6 wycięto, a następnie rccięto drobno na 3 mm Kostki. Powstałe fragmenty nowotworu wszczepiono podskórnie myszoz w ilości jednego na mysz. Dwa do trzech tygodni po przeszczepie, gdy potwierdzono, ze objętość guza u Każdej z myszy stała się wystarczająco duża, uśredniono stężenie wannia we krwi i ciężar ciała u poszczególnych σηιη zaś mvszv zastosowano lako ν ΐ u i^-------σ---j--- X ’ — ~ ---j--j — ---- — ~ j --model zwierzęcy hirerkalcymll.

Badanie skuteczności terapeutycznej wobec hiperkalcymii przeprowadzono w następujący sposób. Każdej z myszy hipyrkαlcyzlrzaych podano przez żyłę ogonową pojedynczą dawkę przeciwciała chimerycznego albo przeciwciała humanizowanego o wersji łańcucha L „q”, przeciwko PTHrP w ilości 10 albo 30 pg na mysz. W dniu 1, 3, 6 albo 10 po podaniu każdej z myszy zmierzono stężenie wapnia we krwi

190 351 i zbadano ciężar ciała, w celu zmierzenia skuteczności farmakologicznej przeciwciał. Stężenie wapnia we krwi obliczono jako stężenie wapnia zSooizowanego w krwi pełnej przez pobranie krwi od każdej z myszy przez splot oczodołowy, stosując probówkę i umieszczając próbkę w automatycznym urządzeniu 643 Automatic Ca2+/pH analyzer (CIBA-CORNING).

W wyniku stwierdzono, ze podawanie przeciwciała chimerycznego i przeciwciał humanizowanych o wersji łańcucha L „q”, prowadzi do gwałtowanej poprawy w odniesieniu do ciężaru ciała i stężenia wapnia we krwi oraz do długotrwałej poprawy stanu pacjenta. Wynik ten pokazuje, że przeciwciała chimeryczne i humanizowane według wynalazku są przydatne do leczenia hiperkalcemii towarzyszącej nowotworom (patrz, fig. 18).

Przykład 8

Analiza kinetyczna oddziaływania pomiędzy PTHrP i przeciwciałem przeciwko PTHrP przy użyciu BIACORE

W tym doświadczeniu przeprowadzono analizę kinetyczną oddziaływania antygenprzeciwciało przy użyciu BIACORE PTHrP(1-34+Cys) zastosowano jako antygen i adsorbowano na końcówce czujnika swoistego dla końców C. Oczyszczone przeciwciała o różnych stężeniach zastosowano jako próbkę analityczną· Z otrzymanego reosorogramu obliczono parametry kinetyczne (stałą wiązania „Kass” i stałą dysocSaśJi „1^”) W odniesieniu do analizy kinetycznej, jako odnośnika użyto literatury „Kinetic analysis of monoclonal antibodyαotlgeo ioteraśtioor with a new bioreoror based analytical system” Karlsson i in., (1991) J Immunol Methods 145.229-240.

(1) Unieruchamianie PTHrP(1-34+C) na końcówce czujnika

PTHrP(1-34+C) adsorbowano na końcówce czujnika CM5 (Pharmacia)

Jako bufor roboczy, zastosowano HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 0,15 M NaCl; 3,4 mM EDTA; 0,005% Surfactant P20) przy przepływie 5 pl/mm. Grupy karboksylowe karboksymetylodekstranu na końcówce czujnika CM5 aktywowano przez wstrzyknięcie 100 pl 0,05 M Nhydroksyrukcynimldu (HNS)/0,2 M chlorowodorku N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) i wstrzyknięcie 100 pl 80 mM 2-(2-pirydyoylotio)etanammy (PDEA)/0,1 M buforu boranowego (pH 8,5) i dodatkowo wstrzyknięcie 10 pl 5 pg/ml PTHrP (1-34+C)/10 mM bufor octanu sodu pH 5,0) w celu adsorbowania końców C PTHrP(1-34+C) swoiście na resztach Cys. Następnie, wstrzyknięto 100 pl 50 mM (L)-cysteiny/l M NaCl/0,1 M bufor mrówczanu sodu (pH 4,3) w celu zablokowania nadmiernie aktywnych grup. Następnie, wstrzyknięto 10 pl 0,1 M buforu glicyny-HCl (pH 2,5) i 10 pl 10 mM HCL w celu wypłukania substancji związanych nie kowalencyjnie. Ilość unieruchomionego tak PTHrP(1-34+C) wyniosła 226,4 RU (jednostek rezonansu) (patrz, fig. 19).

(2) Oddziaływanie pomiędzy unieruchomionym PHHrP(1-34+C) i oczyszczonym mysim przeciwciałem przeciwko PTHrP

Jako bufor roboczy zastosowano HBS przy przepływie 20 pl/mmutę. Hybrydoma wytwarzające przeciwciała wstrzyknięto do jamy otrzewnej myszy Balb/c i po kilku tygodniach zebrano płyn wysiękowy i wprowadzono do kolumny z białkiem A w celu oczyszczenia przeciwciał. Oczyszczone przeciwciało #23-57-137-1 oznaczono „MBC”, zaś oczyszczone przeciwciało 3F5 oznaczono „3F5” Przeciwciała te rozcieńczono HBS w szeregu stężeń wynoszących 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 pg/ml.

Podczas analizy 40 pl roztworu przeciwciała wstrzykiwano przez 2 minuty otrzymując fazę wiązania, a następnie przez 2 minuty wstrzykiwano HBS otrzymując fazę dyrocJaśsi· Po zakończeniu dyszcJaśSl, w celu oczyszczenia końcówki czujnika wstrzykiwano 10 pl, 10 mM HCl Analizę przeprowadzono przy zastosowaniu tego cyklu wiacania-dysośJacJi-oczyszczania i wstrzykiwano różne roztwory przeciwciała otrzymując reororogram.

V»U111V )mi

DTEJ-D/I iluonylii i lHU^r

O — C) i uczyszczony!

U,, humamzowanym przeciwciałem przeciwko PTHrP

Jako bufor roboczy zastosowano HBS przy przepływie 20 pl/mmutę. Przeciwciało wytworzono w komórkach CHO oczyszczono na kolumnie z białkiem A. Oczyszczone przeciwciało chimeryczne oznaczono „chMBC”, zaś uczyrcścooe przeciwciała wersji m i q oznaczono, odpowiednio, „hMBCm” i „hMBCq”. Przeciwciała te rozcieńczono HBS w szeregu stężeń wynoszących 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 pg/ml.

190 351

Podczas analizę 40 pl roztworu przeciwciała wstrzykiwano przez 2 minuty otrzymując fazę wiązania, a następnie przez 2 minuty wstrzykiwano HBS otrzymując fazę dysoySacJi. Po zakończeniu derocjaySi, w celu oczyszczenia końcówki czujnika wstrzykiwano 10 μΐ 10 mM HCl. Analizę przeprowadzono pnzę zastosowaniu tego cyklu wiązania-dęskCsayJi-kczyszyzania i wstrzykiwano różne roztwory pnzeciwciała otrzymując sensorognsm.

(4) Analiza kinetyczna oddziaływania

Plik mtenesująyeyh danych odczytano i przepnowadzono porównanie wzorców reakcji przez nałożenie interesujących regionów reakcji (fig. 20-24). W każdej z fig. 20-24, linie kolejno oznaczają od górę dane dla stężeń przeciwciał równych 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 μg/ml. Dalej, przeprowadzono analizę kinetyczną oddziaływania stosując oprogramowanie do analizy przeznaczone specjalnie dla BLACORE „BIAevαluatikr 2 1” (Pharmayia), które pozwala obliczyć parametry kinetyczne (stałą wiązania „km” i stałą derkySscJi „kam”) przez cięcie krzywej (tab 4 i 5)

Tabela 4

Parametry Kinetyczne MBC i 3F5

	MBC	3F5
kum [1/s]	7,38x10 5	1,22x10'2
km [1/Ms]	7,23x105	6,55x105
KD [M]	1,02x10’°	1,86x10^s

Tabela 5

Parametry Kinetyczne przeciwciał humanizowanych l chimerycznych

	yhH-yh/	hMBCm	hMBCq
1^ [1/s] (xl0⁴)	1,66	3,160	2,32
Kas [1Ms] (x10⁶)	1,24	0,883	1,03
KD [M] (x10·¹⁰)	1.34	3,580	2,25

W tym doświadczeniu, w celu określenia stałej wiązania zastosowano model analizę typu 4 (BIAevaluation 2,1 Software HandtOok, A1-A5).

Przykład 9

Zahamowanie wydzielania fosforu w modelu hiperkalcemii towarzyszącej nowotworom

Hiperkalyemia związana z nowotworem (HHM) jest chorobą spowodowaną obenością PTHnP i jak wiadomo PTHnP przyspiesza nesorpcSę kości i rerorpySę wapnia w nerkach i kanaliku, yo powoduje rozwój hiperkalyemii. Z drugiej stronę, w odniesieniu do fosforu, PTHrP hamuje neskrpyJę fosforu w nerkach i kanaliku nerkowym powodując powstanie działania eliminującego, a w ten sposób pacjenci z klinicznym HHM często rozwijają hipkfkrfαtemię. Badano wpływ humanizowanego przeciwciała przeciwko PTHnP na wydzielanie fosforu w nerce, pnzę użyciu szczurzego modelu hiperkalyemii towarzyszącej nowotworowi złośliwemu

Jako model zwierzęcy, zastosowano szczury nagie, którym wrzyzepikro ludzkiego naka płuca LC-6 (zakupione z Central Institute fon Experimental Animals). Wiadomo, ze szczury nagie, którym przeszczepiono ludzkiego naka płuc LC-6 wykazują zwiększone stężenie wapnia we krwi w miarę powiększania się wielkości guza i rozwija się hiperkalyemis, której towarzyszy, przykładowo, zmniejszenie ciężaru ciała i spontaniczna aktywność. Stosując ten model zwierzęcy badano wpływ humanizowanego przeciwciała przeciwko PTHrP według

190 351 wynalazku na wydzielanie fosforanu w nerkach, metodą klirensu nerkowego opartego na frakcjonowanym wydzielaniu fosforanu.

Pasaż ludzkiego raka płuc LC-6 przeprowadzono z użyciem BALB/c-ou/ou (Nippon Kurea) ir vivo. Do badania skuteczności farmakologicznej cnkupinoo 5atygnUoiowf samce szczura F344N/Jal-rou (Nippon Kurea) i aklimatyzowano je przez tydzień, i gdy osiągnęły wiek 6 tygodni przygotowano je do doświadczenia

Model hiperkalcemii towarzyszącej nowotworom u szczurów wytworzono w następujący sposób. Pasażowany rak płuc LC-6 wycięto, a następnie pocięto drobno na 3 mm kostki. Powstałe fragmenty nowotworu wszczepiono podskórnie szczurom w ilości jednego na szczura Około 30 dni po przeszczepie, gdy potwierdzono, że objętość guza u każdej z myszy stała się wystarczająco duża (3000 mm³) potwierdzono u szczurów istnienie hiperkalcemii towarzyszącej nowotworom złośliwym w oparciu o stężenie wapnia we krwi i ciężar ciała

Badanie skuteczności terapeutycznej wobec hiperkalcemii przeprowadzono w następujący sposób (1) Metoda klirensu nerkowego

Zwierzęta z modelem hiperkalcemii związanej z nowotworem złośliwym coifczulnoz przy użyciu pfotzbarbitalu (Nembutal, Dainippon Pharmaaeurianl Co., Ltd) umocowano na podgrzewanej macie w temperaturze 37°C i wprowadzono im cewnik (rurka polietylenowa, PE50, Nippon Becton Dickmson) do pęcherza w celu pobrania moczu. Następnie, zwierzęciu wprowadzono cewnik (rurka polietylenowa, PE10, Nippon Becton Dickinson) do żyły udowej, a następnie wprowadzono roztwór infuzyjny (0,7% inulina, 5% mnoltnl, 0,2% pentnbnrbital i 0,9% chlorek sodu) przy przepływie 2 ml/godzinę przez pompę iofuzyjoa (pompa strzykawkowa Tfrufusino; sTC-525; Terumo). Po zrównoważeniu przez 50 minut, pobierano mocz pięciokrotnie w odstępach 20-mloutzwyah (tj. od okresu 1 do okresu 5) otrzymując próbki moczu. W pośrednim punkcie czasu podczas pobierania moczu pobrano około 0,25 ml krwi z żyły szyjnej przy użyciu hfparyniznwanęj strzykawki.

(2) Podawanie przeciwciała

W trakcie testu klirensu, w punkcie czasowym, kiedy rozpoczęto 2 okres pobierania moczu, dożylnie podano zwierzęciu humanizowane przeciwciało przeciwko PTHrP w dawce 1 mg/ml/kg (3) Ozsnczaoif stężenia inuliny i fosforu w moczu i krwi

Próbki moczu otrzymane od okresu 1 do 5 mierzono pod względem ich objętości, a następnie określano ich stężenie inuliny i fosforu. Próbki krwi otrzymane jak to opisano wyżej poddano wirowaniu z chłodzeniem w celu otrzymania próbki osocza, którą zastosowano do określania stężenia inuliny i fosforu w osoczu. Oznaczania inuliny przeprowadzono metodą antrzoz-slnrcznou (Roe i in., J. Biol. Chem. 178, 839-845, 1949) zaś ocoaczeoie fosforu przeprowadzono na urządzeniu Hitachi Automalc Analyzer model 7170 z oUac,yIlmkifm do oznnccanla fosforu nieorganicznego, Autosera IP (Danchi Pure Chemicals) zgodnie z podręcznikiem (metodą Ph^sl^-SabaioNa).

(4) zbliccasie klirensu inuliny, fosforu i frakajnnnwnoego wydalania fosforu

Klirens inuliny (Cin), klirens fosforu (Cp) i frakajooowanf wydalanie fosforu obliczono według następującego wzoru.

Obliczanie klirensu inuliny (Cin)' cin = Uin V/Pin gdzie Cin ozoacon klirens inuliny (ml/kg/min); Uin ocoaaon stężenie inuliny w moczu (mg/ml), V oznacza ilość moczu na jednostkę czasu (ml/kg/min); zaś Pin oznacza stężenie mulmy we krwi (mg/ml).

Ohllacaoif klireosu fosforu (Cp)'

Cp = Up V/Pp gdzie Cp zzoaacn klirens fosforu (ml/kg/min); Up oznacza stężenie fosforu w moczu (mg/ml), V zcoaaza ilość moczu na jednostkę czasu (ml/kg/min); zaś Pp ocoaccn stężenie fosforu we krwi (mg/ml)

Obliczanie frakajnnowaofgo wydalania fosforu (FEp):

FEp = Cp/Cm

190 351 gdzie FEp oznacza frakcJnonwaae wydzielanie fosforu; Cio oznacza ΟΗοΌδ muliny, zaś Cp oznacza klireos fosforu Badanie przecrnwadenon na czterech zwierzętach. Wyniki ozoacznon jako średnią ± błąd standardowy

Wyniki frakcjnnnwaaegn wydalania fosforanów i stężenia fosforanów we kowi pokazano oa fig. 25 i 26

Figuoa 25 stanowi wykres ilustrujący zalezoość fOaOcjooowane/o wydalania fosforu (klioens fosfooc/klirens inuliny) w stosunku Co okresów Olireosu (1 okoes = 20 minut). Humaarznwane crzeciwciałn pozehi_kn PTHrP (1 mg/kg) cndaan (i.v.) w czasie rozpoczęcia okresu 2.

Figura 26 stanowi wykres pokazujący zależność stężenia fosforu w osoczu w stosunku do okresów Olireosu (1 okres = 20 miout). Humanizowane przeciwciało przeciwko PTHrP (1 mg/Og) podawano (i v.) w czasie rozpoczęcia okresu 2.

Na podstawie tych wyników stwierdzono, ze fraOcJnynwaoe wydalanie fosforu po cnaaoru przeciwciała (tj. od okresu 2 Co okresu 5) było wyraźnie zahamowane w cnrówaaaru z wydalaniem przed pnaaaiem przeciwciała (tj. w okresie 1). Iooymi słowy, stwierdzono, ze podanie przeciwciała neutralizującego osobnikowi rozwijającemu hiceofnsfatemlę, która prowadzi do przyspieszema wydalania fosforu (FEp > 0,2) przywraca wydalame fosforu u osobnika do poziomu ebJlenyegn Co normalnego (frakcjonowane wydalanie fosforu = 1-EFp > 0,8%) i w wyniku prowadzi do anrmaJizacJi stężenia fosforu we kowi obserwowane/o osobnika. Wyniki te sugerują precaatonść przeciwciał według wynalazku aakn czynnika leczącego przyspieszone wydalanie fosforu i hlceofnsfatemrr spowodowanej obecnością PTHrP.

Ponieważ PTHrP jest substratem pnwnauaąccm hrcerkalhemrę towarzyszącą rom złośliwym, można przewidzieć możliwość zwiększenia wydalania fosforu i zmniejszenia _CsnOnenergetccenegn fosforu w tkaoOach scnwnanwaaegn przez PTHrP. Tak więc, uważa się ze różne stopnie choroby związanej z hipnfnsfatemią, takich jak kozc_rha hrcnfnsfate[οιζοα i krzywica oporna na witaminę D, scnwnanwaoe są głównie przez wzrost wydalania fosforu z moczem, a stąd przeciwciała wedłu/ wynalazku cnwloay być przydatne do leczenia tych chorób.

Przykład 10

ZmyreJseeole różnych objawów klmlczocch hicerkalhemii związanej z onwnt_noami

Wiadomo, że hiperkalcemia związana z on_ntwnraml scn_ndn_ana jest obecnością PTHrP, który jest wytwarzany przez onwnt_ór ooaz, ze PTHoP crzyscresea resnoccJę kości i κ^φ^ wapoia w nerkach i kanalikach nerkowych, prowadząc Co hiperOaJhemir. Dalej, c pacjenta hleφlącegn oa Ciceokalcemię obserwuje się objawów klrniheochh, takich jak słaby stao n/ólyc, utrata przytomności, ogólne osłabienie, hcdrocsaa, nudności i wymioty (aonreOsJa). Wpływ przeciwciała przeciwko PTHrP na te objawy ΟΕο^οϊ badano stosując zwierzęcy model hlcerkalhemii w Układzie ludzkiego przeszczepionego na mysz oagą i onwnt_nou ludzOregn przeseheecrnnegn na szczura nagie/o.

Podobnie jak w zwierzęcym modelu hiperkalcemii, zastosowano mysz nagą i szczura οα/ιϊ/^ oa które przeszczepia się ludzkiego raka płuca LC-6 (zakupione z Central Institute for Expeoimeatal Aaimals). Myszy nagie i szczury oa/ie, aa które przeszczepia się ludekiegn oaOa płuc LC-6 wykazują zwiększone stężenie wapoia we kowi woaz ze zwiększeniem objętości guza, prowadząc do hiperkalcemii związanej ze zmniejszeniem temperatury ciała i ciężarem ciała

Polepszający efekt przeciwciał przeciwko PTHrP na n/óJae nbaa_c hrcerOaJhemri związanej z nowotworem badano stosując układ przeszczepiania ludzCie/o oaOa płuca LC-6 aa mysz oa/ą, zaś wymiCi ^Ο^αμ fotograficznie. Wpływ przeciwciała oa poprawę aktywności spontanicznej, temperatury ciała i anoreksji baaaon stosując układ przeszczepiania luaekiegn raka płuca LC_-6 oa mysz na/ą,

Zmmejseeore objawów kJiaiceoccC związanych z hiperOalcemią

Pasaż ludekiegn raka płuc LC-6 creecrowadznnn z użyciem BALB/c-ou/au Charles Rrver) in vivo. Do badania skuteczności farmaknJn/iczaea zakupiono 5-ty/ndarnwe samce myszy BALB/c (Nlpcna Charles River) i akJimatyenwaan je przez tydzień, i gdy osiągnęły wiek 6 coec/ntnwaan je do doświadczenia.

190 351

Model hiperKalcemii u myszy wytworzono i pbdzinlbob grupy w następujący sposób. Pssszowsoc rak płuc LC-6 wycięto, a następnie pocięto drobno na 3 mm kostki. Powstałe fragmenty nowotworu wszczeplbnb podskórnie myszom w ilości jednego na mysz. Dwa do trzech tygodni po przeszczepie, gdy potwierdzono, ze objętość guza u Każdej z myszy stała się wystarczająco duza, uśredniono stężenie wapnia we Krwi i ciężar ciała u poszczególnych grup, zaś myszy zastosowano jako model zwierzęcy hlperkalcnmll.

Objętość guza oznaczono przez pomiar średnicy większej (a mm) i średnicy mniejszej (b mm) guza i obliczenie z użyciem obu średnic, według zdwosoia Galanfa [ab²/2].

Stężenie wapnia we Krwi obliczono jako stężenie wapnia zebnizowsnego w Krwi pełnej przez pobranie krwi od każdej z myszy przez splot oczodołowy, stosując probówkę i umieszczając próbkę w automatycznym urządzeniu 643 Automatic Caa⁺/pH s/sIcz^z (CIBACORNING)

Badanie skuteczności terapeutycznej przeciwciała oa hiperkalcemię przeprowadzono w następujący sposób Przeciwciało mysie przeciwko PTHrP podawano każdej myszy żyłą ogonową w dniu 27, 30, 34 i 37 po przeszczepieniu nowotworu w ilości 100 (ig/mysz. W celu wytworzenia Kontroli, zamiast przeciwciała podawano sól fizjologiczną w teo sam sposób. W 41 dniu po przeszczepieniu nowotworu, z Każdej grupy przyjmującej przeciwciało i grupy Kontrolnej wybrano typową mysz i wcKooaob jej zdjęcie wraz z myszą normalną.

W wyniku, w modelu zwierząt hipezkslcnmiczocch, którym przeszczepiono ludzkiego raka płuc LC-6, mimo iz przeciwciało podawano myszy (pbkszaoee w środku fig. 27 i 28) niosącej teo sam ładunek nowotworu co myszy Kontrolne (pokazane z prawej strony fig. 27 i 28), wykazywały ooe ten sam wygląd co myszy normalne (pokazane po lewej stronie fig. 27 i 28). Wynik teo sugeruje, ze podawanie przeciwciał przeciwko PTHrP wywiera poprawę oa objawy Kliniczne (fig. 27 i 28).

2. Poprawa spadku spontanicznej aktywności związanej z hlpezkslcemlą

Pasaż ludzkiego raka płuc LC-6 pzznprowahzboo z użyciem BALB/c-ou/ou (Nippon Kurea) in vivo. Do badania skuteczności farmakologicznej zskuplbob 5-tcgoholbwe samce szczura F344N/Jcl-mu (Nippoo Kurea) i aKllmstyzbwaoo je przez tydzień, i gdy osiągnęły wiek 6 tygodni przygotowano je do doświadczenia.

Model hiperKalcemii towarzyszącej nowotworom u szczurów wytworzono w następujący sposób. Pasazowmy raK płuc LC-6 wycięto, a następnie pocięto drobno oa 3 mm Kostki. Powstałe fragmenty nowotworu wszczepiono podskórnie szczurom w ilości jednego oa szczura Około 30 doi po przeszczepie, gdy potwierdzono, ze objętość guza u każdej z myszy stała się wystarczająco duza potwierdzono u szczurów istnienie hiperKalcemii towarzyszącej nowotworom złośliwym w oparciu o stężenie wapnia we krwi i ciężar ciała.

Stężeoie wapnia we krwi obliczono jako stężenie wapnia zJboizbwaongb w krwi pełnej przez pobranie Krwi od każdej z myszy przez splot oczodołowy, stosując probówkę i umieszczając próbkę w automatycznym urządzeniu 643 Automatic Cći/pH analyzer (CIBA-CORNING).

(1) Sposób oznaczania aktywności spbotsolczoeJ

OKreślenie aktywności spbotsnicznne przeprowadzono z użyciem mieroiKa aktywności ANIMEX typu SE (Farad, Electronics, Szwecja), który umieszczono w określonym położeniu w Klatce pollntclnoowne, w której trzymano poszczególne zwierzęta (poennln i Karmienie) Urządzenie przeznaczone było do pomiaru ilości ruchu u szczura. Stosując to urządzenie, rejestrowano ilość ruchu jako jednostkę w oKreślonym oKresie czasu. Pomiar prowadzono przez 13 godzin (od 7 jednego dnia do 20 następnego dnia, zaś wyniki przedstawiono jako liczbę oa dzień.

(2) Podawanie przeciwciała

Hi 'iało pzzniióKb PTHrP ^1U1V LZA Z-iWl r ł 1VX_/ X XX XI X

M/Arlni trnwn 1 z-» -,bdsósmo Każdemu zc szczurów,

Które rozwinęły hlpnrKalcemlp, przez żyłę ogonową jako kontrolę ilości 5 mg/0,5 ml/Kg Roztwór soli podawano mnej' grupie szczurów w teo sam sposób. Pomiar przeprowadzono ze zmianą szczurów Kontrolnych na szczury badane

Pomiar pzznprowadzbob w doiu 0 (tj. dniu bezpośrednio poprzedzającym podanie przeciwciał), 2, 4, 7 i 14 dla przeciwciał podawanych szczurom, i w dniu 1, 3, 5, 8 i 15 dla szczurów Kontrolnych

190 351

W wyniku, szczury kontrolne nir wykazywały zmian albo zmniejszenia epdnteniczneJ aktywności ruchowej podczas okresu badania, podczas gdy szczury, którym podano przeciwciało wykazują wzrost aktywności spontanicznej po 4 dniach podawania (fig. 29)

Zmniejszenie spadku trmprreturc ciała związanej z hiprrkalcrmią

Pasaż ludzkiego raka płuc LC-6 i przygotowywanie zwierzęcego modelu hiprrkalcrmii związanej z nowotworem przeprowadzono w sposób opieenc w rtapir 2.

(1) Sposób pomiaru temperatury ciała

Pomiar temperatury ciała przeprowadzono przy użyciu cyfrowego termometru przez znieczulenie jednego ze zwierząt pentobarbitalrm (Nembutal Damippon Phermacrutlcel Co Lid), i wprowadzono czujnik temperatury do odbytu.

(2) Podawanie przeciwciała

Humanizowane PTHrp podawano każdemu z hiperealcemiczncch szczurów modelowych przrz żyłę ogonową w dawce dziennej 1 mg/ml/kg. Dla kontroli, innym szczurom podawano przrz żyłę ogonową roztwór soli fizjologicznej. Dalej, normalnym szczurom, którym nir podawano przeciwciała również mierzono temperaturę. Pomiar temperatury ciała szczurów przeprowadzono w dniu 0 (tj. dniu podawania) 1, 2, i 3 po podaniu przeciwciała w odniesieniu do szczurów, którym podawano przeciwciało, szczurów kontrolnych i ndrmelncch.

W wyniku, normalne szczury nir wykazywały zmian w temperaturze ciała (34,2-34,4°^ przez okres testu, podczas gdy szczury z modelową hiperkalcemią wywołaną nowotworem złośliwym wcełzywαłc zmniejszenie temperatury ciała o około 2°C w pdrównemu ze szczurami normalnymi. Gdy przeciwciało humanizowane przeciwko PTHrP podawano szczurom modelowym, potwierdzono, że szczury z modelową hiprrkali^i^mią towarzyszącą nowotworom wyrównują swą temperaturę na tym samym poziomie, co szczury normalne trzy dni po podaniu. Wyniki tr wskazują, zr humanizowane przeciwciało przeciwko PTHrP według wynalazku jest skuteczne do zwiększenia temperatury ciała w zwierzęcym modrlu hiprrkalcemii towarzyszącej nowotworom złośliwym (fig. 30)

Zwiększenie przyjmowania pożywienia

Pasaż ludzkiego raka płuca LC-6 i wytwarzanie zwierząt z modrlrm hiperkalcemii przeprowadzano w sposób opisany wyżej w rozdziale 2. Modelowe zwierzęta dzielono na dwir grupy, uśredniając stężenie wapnia wr krwi i ciężar ciała u poszczególnych grup, zaś myszy zastosowano w ponizszych doświadczeniach.

(1) Pomiar ilości przyjmowanego pożywienia

W okrrsir badania, szczury indywidualnie umieszczano w klatkach metabolicznych i karmiono, i pojono. W odniesieniu do każdego zwierzęcia, ilość przyjmowanego pożywienia określano jako ilość (g) na 24 godziny (począwszy od 9:00 rano do 9:00 następnego dnia). Oznaczenie przeprowadzano przez pomiar ciężaru całkowitego pojemnika z pożywieniem o 9 00 danego dnia i o 9:00 następnego dnia obliczając różnicę.

(2) Podawanie przeciwciała

Humanizowane przeciwciało przeciwko PTHrP podawano szczurom z modelową hiprrealcemią (szczury HHM) opisanym wyżej, przez żyłę ogonową w dawce 5 mg/0,5 ml/kg Kontrolnym szczurom podawano roztwór soli w trn sam sposób. Roztwór soli podawano normalnym szczurom w taki sam sposób. W odniesieniu do wszystkich szczurów, którym podawano przeciwciało, szczurów kontrolnych i szczurów normalnych, obliczanie ilości przyjmowanego pożywienia prowadzono w dniu 0 (tj. od dnia poprzedzającego podanie do dnia podania), dma 1 (tj. w okresie od dnia podawania do następnego dnia), dnia 3 (tj w okresie od trzeciego dnia po podawaniu do następnego dnia) i dnia 5 (tj. w okresie od pięciu dni po podaniu do następnego dnia).

ieła ilość pożywienia przyjmowanego przez

W Τ’ unmikl młrnmom ykyvtcx»v uinvni szczury hlprrkelcrmiczne (5-9 szczurów) wcnoeiłe średnio 8,11 g, podczas gdy normalne szczury przyjmowały średnio 12,06 g, co ilustruje wyraźne zmniejszenie ilości spożywanej przez szczury hiperkalcrmicznr. Gdy humanizowane przeciwciało przeciwko PTHrP podano szczurom hiperkalcemicznym, mimo iż nir obserwowano zmiany w ilości spożywanej przrz szczury kontrolne, ilość spożywana u szczurów, którym podawano przeciwciało powracała do poziomu szczurów normalnych. Wyniki te wskazują, żr humanizowane

190 351 przeciwciało przeciwko PTHrP według wynalazku jest skuteczne w poprawie zmniejszeζ^ ilości spożywanej przez szczury z modelową hiperkalcymlą (tab. 6).

Tabela 6

Wpływ na spożycie

Zwierzę	Osobnik	Podawanie	Ilość spożywana przez osobnika (g)
dzień 0	dzień 1	dzień 3	dzień 5
Szczur normalny	1	sól	13,70	16,7	18,63	18,71
	2	sól	14,27	15,3	19,55	19,39
	3	sól	9,83	15,5	20,72	19,88
	4	sól	10,42	15,04	20,28	22,03
Szczur HHM	5	sól	10,77	14,24	12,66	11,82
	6	sól	6,99	8,92	2,59	14,8
Szczur HHM	7	Przeciwciało przeciwko PTHrP	7,46	17,65	22,52	17,99
	8	Przeciwciało przeciwko PTHrP	12,00	12,38	20,94	23,10
	9	Przeciwciało przeciwko PTHrP	3,35	16,65	20,36	21,89

Podawanie soli (roztwór soli)' 0,5 ml/kg, przez żyłę ogonową, i

Podawanie przeciwciała. 5 mg/0,5 ml/kg, przez żyłę ogonową

Z powyższych wyników wvkyzaac, ze przeciwciała chimeryczne i humanizowane według wynalazku są przydatne jaKo czynniki zmaiejszające różne objawy kliniczne hiperkalcemii związanej z nowotworem.

5. Poprawa zmniejszenia pH Krwi wywołanego hiperkalcezią

Pasaż ludzkiego raka płuca LC-6 i wytwarzanie zwierząt z modelem hiperKalcemii przyprdąydzymc w sposób opisany wyżej w rozdziale 2. Modelowe zwierzęta dzielono na dwie grupy, uśredniając stężenie wypaiy we Krwi i ciężar ciała u poszczególnych grup.

(1) Określanie pH Krwi

Krew pobraną od zwierząt testowych przy użyciu strzykawki hypαrvnizdwyaej techniką robierαmy Krwi z serca -wprowadzono do urządzenia 643 Automatic Ca2⁺/pH analyzer (CIBA-CORNING) w celu określenia pH próbki Krwi (2) Podawanie przeciwciała

Humanizowane przeciwciało przeciwko PTHrP podawano szczurom z modelową hiperKalcemią (szczury HHM) opisanym wyżej, przez żyłę ogonową w dawce 5 mg/O© zl/Kg (z = 3). Koatrolavz szczurom podawano roztwór soli w ten sam sposób (n = 2). W cnniysiyaiu do wszystkich szczurów, którym podawano przeciwciało, szczurów kontrolnych oznaczenie pH Krwi prowadzono w dniu 0 (tj. w dniu podawania), w dniu 1 i w dniu 7. Wyniki pcnyac jako średnią otrzymanych wartości pH. _

W wyniku, przed podaniem przeciwciała, pH Krwi u szczurów z modelową hipyrkalcemią wynosiło 7,49 (podczas gdy u szczurów normalnych 7,4±0,02), co oznacza, ze szczury

190 351 modelowe ro zwijały zasadowicę metaboliczną. Gdę podawano szczurom modelowym przeciwciało humanizowane przeciwko PTHnP według wynalazku, mimo iż szczury kontrolne nie wykazywały poprawę wartości pH, szyzui^c', którym podawano przeciwciało powracały do wartości niemal pH szczurów normalnech siedem dni po podaniu przeciwciała. Jako jeden z objawów klinicznych hiperkalyemii towarzyszącej nowotworom (HHM) opisywano zasadowicę metaboliczną, co jak wiadomo jest wywoływane zahamowaniem wydalania jonu dwuwęglanowego (HCO<) w nerkach. Poruewiż: podao,'anie humanizowaneego przeciwc^a przeciwko PTHrP według wynalazku normalizuje pH krwi w modelu hipenkalyemil, sugeruje się, ze przeciwciało może zmniejszyć zasadowicę metaboliczną spotykaną w HHM (fig. 31).

Z opisanych wyżej wyników wykazano, ze przeciwciała chimeryczne 1 humanizowane według wynalazku są przydatne jako środki zmniejszające objawy kliniczne hiperkaleemii towarzyszącej nowotworom.

Możliwość zastosowania przemysłowego

W nawiązaniu do niniejszego wynalazku, dostarczono chimeryczne albo humanizowane przeciwciała przeciwko PTHrP. Przeciwciała te mają słabą antygenkwość u ludzi, a stąd są przydatne jako środki do leczenia hiperkslyemii, hipofosfatemii itp.

190 351

LISTA SEKWENCJI (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1 (i) .CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:

AAATAGCCCT TGACCAGGCA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR.: 2:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc „syntetyczny DNA

190 351 (XX) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3:

GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR :4 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4:

GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5:

GTTTTCCCAG TCACGAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

190 351 (A) OPIS: /deso = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6:

CAGGAAACAG CTATGAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:

GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C (2) INFOIRMACJA DLA IDENTYFIIKATOIRA SEEKWENCJI NR:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKA inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:

TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA (2) INFOIRMACJA DLA IDENTYFIIKATOIRA SEPWF.NCJI NR:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

190 351 (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:

GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10:

TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ): 109 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 110 par zasad

190 351 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12:

GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC

ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG IGGCCTTGTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 98 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

CA) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 13:

GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGGGGC CAGCAGCTAC

CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 106 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

190 351 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14:

TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 43 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 15:

GTCTGAATTA AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16:

TGTTGAATTC TTACTATGAA

190 351 (2) DUA IDENTYFIIKATOiRA SEKWENCJI NR:17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwaas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 17:

CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC (2) INFORMACJA DIA IDENTYFIKATORA SEIKWENCJZ NR:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR.: 18:

GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEEKWENCJI NR:19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwaas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 19:

GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC

190 351 (2) INFOPRMACJA DLA IDENTYFIIKATOIRA SEEKWENCJI NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kw/as nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 20:

TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA (2) INFOORMACJA DUA IDENTYFIIKATOIRA SEEKWENCJI NR: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 21:

GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT (2) INFOFRUACJA DUA IDENTYFIIKATOIRA SEiKWENCJI NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ': 48 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZiU: inny Jwaas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 22:

190 351

TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 128 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 23:

GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCGTTGC ΤΟΠΤΓΑΑΟΑ GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG

TCCCTGAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 125 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 24:

ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC

ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG

GACAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:25:

190 351 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 132 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwzas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 25:

CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC

CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC

CTCCCAGGCT GG (2) INFFRRACJJ DLA IDENTYFUKTOOA SEEKWENCJI NR: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 110 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwzas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 26:

TG-TT-GGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC

ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR.: 27:

190 351 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 27:

GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 28:

TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 133 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 29:

ACAAAGCTTC CACCATGGGC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG

GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT

CGGTCAAGCT CAC

190 351 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 30:

AGCAAGATCG AAGCCACAGC ACAGGTCATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 128 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 31:

rrPTrrrTTr γδτγττωγττ ΔΛΓ.ΤΓΓΓΑΤΓ ΑΑΓ.ΤΑΓΓΓιΑΟ GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC

Vlu l W'-' A 1 KZ l < W * t *4 A - ------TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC

GAGGCTCC

190 351 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIiKATOERA SEEKWENCJI NR: 32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 114 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZK:: inny kwras nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 32:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA (2) INFORMACJA DJLA LDENTYFIKKATOERA SEEKWENCJI NR: 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKA inny kwaas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (ii) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 33:

ACAAAGCTTC caccatg (2) INFORMACJA DDLA IDENTYFIIKATOiRA SEIKWENCJI NR:34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

190 351 (A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:34:

CTTGGATCCG GGCTGACCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 75 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 35:

CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGAOGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA TTGTTCCTTA ATTGT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 43 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA

190 351 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 36:

AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG (2) INFORRBACJA DILA IDENTYFIIKATOiRA SEEKJENCJI NR: 37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 46 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza.

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwaas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 37:

ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA (2) INFORRBACJA DILA IDENTYFIIKATOiRA NR: 38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 111 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 38:

CTTCGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA

TTCTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C # χ·\ \ -r »7» z-, -t-λ ν-»ττ» -r r>riXTmr nv m -n nnrzr.Tnnn *tt (z; xwr OkkiAu ujn ujllH. jlujlj.j n j.c α&ΛΗωΊυυι.

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

190 351 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 39:

CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 40:

CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:41:

GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad

190 351 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:42:

CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy z z .

(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 43:

GGCTTGGAGC TCCTCAGA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

ODTQ _: νχ. a. KZ · //dnc n —

O X r»·» ł- ł— τ z» ▼ r „syntetyczny r\kT7\ rr DNA.

GACAGTGGTT CAAAGTTTTT (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 44:

190 351 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 45:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Sgr Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly

Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg

190 351

70 75

Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Het Tyr

85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro

110

115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 4 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 46:

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly

10 15

Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu

40 45

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr

55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

190 351

70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr L^^u Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp

85 90

Thr Ala Mtet Phe Tyr Cys Ala Arg Gln hhr hhr Met Thr Tyr Phh

110 115

Ala Tyr Trp GGy GGn Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

110 115 (2) INFORMACJA DULA IDENTYFIKATORA SEiKWENCJI NIR: 4 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 116 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ci) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 47:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser All Ser I.lu Gly

10 15

Ha Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gil His Ssr Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu LLy Giy Pro Arg

40 45

Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr GGy Aap

55 60

Gly Iie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arr

190 351

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 48 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 48:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

190 351

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

Tyr Cys Gly Val G1y Asp Thr Ue

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Tlm

110

	70					75
Ser	Glu	Asp	Glu	Ala	Asp	Tyr
	85					99
Lys	Glu	Gln	Flie	Val	Tyr	Vvl
	110					115
Val	Leu	Gly	Gln	Pro
	111

(2) IDFFRRMACJA DLA IDENTYFIDKlTORR SEiKWiNCJI NR: 49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (E) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 49:

Gln Leu Val Leu Hu· Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Tlhr

25 3

Tyr Thr Ile Glu Tri) Tyr G In Gln Gln IPo Glu Lys Gly FPo Lys

40 45

Tyr Val Met Asp eeu ys s Gln Asp Gis Ser H is Ser ThG G ly /Asi?

55 6

Gly Ile Pro Tsp Ar. Phe S er r ly Ser SSr Ser Sir Ala Glu Ara

190 351

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr He Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

110 115 (2) INFO1RMACJA DIA IDENTYFHKATO1R SEIKfENCJI NR:50 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKA białko (ci) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 50:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

190 351

70 75

Tyr Leu Thr ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:51:

(x> CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 51:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly

10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Val Het Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

190 351

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asg GIa Ala Asp Tyr

85 07

Tyr Cys Gly Val GGy Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

170 107

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu The lal Leu Gly Gln Pro

007 018 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIIKATOIRA SEEKIENCJI NR: :552 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 52:

Gln

Lee

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

Ala

Ser

Ala

Ser

Leu

Gly

1

5

70

10

Ala

Ser

Val

Lys

Sen

TSt

Css

SIil

Gen

i5en

rer

Gln

His

Ser

Tlnr

22

25

30

Tyr

Thr

Ile

G lu

Trp

Tyr

Gln

Pro

Glu

Lys

Gly

tPro

Lys

38

70

45

T _

1___ LSG

A

f

1

n„

Ολ».

u; >-

TK·»·

r.i„

A

iyi

mc m

nap

¹ LLU

łzj O

vxn

utop

my

ner

HU

wr

MU.

MA/

< IO|A

87

85

Gly

Ile

Pro

Asa

I AAg

PPe

PSr

Gly

Ser

Gly

Ala

Glu

Prg

190 351

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tjr

85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln hhe Val Tyr Val

100 100

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

110 110 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 53:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala der Ala Srr Leu Gly

10 10

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu err err dn Hss Ser TTh

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln roo du Lys Gly FP-o AAr

40 45

Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser Hss Ser Thr Gly Aas

55 66

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Srr Ser lly Ala Glu AAr

190 351 ⁶⁵ 70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

110

115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 54 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 54:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys

40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp

55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

190 351

70 75

Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr

85 90

Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val

100 105

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 55:

Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr

25 30

Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg

40 45

Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg

190 351

65

70

75

Tyr

1 eti

Thr

Ile

Ser

l.eu

Gln

Ser

Glu

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr

80

85

90

Ile

Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Ihr

Ile

Lys

Glu

Gln

Phe

Val

Tyr

Val

95

100

105

Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

Gln

Pro

110

115

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:56 ii) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 56:

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly

10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

25 30

Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60

Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

190 351

70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe

100 105

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: CDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 57:

ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTC ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45

Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys

-15 -10 -5

GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC HA 90

Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu

5 10

GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

190 351

15

20

25

TTC

ACT

rrc

AGT AGC

TAT

GGC

ATG

TCT

TGG

ATT

CGC

CAG

ACT

CCA

180

Phe

Thr

Phe

Ser Ser

Tyr

Gly

Met

Ser

Trp

Ile

Arg

Gln

Thr

Pro

30

35

40

GAC

AAG

AGG

CTG GAG

TGG

GTC

GCA

ACC

ATT

AGT

GGT

AGT

225

Asp

Lys

Arg

Leu Glu

Trp

Val

Ala

Thr

Ile

Ser

Gly

Ser

45

50

55

TAC

ACC

TAC

TAT CCA

GAC

AGT

GTG

AAG

GGG

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

270

Tyr

Thr

Tyr

Tyr Pro

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

60

65

70

AGA

GAC

AAT

GCC AAG

AAC

ACC

CTA

TAC

CTG

CAA

ATG

AGC

AGT

CTG

315

Arg

Asp

Asn

Ala Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Ser

Leu

75

80

85

AAG

TCT

GAG

GAC ACA

GCC

ATG

πτ

TAC

TGT

GCA

AGA

CAG

ACT

360

Lys

Ser

Glu

Asp Thr

Ala

Met

Phe

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gln

Thr

90

95

100

ATG

ACT

TAC

TTT GCT

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACT

CTG

GTC

ACT

GTC

405

Met

Thr

Tyr

Phe Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

105 110 115

TCT ca 411

Ser Ala (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:58 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna i γί \ mr>nr\T r\r*T τ\ · Ή η-ΐ ζιτ.τϋ (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 58:

190 351

ATG

GGG

TTT

GGG

CTC

agc

TGG

GIT

CTC

CTT

GCT

crr

TTT

CAG

45

Met

Gly

Phe

Gly

Leu

Ser

Tnp

Val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Arg;

-15

-10

-5

GGT

GTC

CAG

TCT

GAG

GTC

CAG

CTC

GTC

Gd

TCT

OH

GGA

GGC

GTC

90

Gly

Val

Gln

Cys

Gln

Val

Gln

Leu

Vvl

Glu

Ser

Gly

Glyy

Gly

Vvl

1

5

10

GTC

CAG

CCT

GGG

AtH

TCC

CTC

AGA

crc

TCC

TCT

GCA

GCC

TCT

GGA

135

Val

Gln

Pro

Gly

Arg

Ser

iLiU

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Glyr

15

20

25

TTC

ACC

TTC

ACT

AdC

TAT

GGC

ATC

TCT

TK

GTC

OGC

GAG

GGT

CCA

180

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

Glyy

Met

Ser

Trp

V£^l

Arg

Gln

Ala

Pro

30

35

40

GGC

AAG

GGG

γτγ'

GAG

TCG

CTG

GGA

AĆCC

ATT

AGT

ACT

GGT

GlT

AGT

225

Gly

Lys

dy

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Hu·

Ile

Ser

Gly

Glyy

Ser

45

50

55

TAC

ACC

TAC

TAT

CCA

GAC

AdT

GTC

AAG

GGG

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

270

Tyr

Thr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Tłhr

Ile

Ser

60

65

70

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AlAC

ACH

crc

TAT

CTG

CAA

ATC

AAC

AGC

CTC

315

Arg

Asp

AAn

Ser

Lys

Asn

Tłu*

Leu

Tyr

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

75

80

85

AGA

CCT

GGG

GAC

ACG

GCT

GTC

TAT

TAC

TCT

GCG

AGA

GAG

ACT

360

Arg

Ala

du

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gln

Tłhr

Thr

90

95

100

ATG

ACT

TTA

TTT

GCT

TAC

TGG

ax

CAG

GGA

ACC

CTC

GTC

AGC

GTC

405

Met

Thr

Ttt

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Le»j

Vvł

Ttr

Vv1

TCC TCA 411

Ser Ser

190 351 (2) INFORMACJA DRA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ): 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 59:

Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala (2) INFORMACJA DJLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJJ CZĄSTECZKI: peeptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 60:

Ser Ala Ser Asn Tyr Thr (2) INFORMACJA DILA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ): 9 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) R0t^2^A^J CZĄSTECZK:: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 61:

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 62:

(l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

190 351 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 62:

Pro Tyr Trp Met Gln (2) INFORMACJA ELA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 63:

Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arp Tyr

Ser Gln Lys Phe Lys Gly (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 64:

Gly Leu Arp Arp Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp

Tyr

190 351 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:65 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 65:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser

5 10

TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135

Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

190 351

CAG

CAC

ACT

ACG

TCC

CCC

Aπ

AAA

TCC

ATT

CCAG

(CAr

<C1G

CCC

CTC

180

Gln

His

Ser

Thr

Tyr

hhr

Ile

G1u

rsp

Τργ

Gln

Gin

Gln

Prr

Lli

30

35

40

AAG

CCT

AAG

AAT

TTG

TGG

ATT

TTT

AGC

CM

GAT

GCA

AG)

CCA

225

Lys

Pro

Lys

Τργ

aal

Mt t

Asp

eu u

Ts s

Gln

Asp

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC

ACA

GGT

GAT

GGG

ATT

CCT

GAT

CCC

TCC

TCT

GCA

TGC

AG)

TTC

270

Ser

Thr

Gly

Asp

Hy

He

Poo

ssp

rgg

hee

S^ip

Gly

Ser

60

65

70

GGT

GCT

GAT

CGC

ACC

TTT

GCC

TTT

CCC

ACC

ATC

CAG

<CCA

GAA

GAT

315

Gly

Ala

Asp

Arg

Tpt

euu

err

lle

Srr

snn

Ile

Gln

!Pp3

Glu

Asp

75

80

85

GAA

GCA

ATG

TAC

TTC

GCT

GGG

GTT

GAT

ACA

ATT

AAG

GAA

CCA.

360

Glu

Ala

Met

Tyr

U e

Ts s

ly y

a_ai

G1 y

ss p

Ήττ

Ile

Lys

Glu

Gin

90

95

100

TTT

GTG

TAT

GTT

TTC

GGG

GGT

cgg

AOC

AAG

{^HC

ACT

GTC

CTA

GIT

405

Phe

Val

Tyr

Val

hee

Gly

Hy

TPr

Tss

Val

Thr

Val

Leu

Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 405 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR; 66:

190 351

ATG	GCC	TGG	AC*	CCT	CTC
Met	Ala	Trp	Tlur	Pio	Llu
				-15
GGT	TCT	TTC	TCC	CCA	GCT
Gly	Ser	Phe	Ser	Gln	Glu
				1
GCC	TCC	CTG	GG/A	GCC	TCC
Ala	Ser	Leu	Gly	Ala	Ser
			15
CAG	CAC	AGT	ATC	TAC	(ACC
Gln	His	Ser	TItu	T*yo	'(Tu
			30
AAG	GGC	CCT	CTC	TAC	(CCG
Lys	Gly	Pro	Arg	Tyr	Llu
			45
AGC	ACA	GGT	GAT	(Gd	ATT*
Ser	Thr	Gly	Asp	Gly	Ile
			60
GGG	GCT	GAG	GCC	TAC	CTC
Gly	Ala	Glu	Arg	T(y	Glu
			75
GAG	GCT	GAC	TAT	TAC	TCT
Glu	Ala	Asp	Tyr	T(uo	Cys

Phe Phe Val

GTG CTC ACT CfAA TCG

Val Leu (Thr Gln Siar

GTC AAG CCC AGC (TGC

Val Lys Leu Thr Cys

GTT GAA TCd CAT CAG

Ile Glu Trp His Gln (35

GTG AAA CTT AAG CAA

Met Lys Leu Lys Gln

GCT GAT (CGC TTC TCA

Pro Asp Arg Phe Ser

A<GG AITG TCC ATC CTC

Thr Ile Ser Ser Leu

GGT GTC GGT GAT ACA

Gly Val Gly Asp Thr

CTT CAT TCRC TCA 45

Leu His Cys Ser

TCC TCT (GCC CCC 90

Pro Ser Ala S®r

AGC TTG AGT AGT 135

Tut Leu Ser Ser

CAG CAG CCA GAG 118)

Gln Gln Pro Glu (GAT GGA ATC (GAC 225

Asp Gly Ser His (GGC TCC ATC TCT 270

Gly Ser Ser Ser

CAG TCT GAG GAT 315

Gln Ser Glu Asp

ATT AAG GAA CAA 360

Ile Lys Glu Gln

190 351

95 HW

TTT GTG TAC GTG TTC GiGGGGACGGi ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly 'Πιΐ' Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 111 115 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 67:

ATG

GCC

TGG

ACT

CCT

CTC

TTC

TIC

ΤΤΤ

(ΤΓΤ

CTT

CAT

'TGC

TCA

45

Met

Ala

Trp

Thr

Pro

Leu

Phe

Val

Leu

His

Cys

Ser

-15

-10

-5

GGT

TCT

TTC

TCC

CAG

CTT

GTG

CTG

ACT

CM

TCG

αχ

TUT

(GCC

TTC

90

Gly

Ser

Phe

Ser

Gln

LeL

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

FPo

Ser

Ala

Ser

1

5

10

GCC

TCC

CTG

GGA

GCC

TCG

GTC

AAG

CCC

AOC

TO

AOC

rrc

AGT

133

Ala

Ser

Leu

Gly

A1a

Ser

VaV

Lys

Llu

Tu*

Cys

Πη-

L^u

Ser

&3Γ

15

20

22

CAG

CAC

AGT

ACT:

TAC

ACC

ATT

GM

TO

TAT

CAG

(CA

GAG

180

Gln

His

Ser

Thr

TyT

Thr

I l e

GGu

Ttt

Tjy

GGn

TGu

Ti^o

GGu

190 351

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 68:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGTA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 68:

190 351

ATG

GCC

TGG

GCT

CCT

ccc

CTT

TCC

ITC

πτ

GIT

CTT

CAT

TCC

TCA

45

Met

Ala

Trp

Thr

Per

Cuu

CPe

Phe

Val

Luju

His

Cys

Ser

-15

-10

-5

GGT

TCT

TTC

TCC

CAG

CTT

CGG

CTC

ACC'

CM

TCG

GAC

'TCT

dC

IGCT

90

Gly

Ser

Phe

eer

Llu

Cal

Leu

Tr·

Gln

Ser

Fer>

Ser

Ala

Ser

1

5

10

GCC

TCC

CTG

GGA

GO

CGO

CTC

AAG

CTC

AGC

rac

ACCC

TTC

AGT

115

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

Ser

Vv1

Cys

Leu

Tłrr

Cys

Thr

Leu

Ser

15

20

25

CAG

CAC

AGT

A(C

CAC

A(X

AUT

CM

Tm

TAT

CiAG

CAG

GAG

OC\

GAG

180

Gln

His

Ser

TCr

Tjr

'Crr

Ile

Glu

Tnp

Tyr

Gln

CPo

Glu

30

35

40

AAG

GGC

CCT

TAG

TAC

GTC

aat;

G/AT

CCT

AAG

CM

GAT

GGA

Ad

CAC

225

Lys

Gly

Pro

Τ>τ

Val

Met

Asp

Ll3U

Lys

Gln

A;?

Gly

Ser

His

45

50

55

AGC

ACA

GGT

GAT

CGG

ATT

CCT

GAT

cgc

TTC

TCA

GGC

rac

AGC

iccr

270

Ser

Thr

Gly

Asp

Gly

Ile

pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

60

65

70

GGG

GCT

GAG

CGC

TAC

CTC

ACC

ATC

TOC

AGC

CTC

CAG

ΤΤΑΤ

G^G

GAT

315

Gly

Ala

Glu

uArg

Tjr

Leu

TCrr

Ile

Ser

Leu

Gln

Ser

Glu

Asp

75

80

85

GAG

GCT

GAC

TAT

TAC

TCT

GUT

CTG

GGT

GfćT

ACA

ATT

MG

GM

CM

360

Glu

Ala

Asp

Ter

Tyr

Cys

Gly

Val

Gly

Asp

Thr

Ile

Lys

Glu

Gln

90

95

100

TTT

GTG

TAC

GTG

TCC

GGC

GGA

GGC

CCC

AM

TTC

CCC

GAC

CTC

GGC

005

190 351

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFOORACJA DILA ΙΟΕΝΤΥΓΙΚΤΟΚ SEFKJENCJI NR:69 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do uRNAA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 69:

ATG GCC TGG ACT CCC CCC TTC TTC TTC ΤΓΓ GIT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Płi^ Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTC ACT CM TOG (TC 1CT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Hu· Gln Sie: FPro Ser Ala Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA CCC TCC GTC MG CTC AG3 TOS ACC TTC ACT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Alei Ser Val Lys Leu Ήτ·’ Cys Hu· bej Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC MC ATT GM TCGG TAT (CAG CIG OlG OCl GAG 180

Gln His Ser Thr Tyr Thr He Glu Trp Tjyr Gln Gln Gln FPo Glu

190 351

35 40

AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CH AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Arg TTr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser C is

55 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATTCCT GAT (GC TCC 'CA GGCC T(CC AAG CTC 270

Ser Thr Gly Asp GGy Ile Pro Asp Arg Re Ser Gly Ser Ser C er

65 70

GGG GCT GCG CGC TTA CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GGA CGA 315

Gly Ala Glu Arg Tti Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Gil Cap

80 85

GAG GCT GAC TCT TTC TGT OTT GTG (OT GCT ACC ATT GCG GGC CCC 360

Glu Ala Asp Tyr Tir Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Gil Cll

95 100

TTT GTG TCC GTO TTCGGC GGA G(G ACC AAC CTG ACC GTC CT' CGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gl.y Thr Lys Leu Thr Val Lee G^

105 111 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 70:

100

190 351

ATG GCC TGG ACTCCTCTC TTC TTC TTC TTT GTT CTTCATTGC TCA 45

Met Ala Trp Tle Pro Leu Phe PheThe The Tal Teu Tis Tas Ter

-15 -10 -5 ^Τ TAT CTT TOCCAT (ATT GTG CAT ACA CAG TTA CAA TTA CGA TTA 90

Gly Sur hhr Ser Gln Ten Val LerTGe GGl Ter Thr Ter da Ter

5 10

GAC TAA ATG GGA GTT;(GAT GTC AAG CAT ATA TTG CTT TTC CGG TTG 135

Ala Srr Luu Gly Ala Ser Val Ler Ter TTe Tas TTr Ter Ter Ter

20 25

ATG AAA TGT ACAT ^/^(T AOC ATT GGT TTG TTT CAG CAT CAT TTC CGG 110

Gln His err Thr T(y TTuc He Glu Ter Ter GL· CL· GL· Thr GGl

35 40

ATG GGA AAG A(TG TAC GTG ATG GAT CAG CTG CAT C^T* GGA CGG: GATT 225 eys Gly hro Arg Tisr V^1 Met Asp Ler Ces GG^ Cap GGl Ger Gis

50 55

AGA TAT GGC GAT ATT (AAT GAT (AGT CTC TCA (^^ TTA! AAC TTA 270 err CUr Gly Asp Gly Ile ihro Asp (Ur Che Ger Gly Ger Ser Ger

65 70

GAG GAG CGC tttq CCC ACC ATC TCC AGC CTCT CAG TCT GAG CAT 315

Gly Gla Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu GGn Ser Glu (Gp>

80 85

GAG GCT GTA TCT “TAC TGT GCT CTG CG^T GAT A(TT AGTT (TTG G/GT CTG\ 360

Glu Ala Gsp T(r Tyr Cys Gly Val Gly Asp TTer Ile Lys Glu Gln

95 1(0)

TCC GCG GTA GTCTTC GGC GGA ΟΓ (GAT (GAT CAT (GXT GTC CATA 005

190 351

101

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 71:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC ΕΠ’ GTT CTT CAT GGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val bei His Cys Ser

-15 -10 -5

GOT TCT TTC TCC CAG CU GTG CTG ACT CAA TGG CCC TCT GCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Poo Ser /Ha Ser

5 10

GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC GGC ACC TGG AGT AGT 135

Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys 'Hhr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CGG CAG CGG CCA GAG 1^0

Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln (Pro G1g

102

190 351

35 44

TTG GGC CCT TAG TTC CTG ART GAT επ’ AAG CAA GAT GGA ATG CAA 225

Lys GIt Ppo Lys Tyr eeu Mtt ssp Leu Lys G1n ssp Hy Sse His

50 55

AGC TCT GG’ GTT GCG ATT CCT GAT^- CCG TTC TCA GGC TCC AGCTCT C70

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro tep Arg Phe Ser Gly Ser Sse Sse

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTCACCATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT TT5

Gly Tla Glu Arg Ttp Iuu TPr He Ιργ Ιργ Iuu Gln Ιργ GGg Atp

80 85

GTG GCT GTC TTT TTC TGTGGTGTG GGT GAT ATCt ATT AAG GAA CGT T60

Glu Tla Asp Tyr Ile Ts s Gly aal Gly ssp Thr He Tss GGg GL·

95 100

TH GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTT CTA CCT GO5

Phe VaI Tyr VaG Phe GGy GGy Gly Thr Lys Leu Thr Val Lli Gly

105 110 115

CAG CCC 411

GGn Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:72 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 72:

190 351

103

ATG GCC TGTACT CCC CCT GTC GTC GTT GTT GTT FAT CAT 'TCC TCA 45

Met Ala Tit TTt Gir Cte Phh Phh FPih Phh Val Leu His Cci GSr

-15 -10 -5

GGT TAA TTT TCC CCC CTT CTG FAT ACT CM TCG GACA FTCT CGAC FTA 90

Gly Ser PhP rSr dn CLr Val Leu FTt Gln Ser FPr» Seer Ala Cer

5 10

GAA TAC CTGGGA GCC GTC GTC MG CTC ACC 'TGA AGA GIC AGT AGT 113

Ala Ser Leu Gly AAa 'Sr Val Lys Llu FTt· Cys Tt Leu Ser Ser

20 22

AGG CCC AGG ACC TAAA AAC GATT GM GTC TAT GAG GAG CC^G CCC GAG 118

Gln His Srr Thr Tyr Thr ILe Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu

35 40

CCG GGC CCTAGG CAC CCG AAT GAT FCT MG CM GAT GGiA FGGC FCAA 225

Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Mrt Asp Leu Lys Gln Asp Gly Srr His

50 55

GGC CCC GGT GAT CGG AAT GCT GAT GGA TTC TCA GGC TGC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly IIe FPo Asp Mg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

Gd GCT GAdCC CAC CTC ACC ATC TGC AGC CTC CAG TCT GGG GGT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Gpp

80 85

GAG GCT GAC TAT AATA TCT GGT GTC GGT GAT ACA ATT MG GM CAA 3^0

Glu Ala Asp Tyr Ilr Cys Gly Val Gly Asp Thr 11g Ipg Hg lin

915 IG)

TTT GTC TAC GTC GTT( FGGC FHA Gd ACC GACA CTG ACC GTC CTA GGC -435

104

190 351

35 40

AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225

Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His

50 55

AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC CTC TCA GGC TCC AGC TCT 270

Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

65 70

GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp

80 85

GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360

Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln

95 100

TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:74 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ιί) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:74:

190 351

105

Phe Val Tyo Val Phe Gly Gly Gly Tho Lys Leu Tho Val Leu Gly

105 110 115

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DILA IDENTYFIKAATORA SEEKWENCJI NR:73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 411 pao zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do iRWA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 73:

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT CIG CTT CAA TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe VaV Leu His Cys Ser

-15 -10 -5

GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAAACGCCC TCT GCCC TCT 90

Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu TUv Gln ner Pro Ser Ala. Ser

5 11

GCC TO CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC CGCACC TTG AGT AGT 135

Ala Svv Lvu Gly Ala Svv Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser

20 25

CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 100

Gln His Svv Thr Tyr Thv Ile Glu Trp Tyr· Gln Gln Gln JPv> Glu

106

190 351

ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTCTTC TTCTTTGTT CTT CAT TGC TCA 45

Met Ala Trp Thr Pro Ltu PTe PTe PTe PTe Vd Leu Tis Tcs Ter

-15 -10 -5

GGC CCT TTC TCC CAA CCT GTG TTG ACC CAG TCG CCC TCT TCC TTC TC

GLy Ser Phe Ser Gln Uru VtL Uru Thr GLn Ser Oro Ser Ala Ser

5 10

GTT TCT CTG GGA TCO TO TCCACGGCCTTeTTCTTC TTT TAG TTG 135

ALc Ser Ueu GLy AIa. Cts rd Lye Ltu UTt Cts Tłu- Tup Tsp Tsp

20 25

ATG CTC TGC GTC TAC TCAC ATT GMTCG TATCAG(C^ TTA TCC dG 180

GLn His Ser The Tjt Che I Te G lu TjtiTits G ln Gln du Tor du

35 40

TAG TCT CTG GGG TAC GTT ATT GATCTTAAG C/CGGAT Td TTC TCG 225

Uys GLy Oro Teg Tjtt Val Met Asp Leu Lys G ln du Tsp Tis

50 55

AGC TCA TCC GAC GGG ATT CCT GAT CTCTTC TCA (GGA TTC TTC TCT 270

See The GLy Tsp Gty I le Pro A τρ Arg Phe S er Gly Ser Ter Ter

65 70

GTC GCT GTG AGA TAC CTC AGA ATCTCCATCCTTCAG TTC TGG TAT 315

GLy GLc GLu Teg Tjt- Leu Thr I le S er S er Leu Gln Ser du TTl

80 85

GAG TCT GAC CAT ATT TGT GGT GTG TCTGATACA ATT TH TM TCT 360

GLu ALc Asp Cyc Ile Cc: TT ty VvT du AglTTt Ile Les du dn

95 100

TTC GTG TGT dG TTCGGCTCAGTC ACC AAACCT ACC GTC CTA TTC 405

190 351

107

Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 HO US

CAG CCC 411

Gln Pro (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 75:

Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile ¹ 5 10 15

Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu

25 30

Ile His Thr Ala

108

190 351 to (2)

FIG.2

Hj-ndlU θ

D BamHI

FRi CDR1 FR2 COR2 FR3 CDR3 FR4 (A-E)

F

Pierwsza reakcja PCR (B-F) (C-G) (D-H)

Przyłączenie

S Druga reakcja PCR (3)

190 351

109

FIG.3 v region

FRl	FR2	FR3	FR4
	CDRl Bil CDR2	Sil CDR3
			Plazmid Aktywność
H	H	m	m h/mMBClL(l) —
m	m	H	H m/hMBClLU) +
H	m	m	m hmmMBClL(l) +
m	H	m	m mhmMBClL(λ) —

H : FR Przeciwciała ludzkiego m : FR Przeciwciała mysiego

110

190 351

FIG.4

Określanie Aktywności Wiązania Antygenu

O.D. 405/620

Stężenie przeciwciała (ng/ml)

190 351

111

O.D. 405/620

FIG.5

112

190 351

O.D. 405/620

FIG.6

Określanie Aktywności Wiązania Antygenu

Stężenie przeciwciała (ng/ml)

190 351

113

O.D. 405/620

FIG.7

114

190 351

O.D. 405/620

FIG.8

Określanie Aktywności Wiązania Antygenu

Stężenie przeciwciała (ng/ml)

190 351

115

O. D. 405/620

FIG.9

Stężenie przeciwciała (ng/ml)

116

190 351

O.D. 405/620

FIG.10

Określanie Aktywności Wiązania Antygenu

Stężenie przeciwciała (ng/ml)

190 351

117

O.D. 405/620

FIG.11

Określanie Aktywności Wiązania Antygenu

Stężenie przeciwciała (ng/ml)

118

190 351

Stężenie c-AMP (pmole/mł)

FIG.1 2

Aktywność neutralizująca Humanizowanego Przeciwciała przeciwko PTHrP(1-34)

Stężenie Przeciwciała (pg/ml) hMBC j hMBC m hMBC o hMBC r chMBC #23-57-137-1

190 351

119

FIG.1 3

Aktywność neutralizująca Humanizowanego Przeciwciała

chMBC hMBC I hMBCs hMBC t

Stężenie Przeciwciała ^g/ml)

120

190 351

FIG.14

Aktywność neutralizująca Humanizowanego Przeciwciała przeciwko PTHrP(1-34)

chMBC hMBC q hMBC r

Stężenie Przeciwciała ^g/ml)

121

190 351

(6) E(eio Jeżcie

Dni po Przeszczepieniu (Dni)

122

190 351

N

E

OJ

—u O CO	O	C3 to	o CM	<D £
O m	O ω	σ O	O O	.2
	2	m	tn
-C	JZ	2	2	CQ
U	o	x:	.c	Q-

Wpływ Przeciwciała Chimerycznego i Przeciwciała Humanizowanego na Zwierzęcy Model Hiperkalcemii (Myszy Nagie Niosące Ludzkiego Raka Trzustki PAN-7)

(6) E}EJQ JEZSlQ

Dni po Przeszczepieniu (Dni)

123

190 351

Dni po Przeszczepieniu (Dni)

124

190 351

N CZ) >» P
03	Sb X o π
O	U
b.	ca
c o	2
	u

ε oh

X

O

U ca

S u

>>

n σ cr

O O ca ca S S z* z· o

£ '?

Cd

b.

CU .S2 c5

Ό

O

O.

;>

T

c

Q

FIG.18

□ c

o

o.

N

ΙΛ <D

0.

O

CL

Ξ (S) Bł3!0 ·>^Β?^δ!0

190 351

125

W

CU

N

O

o	O	O	O	O	O	O	o	o
o	O	O	O	O	O	O	o	o
o	O	O	O	o	O	O	o	o
	CN	O	00	CD	N-	CN	o	00
CN	CN	CN	x—	X™	x—	X“	χ—

(na) ef05(Bsy og £ t = + o § w Q °

HZ UJ I Z + < ι ω ui £ x Q aZŁ

o.

(Z)

Φ ęę

Φ tr <u c

Φ

U)

TO cn φ

O.

O

W »

Φ o:

» .o <

o

Ό

C

Φ

E ίο

LU o tri r a.

□ o t—·

I _ <=> □ □ 7 o tn — »ROI φ

* > j o o o cm co co oo oo co ty t- co σι r- t- o co co CO Tt Ol CM CM

CZ) W Φ <D > >. Z 2 Z 2

Γ-	CM		m	O	co
O	CM	r-	Tt	t—	Τ-
o	7	o 1	Tt 1	T	Ο 1
γ-	Ol	to	Tt	00	00
ι-	CM	co	CO	o	CM
ο'	CM	X—	co	CM	Ó
p	00	Ol	co	CD	CO
Tt	ty	χΙ-	00	CO	to
00	LO	Ο	tn	CM	cn
r-	t—	to	o	Tj-	co
»—	CM	CM	Tt	CM	CM
χ^-	Τ-		V—	x~	x~
o	Ο	o	o	O	p
tri	tri	tri	tri	tri	tri
to	CM	to	o	co	χί-
cn	CM	to	co	Tt	Ο
wj co	to	cn	tn	tn	00
co	X^-	CM	co	tn	tn
CM	CM	CM	CM	CM	CM

6063 5.0 12383.6 0.13 0.00 No 226.4 10mM-HCI-10ul

Sensorogram mobilizacji PTHrP (1-34+C) na końcówce czujnika

126

190 351 m

ro

Ό $

Φ 'c _ Φ o N Φ

Φ- N ** —ł ω x 3

-= o c tn cm uo o

o

M^- o

QQ

o		O co s 75 E ro i_
o		o> o
co		L_
	O ω
	ω	c
		fl)
	ω	(0
	co	g>
	N	</)
	O	fl)
o		c
o		ro
CM		~σ
		ro 72 ro 2

FIG.20

O	o	O	O	o	O	o o	o
O	o	O	O	o	O	o	o
m-	CM	O	00	CD	xr	CM	CM

(na) efo^eey

190 351

127

3F5

O

LO o

o

N o

o co o

o

CN

C\J o

LL.

o	O	O	O	o	o	o o	o
o	O	O	O	o	o	o	o
Ν'	CN	O	CO	co		CN	CN

(ny) efo^esy

CO

CO ro

N o

Nakładanie się sensorogramu 3F5

128

190 351

FIG.22 chMBC

i a\ »λΓλιιΛΛ\ a kAa?

z—>

w <n ro

N

O

Nakładanie się sensorogramu chMBC

190 351

129

O r ° LO

FIG.23 hMBCm

Nakładanie się sensorogramu chMBC

o	o	O	O	o	o	o o	O
o	o	O	O	o	o	o	O
TC	CN	O	00	co	TC	CN	CN

\ino\ a

130

190 351

O

LO

O

O xr o

o co

FIG.24 hMBCq

o	o	O	O	o	o	o o	O
o	o	O	O	o	o	o	O
	CM	O	00	co	'M'	CM	CM

(na) Φ>|ΒθΗ o

o cm (Λ (0

N o

Nakładanie się sensorogramu hMBCq

190 351

131

FIG.25

Wpływ na frakcjonowane wydalanie foforanu

Frakcjonowane wydalanie fosforanu

Okres (1 okres: 20 minut; wartość średnia ± błąd standardowy)

132

190 351

0.070

FIG.26

Wpływ na stężenie foforanu w osoczu

Stężenie fosforanu w osoczu (mg/ml)

0.065

0.060

0.055

Humanizowane Przeciwciało przeciwko PTHrP

0.050 ^L0

J_I_I_I_L

2 3 4 5

Okres (1 okres: 20 minut; wartość średnia ± błąd standardowy)

190 351

133

FIG.27

134

190 351

FIG.28

190 351

135

FIG.29

Wpływ na spontaniczny ruch

Dni

136

190 351

FIG.30

Wpływ na temperaturę ciała

Temperatura ciała (°C)

J I-1-1

3 4

Szczur normalny Przeciwciało przeciwko PTHrP

Kontrola

Dni

190 351

137

FIG.31

Wpływ na pH krwi pH Krwi

7.52

7.50

7.48

7.46

7.44

7.42

HHM Kontrola

HHM Przeciwciało przeciwko PTHrP

Dni

138

190 351

FIG. 1

FR (region zrębowy)

Łańcuch ciężki (łańcuch H)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzezenia patentowe

1 Chimeryczny łańcuch L obejmujący region C łańcucha L przeciwciała ludzkiego i region V łańcucha L mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze region V łańcucha L obejmuje sekwencję aminokwasową jak pokazana na Id Sekw. Nr: 45
2 Chimeryczny łańcuch L według zastrz 1, znamienny tym, ze regionem C jest łańcuch CX
3 Chimeryczny łańcuch H obejmujący region C łańcucha H przeciwciała ludzkiego i region V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, że region V łańcucha H obejmuje sekwencję aminokwasową jak pokazana na Id. Sekw. Nr: 46.
4. Chimeryczny łańcuch H według zastrz 3, znamienny tym, ze regionem C jest łańcuch Cyl
5 Chimeryczne przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienne tym, ze obejmuje chimeryczny łańcuch L określony w zastrz 1 i chimeryczny łańcuch H określony w zastrz. 3
6. Polipeptyd obejmujący region V łańcucha L przeciwciała humanizowanego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze regiony zrębowe od 1 do 3 regionu V łańcucha L są identyczne z regionami zrębowymi 1 do 3 ludzkiego przeciwciała HSU03868, a region zrębowy 4 regionu V łańcucha Ljest identyczny z regionem 4 ludzkiego przeciwciała S25755, i regiony określające komplementamość 1 do 3 regionu V łańcucha L obejmują sekwencje aminokwasowe pokazane na Id. Sekw. Nr: od 59 do 61.
7 Polipeptyd według zastrz. 6, znamienny tym, ze w regionach zrębowych aminokwasami 36 i 49, według definicji Kabat'a, jest odpowiednio, tyrozyna i kwas asparaginowy.
8 Polipeptyd według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasowąjak pokazana nąjednym z Id. Sekw. Nr: od 48 do 51.
9 Polipeptyd według zastrz. 6, znamienny tym, że w regionach zrębowych aminokwasami 45 i 87, według definicji Kabat'a, jest odpowiednio lizyna i izoleucyna.
10 Polipeptyd według zastrz. 9, znamienny tym, ze obejmuje sekwencję aminokwasowąjak pokazana na jednym z Id. Sekw. Nr: od 52 do 55.
11 Polipeptyd obejmujący region V łańcucha H przeciwciała humanizowanego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze regiony zrębowe od 1 do 4 regionu V łańcucha H są identyczne z regionami zrębowymi 1 do 4 przeciwciała ludzkiego podgrupy m, a regiony określające komplementamość od 1 do 3 regionu V łańcucha H obejmują sekwencje aminokwasowe jak pokazane na Id. Sekw. Nr: od 62 do 64
12 Polipeptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że przeciwciało ludzkie jest ludzkim przeciwciałem S31679.
13 Polipeptyd według zastrz. 11, znamienny tym, ze obejmuje sekwencję aminokwasową jak pokazana na Id Sekw Nr: 56.
14 Łańcuch L humanizowanego przeciwciała przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze obejmuje polipeptyd obejmujący region C łańcucha L przeciwciała ludzkiego i polieptyd określony w zastrz. 6.

190 351
15. Łańcuch L humanizowanego przeciwciała według zastrz. 14, znamienny tym, ze regionem C jest łańcuch CX, regiony zrębowe od 1 do 3 są identyczne z, odpowiednio, regionami zrębowymi 1 do 3 ludzkiego przeciwciała HSU03868, a region zrębowy 4 jest identyczny z regionem zrębowym 4 ludzkiego przeciwciała S25755, zaś regiony określające komplementamość od 1 do 3 obejmują sekwencje aminokwasowe jak pokazane na, odpowiednio, Id. Sekw. Nr' 59 do 61.
16. Łańcuch H humanizowanego przeciwciała przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze obejmuje polipeptyd obejmujący region C łańcucha H ludzkiego przeciwciała i polipeptyd określony w zastrz. 11.
17. Łańcuch II humanizowanego przeciwciała według zastrz. 16, znamienny tym, ze regionem C jest łańcuch Cyl, regiony zrębowe od 1 do 4 pochodzą odpowiednio z regionów 1 do 4 ludzkiego przeciwciała HSGIII, zaś regiony określające komplementamość od 1 do 3 obejmują sekwencje aminokwasowe jak pokazane na, odpowiednio, Id. Sekw^;. Nr: 62 do 64.
18. Humanizowane przeciwciało przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem obejmujące łańcuch L humanizowanego przeciwciała określony w zastrz. 14 albo 15 oraz łańcuch H humanizowanego przeciwciała określony w zastrz. 16 albo 17.
19. DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą region V łańcucha L mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze region V łańcucha L obejmuje sekwencję aminokwasową jak pokazana na Id. Sekw Nr 45.
20. DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą region V łańcucha L mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze sekwencja zasad kodująca region V łańcucha L jest pokazana na Id. Sekw. Nr: 65
21. DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą region V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, ze region V łańcucha H obejmuje sekwencję aminokwasową jak pokazana na Id Sekw. Nr. 46
22. DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą region V łańcucha H mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, że sekwencja zasad kodująca region V łańcucha H jest pokazana na Id. Sekw. Nr: 57.
23. DNA kodujący chimeryczny łańcuch L określony w zastrz. 1.
24. DNA według zastrz. 23, znamienny tym, że koduje chimeryczny łańcuch L obejmujący sekwencję zasad jak pokazana na Id. Sekw. Nr: 65.
25 DNA kodujący chimeryczny łańcuch H określony w zastrz. 3.
26. DNA według zastrz. 25, znamienny tym, ze koduje chimeryczny łańcuch H obejmujący sekwencję zasad jak pokazana na Id. Sekw Nr: 57.
27. DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą polipeptyd określony w zastrz. 6.
28. DNA według zastrz. 27, znamienny tym, ze obejmuje sekwencję zasad jak pokazano na jednym z Id. Sekw. Nr: 66 do 74.
29. DNA obejmujący sekwencję zasad kodującą polipeptyd określony w zastrz. 11.
30. DNA według zastrz 29, znamienny tym, że obejmuje sekwencję zasad jak pokazano na Id. Sekw. Nr: 58.
31. DNA kodujący chimeryczny łańcuch L humanizowanego przeciwciała określonego w zastrz. 14.
32 DNA kodujący chimeryczny łańcuch L humanizowanego przeciwciała określonego w zastrz. 15.
33. DNA dla łańcucha L przeciwciała humanizowanego, znamienny tym, ze obejmuje sekwencję zasad kodującą sekwencję aminokwasową jak pokazana w jednym z Id. Sekw·'. Nr. 47 do 55
34. DNA według zastrz 33, znamienny tym, ze DNA dla łańcucha L przeciwciała humanizowanego obejmuje sekwencję zasad jak pokazana w jednym z Id. Sekw. Nr: 66 do 74.

190 351
35 DNA kodujący łańcuch H przeciwciała humanizowanego określony w zastrz 16
36. DNA kodujący łańcuch H przeciwciała humanizowanego określony w zastrz. 17
37 DNA dla łańcucha H przewciała humanizowanego, obejmujący sekwencję zasad kodującą sekwencję aminokwasowąjak pokazana w Id. Sekw. Nr: 56.
38. DNA według zastrz. 37, znamienny tym, że DNA dla łańcucha H przeciwciała humanizowanego obejmuje sekwencję zasad jak pokazana w Id. Sekw. Nr: 58.
39. Rekombinowany wektor obejmujący DNA określony w jednym z zastrz. 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 37.
40. Komórka gospodarza transformowana rekombinowanym wektorem określonym w zastrz. 39.
41. Sposób wytwarzania przeciwciała chimerycznego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, że obejmuje hodowanie transformantów transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym DNA określony w jednym z zastrz. 19, 20, 23 i wektorem ekspresyjnym obejmującym dNa określony w jednym z zastrz. 21, 22, 25;

i zbieranie z uzyskanej hodowli chimerycznego przeciwciała przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem.
42 Sposób wytwarzania przeciwciała humanizowanego przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem, znamienny tym, że obejmuje hodowanie transformantów transformowanych wektorem ekspresyjnym obejmującym DNA określony w jednym z zastrz. 27, 31, 32, 33, 34 i wektorem ekspresyjnym obejmującym DNA określony w jednym z zastrz. 29, 35, 36, 37, i zbieranie z uzyskanej hodowli humanizowanego przeciwciała przeciwko ludzkiemu białku pokrewnemu z parathormonem.
43. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze jako składnik czynny obejmuje humanizowane przeciwciało określone w zastrz. 18.
44 Czynnik do hamowania hiperkalcemii, znamienny tym, ze jako składnik czynny obejmuje humanizowane przeciwciało określone w zastrz. 18.
45 Czynnik do hamowania hiperkalcemii związanej z nowotworem złośliwym, znamienny tym, ze obejmuje jako składnik aktywny humanizowane przeciwciało określone w zastrz. 18.
46. Czynnik do hamowania hiperkalcemii według zastrz. 45, znamienny tym, że nowotwór złośliwy jest co najmniej jednym wybranym z grupy składającej się z raka trzustki, płuc, gardła, krtani, języka, dziąseł, przełyku, żołądka, dróg żółciowych, sutka, nerek, pęcherza moczowego, macicy i prostaty oraz chłoniaka złośliwego.
47 Czynnik do poprawienia stanu pacjenta z hipofosfatemią, znamienny tym, ze obejmuje jako czynnik aktywny humanizowane przeciwciało określone w zastrz. 18.
48. Czynnik według zastrz. 47, znamienny tym, że hipofosfatemią jest krzywica hipofosfatemiczna.
49. Czynnik do poprawienia stanu pacjenta z hipofosfatemią według zastrz. 47, znamienny tym, ze hipofosfatemiąjest krzywica hipofosfatemiczna oporna na witaminę D.