ES2287949T3

ES2287949T3 - Parapoxvirus, que contienen adn foraneo, su obtencion y su empleo en vacunas.

Info

Publication number: ES2287949T3
Application number: ES97904453T
Authority: ES
Inventors: Norbert Schmeer; Walter Strube; Mathias Buttner; Hans-Joachim Rziha
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2017-02-17
Also published as: JP2000507092A; CA2247336A1; DE59712852D1; CA2247336C; EP0886679B1; CN1217027A; AU718141B2; NZ331556A; DK0886679T3; SK120098A3; HUP9901035A2; BR9707785A; NO983946L; IL125797A0; AU1725797A; PL328870A1; NO983946D0; US6365393B1; WO1997032029A1; EP0886679A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE VIRUS DEL TIPO PARAPOX OBTENIDOS POR RECOMBINACION, QUE LLEVAN EN SU GENOMA DELECIONES O INSERCIONES EN FORMA DE INFORMACION HEREDITARIA EXTRAÑA Y CONTIENEN OTRAS INFORMACIONES HEREDITARIAS, LA PREPARACION DE TALES ESTRUCTURAS ASI COMO SU UTILIZACION EN VACUNAS.

Description

Parapoxvirus, que contienen ADN foráneo, su obtención y su empleo en vacunas.

El objeto de la presente invención son parapoxvirus recombinantes, su obtención, vacunas e inmunomoduladores, que los contienen.

Los parapoxvirus, genéticamente modificados según la invención, portan en su genoma deleciones y/o inserciones. La deleción de segmentos del genoma de los parapoxvirus y/o la inserción del ADN foráneo puede conducir a la reducción o bien a la pérdida (atenuación) de su patogenidad. Por medio de las inserciones se incorporan informaciones hereditarias de patógenos o substancias biológicamente activas en el genoma de los parapoxvirus. Se provoca la expresión de estas informaciones hereditarias, foráneas, como parte integrante de los parapoxvirus recombinantes, por ejemplo en cultivos celulares, en tejidos o en organismos intactos.

Los parapoxvirus recombinantes, preparados según la invención, se emplean, por ejemplo, en vacunas o en inmunomoduladores. La expresión del ADN foráneo en el genoma de los parapoxvirus provoca una reacción de defensa contra los patógenos, por ejemplo en el ser vacunado, que están representados por la información hereditaria foránea. Además, pueden estimularse las fuerzas de defensa inespecíficas del ser vacunado. (A continuación se abreviará el concepto de parapoxvirus por medio de las siglas PPV).

Los PPV propiamente dichos pueden actuar de manera inmunomoduladora puesto que no estimulan en el organismo inmunorreacciones específicas del patógeno. De este modo, se emplean con éxito preparaciones procedentes de parapoxvirus por ejemplo en la medicina veterinaria para aumentar las fuerzas de defensa generales.

Las vacunas, que actúan de manera específica al patógeno, requieren varios días hasta semanas, en función del antígeno para el establecimiento de la protección, sin embargo proporcionan una protección prolongada, que se mantiene durante meses e incluso durante años.

Las vacunas, que se preparan a base de parapoxvirus recombinantes, pueden emplearse, por lo tanto, como productos biológicos para combatir de mejor manera las enfermedades infecciosas, puesto que establecen una inmunidad específica del patógeno, que se mantiene de manera prolongada, y también inducen en el organismo una protección específica del patógeno, que se presenta muy rápidamente.

Es nueva la combinación de las propiedades inmunoestimulantes de los PPV con la expresión de antígenos foráneos, que induzcan una protección homóloga y/o heteróloga específica del patógeno. Esto permite la fabricación de productos, que induzcan una amplia protección contra las infecciones, específica del patógeno, que se establece rápidamente, así como también ofrecen una protección contra las infecciones, específica del patógeno, que se mantiene durante un tiempo prolongado.

La familia de los poxvirus en los vertebrados (Chordopoxvirinae) se subdivide en géneros individuales, independientes (Genera). La presente invención se refiere al género de los PPV, que se diferencian de los parapoxvirus restantes tanto desde el punto de vista estructural como también desde el punto de vista genético. Los PPV se subdividen en tres especies diferentes (Lit. #1):

\bullet: los parapoxvirus ovis (denominados también Ecthyma Contagiosum Virus, virus de la postulardermitis contagiosa o virus de Orf), que sirve como prototipo del género,

\bullet: los parapoxvirus bovis 1 (denominados también virus de la estomatitis papulosa bovina o Stomatitis Papulosa Virus) y

\bullet: los parapoxvirus bovis 2 (denominados también virus de la viruela de la ubre, virus de paravaccinia, virus de la pseudoviruela de la vaca o virus de los nódulos de los ordeñadores).

Igualmente, se han descrito representantes de los parapoxvirus, que han sido aislados de camellos, de ciervos mediterráneos, de rebecos, de pinípedos, de focas comunes y de leones marinos. Hasta ahora no se ha explicado definitivamente si se trata, en este caso, de especies individuales dentro del género de los parapoxvirus o de aislados de las especies anteriormente descritas.

Las infecciones con los PPV pueden provocar enfermedades locales en los animales y en los seres humanos (patógeno de zoonosis). La bibliografía Lit. #1 proporciona una recopilación sobre los cuadros patológicos descritos hasta el presente. Es posible la lucha contra las enfermedades por medio del empleo de medidas profilácticas, tales como, por ejemplo, las vacunas. Las vacunas, obtenibles hasta el presente, que han sido desarrolladas, exclusivamente, a base de parapoxvirus ovis presentan, desde luego, una actividad insatisfactoria (Lit. #2).

El objeto de la invención consiste en aprovechar al PPV como soporte (vector) de información genética foránea, que es expresado.

\newpage

Se han descrito ya vectores a base del virus de avipox, de raccoonpox, de capripox, de swinepox o de vaccinia como vectores para la expresión de información genética foránea: los conocimientos adquiridos en este caso no pueden ser trasferidos a los PPV. Tal como han mostrado ensayos comparativos, existen diferencias morfológicas, estructurales y genéticas entre los géneros individuales de los poxvirus. De este modo, pueden diferenciarse por métodos serológicos, por ejemplo, los PPV de los otros géneros de los poxvirus, lo cual se debe a cuadros proteicos diferentes y a informaciones hereditarias diferentes, relacionadas con los mismos. Algunos representantes de los poxvirus tienen, por ejemplo, la capacidad de aglutinar eritrocitos. Esta actividad se induce por medio de una proteína superficial, la denominada hemaglutinina (HA). Los PPV no tienen esta actividad.

Los conocimientos sobre la organización del genoma de los PPV están limitados, en la actualidad, a las determinaciones del tamaño del genoma, al contenido GC de los ácidos nucleicos, a los análisis comparativos del enzima de restricción, a la clonación de fragmentos individuales del genoma, a los análisis secuenciales de regiones parciales y a la descripción primaria, relacionada con los anteriores, de los genes individuales (para una recopilación véanse las bibliografías Lit. #1, Lit. #5, Lit. #6).

En la actualidad no pueden aprovecharse los puntos de inserción, conocidos en vaccinia, debido a su inexistencia, o a la falta de demostración de su existencia, en los PPV.

De este modo, no proporcionaron resultados, por ejemplo, los ensayos para identificar el gen de la timidinaquinasa en el genoma del PPV, como en el caso del aprovechamiento de los ortopoxvirus como puntos de inserción. Los autores Mazur y colaboradores (Lit. #3) describen, ciertamente, la identificación de un segmento del genoma de los PPV, que tendría similitudes con el gen de la timidinaquinasa del virus de vaccinia (un ortopoxvirus), desde luego, investigaciones propias, de gran amplitud, no pudieron demostrar la existencia de un gen de este tipo en los PPV. Tampoco otros autores (Lit. #1) pudieron encontrar un gen de timidinaquinasa en los PPV. En el caso del virus de vaccinia se utiliza el gen para HA como punto de inserción para el ADN foráneo. Los PPV no tienen esta actividad, como se ha descrito más arriba.

Los autores Robinson y Lyttle citaron en 1992 puntos de inserción alternativos sobre el genoma de los PPV (Lit. #1), sin que, sin embargo, hayan proporcionado una descripción o una caracterización exacta de estos puntos. Tampoco se ha producido hasta el presente una descripción de una aplicación, con éxito, de los PPV como vectores.

Durante la realización de investigaciones propias para el análisis secuencial del fragmento I de HindIII de la cepa D1701 de los PPV, se encontró un ORF con homología de aminoácidos (36,1 hasta 38,3% de identidad; 52,8 hasta 58,6% de similitud, GCG, Wisconsin Package 8.1, por ejemplo Programm Pikup) con respecto al factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) de diversas especies de mamíferos (por ejemplo ratón, rata, conejillo de Indias, vaca, seres humanos). La Seq. ID No: 1 muestra la secuencia de nucleótidos del gen en D1701, la Seq. ID No: 15 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente de D1701. Recientemente se ha descrito un gen homólogo también en el caso de las cepas NZ2 y NZ7 de los PPV (Lit. #6), pero cuya función no es conocida. No se conoce un gen correspondiente en otros poxvirus, por ejemplo en ortopoxvirus. En el transcurso del texto se denominará este gen como gen VEFG.

Nuestro análisis secuencial del fragmento I de HindIII de la D1701 condujo a la identificación de otro ORF, que tiene homología con los genes de la proteínaquinasa de los ortopoxvirus y que es conocido como F10L en el caso de la vaccinia. La identidad con respecto al gen F10L de vaccinia es del 51%, la similitud es del 70%. En el transcurso de la solicitud este gen se denominará gen PK. La Seq. ID No: 2, No: 9, No: 13 nuestra versiones de secuencia de nucleótidos del gen en el D1701, la Seq. ID No: 14

\hbox{muestra la secuencia de aminoácidos  de la
proteína correspondiente de D1701.}

Además, se ha encontrado un ORF, que solapa al extremo 3' del gen PK y con al extremo 5' del gen VEFG. Investigaciones de homología mostraron una baja identidad (28%) y una baja similitud (51%) con respecto al gen F9L en el caso de la vaccinia. La Seq. ID No: 5, No: 10, muestra versiones de la secuencia de nucleótidos del gen en el caso de D1701. En el transcurso del texto este gen se denominará como gen F9L.

Dentro de la región ITR se encontró otro ORF, que se denominará como ORF3 debido a su similitud con respecto un gen en el caso de los PPV NZ2 (identidad 76%, similitud 83%). La Seq. ID No: 4 muestra la secuencia de nucleótidos del gen en el caso de la D1701. En el transcurso del texto este gen se denominará como gen ORF3.

El objeto de la presente invención está constituido por:

1.: PPV preparados de manera recombinante con inserciones y/o con deleciones, que contienen un antígeno foráneo, que puede inducir una protección específica del patógeno.

2.: PPV preparados de manera recombinante con inserciones y/o deleciones, que contienen una citoquina.

3.: PPV preparados de manera recombinante según 1 o 2, que contienen inserciones y/o deleciones en segmentos del genoma, que no son necesarios para la multiplicación del virus.

4.: PPV preparados de manera recombinante según 1 o 2, que contienen inserciones y/o deleciones en segmentos del genoma, que son necesarios para la multiplicación del virus.

Las expresiones anteriormente indicadas tienen el significado siguiente:

\bullet: La atenuación

: es un procedimiento por medio del cual se ha hecho que los PPV sean menos patógenos o menos virulentos o que no sean patógenos o bien que no sean virulentos para los animales o para los seres humanos, por modificación de su genoma.

\bullet: Las deleciones

: son fragmentos del ADN que faltan en el genoma de los PPV.

\bullet: Los plásmidos de deleción

: son plásmidos que portan fragmentos del genoma de los PPV, además del ADN del plásmido, en los que se han sido retirados fragmentos.

\bullet: Los fragmentos del genoma necesarios (esenciales) para la multiplicación del virus

: son partes del genoma total de los PPV, que son imprescindibles para la multiplicación in vitro de los PPV, es decir para la formación de descendientes víricos infecciosos.

: Una perturbación de los genes, que sean esenciales para la multiplicación de los virus, conduce a una interrupción de la multiplicación del virus. Por ejemplo, si se retiran partes de uno de estos genes o si se retina el gen completo, se interrumpirá la replicación del virus en un punto determinado en el ciclo de multiplicación del virus. Las infecciones o los tratamientos con tales mutantes no conducen a una liberación de descendientes infecciosos procedentes del animal. Si se reemplazan partes de un gen esencial o el gen esencial completo por ADN foráneo o si se inserta ADN foráneo en el gen esencial, podrán construirse vacunas vectoriales, que no son capaces de multiplicarse en el ser vacunado y, por lo tanto, no pueden ser segregados como patógenos infecciosos.

\bullet: Los segmentos del genoma innecesarios (no esenciales) para la multiplicación del virus

: son partes del genoma total de los PPV, de los que puede desistirse para la multiplicación in vitro de los PPV, es decir para la formación de descendientes víricos infecciosos.

\bullet: Los elementos del ADN foráneos (ADN foráneo)

: son fragmentos del ADN, por ejemplo genes foráneos o secuencias de nucleótidos, que no estaban originalmente presentes en el PPV, empleado según la invención.

El ADN foráneo se insertará en el PPV por los motivos siguientes:

1.: para la expresión del ADN foráneo

2.: para la inactivación de funciones de los fragmentos del ADN del PPV

3.: para marcar el PPV.

En función de estos motivos se insertarán ADN foráneos diferentes. Cuando deba expresarse el ADN foráneo, según (1), el ADN foráneo insertado portará, al menos, un marco de lectura abierto, que codifique una o varias proteínas foráneas, deseadas. En caso dado, el ADN foráneo contiene, además, secuencias reguladoras propias o foráneas. La capacidad para alojar al ADN foráneo puede aumentarse por medio de la realización de deleciones en el genoma del virus. En general, la longitud está comprendida entre 1 nucleótido y 35.000, preferentemente entre 100 y aproximadamente 15.000 nucleótidos.

Como ejemplos pueden citarse, genes o partes de genes de virus tales como, por ejemplo

: virus del herpes suid 1,

: virus del herpes equino,

: virus del herpes bovino,

: virus de la glosopeda,

: virus sincitial respiratorio bovino,

: virus de parainfluenza 3 de la vaca,

: virus de la influenza,

: calicivirus

: flavivirus, por ejemplo virus bovino, virus de la diarrea o virus de la peste porcina clásica,

o de bacterias, tales como, por ejemplo

: Pasteurella spec.;

: Salmonella spec.,

: Actinobacillus spec.,

: Chlamydia spec.,

o de parásitos, tales como, por ejemplo

: Toxoplasma,

: Dirofilaria,

: Echinococcus.

Cuando deba insertarse ADN foráneo, según (2), es suficiente para la interrupción de la secuencia virus-vector-ADN, en principio, la inserción de un nucleótido foráneo adecuado. La longitud máxima del ADN foráneo, insertado para la inactivación depende de la capacidad de aceptación del virus-vector con relación al ADN foráneo. En general, la longitud del ADN foráneo está comprendida entre 1 nucleótido y 35.000 nucleótidos, preferentemente entre 100 y 15.000 nucleótidos, de forma especialmente preferente entre 3 y 100 nucleótidos.

Cuando deban insertarse secuencias del ADN, según (3), para el marcaje, su longitud dependerá de los métodos de detección para la identificación del virus marcado. En general, la longitud del ADN foráneo está comprendida entre 1 y 25.000 nucleótidos, preferentemente entre 20 nucleótidos y 15.000 nucleótidos, de forma especialmente preferente entre 5 y 100 nucleótidos.

\bullet: La genoteca

: es la totalidad de los fragmentos de un genoma contenidos en vectores capaces de multiplicarse. Ésta se obtiene por medio de fragmentación del genoma e inserción de todos los fragmentos, de algunos fragmentos individuales o de una gran parte de los fragmentos en vectores capaces de multiplicarse, tales como por ejemplo plásmidos.

\bullet: El fragmento del genoma

: es un pedazo de un genoma, que se presenta aislado o que puede estar insertado en un vector capaz de multiplicarse.

\bullet: La inactivación por inserción significa,

: que el ADN foráneo, insertado, impide la expresión o la función de la secuencia del genoma propia del PPV.

\bullet: Las inserciones

: son fragmentos del ADN, que están incorporadas adicionalmente en genoma de los PPV. La longitud de los fragmentos del ADN puede encontrarse, según el objeto de la inserción, entre 1 nucleótido y varios miles de nucleótidos (véase también la definición de "ADN foráneo").

\bullet: Los plásmidos de inserción

: son plásmidos, especialmente plásmidos bacterianos, que contienen el ADN foráneo, a ser insertado, flanqueado por secuencias del ADN del PPV.

\bullet: Los puntos de inserción

: son puntos en un genoma del virus que son adecuados para el alojamiento del ADN foráneo.

\bullet: La clonación,

: significa que se aísla y se fragmenta el ADN genómico de los PPV. Los fragmentos o una selección de los fragmentos se insertan en vectores del ADN usuales (plásmidos bacterianos o fagovectores o vectores eucariotas).

: Una selección de los métodos para la obtención y la clonación de los fragmentos del ADN está dada en la publicación Lit. #11. Los vectores del ADN con los fragmentos del ADN de los PPV sirven como insertos, por ejemplo, para la obtención de copias idénticas de fragmentos del ADN, originalmente aislados, de los PPV.

\bullet: El marcaje por inserción,

: significa que el ADN foráneo insertado posibilita la identificación ulterior del PPV modificado.

\bullet: Se entiende por ORF (marco de lectura abierto -Open Reading Frame-)

: una serie de nucleótidos en el plano del ADN, que define la secuencia de aminoácidos de una proteína potencial. Ésta está constituida por un número de tripletes de nucleótidos, determinado por el tamaño de la proteína definida por la misma, que está limitada por el lado 5' por medio de un codón de iniciación (ATG) y, por el lado 3', por un codón de terminación (TAG, TGA, TAA).

\bullet: Las secuencias reguladoras

: son secuencias del ADN que influyen sobre la expresión de los genes. Éstas se conocen por la publicación Lit. #15.

: Preferentemente debe citarse el promotor VEGF, como el que se ha descrito en el protocolo de secuencias ID No: 6.

\bullet: Los PPV recombinantes

: son PPV con inserciones y/o deleciones en su genoma. Las inserciones y las deleciones se prepararon, en este caso, según métodos de la biología molecular.

\bullet: las secuencias (ADN) repetitivas

: son secuencias de nucleótidos idénticas, que se presentan en el genoma de los PPV de manera directamente sucesiva o esparcidas sobre diversos puntos.

\bullet: El virus-vector

: es un PPV, que es adecuado para la inserción del ADN foráneo y que puede transportar hasta células infectadas o hasta organismos el ADN foráneo insertado en su genoma y que posibilita, en caso dado, la expresión del ADN foráneo.

La obtención de los PPV, según la invención, se lleva a cabo de la manera descrita a continuación:

1.: Selección de una cepa adecuada de PPV

2.: Identificación de los segmentos del genoma con puntos de inserción en el genoma del PPV

2.a: Identificación de los segmentos del genoma del PPV con puntos de inserción en genes, que no sean esenciales para la multiplicación del virus,

2.b: Identificación de los segmentos del genoma del PPV con puntos de inserción en genes, que sean esenciales para la multiplicación del virus,

2.c: Identificación de los segmentos del genoma con puntos de inserción en regiones situadas fuera de los genes en el genoma del PPV y/o en duplicaciones genéticas,

2.d: Otros métodos para la identificación de los fragmentos del genoma con puntos de inserción,

2.e: Requisitos exigidos a un punto de inserción,

2.1: Identificación de puntos de inserción,

2.1.1: Purificación del genoma del PPV,

2.1.2: Clonación de los fragmentos del genoma, establecimiento de una genoteca,

2.1.3: Secuenciación para la identificación de genes o de segmentos del genoma fuera de los genes,

2.1.4: Selección de clones con fragmentos del genoma del PPV para la elaboración ulterior,

2.2: Región ITR, gen VEGF, gen PK, gen que codifica la proteína 10kDa y la región comprendida entre el gen PK y el gen HDIR como puntos de inserción,

2.2.1: Clonación del gen VEGF,

2.2.2: Clonación del gen de la proteínaquinasa,

2.2.3: Clonación de la región génica que clona la proteína 10kDa,

2.2.4: Clonación de la región ITR (región repetitiva terminal invertida -Inverted-Terminal-Repeat-Region-) o bien del segmento del genoma que se encuentre comprendido entre el gen PKy el gen HD1R,

3.: Construcción de los plásmidos de inserción o de los plásmidos de deleción, que contengan el ADN foráneo a ser insertado,

3.1: Identificación u obtención de puntos de reconocimiento del enzima de restricción que se presenten una sola vez, es decir singulares ("puntos de únicos de restricción" -"unique restriction sites-") en los fragmentos del genoma clonados e inserción del ADN foráneo,

3.2: Deleción de secuencias del genoma en los fragmentos clonados del genoma e inserción del ADN foráneo,

3.3: Una combinación de #3.1 y #3.2,

4.: Construcción de un PPV recombinante.

1. Selección de una cepa adecuada de PPV

Básicamente son adecuadas para la realización de la presente invención todas las especies de PPV. Serán preferentes las cepas de virus, que puedan multiplicarse en un cultivo tisular hasta un título > 10^{5} PFU (unidad formadora de placa- Plaque Forming Unit-)/ml y que puedan obtenerse en estado puro a partir del medio de las células infectadas como virus infeccioso, extracelular. Preferentemente deben citarse las especies PPV ovis (virus de Orf) del género de los PPV.

Debe citarse como especialmente preferente la cepa de D1701 de PPV-ovis, depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest el 28.04.1988 en el Instituto Pasteur, C.N.C.M. bajo el número de registro CNCM I-751, así como sus variantes y mutantes.

La multiplicación del virus se lleva a cabo de manera usual en cultivos tisulares de células animales tales como células de mamíferos, por ejemplo en células de cordero, en células de vaca, preferentemente en células de vaca, tales como las células renales permanentes de vaca BK-K1-3A (o sus descendientes) o en células de mono tales como las células renales permanentes de mono MA104 o Vero (o sus descendientes).

La multiplicación se lleva a cabo en forma en sí conocida en cultivos estacionarios por rotación o sobre soportes en forma de agrupaciones celulares cerradas o en cultivos en suspensión.

Las células y las monocapas celulares, que sirven para la multiplicación del virus, se multiplican de manera usual casi hasta la confluencia o hasta la densidad celular óptima. Las células se infectan con diluciones víricas, que corresponden a una MOI (= multiplicidad de infección -multiplicity of infection-, que corresponde a las partículas víricas infecciosas por célula).

La multiplicación del virus se lleva a cabo con o sin adición de sueros animales. En el caso en que se utilice suero, éste se añadirá al medio de multiplicación a una concentración desde un 1 hasta un 30% en volumen, preferentemente desde un 1 hasta un 10% en volumen.

La infección y la multiplicación del virus se llevan a cabo a temperaturas comprendidas entre la temperatura ambiente y 40ºC, preferentemente entre 32 y 39ºC, de forma especialmente preferente a 37ºC y durante varios días, preferentemente hasta la destrucción completa de las células infectadas. Adicionalmente, en el momento de la recolección del virus, pueden liberarse el virus, todavía enlazados con las células, por vía mecánica o por medio de ultrasonidos o por medio de proteólisis enzimática suave, por ejemplo con tripsina.

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El medio de las células infectadas, que contiene el virus, puede seguir siendo elaborado ulteriormente, por ejemplo por eliminación de los detritos celulares por medio de filtración con tamaños de poros de, por ejemplo, 0,2 hasta 0,45 \mum y/o centrifugación con bajo número de revoluciones.

El filtrado o el sobrenadante de la centrifugación pueden emplearse para el enriquecimiento y la purificación del virus. Para ello se somete al filtrado o al sobrenadante a una centrifugación con elevado número de revoluciones hasta la sedimentación de las partículas víricas. En caso dado pueden efectuarse a continuación otras etapas de purificación, por ejemplo por medio de centrifugación en un gradiente de densidades.

2. Identificación de los segmentos del genoma con puntos de inserción en el genoma del PPV

Diversas regiones del genoma del PPV pueden servir como puntos de inserción para la inserción del ADN foráneo. El ADN foráneo puede insertarse,

a.: en genes, que no sean esenciales para la multiplicación del virus in vitro y/o in vivo,

b.: en genes, que sean esenciales para la multiplicación del virus y/o

c.: en regiones sin función génica.

2.a Identificación de segmentos de genoma con puntos de inserción en genes, que no sean esenciales para la multiplicación del virus, en el genoma del PPV

i.: Genes víricos, que no sean esenciales para la multiplicación del virus, se encuentran, por ejemplo, por medio de ensayos comparativos con representantes de diversas especies de los PPV. Los genes, que no estén presentes en uno o en varios aislados o cepas de una especie de PPV, pero que sean encontrados en otros aislados o cepas, son potencialmente no esenciales.

ii.: Los genes, que no sean esenciales para la multiplicación del virus, pueden identificarse también por una vía alternativa. Tras la secuenciación de los fragmentos del genoma del PPV, que pueden presentarse, por ejemplo, en forma de fragmentos clonados, se investigan estas secuencias del ADN para encontrar posibles "marcos de lectura abiertos" ("Open Reading Frames", ORF). Si se encuentra un ORF, se verificará su función como gen por medio de la demostración de la transcripción y/o de la traducción. Para verificar si el gen encontrado no es esencial para la multiplicación del virus, se retirará el gen del genoma del PPV con ayuda de los métodos de genética molecular, se destruirá parcialmente o se interrumpirá por medio de una o varias mutaciones introducidas y se ensayará el virus resultante con relación a su capacidad de multiplicación. Si el virus puede replicarse, sin la existencia del gen manipulado, se trata en este caso de un gen no esencial.

Ejemplos de puntos de inserción identificados

i.: Como ejemplo de un gen no esencial de PPV se citará aquí el gen VEGF del PPV ovis, que sirve como punto de inserción para el ADN foráneo. Este gen está presente en las cepas ensayadas de parapoxvirus ovis (NZ-2, NZ-7 y D1701 (Lit. #6)). En algunas cepas de PPV, por ejemplo el representante de PPV bovis 1, no se ha detectado este gen VEGF. La identificación de la región con el gen VEGF en el genoma del PPV puede llevase a cabo con ayuda de la secuencia del ADN, mostrada en el protocolo de secuencias ID No: 1. Con ayuda de los métodos usuales en la biología molecular, puede ser encontrado el gen en el genoma de un PPV por medio de experimentos de hibridación, de análisis secuencial del genoma y/o por medio de reacciones en cadena de la polimerasa.

ii.: Puede citarse, como otro ejemplo de un gen potencialmente no esencial de PPV, el gen de la proteína 10kDa de PPV. Este gen está presente en cepas de parapoxvirus ovis (NZ-2, NZ-7 y D1701). La identificación de la región con el gen para la proteína 10kDa sobre el genoma del PPV puede encontrarse sobre el genoma de un PPV con métodos usuales de la biología molecular tal como por ejemplo con ayuda de las reacciones en cadena de la polimerasa (RCP). La publicación Lit. #8 muestra la secuencia del ADN del gen de la proteína 10 kDa. Los cebadores, empleables para una RCP, han sido citados, por ejemplo, en la publicación Lit. #8. El protocolo de secuencias ID No: 11 muestra la secuencia del ADN del producto de la RCP específico 10 kDa de D1701.

Para la inserción del ADN foráneo puede retirarse, en partes o por completo, el gen no esencial del genoma del PPV. Sin embargo, es posible también insertar ADN foráneo en el gen no esencial sin que se retiren regiones del gen de PPV. Como puntos de inserción pueden servir, por ejemplo, puntos de reconocimiento del enzima de restricción.

2.b Identificación de fragmentos del genoma del PPV con puntos de inserción en genes, que son esenciales, en el genoma del PPV

i.: La identificación de los genes esenciales puede verificarse por medio de secuenciación de fragmentos víricos del genoma que estén presentes, por ejemplo, como fragmentos clonados y por medio de la identificación de los posibles ORF.

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: Si se encuentra un ORF, se verificará su función como gen por medio de la demostración de la transcripción y/o de la traducción. Para verificar si el gen encontrado es esencial para la multiplicación del virus, se destruirá el gen con ayuda de métodos de genética molecular en el genoma del PPV, por ejemplo por medio de retirada de partes del gen o de todo el gen o por medio de inserción del ADN foráneo, y el virus resultante se investigará con relación a su capacidad de multiplicación. Si el mutante del virus obtenido no puede multiplicarse, se tratará en este caso, con gran probabilidad, de un gen esencial.

El crecimiento exclusivo del mutante del virus en líneas celulares complementarias es probatorio.

Ejemplos de puntos de inserción

Como ejemplo debe citarse el gen de la proteínaquinasa (gen PK) de la D1701 del PPV. El gen PK se expresará ulteriormente en el ciclo de multiplicación del virus. La identificación del gen PK en el genoma del PPV puede llevarse a cabo con ayuda de las versiones de la secuencia del ADN mostradas en el protocolo de secuencias ID No: 2, No: 9 o No: 13. La región con el gen puede encontrarse en el genoma de un PPV con ayuda de los métodos usuales de la biología molecular, por ejemplo por medio de experimentos de hibridación, análisis secuencial del genoma y/o reacciones en cadena de la polimerasa.

Para la inserción del ADN foráneo puede retirarse el gen esencial del genoma del PPV, en partes o por completo. Sin embargo, es posible también insertar ADN foráneo en el gen esencial sin que se retiren regiones del gen PPV.

2.c Identificación de segmentos del genoma con puntos de inserción en regiones situadas fuera de genes en el genoma del PPV y/o en duplicaciones génicas

En principio son adecuados como puntos de inserción para el ADN foráneo los fragmentos del genoma, que no codifiquen productos génicos funcionales y que no tengan funciones reguladoras esenciales (los fragmentos denominados intergénicos). Son especialmente adecuadas las regiones con secuencias repetitivas puesto que las modificaciones en fragmentos pueden ser compensadas por medio de repeticiones secuenciales remanentes. Entre éstos se encuentran también aquellos genes, que están presentes en dos o varias copias, denominados duplicaciones génicas.

En el genoma del virus existen, en dos copias, los genes en la región ITR o en segmentos duplicados del genoma del PPV. Tras la retirada o la modificación de una copia de un gen de este tipo e inserción del ADN foráneo, pueden obtenerse PPV recombinantes estables, incluso en el caso en que el gen modificado fuese importante para la multiplicación del virus. Una segunda copia del gen, no modificada, podría ser suficiente para la función
génica.

i.: La identificación de la secuencia del genoma, que no codifica los productos génicos, se lleva a cabo por medio de análisis secuencial del genoma de los PPV. Las regiones del genoma, que no presenten un ORF, por análisis secuencial, ni una transcripción específica del virus y que no presenten ninguna función reguladora, representan puntos potenciales de inserción. Especialmente los puntos de corte para los enzimas de restricción en estas regiones representan puntos de inserción potenciales. Para verificar si está presente un punto de inserción adecuado, se insertará ADN foráneo, con ayuda de métodos conocidos de la biología molecular, en el punto de inserción potencial y se investigará el mutante del virus resultante con relación a sus posibilidades de supervivencia. Cuando el mutante del virus, que porta ADN foráneo en el posible punto de inserción, sea capaz de multiplicarse, el punto ensayado será un punto de inserción adecuado.

ii.: La identificación de secuencias representativas así como las duplicaciones génicas se llevan a cabo, por ejemplo, por medio de experimentos de hibridación del ADN y/o por medio de análisis secuencial. En los experimentos de hibridación se emplearán como sondas fragmentos del genoma clonados o aislados de un PPV para la hibridación con fragmentos del ADN de PPV. Los fragmentos del genoma del PPV, que se hibriden con más de un fragmento del genoma completo del PPV, contendrán una o varias secuencias repetitivas. Para localizar exactamente la secuencia repetitiva o las regiones del genoma duplicadas en el fragmento del genoma, se determinará la secuencia de nucleótidos. Para determinar si un punto potencial de inserción es un punto de inserción adecuado en el genoma completo del PPV, debe insertarse ADN foráneo en una secuencia repetitiva o en una copia de la duplicación génica y debe incorporarse en el genoma vírico el fragmento del genoma del PPV con el inserto. A continuación se ensayará el virus recombinante, que contiene el ADN foráneo, con respecto a su capacidad de multiplicación. Si el virus recombinante se multiplica, el punto de reconocimiento identificado es adecuado como punto de inserción.

Ejemplos de puntos de inserción

i.: Como ejemplos de regiones intergénicas deben citarse el fragmento del genoma, comprendido entre el gen de la proteínaquinasa y el gen HDIR (protocolo de secuencias ID No: 7).

ii.: Como ejemplo de una secuencia repetitiva debe citará la región ITR (protocolo de secuencias ID No: 4).

iii.: Como ejemplo de una duplicación génica en la cepa D1701 del PPV debe citarse el gen potencial "ORF 3" (en la región ITR) así como el gen VEGF. Se ha demostrado, por medio de estudios por hibridación, que se duplico, en la cepa D1701 presente, una región, que contiene el gen VEGF y que se desplazó hasta el otro extremo del genoma del virus de tal manera, que están presentes dos copias génicas de VEGF.

: Por medio de las secuencias en el protocolo de secuencias ID No: 4 (secuencia ITR con el gen "ORF3") e ID No: 7 (región comprendida entre el gen PK y el gen HDIR) pueden encontrarse las regiones correspondientes del genoma en otros PPV con métodos usuales de la biología molecular, por ejemplo por medio de experimentos de hibridación, análisis secuencial del genoma y/o reacciones en cadena de la polimerasa.

2.d Otros métodos para la identificación de los puntos de inserción

En general se encontrarán posibles puntos de inserción en el genoma de los PPV también por medio de modificaciones de las secuencias víricas del genoma. Los puntos del genoma, en los cuales los intercambios de nucleótidos, las deleciones y/o las inserciones o las combinaciones de estos métodos, no bloqueen la multiplicación del virus, representan posibles puntos de inserción. Para verificar si un punto de inserción potencial representa un punto de inserción adecuado, se insertará ADN foráneo en el punto de inserción potencial con ayuda de métodos conocidos de la biología molecular y se ensayarán los mutantes del virus resultantes en cuanto a su posibilidad de supervivencia. Cuando el recombinante del virus sea capaz de multiplicarse, el punto ensayado será un punto de inserción adecuado.

2.1 Identificación de los puntos de inserción 2.1.1 Purificación del genoma del PPV

Para la clonación por medio de genética molecular de puntos de inserción de PPV se purifica, en primer lugar, el genoma de los PPV. A partir del virus preparado según 1 (precedente) se aísla y se purifica el genoma. La extracción del ADN vírico nativo se lleva a cabo, preferentemente, por medio del tratamiento de los viriones purificados con soluciones acuosas de detergentes y con proteasas.

Como detergentes pueden citarse los detergentes aniónicos, catiónicos, anfóteros, no iónicos. Preferentemente, se emplearán detergentes iónicos. Serán especialmente preferentes el dodecilsulfato de sodio, el laurilsulfato de sodio.

Como proteasas pueden citarse todas las proteasas, que trabajen en presencia de detergentes, tales como, por ejemplo, la proteinasa K y la pronasa. Preferentemente debe citarse la proteinasa K.

Los detergentes se emplearán en concentraciones desde 0,1 hasta 10% en volumen, siendo preferentes concentraciones desde 0,5 hasta 3% en volumen.

Las proteasas se emplean en concentraciones desde 0,01 hasta 10 mg/ml de lisado del virus, siendo preferentes concentraciones desde 0,05 hasta 0,5 mg/ml de lisado del virus.

Preferentemente, se trabajará en una solución acuosa tamponada en presencia de inhibidores de la DNasa. Como substancias de tampón deben citarse: las sales de los ácidos débiles con bases fuertes tales como, por ejemplo, el tris(hidroximetilaminometano), las sales de los ácidos fuertes con bases débiles, tales como, por ejemplo, los fosfatos primarios o mezclas de los mismos.

Preferentemente debe citarse el siguiente sistema tampón: tris(hidroximetolaminometano).

Las substancias de tampón o los sistemas de tampón se emplearán en aquellas concentraciones que garanticen valores del pH, a los cuales no se desnaturalice el ADN. Los valores preferentes del pH están comprendidos entre 5 y 9, de forma especialmente preferente entre 6 y 8,5, de forma muy especialmente preferente entre 7 y 8, en particular debe citarse el trabajo en el intervalo neutro.

Los inhibidores de la DNasa son, por ejemplo, el ácido etilendiaminotetraacético en concentraciones desde 0,1 hasta 10 mM (milimoles), siendo preferente una concentración de 1 mM aproximadamente.

A continuación se extraen los componentes lipófilos del lisado del virus. Como agentes para la extracción sirven disolventes tales como el fenol, el cloroformo, el alcohol isoamílico o sus mezclas. Preferentemente, se empleará, en primer lugar, una mezcla formada por fenol y por cloroformo/alcohol isoamílico, llevándose a cabo la extracción en una o varias etapas.

Otros métodos para el aislamiento del ADN del virus son, por ejemplo, la centrifugación de un lisado del virus con un gradiente de densidades de CsCI o en la electrofóresis de gel (véase la publicación Lit. #14).

La extracción de los ácidos nucleicos se describe en la publicación Lit. #13.

El ADN, extraído de este modo, se precipita preferentemente a partir de la solución acuosa, por ejemplo, con alcohol, preferentemente con etanol o con isopropanol y con adición de sales monovalentes tales como los cloruros o los acetatos alcalinos, preferentemente el cloruro de litio, el cloruro de sodio o el acetato de sodio, el acetato de potasio (véase loc cit.).

2.1.2 Clonación de los fragmentos del genoma

El ADN vírico, purificado de este modo, sirve ahora para la obtención de fragmentos del ADN. Para ello se tratará, por ejemplo, con enzimas de restricción. Los enzimas de restricción adecuados son, por ejemplo, Eco RI, BamH1 HindIII, Kpnl. Alternativamente, pueden sintetizarse fragmentos del genoma por medio de reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Para ello se seleccionarán cebadores procedentes de fragmentos, ya conocidos, de la secuencia del genoma del virus y se sintetizarán in vitro, por ejemplo, por medio de la polimerasa Taq o bien de la polimerasa Pfu del fragmento del genoma limitado por el par de cebadores.

Estos fragmentos del ADN, resultantes de la digestión de restricción o bien de la RCP, pueden clonarse en sistemas vectoriales, según los métodos descritos en (Sambrock 89). Para ello se ofrecen, por ejemplo, en función del tamaño del respectivo fragmento del ADN, a ser clonado, vectores de plásmidos, vectores de fagos lambda o bien vectores cósmidos.

2.1.3 Secuenciación, identificación y caracterización de genes. Verificación de su expresión

En primer lugar se analizarán por medio de secuenciación los fragmentos del genoma clonados en vectores. Los fragmentos del ADN insertados se mapean por medio de diversos enzimas de restricción y se clonan subfragmentos adecuados en vectores de plásmidos. La reacción de secuenciación se lleva a cabo, por ejemplo, por medio del empleo del estuche de secuenciación T7 de la firma Pharmacia de acuerdo con las indicaciones del fabricante. El ADN plásmido, de cadena doble, necesario para ello, se prepara, preferentemente, según el método PEG (Hattori y Sakaki 1985). Los "marcos de lectura abiertos (ORF)" existentes en los fragmentos del genoma se identifican por medio de análisis por ordenador (CGC, véase más adelante). Pueden obtenerse conocimientos sobre la función correspondiente de los ORF identificados por medio de comparación de su secuencia con otras secuencias génicas con función conocida, existentes en un banco de datos. Los ORF identificados se caracterizan funcionalmente por medio de la detección de sus respectivos transcritos correspondientes en células infectadas con el virus. Para ello se aísla el ARN completo de células infectadas con el virus, por ejemplo, con ayuda del método AGPC (Chomczynski y Sacchi, (20) 1987). Los transcritos específicos junto con sus extremos 5' y 3' pueden identificarse por medio de análisis con transferencias de Northern o bien extensión del cebador y ensayos de protección del ARN. Alternativamente, existe la posibilidad de expresar in vitro la proteína vírica codificada por medio de un ORF identificado, la posibilidad de obtener antisueros por medio del producto de expresión y de demostrar la expresión del
ORF.

Para determinar si el gen encontrado no es esencial para la multiplicación del virus, puede destruirse el gen por medio de disrupción génica o bien deleción génica. En este caso se retira del genoma del PPV bien el gen completo o bien partes del mismo o se interrumpe el marco de lectura del gen por medio de la inserción de secuencias génicas foráneas. El virus resultante se ensaya con relación a su capacidad de multiplicación. Si el virus puede replicarse, incluso sin la existencia del gen destruido, se tratará en este caso de un gen no esencial.

2.1.4 Selección de clones con fragmentos del genoma del PPV

Los clones a ser empleados, entre los obtenidos anteriormente, con fragmentos del genoma del PPV dependerá de que los PPV recombinantes a ser preparados (i) sean capaces de replicarse o (ii) de que sean defectuosos para la replicación.

i.: Cuando deban prepararse PPV recombinantes, que sean capaces de replicarse, a pesar de la inserción y/o de la deleción, se elaborarán ulteriormente fragmentos víricos clonados del genoma, que contengan genes o regiones del genoma fuera de los genes, que no sean esenciales para la multiplicación del virus o que contengan duplicaciones genéticas.

: La verificación de que el presente gen o la región del genoma estén constituidos por una región no esencial del genoma del virus o por una duplicación génica, se determinará por medio de mutantes del virus. Para ello se inactivará el gen ensayado o bien la región del genoma ensayada en el PPV, por medio de los métodos de la biología molecular, por ejemplo por medio de la deleción parcial o completa de la región en cuestión, y se ensayará la capacidad de multiplicación del mutante del virus. Si el mutante del virus puede multiplicarse, a pesar de la inactivación del gen en cuestión o de la región del genoma en cuestión, el gen o la región del genoma que han sido ensayados serán una región no esencial.

: Serán preferentes los fragmentos del genoma clonados del PPV, que contengan a los genes no esenciales completos. Además, deberían estar contenidas, igualmente, las regiones víricas del genoma que flanquean, en ambos extremos, al gen o de la región del genoma. La longitud de las regiones flanqueantes debería ser mayor que 100 pares de bases. Cuando no estén presentes tales clones del genoma, podrán prepararse a partir de clones existentes del genoma, con ayuda de los métodos de la biología molecular. Cuando los fragmentos del genoma clonados contengan, adicionalmente, regiones del genoma, que no sean necesarias para la presente obtención, éstas podrán ser retiradas por medio de subclonaciones.

ii.: Cuando deban prepararse PPV recombinantes, que hayan perdido la capacidad para formar descendientes infecciosos, debido a la inserción o a la deleción, se seguirán elaborando los fragmentos víricos del genoma clonados, que contengan genes o regiones del genoma fuera de los genes, que sean esenciales para la multiplicación del virus.

: La verificación de que el presente gen o que la presente región del genoma están constituidos por una región esencial del genoma del virus, puede determinarse por medio de mutantes del virus. Para ello se inactivará el gen ensayado, o bien la región del genoma ensayada, en el PPV con ayuda de los métodos de la biología molecular, por ejemplo por medio de deleción parcial o completa de la región en cuestión, y se ensayará la capacidad de multiplicación del mutante del virus. Cuando el mutante del virus ya no pueda multiplicarse, debido a la inactivación del gen, o de la región del genoma, en cuestión, el gen o la región del genoma, ensayados, estarán constituidos por una región esencial.

: Serán preferentes los fragmentos clonados del genoma del PPV, que contengan la totalidad de los genes esenciales. Además, deberían estar contenidas, igualmente, en ambos extremos del gen o de la región del genoma las regiones víricas flanqueantes del genoma. La longitud de las regiones flanqueantes debería ser mayor que 100 pares de bases. Cuando no estén presentes tales clones del genoma, éstas podrán prepararse a partir de clones del genoma, existentes, con métodos de la biología molecular. Cuando los fragmentos clonados del genoma contengan, adicionalmente, regiones del genoma, que no sean necesarias para la presente obtención, podrán retirarse éstas por medio de subclonaciones.

2.2 Región ITR, gen VEGF, gen PK, gen que codifica la proteína 10kDa y la región comprendida entre el gen PK y el gen HD1R como puntos de inserción

Cuando deban utilizarse como puntos de inserción en un PPV la región ITR, el gen VEGF, el gen PK, el gen que codifica la proteína 10kDa o la región intergénica, comprendida entre el gen PK y el gen HD1R, tendrán que aislarse las regiones correspondientes del genoma del PPV, que contengan los puntos de inserción. Para ello se clonarán las regiones correspondientes del genoma del PPV.

2.2.1 Clonación del gen VEGF

El gen, que codifica VEGF, se localiza en el genoma del PPV y, a continuación, se aísla en partes o en su totalidad con sus fragmentos flanqueantes del genoma. Para ello se multiplicará preferentemente el PPV según #1 y se purificará el genoma según #2.1.1.

a.: El gen VEGF se amplifica, por ejemplo, por medio de una reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Las secuencias de iniciación, necesarias para esta reacción (cebadores) se derivan a partir de la secuencia del ADN del gen VEGF, representada en el protocolo de secuencias ID No: 1. El amplificado obtenido se clonará, preferentemente, a continuación.

b.: Preferentemente, se obtendrá la región, que contiene el gen VEGF y sus segmentos flanqueantes del genoma, por medio de la fragmentación del genoma del PPV y aislamiento así como por medio de la clonación del o de los correspondientes fragmentos del genoma. Para ello se troceará el genoma purificado del virus, como se ha descrito en #2.1.2, preferentemente con el enzima de restricción HindIII. Para la identificación del o de los segmentos del genoma, que porta o que portan el gen VEGF y sus segmentos flanqueantes del genoma, se separarán, preferentemente, los fragmentos del genoma, obtenidos tras la digestión enzimática, con ayuda de procedimientos electroforéticos o cromatográficos.

: Las separaciones por electrofóresis en agarosa o bien en poliacrilamida se llevarán a cabo según los métodos usuales, que han sido descritos en las publicaciones

-: Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, Verlag Wiley-Interscience, 1987

-: A Practical Guide to Molecular Cloning, Perbal, 2^{nd} edition, Verlag Wiley Interscience, 1988

-: Molecular Cloning, loc. cit.

-: Virologische Arbeitsmethoden, tomo III, Gustav Fischer Verlag, 1989.

La identificación de los fragmentos del genoma, que portan el gen VEGF y sus secuencias flanqueantes, se lleva a cabo, por ejemplo, por medio de hibridación con sondas definidas de ácidos nucleicos. En este caso, se transfieren los fragmentos del genoma, retirados, sobre filtros y se hibridan con sondas de ácidos nucleicos específicas del VEGF y marcadas, según el método de la transferencia de Southern. El método para la transferencia de los fragmentos del genoma, y para la hibridación, pueden llevarse a cabo según protocolos usuales, como los que han sido descritos en el apartado "Southern Blotting" en la publicación Molecular Cloning loc.cit. Los oligonucleótidos o los fragmentos de ácidos nucleicos, empleables como sondas, pueden deducirse del protocolo de secuencias Seq ID No: 1. A modo de ejemplo, se empleará como sonda para la hibridación el subfragmento TaqI (366 bp), que puede ser identificado por medio de la Seq ID No: 1.

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Los fragmentos el genoma, que contengan partes o preferentemente, todo el gen VEGA, de manera demostrable, y los segmentos flanqueantes del genoma, se aislarán y se clonarán. El aislamiento por medio de electrofóresis del o de los fragmentos correspondientes del genoma se llevará a cabo, por ejemplo, por medio de electroelución o por medio del procedimiento de la "agarosa de bajo punto de fusión -Low-Melting-Agarose-" - a partir de la correspondiente región del gel.

Para la clonación del gen VEGF se insertarán los fragmentos del genoma, anteriormente preparados, en vectores bacterianos o eucariotas. En primer lugar serán especialmente preferentes los vectores bacterianos de plásmidos o de fagos. Para la inserción del fragmento del genoma se tratarán con enzimas de restricción las moléculas bicatenarias del ADN del vector de plásmidos o de fagos de tal manera, que se formen los extremos adecuados para la inserción.

Como plásmidos sirven los plásmidos conocidos, tales como por ejemplo el pBR322 y sus descendientes, por ejemplo pSPT18/19, pAT153, pACYC184, pUC18/19, pSP64/65.

Como vectores de fagos sirven por ejemplo las variantes conocidas del fago lambda tal como por ejemplo ZAP, gt 10/11 o los fagos M13mp18/19.

Los enzimas de restricción empleables son conocidos, por ejemplo, por la publicación Gene tomo 92 (1989) Elsevier Science Publishers BV Amsterdam.

El plásmido o el vector de fagos, tratados con el enzima de restricción, se mezclarán con un exceso del fragmento del ADN a ser insertado, por ejemplo en la relación de 5:1 aproximadamente y se ensamblarán en el vector por medio de ligasas del ADN. El ensamblaje se insertará en células procariotas o eucariotas, preferentemente en bacterias (por ejemplo Escherichia coli cepa K-12 y sus derivados), para la multiplicación de los plásmidos o de los fagos, y éstas se multiplican.

La transformación y la selección de las bacterias se lleva a cabo como se ha descrito en la publicación Molecular Cloning loc. sit..

La identidad del ADN foráneo se verificará, preferentemente, por medio de experimentos de hibridación y, de forma especialmente preferente, por medio del análisis secuencial. En caso se llevarán a cabo subclonaciones.

2.2.2 Clonación del gen de la proteínaquinasa

Se localiza el gen, que codifica la proteínaquinasa, en el genoma del PPV y, a continuación, se aísla en partes o completamente con sus segmentos flanqueantes del genoma.

Esta región puede obtenerse, tal como se ha descrito para la clonación del gen VEGF, por medio de la fragmentación del genoma del PPV (con relación a los puntos de corte véase la figura 1), preferentemente con clonación subsiguiente de los fragmentos, y selección de los fragmentos o bien clones, que contengan partes del gen PK o, preferentemente, que contengan todo el gen PK con las secuencias flanqueantes del ADN del genoma del PPV. Las moléculas del ADN, que pueden ser empleadas como cebadoras para una RCP o como sondas para la hibridación, pueden deducirse de la secuencia del protocolo ID No: 2 o bien ID No: 9.

En caso dado se llevarán a cabo subclonaciones.

2.2.3 Clonación del gen, que codifica la proteína 10kDa

El gen, que codifica la proteína 10kDa, se localiza en el genoma del PPV, según el procedimiento que ha sido descrito (anteriormente) de manera detallada para el gen VEGF y para el gen PK y se aislará en partes o, preferentemente, en su totalidad con sus secuencias flanqueantes del genoma del PPV.

En este caso se obtendrá la región del genoma del PPV, que contiene el gen para la proteína 10kDa o partes del mismo, preferentemente por medio de RCP y/o por clonación e identificación y selección de los clones adecuados.

Las moléculas del ADN, que pueden ser empleadas como cebadores de una RCP o como sondas para una hibridación, pueden verse en la publicación Lit. #8. En caso dado se llevarán a cabo subclonaciones.

2.2.4 Clonación de la región repetitiva terminal invertida (Inverted-Terminal-Repeat) o bien del fragmento del genoma, que se encuentra comprendido entre el gen PK y el gen HD1R

La forma de proceder corresponde a la clonación detalladamente descrita del gen VEGF (más arriba). Las moléculas del ADN, que pueden ser empleadas como cebadores de una RCP, para el aislamiento de las regiones correspondientes, o como sondas para una hibridación, pueden verse en el protocolo de secuencias ID No: 4 (región ITR) y No: 7 (región comprendida entre el gen PK y el gen HDIR.

3. Construcción de plásmidos de inserción o de plásmidos de deleción

Los plásmidos, denominados de inserción, que pueden ser aprovechados para la inserción del ADN foráneo en el genoma de los PPV, se preparan a base de los fragmentos del genoma del PPV identificados, localizados y clonados según el párrafo 2,. Los plásmidos de inserción portan el ADN foráneo, a ser insertado en el PPV, flanqueado por los fragmentos del genoma del PPV. Existen diversas posibilidades para la preparación de los plásmidos de inserción: Como ejemplos pueden citarse en este caso

3.1 Identificación u obtención de puntos singulares para el reconocimiento del enzima de restricción ("unique restriction sites") en los fragmentos del genoma clonados, obtenidos según 2.1.4 o 2.2 e inserción del ADN foráneo

Los puntos de corte por restricción que se presentan una sola vez, es decir singulares, pueden identificarse, por ejemplo (véase 2.1.3) por medio de las secuencias de nucleótidos del PPV, determinadas.

En éstos pueden incorporarse los oligonucleótidos, preparados por síntesis, que porten nuevos puntos de corte singulares para el enzima de restricción.

Los plásmidos obtenidos se multiplican y se seleccionan como se ha descrito precedentemente.

Alternativamente, pueden incorporarse nuevos puntos singulares de reconocimiento del enzima de restricción en los fragmentos del genoma del PPV por medio de "RCP", como se ha descrito por Jacobs et al. (Lit. #12).

Los puntos singulares de reconocimiento del enzima de restricción, identificados y/o preparados, sirven para la inserción del ADN foráneo en el genoma del PPV.

La inserción del ADN foráneo se lleva a cabo según los métodos usuales.

3.2 Deleción de secuencias del genoma en los fragmentos clonados del genoma e inserción del ADN foráneo

La deleción de subfragmentos, a partir de los fragmentos clonados del genoma del PPV, puede llevarse a cabo, por ejemplo, por medio del tratamiento con enzimas de restricción que tengan preferentemente más de un punto de reconocimiento, de forma especialmente preferente que tengan 2 puntos de reconocimiento. Tras el tratamiento enzimático se separan los fragmentos obtenidos, como se ha descrito precedentemente, por ejemplo, por electrofóresis, se aíslan y se vuelven a reunir los fragmentos correspondientes por medio de tratamiento con ligasa. Los plásmidos obtenidos se multiplican y se seleccionan los plásmidos que han sufrido la deleción.

Alternativamente, se aprovechará un punto singular de reconocimiento de los enzimas de restricción sobre el fragmento del genoma del PPV como punto de iniciación para una degradación en ambos sentidos de los fragmentos con una endonucleasa, por ejemplo con el enzima Bal31. El tamaño de la deleción puede determinarse por medio de la duración de la acción del enzima y puede verificarse por medio de la electrofóresis de gel. Sobre los nuevos extremos del fragmento, formados, se acoplarán oligonucleótidos sintéticos, como se ha descrito en 3.1 (véase más
arriba).

La transferencia del gen foráneo hasta el genoma del PPV se consigue únicamente en un bajo porcentaje de toda la población de PPV.

Por lo tanto, se requieren sistemas de selección para la separación del PPV recombinante y del PPV natural (Lit. #Moss).

Preferentemente, se empleará el sistema de selección gpt, que está basado en el gen guanil-fosforibosil-transferasa de E. coli. Cuando se expresa este gen en una célula eucariótica, induce resistencia contra el ácido micofenólico, que es un inhibidor del metabolismo de la purina. Se ha descrito se empleo, en múltiples ocasiones (véanse las publicaciones Lit. #16/#17), para la construcción de virus-vector recombinantes.

4. Construcción de un PPV recombinante según 1 hasta 12

La inserción del ADN foráneo en el genoma del PPV se lleva a cabo por medio de:

a.: transfección simultánea del ADN del plásmido de inserción o del plásmido de deleción e infección con el PPV en células huésped adecuadas,

b.: transfección del ADN del plásmido de inserción o del plásmido de deleción y subsiguiente infección con el PPV en células huésped adecuadas,

c.: infección con el PPV y, a continuación, transfección con el ADN del plásmido de inserción o del plásmido de deleción en células huésped adecuadas.

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Los métodos para los procedimientos, adecuados a este respecto, son conocidos. La transfección puede llevarse a cabo con ayuda de los métodos conocidos tales como, por ejemplo, la técnica del fosfato de calcio, la transfección inducida por liposomas o la electroporación (véase la publicación Lit. #18).

1. Infección con PPV

: Para la obtención de los PPV con el ADN foráneo serán preferentes cultivos de células, que permitan una buena multiplicación del virus y una transfección eficiente, por ejemplo la célula permanente de riñón de vaca BK-K1-3A.

2. Obtención del ADN del plásmido de inserción o del plásmido de deleción

: Las células transformadas, obtenidas según los procedimientos anteriormente descritos, por ejemplo las bacterias, que contienen el plásmido de inserción o el plásmido de deleción, se multiplican y los plásmidos se aíslan a partir de las células, en forma en sí conocida y se purifican adicionalmente. La purificación se lleva a cabo, por ejemplo, por medio de centrifugación de equilibrio en el gradiente de densidades, por ejemplo, de CsCl. o por medio de una purificación por afinidad sobre partículas de silicato obtenibles en el comercio.

3. Transfección

: Para la transfección se empleará preferentemente ADN plásmido purificado, circular o linealizado. La purificación se lleva a cabo, por ejemplo, como se ha indicado en el párrafo 2 (véase más arriba).

4. Cultivo de células transfectadas e infectadas

: Las células se cultivan según los métodos anteriormente descritos. Cuando aparezca un efecto citopatógeno se retirará el medio de cultivo, en caso dado se liberará de los detritos celulares por medio de centrifugación o filtración y, en caso dado, se almacenará así como se elaborará según los métodos tradicionales para la purificación de virus en placas aisladas.

Para la obtención del PPV recombinante se empleará el procedimiento siguiente:

Células BK-KL-3A, desarrolladas por confluencia, se infectan con una dosis infecciosa comprendida entre 0,001 y 5, preferentemente de 0,1 MOI (multiplicidad de la infección -multiplicity of infection-). Dos horas más tarde se somete a una transfección a las células infectadas, por ejemplo con ADN (2-10 \mug) del plásmido pMT-10 bien según el método del choque con CaPO_{4}-glicerol o bien por medio del empleo de un estuche de transfección, según las indicaciones del fabricante (DOSPER, Boehringer-Manaheim). A continuación se incuban los cultivos celulares con medio durante tres hasta seis días a 37ºC, con atmósfera de CO_{2} al 5%, hasta

\hbox{cpe
o hasta que sea visible la formación de placas.}

La identificación de los PPV recombinantes se lleva a cabo en función de los ADN foráneos insertados, por ejemplo por medio de:

a.: la detección del ADN foráneo, por ejemplo por medio de hibridación ADN/ADN

b.: la amplificación del ADN foráneo por medio de RCP

c.: la expresión del ADN foráneo con ayuda de virus recombinantes.

Con respecto al punto a

Para ello se obtendrá el ADN del virus en cuestión y se hibridará con un ácido nucleico que sea idéntico, al menos en parte, al ADN foráneo insertado.

Los PPV purificados en placas aisladas e identificados como recombinantes, se ensayan de nuevo, preferentemente, con relación a la presencia y/o a la expresión del ADN foráneo. Los PPV recombinantes, que contengan y/o que expresen de manera estable el ADN foráneo, estarán disponibles para la aplicación ulterior.

Con respecto al punto c

La expresión del ADN foráneo, en el plano proteínico, puede demostrarse por ejemplo por medio de la infección de células con el virus y subsiguiente análisis por inmunofluorescencia con anticuerpos específicos frente a la proteína codificada por el ADN foráneo o por medio de inmunoprecipitación o transferencia de Western con anticuerpos frente a la proteína, que codifica el ADN foráneo, a partir de lisados de las células infectadas.

La expresión del ADN foráneo, en el plano del ARN, puede llevarse a cabo por medio de detección de los transcritos específicos. Para ello se aislará ARN a partir de células infectadas con virus y se someterá a una hibridación con una sonda del ADN, que sea idéntica, al menos en parte, al ADN foráneo insertado.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes describen una región del genoma del PPV, que es adecuada para la inserción y para la expresión de genes homólogos y heterólogos o de partes de los mismos. Los fragmentos genómicos adecuados están contenidos en el fragmento I HindIII de la cepa D1701 de PPV ovis (y sus derivados correspondientes) (protocolo de secuencias ID No: 8 e ID No: 12).

1. Clonación del fragmento I de HindIII

Tras corte del ADN vírico adecuado con el enzima de restricción HindIII se separan los fragmentos resultantes del ADN por medio de electrofóresis en gel de agarosa, se recorta el fragmento I, con un tamaño aproximado de 5,6 kbp y se aísla y purifica por medio del método Qiaex® (Qiagen). Este fragmento del ADN se clonó con técnicas usuales (Maniatis et al.) en el plásmido vectorial pSPT18 cortado con HindIII y tratado con CIP (fosfatasa de intestino de ternera) (Boehringer, Mannheim). Los plásmidos recombinantes pORF-1 y pORF-2, resultantes, se diferencian únicamente por la orientación del inserto. El establecimiento de un mapa de restricción posibilita una subclonación adicional, como se ha mostrado en la figura 1. Todos los ADN plásmidos recombinantes se ensayaron por medio de la hibridación con transferencia de Southern con relación al ADN vírico o plásmido digerido por restricción, para verificar su identidad y su origen vírico.

2. Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN se llevó a cabo por medio del empleo del ADN bicatenario de los diversos plásmidos recombinantes y de cebadores específicos de SP6 así como de T7, que enlazan por ambos extremos los puntos de clonación del plásmido vectorial pSPT18. Se llevó a cabo el procedimiento didesoxi para la terminación de las cadenas según Sanger, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Pharmacia - Biotech), en presencia de ^{35}S-[\alpha]-dATP y de T7-ADN-polimerasa. De acuerdo con la secuencia obtenida del ADN se sintetizó una pluralidad de oligonucleótidos y se emplearon para la secuenciación de ambas cadenas del fragmento I de HindIII. Para disolver los artefactos de secuenciación o la compresión de bandas, debido al contenido relativamente elevado en G+C del inserto del ADN vírico (64,78%), se utilizó 7-desaza-GTP y los productos de la secuenciación se separaron, en caso necesario, en geles de poliacrilamida desnaturalizantes, que contenían formamida.

3. Identificación de los genes potenciales

Un análisis, asistido por ordenador, de la secuencia obtenida del ADN (protocolo de secuencias ID No: 8 y ID No: 12) puso de manifiesto varios posibles marcos de lectura abiertos (ORF). La secuencia de aminoácidos, derivada de estos ORF, se empleó para investigaciones de la homología génica (por ejemplo programa GCG). Como resultados se detectaron significativas homologías de los aminoácidos con los genes siguientes (véase también la
figura 1).

3.1 Se encontró un ORF con homología de los aminoácidos (36,1 hasta 38,3% de identidad; 52,8 hasta 58,6% de similitud) con respecto al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de diversas especies de mamíferos (por ejemplo ratón, rata, conejillo de Indias, vaca, seres humanos) así como también con respecto al homólogo del gen VEGF, que ha sido descrito recientemente en las cepas NZ-2 y NZ-7 de los PPV (Lit. #6). Un homólogo génico correspondiente no es conocido en otros poxvirus, tales como diversos ortopoxvirus. Este ORF, que se denomina como VEGF, comprende 399 nucleótidos y codifica un polipéptido con 132 aminoácidos con un peso molecular calculado de 14,77 kDa. Los análisis por transcripción con empleo de la hibridación con transferencia de Northern, los ensayos de protección del ARN y los ensayos de extensión de los cebadores con todo el ARN seleccionado o con oligo(dT) ARN seleccionado, que se aisló a partir de células infectadas, demostraron la expresión de VEGF como gen incipiente aproximadamente a partir de las 2 horas desde la infección (p.i.). Se ha encontrado que el mARN específico cubre desde 422 hasta 425 bases, comenzando directamente aguas debajo de una secuencia, que presenta un 100% de homología con la región crítica de un motivo de consenso, que es típico de los promotores para los genes incipientes del virus de vaccinia. El extremo 3' del VEGF-mARN pudo mapearse en una secuencia de consenso, que es común con los transcriptos incipientes, por ejemplo, de los genes del virus de vaccinia. Por medio de la hibridación con transferencia de Northern se estimó el tamaño de este mARN en aproximadamente 500 bases, lo cual sugiere un segmento poli(A) con una longitud de aproximadamente 100 bases.

3.2 Se encontró otro ORF, que codifica una proteínaquinasa potencial (PK) con homología con respecto a un gen correspondiente, que existe en varios ortopoxvirus (por ejemplo el virus de vaccinia, de Variola o de fibroma de Shope) y que se conoce como F10L. Este homólogo génico se transcribirá ulteriormente en el ciclo de infección de la cepa D1701 del PPV (a partir de 12 hasta 16 horas p.i.). El punto de iniciación de la transcripción se encuentra próximo, aguas abajo, de una región, que presenta una elevada homología con respecto a los promotores conocidos de los genes tardíos del virus de vaccinia.

3.3 Se encontraron otros ORF posibles, que no mostraban, hasta ahora, homologías apreciables con respecto a las secuencias génicas conocidas. Tiene un interés especial un gen potencial, que se denomina como gen HD1R (figura 1). Los análisis, como los que se han descrito precedentemente, mostraron la transcripción de un mARN incipiente específico con un tamaño de 1,6 kb aproximadamente.

3.4 Finalmente se encontró un ORF, por medio de ordenador, que solapa el extremo 3' de F10L y el extremo 5' de VEGF (F9L, figura 1). La comparación de las secuencias muestra homología con el gen F9L del virus de
vaccinia.

3.5 En comparación con las secuencias conocidas del ADN de las cepas NZ-2 y NZ-7 de Orf puede fijarse el inicio de la denominada región ITR en el genoma de D 1701 en la posición del nucleótido 1611 del fragmento I de HindIII. La región ITR está constituida por una región de la secuencia, que se presenta en el extremo del genoma del poxvirus, que está presente, también, en el otro extremo del genoma, con una orientación invertida y que se denomina, por lo tanto, "región repetida invertida -inverted repeat region-" (ITR) (véase el protocolo de secuencias ID No: 4). Los resultados obtenidos de la comparación de las secuencias son congruentes con los ensayos relativos a la localización del genoma del fragmento I de Hindin de D1701, clonado en pORF-1. El mapeado de este fragmento y del fragmento H de HindIII, posiblemente idéntico, se ha representado en la figura 2. A partir de esto puede deducirse que la ITR del genoma D1701 abarca 2,6 kbp aproximadamente.

Se ha descubierto, por medio de ensayos para la determinación del extremo 3' del VEGA mARN de D1701, que comienza en la ITR, al menos, otro ARN específico del virus, entre aproximadamente 40 y 220 bp después de la transición a la ITR. El gen correspondiente se denominó como ORF3, debido a la homología de los aminoácidos con respecto a NZ-2 (figura 1). Por delante del extremo putativo 5' del ORF3-mARN se encuentra una secuencia de consenso, que es típica de un promotor incipiente del los poxvirus. Hasta el presente no ha podido encontrarse una homología con respecto a otros genes conocidos.

4. Inserción de secuencias del ADN en el fragmento I de HindIII

Se investigó la posibilidad de la multiplicación del fragmento HindIII-DNA descrito (clonado en los plásmidos pORF-1 y pORF-2) para la inserción de secuencias del ADN homólogas o heterólogas. A continuación se han empleado tres estrategias diferentes para conseguir este objetivo.

Para los ejemplos siguientes se construyó el plásmido pGSRZ, que contiene al gen funcional LacZ de E. coli bajo el control del promotor 11K del virus de vaccinia. Con esta finalidad se aislaron las partes relevantes del ADN del plásmido pUCIILZ (véase la publicación Lit. #7) y se insertó por clonación en el plásmido pSPT18. Esta combinación génica funcional 11K-LacZ (denominada a continuación como casete LacZ) puede obtenerse por medio del aislamiento de un fragmento SmaI-SalI del pGSRZ, con un tamaño de 3,2-kbp (figura 3).

Construcción de las casetes de selección

A partir de los plásmidos pGSRZ (que contiene al gen LacZ bajo el control del promotor del virus de vaccinia P_{11K}), pMT-1 (que contiene el promotor VEGF del PPV) y pMT5 (que contiene el gen gpt de E. coli) se construyeron diversas casetes denominadas de selección, como se ha representado en la figura No: 7. Se prepararon oligonucleótidos complementarios sintéticos, que representan la secuencia del promotor VEGF (P_{VEGF}), y se insertaron (pMT-1) en los puntos de corte Smal de pSPT18. A continuación se prepararon los plásmidos pMT-2 y pMT-4, retirándose el gen LacZ procedente de p18Z (obtenido por inserción en pSPT18 del fragmento BamHI, procedente de pGSRZ) o bien el gen gpt procedente de pMT-5 por medio del corte BamHI y se insertó en pMT-1 (figura 7).

El gen funcional gpt se amplificó, por medio de RCP, por el plásmido gpt pMSG (Pharmacia-Biotech) y se clonó en el vector pCRII por medio de la denominada clonación TA, de acuerdo con las indicaciones del fabricante (Invitrogen Inc.).

A continuación pudieron ser construidas las casetes dobles de selección, como se ha representado esquemáticamente en la figura 7, que expresan, en las combinaciones y con las orientaciones mostradas, al gen LacZ o bien al gen gpt bajo el control del promotor 11K y/o del P_{VEGF}.

De acuerdo con el ejemplo XX (delección LacZ-VEGF) o YY (Ba131 intergénico), pueden insertarse estas casetes de selección, tras un corte correspondiente por medio del enzima de restricción y aislamiento, en los diversos plásmidos del ADN de PPV orf. Tras inserción de un casete doble de selección en el plásmido pdV-500, descrito, que presenta una deleción con un tamaño de 312 bp del gen VEGF de D 1701 del PPV, se construyó el plásmido pMT-10. Por medio de esta construcción se aplicaron los genes funcionales LacZ y gpt en lugar del VEGF-ORF, retirado por medio de deleción. De acuerdo con los ensayos pasajeros de expresión, pudo demostrarse la actividad del gen LacZ en células infectadas con D1701 de PPV (no representado), de tal manera, que se llevó a cabo además una selección de mutantes de deleción VEGF de la D1701, que expresan gpt y LacZ.

4.1 Inserción en regiones intergénicas, no codificantes

Identificación o consecución de nuevos puntos singulares de restricción, que se encuentran en una parte intergénica, no codificante. Estos puntos se emplearán a continuación para insertar secuencias del ADN foráneo, que codifican productos génicos funcionales y detectables (por ejemplo el gen LacZ, de E. coli) o partes de los mismos.

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Ejemplo 4.1.1

El plásmido pORF-PB (figura 1) contiene un solo punto de corte NruI, que se encuentra entre la proteínaquinasa (F10L) y el gen HD1R. Tras linealización del pORF-PB con este enzima de restricción, se encajó, con "extremo truncado -blunt end-", el casete LacZ (tras reacción de relleno). Los plásmidos recombinantes, que contenían el gen funcional LacZ, se seleccionaron, tras corte, por ejemplo con BglI, y se demostró la inserción correcta por medio de la hibridación con transferencia de Southern con una sonda específica de LacZ así como por medio de la secuenciación parcial del ADN de la transición de los ADN del LacZ y del PPV.

Ejemplo 4.1.2

Se empleó la misma forma de proceder que la descrita en el ejemplo precedente, aguas abajo del gen VEGF (corte en el punto BstEII, figura 1) y se emplearon en genes potenciales ORF 3 en la región ITR (degradación parcial con XbaI, para impedir un corte del punto XbaI en los puntos de clonación de pSPT18).

Ejemplo 4.1.3

Para insertar un nuevo punto singular de restricción en cada punto deseado de los fragmentos clonados del ADN del PPV, puede emplearse la técnica de la mutagénesis RCP (véase la figura 10, publicación Lit. #12). Con esta finalidad se llevan a cabo por separado dos reacciones RCP, empleándose el par de cebadores E1+EV2 (RCP A) o bien EV1+XB (RCP B). Todos los cebadores abarcan 25 nucleótidos, que son idénticos a la secuencia del ADN del PPV en las posiciones secuenciales indicadas. Mientras que el cebador XB representa la secuencia auténtica, por ejemplo alrededor del punto XbaI (figura 1), se insertó en el cebador E1, en el extremo 5', un nuevo punto EcoRI y en los cebadores EV1 y EV2 (que son complementarios entre sí) se insertó un nuevo punto EcoRV. Los puntos EcoRV, que no están originalmente presentes en la secuencia completa de pORF-1 o de pORF-2, se dispuso en una posición que se había elegido para la inserción del casete LacZ. Se purifican los productos de la RCP, obtenidos a partir de las reacciones A y B, se desnaturalizan para dar cadenas simples y se mezclan bajo condiciones de reasociación; a continuación se utilizan para la última reacción RCP C. Como cebadores se utilizan ahora E1 y XB, para prolongar en este ejemplo los 793 bp izquierdos del pORF-1. Tras el aislamiento y la purificación en gel se corta el producto resultante RCP de la reacción C con EcoRI y con XbaI y, a continuación, se encaja con el plásmido pORF-XB, cortado por medio de EcoRI y XbaI. Como resultado, el plásmido pORF-1EV (figura 5) contiene el punto de restricción EcoRV en la posición deseada; a continuación puede emplearse éste para una linealización y el encajado con el casete LacZ.

Además, pueden emplearse cebadores de emparejamiento erróneo para el procedimiento descrito en este ejemplo, que contengan modificaciones definidas de las bases o una deleción de algunas bases individuales para generar, por ejemplo, codones de detención de la traducción o deleciones de aminoácidos en cualquier punto deseado en la secuencia vírica del ADN.

4.2 Inserción intergénica sin delección de secuencias de Orf

Tras el corte en los puntos de restricción, que se presentan sólo una vez en el gen seleccionado, pueden insertarse secuencias nuevas o adicionales en las secuencias codificantes de uno de los ORF descritos.

Ejemplo 4.2.1

Se empleó el punto singular XcmI, que se encuentra en la parte derecha del homólogo génico F10L, para linealizar al plásmido pORF-1. Tanto el casete LacZ como también el ADN del pORF-1, cortado, se dotaron con extremos nítidos por medio de T4- o de Klenow-ADN-polimerasa, se encajaron y se emplearon bacterias de E. coli competentes (DHS\alphaF') para la transformación. Las colonias bacterianas resultantes se ensayaron con relación a los plásmidos recombinantes positivos por medio de hibridación sobre filtro de las colonias con empleo de una sonda específica de LacZ y, a continuación, se sometieron los ADN plásmidos correspondientes a un corte por restricción.

Ejemplo 4.2.2

La región codificante VEGF contiene un solo punto StyI, que se utilizó, como se ha descrito anteriormente, para insertar el casete LacZ.

4.3 Deleción de secuencias víricas

En los ejemplos siguientes se describe la retirada tanto de regiones codificantes (deleciones intragénicas) así como también de regiones no codificantes (deleciones intergénicas):

Ejemplo 4.3.1

Se retiraron partes definidas del fragmento I del ADN de HindIII por medio del empleo de enzimas de restricción, para reemplazar las secuencias víricas que han sufrido la deleción, insertándose genes foráneos o partes de los mismos. Esto se llevó a cabo por medio del corte del plásmido pORF-PA con el enzima de restricción NruI (en un punto en la región ITR, figura 1), verificándose la deleción de un fragmento con 396 bp. Tras una reacción de relleno se encajó el casete LacZ como se ha descrito anteriormente. La figura 4 muestra, esquemáticamente, la deleción del fragmento de 396 bp a partir de pORF-PA y la inserción del casete LacZ. Las figuras 5 y 6 muestran los plásmidos de deleción/inserción, construidos de este modo, pCE4 y pCE9 procedentes de pORF-PA.

Ejemplo 4.3.2

Se emplearon puntos individuales de restricción en el fragmento del ADN de HindIII como puntos de iniciación para provocar una delección en ambos sentidos de secuencias bajo la acción de la endonucleasa Bal31, como se ha representado, esquemáticamente, en la figura 6. Para la degradación por restricción se empleó, en el caso del plásmido pORF-PA, el enzima StyI y, en el caso del plásmido pORF-1 o pORF-XB, se empleó el enzima XcmI, para abrir los genes, que codifican VEGF o bien F10L de la proteínaquinasa (figuras 1 y 6). Tras adición de la exonucleasa Ba131, se retiraron partes iguales de la reacción cada 2 minutos y se detuvo la reacción. La tabulación de los valores temporales por ejemplo con el enzima de restricción BglI y, a continuación, la electrofóresis de gel permitieron la estimación del tamaño del fragmento del ADN que ha sufrido la deleción por medio de Bal31. A continuación se emplearon mezclas de los puntos temporales adecuados para cerrar los extremos del ADN por medio de una reacción de relleno. Se hibridizaron los oligonucleótidos complementarios, que representan puntos singulares nuevos de restricción SmaI, SalI y EcoRV y las moléculas de cebadores bicatenarias, resultantes, (denominadas como enlazadores "EcoRV") se encajaron en los productos Ba131, dotados con extremos nítidos. Después de la transformación de las bacterias se aisló el ADN plásmido y se cortó con EcoRV, que no contenía ningún punto de reconocimiento en la secuencia del ADN del fragmento I de HindIII del PPV. Por lo tanto, cada ADN plásmido, con un punto EcoRV, contenía la secuencia insertada del enlazador y se empleó a continuación para encajar en el nuevo punto EcoRV el casete LacZ, dotado con extremos nítidos. El tamaño exacto de la deleción provocada del ADN en cada ADN plásmido recombinante, resultante, pudo determinarse por medio de secuenciación con los enlazadores EcoRV monocatenarios así como con cebadores adecuados, específicos del gen LacZ.

5. Detección e identificación del gen VEGF en otros parapoxvirus

El conocimiento de la región del ADN, que codifica al VEGF en D1701, permite la obtención de sondas específicas del ADN y de cebadores específicos de la RCP para identificar a este gen en otras cepas de parapoxvirus, que pueden tener perfiles de restricción extraordinariamente diferentes. Con esta finalidad se ensayaron las siguientes posibilidades: (i) el aislamiento de un subfragmento TaqI (con un tamaño de 366 bp) de pORF-PA como sonda para la hibridación, que representa la parte central del gen VEGF de D1701; (ii) la amplificación del VEGF-ORF completo con ayuda de cebadores sintéticos adecuados y subsiguiente clonación del plásmido del producto de la RCP; (iii) el empleo de cebadores, que cubran diversas partes del gen VEGF, empleándose para las RCP en presencia de los ADN del PPV como matrices así como sondas específicas para la hibridación.

Tras marcaje radioactivo se emplearon con éxito estas sondas para la hibridación por medio de transferencias de Southern así como de Dot/Spot con el ADN genómico de diversos aislados y cepas de parapox ovis, de parapox bovis 1 (estomatitis papulosa bovina; BPS) y de parapox bovis 2 (pústulas del ordeñador). La hibridación por transferencia de Southern muestra señales positivas de VEGF con fragmentos definidos del ADN del PPV, que permiten otro mapeado detallado del gen VEGF de los diversos PPV.

Además, pueden emplearse las mismas sondas para análisis de ARN comparativos, tal como la hibridación por transferencia de Northern, para ensayar la expresión de genes VEGF potenciales en otras cepas del PPV.

6. Generación de recombinantes de D1701

Se infectaron células BK-KL-3A, desarrolladas de manera confluente, con una dosis infecciosa de 0,1 moi (multiplicidad de infección -multiplicity of infection-). Las células infectadas se sometieron a una transfección, dos horas más tarde, por ejemplo con el ADN (2 hasta 10 \mug) del plásmido pMT-10 bien según el método del choque con CaPO_{4}-glicerol o bien por medio del empleo de un estuche de transfección, según las indicaciones del fabricante (DOSPER, Boehringer-Mannheim). A continuación se incubaron estos cultivos celulares con medio selectivo (medio HAT+MPA ácido microfenólico - xantina - FKS al 5%) durante tres hasta seis días a 37ºC, con atmósfera de CO_{2} al 5%, hasta que fue visible cpe o la formación de placa. De acuerdo con la intensidad del cpe, en función del virus:

a.: se obtuvo el lisado celular, se preparó una serie de diluciones y se llevó a cabo un ensayo en placa sobre las células BK-KL-3A. La mezcla de medio de agarosa añadida contenía 0,3 mg/ml de Bluo-Gal (Life Science GIBCO-BRL), para la identificación de las placas azules, que contenían recombinantes de D1701 resistentes a la MPA, que expresan LacZ.

b: Tras la formación de las placas aisladas se añadió la mezcla de agarosa-Bluo Gal descrita en (a) y se recolectaron las placas aisladas coloreadas de azul.

Los virus obtenidos en (a) o en (b) se emplean - como se ha descrito precedentemente - para la infección de BK-KL-3A y se someten, al menos, a otras dos titulaciones y purificaciones en placa, hasta que se presente una población vírica recombinante homogénea al 100%.

7. Promotor de VEGF

Tal como se ha esquematizado en el capítulo 3.1, el gen VEGF de D1701 representa un gen incipiente, el mARN específico se transcribe en grandes cantidades en células infectadas con virus de D1701 a partir de dos hasta cuatro horas después de la infección, hasta tiempos posteriores a la infección. Por lo tanto, la región promotora identificada del VEGF de D1701 debería ser muy útil para el control de la expresión de los genes foráneos o de partes de los mismos en virus recombinantes del PPV. La secuencia, que abarca el promotor de VEGF (35 hasta 40 nucleótidos; protocolo de secuencia ID No: 6), puede aislarse por medio de (i) la RCP con empleo de los cebadores correspondientes, que flanquean la región del promotor, (ii) la subclonación del correspondiente fragmento del ADN o (iii) la sintetización de la secuencia del promotor en forma de oligonucleótido. Tras el enlace del promotor de VEGF con cada gen interesado, o con una secuencia del ADN, podrá emplearse el casete génico resultante para la obtención del PPV recombinante según cualquier procedimiento, como se ha descrito en los capítulos precedentes.

8. Gen 10kDa

Tomando como base la secuencia del ADN, publicada, del gen 10kDa de la cepa NZ-2 del PPV (Lit. #8) se estableció una RCP específica para la detección del gen 10kDa del PPV. Tras realización de la RCP con los cebadores, preparados por síntesis, 10K-up (5-CAATATGGATGAAAATGACGG-3) y 10k-low (5-CAGACGGCAACACAGCG-3) se consigue la amplificación de un producto específico, con un tamaño de 297 pares de bases. La clonación subsiguiente (TA cloning kit, Invitrogen Inc.) proporcionó el plásmido pJS-1, que contiene como fragmento EcoRI al producto de la RCP de 297 bp. La secuenciación del ADN de ambas cadenas del ADN de la inserción de pJS-1 demuestra la presencia de la secuencia específica 10kDa. A continuación D1701 codifica una proteína 10kDa con un tamaño de 91 aminoácidos, que presenta una identidad de los aminoácidos del 96,7% y una similitud de los aminoácidos del 96,7% con respecto a la cepa NZ-2 del PPV.

La localización del gen 10kDa en el fragmento E de EcoRI (4,25 kbp) del genoma D1701 se llevó a cabo por medio de la hibridación por transferencia de Southern con pJS-1 marcado de manera radioactiva. Por lo tanto, este gen, lo mismo que en el caso de NZ-2, está localizado en la parte derecha del genoma vírico y contiene un punto de corte de los fragmentos K y G de HindIII (figura 2).

Los plásmidos pDE-E1 y pRZ-E1, que contienen el fragmento E de EcoRI de la D1701, con un tamaño de 4,25 kbp, sirven para la obtención de plásmidos de inserción y de plásmidos de deleción en el gen 10kDa (en principio como se ha descrito precedentemente). Los puntos de corte HindIII (fragmentos K-G) en el segmento N-terminal del gen 10kDa de la D1701 (#124-#129 secuencia ID No: 11) puede aprovecharse tanto para la inserción directa del ADN foráneo así como también para la deleción (véase la digestión en ambos sentidos con Ba131) del gen 10kDa. Para la última construcción se retiró el segundo punto de corte HindIII (de los puntos múltiples de clonación del plásmido vectorial pSPT18) en el plásmido pDE-E1. Con esta finalidad se cortó el ADN de pSPT18 con HindIII, los puntos de corte de HindIII se destruyeron por medio de tratamiento según Klenow y se volvieron a unir. En los puntos de corte de EcoRI de este nuevo plásmido vectorial pSPT18dH se clonó, a continuación, el fragmento E de EcoRI de D1701, con un tamaño de 4,25 kbp. El plásmido resultante pRZ-E1 (figura 8) tiene ahora un punto de corte singular de HindIII en el gen 10kDa, que permite una manipulación sencilla ulterior.

La hibridación por transferencia de Southern con pDE-E1 y pJS-1 como sondas marcadas de manera radioactiva, así como los ensayos por medio de la RCP muestran que los genomas de diversos PPV bovis 1 no contienen ninguna secuencia específica de 10kDa. Esto indica que el gen 10kDa del PPV no es esencial (Büttner M. et al. 1996,
Lit. #10).

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ID No: 1

La secuencia ID No: 1 de la solicitud muestra el gen VEFG localizado sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV.

Informaciones adicionales

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1

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ID No: 2

La secuencia ID No: 2 de la solicitud muestra el gen F10L de la proteínaquinasa, localizado sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV (versión 1)

Informaciones adicionales

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2

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ID No: 3

La secuencia ID No: 3 de la solicitud muestra el segmento del gen HD1R, localizado sobre el fragmento I de Hindin de la cepa D1701 del PPV.

ID No: 4

La secuencia ID No: 4 de la solicitud muestra la región ITR, localizada sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV y el gen ORF3, que se encuentra en esta región.

Informaciones adicionales

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3

\vskip1.000000\baselineskip

ID No: 5

La secuencia ID No: 5 de la solicitud muestra el homólogo del gen F9L, localizado sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV(versión 1).

Informaciones adicionales

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

ID No: 6

La secuencia ID No: 6 de la solicitud muestra la región del promotor VEGA, localizada sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV.

ID No: 7

La secuencia ID No: 7 de la solicitud muestra la región intergénica, localizada sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV, situada entre el gen HD1R y el gen PKF10L.

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

ID No: 8

La secuencia ID No: 8 de la solicitud muestra la secuencia completa de los nucleótidos del fragmento I de HindIII (versión 1) de la cepa D1701 del PPV.

ID No: 9

La secuencia ID No: 9 de la solicitud muestra la versión 2 del gen F10L de la proteínaquinasa, localizado sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV.

Informaciones adicionales

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

ID No: 10

La secuencia ID No: 10 de la solicitud muestra la versión 2 del homólogo del gen F9L, localizado sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV.

Informaciones adicionales

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

ID No: 11

La secuencia ID No: 11 de la solicitud muestra el gen 10kDa, localizado sobre el fragmento E de EcoRI de la cepa D1701 del PPV.

Informaciones adicionales

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

ID No: 12

La secuencia ID No: 12 de la solicitud muestra la secuencia completa de los nucleótidos de la versión 2 del fragmento I de HindIII de la cepa D1741 del PPV.

ID No:13

La secuencia ID No: 13 de la solicitud muestra versión 3 del gen FIOL de la proteínaquinasa, localizado sobre el fragmento I de HindIII de la cepa D1701 del PPV.

Informaciones adicionales

11

ID No: 14

La secuencia ID No: 14 muestra la secuencia de aminoácidos del homólogo F10L de la proteínaquinasa de la D1701 del PPV(derivada de la secuencia ID No: 13).

ID No: 15

La secuencia ID No: 15 muestra la secuencia de aminoácidos del homólogo VEGF de la D1701 del PPV(derivada de la secuencia ID No: 1).

ID No: 16

La secuencia ID No: 16 muestra la secuencia de aminoácidos del homólogo F9L de la D1701 del PPV (derivada de la secuencia ID No: 10).

Explicación de los dibujos

La figura 1 muestra el mapa físico del fragmento I de HindIII de Orf de la D1701 en los plásmidos pORF-1/-2. Las flechas delgadas marcan los mARN identificados, las flechas gruesas indican los ORF.

La figura 2 muestra el mapa físico de los puntos de reconocimiento Hind III sobre el genoma de la D1701 y los genes identificados sobre el fragmento I de Hind III así como una parte de la región repetida terminal invertida (Inverted Terminal Repeat Region).

La figura 3 muestra el plásmido pCE4. Tras corte con NruI se intercambió un fragmento de 396 bp por el casete LacZ.

La figura 4 muestra el plásmido pCE9 en el que se ha insertado el casete LacZ, tras la linealización por medio del corte con XcmI.

La figura 5 muestra esquemáticamente, como se ha descrito en el texto, la estrategia para la generación de un nuevo punto singular de corte por medio de la PCR.

La figura 6 muestra esquemáticamente el acortamiento en ambos sentidos por medio de la nucleasa Bal31 con subsiguiente inserción del enlazador de EcoRV y del casete LacZ.

La figura 7 muestra la estrategia para la obtención del casete de selección LacZ/gpt:

P_{11K}: promotor de 11k de la vacuna

P_{VEGF}: promotor de VEGA del PPV

Sm: Sma I

B: Bam H1

La figura 8 muestra esquemáticamente la estrategia para la clonación del fragmento E de EcoR1 de la D1701 del PPV, que contiene el gen 10 kDa (como se ha descrito en el texto).

\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: BAYER AG

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Bayerwerk

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Leverkusen

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): D-51368

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 0214/3061285

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 0214/30 3482

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Parapoxvirus, que contienen ADN foráneo, su obtención y su empleo en vacunas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DEL MEDIO: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: Patent In Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 540 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: gen D1701-VEGF

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1740 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: gen de la proteínaquinasa de la D1701 (versión 1)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1080 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: región génica HD1R de la D1701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1616 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: genes ITR y ORF3 de la d1701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 900 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: gen F9L de la D1701(versión 1)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: promotor VEGA de la D1701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 250 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: intergen de la D1701. Región situada entre los genes HD1R y de proteínaquinasa

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5515 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Fragmento I de HIND III de la D1701 (versión 1)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1620 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: gen F10L de la proteínaquinasa de la D1701 (versión 2)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 780 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: gen F9L de la D1701, versión 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 297 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: gen 10kD de la D1701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5519 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: D 1701, fragmento I de HindIII, versión 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1742 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: gen F10L de la proteínaquinasa de la D 1701(versión 3)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 497 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: F10L de la proteínaquinasa de la D1701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 132 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: proteína VEGF de la D1701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 224 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): QUIMÉRICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Parapox ovis

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: proteína F9L de la D1701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

40

Claims

1. PPV preparados por recombinación con inserciones y/o deleciones, que contienen un antígeno foráneo, que puede inducir una protección, que es específica del agente patógeno.

2. PPV preparados por recombinación con inserciones y/o deleciones, que contienen una citoquina.

3. PPV preparados por recombinación, según las reivindicaciones 1 o 2, que contienen inserciones y/o deleciones en fragmentos del genoma, que no son necesarios para la multiplicación del virus.

4. PPV preparados por recombinación con inserciones y/o deleciones, según las reivindicaciones 1 o 2, que contienen inserciones y/o deleciones en fragmentos del genoma, que son necesarios para la multiplicación del virus.