PL190404B1 - Środek farmaceutyczny działający przeciwko nowotworom, mikroorganizmom chorobotwórczym i chorobom inwazyjnym - Google Patents

Abstract

1. Srodek farmaceutyczny dzialajacy przeciwko nowotworom, mikroorganizmom chorobotwórczym i chorobom inwazyjnym, skladajacy sie z substancji czynnej, nosnika i znanych srodków stabilizujacych i konserwujacych, znamienny tym, ze substancje czynna stanowia inhibitory cystei nowych peptydaz o masach czasteczkowych od 9,0 do 57 kDa, wyizolowane z lozyska lub wód plodowych ludzi lub zwierzat, przy czym pojedyncza dawka zawiera od 10 do 50 jednostek inhibitorowych w 1,0 x 10-4 do 1,0 x 10-5 mg bial- ka/ml farmaceutycznego nosnika, dostosowanego do rodzaju terapii, zwlaszcza stanowia- cego roztwór wodny lub zawiesine olejowa. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny działający przeciwko nowotworom, mikroorganizmom chorobotwórczym i chorobom inwazyjnym, wykazujący ponadto zdolność do zastosowania w diagnozowaniu nowotworów i kontroli działania terapeutycznego konwencjonalnych terapii.

Badania prowadzone w wielu niezależnych zespołach potwierdziły, że procesy nowotworowe rozpoczynają się w momencie uaktywnienia katepsyny D. Jest to enzym proteolityczny, który posiada w swoim centrum aktywnym resztę kwasu asparaginowego zdolnego aktywować cysteinowe endopeptydazy, głównie katepsyny B i L, które z kolei uaktywniają inne enzymy odgrywające kluczowe role w kaskadzie przemian nowotworowych, jak aktywator plazminogenu μΡΑ oraz specyficzne metaloproteinazy np. kolagenazy. Dalsze badania potwierdziły udział cysternowych peptydaz oraz ich inhibitorów w kontroli procesów nowotworowych narządów rodnych. Podobne procesy jak towarzyszące nowotworom złośliwym stwierdzono w stwardnieniu rozsianym, zapaleniu stawów, kłębuszków nerkowych, w zmianach w tkankach przyzębia, rzeszotowieniu kości, oraz w chorobach bakteryjnych i wirusowych, w tym AIDS.

Dużo publikacji dotyczących poznania procesów enzymatycznych w nowotworach narządów rodnych opisuje korelację pomiędzy poziomem aktywatora plazminogenu μΡΑΙ oraz jego specyficznych inhibitorów. Określenie poziomu μΡΑΙ oraz ich inhibitorów rozpoczęto też stosować w diagnozowaniu zaawansowania nowotworów narządów rodnych. Przeprowadzono też próby kontroli procesów nowotworowych, hamując aktywność urokinazy typu plaminogenu inhibitorami trypsyny izolowanymi z ludzkiego moczu. Stwierdzono też, że aktywność μΡΑ związana jest z poziomem aktywnej katepsyny B w organizmie pacjentek z nowotworami narządów rodnych. Poziom cysternowych endopeptydaz, ich inhibitorów oraz plazminogenu stosowano w diagnozowaniu procesu nowotworowego przy jego wzroście oraz stosowanej chemioterapii. Przeprowadzono także, próby kontroli przerzutów nowotworowych przy użyciu białek wyizolowanych z płynu owodniowego pozyskiwanego od kobiet po porodzie. Od kilku lat ukazują się informacje z badań potwierdzające możliwość kontroli kaskady procesów enzymatycznych, przez poznanie w nich roli cysternowych endopeptydaz oraz próby zastosowania ich inhibitorów jako potencjalnych leków mogących znaleźć zastosowanie jako potencjalnych leków. Potwierdzeniem tych badań jest nadekspersja peptydaz cysternowych w stanach patologicznych, która regulowana jest in vivo przez naturalne autogenne inhibitory peptydaz cysternowych.

190 404

Z polskiego patentu nr 174 636 znany jest sposób otrzymywania inhibitorów cysternowych peptydaz metodą chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, w którym supenatant nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie i przemywa buforem o pH 6,0, z dodatkiem 0,2M chlorku sodowego, w celu usunięcia wszystkich białek i innych substancji nie związanych z nośnikiem. Roztwór nanoszony na kolumnę uzyskuje się z białka jaj, lub ich liofilizatu, które dodaje się powoli do buforu fosforanowego, zawierającego kwas etylenodwuaminooctanowy i cysteinę. Uzyskany z kolumny biosorbent zawiesza się w wodzie i doprowadza do pH 1-4, bądź do pH 9-12, następnie ogrzewa do temperatury powyżej 60°C, potem schładza do temperatury 37°C, zobojętnia, osad oddziela, supenatant zagęszcza, oddziela od chlorku sodu i ampułkuje. Otrzymane w tym sposobie minhibitory cysternowych peptydaz przeznacza się do leczenia chorób śluzówki jamy ustnej, zwłaszcza chorób przyzębia oraz chorób skórnych.

W białku jaj kurzych znajdują się trzy rodzaje inhibitorów z grupy cystatyn, które wykazują podobieństwo genetyczne do cystatyny C, występującej w organizmie człowieka. Inhibitory te hamują cysteinowe endopeptydazy, to jest enzymy katalizujące zmiany w procesach towarzyszących paradontozie. Hamują one enzymy pojawiające się w płynie kieszonki zębowej oraz homogenatach tkanek dziąsła osób z chorobami przyzębia.

Wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego działającego przeciwko nowotworom, mikroorganizmom chorobotwórczym i chorobom inwazyjnym, który składa się z substancji czynnej, nośnika i znanych środków stabilizacyjnych i konserwujących.

Istota wynalazku polega na tym, że substancję czynną stanowią inhibitory peptydaz cysternowych o masach cząsteczkowych od 9,0 do 57 kDa, wyizolowane z łożyska lub wód płodowych ludzi lub zwierząt. Pojedyncza dawka zawiera 10 - 50 jednostek inhibitorowych w 1,0 x 10'⁴ do 1,0 x 10‘5 mg białka/1,0 ml farmaceutycznego nośnika dostosowanego do rodzaju terapii, zwłaszcza emulgatora stosowanego rutynowo w przemyśle spożywczym, stanowiącym roztwór wodny lub zawiesinę olejową.

Korzystne jest, gdy środek farmaceutyczny zawiera olej kukurydziany w ilości do 80% masowych, liczonych w stosunku do masy substancji czynnej oraz ewentualnie witaminę E.

Inhibitory peptydaz cysternowych uzyskuje się metodą chromatografii powinowactwa z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku. Supernatant nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie i przemywa usuwając inne składniki nanoszonego płynu 0,01M buforem fosforanowym o pH 6,0 z dodatkiem 0,2M chlorku sodowego. Supernatant uzyskiwany z płynu owodniowego kobiet lub zwierząt, pobieranych bezpośrednio po porodzie, bądź z łożyska ludzkiego lub zwierzęcego po uprzednim spreparowaniu, dodaje się powoli do buforu fosforanowego, zawierającego kwas etylenodiaminowy i cysteinę. Uzyskany z kolumny biosorbent związany z inhibitorami cysternowych peptydaz przemywa się wodą destylowani^ a następnie zawiesza się w niej, po czym doprowadza do pH 1,0 do 4,0 bądź do pH 9,0 do 12,0, ogrzewa do temperatury powyżej 60°C, potem schładza się, zobojętnia, osad oddziela, supernatant zagęszcza, oczyszcza z chlorku sodu oraz po przepuszczeniu przez filtry bakteryjne i sprawdzeniu sterylności uzyskanego preperatu ampułkuje.

Stwierdzono obecność pięciu różnych inhibitorów o masach cząsteczkowych 57, 45, 25, 13 i 9 kDa, które hamują zarówno cysteinowe endopeptydazy, w tym katepsyny B i L pojawiające się w tkankach nowotworowych oraz enzym pochodzenia roślinnego papainę, stosowaną w badaniach jako wzorcowy enzym cysternowych peptydaz. Najbardziej interesujące okazały się inhibitory o masach cząsteczkowych 57, 45 i 25 kDa. Przetestowano je szczególnie we wstępnych badaniach in vitro w bezpośredniej oraz wspomagającej terapii przeciwnowotworowej, a także jako znakowane technetem lub związane ze specyficznymi związkami fluorogennymi do określenia in vivo obecności komórek nowotworowych u pacjentów przygotowywanych do zabiegów operacyjnych z powodu nowotworu złośliwego. Pomocna jest ona w przygotowaniu testu przeznaczonego do oznaczania w organizmie przerzutów, co pozwoli zadecydować o rozległości przygotowywanej operacji. Stwierdzono, że wszystkie inhibitory hamują aktywność cysternowych peptydaz w homogenatach tkanek nowotworowych przewodu pokarmowego, zwłaszcza żołądka i jelita grubego. Inhibitory te hamują aktywność tych enzy4

190 404 mów również w pH 2,0 czyli środowisku płynów obecnych w żołądku w warunkach homeostazy. Inhibitory o masie cząsteczkowej 57 kDa mogą być wiązane ze znacznikami pozwalającymi zastosować je w diagnostyce nowotworowej, co może pomóc we wskazaniu miejsca przerzutów nowotworowych i pomagać w określeniu zasięgu planowanego zabiegu chirurgicznego. Jeden z inhibitorów o masie cząsteczkowej około 13 kDa hamuje rozwój Pseudomonas Aeuroginosa, mokroorganizmu powodującego powstawanie niebezpiecznych stanów zapalnych nerek, pęcherza i przewodu moczowego. Stwierdzono też udział tych inhibitorów w kontroli niektórych patologicznych zmian dermatologicznych. Ponadto stwierdzono, że inhibitory uzyskane z łożyska i wód płodowych hamują enzymy biorące udział w rozwoju nowotworów prawie dziesięciokrotnie silniej niż te, które otrzymuje się z białka jaj. Okazało się też, że mogą one znaleźć zastosowanie w próbach kontroli rozwoju innych chorób, w których peptydazy cysternowe odgrywają kluczowe role, w tym chorób przyzębia, dystrofii mięśniowej, wywołanych infekcją bakteryjną lub wirusową, w tym wirusami HIV. Wysokie powinowactwo inhibitorów cysternowych peptydaz, wyizolowanych z płynów owodniowych do katepsyn B i L występujących w membranach komórek nowotworowych oraz na granicy tkanki prawidłowej i nowotworowej, może okazać się użyteczne w transporcie leków wysoko toksycznych do wybranych miejsc w organizmie, gdzie rozwija się nowotwór. Zawieszenie inhibitorów według wynalazku w oleju kukurydzianym wzmacnia ich skuteczność dzięki temu, że olej ułatwia trawienie i wnikanie inhibitorów z przewodu pokarmowego do organizmu oraz, że może on dodatkowo zawierać witaminę E o działaniu silnie antyoksydacyjnym. Zastosowanie tej kombinacji pozwala na uzyskanie wysokich efektów w leczeniu głównie nowotworów przewodu pokarmowego i prostaty.

Środek farmaceutyczny uzyskuje się prostym, a co za tym idzie tanim sposobem, z wydajnością około 80% w stosunku do jego zawartości w surowcu. Np z 1,0 kg łożyska można uzyskać około 600 dóz leku co pozwala na przeprowadzenie miesięcznej kuracji u 2 osób w zależności od przyjętej postaci leku. Przedmiot wynalazku przedstawiony jest w przykładach wykonania, które mają na celu zilustrowanie wynalazku, bez zamiaru ograniczania go w jakikolwiek sposób.

Przykład I. Lek podawany domięśniowo

A. Uzyskane opisaną i opatentowaną metodą chromatografii powinowactwa inhibitory cysternowych peptydaz z łożyska lub wód płodowych pozyskiwanych od kobiet po porodzie, poddane oczyszczeniu na filtrach mikrobiologicznych, zagęszczone tak, aby w 1,0 ml roztworu soli fizjologicznej było po 20 jednostek inhibitorowych mierzonych względem papainy, zamknięte są sterylnie w ampułkach o objętości 1 i 2 mililitry, do podawania domięśniowego dwa razy dziennie.

B. Uzyskane inhibitory jak opisano w punkcie 1, umiejscowione znaną metodą w liposomach, aby uniknąć efektów toksyczności preparatu, oczyszczone na filtrach mikrobiologicznych i jako sterylne zamknięte są w 2,0 mililitrowych ampułkach, do podawania domięśniowego pacjentom dwa razy dziennie.

Opisane preparaty mogą być podawane pacjentom z nowotworami złośliwymi, w tym głównie sutka, wątroby, prostaty, trzustki, a także pacjentom zakażonym wirusem HIV.

Przykład II. Lek podawany doustnie: A. Lek w formie oleistej.

Uzyskane preparaty inhibitorów cysternowych peptydaz z łożyska lub wód płodowych ludzi lub zwierząt, zagęszczone do 10 jednostek inhibitorowych w 1,0 mililitrze, zawieszone są w proporcji 1 mililitr roztworu inhibitora na 5,0 mililitrów oleju kukurydzianego, zabezpieczonego witaminą E przed rozwojem mikroorganizmów, mogących spowodować utlenianie oraz dodatkiem stosowanych w przemyśle spożywczym znanych emulgatorów.

Preparat przeznaczony jest dla pacjentów głównie z nowotworami przewodu pokarmowego, a także innych, po wchłonięciu do organizmu w jelitach. Może być podawany też pacjentom z wirusem HIV jako nowa inhibitoro-terapia lub ze stanami bakteryjnego zapalenia nerek i dróg moczowych.

B. Lek podawany w formie tabletek.

Uzyskane preparaty inhibitorów cysternowych peptydaz z łożyska lub wód płodowych ludzi lub zwierząt zagęszczone są do 10 jednostek inhibitorowych w 0,1 mililitra soli fizjolo190 404 gicznej z dodatkiem znanego środka farmakologicznego pozwalający na wytworzenie leku w formie tabletki.

Uzyskany preparat przeznaczony jest dla pacjentów głównie z nowotworami przewodu pokarmowego, a także innych po wchłonięciu do organizmu w jelitach. Może być podawany tez pacjentom z wirusem HIV jako nowa inhibitoro-terapia lub ze stanami bakteryjnego zapalenia nerek i dróg moczowych.

Przykład III. Lek podawany w aerozolu..

Uzyskane opisaną i opatentowaną metodą chromatografii powinowactwa inhibitory cysternowych peptydaz z łożyska lub wód płodowych, pozyskiwanych od kobiet po porodzie, poddane oczyszczeniu na filtrach mikrobiologicznych, zagęszczone są tak aby w 1,0 ml roztworu soli fizjologicznej było po 20 jednostek inhibitorowych, mierzonych względem papainy w roztworze soli fizjologicznej i po oczyszczeniu na filtrach mikrobiologicznych zamknięte są w znanych aparatach zdolnych do wytwarzania aerozolu.

Przygotowany preparat przeznaczony jest do leczenia nowotworów płuc oraz krtani i może też być podawany doustnie lub w formie leważy pacjentom z nowotworami krtani lub płuc.

Przykład IV. Lek w formie infekcji bezpośrednio do guza nowotworowego.

Uzyskane metodą chromatografii powinowactwa inhibitory cysternowych peptydaz z łożyska lub wód płodowych pozyskiwanych od kobiet po porodzie, poddane są oczyszczeniu na filtrach mikrobiologicznych i zagęszczone tak, aby w 1,0 ml roztworu soli fizjologicznej było po 20 jednostek inhibitorowych mierzonych względem papainy, zamknięte są sterylnie w ampułkach o objętości 1,2 mililitry.

Lek przeznaczony jest do leczenia pacjentów ze zlokalizowanym nowotworem złośliwym i podawane domięśniowo dwa razy dziennie, bezpośrednio do zlokalizowanego guza nowotworowego.

Przykład V. Lek podawany w postaci żeli, maści itp.

Uzyskane opisaną i opatentowaną metodą chromatografii powinowactwa inhibitory cysternowych peptydaz z łożyska lub wód płodowych, pozyskiwanych od kobiet po porodzie, poddane oczyszczeniu na filtrach mikrobiologicznych, zagęszcza się tak, aby w 1,0 ml roztworu soli fizjologicznej było po 20 jednostek inhibitorowych mierzonych względem papainy, zawieszony jest w znanych i dopuszczonych przez przemysł farmaceutyczny żelach lub maściach i zmieszany z roztworem substancji zawierającej substancję czynną. Do uzyskania leku na konkretne schorzenie dobiera się odpowiednie wyizolowane inhibitory.

Preparat przeznaczony jest dla pacjentów z infekcjami dermatologicznymi, nowotworami, głównie czerniaka i innymi nowotworami skóry oraz przy zmianach wywołanych zmianami spowodowanymi radioterapią.

190 404

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek farmaceutyczny działający przeciwko nowotworom, mikroorganizmom chorobotwórczym i chorobom inwazyjnym, składający się z Substancji czynnej, nośnika i znanych środków stabilizujących i konserwujących, znamienny tym, że substancję czynną stanowią inhibitory cysternowych peptydaz o masach cząsteczkowych od 9,0 do 57 kDa, wyizolowane z łożyska lub wód płodowych ludzi lub zwierząt, przy czym pojedyncza dawka zawiera od 10 do 50 jednostek inhibitorowych w 1,0 x 10'⁴ do 1,0 x 10'⁵ mg białka/ml farmaceutycznego nośnika, dostosowanego do rodzaju terapii, zwłaszcza stanowiącego roztwór wodny lub zawiesinę olejową.
2. 2. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera olej kukurydziany w, ilości do 80% masowych, liczonych w stosunku do masy substancji czynnej.
3. 3. Środek farmaceutyczny według zastrz, albo 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera witaminę E.