PL190401B1 - Wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus pochodzący ze szczepu parapoxwirusa D 1701, sposób wytwarzania szczepionki, oraz rekombinacyjnie wytworzone PPV - Google Patents

Abstract

1. Wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus pochodzacy ze szczepu parapox- wirusa D 1701 zdeponowanego pod numerem rejestracyjnym CNCM 1-751 1 zawiera- jacy przynajmniej jedna wstawke elementu obcego DNA we fragmencie I Hind III pa- rapoxwirusa szczepu D 1701. 2. Wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wstawka jest zlokalizowana w sekwencji kodujacej VEGF lub w przyleglych nie- kodujacych sekwencjach, przy czym sekwencja kodujaca VEGH jest scharakteryzowana przez nukleotydy od 92 do 487 sekwencji przedstawionej w Id Sekw. Nr 1. 5. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, ze obejmuje wlaczenie wy- tworzonego rekombinacyjnie parapoxwirusa pochodzacego ze szczepu parapoxwirusa D 1701 zdeponowanego pod numerem rejestracyjnym CNCM 1-751 i zawierajacego przy- najmniej jedna wstawke elementu obcego DNA we fragmencie I Hind III, która koduje im- munogenny skladnik patogenu. 6 Rekombinacyjnie wytworzone PPV, znamienne tym, ze zawieraja wstawki i/lub delecje w miejscu sekwencji genowej PK lub w przyleglych niekodujacych sekwencjach. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus pochodzący ze szczepu parapoxwirusa D 1701 zdeponowanego pod numerem rejestracyjnym CNCM 1-751 i zawierający przynajmniej jedną wstawkę elementu obcego DNA we fragmencie I Hind ΙΠ parapoxwirusa szczepu D 1701.

W korzystnym wykonaniu wynalazku wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus ma wstawkę zlokalizowaną w sekwencji kodującej VEGF lub w przyległych dekodujących sekwencjach, przy czym sekwencja kodująca VEGH jest scharakteryzowana przez nukleotydy od 92 do 487 sekwencji przedstawionej w Id Sekw. Nr 1, korzystniej wstawka jest zlokalizowana w sekwencji kodującej ITR lub w przyległych dekodujących sekwencjach, przy czym sekwencja kodująca ITR jest scharakteryzowana przez sekwencję przedstawioną w Id Sekw. Nr 4, jeszcze korzystniej, ze wstawka koduje immunogenny składdk patogenu.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania szczepionki obejmuiącej włączenie wytworzonego rekombinacyjnie parapoxwirusa pochodzącego ze szczepu parapoxwirusa D 1701 zdeponowanego pod numerem rejestracyjnym CNCM 1-751 i zawierającego przynajmniej jedną wstawkę elemend obcego DNA we fragmencie I Hind ΙΠ, która koduje immunogenny składnik patogenu.

Wynalazek dalej dotyczy rekombinacyjnie wytworzonych PPV, które zawierają wstawki i/lub delecje w miejscu sekwencji genowej PK lub w przyległych dekodujących sekwencjach.

190 401

Przedmiotem wynalazku są również rekombinacyjnie wytworzone PPV, które zawierają wstawki i/lub delecje w miejscu sekwencji genowej HD1R lub w przyległych niekodujących sekwencjach.

W zakres wynalazku wchodzą rekombinacyjnie wytworzone PPV, które zawierają wstawki i/lub delecje w miejscu sekwencji genowej F9L lub w przyległych niekodujących sekwencjach

Wynalazek dalej obejmuje rekombinacyjnie wytworzone PPV, które zawierają wstawki i/lub delecje w miejscu sekwencji genu, która koduje ITR lub w przyległych niekodujących sekwencjach..

Wynalazek również obejmuje rekombinacyjnie wytworzone PPV, które zawierają wstawki i/lub delecje w sekwencji międzygenowej pomiędzy genem HD1Ri genem PK.

Wyżej opisane fragmenty genomu PPV, które można wprowadzać do plazmidów albo wirusów i które mogą występować jako wolne segmenty DNA, obejmują dane sekwencje DNA i ich odmiany i homologi.

Wyżej wymienione określenia mają następujące znaczenia:

- atenuacja oznacza proces, w którym w wyniku zmiany w ich genomie, PPV stają się mniej patogenne albo me patogenne albo mniej zjadliwe albo nie zjadliwe dla ludzi albo zwierząt.

- plazmidy delecyjne oznaczają plazmidy, które oprócz plazmidowego DNA niosą segmenty genomu PPV, z których usunięto fragmenty.

- segmenty genomu niezbędne (istotne) do namnażania wirusa oznaczają części całego genomu PPV, które są niezastępowalne w namnazaniu PPV in vitro, tj. są niezastępowalne przy wytwarzaniu zakaźnego potomstwa wirusa.

Zakłócanie genów, które są istotne dla namnażania wirusa prowadzi do przerwania namnażania wirusa. Jeżeli, przykładowo, usunie się części tych genów albo całe geny, replikacja wirusa zostaje przerwana w określonym punkcie cyklu namnażania wirusa. Zakażenie albo traktowanie mutantami tego rodzaju nie prowadzi do uwalniania zakaźnego potomstwa z organizmu zwierzęcia Jeżeli części istotnego genu albo cały istotny gen jest zastąpiony przez obcy DNA, albo obcy DNA jest wprowadzony do istotnego genu, możliwe jest skonstruowanie szczepionek opartych na wektorze, który jest niezdolny do namnażania w organizmie szczepionego osobnika i w następstwie nie jest wydzielany jako zakaźny patogen.

- segmenty genomu, które nie są niezbędne (nieistotne) dla namnażania wirusa oznaczają części całego genomu PPV, które są zastępowalne w namnazaniu PPV in vitro, tj. przy tworzeniu zakaźnego potomstwa wirusa.

- elementy obcego DNA (obcy DNA) oznacza fragmenty DNA, np. obce geny albo sekwencje nukleotydów, które nie występują oryginalnie w PPV, który zastosowano według wynalazku.

Obcy DNA można wprowadzać do PPV w z następujących powodów:

1. w celu ekspresji obcego DNA,

2. w celu inaktywacji funkcji fragmentów DNA PPV, w celu znakowania PPV.

Zależnie od celu, wprowadza się różne obce DNA. Jeżeli obcy DNA ma ulegać ekspresji zgodnie z (1), wprowadzony obcy DNA powinien nieść przynajmniej otwartą ramkę odczytu, która koduje jedno albo więcej pożądanych obcych białek. Jeżeli to konieczne, obcy DNA dodatkowo zawiera własne albo obce sekwencje regulatorowe. Zdolność do przyjęcia obcego DNA można zwiększyć przez wytworzenie delecji w genomie wirusa. Ogólnie, długość zawiera się od 1 nukleotydu do 35000 nukleotydów, korzystnie pomiędzy 100 i około 15000 nukleotydów.

Przykładowo można wymienić geny albo części genów, z wirusów takich jak:

wirus Herpes suid 1, końskie wirusy herpes, bydlęce wirusy herpes, wirus choroby kopyt i pyska, bydlęcy wirus oddechowy, bydlęcy wirus paragrypy 3,

190 401 wirus grypy,

Calciwirus,

FIaviwirusy, np. bydlęcy wirus krwawej biegunki albo wirusy klasycznej gorączki świń, albo bakterii takich jak Pasteurella spec.,

Salmonella spec .

Actinobacillus spec .

Chlamydia spec, albo pasożytów takich jak:

Tosoplasma.

Dirofilana,

Echinococcus.

Jeżeli obcy DNA, który ma być wprowadzony zgodnie z (2), wprowadzenie odpowiedniego obcego nukleotydu jest w zasadzie wystarczające do zaburzenia sekwencji DNA wektora wirusowego. Maksymalna długość obcego DNA, który jest wprowadzany w celu inaktywacji zalezy od zdolności wektora wirusowego do przyjęcia obcego DNA. Ogólnie, długość obcego DNA zawiera się od 1 nukleotydu do 35000 nukleotydów, korzystnie pomiędzy 100 i około 15000 nukleotydów, szczególnie korzystnie od 3 do 100 nukleotydów.

Jeżeli sekwencje DNA mają być wprowadzone w celu znakowania według (3), ich długość zależy od zastosowanego sposobu identyfikacji znakowanego wirusa.

Ogólnie długość obcego DNA zawiera się od 1 nukleotydu do 25000 nukleotydów, korzystnie pomiędzy 20 i około 15000 nukleotydów, szczególnie korzystnie od 3 do 100 nukleotydów;

- biblioteka genów oznacza całość fragmentów genomu, które zawarte są w wektorach zdolnych do replikacji. Bibliotekę otrzymuje się przez fragmentację genomu i wprowadzenie wszystkich fragmentów, kilku albo większej części fragmentów do wektorów, które są zdolne do replikacji, przykładowo do plazmidó w.

Fragment genomu oznacza część genomu, która może występować w postaci izolowanej albo może być wprowadzona do wektora, który jest zdolny do replikacji.

- inaktywacja przez insercję oznacza, ze wprowadzony fragment DNA zapobiega ekspresji albo funkcji natywnych sekwencji genomu PPV

- insercjami są kawałki DNA, które dodatkowo włączono do genomu PPV Zależnie od powodu insercji, długość fragmentów DNA może się zawierać od 1 nukleotydu do kilku tysięcy nukleotydów (patrz również, definicja „obcego DNA”).

- plazmidy insercyjne oznaczają plazmidy, w szczególności plazmidy bakteryjne, które zawierają wprowadzony obcy DNA otoczony sekwencjami DNAPPV.

- miejsca insercyjne oznaczają miejsca w genomie wirusowym, które są przydatne do przyjmowania obcego DNA.

- klonowanie oznacza, ze genomowy DNA PPV jest izolowany i fragmentowany. Fragmenty albo selekcje fragmentów, wprowadza się następnie do zwykłych wektorów DNA (plazmidów bakteryjnych albo wektorów fagowych albo wektorów eukariotycznych).

Odnośnik 11 dostarcza wybranych sposobów wytwarzania i klonowania fragmentów DNA Wektory DNA, zawierające fragmenty DNA PPV jako wstawki stosuje się, przykładowo, do wytwarzania identycznych kopii oryginalnie izolowanych fragmentów DNA PPV.

- znakowanie przez insercję oznacza, ze wprowadzony obcy DNA umożliwia późniejszą identyfikację zmodyfikowanego PPV.

- ORF (otwarta ramka odczytu) oznacza sekwencję nukleotydów, na poziomie DNA, która określa sekwencję aminokwasową ewentualnego białka. Obejmuje ona pewną liczbę, określoną wielkością białka, które określa, tripletów nukleotydów, które na końcu 5' ograniczone są kodonem start (ATG), zaś na końcu 3' kodonem stop (TAG, TGA, TAA).

- sekwencje regulatorowe oznaczają sekwencje DNA, które wywierają swój wpływ na ekspresję genów. Sekwencje tego rodzaju znane są z odnośnika 15.

Korzystnie można wymienić promotor VEGF, jak opisany w Identyfikatorze Sekw. nr 6

190 401

- rekombinowane PPV oznaczają PPV zawierające insercje i/lub delecje w genomie. W tym kontekście, insercje i delecje tworzy się metodami biologii molekularnej.

- sekwencje (DNA) powtarzające się oznaczają identyczne sekwencje nukleotydowe, które występują w genomie PPV bezpośrednio jedna za drugą albo rozrzucone w rożnych miejscach

- wektor wirusowy oznacza PPV, który jest przydatny do wprowadzania obcego DNA i który może transportować wprowadzony obcy dNa, w swoim genomie, do zakazanych komórek albo organizmów, i który jeżeli to konieczne, umożliwi ekspresję obcego DNA

Nowe PPV według wynalazku według wytwarza się w następujący sposób:

1. selekcjonuje się odpowiedni szczep PPV,

2. identyfikuje się segmenty genomu w genomie PPV, które posiadają miejsca insercyjne,

2a. Identyfikuje się segmenty genomu PPV posiadające miejsca insercyjne w genach, które nic są istotne dla namnażania wirusa,

2b. Identyfikuje się segmenty genomu PPV posiadające miejsca insercyjne w genach, które są istotne dla namnażania wirusa,

2c Identyfikuje się segmenty genomu posiadające miejsca insercyjne w regionach poza genami w genomie PPV i/lub w powtórzeniach genów,

2d. Innymi sposobami identyfikuje się segmenty genomu posiadające miejsca insercyjne,

2e Szuka się pożądanego miejsca insercyjnego,

1. Identyfikuje się miejsca insercyjne,

2.1.1. Oczyszcza się genom,

2.1.2 Klonuje się fragmenty genomu i wytwarza się bibliotekę genów,

2.1.3 Sekwencjonuje się w celu identyfikacji genów albo segmentów genów poza genami,

2.2 4 Selekcjonuje się klony zawierające fragmenty genomu PPV w celu dalszej obróbki,

2.2. Jako miejsca insercyjne stosuje się region ITR, gen VEGF, gen PK, gen kodujący białko 10 kDa oraz region pomiędzy genem PK i genem HD1R,

2.2.1 Klonuje się genVEGF,

2.2 2 Klonuje się gen kinazy białkowej,

2.2.3 Klonuje się region genu, który koduje białko 10 kDa,

2.2.4 Klonuje się region ITR (odwrócony region końcowych powtórzeń) albo segment genomu, który leży pomiędzy genem PK i genem HD1R,

3. Konstruuje się plazmidy insercyjne albo plazmidy delecyjne, które zawierają wstawiany segment obcego DNA,

1 Identyfikuje się albo wytwarza miejsce rozpoznawania przez enzymy restrykcyjne, które występują jeden raz, tj. unikalne miejsca restrykcyjne, w klonowanych fragmentach genomu i wprowadza się obcy DNA,

3.3. Kombinacja 3.1. i 3.2.,

Konstruuje się rekombinowane PPV według 1 do 12 (wyżej).

Selekcja odpowiedniego szczepu PPV

W zasadzie, wszystkie gatunki PPV są przydatne do zastosowania wynalazku. Korzystne są szczepy wirusowe, które można namnożyć do miana >105 PFU (jednostki tworzące łysinki)/ml hodowli tkankowej i które można wytworzyć w postaci czystej z zewnątrzkomórkowego, zakaźnego wirusa, z pożywki zakazonych komórek. Gatunkiem rodzaju PPV, który można wymienić jako korzystny jest PPV ovis (wirusy orf).

Szczepem PPV ovis, który można wymienić jako szczególnie korzystny jest D1701, który zdeponowano 28 kwietnia 1988, zgodnie z postanowieniami Traktatu Budapeszteńskiego w Institut Pasteur, CNCM, pod numerem CNCM 1-751, jak rówmeż jego mutanty i odmiany.

Wirusy namnaza się w zwykły sposób w hodowli tkankowej komórek zwierzęcych, takich jak komórki ssaków. np komórki owcze albo komórki bydlęce, korzystnie takie komórki bydlęce jak ustalona linia komórkowa nerki bydlęcej BK-K1-3A (albo jej potomstwo), albo komórki małpie, takie jak ustalona linia komórkowa nerki małpiej MA101 albo Vero (albo ich potomstwo)

190 401

Namnażanie uzyskuje się w sposób znany per se w hodowlach stacjonarnych, obrotowych albo nośnikowych w postaci zwartych agregatów komórek albo w hodowlach w zawiesinie.

Komórki albo warstwy komórek, które stosuje się do namnażania wirusów hoduje się praktycznie do zlewności albo do optymalnej gęstości stosując metody standardowe. Komórki zakaza się rozcieńczeniami wirusa odpowiadającymi MOI (= wielokrotność zakazenia, co odpowiada liczbie zakaźnych cząstek wirusowych na komórkę).

Wirus namnaża się z dodatkiem albo bez dodatku surowicy zwierzęcej. Jeżeli stosuje się surowicę, dodaje się jądo pożywki w stężeniu 1-30%, korzystnie 1-10%

Zakażenie i namnażanie wirusa przeprowadza się w temperaturach pomiędzy temperaturą pokojową i 40°C, korzystnie pomiędzy 32°C i 39°C, szczególnie korzystnie w 37°C, przez kilka dni, korzystnie, dopóki zakazone komórki nie zostaną całkowicie zniszczone. W połączeniu ze zbieraniem wirusa, wirus, który wciąż jest związany z błonami można dodatkowo uwolnić mechanicznie albo przy użyciu ultrasonikacji, albo delikatnym trawieniem proteolitycznym, stosując przykładowo trypsynę.

Pożywkę z zakazonych komórek zawierającą wirusa można dalej przetwarzać, przykładowo, przez usunięcie resztek komórkowych przy użyciu filtracji stosując filtry o wielkości porów, przykładowo od 0,2-0,45 pm i/lub wolnoobrotowe wirowanie.

Filtraty albo nadsącze z wirowania można zastosować do zagęszczania wirusa i oczyszczania. W tym celu, filtraty albo nadsącze poddaje się szybkoobrotowemu wirowaniu dopóki cząstki wirusa nie opadną na dno. Jeżeli to konieczne, można wykonać dalsze etapy oczyszczania, przykładowo, przy użyciu wirowania na gradiencie gęstości.

2. Identyfikacja segmentów·· genomu w genomie PPV, które posiadają miejsca :^rjscrcyj^e

Różne regiony w genomie PPV można zastosować jako miejąca insarcyJae do wprowadzania obcego DNA. Obcy DNA można wprowadzić:

a do genów, które nie są istotne dla namnażania wirusa, b do genów, które są istotne dla aamnażenia wirusa, c. do genów, które nie posiadają żadnej funkcji.

2a. Identyfikacja segmentów genomu PPV posiadających miejsca iasercyjaa w genach, które nie są istotne dla namnażania wirusa

i. Geny wirusowe, które nie są istotne dla namnażania wirusa znajduje się, przykładowo, przez przeprowadzenie badań porównawczych stosując przedstawicieli różnych gatunków PPV. Geny. które nie występują w jednym albo wielu izolatach albo szczepach gatunków PPV, ale które spotyka się w innych izolatach albo szczepach są potencjalnie nieistotne.

ii. Geny, które nie są istotne dla aamaażaaia wirusa można również zidentyfikować w alternatywny sposób. Po ąakwancjoaowaniu fragmentów genomu PPV, które mogą, przykładowo, być obecne w klonowanych fragmentach, sekwencje DNA bada się w kierunku ewentualnych „otwartych ramek odczytu” (ORF). Jeżeli znajdzie się ORF, jej funkcję jako gen potwierdza się wykazując transkrypcję i/lub translację. W celu ustalenia czy znaleziony gen jest nieistotny dla namnażaaia wirusa, stosuje się metody biologii molekularnej w celu usunięcia genu z genomu PPV albo zniszczenia go częściowo albo przerwanie przez wprowadzenie (a) mutacji, po czym bada się zdolność powstałego wirusa do namnażania. Jeżeli wirus jest zdolny do namnażama bez obecności manipulowanego genu, jest on genem nieistotnym.

Przykłady zidentyfikowanych miejsc insarcyjaych

i. W tym miejscu można wymienić gen VEGf PPV ovis jako przykład nieistotnego genu, który można zastosować jako miejsce msercyjne dla obcego DNA. Gen ten jest spotykany w szczepach Parapoxvirus ovis (NZ-2, NZ-7 i D1701), które zbadano (6). Genu VEGF me stwierdzono w niektórych szczepach PPV, przykładowo u przedstawicieli PPV bovią 1. Region genomu PPV zawierający gen VEGF można zidentyfikować przy użyciu sekwencji DNA pokazanej jako Identyfikator Sekw. nr 1. Standardowe metody biologii molekularnej można zastosować w celu znalezienia genu w genomie PPY przy użyciu hybrydyzacji, analizy sekwencji genomu i/lub reakcji łańcuchowej polimerazy.

u. Gen dla białka 10 kDa można wymimić jako inny przykład potencjalnie nieistotnego genu PPY. Gen ten spotyka się w szczepach Parapoxvirus ovis (NZ-2, NZ-7 i D1701)

190 401

Standardowe metody biologii molekularnej można zastosować w celu znalezienia genu białka 10 kDa w genomie PPV, przykładowo przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) Odnośnik 8 podaje sekwencję DNA białka 10 kDa. Startery, które można zastosować do PCR podane są, przykładowo, w odnośniku 8. Identyfikator Sekw. nr 11 pokazuje sekwencję DNA produktu pCr swoistego dla 10 kDa z D1701.

W celu wprowadzania obcego DNA, nieistotny gen można usunąć z genomu PPV częściowo albo w całości. Jednakże, możliwe jest również wprowadzenie obcego DNA do nieistotnego genu bez usuwania jakiegokolwiek regionu genu PPV. Miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne można, przykładowo, zastosować jako miejsca insercyjne.

2.b. Identyfikacja segmentów genomu PPV posiadających miejsca insercyjne w genach, które są istotne dla namnażania wirusa

i. Istotne geny można zidentyfikować przez sekwencjonowanie fragmentów genomu wirusowego, które występują, przykładowo jako fragmenty klonowane, a następnie identyfikację ORF.

Jeżeli znajdzie się ORF, jej funkcję jako gen potwierdza się wykazując transkrypcję i/lub translację W celu ustalenia czy znaleziony gen jest istotny dla namnażania wirusa, stosuje się metody biologii molekularnej w celu usunięcia genu z genomu PPV albo zniszczenia go częściowo albo przerwanie przez wprowadzenie (a) mutacji, po czym bada się zdolność powstałego wirusa do namnażania. Jeżeli wirus zmutowany nie jest zdolny do namnażania bez obecności manipulowanego genu, jest on genem istotnym.

Jeżeli mutant wirusa jest zdolny do wzrostu jedynie na uzupełniających liniach komórkowych, dowodzi to, ze gen jest istotny.

Przykłady miejsc lnserjyjnyjh

Gen kinazy białkowej (gen PK) D1701 można wymienić jako przykład. Gen PK ulega ekspresji późno w cyklu namnażania wirusa. Wersje sekwencji DNA pokazanej jako Identyfikatory Sekw nr 2, 9 i 13, można zastosować do identyfikacji genu PK w genomie PPV. Zwykłe metody biologii molekularnej można zastosować w celu znalezienia genu w genomie PPV przy użyciu hybrydyzacji, analizy sekwencji genomu i/lub reakcji łańcuchowej polimerazy.

W celu wprowadzania obcego DNA, nieistotny gen można usunąć z genomu PPV częściowo albo w całości. Jednakże, możliwe jest również wprowadzenie obcego DNA do nieistotnego genu bez usuwania jakiegokolwiek regionu genu PPV.

2c. Identyfikacja segmentów genomu posiadających miejsca insercyjne w regionach poza genami w genomie PPV i/lub w powtórzeniach genów

Segmenty genomu, które nie kodują funkcjonalnych produktów genowych i które nie posiadają żadnej funkcji regulacyjnej (tzw. segmenty międzygenowe) są, zasadniczo, przydatne do zastosowania jako miejsca insercyjne dla obcego DNA. Regiony zawierające sekwencje powtarzające się są szczególnie przydatne, ponieważ zmiany w części regionu mogą być maskowane pozostałymi powtórzeniami sekwencji. Geny, które występują w dwóch albo wielu kopiach, tzw'. podwojenia genu, również zaliczają się do tej kategorii.

Geny w regionie ITR albo w podwojonych segmentach genomu PPV występują w dwóch kopiach w genomie wirusowym. Jeżeli jedną z kopii usunie się albo zmieni i wprowadzi się obcy DNA, można uzyskać stabilne rekombinowane PPV, nawet gdy zmieniony gen jest istotny dla namnażania wirusa. Druga, niezmieniona kopia genu może wystarczyć do działania genu.

i. W celu identyfikacji sekwencji genomu, które: nie leodująproduktów genu stosuje się analizę sekwencji genomu PPV Regiony genomu, które nie wykazują ORF po analizie sekwencji, albo Craaegrypcji swoistej dla wirusa i które nie posiadają żadnej funkcji regulatorowej stanowią koCeacjalae miejsce iasercyjno. W szczególności, miejsca cięcia enzymami reetrykcyjnyml w tych regionach są potencjalnymi· miejscami iasercyjaymi. W celu sprawdzenia czy występuje potencjalne miejsce lneorcyjne stosuje się znane metody biologii molekularnej w celu wprowadzenia obcego DNA do potencjalnego miejsca meercyjaogo, po czym bada się żywotność powstałego mutanta wirusa. Jeżeli mutant wirusa, który aiosio obcy DNa w ewentualnym miejscu lasercyjaym jest zdolny do aamaazaaia, badane miejsce jest przydatnym miejscem meorcyjnym.

190 401 ii Hybrydyzację DNA i/lub analizy sekwencji stosuje się w celu identyfikacji sekwencji powtarzających się i pokwojnń gnnów. W hybrydyzacji, klonowana i izolowana fcagmantz PPV stosują się jako sondy ko hybrydyzacji z fCagmantami DNA PPV. Fragmanty ganomy PPV, itóra hybrydyzują z więcaj niz jaknym fragmantam całago ganomu PPV zawiarąjąjakną albo wiata saewancji powtarzających się. W calu zlokalizowania saewancji powtarzających się albo pokwojonych ragionów ganomu koiłaknia wa fragmancia ganomu, oiraśla się saewancję nuelaotykową tago fragmantu. W calu ustalania, czy potancjalna miajsca insarcyjna jast przykatna w całym ganomia PPV, obcy DNA wporwakza się ko saewancji powtarzającaj się albo ko kopii pokwojania ganu i fragmant ganomu PPV zawiarający wstawię wprowakza się ko ganomu PPV Następnia baka się zkolność ko namnazania raeombinowanago wirusa, zawiarającago obcy DNA. Jazali wirus raeombinowany namnaza się, zidanSyfikowany ragion jast przykatny jaeo miajsca icsareyjca.

Przyełaky miajsc insarcejnech ,i. Sagmant ganomu pomiędze ganam einazy białeowaj i ganam HD1R (Idantyfieator Saew. nr 7) mozna wymianić jaeo przydak ragiony miękzy ganowago.

ii Ragion ITR (Ikantyfieator Saew. nr 4) mozna wymianić jaeo przyełak saewancji pow-larzającej się iii PoSancJatne gan „ORF3” (w ragionia ITR) oraz gan VEGF mozna wymianić jaeo przyełade pokwojania ganu w szczapia D1701 PPV. Hyaredyzacja wyeazała, za ragion zawiarające gan VEGF w obac^m szczapia D1701 został pokwojony i przaniasione na inny eomac ganomu wirusowago w taei sposób, za występują kwia eopia ganu VEGF.

Przy pomocy sakwancJl IdanSefikatora Saew. nr 4 (sakwaneja ITR z „ganam ORF3”) i Idantyfieasora Sakw. nr 7 (ragion pomiękzy ganami PK i HD1R), mozna zastosować zwzkła matoke biologii molakularnaJ, taeia jae hybredyzaeja, analizy saewancji ganomu i/lub raakcja łańcuchowa potimeIazj, w calu sSwlardzania odpowiadnich ragionów ganomu w innych PPV

2.k Inna sposoby ikantefieacJl miajsc lnsarcejnech

Ogólnm, mozna zastosować modyfieacJa saewancji ganomu wirusowago w calu stwiarkzania potencjatneeh miajsc msercejnech w ganomia PPV. Miajsca ganomu, w dóiych substytucja, kalacja i/lub insarcja albo ich kombinacja, nia bloeują namnazania wirusa, stanowią poSancjatna miajsca insareyjr^e. W calu sprawdzania, czy potancjatna miajsca rnsarczna jast przedatne'm miajscam insarcznym, stosuja się znana maSode biologii motakytarnaj w calu wprowadzania obcago DNA ko pota^ja^ych miajsc insarcyjnych, a następnia baka się powstałago mutanta wirusa. Jazali raeomblnowane wirus jast zkolny ko namnazania, bakana miajsca jast przydatnem miajscam lnsareeJnym.

2.1 ΙχΤίτΖυΙ-ο-a nnejsc nych

2.11 Oczyszczania ganomu PPV

W calu elonowania miajsc lnsareejnych PPV matokami biologii motakulamaJ, ganom PPV najpiarw oczyszcza się. Ganom izoluja się z wirusa wytworzonago wakług 1 (wyzaj), a następnia oczyszcza się go. NaSewny wirusowy DNA eorzystnia aestrahuja się przaz traetowania oczyszczonych wirionów woknym roztworam kaSargantów i protaaz.

Datargantami, etóra mozna wymianić są daSargante anionowa, eationowa, amfatarzczne i niajonowa. Korzystna jast zastosowania kaSarganSów jonow-ych Szczagólnia eorzystna jast sól sokowa siarczany dodaeelu (sól sokowa siarczanu layretu).

Protaazami, etóra mozna wymianić są wszystka proSaazy, etóra kziałają w obacności kaSargentów, taeia jae protaaza K i pronaza ProSainazę K mozna wymianić jabo szczagólnia eorzystn^.

Detargante stosuja się w stęzaniu 0,1-10% obj., korzestnla 0,5-3% obj.

Protaaze stosuja się w stęzaniach 0,01-10 mg/ml lizatu wirusa, eorzestnla 0,05-0,5 mg/ml lizatu wirusa.

Korzystna jast przaprowadzama raakeji w woknym, buforowanym roztworza w obacności inhibitorów DNazy. Substancjami buforującymi, etóra mozna wymianić są sola słabych ewasów i silnych zasak, np Srls(hekroesematyloaminomatanu), sola silnych ewasów i słabych zasak, np. plerwszorzędowa fosforany albo ich miaszaniny

190 401

Korzystnym układem buforującym jest tris (hydroksymetyloaminometan).

Substancje buforujące albo układy buforujące stosowane są w stężeniach, które zapewniają wartości pH przy których DNA nie denaturuje. Korzystne są wartości pH 5-9, szczególnie korzystne są wartości pH 6-8,5, zaś bardzo szczególnie korzystne są wartości pH 7-8, w szczególności można wymienić działanie w zakresie neutralnym

Przykładem inhibitora DNazy jest kwas etylenodiammotetraoctowy w stężeniu 0,1-10 mM (milimolarnym), korzystnie około 1 mM.

Następnie, ekstrahuje się składnik lipidowy lizatu wirusa. Jak czynniki ekstrahujące stosuje się rozpuszczalniki takie jak fenol, chloroform, alkoholizoamylowy i ich mieszaniny. Korzystne jest zastosowanie na wstępie mieszaniny fenolu i chloroformu/alkoholu izoamylowego, z ekstrakcją przebiegająca na wielu etapach.

Przykładem innych metod izolowania wirusowego DNa jest wirowanie lizatu wirusa na gradiencie gęstości CsCl albo elektroforeza na żelu (patrz, 14).

Ekstrakcję kwasów nukleinowych opisano w odnośniku 13.

DNA, który ekstrahowano w ten sposób, korzystnie precypituje się z roztworu wodnego, przykładowo, alkoholem, korzystnie etanolem albo izopropanolem i dodaniem soli jednowartościowych takich jak chlorki albo octany metali alkalicznych, korzystnie chlorku litu, chlorku sodu albo octanu sodu albo octanu potasu (patrz, wyżej).

1.2. Klonowanie fragmentów genomu

Wirusowy DNA, który oczyszczono w taki sposób stosuje się następnie do wytworzenia fragmentów DNA. W tym celu, traktuje się go, przykładowo, enzymami restrykcyjnymi. Przykładami przydatnych enzymów restrykcyjnych są EcoRI, BamHI, HindIII i KpnI. Alternatywnie fragmenty genomu można syntetyzować przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W tym celu wybiera się startery z segmentów sekwencji genomu wirusowego, który jest juz znany i segment genomu, który jest ograniczony przez parę starterów syntetyzuje się in vitro stosują, przykładowo, polimerazę Taq albo Pfu.

Fragmenty DNA powstałe z trawienia restrykcyjnego albo PCR można klonować do układów wektora stosując sposoby opisane w Sambrook i in, 89. Przykładowo, zależnie od wielkości klonowanego fragmentu DNA, można zastosować wektory plazmidowe, wektory fagów lambda albo wektory kosmidowe.

2.1.3 Sekwencjonowanie, identyfikacja i charakterystyka genów oraz potwierdzanie ich ekspresji

Fragmenty genomu, które klonuje się do wektorów przede wszystkim analizuje się przez gokweacjonowaaie. Wprowadzony segment DNA mapuje się stosując różne enzymy restrykcyjne i odpowiednie fragmenty klonuje się do wektorów plazmidowych. Reakcję sekwencjonowania przeprowadza się, przykładowo, przy użyciu zestawu do sokwoncjonowama T7, z firmy Pearmacia, według instrukcji producenta. Dwuniciowy plazmidowy DNA, który jest niezbędny do tego, jest korzystnie wytwarzany z użyciem metody PEG (Hattori i Saiki, 1985) „Otwarte ramki odczytu (ORF)”, które występują we fragmentach genomu ιΙο^^ι^ο się przy użyciu analizy komputerowej (GCG, patrz wyżej). Informację na temat odpowiedniej funkcji zidentyfikowanych ORF można uzyskać przy użyciu porównania ich sekwencji mmymi sekwencjami genów o znanej funkcji, znajdujących się w bazie danych. Zidentyfikowane ORF charakteryzuje się funkcjoaalme przez wykrywanie odpowiadających im traagkryptów w komórkach zakazonych wirusem W tym celu, stosuje się metodę AGPC (Chomczynski i Sacchi, (20) 1987) do izolacji całkowitego RNA z komórek zakażonych wirusem. Swoiste transkrypty. oraz ich końce 5' i 3', można zidentyfikować przy użyciu analizy Northern blot albo wydłużania starterów i metody hhrenioaia RNA. Jako alternatywa, możliwe jest wyrażanie białka wirusowego, które jest kodowane, przez idoaΐyaikację ORF in vurof następnie przez zastosowanie produktu ekspresji do uzyskania surowic odpornościowych i zastosowanie surowic do wykazania ekspresji ORE.

W celu ustalenia, czy gen który znaleziono jest nieistotny dla namnażania wirusa, gen można zniszczyć przez rozerwanie albo delecję genu. W tym kontekście, cały gen, albo jego części, usuwa się z genomu PPV albo ramkę odczytu genu przerywa się przez wprowadzenie

190 401 sekwencji genu obcego. Bada się zdolność powstałego wirusa do namnażania. Jeżeli wirus może replikować nawet bez obecności zniszczonego genu, gen ten jest genem nieistotnym.

2.1 4 Selekcjonowanie klonów zawierających fragmenty genomu PPV

To, który z klonów zawierających fragment genomu PPV uzyskany powyżej zostanie zastosowany, zależy od tego czy rekombinowane PPV, które wytworzono są (1) zdolne do replikacji czy (ii) niezdolne do replikacji.

i. Jeżeli wytwarza się rekombinowane PPV, które są zdolne do replikacji mimo insercji i/lub delecji, dalszą obróbkę przeprowadza się na klonowanych fragmentach genomu wirusowego, które zawierają geny albo regiony genomu poza genami nieistotnymi dla replikacji wirusa albo, które zawierają podwojenia genów.

Mutanty wirusa stosuje się w celu zbadania, czy gen albo region genomu jest regionem nieistotnym genomu wirusa albo podwojeniem genu. W tym celu stosuje się metody biologii molekularnej w celu inaktywacji genu albo regionu genomu w badanym PPV, przykładowo, przez częściowe albo całkowite usunięcie danego regionu, po czym bada się zdolność mutantów wirusowych do namnażania. Jeżeli mutant wirusa może namnażać się mimo inaktywacji danego genu albo regionu genomu, badany gen albo region genomu jest regionem nieistotnym.

Korzystne są klonowane fragmenty genomu PPV, które zawierają kompletne wersje nieistotnych genów. Oprócz tego, powinny również występować regiony flankujące genomu wirusowego na końcach genów albo regionów genomu. Długość regionów flankujących nie powinna przekraczać 100 par zasad. Jeżeli niedostępne są takie klony genomowe, można je wytworzyć z istniejących klonów genów przy użyciu metod biologii molekularnej. Jeżeli klonowane fragmenty genomu dodatkowo zawierają regiony genomu, które nie są niezbędne w niniejszych preparatach, regiony te można usunąć przy użyciu klonowania.

ii. Jeżeli wytwarza się rekombinowane PPV, które utraciły zdolność do tworzenia zakaźnego potomstwa w wyniku insercji i/lub delecji, klonowane fragmenty genomu wirusowego, które zawierają geny albo regiony genomu poza genami, które nie są istotne dla namnażania wirusa są przedmiotem dalszej obróbki.

Mutanty wirusa można zastosować do badania, czy gen albo region genomu jest istotnym regionem genomu wirusowego. W tym celu, metody biologii molekularnej stosuje się w celu inaktywacji genu albo regionu genomu w badanym PPV, przykładowo bada się przez częściowe albo całkowite usunięcie badanego regionu zdolność wirusa do namnażania. Jeżeli wirus nie może się namnażać w wyniku inaktywacji badanego genu albo regionu genomu, badany gen albo region genomu jest regionem istotnym.

Korzystne są klonowane fragmenty genomu PPV, które zawierają kompletne wersje istotnych genów. Oprócz tego, powinny również występować regiony flankujące genomu wirusowego na końcach genów albo regionów genomu. Długość regionów flankujących nie powinna przekraczać 100 par zasad. Jeżeli niedostępne są takie klony genomowe, można je wytworzyć z istniejących klonów genów przy użyciu metod biologii molekularnej. Jeżeli klonowane fragmenty genomu dodatkowo zawierają regiony genomu, które nie są niezbędne w niniejszych preparatach, regiony te można usunąć przy użyciu klonowania.

2.2. Region ITR, gen VEGF, Een PK. g en koduj ący ujałko 10 Waoraz rerazn pomi ędzy genem PK i genem HD1R, jako miejsca insercyjne

Jeżeli region ITR, gen VEGF, gen PK, gen kodujący białko 10 kDa oraz regien pomiędzy genem PK i genem HD1R stosuje się jako miejsce insercyjne w PPV, izoluje się odpowiednie regiony genomu PPV, które zawierają miejsca insercyjne. W tym celu, klonuje się odpowiednie regiony genomu PPV.

2.2.1. Klonowanie genu VEGF ___

Gen, który koduje VEGF położony jest w genomie PPV i izoluje się go w części albo w całości wraz z segmentami flankującymi genomu. W tym celu, PPV korzystnie namnaza się według 1, zaś genom jego oczyszcza się według 2.1.1.

a Gen VEGF korzystnie namnaza się przy użyciu reakcji łańcuchowej polime^zy (PCR) Sekwencje startowe (startery), które są niezbędne do tej reakcji pochodzą z sekwencji DNA genu VEGF, który jest przedstawiony na Identyfikatorze Sekw'. nr 1. Powstały produkt jest korzystnie klonowany.

190 401 b Region, który zawiera gen VEGF i jego flankujące segmenty genomu korzystnie otrzymuje się przez fragmentację genomu PPV i izolowanie i klonowanie odpowiednich fragmentów genomu W tym celu, oczyszczony genom wirusa tnie się jak to opisano w 2 1.2 , korzystnie przy użyciu enzymu restrykcyjnego HindIII. Fragmenty genomu, które uzyskuje się po trawiemu restrykcyjnym korzystnie frakcjonuje się przy użyciu metod elektroforetycznych albo chromatograficznych, w celu identyfikacji fragmentów genomu, które niosą gen VEGF i jego flankujące segmenty genomowe.

Frakcjonowanie na agarozie albo akryloamidzie przeprowadza się stosując standardowe metody, które opisano w

- Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, Wiley-Interscience 1987,

- A Practicał Guide to Molecular Cloning, Perbal, wyd. 2, Wiley Interscience, 1988,

- Molecular Cloning, patrz, lit,

- Virologische Arbeitsmethoden [Practicał Methods in Viiology], tom ΠΙ, Gustav Fischer Verlag, 1989.

Identyfikuje się fragmenty genomu, które niosą gen VEGF i jego sekwencje flankujące, przykładowo, przy użyciu hybrydyzacji określonymi sondami kwasu nukleinowego. W tym celu, frakcjonowane fragmenty genomu przenosi się na filtry i hybrydyzuje z sondami kwasu nukleinowego swoistymi dla VEGF, zgodnie z metodą Southern biot. Sposoby przenoszenia fragmentów genomu i hybrydyzacji można przeprowadzić zgodnie z protokołami standardowymi, jak opisano w „Southern blotting” w Molecular Cloning Oligonukleotydy albo fragmenty kwasu nukleinowego, które można zastosować jako sondy można uzyskać z Identyfikatora Sekw. nr 1. Przykładowo, fragment Taql (366 bp), który można zidentyfikować przy uzyra sekw. nr 1, stosuje się jako sondę hybrydyzacyjną.

Fragmenty genomu, które zawierają jak wykazano, części albo korzystnie całość genu VEGF i segmenty flankujące genomu izoluje się i klonuje. Odpowiednie fragmenty genomu izoluje się elektroforetycznie, przykładowo, z odpowiedniego regionu zelu, przy użyciu elektroelucji albo przez zastosowanie agarozy o niskiej temperaturze topnienia.

W celu klonowania genu VEGF, fragmenty genomu, które wytworzono powyżej wprowadza się do wektorów bakteryjnych albo eukariotycznych. Wektory plazmidowe albo fagowe są szczególnie korzystne W celu wprowadzenia fragmentu genomu, dwuniciowe cząsteczki DNA plazmidu albo faga traktuje się enzymami restrykcyjnymi w taki sposób, że wytwarza się końce odpowiednie do wprowadzania.

Jako plazmidy stosuje się znane plazmidy takie jak pBR322 albo jego pochodne, np. pSPT18/19, pAT153, pACYC184, pUC18/19 i pSP64/65.

Jako wektory fagowe stosuje się znane odmiany faga lambda takie jak ZAP i fag lambda gtlO/11, albo fag M13mpl8/19.

Enzymy restrykcyjne, które można zastosować znane są przykładowo, z Gene, tom 92, (1989), Elsevier Science Pubhshers BV Amsterdam

Wektor plazmidowy albo fagowy, który traktowano enzymem restrykcyjnym miesza się z nadmiarem wprowadzanego fragmentu DNA, przykładowo w przybliżonym stosunku 5:1, po czym mieszaninę traktuje się ligazą DNA w celu ligacji fragmentów do wektora. W celu namnożenia plazmidów albo fagów, mieszaninę ligacyjną wprowadza się do komórek prokanotyczynych albo eukariotycznych, korzystnie do bakterii (np. Escherichia coli szczepu KI2 albo pochodnych) i replikuje się je.

Bakterie transformuje się i selekcjonuje, jak to opisano w Molecular Cloning.

Identyczność obcego DNA korzystnie potwierdza się przy użyciu hybrydyzacji, zaś szczególnie korzystnie przy użyciu analizy sekwencji. Jeżeli to konieczne wykonuje się klonowanie.

2.2.2. Klonowanie genu kinazy białkowej

Gen, który koduje kinazę białkową położony jest w genomie PPV skąd się go izoluje w częściach albo w całości wraz z flankującymi segmentami genomu.

Jak to opisano w przypadku klonowania genu VEGF, region ten można izolować przez fragmentację genomu PPV (miejsca cięcia, patrz, fig. 1), korzystnie po klonowaniu fragmentów i selekcji fragmentów albo klonów, które zawierają części genu PK wraz z flankującymi

190 401 sekwencjami DNA genomu PPV. Cząsteczki DNA, które można zastosować jako startery do PCR albo jako sondy do hybrydyzacji można uzyskać z Identyfikatora Sekw. nr 2 albo Identyfikatora Sekw nr 9 Jeżeli to konieczne wykonuje się klonowanie.

2.3. Klonowanie genu kodującego białko 10 kDa

Gen, który koduje białko 10 kDa położony jest w genomie PPV skąd się go izoluje w- częściach albo w całości wraz z flankującymi segmentami genomu.

W tym przypadku, regiony genomu PPV, które zawierają gen dla białka 10 kDa, albo jego części otrzymuje się, korzystnie przy użyciu PCR i/lub klonowania i identyfikowania oraz selekcjonowania odpowiednich klonów.

Odnośnik 8 dostarcza szczegółów cząsteczek DNA, które można zastosować jako startery dla PCR albo sondy do hybrydyzacji. Jeżeli to konieczne wykonuje się klonowanie.

2.2 4. Klonowanie odwróconego regionu końcowych powtórzeń, który leży pomiędzy genem PK i genem HD1R

Podejście odpowiadało klonowaniu genu VEGF, który szczegółowo opisano (wyżej). Cząsteczki DNA, które można zastosować, jako startery do PCR albo sondy do hybrydyzacji, do izolowania odpowiednich regionów, są oczywiste w świetle Identyfikatora Sekw. nr 4 region ITR) i Identyfikatora Sekw nr 7 (region pomiędzy genem PK i genem HD1R).

Konstruowanie plazmidów msercyjnych albo delecyjnych

Tak zwane plazmidy insercyjne, które można zastosować do wprowadzania obcego DNA do genomu PPV, wytwarza się na podstawie fragmentów genomu PPV, które identyfikuje się, umiejscawia i klonuje jak to opisano w rozdziale 2. Plazmidy insercyjne niosą obcy DNA, który wprowadzono do PPV, flankowany przez segmenty genomu PPV. Istnieje wiele możliwości wytwarzania plazmidów insercyjnych; poniżej wymieniono kilka z nich:

3.1 Identyfikacja albo wytwarzanie unikalnych miejsc restrykcyjnych w klonowanych fragmentach genomu, które otrzymano jak to opisano w 2.1.4. albo 2.2. i wprowadzanie obcego DNA

Miejsca cięcia restrykcyjnego, które może zachodzić tylko raz, tj. takie, które są unikalne, można przykładowo (patrz, 2 1.3.) zidentyfikować w sekwencjach nukleotydowych PPV, które określono.

Syntetycznie wytworzone oligonukleotydy, które niosą nowe, unikalne miejsca enzymów restrykcyjnych można wprowadzać do tych unikalnych miejsc restiykcyjnych.

Powstałe plazmidy namnaza się i selekcjonuje jak to opisano uprzednio.

Alternatywnie, można zastosować PCR jak to opisano (Jacobs i in., 12), w celu wbudowania nowych unikalnych miejsc enzymów restrykcyjnych do fragmentów genomu PPV.

Unikalne miejsca restrykcyjne, które zidentyfikowano i/lub wytworzono stosuje się do wprowadzania obcego DNA do genomu PPV.

Obcy DNA wprowadza się znanymi sposobami (11).

3.2 Delecja sekwencji genomowych w klonowanych fragmentach genomu i wprowadzanie obcego DNA

Fragmenty można, przykładowo, usuwać z klonowanych fragmentów genomu PPV przez traktowanie ich enzymami restrykcyjnymi, które korzystnie posiadają jedno, szczególnie korzystnie dwa miejsca rozpoznawania Po traktowaniu enzymami, powstałe fragmenty frakcjonuje się, jak to opisano wyżej, przykładowo elektroforetycznie, i izoluje się, zaś odpowiednie fragmenty łączy się ze sobą przy użyciu ligazy. Powstałe plazmidy namnaza się i selekcjonuje plazmidy delecyjne.

Alternatywnie, unikalne miejsca restrykcyjne we fragmencie genomu PPV stosuje się lako punkty wyjściowe do dwukierunkowej degradacji fragmentu egzonukleazą, przykładowo enzymem Bal31. Wielkość delecji można okieślić przez długość okresu przez jaki działa enzym i można go sprawdzić przy użyciu elektroforezy na żelu. Syntetyczne oligonukleotydy poddaje się ligacji z nowo wytworzonymi końcami fragmentów jak to opisano w 3.1 (wyżej)

Obcy gen przenosi się do genomu PPV w tylko niewielkim odsetku całej populacji PPV.

Z tego powodu, konieczny jest układ selekcyjny w celu oddzielenia rekombmowanych PPV od PPV typu dzikiego (16).

190 401

Korzystny jest układ selekcyjny gpt, który jest oparty na genie guanylo-fosforybozylo-traasferazy E coli. Podczas ekspresji w komórkach eukariotycznych, gen ten dostarcza oporności na kwas mykofenolowy, który jest inhibitorem metabolizmu puryn. Jego zastosowanie w konstruowaniu rekombinowanych wektorów wirusowych opisano wielokrotnie (16, 17).

4. Konstruowanie ^kombinowanych PPV według wynalazku

Obcy DNA wprowadza się do genomu PPV przez:

a. równoczesne traasaakoweme DNA plazmidu insercyjnego albo delecyjaago i treasfakowanie odpowiedniej komórki gospodarza przy użyciu PPV,

b. transaekowama DNA plazmidu insercyjnego albo delecyjnego i transfeRowanie odpowiedniej komórki gospodarza przy użyciu PPV, c zakazenie PPV, a następnie traaąfakowame DNA plazmidu inąercyjnego albo delacyjnego do odpowiedniej komórki gospodarza.

Sposoby które są przydatne do tego celu są znane. Transfe^ę można uzyskać przy użyciu znanych sposobów takich jak technika fosforanu wapnia, traaąfekcja za pośrednictwem liposomów albo elektroporacja (patrz, 18).

1. Zakazenie PPV:

Hodowle komórkowe, które umożliwiają dobre namnożenie wirusa i skuteczną Oreasfekcję, przykładowo ustalona linia komórkowa nerki bydlęcej BK-K1-3A, są korzystne do wytwazania PPV zawierających obcy DNA.

2. Wytwarzanie DNA plazmidów insercyjnych albo delecyjnych:

Transformowane komórki, przykładowo bakterie, które otrzymano uprzednio opisanymi sposobami i które niosą plazmidy inąercyjne albo delacyjna aamneza się i izoluje się plazmid

Λνπιυινιν W ojju.zuo i pirwUdjV oiy dZtóamu. vu zimuje pl/LCZ,, przykładowo, wirowaaia izopykniczne na gradiencie gęstości, przykładowo CsCl albo przez oczyszczenie powinowactwa na dostępnych w handlu cząstkach krzemionki.

3. Traaąfekcje:

Oczyszczony DNA kolistych albo liaearyzoweaych plazmidów stosuje się korzystnie do traaąfekcJi Oczyszczanie' zachodzi, przykładowo jak to pokazano w 2 (wyżej).

4. Hodowanie komórek treasfekowaaych i zakażonych

Komórki hoduje się przy użyciu dobrze znanych sposobów.

Gdy pojawia się efekt cytopatyczny, pożywkę hodowlaną pobiera się, jeżeli to konieczne uwalnia od resztek komórkowych przez odwirowanie i filtroweaie i, jeżeli to konieczne, przechowuje się, a następnie przerabia stosując konwencjonalne sposoby oczyszczania wirusów przez łysinki.

Poniższe sposoby stosuje się przy wytwarzaniu rekombinowanych PPV:

Komórki BK-K1-3A, które namnożono do zlewności zakazono dawką MOI (wielokrotność zakazenia) od 0,001 do 5, korzystnie 0,1. Dwie godziny później, zakazone komórki transferowano, przykładowo, DNA (2-10 pg) plazmidu pMT-10, stosując metodę wstrząsu Caó04-ghceryny albo stosując zestaw do treasfakcji według instrukcji producenta (DOSPER, Boehringer Mannheim). Hodowle komórkowe inkubuje się w pożywce w 37°C w atmosferze 5% CO2 przez sześć dni dopóki nie pojawi się cpe albo łysinki.

Zależnie od wprowadzonego obcego DNA, rekombinowane PPV identyfikuje się przez:

a. Wykrywanie obcego DNA, np. przy użyciu hybrydyzacji DNA/DNA,

b. amplifikacji obcego DNA przy użyciu PCR,

c. wyrażania obcego DNA przy użyciu wirusów rekombinowanych.

W odniesieniu do a.

W tym celu, DNA izoluje się z danego wirusa 1 hybrydyzuje z kwasem nukleinowym, który jest przynajmniej częściowo identyczny z wprowadzonym fragmentem DNA.

PPV, który oczyszczono z pojedynczej łysinki i który określono jako rekombinowany, jest korzystnie badany ponownie na obecność i/lub ekspresję obcego DNA. Rekombinowene PPV, które zawierają stabilnie i/lub wyrażają obcy DNA są dostępne do dalszego użytku.

W odniesieniu do c.

Ekspresję obcego DNA można wykryć na poziomie białka, przez przykładowo zakazanie komórek wirusem, a następnie przeprowadzenie analizy immuaofluoraącencyjaej z użyciem

190 401 swoistych przeciwciał przeciwko białku kodowanemu przez obcy DNA, albo przez przeprowadzenie immuaoprocypltacji albo analizy metodą Western biot, z użyciem przeciwciał przeciwko białku kodowanemu przez obcy DNA przy użyciu lizatów z zakazonych komórek.

Ekspresję obcego DNA można wykryć na poziomie RNA przez iWonCyfikację swoistych υ'ίΐι·ϋ^|®:Λ\·. W tym celu, RNA izoluje się z komórek zakazonych wirusem i hybrydyzuje z sondą DNA, która jest przynajmniej częściowo identyczna z wprowadzonym obcym DNA.

Przykłady

Poniższe przykłady opisują region genomu PPV, który jest przydatny do wprowadzania i ekspresji genów homologicznych i hktorologicznych, albo ich części. Przydatne fragmenty gonomowe zawarte są we fragmencie HindIII I PPV wis szczepu D1701 (i odpowiednich pochodnych) (Identyfikator Sekw. nr 8 i Identyfikator Sekw. nr 12).

1. Klonowanie fragmentu HindIII I:

Po oczyszczeniu, wirusowy DNA cięto enzymem restrykcyjnym HiaWIII, powstałe fragmenty DNA rozdzielono przez elektroforezę na żelu agarozowym i wycięto fragment wielkości około 5,6 kb, po czym izolowano i oczyszczono stosując Qiaex™ (Qlagoa). W celu klonowania fragmentu DNA do wektora plazmidowego pSPT18 (Boehringer Mannheim), który cięto HmdIII i traktowano CIP (cielęcą fosfatazą alkaliczną) zastosowano techniki standardowe (Mamatis i in.). Powstałe rekombiakwaae plazmidy, pORF-1 i pOR^-2, różniły się jedynie oaeaCacJą wstawki. Konstrukcja mapy restrykcyjnej umożliwiło przeprowadzenie dalszego klonowania, jak pokazano na fig. 1. Hybrydyzację metodą SouChorm blot zastosowano w celu zbadania wszystkich rekombinowanych plazmidowych DNA, w celu potwierdzenia ich identyczności i pochodzenia wirusowego.

Sokwencjonowanlo DNA

Sokwenjjonowaaie DNA wykonano przez zastosowanie dwualclowogo DNA różnych plazmidów rekombrnowanych i starterów swoistych wobec SP6 i T7, które wiązały się z oboma końcami miejsca klonowania wektora plazmidowego pSPT18. Przeprowadzono metodę sekwoacjoaowaala metodą przerywania łańcucha dldozoksynuklooCydami Sangera, w obecności ³⁵S-[a]-dATP i polimerazy DNA T7 według instrukcji producenta (Pharmacia Biotech) Syntetyzowano znaczną liczbę ollgoauklooCydów zgodnie z sekwencją DNA, którą uzyskano, a następnie zastosowano do eokweacjoaowania obu nici fragmentu HindIII I. 7-deaza-GTP zastosowano w celu rozwikłania artefaktów sokwoncjoaowama albo kompresji prążków, z powodu względnie wysokiej zawartości G+C wstawki wirusowego DNA (64,78%), po czym produkty eekwencjonowama rozdzielono na denaturujących żelach kkllakryloamlrowych zawierających formamid.

3. Identyfikacja potencjalnych genów

Wspomagana komputerowo analiza otrzymanych sekwencji DNA (Identyfikator Sekw. nr 8 i 12) ujawniła kilka piawWokoWobnych otwartych ramek odczytu (ORF). Sekwencje amiaokwasowe pochodzące z tych ORF zastosowano do poszukiwań homologii genu (np program GCG) Istotne homoteg^ amiaokwasowe w poniższych genach stwierdzono w wyniku (patrz również figura 1).

3.1. Stwierdzono (zono o homologii ammokwasowej (3^1 doSS,^ identyc:ksoJji; 52,8 do 58,6% podobieństwa) z czynnikiem wzrostowym śrórbłoaka naczyń (VEGF) różnych gatunków ssaków (np. myszy, szczura, świnki morskiej, krowy i człowieka) jak również homologię z ostatnio opisanymi szczepami PPV NZ-2 i NZ-7 (6). Nie wiadomo, czy inne wirusy ospy, np. ortopoxwirusy, posiadają odpowiadający mu gen. Ta ORF, którą określono jako VEGF, obejmuje 399 aukleotydów i koduje polipeptyd, który zawiera 132 aminokwasy, którego ciężar cząsteczkowy określon-o na 14,77 kDa. Analiza transkrypcji całego RNA wyselekcjonowanego dzięki olig^dT) przy użyciu hybrydyzacji metodą Northern, doświadczenia nad chronieniem RNA i badania wydłużania starterów potwierdziły, że VEGF ulega ekspresji jako gen wczesny w około 2 godziny po zakazeniu (p.i.)· Stwierdzono, ze swoisty mRNA pokrywa od 422 do 425 zasad, znajdując się bezpośrednio poniżej sekwencji, wykazują 100% homologii z krytycznym regionem motywu zgodności, który IosC typowy dla promotorów genów wczesnych wirusa krowianki. Koniec 3' mRNA VEGF zmakkwaao w sekwencji zgodności, którą posiada większość wczesnych traaskrykCów, przykładowo, genów wirusa krowianki

190 401

Wielkość tego mRNA oczniono w badaniu metodą Northem na około 500 zasad, co wskazuje na segment poli(A) winlkaści około 100 zasad.

2. Znaleziono zmią ΟΠΕ która koóua e pn-encjalnąkinezę Halko wa(PK) o homoloom z odpowiednim genem obecnym w kilku ortopoxwirusac0 (np. wirusis krowianki, wirusie ospy prawdziwej albo wirusie włókniaka Shope), znanym jako F10L. Ten hρmolog ulnga ekspresji późno w cyklu zakazenia PPV szczepu D1701 (od 12 do 16 godzin p.i.). Punkt rozpoczynający transkrypcję lnży niedaleko poniżej regionu, który wykazuje wysoki stopień homologii ze znanym promotorem późnych gsnów krowianki.

3.3 Znaleztóao inne we OMS które do ter P°^ry nio wyknzująaadner aomologii ze znanymi genami. Szczngó-eie interesujący jest potencjalny gen, który określoRP jako HD1R (fig. 1). AnaUzY, jak opisane powyżej, wykazały transkrypcję swoistego wcznsnngo mRNA o wie-ności około 1,6 kb

3.4. Na kaeiec, przy użyciu komputera znaleziono ORF, która nakłada się na koniec 3' F10L i koniec 5' genu VEGF (F9L, fig. 1). Porównanie sekwencji wykazało podobieństwo do genu F9L wirusa nrowiaRki

3.5. Przez porównanie znanych sekwencji DNA szczepów NZ-2 i NZ-7, możliwe było ustα-enie początku tzw rngionu ITR w gsnomis D1701 w pozycji Rukleotydowej 1611 fragmentu HmdIII I Rsgion ITR jsst regionim sekwencji, który wydajn się być końcem genomu poxwiruse i który prawdopodobnie występuje, w odbrpteym położeniu, na drugim końcu gnnomu i stąd nazywany jest odwróconym regionem powtórzeń (ITR) (patrz, Identyfikator Snkw. nr 4) Porównanie sekwencji wykazało zbieżność z doświadczeniami nad lρkalizacją w genomie D1701 fragmentu HindIII I kloeowansgo do pORF-1. Mapa tego fragmentu i prebdopo0obnle identycznsgo fragmentu HirOIII H przndstawiORa jest na fig 2. Na tej pod stawis można wywnioskować, ze ITR genomu D1701 obejmuje około 2,6 kb.

Doświadczenia mające na celu onrnś-seie końca 3' mRNA VEGF D1701 wykazały, ze przynajmniej jeden RNA wirusa rozpoczyna się w ITR pomiędzy około 40 i 220 bp po przejściu w ITR. Z powodu homologii sekwencji amieokwαsownj z NZ-2, onppwindm gnn określono jako ORF3 (fig. 1). Przed domniemanym końcem 5' mRNA ORF3 występuje sekwencja zgodności typowa dla wczesnego promotora poxwirusów. Do tej pory nie można było znaleźć homalogii z iReymi genami.

4. Wprowadzenie sekwencji DNA do fragmentu HIrOIII I

Badano możliwość zastosowania opisanego fragmentu DNA HmdIII (nloRowaRngo w plazmidach pORF-1 i pORF-2) do koestruoweRia homologicznych i Oetnrologicznych snnwsncji DNA Poniżej przedstawiono trzy różne strategie osiegnięcie tego celu.

Plazmid pGSRZ, który zawiera funkcjonalny gen LacZ z E. coli pod kontrolą promotora wirusa nrowianni 11K skonstruowano dla ponizszych przykładów. Do tej pory wyizo-owaRP odpowiednie części DNA plazmidu pUCIILZ (patrz, 7) i klonowano do plazmidu pSPT18. Tę fuRncjoealeą kombinację genu 11K/LacZ (onreślaee poniżej jako kaszta LacZ) można uzyskać przrz lzo-owemn fragmentu Smal/Sall wielkości 3,2 kb z pGSRZ (fig. 3).

Konstruowami kaset selekcyjnych

Skonstruowano różne tzw kasety selnkcyjen przy użyciu plazmidów pGSSRZ (zawierające gen LacZ pod kontrolą promotora Pllowirusa nrowiaRni) i pMT5 (zawinrającngo gen gpt E. coli), jak to pokazano na fig. 7. Syntetyczne o-igonunleotyny komplnmeRtarnni którs stanowiły sekwencję promotora VEGF (Pvegf) wytworzono i wprowadzono do miejsca cięcia SmaI w pSPT18 (pMT-1). Plazmidy pMT-2 i pMT-4 wytworzono przez usunięcie genu LacZ z p-8Z (otrzymanego przez wprowadzenie fragmentu BamHI z pGSRZ dp pSPT18), albo genu gpt z pMT-5, przy użyciu cięcia BamHI i wprowadzenia ich do pMT-1 (fig. 7).

Funkcjonalny gen gpt amplifikowano z plazmidu GPT pMSG (Phermαciα Biotech) przy użyciu PCR, a następnie nlonowaRO do wektora pCRII przy użyciu tzw. klonowenie TA według instrukcji producenta (Invitrogee, Inc.).

Umożliwiło to, jak schematycznie przedstawiono na fig. 7, skonstruowanie podwójnej kasety se-encyjeej, która wyrażała gen LacZ albo gen gpt, pod kontrolą, odpowindnio, promotora 11K i/lub Pvegf w kombinacjach i arieRtacjach jak pokazano.

190 401

Według przykładu XX (delecją LacZ-VEGF) albo YY (śródgenowy Bal 31), te kasety selekcyjne można wprowadzać, po odpowiednim cięciu enzymem restrykcyjnymi izolacji do różnych DNA plazmidowych PPV orf. Plazmid pMT-10 skonstruowano po wprowadzeniu podwójnej kasety selekcyjnej do opisanego plazmidu pdV-500, który wykazuje delecję 312 bp genu VEGF PPV D1701. Przy użyciu tej konstrukcji, funkcjonalne geny lacZ i gpt wprowadzono w miejsce VEGF ORF, który usunięto przez delecję. Po badaniach przemijającej ekspresji, można było wykazać aktywność genu Lac w komórkach zakazonych PPV D1701 (me pokazane), w taki sposób, ze przeprowadzono selekcję mutantów delecyjnyhh D1701, które wyrażały gpt i lacZ.

4.1. wprowadzanie do międzygenowyhe regionów nie kodujących

Identyfikacja albo wytworzenie nowych unikalnych miejsc restrykcyjnych, które są położone międzygenowym regionie nie kodującym. Miejsca te stosuje się do wprowadzania sekwencji obcego DNA, który koduje funkcjonalne i wykrywalne produkty genu (np. genu LacZ E coli) albo ich części.

Przykład 4.1.1.

Plazmid pORF-PB (fig. 1) zawiera pojedyncze miejsce cięcia NruL które jest położone pomiędzy genem kinazy białkowej (FIOL) i genem HD1R. Po lmorryzαcji pORF-PB enzymem restrykcyjnym, kasetę LacZ poddano ligacji (po reakcji wypełnienia końców) przez ligację na tępe końce. Rekombinowane plazmidy-, które zawierały funkcjonalny gen LacZ wyselekcjonowano po cięciu, np. BglI i wykazano prawidłową wstawkę przy użyciu hybrydyzacji Southern^ stosując sondę swoistą dla LacZ i częściowego sekwencjonowania DNA przejścia LacZ/PPV.

Przykład 4.1.2

To samo podejście jak opisane wyżej zastosowano poniżej genu VEGF (cięcie BstEII, fig. 1) i potencjalnego genu ORF3 w regionie ITR (częściowa degradacja XbaI w celu zapobiegnięcia cięciu miejsca XbaI w miejscu klonowania pSPT18).

Przykład 4.1.3.

Technikę mutagenezy PCR można zastosować w celu wprowadzenia nowego, unikalnego miejsca restrykcyjnego w dowolnym pożądanym punkcie klonowanego fragmentu DNA PPV (patrz, fig. 10, odnośnik 12). Do tej pory przeprowadzono dwie osobne reakcje PCR stosując pary starterów E1+EV2 (PCR A) i EV1+XB (PCR B). Wszystkie startery pokrywały 25 nukleotydów, które są identyczne z sekwencją DNA PPV w danym położeniu. Podczas gdy starter XB stanowi autentyczną sekwencję, przykładowo wokół miejsca XbaI (fig. 1) nowe miejsce EcoRI wprowadzono na końcu 5' startera E1, zaś nowe miejsce EcoRV wprowadzono do starterów EV1 i EV2 (które są ze sobą komplementarne). Miejsce EhoRV, które oryginalnie nie występuje w całej sekwencji pORF-1 albo pORF-2, wprowadzono w miejscu, które wybrano w celu wprowadzenia kasety LacZ. Produkty PCR, które otrzymano w reakcji A i B oczyszczono, denaturowano do pojedynczych nici i zmieszano w warunkach umożliwiających ponowne połączenie; następnie zastosowano je do ostatniej reakcji PCR; tj. PCR C. W tym celu zastosowano E1 i XB jako startery, w celu wydłużenia pozostałych 793 bp pORF-1. Po izolacji i oczyszczaniu na żelu produkt PCR powstały w reakcji C cięto EcoRI i XbaI, a następnie poddano ligacji do plazmidu pORF-XB, który cięto EcoRI i XbaI. W wyniku, plazmid pORF-1EV (fig. 5) zawierał miejsce restrykcyjne EcoRV w pożądanej pozycji; można je zastosować do liaearyzrcJi i poddać ligaj z kasetą LacZ.

Oprócz tego niesparowane startery, które zawierają określone zmiany albo delecie zasad można zastosować w sposobie opisanym w tym przykładzie w celu wytworzenia przykładowo, kodmu stop albo 1ο1οο|1 aminokwasów w dowolnym pożądanym punkcie sekwencji wirusowego DNA.

4.2 ^^ο|ο śródgonowe bez delecji sekwencji orf

Nowe albo dodatkowe sekwencje można wprowadzić do sekwencji kodujących jednej z opisanych ORF po cięciu miejsc restrykcyjnych, które występują tylko raz w wybranym genie

Przykład 4.2.1.

Unikalne miejsce XcmI, które jest położone po prawej stronie homologa genu F10L zastosowano do Imearyzacji plazmidu pORF-1. Zarówno kasetę LacZ jak i cięty DNA pORF-1

190 401 dostarczono z tępymi końcami stosując polimerazę T4 albo fragment poHmierazy DNA Klenowa, a następnie poddano ligacji; kompetentne bakterie E. coli (DHcaF') zastosowano do transformacji. Powstałe ąelonie bakterii badano w kierunku plazmidów reąombinowankch przy użyciu hybrydyzacji kolonii na filtrach stosując sondę swoistą dla LacZ, po czym odpowiedni DNA wycinano enzymami restrykcyjnymi.

Przykład 4 2.2.

Region kodujący VEGF zawierał pojedyncze miejsce Styl, które zastosowano do wprowadzenia kasety LacZ, jak to opisano wyżej.

4.3. Delecje w sekwencji wirusowej

Poniższe przykłady opisują usuwanie regionów kodujących (delecje śródgenowe) i nie kodujących (delecje międzygenowe):

Przykład 4.3 1.

W celu usunięcia określonych części fragmentu DNA HindIII I w celu zastąpienia usuniętych sekwencji wirusowych przez wprowadzenie obcych genów albo części tych genów zastosowano enzymy restrykcyjne. Uzyskano to przez cięcie plazmidu pORF-PA enzymem restrykcyjnym NruI (w miejscu regionu ITR, fig. 1), w wyniku czego usunięto fragment 396 bp. Po reakcji wypełnienia kasetę LacZ poddano ligacji w opisany sposób. Figura 4 pokazuje schematycznie delecję fragmentu 396 bp z pORF-PA i wprowadzenie kasety LacZ. Figury 5 i 6 pokazują plazmidy insercyjne/delecyjne pCE4 i pCE9, które skonstruowano w ten sposób i które pochodzą z pORF-PA.

Przykład 4.3.2

Indywidualne miejsca restrykcyjne we fragmencie DNA HindIII zastosowano jako punkt wtn ςρι riy n^an nlzi pri inw^uir^i Λοίροιι cćwL·*'J^^iI teyrl s \e^ »t j nullumu i, wiil\.v' rt v/j uviVvji uvi.u

Ba131, jak schematycznie przedstawiono na fig. 6. Enzymy StyI i XcmI zastosowano do degradacji restrykcyjnej odpowiednio, w przypadku plazmidu pORF-PA i plazmidu pORF-1 albo pORF-XB, w celu otworzenia tych genów, które kodują odpowiednie VEGF i kinazę białkową F10L (fig. 1 i 6). Po dodaniu egzonukleazy Ba131, pobierano porcje reakcji z 2 minuty, a następnie reakcję przerwano. Cięcie próbek w czasie przykładowo, enzymem restrykcyjnym BglI a następnie elektroforeza na żelu agarozowym umożliwiła określenie wielkości segmentu DNA usuniętego przez Ba131' Mieszaniny odpowiednich próbek punktów czasowych zastosowano do zamknięcia segmentu DNA przy użyciu reakcji wypełnienia. Dwa komplementarne ohgonukleotydk stanowiące unikalne miejsce SmaI, Sali i EcoRV hybrydyzowano i powstałe dwuniciowe cząsteczki starterów (określane jako łączniki EcoRV) poddano ligacji z tępymi końcami produktów Ba131 Po otrzymaniu transformantów, plazmidowy DNA izolowano i cięto EcoRV, który nie posiada żadnego miejsca rozpoznawanego w sekwencji DNA fragmentu HmdIII I PPV. Każdy plazmidowy DNA posiadający miejsce EcoRV zawiera więc wprowadzoną sekwencję łącznika i został zastosowany do ligacji tępo zakończonej kasety LacZ w nowym miejscy EcoRV. Możliwe było określenie dokładnej wielkości delecji DNA wytworzonej w każdym z powstałych rekombinowanych plazmidów DNA przy użyciu sekwencjonowania z użyciem jednoniciowkch łączników EcoRV i odpowiedniego startera swoistego dla genu LacZ.

5. Wykrywanie i identyfikacja genu VFGF u innych parapoxwirusów

Znajomość regionu DNA, który koduje VEGF w D1701 umożliwiła wytworzenie swoistych sond DNA i starterów PGR w celu identyfikacji tego genu u innych szczepów parapoxwirusów, które mogą się bardzo różnić profilem restrykcyjnym. Przetestowano następujące możliwości, (i) izolowanie fragmentu TaqI (366 bp) pORF-PA jako sondy hybrydyzacyjnej odzwierciedlającej centralną część genu VEGf D1701, (ii) amplifikacja kompletnej ORF VEGF przy użyciu syntetycznych starterów, a następnie klonowanie produktu PCR do plazmidów; (ni) startery które pokrywają różne części genu VEGF zastosowano do PCR w obecności DNA PPV jako matrycy, jak również jako swoistych sond hybrydy zacyjnych

Po znakowaniu radioaktywnym, sondy te zastosowano z powodzeniem do hybrydyzacji metodą Southerria i dot/spot z genomowym DNA różnych izolatów i szczepów Parapox ovis, Parapos bovis 1 (BPS) i Parapox bovis 2 (guzki dojarek). Hybrydyzacja Sou^emU wykazała

190 401 sygnał pozytywny swoisty dla VEGF, które określały fragmenty DNA PPV co umożliwiło dalsze szczegółowe mapowanie genów VEGF w różnych PPV.

Oprócz tego, te same sondy zastosowano do porównawczej analizy RNA, takiej jak hybrydyzacja Northern, w celu badania ekspresji potencjalnych genów VEGF w innych szczepach ppv

Wytwarzanie rekombinantów D1701

Komórki BK-KL-3A które hodowano do zlewności zakazono dawką MOI równą 0,1 Dwie godziny później, zakażone komórki transfekowano, przykładowo, DNA (2-10 pg) plazmidu pMT-10, stosując metodę wstrząsu CaPOą-gliceryny albo stosując zestaw do transfekcji według instrukcji producenta (DOSPER, Boehringer Mannheim). Hodowle komórkowe inkubuje się w pożywce w 37°C w atmosferze 5% C0₂ przez sześć dni dopóki nie pojawi się cpe albo łysinki. Zależnie od wielkości cpe wywołanego przez wirusa:

a) uzyskuje się lizat komórek, wytwarza się szereg rozcieńczeń i przeprowadza się test łysinkowy na komórkach BK-KL-3A Mieszanina agarozy z pożywką którą się dodaje zawiera 0,3 mg/ml Bluo-Gal (GIBCO-BRL Life Sciences) w celu identyfikacji niebieskich łysinek, które zawierająrekombinanty D1701 oporne na MPA, wyrażające LacZ.

b) po utworzeniu się poszczególnych łysinek, mieszaninę Bluo Gal z agarozą jak opisana w (a) dodaje się i wybiera poszczególne niebieskie łysinki.

Wirus otrzymany w (a) albo (b) stosuje się, jak opisano poniżej, do zakazania BK-KL-3A i poddaje przynajmniej dwóm dalszym miareczkowaniom i oczyszczaniom dopóki nie uzyska się w 100% homologicznego wirusa.

7. Promotor VEGF

Jak opisano w rozdziale 3 1. gen VEGF w D1701 jest genem wczesnym, swoiste mRNA ulega transkrypcji w dużych ilościach w komórkach zakażonych D1701 w 2-4 godzin po zakazeniu. Z tego powodu region promotora, który zidentyfikowano, powinien być przydatny do kontrolowania ekspresji obcych genów, albo części tych genów, w rekombinowanych wirusach PPV. Sekwencje, które obejmują promotor VEGF (35 do 40; Identyfikator Sekw. nr 6) można izolować przy użyciu (i) PCR stosując odpowiednie startery flankujące region promotora, (ii) klonowania odpowiednich fragmentów DNA, albo (iii) syntetyzowania sekwencji promotora jako oligonukleotyd.

Po połączeniu promotora VEGF z dowolnym genem albo sekwencją DNA, powstałą kasetę można zastosować do wytworzenia rekombinowanych PPV zgodnie z dowolną metodą opisaną w poprzedzających rozdziałach.

8. Gen 10 kDa

Ustalono PCR swoistą dla wykrywania genu 10 kDa PPV, na podstawie opublikowanej sekwencji DNA genu 10 kDa ze szczepu NZ-2 PPV (8). Po przeprowadzeniu PCR z użyciem starterów wytworzonych syntetycznie 10K-up (5'CAATCTGGATGAAAATGACGG3') i 10Kdown (5'CAGACGGCAACACAGCG3') uzyskano amplifikację swoistego produktu wielkości 297 par zasad. Klonowanie (zestaw TA Cloning, Invitrogen, Inc.) dało plazmid pJS-1, który zawierał produkt PCR wielkości 297 bp jako fragment EcoRI. Sekwencjonowanie DNA dwóch nici Dna wstawki pJS-1 pokazało obecność wstawki swoistej dla 10 kDa. W oparciu o tę sekwencję, D1701 koduje białko 10 kDa o 91 aminokwasach, które posiadają 93,3% identyczność aminokwasów i 96,7% podobieństwo aminokwasów ze szczepem NZ-2 PPV.

Hybrydyzacja metodą Southem'a przy użyciu znakowanego radioaktywnie pSJ-1 w celu lokalizacji genu 10 kDa we fragmencie EcoRI E (4,25 kb) genomu D1701. Gen ten, podobnie jak w przypadku NZ-2 położony jest po prawej stronie genomu wirusowego i zawiera miejsce cięcia fragmentów HindIII K i G (fig. 2) ______

Plazmidy pDE-El i pRZ-E1, które zawierają fragment EcoRI E D1/01 wielkości 4,25 kb zastosowano do wytworzenia plazmidów, w których gen 10 kDa zawiera wstawkę albo delecję (jak to opisano wyżej). Miejsce cięcia HindIII (Fragmenty K-G) w N-końcowym segmencie genu 10 kDa D1701 (#124-# 129) Identyfikatora Sekw. nr 11) można zastosować do bezpośredniego wprowadzenia obcego DNA oraz w celu usunięcia (patrz trawienie dwukierunkowe Ba131) genu 10 kDa. W tym ostatnim konstrukcie, drugie miejsce cięcia HindIII (miejsce klonowania wektora plazmidowego pSPT18) usunięto z plazmidu pDE-EF W tym celu,

190 401

DNA pSPT18 cięto HmkIII, po czym miajsca cięcia ΗίπύΠ^ zniszczono przaz Sraetowama fragmantam Klanowa i ponownia ligowano plazmik. Fragmant EcoRI E D1701 wialeości 4,25 eb ktoπowaπo w miajsca rastrzecejne EcoRI nowago waesora plazmikowago pSPT18kH. Powstały plazmik pRZ-E1 (fig 8) posiaka taraz unieal^a miajsca cięcia HinkIII w gania 10 PDa, co umozliwia łatwą manipulację

HebrykezaeJa matoką Southarn blot z uźyciam pDE-E1 i pJS-1 jaeo sonk zπakowaπeeh rakloakSewma jae równiaz bakania PCR weeazały, za ganomy róznych szczapów PPV bovis 1 nia zawiarają zaknych sakwaπeJl 10 eDa. Wseazuja to, za gan 10 eDa PPV nia jast istotny (Buattnar i in., 1996, oknośnie 10).

190 401

Odnośniki literaturowe

1. Robinson, A.J. and Lyttle, D .J. 1992.

óarepoxviruąes: Their biology and potential as recombiaeat vaccineą. In: Recombinant poxvlruąaą edts. M.M Binns and G.L. Smith, CRC Press Inc.

2. Mayr, A. 1990

Chapter 7 (Ecthyma (Orf) Virus) in. Virus Iafactions of Vartabrataą, Vol. 3: Virus Iuiections of Ruminants, 1990, Elsevier Science Publishers B.V., The Natharlands.

3. Mazur, C., Rangel Filho, F.B. aid Galler, R. 1991.

Molec^a ananas of contagious pustular dermatitlą virus: A simplified method for viral DNA extrectloa form scrab material J.Virol. Methods 35, 265-272.

Mercer, A A 1994.

10th Int. Conf. on Poxvlruąes and Indoviruses 30. April - 5. May 1994. óroceadlngs.

5. Fleming, S.B., Lyttle, D.J., Sullivan, J.T., Mercer, A.A. and Robinson, A.J. 1995. Genomic anatys^ of a traaąposltlon-deletlon verieat of orf virus reveals a 3 3 kbp region of noa-eąąentlal DNA. J. gen. Virol. 76, 2669-2678.

6. Lyttle, D.J , Fraser, K M., Fleming, S.B., Mercer, A.A. and Robinson, A.J. 1994. Homologues of vaącular eadothallal growth factor are aacodad by the poxvirus orf virus. J Virol 72, 1171-1181

7. Sutter, G. and Moss, B. 1992.

vaccinia vector affϊclently expresses recombinant genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851.

8. ^ase, M., Nicholson, B.H., Fraser, K.M., Mercer, A.A. and Robmson, A.J. 1991

An orf vlruą ąequeace showing homology to the 14K fusion protein of vaccinia vlruą J.gen Virol 72, 1177-1181

9. Graham, F.L. and van der Eb, A.J 1973.

A new techn^e for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467.

10. Buttner, M., Mclnnes, C., von Einem, C., Rziha, H.J. and Haig, D. 1996.

Molecular discrimination of parapoxvlruąas from dificrent species. 11th óoxvlruą and

Iridovlruą maetlng, 4.-9. May, Toledo, Spam.

11. Sambrock, J., Frisch, E.F. and Mamatis, T. 1989.

Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press

12. Jacobs, L., Rziha, H -J., Kimman, T.G, Gialkeas, A.L.J. and von Oirschot, J.T. 1993. Dalatmg valme-125 and cysteme-^ in glycoprotein gl of pseudo^ies Yirus strain

NIA-3 decraaąes plaque size and ^duces vlrulaace for mice. Arch. Virol. 131, 251-264

VlrologlScheArheltsmelhogen, [PractlóajMejhodr inYirol ogyo, o989 Biochem-che und B^hys^^^ Methoden, [Biochemical and Biophysical Methods], VEB Fischer Yerlag.

190 401

Sharp, P.A., Berk. A J and Berger, S.M. 1980.

Traagcrlptioa maps of adenovirus Meth. Enzymol. 65, 750-768.

Watson, J.D., Hopkins, N.H., Roberts, J.W., Seitz, J.A. and Weiner, A.M. 1987. Moleculrr Biology of the Gene, Benjamm/Cummins Publishing Company, Menlo Park

Fulkner, F.G and Moss, B. 1988

Escherichia coli gpt gene provides dominant seloctien for vachiaia virus open reading frame exprossioa voctors J.Virol. 62, 1849-1854.

17. Boyle, D.B. and Coupar, B.E. 1988.

Construction of recombinant fowlpox virusos as vectors for poultry vaccmos. Virus Res 10, 343-356

18. Methods in Virology, Vol. VI, 1977.

edts Maramorosch, K. and Koprowski H. Academic Press. New York, San Francisco.

Hatton, M and Sakaki Y. 1986.

Dideoxy soquencmg method using donaturatod plasmid templates. Anal. Biochem. 152, 232-238

20. Chomczynski, P and Sacchi, N. 1987.

Single step method of RNA isolatioa by acid guanidiaium-thiocyanato-peenolchloroform οχ^^^μ Ana. Biochem 162,15()-159.

Identyfikator Sekw. Nr 1

Identyfikator Sekw. Nr 1 zgłoszenia pokazuje gen VEGF, który jost zlokalizowany na fragmencie- I Hind ΓΠ szczepu PPV D1701.

Informacje dodatkowe:

Wczesny promotor. Nukleotydy od 50 do 64

Start mRNA: NukleoJydy od 78 do 80

Stop mRNA Nuktootydy od 498 do 500

Start translacji. Nuktootydy od 92 do 94

Stop translacji: Nukeeotydy od 488 do 490

Identyfikator Sekw Nr 2

Identyfikator Sekw Nr 2 zgłoszenia pokazuje gen kinazy białkowej F10L (wersja I), który jest zlokalizowany na fragmencie I Hind ICH szczepu PPV D1701.

Informacje dodatkowe.

Późny promotor: Nukteotydy od 48 do 66

Start mRNA· NukleoJydy od 74 do 78

Start translacji- NukleoJydy od 94 do 96

Stop translacji: Nukleotydy od 1738 do 1740

Idontyaikater Sekw. Nr 3

Identyfikator Sekw. Nr 3 zgłoszenia pokazuje segment genu HD1R, który jest zlokalizowany na fragmencie 1 Hind FU szczepu PPV D1701

Identyfikator Sekw. Nr 4

Identyfikator Sekw. Nr 4 zgłoszenia pokazuje region ITR, który jest zlokalizowany na fragmencie I Hind III szczepu PPV D1701 i gen ORF3, który został znaleziony w tym regionie.

Informacje dodatkowe

Początek regionu ITR: 1^1^11100^x1.1 7

Wczesny promotor: NukleoJydy od 18 do 33

Start ORF3 mRNA: Nukteotydy od 40 do 41

190 401

Stop ORF3 mRNA NuetaoSydy od 673 óo 667

Start translacji OFR3: NuelaoSzkz od 11 i ko 113

Stop translacji ORF3: NuOlaotydy ok 562 ko 566IkeπSyfϊkaSor Saew Nr 5

Idaπtyfi0aSor Saew. Nr 5 zgłoszania poOazuja homolog ganu F9L (warsja I), który jast zlokalizowany na fragmancia I Hink III szczapu PPV D1701.

Informacja kokateowa:

Start eokon. NuOlaot^^dy ok 48 ko 50

Stop eokon' Nuelaotydz ok 861 ko 863

IkeπSyfieator SaOw. Nr 6

Idaπtefieasor Saew. Nr 6 zgłoszania poeazuja ragion pro-motorowy VEGF, Otóry jast zloealizowany na fragmancia I Hink III szczapu PPV D1701.

IkeπSyflkaSor SaOw. Nr 7

Ikantyfieator Saew Nr 7 zgłoszania poeazuja ragion śrókganowy, Otóry jast usytuowany pomiękze ganami HD1R i PKF10L i jast zloealizowany na fragmancia I Hink III szczapu PPV D1701.

NukieGoyed oo 25 do 22

141^0^^ oZ ok 3 2o ko 5

Domniamany stop translacji hD1R:

Start translacji PKF10L:

Ikeπsyfikasor Saew Nr 8 IkeπtefleaSor Saew. Nr 8 zgłoszania poeazuja Oomplatną saewancja nuetaotykową fragmantu I Hink III szczapu PPV D1701.

IdantyfiOator SaOw^. Nr 9

SaOw·. Nr 9 zgłoszania poeazuja warsję 2 ganu einazj blał0owaj F10L, etóry jast zloealizowany na fragmancia I Hink III szczapu PPv D1701.

Informacja Ookaseowa.

Nukieoiydy od 418 do 66 Nul·0eoiyjl\j od 72 do 80 Nukieoiyjly od 74 do 78 Nι^l<i^t^i^doj ool 94 do 99? Nukleotydy od 1585 do 1588

Późny promotor:

Sygnał startowy RNA:

Start mRNA :

Start translacji Stop translacji:

Ikantyfieator SaOw. Nr 10

IkenSyfieaSor Saew. Nr 10 zgłoszania poeazuja warsję 2 homologa ganu F9L, etóry jast zlokalizowany na fragmancia I Hink III szczapu PPV D1701.

Informacja kokateowa:

Start translacji. Nublyety0y ki ok d0 ko

Stop translacji. Nukleotydy od 722 do 724

IkanSyfl0ator Saew. Nr 11

Ikaπtefi0ator SaOw. Nr 11 zgłoszania poeazuja gan 100Da, etóry jast zlo0alizowaπz na fIagmanela E EcoR1 szczapu PPV D1701.

Informacja kodaseowa:

Start translacji: Nukledyda oZ5 do 7

Stop translacji: Nukleotydy od 275 do 277

IOnnSyfleator Saew Nr 12

Ikansefi0asor Saew Nr 12 zgłoszania poeazuja eomplatną sa0waπeJę πyelaotykową warsji 2 fragmantu I Hink III szczapu PPV D1701.

IknnSyfleator Saew. Nr 13

Ikantyfieator Sa0w. Nr 13 zgłoszania poeazuja warsję 3 ganu Oinazy białeowaj F110L, etóry jast zrealizowany na fragmancia I Hink III szczapu PPV D1701.

Informacja kokateowa:

Późny promotor: NuOlaotydy ok 48 ko 66

Sygnał startowy RNA: NuOlaotyke' ok 72 do 80

Start mRNA NuOlaotydy od 74 do 78

Start translacji: NuOlaotydy od 94 do 96

190 401

Stop translacji Nukleotydy od 1585 do 1588

Identyfikator Sekw. Nr 14

Identyfikator Sekw. Nr 14 zgłoszenia pokazuje sekwencje aminokwasową homologu FIOL kinazy białkowej PPV D1710 (wywnioskowana z sekwencji Identyfikator Sekw. nr 13).

Identyfikator Sekw. Nr 15

Identyfikator Sekw. Nr 15 zgłoszenia pokazuje sekwencję aminokwasową homologu VEGF PPV D1701 (wywnioskowana z sekwencji Identyfikator Sekw. nr 1).

Identyfikator Sekw. Nr 16

Identyfikator Sekw Nr 16 zgłoszenia pokazuje sekwencję aminokwasową homologu F9LPPV D1701 (wywnioskowana z sekwencji Identyfikator Sekw. nr 10).

190 401

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGOLNE:

(l) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: BAYER AG (B) ULICA: Bayerwerk (C) MIASTO: Leverkusen (E) KRAJ: Germany (F) KOD POCZTOWY (KOD): D-5136S (G) TELEFON: 0214/3061285 (H) TELEFAX: 0214/30 3482 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:

(m) LICZBA SEKWENCJI: 16 <iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 1:

(r) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 540 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (n) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (lii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701-VEGF-Gen

!.-:i) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:

GGTGCGCTAC CAATTCGCGC GGCCGGCCGC GCTGCGCGCG TAGCCGCGCA AAATGTAAAT 60

TATAACGCCC AACTTTTAAG GGTGAGGCGC CATGAAGTTT CTCGTCGGCA TACTGGTAGC 120

TGTGTGCTTG CACCAGTATC TGCTGAACGC GGACAGCACG AAAACATGGT CCGAAGTGTT ISO τ,-ά7\?> γ·,γ’λγ'γ· ά/'Γ' γλ ΑΟΩΓ/’Γλ^φ GGTCTTTCCA GTACACGACG AGCACCCGCA 240

GCTAACTTCT CAGCGGTTCA ACCCGCCGTG TGTCACGTTG ATGCGATGCG GCGGGTGCTG 300

CAACGACGAG AGCTTAGAAT GCGTCCCCAC GGAAGAGGCA AACGTAACGA TGCAACTCAT 360

GGGAGCGTCG GTCTCCGGTG GTAACGGGAT GCAACATCTG AGCTTCGTAG AGCATAAGAA 420

190 401

ATGCGATTGT AAACCACCAC TCACGACCAC GCCACCGACG ACCACAAGGC CGCCCAGAAG 480

ACGCCGCTAG AACTTTTTAT GGACCGCATA TCCAAACGAT GATGCGATCA GGTCATGCGG 540 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 2:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1740 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (in) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701- Proteinkinase-Gen(Version 1) (X1) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2:

CGAGTGACTG	CCCATCCCGT	TGCTGCGCGCG	CTTGGGG^CTG	CCCTCTGTTT	TTCTTTCCCG	60
TTTCTTCTTA	TTAGGTAGTT	GTTGCCCACC	TCCACGACCC	TCGGACGCGC	T<^G<^G<^G¢^<GC	112
CCTCGCACGC	CCGCGGCGGC	CGCGGCGGCC	GCCGACGACC	GCAAGAACAG	tcgatcgccgg	110
AAGCGCAAGC	GCAAGACGCC	CAACTGCGIA	GΆCCCCCACG	ACTCCGACGA	CG]CGC·GCGC CG	22 0
CAGACGCCGT	GCGACCGCGA	GTGGCCGGA.C	TGTGGCGCGΆ	GCTCGATCAC	GAGCTCCCGAC	300
TCGGTCTCTC	TCGGCGACGA	GATCTACTTG	CGGTGCGTGC	CCTCGCAGCT	GGACTTCGCG	36 0
CAGACCTGGG	CCCCGCCGGT	GCGGCTGCTG	CCCCTTGTGG	GGACGTTCTG	GĆA^(G^jAA^<^G	400
CTCAGCCGCA	TGTCGCGGCG	CGGGTGTCGTG	AACCCCCGGG	AGTTGCAGAG	GGCGCACGCG	480
CGCTTCTCGC	CCACCAACGA	cgacatgtac	CΆCACGGCGG	CGGGCGGGTA	CCGGCATCGTG	540
TTCCGCTTCG	ACCGCTACGT		GGCCTCCAGC	CGCGGCCCGG	CATGTCCGAG	600
ATGGACGCCT	ra^GGAc^	CACGGTGCCG	CGGTGGCCTC	GCAAGACCCT	C.CACGGGCGAC	60 0
GAGCGCGAGT	TCGTGGTCTG	CGCGCTGGCC	ATGGGGCTGA	ACTACCGGCT	GGGCTTCCGG	720
t\ /·· m <··· z-·/-% m z·· m	T> /-,/Ί/ΊΖ’ ΛΖ’ί-'Λ’ΓΤΙ
CAC T CGC TGT	ACCGGCGCGT	GCTGCACACG	CCGCGGCCTC	G CAGGGGcGT	GGAGoAAjIg^c	t 0 0/
CAGCGGCCCT	CGGTAGAGAT	GGCCcOAGAOG	CGCCGTCCGC	GGTGGGGCGC	GGCGCGCAAG	84 0
GACAGCGAGT	CCTTCGTGCG	CCTGGTCTCG	TACGGCTACC	CCTCGGCcGG	GCjCGCGCΆjCC	900
GTGAACCTGA	TGCCGACCTG	CCACCACCTG	GGTCGCCTGG	GGGCGCCCGA	GAAGCGCGCG	960

190 401

CGGTACGTGT TCCACCGCGG GGCCGTGATC GTGTTCCCTC TGGCGCGCGG GTCCGCGGAC	1100
TCGATCTCGC CGGAGGCGGC GGCAGCGCTG GGCTCCGCGC CGCACCCGGA GTTCCTCCAIG	1100
TTCGTGTTCC TCCACATCGC GCCGCCGCAC CTGCCAACAT ΤΑΟΑΟΟΤΟΟΟ GCdCTGCACG	1140
AACTTCCTGC ACCTCGACCT GAAGCCCGAC AACGTGCTCT TCTTCGACAG CGCGCGCGCT	1100
CACCCTGACT GCCGCCGCTC CCACTTTTCG CTCCTCGGAG C^C^C^C^C^C^<GC^¢^C5 C<C3CGCTGCCC	1160
CGACTTCGAC TTCCCCCCCG TCCCCACCAT CGACCCAC:C3C AAGATCGCGG GCAGCGTCCG	1320
CGTGCCGCAC AACTGGTACT ACGACTTCCA CTTCTTCGCG CACCACGCTGC	1380
CCCGCACATC GCO^GGA^ ACCCCCGCTT CCCYCGCGCTCT CTCTCGGAGC TCACGCGTGTC	1440
CTGCTCGCGC G^ACC^^ ACCGCTTCCG GCTGCGCGTG TCCTCGCCGC ACCCCATCGA	1500
GCACCTCGCG CCCCTCGTCC GCCGCGACGT CTTCTCCCGC TGCGATAAATG	1560
CGCCCCCGAC GCCGCACTCT CCTGAGCCC^ CGCCCGCGGC GCCGGGCTCG CTGTACGACG
TCTTCCTCGC CGCCACCTCG CCGCGCGCGC TCGGCCGCCT	1680
CCGCCCTCCC CCTCCCTCCC CTGCGCGGCC GCCTCCGCGGA CTGCGAGCTG GTGGTGCTGA	1740
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 3: (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1080 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (n)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (Vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE: (A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701-HD1R-Genregion (X1) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3: CCCCACTACC TGTTGTCCCC CGCCCTCCTG CATCACACCC AGCCGATCAT	60
GGAC^^^ CTCGCCCTCG GCGCCGACGT GCG.CACTCAC CTCCGCGTGT GCGGCACGGC	110
CCTGCACCCC TCCCTTCCCG GCTTGTACAC GGC^CCCCCGC: CTCCTTCCCC GGCTGCTTCG	110
ccGcCGcGcC AGcGTccccG Gΐ·cccA:cC^cCC CCAcGccACG cccccccTcc CGTGTTGCTG	240
CCGTCCGCCA GCGCGACGCC GGAGCTCGTG CCCACTCC,CG TCCCCCCCCC «Γ<Χ<3Α0αΤ6	330
CGCCCCCCCG ACTTCCGCCT CZC\CGG<GCTG CCTCACCACC CCCCCGTCCC CGCGCCCGCG	330
CCCCCCCGTC CTGCGCCCGC TCATCCGGCT TGGGGGGAGC CCCGCGGCCC 7CACACCΓGTT	420

190 401

TGGGAACACG	CCGATGCACA	TGCTGGCCCCT	GCGAAAGCCCC	TGCCGCCGCT	CGCTGATCCT	480
CCCGCTGCTG	GAGGCAGGGC	TTTCCGTGTC	CGAGGG.CGAC	CTGCACTACG	GCACCGTGCC	540
TCTGCACGTG	GCCTCGGGGT	ACGACAACAC	GCAGGGCCGC	CTCCAGCTCC	'TCCGGCAGGG	600
AGGAGACCCC	ACCGTCGTGT	CAGCCCCCCGG	ACGGACACCG	ATCTCGAACA	TGCTCGTCAA	660
AGCCAACCAC	GTGGCGGTCG	CCGGCGCGCT	GGC^C^C^C^C:?^C	CCGAGCGCGG	cagtggtcgt	720
GCAGGCTCTC	GAGCAGGCTC	TCGCMAUACGT	GCTCCCGCC	GGGCCCA.GCG	AGGCCTCGCG	780
GCTCGCCGTG	GCCTTTGTGG	TGGCGCGCGC	CGGCGGCTCC	GCGCTACCW5	AGGCCGTGCG	840
CCGTCTTCAC	GAGGGCTTCG	TCGCCGCGCTG	OGACaCCG^		TTTCCCGCAG	900
CATGCTCGGC	ACACCGGCCG	TGAGCGCGCT	GGTCGTGCTG	GC^C:CG^C^CG^G^G	AGGTCTTTGG	960
CACTGTTATC	TCCTCGCGTG	CGCTGCGCGT	CCCGCCCCGC		GCCCGGCCCC	io;2(0
GCTCCGCGAG	GCGCTCATAA	ATCTGCGCCA	CGGGCCCCCC	^AG^^CA	CCCCCGGGGC	10S0
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:	4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1616 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
(i!I) HIPOTETYCZNA-	: NIE
(iv) ANTYSENSOWNA	: NIE
(VI) ŹRÓDŁO ORYGINALNE: (A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701- ITR und ORF3 -Gen
(ii) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW.	. NR: 4:
AAGGAGGCTC	CACGGAGCAA	AGTGAAAAAG	GAC CGCCTAG	GGCCGGCGCC	CCTCCCTCCC	60
GCCTCGGGCA	AACCCACAGC	CGCCGOCAAC	ACCACACCCG	CCCGCCCGCC	ATGCACCCCT	120
CGCCGCGCCG	GCTGCTCGGC	GCGCTCGCGC		CGCCCCCCCT	CGGCGCGCTC	180
y n*s-y/-· m X	<-« r·* z·» n zi z·* /“» /“* m ζί	z-, m/-* zt/-t/-< z-'· z“« z-« z-·	z-, ł» ooi ιυυχουΛ	ztrfnz'/iz'z’z<ii z-» VJ\3 X	G*x GCGCGCGA	o λ r\ 4, X O
ACCCGTCCGC	CTCGGTGACC	TGCCTCTCCGG	TGGGCGGCGA	CCCGCCGCGC	ATGGCGGCGG	300
TCGCGCACGG	CGGCGGGACG	CTCTCGCCGG	TGTACCCGCT	GGCCCCCCGC	ATGCACGCGA	3 60
CCTTCTCCTC	CGCGCGCAAG	GGCGCGCTGC		CGCCACCCCG	ACTGTGTACG	420

190 401

ACGTGCGCGC	GCTCGCCCCC	GAGTTCGAGC	TCGTCTGCAT	CGCGGTGGTG	GTGTGGGGGA	480
ACTCGGCCGC	GGCCGCCACG	CGGCCCGCGG	CCGAGTGGCA	CCGCCAGCGG	TTTCTGTGCT	550
GCTCGGAGCT	GTGACCCCTC	CCTCCCCGGT	CTCCCTCTGT	CTGTTGAGCC	GTTTGGGGCT	600
ATTAGACATC	ATCCTCCACG	CCTCTTTGTC	CGCCGCCCTT	CTGTGCTGTT	GTTGCGTCCG	660
ATTAATTAAT	TATTTTTGTC	GCTCGCCCGC	TCACTCCGGC	AAGCTTACCG	CTGGTCCTGG	720
CTCTCTCACC	CTCACGCACA	AGAACAAGAA	CCGCTCACTC	ACCGGTGTGC	TTTTCCCCGT	780)
TAAGGTCAAC	TCACTCGCGA	GAACAAGTTG	ACCCTCACTC	TAGCGCACCG	CTTACCGGTT	6 40
ACAAGCAACC	GTCAACTCAC	TTACCACGAG	AACAAGTTGA	CCGGTGCCGG	ATCCTTG.CCG	900
AGAACAGTAA	CCGTTCTCGC	TCGCTCGGAA	CAATAGAACA	AGCTGG.CCGG	GTCCGGCTCG	960
CTCGGTGTAA	GAGAACAACA	GAACAAGCAA	CTGTTGACCA	CTCGG.CCCCC	CTAGA/AGAGA	1020
ACAAGAGAGC	AGTCAACTCA	CCCACTCAGT	CTTGGATGAG	AOTAGGACGA	CTG.GGCCAGT	1080
ACTCGCACGC	AGAGTGAGAG	AGTGAGGACA	TAATAATAGT	·ΐAGtCGAGCGGt	ATACTCACTC	1140
GCTCACTCAG	AGTGAGAGAG	AACCAGTGAG	CGAGTTAACC	ΟΟΟΟΑΟΑΟΟΑ	ATGAGAGAAC
AGTGAACTGC	TCGCGCGCTC	GCTCGGTAGC	AGTCGGCCTT	GCGTCCCCGT	TGTCTGACCA	12 00
CTTTTCCCGA	GACAGTTCAC	CCTCCAAAAC	TTTTAAAACT	CCAGGGTG.CG	TGTTCGTGCG	1320
CTCCACTCTC	CGTAAAACTT	TTGTAAAACT	GTCGGAGGTC	GGTCGACTTC	GCTG\CTCGTC	1(300
CGCGAAAACT	TTTCGTGGGC	AGTGTCTGCC	TCTCTCAGGC	TCCTCGCATC	ACTTTCGCGG	1400
AGCCTCGAGG	TAGGTCACCT	CTCTCCAAAC	TTTTGTAAAA	ACTTTTTCGC	GGAGCCTCTG	1500
GAGGCCGTCC	TCCCTCCAAA	ACTTTTCGTA	AAATCTCTTC	GGAGGCCGTC	CTCCCTCCĄCa	1500
AACTTTTCGT	AAAATCTTTG	GGAGGTCGAC	CTCCCTCAAA	ACTTTTTATA	GGCGCTT	1010

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 900 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNĄ: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1201- F9L-Gen (Version 1)

190 401 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5:

GCACCTCGCG	CGGCTGGTGC	GCCGCGACGT	CTTCTCCCGC	TGGATAAATG	CCGCCGCGGA	60
CGCCCCCGAC	GCCGCACTCT	CCTGAGCCCA	CGCCCGCGGC	GCCGGGCTCG	CTGTACGACG	120
TCTTCCTCGC	GCGCTTCCTG	CGCCAGCTGG	CCGCGCGCGC	GGCGCCGGCC	TCGGCCGCCT	180
GCGCCGTGCG	CGTGGGTGCG	GTGCGCGGCC	GCCTGCGGAA	CTGCGAGCTG	GTGGTGCTGA	240
ACCGCTGCCA	CGCGGACGCT	GCCGGCGCGC	TCGCGCTGGC	CTCCGCGGCG	CTGGCGGAAA	30C
CGCTGGCGGA	GCTGCCGCGC	GCGGACAGGC	TCGCCGTCGC	GCGCGAGCTG	GGCGTGGACC	360
CAGAGCACCC	GGAGCTGACG	CCGGACCCCG	CCTGCGCGGG	CGAGAGGCGC	GCTTGCGCAG	420
AACATCGACA	TCCAGACGCT	GGACCTGGGC	GACTGCGGCG	ACCCCAAAGG	CCGCCGACTG	480
CGCGTGGCGC	TGGTGAACAG	CGGCCACGCG	GCCGCAAACT	GCGCGCTCGC	GCGCGTAGCG	540
ACCGCGCTGA	CGCGCCGCGT	GCCCGCAAGC	CGGCACGGCC	TCGCGGAGGG	CGGCACGCCG	600
CCGTGGACGC	TGCTGCTGGC	GGTGGCCGCG	GTGACGGTGC	TCAGCGTGGT	GGCGGTTTCG	660
CTGCTGCGGC	GCGCGCTGCG	GGTGCGCTAC	CAATTCGCGC	GGCCGGCCGC	GCTGCGCGCG	720
TAGCCGCGCA	AAATGTAAAT	TATAACGCCC	AACTTTTAAG	GGTGAGGCGC	CATGAAGTTT	780
CTCGTCGGCA	TACTGGTAGC	TGTGTGCTTG	CACCAGTATC	TGCTGAACGC	GGACAGCACG	840
AAAACATGGT	CCGAAGTGTT	TGAAAACAGC	GGGTGCAAGC	CAAGGCCGAT	GGTCTTTCGA	900

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 94 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (lll) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSBNSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701- VEGF-Promotor lxil OPTS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6:

CCGCGCTGCG CGCGCGTAGC CGCGCAAAAT GTAAATTATA ACGCCCAACT TTTAAGGGTG 60

AGGCGCCATG AAGTTTCTCG TCGGCATACT GGTA 94 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 7

190 401 (1) CHAAAKTERYSTTYKi SEKKENCCI:

(A) DŁUGOŚĆ: 250 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) źródło oryginalne:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701- Intergen. Region zwischen HD1R und

Proteinkinase Gen (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:

CAAATGCCGC	TTAGTTTCCA	GCCTTTAAAAG	GCAAGGTGGGA	CCCTGCTCGC	TGCCCGGCGA	60
ACTGGTGGAG	CGCGTGCTCG	CCGG^C^C^C^irC^C^C	ACTGGCCGAC	TTGCGCCGCT	CGTGCAGGCCG	110
CCGCGCGCCC	GAGTGACTGC		GCTGCGCGAC	TCGGCACCTGC	CCTCTGTTTT	110
TCTTTCCCGT	TTCTTCTTAT	TAAG3TAGTTG	TTGCCCACCT	CCATGATCCT	CGCACCGCGCT	24 0
GGCGGGCGAC						250

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 8:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5515 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (Iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (Vl) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701- HIND III Fragment I (Version 1) (_XI) OPIS SEKWENCJI.· IDENTYFIKATOR SEiWł. NR: fi:

AAGCTTGTTG	CGCGAGTACG	TGGTGTGCCCG	CGGCCAACCG	GATCAGACCG	G^CSCJ CG/GOCG	60
GGACTTGCTC	ATCGGCATGG	GCGCCGACGT	GGGAAAGGAA	GTCGGCGTGG	GCCGCACGGC	1(20
GCTGCACGCC	TGCCTTACGG	GCGTGTGAAC	GGAACGGGAG	GTGATTATGA	CGGCGCGCGG	180

190 401

GGCCGCCGGG	AGCGTGACCG	CAGAACGACAC	CTACAAGATG	(CCGCCCCCTGG	CGGTCTTGGG	24 0
AACTGGCCGA	GCGCGACGCC	GGAGCTCGTG	CGCATCCTCG	TGCCAACAGG	CCCCCACGTG	300
AGCGCCACCG	ACTTCCGCCT	CTCACGGCATG	CTGCGCCCCCCC	ACGCAGTCCG.	CGGGCCCGCG	340
CGCGAGCGTC	ATGCGCGAGC	TCATCCGGCT	GGGGTGCAGC	CCJAGCGGCCGA	0AAAAGAGTT	420
TGGGAACACG	CCGATGCACA	TGCTGGCCAT	GGCCACGCTCC	TTCCCGCCGG	CGCGTAACCT	480
CCCGCTGCTG	CAGGGACGGG	TTTCCGTCTCC	CGCCACGACCC	CTGCACTACG	GGAACGGGCC	54 0
TCTGCACGTG	GCCTCGGGGT	ACGACCGAACC	GCAGGGCTGC	CTCCACGCTCC	TCCGGCAGGG	600
AGGAGACCCC	AGGCTGCTCT	CTCGCCGCCCC-	ACGCCCCACCG	ATCTCGCACCGc	^(^(CT^T^C^TCCAC	660
ACGCAACCAC	GTGGCGGTCG	CCGGCGCGCT	GTCTGCCGCCGC	(G<CGCAC<C<C<C(CG	CAGGGGGCGT	720
GCAGGCTCTC	GAGCAGGCTC	TCGAGAACCT	GCTGTGCCGCC	(GG<3<C<C<CjAG<C<G	AGGCCTCGCG	780
GCTCGCCGTG	GCCTTTGTGG	TG<^(3<C^(3i^<^<C	CGGCGCATCC	GCGCGtACCGCG	AGGCCGTGCG	840
CCGTCTTCAC	GAGGGCTTCG	TCGCCGACTG	CGAGCGCGGCc	(^C^^CfCt^tCTT^fClC	TTTCCCGCAG	900
CATGCTCGGC	ACACCGGCCG	TGAGCGCGCT		GTGASCGAAGC	AGGTCTTGGG	960
CACTGTTATC	TCCTCGCGTG	CGCTGCGCGT	CGCGCGGGAG	GTCCGCGTGT	ACGCCACCGCCC	1020
gctccgcgag	CCGGTGATAA	ATCTGCGCCA	C0CACTGCCGC	T^T^G^tTtTC^^CC	GCCTTTAAA.G	1080
GCAAGTGGGA	CCCTGCTCGC	TGCCCGGCCCG	ACTGGTGGAG	CGCGTGCTCG	CCC.CCGTGCC	1140
ACTGGCCGAC	TTGCGCCGCT	CGTGCGCGCCG	CCGCGCGCCC	gagtgactgc	GGATCCCGTT	1200
GCTGCGCGAC	TCGGGACTGC	CCTCTGTTTT	TCTCTCCCGT	TTCTTCTTCT	TAGGTAGTTG	12 00
TTGCCCACCT	CCATGATCCT	CGCG^C^C^C^C^C^tr	GGCGGGCGAC	CTCGCTCCGCC	CGCGGCGGCTC	132 0
GCGGCGGCCG	CCGAGGACGG	CAAACACACT	C4ATCGCCCGCA	AGCGOAACG	CCACGCCCGCCC	1380
AACTGCGAAG	ACCCCCACAA	CTCCCGCCGAC	GAGCTAGCGC	CAGJCCGCCGTG	CGACCGCCGCG	1440
TGGCCGGACT	GTCGCGCGAG	CyCGjGACTCAG	AGC^tTiTC^C^C^C^CP	CGGTCTCTCT	CGGCGCACGCcG	1500
ATCTACTTGC	GGTACGTAGC	CTCGOGGGTG	GACTTCGCGC	AGACCT(G3GC	CCCGCCGGCTG	15 00
CCCCTGCTCC	GCTTCTTCGG		AACAGGACCGC	TCCAGCCGCAT	GTCGCGGCGC	1620
GGGTACGTGA	ACCGCTCCTA	CTTCCAGATG	GCGCCGtGCGC	GCTTCTCGCC	CACCGACGAC	1680
GACATGTACC	AGATCCGGAC	TGGCGGGTAC	ggcgctcgtgt	TCCGCTTCGA	CCGCTACGTG	1740
GTCAAGTACG	m/>«mrr*Λ lUi iUCnoGA	CCGCAACGGC	ATGT CCGAGA	γπζ'/ίΤι s~, s·* s-t s~*m ri	rm\ rmii r»	1 O QQ
ACGGTGCCGC	GGTTCCTGCG	CTCATATACCTC	AAGGGCGACG	(AGCGCCGCGTT	CGTGGTCTGC	1860
GCGCTGGCCA	TGGGGCTGAA	CTACCGGCTG	GGCTTCCTGC	ACTCGCTGTA	CGGGCGCGCTC	1920
CTGCACACGC	TGCTGCTGCT	CATGCGCGTG	gaggcccggcc	AGCGGCCCTC	GGCTCGCcGCAT,	1980

190 401

GCCAAGAAGC	CGCTGCTGCG	CTGGTTCGAG	GCGCGCAAGG	ACAGCGAGTC	CGCCGTGCGC	2040
CTGGTCTCGT	ACTTCTACCC	CTCGGCCGTG	CAGAGCAACG	'Γ ΚΑΑΑ^ΰΑΤ		2100
CACCACCTGG	TGCACTTCTT	TGAGCACGAG	AAGCGCGCGC	GGGACGTGTT	C<G^C^<^<^C^<^<^G	2060
GCCGTGATCG	TGTTCCCTCT	GGCGCGCGGG	TCCGCGGACC	«ΣΌΛΑΟΤΟΘΟε	G«^(3C^<3<^<^<3<:3	2000
GCAGCGCTGG	GCTTCGCGCC	GCACTCGGAG	TTCCTT^AT	TCGTGTTCCT	GCAGATCGCG	2100
CTGCTGTACC	TGAAGATATA	CGAGCTCCCG	GGCTGCACGA	ACTTCCTGCCC	CGTGGACCTG	2040
AAGCCCGACA	ACGTGCTCAT	CTTCGACAGC	GCGCGCGGCT	AG<2<3T^iCCC^^G	CGCCCGGTGC	2000
GACTTTTCGC	TTCGAAGAGC	CCGTGCGCGC	GCCGCTGGAC		TCGCGCGCGT	2000
GGCCACCATC	GAGAACCGCA	AGATCGCGGG		GTGCCGCTCGGC	ACTGGTACTA	2020
CGACTTCCAC	TTCTTCGCGC	ACACGCTGCT	GCCCGCGCCC	CCGCCCCTCTCG	CCGCGGAGGIA	2080
CCCGGGCTTC	CACGCGCTGC	TCTCGGAGCT	GAGGGCCCCC	TC^CCCG^	GGACCCGCCG	2640
CCGCTTCCGG	CTGCGCGTGT	CCTCGCCGCA	CGGGACGGAC	GAGGCGCGGC	ggccc^^cc^^g	2000
CCGCGACGTC	TTCTCCCGCT	GGATAAATGC	cGGcGGGGAC	««CCGACC	CCGGΆCCGTC	206 04
CTGAGCCCAC	GCCCGCGGCG	CCGGGCTCGC	TGTACGACGT	CCCGCTCGGG	CGGCGCTGGC	2820
GCCAGCTGGC	CGCGCGCGCG	GCGCCGGCCT	CGCGCGCGTG	GGGGGTGGGG	GTGGGGGCGC	2880
TGCGCGGCCG	CCTGCGGAAC	TGCGAGCTGG	CGCCGGCCAA	CGGGTGCGAC		2940
CCGGCGCGCT	CGCGCTGGCC	TCCGCGGCGC	CCCGCCAAAG	G^^C^AG	CTGCCGCGCG	3000
CGGACAGGCT	CGCCGTCGCG	CGCGAGCTGG	CGCCCCAGGC	ACAGCACCCG	GAGCTGACGC	3060
CGGACCCCGC	CTGCGCGGGC	GAGAGGCGCG	GCTCGCCACA	ACACGGAGAC	CCAGACGCTG	3120
GACCTGGGCG	ACTGCGGCGA	CCCCAAAGGC	CGCCCACCGG	«CT^CC-CT	οοτοτνοΑοο	3180
GGCCACGCGG	CCGCAAACTG	CGCGCTCGCG	CCGGTACGCA	«««TGAC	GCGCCGCGTG	32040
CCCGCAAGCC	GGCACGGCCT	CGCGGAGGGC	CCGAGCGCGG	CGTGGACGGC	GCTGCTGGCG	3300
GTGGCCGCGG	TGACGGTGCT	CAGCGTGGTG	GGCGCCCGGC	CGGCGGGGGG	CGCGCTGCGG	3300
GTGCGCTACC	AATTCGCGCG	GCCGGCCGCG	CCCGCCGCGT	ACCC^^AA	AATt^TCTA^TT	3420
ATAACGCCCA	ACTTTTAAGG	GTGAGGCGCC	ACGAACCTCC	TGGCGGGGAC		3400
GTGTGCTTGC	ACCAGTATCT	GCTGAACGCG	CACACCACCA	AAACACGGCG	CGTGA5TGTTT	3540
GAAAACAGCG	GGTGCAAGCC	AAGGCCGATG	CCGCTCCCAC	TACC^A^A	gcacccggag	3 G00
CTAACTTCTC	AGCGGTTCAA	CCCGCCGTGT	GCCAGCCTGA	TC^AT^CC	CGGGTGCTGC	3000
AACGACGAGA	GCTTAGAATG	CGTCCCCACG	GAACACGCAA	AGGCAAGGAC	GCAACTCATG	3700
GGAGCGTCGG	TCTCCGGTGG	TAACGGGATG	GAAGATCCCA	«T^CTACA	GCATAAGAAA	3700

190 401

GGGGAGGTGC	CAGGAGGCGT	CACGACCACG	CCC\CCGACGA	CGCGCAGTGG	OC^AG^GA	3840
GTGGGGGAGC	AGGTTTGCTT	GACCGCATAT	C(:ccCC'’CGY^,G	CGTGGCTGAT	GTCATGCGGA	3 900
CTGCTTGTGG	CGGGAGGCCC	GTGGTCCC(GG	ACCGCCTAGA	GTGGATCGGG	CTCCCTCCCG	3960
GGTGTTTGCA		GCCGCCGA(CA	(GCG(CG((^C^CO¢^CG	GGAGGGAGGA	TGCACCCCTC	4020
TGGTGTGGTG	GGTGTCGGGT	CGCTCGCGCT	GCTGGCGCTG	TTGTGGGGTG	GGCGCGCTCT	4080
GGTGGGGGGT	TGGGGTGTGT	TGCCGGCCGC	<2G^G^C^C^^G<^C3	GTGTGGGCGG	TGCGCGC<:CCT	4140
GGGGTGGGCG	GGGGTTAGGG	GCCTCACGGT	GGGCGGCGAC	GGGGGGGAGC	TGGCGGCGGT	4200
GTGGGAGGTG	TTGTGTAGGG	TCTCGCCGGT	GTACCCGCTG	GCGTGGGGGC	TGCACOCGAC	4(2 T 0
GGGGGGGGGG	GGGCGCCCTG	GCGCGCTGCT	GTGΐGTACGGTC	GGGAGGGTTA	CTGTGTACGA	4320
GTGTGGGTGG	GGGTCCGGGG	AGTTCGAGCT	CGGCTCCATC	GGTGTGGTGT	GCGGCTACAd	4380
GGGTGGGGCT	GGGGCGAGGG	GGCCCGCGGC	CGAGTGGCAC	CGGGCTGTGG	AGCTGCGCCG	4440
GGGGTCTGTT	GTAGGCGGGG	CTCCCCGGTC	TCCCTCTGTC	GTTTGCATGG	GCCTTAGAGA	4500
GGAGAGCGCC	GGGGGCAGTC	CTCTTTGTCC	GCCGCCCTTC	TGGGCTGCGG	<^(^rFC^(C^<G¢^(CT	45 60
GGACTGCAGG	CTGTTGTGGT	CTCGCCCGCT	CCGGCCA	CGGGCAGGAT	TGACGTCAAC	4 620
GGGGTCAGGG	TGACGGAGCC	ΑΑΑΑΑΑΥΑΑΥ	CGCTCACTCA	GCGGTGCCGT	<CCGCACGGTT	4 680
CCGGTGCCCG	CCGGCTGGCG	AAAAAGTTGA	CCCTCACTCT	CGATCACTCG	G(CGCGGGC(CT	4740
GCCTGCAGCG	GCCCCTGAGG	TACCAGGAGA	^<^CC<^t^T<T^CG	CGCCACTCCA		4800
TCCGATGCAG	GTTTCGGTGG	CGCTCG<TTCC	ΑΛΤΑο.—Α	TTTCCGGTGA	ACTCGCTCGC	4860
GGGGGTGCCG	CTCACCAGAG	AACAAGCAAC	'rGTTGACCAC	GGCCGGGGGG	GAC^GAC^	4 920
GACGAGATCA	TGCCCGTGAG	CCCCCTCAGTC	TTGGATGAfr.	TGCTTACGAT	TTAACGAGTA	4980
GGGGGAGTCA	GCTGGATCGA	GTGAGGACAT	r!CCTGCCΓΆGTT	CACGCGTTCC	TACTCACTCG	5040
GGGAGGGATC	GGGAGCTATA	AC<^]GG'T(^jTGlT	ΟΑσΤΊΥΛΟΟΟ	GGGAGACGCG	CGAGAG/W(A	5100
TTTCAGGGGG	GGGGGGGGGG	CTCGGTAGCA	GTCGGCCTTT	CTGCCCCCGG	TTCGTAAAAC	51β0
GGGGGGGGCG	AGAGTGGAGG	CΐCCMCCCAE	TTTGCCCCCTA	CCGGCGGCGG	TGGCCTGCCC	5220
GGGAGGGTCG	TTACCCGTTG	TGTTGCCCCTG	TCGGACTTTCG	TTCGCGGTCG	caactcgtcc	5280
GCTACCCCGG	GGCGTTTTGC	GTGTCTGCCT	οτοτεΑοσοτ	GGTCGCCTGC	CTTTCGCGGA	5(300
TGGTGTCGGG	CTTGGAGGTG	ICTCGA/ACT	TTTGTGCCCCC	GGGTTTGTGG	GAGCCTGTGG	5400
CTTGGTGGGG	GGCTGCCCCA		7A^r^<^:^(GT':^c^G	GCGTGGTTGG	TCCCTCCAWT	54β0
CGGGGGGGGA	CCATCGGTGG	GAGGTCGACC	TCCCTCGCCCC	GTTTTTCTCA	AGCTT	5515

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 9:

190 401 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1620 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (u)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (m) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701 Proteinkinase-Gen F10L (Version2) (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:

CGAGTGACTG	CCCATCCCGT	TGCTGCGCGA	CTCGGGACTG	CCCTCTGTTT	TTCTTTCCCG	60
TTTCTTCTTA	TTAGGTAGTT	GTTGCCCACC	TCCATGATCC	TCGCACGCGC	TGGCGGGCGA	120
CCTCGCACGC	CCGCGGCGGC	CGCGGCGGCC	GCCGAGGACG	GCAAGAACAG	TGATCGCCGG	180
AAGCGCAAGC	GCAAGACGCC	CAACTGCGAA	GACGCCGACA	ACTCCGACGA	CGAGCTAGCG	240
CAGACGCCGT	GCGACCGCGA	GTGGCCGGAC	TGTCGCGCGA	GCTCGATCAC	GAGCTCCGAC	300
TCGGTCTCTC	TCGGCGACGA	GATCTACTTG	CGGTACGTAG	CCTCGCAGGT	GGACTTCGCG	360
CAGACCTGGG	CCCCGCCGGT	GCGGCTGCTG	CGCTTCTTCG	GGAACTTCTC	GAAGGAAACG	420
CTCAGCCGCA	TGTCGCGGCG	CGGGTACGTG	AACCGCTCCT	ACTTCCAGAT	GGCGCACGCG	480
CGCTTCTCGC	CCACCAACGA	CGACATGTAC	CACATGGCCA	CTGGCGGGTA	CGGCATCGTG	540
TTCCGCTTCG	ACCGCTACGT	GGTCAAGTAC	GTCTTCGAGC	ACCGCAACGG	CATGTCCGAG	600
ATGGACGCCT	CTACGGAGTA	CACGGTGCCG	CGGTTCCTGC	GCAATAACCT	CAAGGGCGAC	660
GAGCGCGAGT	TCGTGGTCTG	CGCGCTGGCC	ATGGGGCTGA	ACTACCGGCT	GGGCTTCCTG	720
CACTCGCTGT	ACCGGCGCGT	GCTGCACACG	CTGCTGCTGC	TCATGCGCGT	GGAGGAAGGC	780
CAGCGGCCCT	CGGTAGAGAT	GGCCAAGAAG	CCGCTGCTGC	GCTGGTTCGA	GGCGCGCAAG	840
GACAGCGAGT	CCTTCGTGCG	CCTGGTCTCG	TACTTCTACC	CCTCGGCCGT	GCAGAGCAAC	900
GTGAACCTGA	TCAACAACTT	CCACCACCTG	GTGCACTTCT	TTGAGCACGA	GAAGCGCGCG	960
CGGTACGTGT	TCGACCGCGG	GGCCGTGATC	GTGTTCCCTC	TGGCGCGCGG	GTCCGCGGAC	1020
TCGATCTCGC	CGGAGGCGGC	GGCAGCGCTG	GGCTTCGCGC	GGCACTCGGA	GTTCCTCAAG	1080
TTCGTGTTCC	TGCAGATCGC	GCTGCTGTAC	CTGAAGATAT	ACGAGCTCCC	GGGCTGCACG	1140
AACTTCCTGC	ACGTGGACCT	GAAGCCCGAC	AACGTGCTCA	TCTTCGACAG	CGCGCGCGCG	1200

190 401

TCTAGTGCGA	CCGCGGGCGG	TGCGACTTTT	CGGTTCTGAG	AGCCCGTGCG	CGCGGCGCTG	126 0
Α^ΟΜ	ACTTCGCGCG	CGTGGCCCCCC	ATCCGCGACCC	GCTAcG}AI^C^^C	GGGCCCGCGTC	1320
CGCGTGCCGC	AGAACGGGTA	CTACGACACTC	CACTTCCTCG	CCGACrAGCT	GCTGCGCGCG	1^^0
CATTTGTACA	TCGCCGCGGA	GGCCCCCGGGC	ttccacccgc	TGCTCTCGGA	GCTCACGGTC	146 0
CTGCGTCTGC	GCGGGACCTG	CGCG^tZfSCGSCeC	CCGCTGCGCG	TGTCCTCGCC	GCACCCCATC	1500
GAGCACCTCG	CGGGGTTGGT	GCGCCGCGAC	GTCTTCTCCC	GCTGGATTAAC	TGCCGCCGCG	1(56 (0
GACGCCCCCG	ACGTCGCATT	σΓΟΟτα,ΑΟΟ	CrAC^C^C^C^	GCGCCGCCjCT	ασοτσΆΑ^,Α	1620

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 10:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 780 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) źródło oryginalne:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701-F9L Gen, Version 2 (X1) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10:

GAGCACCTCG	CGTGGTTGGT	GCGCCGCGAC	gtcttccccc	GTTGGATAAA	TGCCGCCGCG	60
GATGCCCCTG	ATGCCGCACC	CTCCTGAGCC	CT.CGCCrGCG	GCGCTGGGCC	CGCCGTACGA	120
TGCTCCTCCC	GCGTGTTCTC	TGCGCCAGCT	GGCCC^CC^CG(^	GCGGCGCCGG	CCTCGGCCGC	180
TCGTGTTGCG	CGCGTGGGCG	CGGTGCGCGG	CC^GTT^C:GG-	6CCTCGTGAGT	TGGTGGTGCT	240
GACTTGTCGT	CATGTGGATG	CTGCCGGCGC	GCTCGCGCTG	GTTTCCGCGG	CGCTGGCGGA	300
AATGTCGGTG	GAGCCGCTGT	GCGCGCCCCCCCG	GCCCGCCGGC	GCGCGCGAGC	TGGGCGTGGA	360
TTTAGAGCAC		CGCCGGACCC	CGCCCGCGCG	6CGCGAGAGCG	CGCTTGCGCA	420
GAACACTGAT	ACTCAGACGC	TGTCCCC^C^C^GCCCC	CTGACGGGGC	,Α^^ΑΛΑ,	GCCGCCGACT	480
GTGTGCGGTG	TTGGCGAATA	GCGGCC^CCZGC	GGCCGCCCAC	TGCGCGCTCG	CGCGCGTAGC	540
	ACGTGCTGTG	TGCCCGCGCCG	CC^GCC^C^(CC	CTCGCGGAGG	GCGGCACGCC	600
	CTGCTGTTGG	cggtggccgc	GGGGCcCGGGG	TTTAGTGTGG	TGGCGGTTTC	660
GTCGTCGCGG	CGTGTGTTGC	GCGGTGCGCTA	CCGACCCGCG	CGGCCGGCCG	CTGTTCGCGC	720

190 401

GGAGGGGGGG CACCGGTCCC GTCTCAGGCG GACGTGTTCA GGGTGAGGCG GCCTGCCGTT 700 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 11:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 297 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ?: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (Vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(Α) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701 10kD- Gen (X1) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11:

GΑAGCTGGCG	GAACATGAGG	GCGΑCAAGCT	CTGGGGGGCG	GCTGATGCGG	ATCGCGAGAA	60
TTTCCGCΑAC	GGAGTGTACG	CGGCTGGΑGC	TCCGCCCTGACC	GAAAGTGTGG	AAGAGCGTCT	120
GGTACGGGTG	TTAGCCGGTG	ACCGACCA?AT	WACT GGATTGC	TGCCGCGΑCΑ	CaGGGIMCCCG	180
GTTCGΑCCGC	GTCGCCCGCC	acoctgggg(agg	TCTACGTGCAC	GCGGGGGGTG	GΓGC'G<CϊCCCC3G	2 40
CCCCAGAGCT	GGCGAGAGAG	GATACAGCAG	ATATTAGATA	CGGGGGTGTT	GCGTCTG	277

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW?. NR: 12:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Α) DŁUGOŚĆ: 5519 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (©©RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NiE (Vl) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D J.701, HindlII-Fragrnent i, Version 2 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12:

CAGGGGGGTG GGGGCGGACG GGGGGCCCGG CGCCGAGGCG GCTCAGAGCG CGGCGCTCAG

190 401

GGCGTTGCTG		GCGCCGACGT	GCCCGCTCGC	GTCGGCGTGGT	GCCGCACGGC	120
GCTGCCCCCC	TCCCTTCCCC	σοττσινίΟΑο	GACCCCGCTC	ATGATTCGCG	CGCTGCTTCG	180
GGCGGCGGCG	CCCGTCCCCC	εΛ/ν’-ΑυΑυΛΟ	CCTeGAGATG	ACGCCCACTGG	CGGTGTTGCT	240
CAAGTCCGCC	CGGGCCCCCC	CGCG^^(^,^(^(C^	GCGCACTCTT	GTGCGCCGCGCG	GCTCCGACGT	300
CCCGGCCCGG	CCCTTCCCCC	TCTCACGGCAT	GCCTCACCAC	AACGCGCAGT	CCACGCGCCC	360
CCCCGCGCCG		AGCTCATCCG	GCGTCCGGTG	rcc^c^(zcccc<zcccc	CCAAAiACCAT	420
GTTTGGGACC	ACCCCCCTCC	ACATGCTGGC	CGCTCCAACG	tcctgccgcc	GCTCGCTGAT	480
CCTCCCGCTG		GGCTTTCCGT	GAACGACCCC	AACCT GCCACT	ACGGCACCGT	540
	GTCCCCTCCC	GGTACGftCftA	CACGCAGC-GC		TCCTCCGGCA	600
GGCCCGCCCC	GGCCGCCTCC	TGTCAGCCGC	CGC.GCGCGCG		ACATCCTGCT	6 60
GCACCGCCCG	CCCCTGCCCC	TCGCCGGCGC	G CCTCCGGCG	CACCCGAGCG	CGGCAGTGGT	720
CCTGCCCGCT	GTGGCGCCCC	CTC^GAC^	CGGTCGTAAC	GCCGGGGCCA	GCGAGGCCTC	780
CGGCGTGGGG	G^GCC^^	TGGTGGCGCG	CGCCGCCGCA	TCCGCGCAC	CGGAGGGGGT	840
GCGCCGTCTT	GCGGCCCCCT	TCGTCGGCGA	CCCCGAGCCG	GCACGTCGCGT	TGCTTTGGCG	900
CCCCCTGCTC	GCCCCCCCGC	CCGTGAGCGC	GCCCGCTGCT	CTGGTCAGCA	CCCACGTGTT	960
TGCCCCTCTT	CTCTCCTCCC	GTGCGCTGCG	CGCTGGGCGG	GAGGTCCGCG	TGTACGCAΆG	1020
GCCGCTCCGC	CCCGGCCTGC	TAAATCTGCG	CGGCGCAC!TC	CGCTTAGTTT	^ΑΟ^ΤΤΑ!	1080
CCCGCCCCTC	CCCCCCTCCT	CGCTGCCCGG	CGGACGGGCT	GAGCGCGTGC	TCGCCAGGTT	1140
CGGCGTCCCC	CCGTTGCGCC	GCTCGTGCAG	C GGCCGCGCG	c(^(^(cc<c·^<^:cc	TGCCAATCCC	1200
CTTCCTCCCC	CCGTGCCCCC	TGCCCTCTGT	t£TTTT7CTTT^C	CGTTTCTTCT	TATTAGGTAG	12 60
TTCΓTTGcCCC	CCTCCCTCCT	CCTCGCACGC	GCCGGCGGGC	GACCTCGCAC	GCCCGGCGCG	1320
GCCGCGCCCG	CCGCCCCCGC	CCCSCAAGAAC	ACCCGVTGCC	GGAAGCGCAA	GCGCAACGCG	1380
CGGCACTCGG	CCCCGGCCCC	CAACTCCGAC	GC.CGAGC<AC	CGCAGACGCC	GTGCCAGGGC	1440
CACTCGCCCC	CCTCTCCCCC	GAGCTTGATC	ACGGCGTTCG	ACTCGGTCTC	TTGCCGGCAC	1500
GCCCTCTCCT	TGGGCTCGCT	ACGCTTGGAG	GCTGACTTTG	CGCAGACCTG	GGCCCCGCCG	1560
CTGCCGCTcC	TGGCGTTCTT	CGGGAACTTC	TCGΆACGAAA	CGCTCAGCCG	CΆTGGCGGCG	1620
GGCGGGTCGC	TCACGGCGTG	CTACTTCCAG	ACTGCGCGCG	CGCGCTTCTC	GCCCACCCGC	1680
CAGCCCCTGT	CCCCCCTCCC	CACTGGCGGG	TAGCGGCATG	tgttccgctt	GCACCGTCGC	1740
CTCCTCCCCT	CGCTGTTGGC	GCACCGCAAC	GGCACGCCCG	CCA.TGGCCGC	CTTTACCCAG	1800
TACCCCGTCC	CGCGCTTCCT	GCGCAATAAC	CGTGVCGGCG	AGCAGGGCGA	GTTGTCCTGC	1860

190 401

CCCCCCCCCG	CCGTGGCGCC	GAAGCAGCGC	CCTGCCCCCC	TGCACTCGCT	CTACCCGCGC	1190
CCCCCCCGCG	CGCCGCCGCC	GCCCAGTCGC	GCGGAGGCAG	GCCAGCGGCC	CCCGGCGGAG	1190
ACCGCCGGCA	GGCCCCCGCC	GCGCTTGCCC	GAGGCGCGCA	AGGACAGCGA		2040
CCCCCCCCCC	CCCGCCCCCA	CCCCTCCCCC	GCCCAGGCCA	ACCCCGGCCC	GATCGGCGAC	2110
CCCCGCCGCC	CCCTCCGCCC	CCCCGACCAC	GGGGGGCGCC	CGCGCCGCGC	CCCCGACCGC	2110
CCCGCCCCGA		CCCGGCGCGC	GGGCCCGCCC	GCTCCGCCCC	CCCCGAGGCG	2222
CCCCCACCCC	CGGCCTCCGC	CCCCCGCCCC	GGGCCCCCCA	GCTCCGCGTC	CCCCCGGGCC	2220
CCGCCCCCGC	ACCCGGGGGC	ACACGGGCCC	CCCGCCCGCA	CCAACCCCCC	GCACGCGGGC	2234
CCGGGCCCCG	ACGGCCCCCC	CGCCCCCGGC	AGCCCGCCCG	CGCCCGCCCC	CGCCGCGCCC	2240
CCCGCCGCCT	CCCCCCCCGG	ACACCCCGTG	CCCCCGGCCC	TCGGCCGCCC	CGACCCCGCG	2246
CCCGCCCCCG	CCGTCGGCGG	CCCCGACGCC	CCCCCCAGCC		GCGGGGCCCC	2520
CACCACCACC	CCCGCCCCCT	CCCCCACACC	CCCCCCCCCC	CCTGCCCCCG	CATCGCCGCG	2280
GACCGCCCCC	CCCCCCGCCC	GCCCCTCCCG	CAGCCCGCCC	CCTCGTCCTC	GCGCCCCGCC	2244
CCCGACCCCC	CCCCGCCCCC	CCCGTCCCCG	CCGCACCCC^	CCCGGCGCCC	CCCCCCCCCG	2200
CCCCGCCCCC	GCCCCCCCTC	CCGCCGCGCG	GGCCCCGCCG	CGGGCGCCCC	CGACGCCGCA	2260
CCCCCCCCGG	CCCGCCCCCC	CGGCCCCGCG	CCCGCCGCGC	CGCCCCCTCC	TCGCGCGCCC	2200
CCCGCCCCAG	CCGCCCCCCC	GCCCCCCGCC	GGCCCCGCCC		TGCCCCCCGG	2280
CCCGCCCCGC	CGCCCCCTGC	GGGGCCCCGG	GCCGCCGGCC	CCCGGCCGCC	GCCACGCGCG	2290
CCCCCCCGGC	GCGCCCGCCC	CGGCCCCCGC	GGCGCCGGCC	CAGACCCCGC	CGCGCCCGCC	3300
CCCCCCCGGC	ACGCCCCCCG	CCGCGCCCCG	CCCGCGCGTC	GGCCCGCAGC	ACCCGCGGCC	3360
CACGCCCGGC	CCCCCCCGCG	CGGCCCGGGG	CGCCCCCGCC	CGCAGCATCG	GCACCCGCAC	3 310
GCCGCACCTC	CGCGGCCGCC	GCGACCCCAG	AGGCCCCCCG	CTGCGCCCGC	CGCCCGCCGA	3180
CAGCCCCCGC	CCGCCCCCGG	ACCCCGCCCC	CGCGCCCGTA	GCCGCCCCGC	TGACCCGCCG	3240
CCCCCCCCCG	AGCCGCCACG	GCCCCCCCGA	CGCCCGCACG	CCGCCGTCCG	CCCTCCCGCC	3300
CCCGCCCCCC	GCGCCGGCGG	CGCCCGGCGC	CGCCCCGGCC	CCGCTGCCCC	CGCGCCCCCC	3G36O
GCCGCCCCCC	CACCAACCCG	CGCCGCCGGC	CGCCCCCCCC	GCGTGCCCCC:	GCGGAGTGCA	3420
GACCGCGACC	CCCAACCTCC	GAGGGCCGGG	CGCCACCGGG	CCCCCCCCCC	GCACGCTGGC	3 480
GGCCCCCCGC	CCGCGCCGGC	GCCCCCCGGG	CGCCCGCACC	GCGAGGACGC	GGCCCGGAGC	3 540
CCCCCGGGGC	GGCGGCCGCG	GGCCGACGCC	GGCGCCCTCT	CCACCGCGCC	GCGAGCACCC	3600
CGGGCCGACC	CCCCGGCGCC	CCGGCCCGCC	CCCTCCCACG	CTGACGCGGT	GCGCCCGGTC	3660

190 401

GTGGAAGGAG	GAGAGCTTAG	AATGCGTCCC	CACGGTAAGG	σοΑΑΑΌΤίΑΑ.	CGATGCCAACT	3020
GAGGGGAGCG	TGGGTGTGGG	GTGGTiTACGG	GACGCGAl.CAC	CTGAGCTTCG	ΤΆΟΛΑ/ΟΛΊ’ΑΛ	308 0
GACATGCGAT	GGGΑΑΑGGΑG	CACTCACGAC	CACGCCGACCG	ACGACCACCAA	ggoccgcccag	3040
ΑCGΑGGGGGC	GΑGΑΑCGTTT	TATGGACCGC	ATATCCCAA.C	GATGATGCGA	TCAGGTCATG	3900
CGGAAGGAGG	CTCCAGGGAG	CAAAGTGTGAA	TAGGACCGCC	TAGAGTCGAG	ACCCCTCCCT	3 960
GGGGGGTGGG	GGAAAGGGAG	AGCCGCCGCA	TAiCACCACAC	CCGCCGACCT	ACCATGCACC	4420
GGGGGGGGCG	CGGGGTGGTC	GGCGCGCTCG	cgctgctggc	GCTGGGCTTC	GCTCGGCGCG	4080
GGGGTGGGGG	CGCGGCGCCG	CTCGTGCCGG	CCGCCTTCCT	GSAGGIKGSGG	CACGTGCGCG	4140
GGΑΑGGGGGG	GGCGTCGGGG	ACCTGCCTCA	CGGTGGGCGG	CCGACGGGCGG	ClAGGAΐGGCGG	4200
GGGGGGGGGA	CGGCGGCGGG	ACGCTCTCGC	CGGTGTACCC	GCTGGCCGCC	GGCMGCICCG	4460
GGΑCCTGGTC	GTGGGGGGGG	AAGGGCGCGC		CGTCGCGACC		4320
ΑGGΑGGTGGG	GGGGGGCGGG	CCCGAGTTCG	AGCTCGTCTG	CATCGCGGTG	GTCGGCGGCT	4330
•η /~«τι Ti Gm /-><— z-·/~· ACACC ± CGGC	GZ^GGGZ^G/-1/-·/-· C3GGGCG3GG	ACGCGGCCCG	CCGJCCCGAGTG	GCACCGCCCAG	CrG(3GlCGC'ΐG,G	4440
GGGGGGGGGA	GGTGTGACGC	CTCCCTCCCC	GGTCCTCCCTC	TGTCTTTGTA	ATCGGCCTTA	4500
GAGATTAGAC	AGCATGGGGG	ACGCCTCTTT	G TCCGCCCGCC	CTTCTTCGCG	GACGGATGAA	45 60
GGAATGAATT	ΑΑGGΑGTGTG	GTCGCTCGCC	CGCTCCCCCTCC	Gf^iCAAGlGt^tAlC	CGAGTGACGT	4620
GAACTGTGGC	ΑCCGGGΑCGG	AACACAACAA	GTCCCCGCTCCC	CTCACCGGGC	AAGGGAAGAC	4680
GGGGAAGGTG	AACTCACTCG	CGAGAACAAG	TTGACCCTCCC	CTCTAGAGTAA	CGAGGAACGG	4740
GGAAGAAGCA	ΑCGGTGΑΑCG	cacttaccac	GAGTAACCAAGT	TCGACCGCCCAC	TCAAAGGGAA	4800
CAGAGAACAG	GACGCGTTCG	CGCTCGCTCG	(GACCJACKCGA	ACCAaGTTTaTC	GTC7AACTCGC	48 60
GGGGGGGGTG	TAAGAGAACA	ACAGAACAAG	CAACTGTTGA	CCGAGr<GAACC	CCCGGAGJAAG	4920
AGAACAAGAG	AGCAGTCCAC	TCTCCCCACTC	AGTCTTGCGCT	GACGAGGAGGA	CGAGTTAACG	4 980
AGGAGGGGGA	GGGAGAGGGA	GAGAGTGAGG	ACAT/ACTACC	AGTTŻAACGAG	TTAATACTCA	5040
GGGGGGGAGT	CAGAGTGAGA	GAGCGCCCAGT	GAGCGAGTTA	ACCGCGCACA	CGAGCGAGAG	5!iG:
AAGAGGGAAG	GGGGCGCGGG	CTCGCTCGGT	AGCAGTCGGC	CTTTCTT7CAC	ACGGTTGGTA	5160
AAAGGGGGGC	CGAGACAGTT	CACCCTGGAA	7CCCTTTTJACC	ACTAAACTCG	GAGGTGGCCT	5220
GGGGGGGAGT	GGGGGTΑΑΑΑ	CTTTTGTAAA	ACTGTCGCGCG	GTCGGTCGAC	TTCGCAACTC	52S0
GTCCGCGACA	ACTGTTCGGG	GGCAGTGTCT	GCCTCTCTCA	GGCTCCTCGC	ATGAGTTTGG	5340
GGGAGGGGGG	ΑGGGΑGGTGΑ	CCTCTCTCCA	/cacttttgta	2ACACCTTTTT	CGCGGAGCCT	5400
GGGGAGGGGG	TGGTGGGGGG	AAAACTTTTC	GTTACACTCTC	TTCGCGAGGCC	GTCCTCCCTC	5460

190 401

CAAAATTTCC TGCAAAATCT CTGGGAGCCC GACGCGCCCC AAAACTCCCC ATAAAGCCC (0) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 0700 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (n)RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D 6706 Proteinkinase-Cen F60L ( Version 4)

2269 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 64:

CCACCcATTG	cCCATGCGcC	TGCTGCGCGA
CCTTCTCCTA	TTACCCAGCC	GTC^^C^C^C^^C
TTTTCCATGT	CCCCGGCGGC	cgcggcggcc
AAGTCTAAGC	GCAACACGTT	CTUYCTGCGcC
CACACCCCGT	CCGACCCCGA	GTG^CC^C^CC^C
TTCCTTCCTC	CCACTCATGA	GATCTACTTG
TAGACTTGCG	CCTCGTCCAT	GCGGCTGCTG
TTTACTCCCA	CGCCCCCCTG	CGGGTACGTG
TcCCTTCCCC	TTACTAACCA	CGACATGTAC
CTCTGTTCTG	ACTGCCACAT	GGTCCTCGTAC
ACCAATCTTC	TCACCGACCA	CACGGTGCCG
CACCCTGAGC	TTGCCGTCCG	CGCGCTGGCC
CACTTCCTGC	ACCGGCCCGT	GCTGCACACG
CAGTCATCTC	GCGTAGAGAT	GGCCCC^CAAAC
CACACCCACT	CTCTTATGCC	CCTGGTCTCG
CTGAATTTCA	TCAACAACCC	CCACCACCTG
CCACATCCCT	TCAATCGTGC	GGCCG’SGAG!C
TTCACTCTCT	CCGACCG^	GGCAGCGCTG

CTTTGCACTC	CCCTCTGTTT	TTCTTTCCCG
TTCTCCACTT	TCGCACGCGC	TGGCGGGCGCC
GCCGACGACT	GCCCGAACACC	TGATCGCCGG
CA.CGCCTACA	ATCTCGATGA	CGAGCTAGCG
CGCC^C^CGC^GC.	GCTCGATCAC	GAGCTCCGAC
CGGCC^CGCCcC	CTTGGTAAAC	GGACTTCGCG
CGCTCCTCTG	GGAACTCCCG	(AAAAAAAA^(3
CCCCGCrCCT	ACCCCCAGAC	&3CCSCTA:<3C^G
CACACTACCA	CCGACGGATA	CGGCATCGTG
GCCTTTTAGC	ACCATAATAA	CATGTCCGAG
CTAGTCCTGC	CTAΛTAACTC	CCAACGGCGAC
ATGCGGCCGA	ACCATTGACC	GGGCTTCCTG
CCCCTGCTGC	TCATGTGTGT	GGAGGCACGGC
CCGCTGCTGC	CCCGCTCCGA	GGCGCGCCACG
TACTTCTACC	CCCCCGTCCC	GCCCAA^C^CACC
GCCCACTTCT	TTGAGCACGA	GTCCGC(^C(^CG
GCGTTCCCTC	TGCCCCGCGG	GTCCGCGGCCC
GGCTTCGCGC	CGCACCTCCA	GTTC(CT<CCAAc

120

1^0

240

300

300

420

480

500

600

00

700

700

800

900

900

1000

1000

190 401

CTTGCGTGTC	TGCAGAGCGT	GCTGCTGTAC	CGGGAClAAA	ACGAGCTCCC	GGGCTGCACG	1140
AACCCCTTGC	ACGTGGATTT	GAAGCCCGAC	CACCGTGGTCA	GCTTCGACAG	CGCCGCGCGCG	1200
CCTAGCGTGA	TCGTGGTTGG	TGCGACTTTT	CTlTCCTGAC	AGC^CCGCCGC^	CGCGGCGCTG	1260
AATGATTCCG	ACCTTGTlCG		ATCGAGGACC	GCCACCGCTCGC	GGGCAGCGTC	1320
CGTGTGTTGT	^ΑΑ^^ΥΑ	CTACGACTTC	CTCTTCTTCT	CGCACCCCGCT	GCTGCGCGCG	1380
CATTTlCACA	^Ι^ΠΙΑ	GGACCCGCGCC	TTCCCCCGCGC	TGCTCTCGGA	GCTCACGGTC	1440
CTGTGCCCGT	GTlGGACTCG	CGCCCCGCTTC	CGGCCGCGCG	TGTCCTCGCC	GCACCCCATC	1500
GAGCATCTTG	TGCGGTGGGC	GCGCCGCGAC	GTCTTCFCCC	GCTGGlCTCAAC	TGCCGCCGCG	1560
ΙΑΠ^^η	ACGTGGTACC	CTCCTGAGCC	CACGCCCGCG	GCGCCGGGCT	CGCTGTACGA	1620
TlCTCCTTCC	GCGTGCTCCC	TGCGCCAGCT	GGCCGCGCGC	GCGGCGCCGG	CCTCGGCCGC	1680
TCGTGCCGCG	CGCGGGGGCG	CGGTGCGCGG	CCGCCTGCGG	6CACTGCGAGC	TGGTGGTGCT	17 40

GA 1742 /02 τχτ T?r.TNm η ΤΛ T~\T r τ M^nn^n τ c*m J O a onTDł \*n - -i λ , \c/ ^.α. j. iOń,tR i ar o&jan » r<K . i**.

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 497 aminokwasów (B) ROD ZAJ: amino kwas (C) ΝΙΠΟΗΟέδ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) źródło oryginalne:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701 Proteinkinase F10L (X1) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR .SECT?. NR: 14:

Met 1

Ile

Leu

Ala

Arg 5

Ala

<ny

Gly

Arg

Pro 10

Arg

Thr

Pro

Ala

Ala 15

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala 20

Glu

Asa

Gly

Lys

As n :25

Sec

Aip

Arg

Arc

p.s 30

Arg

Lys

Arg

Lys

mr 35

pro

Asn

c C^s

Glu

Asp 4l

CiLa

Asp

Asn

s>er

Asp 45

Asp

Glu

Leu

Ala

Gin 50

Thr

Pro

Cyi

Asp

Arg 55

Glu

Trp

Pro

Asp

Cys 60

Arg

Ala

Ser

Ser

Ile 65

Thr

Ser

Sei

Asp

Ser 70

Val

Sei

Leu

Gly

Asp 7^

Glu

Ile

Tyr

Leu

Arg 80

190 401

Tyr

Val

Ala

Ser

Gln 85

Val

Asp

Phe

Ala

Gln 90

Thr

Trp

Ala

Pro

Pro 95

Val

Arg

Leu

Leu

Arg 100

Phe

Phe

Gly

Asn

Phe 105

Ser

Lys

Glu

Thr

Leu 110

Ser

Arg

Met

Ser

Arg 115

Arg

Gly

Tyr

Val

Asn 120

Arg

Ser

Tyr

Phe

Gln 125

Met

Ala

His

Ala

Arg 130

Phe

Ser

Pro

Thr

Asn 135

Asp

Asp

Met

Tyr

His 140

Met

Ala

Thr

Gly

Gly 145

Tyr

Gly

Ile

Val

Phe 150

Arg

Phe

Asp

Arg

Tyr 155

Val

Val

Lys

Tyr

Val 160

Phe

Glu

His

Arg

Asn 165

Gly

Met

Ser

Glu

Met 170

Asp

Ala

Ser

Thr

Glu 175

Tyr

Thr

Val

Pro

Arg 180

Phe

Leu

Arg

Asn

Asn 185

Leu

Lys

Gly

Asp

Glu 190

Arg

Glu

Phe

Val

Val 195

Cys

Ala

Leu

Ala

Met 200

Gly

Leu

Asn

Tyr

Arg 205

Leu

Gly

Phe

Leu

His 210

Ser

Leu

Tyr

Arg

Arg 215

Val

Leu

His

Thr

Leu 220

Leu

Leu

Leu

Met

Arg 225

Val

Glu

Glu

Gly

Gln 230

Arg

Pro

Ser

Val

Glu 235

Met

Ala

Lys

Lys

Pro 240

Leu

Leu

Arg

Trp

Phe 245

Glu

Ala

Arg

Lys

Asp 250

Ser

Glu

Ser

Phe

Val 255

Arg

Leu

Val

Ser

Tyr 260

Phe

Tyr

Pro

Ser

Ala 265

Val

Gln

Ser

Asn

Val 270

Asn

Leu

Ile

Asn

Asn 275

Phe

His

His

Leu

Val 280

His

Phe

Phe

Glu

His 285

Glu

Lys

Arg

Ala

Arg 290

Tyr

Val

Phe

Asp

Arg 295

Gly

Ala

Val

Ile

Val 300

Phe

Pro

Leu

Ala

Arg 305

Gly

Ser

Ala

Asp

Ser 310

Ile

Ser

Pro

Glu

Ala 315

Ala

Ala

Ala

Leu

Gly 320

Phe

Ala

Pro

His

Ser 325

Glu

Phe

Leu

Lys

Phe 330

Val

Phe

Leu

Gln

Ile 335

Ala

Leu

Leu

Tyr

Leu 340

Lys

Ile

Tyr

Glu

Leu 345

Pro

Gly

Cys

Thr

Asn 350

Phe

Leu

His

Vai

Asp 355

Leu

Lys

Pro

Asp

Asn 360

Val

Leu

lie

Fhe

Asp 365

Ser

Aia

Arg

Ala

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Gly

Ala

Thr

Phe

Arg

Phe

Glu

Glu

Pro

370 375 380

Val Arg Ala Ala Leu Asn Asp Phe Asp Phe Ala Arg Val Ala Thr Ile 385 390 395 400

190 401

Glu

Asn

Arg

Łys

Ile 405

Ala

Cly

Ser

Val

Acg 410

Val

Pro

Gin

Asn

Trp 4H

Tyr

Tyr

Asp

Phe

His 420

Phe

Phe

Ala

His

Thr 425

Leu

Leu

Arg

Ala

Tyr 430

Ppo

His

Ile

Ala

AAa 435

Glu

Asp

Pro

Gly

Phe 440

His

Ala

Leu

Leu

Ser 445

Glu

Leu

Tho

Val

Ser 450

Cys

Ser

Arg

Gly

Thr 455

Cys

Asp

COg

Phe

Arg 460

Leu

Arg

Val

Ser

Ser 465

Pro

His

Pro

Ile

Glu 470

Hi:

Leu

Ala

Arg

Leu 475

Val

Arg

Arg

Asp

Val 480

Phe

Ser

Arg

Trp

11 e 485

Asn

Ala

Ala

Ala

Asp 440

Ala

Pro

Asp

Ala

Ala 440

Leu

Ser (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 15:

(1) CCHARAKTERYSTUKC SE1KWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 132 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ni) HIPOTETYCZNA.: NIE (iv) ANTTYSENISOWN1A: NIE (vi) ŹRÓDŁO oryginalne: :

(A) ORGANIZM: Paoapox ovis (B) SZCZEP: D1701 VEGF- Protein (X1) OPIS SEKWENCJI: IDENTYTIKTOR SEIWJ. NR: 15:

Met 1

Lys

Phe

Leu

Val 5

Gly

Ile

Leu

Val

Ala 10

Val

Cys

Leu

His

Gln 15

Tyr

Leu

Leu

Asn

A)la 20

Asp

Ser

Thr

Lys

Thr 25

Trp

Ser

Glu

Val

Phe 30

Glu

Asn

Ser

Cly

Cys 35

Ly0

Pro

Arg

Pro

Met 40

Val

Phe

COrg

Val

His 45

Asp

Glu

Hu

Pro

Clu 50

Leu

Thr

Ser

Gln

Agg 55

Ph e

Asn

Pro

Pro

Cys 60

Val

Thr

Leu

Met

Arg 65

Cys

Gly

Gly

Cys

Cys 70

Asn

Asp

Glu

Ser

Leu Ί5

Glu

Cys

Val

Pro

Thr 80

Clu Clu Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Met Cly Ala Ser Val Ser Cly

190 401

82

90

92

Gly

Asn

Gly

Met 100

Gln

His

Leu

Ser

Phe 105

Val

Glu

His

Lys

Lys 110

Cys

Asp

Cys

Lys

Pro 112

Pro

Leu

Thr

Thr

Thr 120

Pro

Pro

Thr

Thr

Tłhr 125

Arg

Pro

Pro

Arg Arg TArg Arg 130 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 16:

(1) CCDARGKTERYSTYίKG SEIKWEJCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: H4 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (li)RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (lii) HIPOTETYCZNA: NIE (lv) ANfTYSENSOWA-. NIE ( vi ) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Parapox ovis (B) SZCZEP: D1701 Protein F9L (X1) OPIS SEKWENCJI: LDENC^,YFIIGCΓOR SEIWW. NR: 11:

Met 1

Pro

Pro

Arg

Thr 5

Pro

Pro

Thr

Pro

His 10

Ser

Pro

Glu

Pro

Thr 15

Pro

Ala

Ala

Pro

Gly 20

Ser

Leu

Tyr

Asp

Val 25

Phe

Leu

Ala

Arg

Phe 30

Leu

Arg

Gln

Leu

Ala 32

Ala

Arg

Ala

Ala

Pro 40

Ala

Ser

Ala

Ala

Ccs 45

Ala

Val

Arg

Val

Gly 20

Alu

Val

Arg

Gly

Arg 22

Leu

Arg

Asn

Cys

Glu 60

Leu

Val

Val

Leu

Asn 62

Arg

Cys

His

Ala

Asp 70

Ala

Ala

Gly

Ala

Leu 7^

Ala

Leu

Ala

Ser

Ala 80

Ala

Leu

Ala

Glu

Thr 82

Leu

Ala

Gln

Leu

Pro 90

Arg

Ala

Asp

Arg

Leu 95

Ala

Val

Ala

Arg

Gln 100

Leu

Gly

Val

Asp

Pro 105

Glu

His

Pro

Glu

Leu 110

Thr

Pro

Asp

Pro

Ala 112

Cys

Ala

Gly

Glu

Ser 120

Ala

Leu

Ala

Gln

Asn m

Iie

Asp

Ile

Gln

Thr 130

Leu

Asp

Leu

Gly

Asp 132

Cys

Gly

Asp

Pro

Lys 140

Gly

Arg

Arg

Leu

190 401

Arg 145

Val

Ala

Leu

Val

Asn 150

Ser

Gly

His

Ala

Ala 155

Ala

Asn

Cys

Ala

Leu 160

Ala

Arg

Val

Ala

Thr 165

Ala

Leu

Thr

Arg

Arg 170

Val

Pro

Ala

Ser

Arg 175

His

Gly

Leu

Ala

Glu 180

Gly

Gly

Thr

Pro

Pro 185

Trp

Thr

Leu

Leu

Leu 190

Ala

Val

Ala

Ala

Val 195

Thr

Val

Leu

Ser

Val 200

Val

Ala

Val

Ser

Leu 205

Leu

Arg

Arg

Ala

Leu 210

Arg

Val

Arg

Tyr

Gln 215

Phe

Ala

Arg

Pro

Ala 220

Ala

Leu

Arg

Ala

190 401

Lista figur

Figura 1 pokazuje mapę fizyczną fragmentu HindIII I orf D1701 w plazmidzie pORF-1/-2. Cienkie strzałki pokazują zidentyfikowany mRNA, zaś grube strzałki pokazują ORF.

Figura 2 pokazuje mapę fizyczną miejsc rozpoznających HindIII w genomie D1701 oraz geny zidentyfikowane w HmdDI I, jak również część regionu odwróconych powtórzeń.

Figura 3 pokazuje plazmid pCE4. Po cięciu NruI, fragment wielkości 396 bp zastąpiono kasetą LacZ.

Figura 4 pokazuje plazmid pCE9, do którego wprowadzono kasetę LacZ po linaaryzacji przez cięcie XcmI.

. Figura 5 pokazuje schematycznie, jak to opisano w tekście, strategię zastosowania PGR do wytworzenia nowych unikalnych miejsc cięcia.

Figura 6 pokazuje schematycznie dwustronne okrawanie przy użyciu egzonukleazy Ba131, a następnie wprowadzenie łączników EcoRV i kasety LacZ.

Figura 7 pokazuje strategię wytwarzania kasety LacZ/gpt;

Puk - promotor K11 krowieaki Pvegf - promotor VEGF PóY Sm - Smal

B - BamHI

Figura 8 pokazuje ąchamatyczaia soiaOegię klonowania fragmentu EcoRI E óóY D1701, który zawiera gen 10 kDa (jak opisano w tekście).

190 401

190 401 pORF-PA

S S Bg Bg Bg

pCE-4

190 401

Xcml

pCE-9

190 401

Xb s xs

Nr

Nr Bg

PCR C

El XB iEcoRI EcoRV Xbal

Fig. 5 <3=>

cl

190 401 >

cc o

ώ (Z) ι

CL

M	iP fO Ή y cc ω > δ Λί c
>-	□
	ρ
co	φ
f—	Η λ:
fi	ρ
υ	3
X	•ο
(D	Φ
H	•Η
C	β
Φ
“I	Η
	3
<a	πΐ
u	Ρ
-P	4 i
r-ł	(Μ

td («η kk »—ι Ε ΞΖύοχ

Φ

H c

ίΰ	φ
Η	2=2
£	Η
<-Μ	Ρ
Φ δ	Ν υ nr
	γΗ
	0J
φ	*Γ0
rd	υ
Ρ	φ
Φ	cn
Η	Η
Cii r-l
Φ·	)
Ρ	Φ
ω	Μ
ΓΟ	•φ

KI

O

Π) >1 > -P <£ a) o ω υ ro td ω φ rd Ή c

<α <σ 5 N Φ Ό Ή ffl w 2 Φ o N Ki £§'

190 401 ρΜΤ-1 ^Ρ11Κ

-- pGSRZ

-- ρΜΤ-4

tłaaif %®Ε@· pGSRZ ρΜΤ-4

-t'>c Ί

190 401

Fsg.8

190 401

T.G 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz Cena 6,00 zł.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1 Wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus pochodzący ze szczepu parapoxwirusa D 1701 zdeponowanego pod numerem rejestracyjnym CNCM 1-751 i zawierający przynajmniej jedną wstawkę elementu obcego DNA we fragmencie I Hind III parapoxwirusa szczepu D 1701.
2. 2 Wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus według zastrz. 1, znamienny tym, ze wstawka jest zlokalizowana w sekwencji kodującej VEGF lub w przyległych niekodujących sekwencjach, przy czym sekwencja kodująca VEGH jest scharakteryzowana przez nukleotydy od 92 do 487 sekwencji przedstawionej w Id Sekw. Nr 1.
3. 3 Wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus według zastrz. 1, znamienny tym, ze wstawka jest zlokalizowana w sekwencji kodującej ITR lub w przyległych niekodujących sekwencjach, przy czym sekwencja kodująca ITR jest scharakteryzowana przez sekwencję przedstawioną w Id Sekw. Nr 4.
4. 4 Wytworzony rekombinacyjnie parapoxwirus według zastrz. 1, znamienny tym, ze wstawka koduje immunogenny składnik patogenu.
5. 5. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że obejmuje włączenie wytworzonego rekombinacyjnie parapoxwirusa pochodzącego ze szczepu parapoxwirusa D 1701 zdeponowanego pod numerem rejestracyjnym CNCM 1-751 i zawierającego przynajmniej jedną wstawkę elementu obcego DNA we fragmencie I Hind III, która koduje immunogenny składnik patogenu.
6. 6. Rekombinacyjnie wytworzone PPV, znamienne tym, ze zawierają wstawki i/lub delecje w miejscu sekwencji genowej PK lub w przyległych niekodujących sekwencjach.
7. 7. Rekombinacyjnie wytworzone PPV, znamienne tym, ze zawierają wstawki i/lub delecje w miejscu sekwencji genowej HD1R lub w przyległych niekodujących sekwencjach.
8. 8 Rekombinacyjnie wytworzone PPV, znamienne tym, ze zawierają wstawki i/lub delecje w miejscu sekwencji genowej F9L lub w przyległych niekodujących sekwencjach.
9. 9. Rekombinacyjnie wytworzone PPV, mamienne tym, ze zaw'ierają\vstawki i/lub deiecje w miejscu sekwencji genu, która koduje ITR lub w przyległych einkodujących sekwencjach.
10. 10. Rekombinamyjnie wytworzone PPM zilamienna tym, ze za\\ύsuzιebnnsta\vZi i/lwk delicji w międzygeeobet pomiędzy genem HD1R i genem PK

    Pizsdmiotem wynalazku jest wytworzony rnnombieecyjnin perapoxwirus pochodzący zs szczepu parepoxwirusa D 1701, sposób wytwarzania szczepionki oraz rekombinacyjeie wytworzone PPV

    Nowe, zmismoee rekombmecytms parapoxwirusy niosą w genomie de-ecje i/lub insercjs De-scje segmentów genomu parapoxwirusów i/lub insercja obcngo DNA mozn prowadzić do zmniejszenia albo utraty ich patogcnności (atenuecja). Informacja genetyczna z patogenów albo substancji aktywnych biologicznie jsst włączeea do genomu perapoxwirusów przy użyciu insercji. Ta obca informacja genetyczna, jako składowa rnnombieowenych parapoxwirusów, ulega ekspresji, przykładowo w hodowli komórkowej, tkankach albo całych organizmach

    Rsnombieawane perepoxwirusy, które wytworzono według wynalazku stosuje się, przykładowo w szczepionkach albo immunomodulatorach. Ekspresja obcego DNA w genomie parapoxwirusów wywołuje, przykładowo, u szcznpionngo osobnika, obronną rnakcję przeciwko patogenom, które są reprezentowane przez obcą informację genetyczną. Można również

    190 401 pobudzić nieswoistą odporność szczepionych osobników. Poniżej, określenie „parapoxwirusy” zostanie zastąpione skrótem PPV

    PPV same wykazują efekt immunomodulujący, ponieważ pobudzają nieswoistą względem patogenu reakcję odpornościową organizmu. Stąd, preparaty parapoxwirusów są, przykładowo, z powodzeniem stosowane w weterynarii do wywoływania ogólnej odporności.

    O ile szczepionki, które wywołująefekt swoisty wobec patogenu wymagająkilku dni do tygodni, zaleznie od antygenu, do wywołania ochrony, zapewniają długą ochronę, która trwa przez miesiące i lata.

    Szczepionki, które są wytworzone w oparciu o rekombinowane parapoxwirusy można zastosować jako produkty biologiczne do usprawnienia kontroli chorób zakaźnych, ponieważ wywołują długotrwałą ochronę swoistą wobec patogenu w organizmie, jak również wywołują ochronę nieswoistą wobec patogenu, która zaczyna się bardzo szybko.

    Kombinacja immunostymulujących właściwości PPV i ekspresji obcych antygenów, które indukują homologiczną i/lub heterologiczną ochronę swoistą wobec patogenu jest nowa. Umożliwia ona wytwarzanie produktów, które zarówno pośredniczą w szerokiej nieswoistej ochronie przed zakazeniami, która występuje szybko, jak również zapewniają długotrwałą ochronę przed zakazeniem swoistym patogenem.

    Rodzina wirusów ospy kręgowców (Chordopoxvirmae) jest podzielona na poszczególne, niezalezne rodzaje. Wynalazek dotyczy rodzaju PPV, który różni się od innych wirusów ospy strukturalnie i genetycznie. PPV sąpodzielone na trzy różne gatunki (1):

    - Parapoxvirus ovis (określany również jako wirus niesztowicy zakaźnej, wirus zakaźnego krostkowego zapalenia skóry albo wirus orf), który jest uważany za wirus prototypowy rodzaju,

    - Parapoxvirus bovis (określany również jako bydlęcy wirus pęcherzykowego zapalenia pyska albo wirus pryszczycy) i

    - Parapoxvirus bovis 2 (określany również jako udderpoxvirus, wirus krowianki, wirus pseudoospy albo wirus guzka dojarek)

    Opisano przedstawicieli parapoxwirusa, których wyizolowano od wielbłądów jednogarbnych, jeleni, giemz, fok i lwów morskich. Nie wyjaśniono do tej pory, czy wirusy te są autonomicznymi gatunkami w rodzaju parapoxwirusów, czy są one izolatami opisanych wyżej gatunków

    Zakażenie PPV może wywołać chorobę miejscową zarówno u zwierząt, jak i u ludzi (patogeny zoonotyczne). Odnośnik literaturowy 1, dostarcza przeglądu zespołów opisanych do tej pory. W celu kontrolowania choroby stosuje się środki profilaktyczne, takie jak szczepionki. Jednakże, aktywność szczepionek, które do tej pory otrzymano i które opierają się wyłącznie naparapoxvirus ovis, jest niezadowalająca (2).

    Wynalazek dotyczy zastosowania PPV jako wektora dla obcej informacji genetycznej, która ulega ekspresji.

    Wektory oparte na wirusach ospy ptasiej, ospy szopiej, ospy koziej, ospy świńskiej albo krowianki opisano juz jako wektory do ekspresji obcej informacji genetycznej. Obserwacje dokonane w tych połączeniach nie mogą być przeniesione na PPV. Jak wykazali badacze dokonujący porównań, istnieją morfologiczne, strukturalne i genetyczne różnice pomiędzy poszczególnymi rodzajami wirusów ospy. Tak więc, można zastosować metody serologiczne do, przykładowo, różnicowania PPV od innych rodzajów wirusów ospy, fakt, który jest przypisywany różnemu wzorcowi białka i różnej informacji genetycznej, która jest z nimi związana Przykładowo, niektórzy przedstawiciele wirusów ospy mają zdolność do aglutynacji erytrocytów Aktywność ta zachodzi dzięki białku powierzchniowemu, tzw. hemaglutyninie (HA). PPV me posiadają tej aktywności.

    Wiedza o organizacji genomu PPV jest obecnie ograniczona do określenia wielkości genomu, zawartości GC w kwasie nukleinowym, porównawczych analiz enzymami restrykcyjnymi, klonowania pojedynczych fragmentów genomu i analizy sekwencji części regionów i wstępnego opisu pojedynczych genów (patrz, 1, 5, 6).

    Nie jest obecnie możliwe zastosowanie miejsc insercyjnych, które są znane w przypadku krowianki, z powodu tego ze miejsc tych nie ma albo nie wykazano ich w PPV.

    190 401

    Stąd, nie powiodły się próby identyfikacji genu kinazy tymidynowej w genomie PPV i zastosowania go jako miejsca msercyjnego, jak w przypadku ortopoxwirusów. O ile Mazur i m., (3) opisują identyfikację segmentu genomu PPV, który jak twierdzą, przypomina gen kinazy tymidynowej wirusa krowianki (ortopoxwirus), intensywne badania prowadzone przez wynalazców nie potwierdziły występowania takiego genu u PPV. Inni autorzy (1) rówmez nie byli w stanie wykryć genu kinazy tymidynowej u PPV. Gen HA stosowano jako miejsce insercyjne obcego DNA w wirusie krowianki. Jak opisano wyżej, PPV nie posiada tej aktywności.

    W 1992 r, Robinson i Lyttle wspomnieli o alternatywnych miejscach insercyjnych w genomie PPV (1), jednakże bez opisu albo precyzyjnej charakterystyki tych miejsc. Do tej pory nie ma jakiegokolwiek opisu pomyślnego zastosowania PPV jako wektorów.

    W naszych badaniach analitycznych sekwencji fragmentu HindIII I szczepu PPV Dl701, stwierdziliśmy ORF, która posiada homologię aminokwasową (36,1 do 38,3% identyczności; 52,8 do 58,6% podobieństwa, GCG, Wisconsin Package 8.1, np. Pikup Program) z czynnikiem wzrostowym śródbłonka naczyń (VEGF) różnych gatunków ssaków (np. myszy, szczura, świnki morskiej, krowy i człowieka). Identyfikator Sekw. nr 1 pokazuje sekwencję nukleotydową genu w Dl701, zaś Identyfikator Sekw. nr 15 pokazuje sekwencję aminokwasową odpowiedniego białka Dl701. Ostatnio, opisano również gen homologiczny w szczepach PPV NZ2 i NZ7 (6); jednakże nie jest znana funkcja tego genu. Nie wiadomo, czy inne wirusy ospy, np. ortopoxwirusy, posiadają odpowiadający mu gen. W dalszym tekście gen ten określany jest jako gen VEGF

    Analiza sekwencji fragmentu HindIII I Dl701 doprowadziła do identyfikacji innej ORF, która posiada homologię z genami kinazy tymidynowej ortopoxwirusów i jest znana w wirusie krowianki jako F10L. identyczność z genem krowianki FIOŁ wynosi 51%, podczas gdy podobieństwo wynosi 70%. W dalszym tekście gen ten określany jest jako gen PK. Identyfikatory Sekw. nr 2, 9 i 13 pokazują wersję sekwencji nukleotydowej genu w D1701, zaś Identyfikator Sekw. nr 14 pokazuje sekwencję aminokwasową odpowiedniego białka w D1701.

    Stwierdzono dodatkową ORF, która nakłada się końcem 3' na gen PK i końcem 5' na gen VEGF. Badania homologii wykazały, ze występuje niska identyczność (28%) i niskie podobieństwo (51%) z genem F9L krowianki. Identyfikator Sekw. nr 5 i Identyfikator Sekw. nr 10 pokazują wersje sekwencji nukleotydowej genu w Dl701. W dalszym tekście gen ten określany jest jako gen F9L.

    W regionie ITR stwierdzono kolejną ORF, którą z powodu podobieństwa do genu w PPV NZ2 (identyczność 76%, podobieństwo 83%) określono jako ORF3. Identyfikator Sekw. nr 4 pokazuje sekwencję nukleotydową genu w D1701. W dalszym tekście gen ten określany jest jako gen ORF3.