PL190615B1 - Kompozycja szczepionki dla świń, zastosowanie kompozycji szczepionki, zestaw do szczepienia, szczepionka dla świń i zastosowanie plazmidu - Google Patents

Kompozycja szczepionki dla świń, zastosowanie kompozycji szczepionki, zestaw do szczepienia, szczepionka dla świń i zastosowanie plazmidu

Info

Publication number
PL190615B1
PL190615B1 PL97331249A PL33124997A PL190615B1 PL 190615 B1 PL190615 B1 PL 190615B1 PL 97331249 A PL97331249 A PL 97331249A PL 33124997 A PL33124997 A PL 33124997A PL 190615 B1 PL190615 B1 PL 190615B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
vaccine
gene
plasmid
virus
swine
Prior art date
Application number
PL97331249A
Other languages
English (en)
Other versions
PL331249A1 (en
Inventor
Jean-Christophe Audonnet
Annabelle Bouchardon
Philippe Baudu
Michel Riviere
Original Assignee
Merial Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial Sas filed Critical Merial Sas
Publication of PL331249A1 publication Critical patent/PL331249A1/xx
Publication of PL190615B1 publication Critical patent/PL190615B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/107—Vibrio
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/23—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/815—Viral vaccine for porcine species, e.g. swine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1 . Kompozycja szczepionki dla swin, w szcze- gólnosci przeciwko chorobom ukladu rozrod- czego i/lub oddechow ego sw in, znam ienna tym, ze obejmuje przynajmniej trzy wartosciowosci szczepionki polinukleotydow ej, z których kazda obejmuje integrujacy plazmid, obejmujacy gen z jednej w artosciow osci patogenu swin, który wyraza go in vivo w kom órce gospodarza, przy czym wartosciow osci te wybrane sa z dwóch grup skladajacych sie z wirusa choroby Aujesz k y' ego, wirusa grypy sw in, wirusa tajemniczej choroby swin, wirusa parwowirozy, wirusa kla- sycznego pomoru sw in i bakterii odpowiedzial- nych za aktinobacilloze, a plazmidy obejmuja dla kazdej w artosciow osci, jeden lub wiecej genów wybranych z grupy skladajacej sie z gB i gD dla wirusa choroby Aujeszky'ego, genów HA, N P i N dla w irusa g r y p y swin, genów E, ORF3, M dla wirusa tajemniczej choroby swin, VP2 dla wirusa parw ow irozy, i genów apxI, apxII i apxIII dla aktinobacillozy. F i g . 2 1 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki dla świń, zastosowanie kompozycji szczepionki, zestaw do szczepienia, szczepionka dla świń i zastosowanie plazmidu. Kompozycja szczepionki pozwala na szczepienie świń, szczególnie przeciwko patologiom układu rozrodczego i układu oddechowego.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci całkowicie zmieniły się zasady hodowli świń. Intensywne odżywianie w zamkniętej przestrzeni stało się regułą, czego następstwem stał się gwałtowny rozwój patologii układu oddechowego.
190 615
Generalnie spektrum objawów chorobowych ze strony układu oddechowego u świń jest połączone w ogólną jednostkę chorobową chorobę układu oddechowego świń i obejmuje szeroką różnorodność czynników wywołujących, w tym wirusy jak również bakterie i mykoplazmy.
Podstawowymi czynnikami wywołującymi choroby układu oddechowego są bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, wirus wywołujący zespół niepłodności i choroby układu oddechowego (PRRS), zwany również wirusem tajemniczej choroby, wirus choroby Aujeszky'ego i wirus grypy świń.
Inne wirusy powodujące zaburzenia płodności prowadzące do poronień, mumifikacji płodu i niepłodności. Głównymi wirusami są PRRS, parwowirus i wirus klasycznego pomoru świń (HCV). Wirus grypy świń PRV i A.pleuropneumoniae mogą również wywoływać te choroby. Zgony mogą występować w przypadkach zakażenia A.pleuropneumoniae, HCV i PRV.
Dodatkowo, szczególnie ważne w przypadku zespołu oddechowego u świń są wzajemne oddziaływania między drobnoustrojami. W rzeczywistości większość patogenów bakteryjnych to organizmy zwykle występujące w rejonie nosogardzieli i migdałków u młodych osobników. Patogeny te, pochodzące od macior, zwykle są wdychane przez młode w ciągu ich pierwszych godzin życia, zanim ujawni się odporność pochodząca z pokarmu matki. Gdy dojdzie do uszkodzenia oddechowych mechanizmów obronnych przez czynnik wywołujący, taki jak Actinobacillus pleuropneumoniae lub przez wirusy, organizmy żyjące w górnym odcinku układu oddechowego mogą atakować niższe odcinki układu oddechowego. Inwazja układu oddechowego może być bardzo szybka, zwłaszcza, gdy patogenem wywołującym jest patogen taki jak Actinobacillus pleuropneumoniae produkujący silne cytotoksyny zdolne do uszkodzenia rzęsek komórek nabłonka oddechowego i makrofagów pęcherzykowych.
Podstawowe zakażenia wirusowe, takie jak grypa, zakażenie układu oddechowego przez koronawirusa i zakażenia wirusem Aujeszky'ego, mogą odgrywać rolę jako czynniki wywołujące zespół oddechowy, podobnie jak bakterie z tropizmem do układu oddechowego i mykoplazmy.
Na koniec, niektóre czynniki mają wpływ zarówno na układ oddechowy jak i na układ rozrodczy. Wzajemne oddziaływania mogą się ujawniać w postaci chorób układu rozrodczego.
Tak więc wydaje się, że istnieje potrzeba rozwoju skutecznej ochrony przed podstawowymi czynnikami patogennymi wywołującymi choroby układu oddechowego i rozrodczego u świń.
Jak dotąd szczepionki skojarzone przygotowywano ze szczepionek inaktywowanych albo szczepionek żywych i ewentualnie ich mieszanin. Ich rozwój napotyka problemy związane ze zgodnością między wartościowościami i ze stabilnością szczepionek. Istnieje rzeczywista potrzeba zapewnienia zgodności między różnymi wartościowościami obu szczepionek, z powodu zastosowania różnych antygenów, bądź z powodu samych kompozycji, szczególnie w przypadku gdzie połączone są szczepionki inaktywowane i szczepionki żywe. Istnieje również problem konserwacji takiej kombinacji szczepionek i ich bezpieczeństwa, szczególnie w obecności adiuwantu. Takie szczepionki są generalnie dosyć drogie.
W zgłoszeniach patentowych WO-A-90 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797 i WO-A-95 20660 doniesiono o stosowaniu ostatnio rozwijanych technik szczepionek polinukleotydowych. Wiadomo, że szczepionki te wykorzystują plazmid zdolny do wyrażania w komórkach gospodarza antygenu włączonego do plazmidu. Proponowano wszystkie drogi podawania (dootrzewnową, dożylną, domięśniową, przezskómą, śródskómą śluzówkową i podobne). Do szczepień stosowane są różne środki, takie jak DNA osadzone na powierzchni cząstek złota i wystrzeliwane tak, że penetrują przez skórę zwierzęcia (Tang i in., Naturę 356, 152-154, 1992) i wtryskiwacze do wstrzyknięć strumienia płynu, które powodują, że jest możliwa jednoczesna transfekcja skóry, tkanek mięśniowych, tkanek tłuszczowych i tkanek gruczołu sutkowego (Furth i in., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992).
W szczepionkach polinukleotydowych mogą również być stosowane zarówno nagie DNA jak i kompozycje DNA, na przykład wewnątrz kationowych lipidowych liposomów.
M-F Le Potier i in. (Second International Symposium on the Eradication of Aujeszky's Disease (pseudorabies) Virus August 6th to 8th 1995 Copenhagen, Denmark) i M. Monteil i in., (Les Joumees d'Animation Scientifiąue du Departament de Pathologie Animale [spotkanie naukowe zorganizowane przez oddział patologii zwierząt], INRA-ENV, Ecole Nationale Veterinaire, LYON, 13-14 grudnia 1994) próbowali szczepić świnie przeciwko chorobie wywoływanej
190 615 przez wirusa Aujeszky'ego plazmidem umożliwiającym ekspresję genu gD pod kontrolą silnego promotora, głównego późnego promotora adenowirusa typu 2. Pomimo dobrego poziomu przeciwciał powstających w odpowiedzi na to szczepienie, nie uzyskano żadnej ochrony. Obecnie, satysfakcjonujące wyniki w zakresie ochrony zanotowano po zaszczepieniu świń rekombinowanym adenowirusem, do którego włączono gen gD i ten sam promotor, co udowadnia, że sama glikoproteina gD może być wystarczająca do wywołania ochrony u świń.
We wcześniejszym stanie techniki nie ma danych o· zapewnianiu ochrony przez szczepienia polinukleotydowe.
Celem wynalazku jest dostarczenie kompozycji multiwalentnej szczepionki, która przez szczepienie świń umożliwi ochronę przeciwko wielu patogennym czynnikom wywołującym zwłaszcza choroby układu oddechowego i/lub układu rozrodczego, która zawiera różne wartościowości, oraz spełnia wszystkie wymagane kryteria wzajemnej zgodności i stabilności wartościowości. Taka kompozycja szczepionki umożliwi połączenie różnych wartościowości w tym samym nośniku i jest łatwa w użyciu i niedroga. Kompozycja szczepionki umożliwi szczepienie świń, które prowadzi do uzyskania ochrony, w tym ochrony multiwalentnej, z wysokim poziomem skuteczności i długim czasem trwania, jak również zapewni bezpieczeństwo i brak pozostałości po szczepionce.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja szczepionki dla świń, w szczególności przeciwko chorobom układu rozrodczego i/lub oddechowego świń, obejmująca przynajmniej trzy wartościowości szczepionki polinukleotydowej, z których każda obejmuje integrujący plazmid obejmujący gen jednej wartościowości patogenu świń, który wyraża go in vivo w komórce gospodarza, przy czym wartościowości te wybrane są z dwóch grup składających się z wirusa choroby Aujeszky'ego (PRV albo wirus pseudowścieklizny), wirusa grypy świń ( SIV), wirusa tajemniczej choroby świń (wirus PRRS), wirusa parwowirozy (wirus PPV), wirusa klasycznego pomoru świń (wirus HCV) i bakterii odpowiedzialnych za aktinobacillozę (A.pleuropneumoniae), a plazmidy obejmują dla każdej wartościowości, jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z gB i gD dla wirusa choroby Aujeszky'ego, HA, NP i N dla wirusa grypy świń, ORF5 (E), ORF3, ORF6 (M) dla wirusa PRRS, VP2 dla wirusa parwowirozy, i apxl, apxll i apxIII dla aktinobacillozy.
Wartościowość w kontekście niniejszego wynalazku należy rozumieć jako przynajmniej jeden antygen zapewniający ochronę przeciwko wirusowi jako rozważanemu patogenowi, i jest możliwe, że wartościowość zawiera, jako podwartościowości, jeden lub więcej zmodyfikowanych lub naturalnych genów z jednego lub więcej szczepów rozważanego patogenu.
Gen czynnika patogennego należy rozumieć nie tylko jako gen kompletny, lecz również jako różnorodne sekwencje nukleotydowe, w tym fragmenty zachowujące zdolność do wywołania odpowiedzi odpornościowej. Wyrażenie, że geny obejmują sekwencje nukleotydowe równoważne z tymi opisanymi szczegółowo w przykładach, dotyczy sekwencji różniących się, lecz kodujących to samo białko. Oznacza to również sekwencje nukleotydowe innych szczepów rozważanego patogenu, które zapewniają ochronę krzyżową albo ochronę charakterystyczną dla danego szczepu albo grupy szczepów. Oznacza również sekwencje nukleotydowe, które zostały zmodyfikowane w celu ułatwienia ekspresji in vivo w zwierzęciu będącym gospodarzem, lecz ciągle kodują to samo białko.
Korzystnie kompozycja szczepionki według wynalazku obejmuje przynajmniej wartościowości dla choroby Aujeszky'ego i grypy świń, do których mogą być dodane inne wartościowości. Korzystnie wybrane z wartościowości dla PRRS i A.pleuropneumoniae (aktinobacilloza). Inne wartościowości wybrane z wartościowości dla parwowirozy i klasycznego pomoru świń mogą być ewentualnie do nich dodane.
Możliwe są wszystkie kombinacje wartościowości. Jednak uważa się, że korzystne są wartościowości dla choroby Aujeszky'ego i grypy świń, a następnie wartościowości dla PRRS, parwowirozy i klasycznego pomoru świń.
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku wartościowości będą wybrane z wartościowości dla choroby Aujeszk/ego i grypy świń, do których dodany jest gen wirusa grypy świń HA i/lub NP lub korzystnie gen E i/lub ORF3 tajemniczej choroby świń.
190 615
Z punktu widzenia, gdy szczepienia szczególnie przeciwko chorobom układu rozrodczego świń, korzystnie wartościowości wybiera się z wartościowości dla PRRS, parwowirozy, klasycznego pomoru świń i choroby Aujeszky'ego.
W odniesieniu do wartościowości dla choroby Aujeszky'ego mogą być wykorzystane zarówno geny gB, jak i gD. Korzystnie zastosowane są oba geny, które są w tym przypadku umieszczone w różnych plazmidach lub w jednym i tym samym plazmidzie.
W odniesieniu do wartościowości dla grypy świń mogą być wykorzystane korzystnie zarówno geny HA, jak i NP. Zastosować można jeden z tych genów, albo oba geny jednocześnie umieszczone w różnych plazmidach lub w jednym i tym samym plazmidzie. Korzystnie można połączyć w tej samej szczepionce sekwencje HA z więcej niż jednego szczepu wirusa grypy, a zwłaszcza z różnych szczepów typu dzikiego. Z drugiej strony, NP zapewnia krzyżową odporność, tak więc sekwencja z jednego szczepu wirusa będzie wystarczająca.
W odniesieniu do wartościowości dla PRRS mogą być wykorzystane zarówno geny E i ORF3, albo alternatywnie geny M. Geny te można wykorzystać zarówno same jak i w kombinacji. W przypadku kombinacji geny można umieścić w różnych plazmidach lub plazmidach łączących 2 albo 3 te geny. Korzystnie w tej samej szczepionce można połączyć geny pochodzące przynajmniej z dwóch szczepów, a zwłaszcza ze szczepu europejskiego i amerykańskiego.
W odniesieniu do wartościowości dla klasycznego pomoru świń mogą być wykorzystane zarówno geny El i E2, jak i kombinacja genów El i E2 w różnych plazmidach lub w jednym i tym samym plazmidzie.
W odniesieniu do wartościowości dla zakażenia A.pleuropneumoniae można wykorzystać jeden z trzech genów opisanych powyżej, albo kombinację dwóch lub trzech tych genów umieszczonych w różnych plazmidach lub w mieszanych plazmidach w celu zapewnienia ochrony przeciwko różnym serotypom A.pleuropneumoniae. Dla antygenów apxl, II i ΙΠ, może być wskazane, aby sekwencje kodujące zostały zmodyfikowane w celu uzyskania antygenów pozbawionych zjadliwości jak szczegółowo opisano w przykładach.
Kompozycję szczepionki według wynalazku można dostarczyć w postaci dawki o objętości generalnie od 0,1 do 10 ml, a zwłaszcza od 1 do 5 ml.
Kompozycja szczepionki według wynalazku przeznaczona jest do podawania śródskórnego w strudze płynu, korzystnie wieloma strugami, w dawce o objętości od 0,1 do 0,9 ml, w szczególności od 0,2 do 0,6 ml, korzystnie od 0,4 do 0,5 ml.
Zazwyczaj dawka będzie w zakresie 10 ng - 1 mg, korzystnie między 100 ng a 500 pg, jeszcze korzystniej między 1 pg a 250 pg na dany rodzaj plazmidu.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji szczepionki według wynalazku do wytwarzania szczepionki przeznaczonej do szczepienia świń, uprzednio szczepionych pierwszą szczepionką wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szczepionkę polinukleotydowąalbo antygen zapewniający odporność krzyżową.
Korzystnie należy stosować nagie plazmidy po prostu w zaróbce do szczepionki, którą zazwyczaj będzie sól fizjologiczna (0,9% NaCl), woda destylowana, bufor TE i podobne. Mogą oczywiście zostać wykorzystane wszystkie kompozycje szczepionki polinukleotydowej wcześniej opisane w stanie techniki.
Każdy plazmid zawiera promotor zdolny do zapewnienia ekspresji włączonego genu, pod jego kontrolą w komórkach gospodarza. Zazwyczaj będzie to silny promotor eukariotyczny, a zwłaszcza wczesny promotor CMV-IE wirusa cytomegalii pochodzenia ludzkiego lub mysiego, albo ewentualnie innego pochodzenia np. od szczurów, świń albo od świnek morskich.
Bardziej ogólnie, promotor może być zarówno pochodzenia wirusowego jak i komórkowego. Jako promotor wirusowy można wymienić wczesny i późny promotor wirusa SV40 albo promotor LTR wirusa mięsaka Rous'a. Możliwy jest również promotor wirusa, z którego pochodzi gen, na przykład własny promotor genu.
Jako promotor komórkowy może być wymieniony promotor genu cytoszkieletu, taki jak na przykład promotor desminy (Bolmont i in., Journal of Submicroscopic Cytology and pathology, 1990, 22, 117-122; i Zhenlin i in., Gene, 1989, 78, 243-254), albo alternatywnie promotor aktyny.
190 615
Gdy kilka genów jest prezentowanych w tym samym plazmidzie, mogą być prezentowane w tej samej jednostce transkrypcyjnej lub w dwóch różnych.
Kombinacja różnych wartościowości szczepionki według wynalazku może być korzystnie uzyskana przez zmieszanie plazmidów polinukleotydowych wyrażających antygen(y) każdej wartościowości, lecz jest również możliwe osiągnięcie tego, że antygeny o wielu wartościowościach wywołujące odpowiedź odpornościową są wyrażane w tym samym plazmidzie. Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka dla świń, zawierająca plazmid obejmujący gen wirusa choroby Aujeszky'ego, wybrany z grupy składającej się z gB i gD, przy czym korzystnie plazmid zawiera oba geny, gB i gD, korzystniej plazmid zawiera gen gB, bardziej korzystnie plazmid zawiera gen gD, jeszcze korzystnie szczepionka zawiera plazmid zawierający gen gB i plazmid zawierający gen gD. Szczepionka dla świń zawierająca plazmid obejmujący gen wirusa PRRS, wybrany z grupy składającej się z E, ORF3 i M wchodzi również w zakres wynalazku. W korzystnym wykonaniu wynalazku plazmid zawiera gen E, korzystniej plazmid zawiera gen ORF3, korzystnie plazmid zawiera gen M, jeszcze korzystniej szczepionka zawiera plazmid zawierający gen PRRS i drugi plazmid z genem PRRS, przy czym geny PRRS są wybrane z grupy składającej się z E, ORF3 i M.
Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka dla świń, która zawiera plazmid obejmujący gen wirusa klasycznego pomoru świń, wybrany z grupy składającej się z El i E2. W korzystnym wykonaniu wynalazku plazmid zawiera gen El lub gen E2 lub plazmid zawiera oba geny El i E2. Szczepionka według wynalazku korzystnie zawiera plazmid zawierający gen El i plazmid zawierający gen E2.
Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka, która zawiera plazmid zawierający gen z A.pleuropneumoniae wybrany z grupy składającej się z apxl, apxll i apxIII. W korzystnym wykonaniu wynalazku szczepionka zawiera dwa lub trzy wymienione geny, korzystnie zawiera dwa lub trzy różne plazmidy, z których każdy zawiera gen z A.pleuropneumoniae.
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku szczepionka według wynalazku obejmuje plazmid, który zawiera wczesny promotor CMV-IE cytomegalowirusa.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie plazmidu zawierającego VP2 z parwowirusa do wytwarzania szczepionki dla świń skutecznej przeciwko świńskiej parwowirozie. W korzystnym wykonaniu wynalazku plazmid zawiera wczesny promotor CMY-IE cytomegalowirusa.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie jednego lub więcej plazmidów według wynalazku do wytwarzania szczepionki do szczepienia świń, których pierwsze szczepienie przeprowadzono wykorzystując standardową szczepionkę (monowalentną albo multiwalentną) opartą na wcześniejszym stanie techniki, w szczególności wybraną, z grupy składającej się z żywej pełnej szczepionki, inaktywowanej pełnej szczepionki, podjednostkowej szczepionki, rekombinowanej szczepionki, ta pierwsza szczepionka posiada (to znaczy zawiera łub jest zdolna do ekspresji) antygen(y) kodowany przez plazmid lub antygen(y) zapewniający odporność krzyżową. Warte odnotowania jest, że szczepionka polinukleotydowa posiada potencjalne działanie dawki przypominającej, co powoduje spotęgowanie odpowiedzi immunologicznej i nabycie długotrwałej odporności.
Ogólnie, szczepionka służąca do pierwszego szczepienia może być wybrana ze szczepionek różnych producentów szczepionek weterynaryjnych dostępnych na rynku.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do szczepień łączący razem kompozycję szczepionki według wynalazku i pierwszą szczepionkę wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szczepionkę polinukleotydową albo antygen zapewniający odporność krzyżową, a zestaw jest przeznaczony do podawania tej pierwszej szczepionki podczas pierwszego szczepienia lub kompozycji szczepionki podczas szczepienia przypominającego.
W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja szczepionki według wynalazku z dołączoną instrukcją obsługi wskazującą, że tę kompozycję można zastosować jako szczepionkę przypominającą dla pierwszej szczepionki wybranej z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę
190 615 rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez plazmid albo antygen zapewniający odporność krzyżową.
Kompozycje szczepionki i zestaw do szczepienia według wynalazku jest przeznaczony do szczepienia świń przeciwko chorobom układu rozrodczego i/lub układu oddechowego, które obejmuje podawanie skutecznej kompozycji szczepionki opisanej powyżej. Szczepienie to obejmuje podawanie jednej lub więcej dawek kompozycji szczepionki, przy czym jest możliwe podawanie tych dawek kolejno w krótkich odstępach czasu i/lub kolejno w długich odstępach czasu.
Kompozycje szczepionki według wynalazku mogą być podawane w celu szczepienia, innymi sposobami opisanymi we wcześniejszym stanie techniki dla szczepionek polinukleotydowych albo znanymi technikami podawania.
Możliwe jest szczepienie zwłaszcza śródskórną drogą podawania z użyciem przyrządu do wtryskiwania płynu, korzystnie o wielu strumieniach, wtryskiwacza do wstrzyknięć, a zwłaszcza wtryskiwacza do wstrzyknięć z główką do wstrzyknięć o wielu jamach lub o wielu końcówkach wylotowych, szczególnie posiadającego od 5 do 6 jam lub końcówek wylotowych, takiego jak przyrząd Pigjet produkowany i rozprowadzany przez zakład Endoscoptic, Laons, France.
Objętość dawki dla takich przyrządów jest korzystnie zmniejszona do zakresu od 0,1 do 0,9 ml, a zwłaszcza od 0,2 do 0,6 ml i korzystnie do zakresu między 0,4 a 0,5 ml i będzie możliwe podawanie tej objętości w jednym lub wielu wstrzyknięciach, korzystnie w dwu wstrzyknięciach.
Wynalazek teraz zostanie opisany bardziej szczegółowo przez wykonania wynalazku podane w odniesieniu do towarzyszących rysunków.
Lista figur
Figura nr 1: Plazmid pVR1012
Figura nr 2: Sekwencja genu gB PRV (szczep NIA3)
Figura nr 3: Konstrukcja plazmidu pAB090
Figura nr 4: Sekwencja genu gD PRV (szczep NIA3)
Figura nr 5: Konstrukcja plazmidu pPB098
Figura nr 6: Sekwencja genu HA grypy świń (szczep H1N1)
Figura nr 7: Konstrukcja plazmidu pPB143
Figura nr 8: Sekwencja genu NP grypy świń (szczep H1N1)
Figura nr 9: Konstrukcja plazmidu pPB42
Figura nr 10: Sekwencja genu HA grypy świń (szczep H3N2)
Figura nr 11: Konstrukcja plazmidu pPB144
Figura nr 12: Sekwencja genu NP grypy świń (szczep H3N2)
Figura nr 13: Konstrukcja plazmidu pPB132
Figura nr 14: Plazmid pAB025
Figura nr 15: Plazmid pAB001
Figura nr 16: Plazmid pAB091
Figura nr 17: Plazmid pAB092
Figura nr 18: Plazmid pAB004
Figura nr 19: Plazmid pAB069
Figura nr 20: Plazmid pAB061
Figura nr 21: Plazmid pPB 162
Figura nr 22: Plazmid pPB 163
Figura nr 23: Plazmid pPB174'
Figura nr 24: Plazmid pPB 189
Figura nr 25: Plazmid pPB 190
Lista sekwencji Id. Sekw. nr :
Id. Sekw. nr 1: Sekwencja genu gB PRV (szczep NIA3)
Id. Sekw. nr 2: oligonukleotyd AB166
Id. Sekw. nr 3: oligonukleotyd AB167
Id. Sekw nr 4: oligonukleotyd AB168
Id. Sekw. nr 5: oligonukleotyd AB169
Id. Sekw. nr 6: Sekwencja genu gD PRY (szczep NIA3)
190 615
Id. Sekw. nr 7: oligonukleotyd PB101 Id. Sekw. nr 8: oligonukleotyd PB102 Id. Sekw. nr 9: oligonukleotyd PB107
Id. Sekw. nr 1C Id. Sekw. nr 11 Id. Sekw. nr 12 Id. Sekw. nr 13 Id. Sekw. nr 14 Id. Sekw. nr 15 Id. Sekw. nr 16 Id. Sekw. nr 17 Id. Sekw. nr 18 Id. Sekw. nr 19 Id. Sekw. nr 20 Id. Sekw. nr 21 Id. Sekw. nr 22 Id. Sekw. nr 23 Id. Sekw. nr 24 Id. Sekw. nr 25 Id. Sekw. nr 26 Id. Sekw. nr 27 Id. Sekw. nr 28 Id. Sekw. nr 29 Id. Sekw. nr 30 Id. Sekw. nr 31 Id. Sekw. nr 32 Id. Sekw. nr 33 Id. Sekw. nr 34 Id. Sekw. nr 35 Id. Sekw. nr 36 Id. Sekw. nr 37 Id. Sekw. nr 38 Id. Sekw. nr 39 Id. Sekw. nr 40 Id. Sekw. nr 41 Id. Sekw. nr 42 Id. Sekw. nr 43 Id. Sekw. nr 44 Id. Sekw. nr 45 Id. Sekw. nr 46 Id. Sekw. nr 47 Id. Sekw. nr 48 Przykłady Przykład 1 oligonukleotyd PB108
Sekwencja genu HA grypy świń (szczep H1N1) oligonukleotyd PB097 oligonukleotyd PB098
Sekwencja genu NP grypy świń (szczep H1N1) oligonukleotyd PB095 oligonukleotyd PB096
Sekwencja genu HA grypy świń (szczep H3N2) Sekwencja genu NP grypy świń (szczep H3N2) oligonukleotyd AB055 oligonukleotyd AB056 oligonukleotyd AB001 oligonukleotyd AB002 oligonukleotyd AB170 oligonukleotyd AB171 oligonukleotyd AB172 oligonukleotyd AB173 oligonukleotyd AB007 oligonukleotyd AB010 oligonukleotyd AB126 oligonukleotyd AB127 oligonukleotyd AB 118 oligonukleotyd AB119 oligonukleotyd PB174 oligonukleotyd PB189 oligonukleotyd PB190 oligonukleotyd PB175 oligonukleotyd PB176 oligonukleotyd PB191 oligonukleotyd PB 192 oligonukleotyd PB177 oligonukleotyd PB278 oligonukleotyd PB279 oligonukleotyd PB280 oligonukleotyd PB307 oligonukleotyd PB303 oligonukleotyd PB306 oligonukleotyd PB304 oligonukleotyd PB305
Hodowla wirusa
Wirusy hoduje się w odpowiednim układzie komórkowym, do uzyskania efektu cytopatycznego. Układy komórkowe do zastosowania dla każdego z wirusów są znane specjalistom. Pokrótce, komórki wrażliwe na wirusa, które hoduje się w minimalnej niezbędnej pożywce Eagle'a (MEM) albo inne odpowiedniej pożywce, zakaża się badanym szczepem wirusa stosując wielokrotność zakażenia równą 1. Zakażone komórki inkubuje się w 37°C przez okres czasu niezbędny do wystąpienia całkowitego efektu cytopatycznego (średnio 36 godzin).
Przykład 2
Hodowla bakterii i ekstrakcja bakteryjnego DNA
Szczepy Actinobacillus pleuropneumoniae hodowano w sposób opisany przez A. Rucroft i in., (J. Gen. Microbiol., 1991, 137, 561-568). DNA o wysokim ciężarze cząsteczko10
190 615 wym (DNA chromosomalne) przygotowywano według klasycznych technik opisanych przez J. Sambrook i in., (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Przykład 3
Ekstrakcja wirusowych genomowych DNA
Po hodowli, nadsącz i rozłożone komórki zbiera się i całą zawiesinę wirusa wiruje się przy 1000 g przez 10 minut w 4°C w celu usunięcia resztek komórkowych. Cząstki wirusa zbiera się przez ultrawirowanie przy 400000 g przez godzinę w 4°C. Osad pobiera się w minimalnej objętości bufora (10 mM Tris, 1 mM EDTA) . Tę zatężoną zawiesinę wirusa trkktuje się proteinia^ąK (100 pg/ml objętości końcowej) w obecności soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS) (0,5%) przez 2 godziny w 37°C. Wirusowy DNA ekstrahuje się mieszaniną fenol/chloroform i precypituje 2 objętościami absolutnego etanolu. Po pozostawieniu przez noc w -20°C, DNA wiruje się przy 10000 g przez 15 minut w 4°C. Osad DNA suszy się i pobiera w minimalnej objętości sterylnej, ultraczystej wody. Następnie można go trawić enzymami restrykcyjnymi.
Przykład 4
Izolacja wirusowych genomowych RNA
Wirusy RNA oczyszczono według technik znanych specjalistom. Następnie, genomowy wirusowy RNA. każdego z wirusów izolowano stosując technikę ekstrakcji „rodankiem guanidyny/fenol-chloroform” opisaną przez Chomczyński i Sacchi (Anal. Biochem., 1987,162: 156-159).
Przykład 5
Techniki biologii molekularnej
Wszystkie konstrukcje plazmidów przeprowadzono stosując standardowe techniki biologii molekularnej, opisane przez Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne zastosowane do wynalazku wyizolowano stosując zestaw „Geneclean” (BIO 101 Inc., LaJolla, CA).
Przykład 6
Technika RT-PCR
Swoiste oHgonukleotydy (obejmujące miejsca restrykcyjne na końcach 5' w celu ułatwienia klonowania amplifikowanych fragmentów) syntetyzowano w taki sposób, że pokrywały w całości regiony kodujące genów, które miały być amplifikowane (patrz, konkretne przykłady). Reakcję odwrotnej transkrypcji (RT) i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przeprowadzono technikami standardowymi (Sambrook i in., 1989). Każdą z reakcji RT-PCR przeprowadzono z parą swoistych starterów amplifikacji z ekstrahowanym genomowym wirusowym RNA jako matrycą. Amplifikowany komplementarny DNA ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1), po czym trawiono enzymami restrykcyjnymi.
Przykład 7
Plazmid pVR1012
Plazmid pVR1012 (fig. 1) otrzymano z Vical Inc., San Diego, CA, USA. Jego konstrukcję opisano w Hartikka i in. (Human Gene Therapy, 1996, 7:1205-1217).
Przykład 8
Konstruowanie plazmidu pAB090 (gen gB PRV)
Plazmid pPR2.15 (Riviere i in., J. Virol., 1992, 66:3424-3434) trawiono ApaI i NaeI w celu uwolnienia fragmentu 2665 bp ApaI-NaeI (fragment A) zawierającego gen kodujący glikoproteinę gB wirusa choroby Aujeszky'ego (szczep NIA3) (fig. 2 i Id. Sekw. nr 1).
Przez hybrydyzowanie następujących 2 oligonukleotydów:
AB166 (33-mer) (Id. Sekw. nr 2)
5'GATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGGCC3'
AB167 (33-mer) (Id. Sekw. nr 3)
5'ACGTCTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC3' rekonstruowano fragment 33 bp zawierający sekwencję genu gD od początkowego kodonu ATG do miejsca ApaI, z wytworzeniem miejsca PstI na końcu 5' (fragment B).
Przez hybrydyzowanie następujących 2 oligonukleotydów:
AB 168 (45-mer) (Id. Sekw. nr 4)
190 615
5'GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTGTCGG3'
AB169 (49-mer) (Id. Sekw. nr 5)
5'GATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTCGAGGCGCTGGTAGTGCC3' rekonstruowano fragment 45 bp zawierający sekwencję genu gD, od miejsca Nael do kodonu stop, z wytworzeniem miejsca BamHI na końcu 3' (fragment C).
Fragmenty A, B i C poddano ligacji ze sobą w wektorze pVR1012 (przykład 7), uprzednio trawionym Pstl i BamHI, otrzymując plazmid pAB090. (7603 bp) (fig. 3).
Przykład 9
Konstruowanie plazmidu pAB098 (gen gD PRV)
Plazmid pPR29 (Riviere i in., J. Virol., 1992, 66:3424-3434) trawiono SalI i BglII w celu uwolnienia fragmentu 711 bp SalI-BglII (fragment A) zawierającego koniec 3' genu kodującego glikoproteinę gD wirusa choroby Aujeszky'ego (szczep NIA3) (fig. 4 i Id. Sekw. nr 6).
Plazmid pPR29 trawiono Eco47III i SalI w celu uwolnienia fragmentu 498 bp Eco47III-SalI zawierającego koniec 5' genu kodującego glikoproteinę gD wirusa choroby Aujeszky'ego (szczep NIA3) (fragment B).
Przez hybrydyzowanie następujących 2 oligonukleotydów:
PB 101 (15-mer) (Id. Sekw. nr 7)
5'GATGCTGCTCGCAGC3'
PB 102 (19-mer) (Id. Sekw. nr 8)
5'GCTGCGAGCAGCATCTGCA3' rekonstruowano fragment 15 bp zawierający sekwencję 5' genu gD od początkowego kodonu ATG do miejsca Eco47III, z wytworzeniem miejsca PstI na końcu 5' (fragment C).
Po oczyszczeniu, Fragmenty A, B i C poddano ligacji razem do wektora pVR1012 (przykład 7), trawionego uprzednio PstI i BglII, otrzymując plazmid pPB098 (6076 bp) (fig. 5).
Przykład 10
Konstrukcja plazmidu pBP143 (gen HA wirusa grypy świń, szczep H1N1)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa grypy świń (SIV, szczep „SW” H1N1) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
Pb 107 (32-mer) (Id. Sekw. nr 9)
5'GTTCTGCAGCACCCGGGAGCAAAAGCAGGGGA3'
PB 108 (33-mer) (Id. Sekw. nr 10)
5'ATTGCGGCCGCTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTT 3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen kodujący białko HA z SIV H2N1 (fig. nr 6 i Id. Sekw. nr 11) w postaci fragmentu PCR o wielkości 1803 bp. Po oczyszczeniu, produkt fragment ten poddano ligacji z wektorem PCRII-direct (Invitrogen odnośnik K2000-01) otrzymując wektor pPB137 (5755 bp). Wektor pPB137 trawiono EcoRV i NotI w celu uwolnienia fragmentu EcoRV-NotI o wielkości 1820 bp zawierającego gen HA. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio EcoRV i NotI, otrzymując plazmid pPB143 (6726 bp) (fig. 7).
Przykład 11
Konstrukcja plazmidu pBP142 (gen NP wirusa grypy świń, szczep H1N1)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa grypy świń (SIV, szczep „SW” H1N1) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
PB097 (36-mer) (Id. Sekw. nr 12)
5' CCGGTCGACCGGGATAATCACTGACTGAGTGACATC3'
PB098 (33-mer) (Id. Sekw. nr 13)
5' IGXCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen kodujący białko NP z SIV H2N1 (fig. nr 8 i Id. Sekw. nr 14) w postaci fragmentu SalI-NotI. Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT o wielkości 1566 bp poddano ligacji z wektorem PCRII-direct (Invitrogen odnośnik K2000-01) otrzymując wektor pPB 127 (5519 bp).
190 615
Wektor pPB127 trawiono SalI i NotI w celu uwolnienia fragmentu SalI-NotI o wielkości 1560 bp zawierającego gen NP. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio SalI i Notl, otrzymując plazmid pPB142 (6451 bp) (fig. 9).
Przykład 12
Konstrukcja plazmidu pBP144 (gen HA wirusa grypy świń, szczep H3N2)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa grypy świń (szczep SIV, H3N2 Cotes do Nord 1987) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
PB095 (31-mer) (Id. Sekw. nr 15)
5'GTTCTGCAGGCAGGGGATAATTCTATCAACC3'
PB096 (36-mer) (Id. Sekw. nr 16)
5'TTGCGGCCGCAAGGGTGTTTTTAATTACTAATATAC3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen kodujący białko HA z SIV H3N2 (fig. 10 i Id. Sekw. nr 17) w postaci fragmentu PstI-Notl. Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT o wielkości 1765 bp poddano ligacji z wektorem PCRU-direct (Invitrogen odnośnik K2000-01) otrzymując wektor pPB 120 (5716 bp).
Wektor pPB120 trawiono NotI w celu uwolnienia fragmentu NotI-NotI zawierającego gen HA. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio NotI, otrzymując plazmid pPB144 (6712 bp) zawierający gen HA H3N2 w prawidłowej orientacji w stosunku do promotora (fig. 11).
Przykład 13
Konstrukcja plazmidu pBP132 (gen NP wirusa grypy świń, szczep H3N2)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa grypy świń (szczep SIV, H3N2 Cotes do Nord 1987) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
PB097 (36-mer) (Id. Sekw. nr 12)
5' CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC3'
PB098 (33-mer) (Id. Sekw. nr 13)
5' rrGCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTArrTTTCT3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen kodujący białko NP z SIV H3N2 (fig. 12 i Id. Sekw. nr 18) w postaci fragmentu SalI-NotI. Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT o wielkości 1564 bp poddano ligacji z wektorem PCRU-direct (Invitrogen odnośnik K2000-01) otrzymując wektor pPB 123 (5485 bp).
Wektor pPB123 trawiono SalI i NotI w celu uwolnienia fragmentu SalI-NotI zawierającego gen NP. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio SalI i NotI, otrzymując plazmid pPB132 (6449 bp) (fig. 13).
Przykład 14
Konstrukcja plazmidu pAB025 (gen ORF5 PRRSV, szczep Lelystad)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa PRRSV (szczep Lelystad) (J.Meulenberg i in.,Virology, 1993, 19, 62-72) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
AB055 (34-mer) (Id. Sekw. nr 19)
5'ACGCGTCCACAATATGAGATGTTCTCACAAATTG3'
AB056 (33-mer) (Id. Sekw. nr 20)
5'CGCGGATCCCGTCTAGGCCTCCCATTGCTCAGC3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen „ORF5” kodujący glikoproteinę otoczkową E (gp25) wirusa PRRS, szczep Lelystad. Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT o wielkości 630 bp poddano trawieniu SalI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu SalI-BamHI o wielkości 617 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio SalI i BamHI, otrzymując plazmid pAB025 (5486 bp) (fig. 14).
Przykład 15
Konstrukcja plazmidu pAB001 (gen ORF5 PRRSV, szczep USA)
Reakcję RT-PCR techniką. według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa PRRSV (szczep ATCC VR2332) (M. Murtaugh i in., Arch. Virol., 1995, 140, 1451-1460) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
190 615
AB001 (30-mer) (Id. Sekw. nr 21)
5'AACTGCAGATGTTGGAGAAATGCTTGACCG3'
AB002 (30-mer) (Id. Sekw. nr 22)
5'CGGGATCCCTAAGGACGACCCCATTGTTCC3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen „ORF5” kodujący glikoproteinę otoczkową E („gp25”) wirusa pRrS, szczep ATCC-VR2332. Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT o wielkości 620 bp poddano trawieniu PstI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu PstI-BamHI o wielkości 606 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio PstI i BamHI, otrzymując plazmid pAB001 (5463 bp) (fig. 15).
Przykład 16
Konstrukcja plazmidu pAB091 (gen ORF3 PRRSV, szczep Lelystad)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa PRRSV (szczep Lelystad) (J. Meulenberg i in., Virology, 1993, 19, 62-72) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
AB 170 (32-mer) (Id. Sekw. nr 23)
5AAACTGCAGCAATGGCTCATCAGTGTGCACGC3'
AB 171 (30-mer) (Id. Sekw. nr 24)
5'CGCGGATCCTTATCGTGATGTACTGGGGAG3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen „ORF3” kodujący glikoproteinę otoczkową E „gp45” wirusa PRRS, szczep Lelystad. Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT o wielkości 818 bp poddano trawieniu PstI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu PstI-BamHI o wielkości 802 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawionym uprzednio PstI i BamHI, otrzymując plazmid pAB091 (5660 bp) (fig. 16).
Przykład 17
Konstrukcja plazmidu pAB092 (gen ORF3 PRRSV, szczep USA)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa PRRSV (szczep ATCC-VR2332)(M. Murtaugh i in., Arch. Virol., 1995, 140, 14-51-1460) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
AB 172 (32-mer) (id. Sekw. nr 25)
5'AAACTGCAGCAATGGTTAATAGCTGTACATTC3'
AB 173 (32-mer) (Id. Sekw. nr 26)
5'CGCGGATC.CCTATCGCCGjTACGGCACTGAGGG3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen „ORF3” kodujący glikoproteinę otoczkową E „gp45” wirusa PRRS, szczep ATCC-VR2332. Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT o wielkości 785 bp poddano trawieniu PstI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu PstI-BamHI o wielkości 769 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio PstI i BamHI, otrzymując plazmid pAB092 (5627 bp) (fig. 17).
Przykład 18
Konstrukcja plazmidu pAB004 (gen VP2 parwowirusa świń)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA parwowirusa świń (szczep NADL2) (J. Vasudevacharya i in., Virology, 1990, 178, 611-616) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
AB007 (33-mer) (Id. Sekw. nr 27)
5'AAAACTGCAGAATGAGTGAAAATCTCCAACAAC3'
AB010 (33-mer) (Id. Sekw. nr 28)
5'CCCCGATCCCTACTATAATTTTCTTCCTAJAAC3' w taki sposób, że precyzyjnie amplifikować fragment zawierający gen kodujący białko VP2 parwowirusa. Po oczyszczeniu, produkt PCR-RT poddano trawieniu PstI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu PstI-BamHI o wielkości 1740 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio PstI i BamHI, otrzymując plazmid pAB004 (6601 bp) (fig. 18).
190 615
Przykład 19
Konstrukcja plazmidu pAB069 (gen E1 wirusa klasycznego pomoru świń HCV)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa klasycznego pomoru świń (HCV) (szczep Alfort) (G. Meyers i in., Virology, 1989, 171, 18-27) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
AB 126 (36-mer) (Id. Sekw. nr 29)
5'ACGCGTCGACATGAAACTAGAAAAAGCCCTGTTGGC3'
AB127 (34-mer) (Id. Sekw. nr 30)
5'CGCGGATCCTCATAGCCGCCCTTGTGCCCCGGTC3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen kodujący białko El wirusa HCV w postaci fragmentu RT-PCR o wielkości 1363 bp. Po oczyszczeniu ten fragment poddano trawieniu Sali i BamHI w celu uwolnienia fragmentu Sall-BamHI o wielkości 1349 bp.
Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawionym uprzednio SalI i BamHI, otrzymując plazmid pAB069 (6218 bp) (fig. 19).
Przykład 20
Konstrukcja plazmidu pAB061 (gen E2 wirusa klasycznego pomoru świń HCV)
Reakcję RT-PCR techniką według przykładu 6 przeprowadzono z genomowym RNA wirusa klasycznego pomoru świń (HCV) (szczep Alfort) (G. Meyers i in., Virology, 1989, 171, 18-27) wytworzonym techniką według przykładu 4 z następującymi oligonukleotydami:
ABH8 (36-mer) (Id. Sekw. nr 31)
5'ACGCGTCGACATGTCAACTACTGCGTTTCTCATTTG3'
AB119 (33-mer) (Id. Sekw. nr 32)
5'CGCGGATCCTCACTGTAGACCAGCAGCGAGCTG3' w taki sposób, że precyzyjnie izolowano gen kodujący białko E2 wirusa HCV w postaci fragmentu RT-PCR o wielkości 1246 bp. Po oczyszczeniu ten fragment poddano trawieniu SalI i BamHI w celu uwolnienia fragmentu SalI-BamHI o wielkości 1232 bp. Fragment ten następnie poddano ligacji z wektorem pVR1012 (przykład 7), trawiony uprzednio SalI i BamHI, otrzymując plazmid pAB061 (6101 bp) (fig. 20).
Przykład 2i
Konstruowanie plazmidu pBP162 ( wydeletowany gen apxl Actinobacillus pleuropneumoniae)
Gen apxl Actinobacillus pleuropneumoniae klonowano w taki sposób, że usunięto bogaty w glicynę region aminokwasowy (związany z wiązaniem jonu wapnia), który znajdował się pomiędzy aminokwasami 719 i 846.
Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 1) (Frey i in., Infect. Immun., 1991, 59:3026-3032), wytworzonego według techniki opisanej w przykładach 2 i 3, oraz poniższych oligonukleotydów:
PB 174 (32-mer) (Id. Sekw. nr 33)
5'TTGTCGACGTAAATAGCTAAGGAGACAACATG3'
PB 189 (29-mer) (Id. Sekw. nr 34) 'TTGAATTCTTCTTCAACAGAATGTAATTC3' w taki sposób, że amplifikowano część 5' genu apxl kodującego białko hemolizyny I Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu SalI-EcoRI. Po oczyszczaniu, pro dukt wielkości 2193 bp trawiono SalI i EcoRI w celu wyizolowania fragmentu 2183 bp SalI-EcoRI (fragment A).
Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 1) (Frey i in., Infect. Immun., 1991, 59:3026-3032) oraz poniższych oligonukleotydów:
BP 190 (32-mer) (Id. Sekw. nr 35) 'TTGAATTCTATCGCTACAGTAAGGAGTACGG3'
PB 175 (31-mer) (Id. Sekw. nr 36)
5'TTGGATCCGCTATTTATCATCTAAAAATAAC3' w taki sposób, że amplifikowano część 3' genu apxl kodującego białko hemolizyny I Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu EcoRI-BamHI. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 576 bp trawiono BamHI i EcoRI w celu wyizolowania fragmentu 566 bp EcoRI190 615
-BamHI (fragment B). Fragmenty A i B poddano ligacji ze sobą w wektorze pVR1012 (przykład 7), uprzednio trawionym Sali i BamHI, otrzymując plazmid pPB162 (7619 bp) (fig. 21).
Przykład 2 2
Konstruowanie plazmidu pBP163 (poddany delecji gen apxll Actinobacillus pleuropneumoniae)
Gen apxll Actinobacillus pleuropneumoniae klonowano w taki sposób, że usunięto bogaty w glicynę region aminokwasowy (związany z wiązaniem jonu wapnia), który znajdował się pomiędzy aminokwasami 716 i 813.
Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 9) (Smits i in., Infect. Immun., 1991, 59:4497-4504), wytworzonego według techniki opisanej w przykładach 2 i 3, oraz poniższych oligonukleotydów:
PB 176 (31-mer) (Id. Sekw. nr 37)
5'TTGTCGACGATCAATTATATAAAGGAGACTC3'
PB 191 (30-mer) (Id. Sekw. nr 38)
5'TTGAATTCCTCTTCAACTGATTTGAGTGAG3' w taki sposób, że amplifikowano część 5' genu apxll kodującego białko hemolizyny II Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu Sall-EcoRI. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 2190 bp trawiono Sali i EcoRI w celu wyizolowania fragmentu 2180 bp Sall-EcoRI (fragment A).
Reakcję PGR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 9) (Smits i in., Infect. Immun., 1991, 59:4497-4504) oraz poniższych oligonukleotydów:
PB 192 (29-mer) (Id. Sekw. nr 39)
5'TTGAATTCGTAAATCTTAAAGACCTCACC3'
PB 177 (30-mer) (Id. Sekw. nr 40)
5'TTGGATCCACCATAGGATTGCTATGATTG3' w taki sposób, że amplifikowano część 3' genu apxll kodującego białko hemolizyny II Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu EcoRI-BamHI. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 473 bp trawiono BamHI i EcoRI w celu wyizolowania fragmentu 463 bp EcoRI-BamHI (fragment B).
Fragmenty A i B poddano ligacji ze sobą w wektorze pVR1012 (przykład 7), uprzednio trawionym Sali i BamHI, otrzymując plazmid pPB163 (7513 bp) (fig. 22).
Przykład 23
Konstruowanie plazmidów pBP174', pPB189 i pPB190 (poddany delecji gen apxIII Actinobacillus pleuropneumoniae)
Pierwszy przykład delecji w ΑχΙΠ (plazmid pPB174')
Gen apxIII Actinobacillus pleuropneumoniae klonowano w taki sposób, że usunięto bogaty w glicynę region aminokwasowy (związany z wiązaniem jonu wapnia), który znajdował się pomiędzy aminokwasem 733 i 860.
Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 8) (Smits 1992, GenBank, nr dostępu Χ68815), wytworzonego według techniki opisanej w przykładach 2 i 3, oraz poniższych oligonukleotydów:
PB278 (30-mer) (Id. Sekw. nr 41)
5' TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG3'
PB279 (28-mer) (Id. Sekw. nr 42)
5'T^ATCGATTCTHCTACTGAA.TGTAATTC3' w taki sposób, że amplifikowano część 5' genu apxIH kodującego białko hemolizyny ΙΠ Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu Sall-Clal. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 2216 bp trawiono Sali i Ciał w celu wyizolowania fragmentu 2205 bp Sall-Clal (fragment A).
Reakcję PGR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 8) (Smits 1992, GenBank, nr dostępu Χ68815) oraz poniższych oligonukleotydów:
PB280 (3 3-mer) (Id. Sekw. nr 43)
5'TTTATCGATTTATGTTTATCGTTCCACTTCAGG3'
PB 3 07 (32-mer) (Id. Sekw. nr 44)
5TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGATAGGTTACC3'
190 615 w taki sposób, że amplifikowano część 3' genu apxIII kodującego białko hemolizyny III Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu Clal-BamHI. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 596 bp trawiono BamHI i Clall w celu wyizolowania fragmentu 583 bp Clal-BamHI (fragment B).
Fragmenty A i B poddano ligacji ze sobą w wektorze pVR1012 (przykład 7), uprzednio trawionym SalI i BamHI, otrzymując plazmid pPB174' (7658 bp) (fig. 23).
Drugi przykład delecji w ApxIII (plazmid pPB189)
Gen apxIII Actinobacillus pleuropneumoniae klonowano w taki sposób, że usunięto bogaty w glicynę region aminokwasowy (związany z wiązaniem jonu wapnia), który znajdował się pomiędzy aminokwasami 705 i 866.
Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 8) (Smits 1992, GenBank, nr dostępu Χ8815), wytworzonego według techniki opisanej w przykładach 2 i 3, oraz poniższych oligonuklcotydów:
PB278 (30-mer) (Id. Sekw. nr 41)
5'TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG3'
PB303 (32-mer) (Id. Sekw. nr 45)
5'TTTATCGATTTCTTCACGTTTACCAACAGCAG3' w taki sposób, że amplifikowano część 5' genu apxIII kodującego białko hemolizyny III Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu SalI-ClaI. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 2133 bp trawiono SalI i Ciał w celu wyizolowania fragmentu 2122 bp SalI-ClaI (fragment A).
Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 8) (Smits 1992, GenBank, nr dostępu Χ68815) oraz poniższych oligonukleotydów:
PB306 (31-mer) (Id. Sekw. nr 46)
5TTTATCGATTCTGATTTTTCCTTCGATCGTC3'
PB307 (32-mer) (Id. Sekw. nr 44)
5'TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGATAGGTTACC3' w taki sposób, że amplifikowano część 3' genu apxDI kodującego białko hemolizyny III Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu Clal-BamHI. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 518 bp trawiono BamHI i EcoRI w celu wyizolowania fragmentu 506 bp Clal-BamHI (fragment B).
Fragmenty A i B poddano ligacji ze sobą w wektorze pVR1012 (przykład 7), uprzednio trawionym SalI i BamHI, otrzymując plazmid pPB189 (7496 bp) (fig. 24).
Trzeci przykład delecji w ApxIII (plazmid pPB190)
Gen apxIII Actinobacillus pleuropneumoniae klonowano w taki sposób, że usunięto bogaty w glicynę region aminokwasowy (związany z wiązaniem jonu wapnia), który znajdował się pomiędzy aminokwasami 718 i 876.
Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 8) (Smits 1992, GenBank, nr dostępu Χ68815), wytworzonego według techniki opisanej w przykładach 2 i 3, oraz poniższych oligonukleotydów:
PB278 (30-mer) (Id. Sekw. nr 41)
5' TITGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATGS'
PB304 (33-mer) (Id. Sekw. nr 47)
5' T'TTATCGATACCTGATTGCGTTAATTCATAATC3' w taki sposób, że amplifikowano część 5' genu apxIII kodującego białko hemolizyny III Actinobacillus pleuropneumoniae, w postaci fragmentu SalI-ClaI. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 2172 bp trawiono SalI i CiaI w celu wyizolowania fragmentu 2161 bp SalI-ClaI (fragment A).
Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego DNA Actinobacillus pleuropneumoniae (serotyp 8) (Smits 1992, GenBank, nr dostępu Χ68815) oraz poniższych oligonukleotydów:
PB305 (31-mer) (Id. Sekw. nr 48)
5' TTTATCGATAAATCTAGTGATTTAGATAAAC3'
PB307 (32-mer) (Id. Sekw. nr 44)
190 615
5'TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGATAGGTTACC3' w taki sposób, że amplifikowano część 3' genu apxIII kodującego białko hemolizyny III Actinobacillue pleuropneumoniae, w postaci fragmentu Clai-BamHI. Po oczyszczaniu, produkt wielkości 548 bp trawiono BamHI i EcoRI w celu wyizolowania fragmentu 536 bp Clal-BamHI (fragment B).
Fragmenty A i B poddano ligacji ze sobą w wektorze pVR1012 (przykład 7), uprzednio trawionym SalI i BamHI, otrzymując plazmid pPB190 (7565 bp) (fig. 25).
Przykład 24
Wytwarzanie i oczyszczanie plazmidów
Do wytwarzania plazmidów przeznaczonych do szczepienia zwierząt, można zastosować dowolną technikę, która umożliwia otrzymanie zawiesiny oczyszczonych plazmidów, głównie w postaci super-skręconej. Techniki te znane są specjalistom. W szczególności można wymienić technikę lizy alkalicznej, a następnie dwa kolejne ultrawirowania na gradiencie chlorku cezu, w obecności bromku etydyny, jak to opisano w Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Można również powołać zgłoszenie patentowe PCT WO 95/21250 i PCT WO 96/02658 opisujące metodę wytwarzania, na skalę przemysłową, plazmidów, które można zastosować do szczepienia. W celu wytwarzania szczepionek (patrz, przykład 17), oczyszczone plazmidy zawiesza się w celu otrzymania zawiesin o wysokim stężeniu (> 2 mg/ml), które są możliwe do przechowywania. W tym celu, plazmidy zawiesza się w ultraczystej wodzie albo w buforze TE (10 mM Tris; 1 mM EDTA, pH 8,0).
Przykład 25
Wytwarzanie szczepionek skojarzonych
Różne plazmidy konieczne do wytwarzania szczepionek skojarzonych miesza się wychodząc z ich stężonych roztworów (przykład 16). Mieszaniny wytwarza się w taki sposób, że stężenie końcowe każdego z plazmidów odpowiada skutecznej dawce każdego z nich. Roztwory, które można zastosować do ustalenia stężenia końcowego szczepionki mogą być roztworami 0,9% NaCl albo buforem PBS.
Przykład 26
Szczepienie świń
Świnie szczepi się dawkami 100 pg, 250 pg albo 500 pg na plazmid.
Wstrzykiwanie można przeprowadzić igłą, drogą domięśniową. W tym przypadku, dawkę podaje się w objętości 2 ml.
Wstrzyknięcia można przeprowadzić drogą śródskórną, stosując urządzenie do strugowego wstrzykiwania płynu (bez igły), dostarczające dawkę 0,32 ml w 5 punktach (0,04 ml na punkt wstrzyknięcia) (przykładowo, urządzenie „Pigjet”). W tym przypadku, dawki szczepienne podaje się w objętości 0,2 albo 0,4 ml, co odpowiada jednemu albo dwóm podaniom. Gdy przeprowadza się dwa kolejne podania przy użyciu urządzenia Pigjet, oddzielone są one od siebie przerwą około 1 do 2 centymetrów.
190 615
ATCCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGGCCCCGGGGGCATCCGCCCGGGCACCACGGCGGG ► ItetProMaGlyGlyGlyLeuTrpArgGlyPruAEgGlyHisArgProGlyaisHisGlyGly
Pstl
GCTGGCCTCGGACGTCTTTGGCCTGCTCCACACCACGCTCCAGCTGCGCGGGGCGCCGTCGCG 22 ► AlaGlyIeuGlyArgLeuTrpProAlal>roHisHifiAlaAlaAlaAlaArgGlyAlaVaIAla
127 CTAGCGCTGCTGCTGCTGGCGCTCGCCGCGGCCCCGCCGTGCGGCGCGGCGGCCGTGACGCGG 43 ► LeuAla£etiLeuIieuŁeuAlaLeuAlaAlaAlaPcoProCysGlyAlaAlaAlaValThcArg
190 CCCGCCTCGGCCTCGCCGACGCCCGGGACGGGCGCCACCCCCAACGACGTCTCCGCCGAGGCC 64 ► AlaAlaSeiAlaSeil>xTyitirP3X)GlylhxGlyAlaThrPraAsnAspValSexAlaGluAla
Xhol
253 TCCCTCGAGGAG ATCGAGGCGTTCTCCCCCGGCCCCTCGGAGGCCCCCGACGGCGAGTACGGC 85 ► SerLeuGluGliiTleGliiAlaPhffSerProGlyProSerGluALaProAspGlyGluTyrGly·
316 CACCTGGACGCGCCGACGGCCGTGCGCGCGGCCCCGACCGAGCGGGACCGCTTCTACGTCTCC 10 6 ► AspLeuAspAXaAi?aTbxAlaValAx^AlaAlaAlaThrGluAr5AspAirgPheTyrValCys 379 CCGCCGCCGTCCGGCTCC ACGGTGGTGCGGCTGGAGCCCGAGCAGGCCTGCCCCGAGTACTCG 127 ► ProProProSexGlySerl5ixVaIValAi^jIZ!uGluProGliiGlnAlaCy3PrOGluTyrSer 442 CAGGGGCGC AACTTC ACGG AGGGGATCGCCCTGCTCTTC AAGGAG AAC ATCGCCCCGC AC AAG 148 ► GliK&yArgAsnPheThzGluGlylleAlaLeuLeuFheLysOluAsnlleAlaBroHisLys 505 TTCAAGGCCCACATCTACTACAAGAACGTCATCGTCACGACCGTGTGGTCCGGGAGCACGTAC 16 9 ► PheLysAlaHislieTłTriłarLyBAsEiValIleVallhiiIła5ralTcpSerGlySerihiiyr 568 GCGGCCATCACGAACCGCTTCACAGACCGCGTGCCCGTCCCCGTGCAGGAGATCACGGACGTG 190 ► AlaAlaIleTbxAsnAr^heTSxiAspArgVialProVialProVXiaLDGluIlel±i2AspVal 631 ATCGACCGCCGCGGCAAGTGCGTCTCCAAGGCCGACTACGTGCGCAACAACCACAAGGTCACC 211 ► IleAspArgArgGlyLysCy^alSeiIyBAlaGluTyxValArgAsnAsnHisLySValThr 694 GCCTTCG ACCGCGACGAG AACCCCGTCGAGGTGGACCTGCGCCCCTCGCGCCTGAACGCGCTC 2 3 2 ► AlaPheAspAi?gAspGluAsEiProVąJ.GluVialAspLeuArai>roSexArvl<euAsiiAlaLeu 757 GGCACCCGCGCCTCGCACACCACCAACGACACCTACACCAAGATCGGCGCCGCGGGCTTCTAC 2 5 3 ► GlyiłirArgAlaTtpHisThi/IliiAsnAspTtirTyrTbrLyalleGlyAlaAlaGlyPheTyr 820 C AGACGGGCACCTCCGTCAACTGCATCGTCGAGGAGGTCGAGGCGCCCTCCGTGTACCCCTAC 27 4 ► Gli*iar^ylhESexValAsnCysIleVal<&uGluValGluAlaArgSexValTyrPxoTyT 883 GACTCCTTCGCCCTGTCC ACGGGGGACATTGTGTAC ATGTCCCCCTTCTACGGCCTGCGCGAG
9 5 ► AspSerPheAlaLeuSerTtrGlyAsplleA/ialTycMatSerProPheTyrGlyŁeuArgGlu 946 GGGGCCCACGGGGAGCAG ATCGGCTACGCGCCCGGGCGCTTCC AGCAGGTGGAGC ACTACTAC 316 * GlyAla&IsGl^GluGlziIleGlyTyxAlaPcoGlyAcgPbe61z]GlnV^lGlu&xsTysTyr
1009 CCCATCGACCTGGACTCGCGCCTCCGCGCCTCCGAGAGCGTGACGCGCAACTTTCTACGCACG
37 ► ProIleAspLeuAspSeiArgLeuAioAlaSerGluSeiyalThiAruAsnPheleuAraThr 1072 CCGCACTTCACGGTGGCCTGGGACTGGGCCCCCAAGACGCGGCGCGTGTGCAGCCTGGCCAAG
58 > Pit3HisPbelłiWaQAlaTrpAspTEpAlaProLysThxArgArgVaięysSerLeuAlaLys 1135 TGGCGCGAGGCCGAGG AG ATGACCCGCGACGAGACGCGCGACGGCTCCTTCCGCTTC ACGTCG
7 9 ► TrpArgGluAlaGluGlxiMatltiiArgAspQluThrArgAspGlySerPheAxgPheThxSer
Pstl
1198 CGGGCCCTGGGCGCCTCCTTCGTCAGCGACGTCACGCAGCTGGACCTGCAGCGCGTGCACCTG
00 ► ArgAlaLeuGlyAlaSerPheValSexAspValTtirGLnLeuAspLeuGlnAx?gValHisLeu 1261 GGCGACTGCGTCCTCCGCGAGGCCTCGGAGGCCATCCACGCCATCTACCGCCGGCGCTACAAC
21 ► GlyAspCy^alŁeuArgGluAlaSeEGluAlaZleAspAlalleTycAcgArgArgTYcAsn 1324 AGCACGCACGTGCTGGCCGGCGAC AGGCCCGAGGTGTACCTCGCCCGCGGGGGCTTCGTGGTG
4 2 ► SeeibrHiSValLeuAlaGlyAspArgProGluValTyrLeuAlaAroGlyGlyPheValVal
Fig. 2
190 615
Xhol
1337 GCCTTCCGCCCGCTGATCTCGAACGAGCTGGCGCAGCTGTACGCGCCCGAGCTCGAGCGCCTC
63 ► AlaJPhaArgProlfiuileSerAsDGluIjeuAlaGlinifiuTyrAlaArgGluLeuGluArgLeu
50 GCCCTCGCCGGCGTCGTCCGCCCCGCCGCCCCCGCGGCCGCCCGTCGCGCCCGGCCCTCCCCC
484 ► GlyLeuAlaGlyyalyalGlyPraAlaAlaPraAlaAlaAlaArgArgAlaArgArgSerPro
1513 GGCCCGGCGGGGACGCCCGAGCCGCCGGCCGTC AACGGCACGGGGCACCTCCGCATCACC ACG
5 ► GlyProAlLaGly7łirProGliJProE>roAla.ValAsnGlylłirGlyaisLeuArgIleTłix^Iłix· Pstl
1576 GGCTCGGCGGAGTTTGCGCGCCTGC AGTTCACCTACGACCACATCCAGGCGCACGTGAACCAC
2 6 ► GlySexJUauGluPheAlaArgŁeuGlnPhfiTixcTyEAspHisIleGlnAlaHiSValAsnAsp
Pstl
1639 ATCCTGGGCCCCATCGCGGCCGCCTGCTGCGAGCTCCAGAACAAGG ACCGCACCCTGTGGAGC
547 ► MetJLeoGlyArglleAlaAlaAlaTrpCysGltiLeuGlnAsnLysAspAroTSirLetfTEpSer
1702 GAGATGTCGCGCCTGAACCCCAGCGCCGTGGCCACGGCCGCGCTCGGCCAGCGCGTCTGCGCG
568 ► GluMatSeiJVcyLeuAsuProSerAlaValAlaItixAlaAlaJleuGlyGliiArgVsLlCysALa
1765 CGC ATGCTCGGCGACGTGATGGCC ATCTCGCGGTGCGTGGAGGTGCGCGGCGGCGTGTACGTG
89 ► Ar^^tJOeuGOLyAspValMetAlaJieSerAr^CysVłlGluValArvGlyGlyValTyrVaJ.
1828 CAGAACTCCATGCGCGTGCCCGGCGAGCGCGGCACGTGCTACAGCCGCCCGCTGGTC ACCTTC
610 ► GlnAsaSezMetArgWalProGlyGluArgGlyTłicęysTyiSerAroProIfiuYaliłirPhe
1891 GAGCACAACGGC ACGGGCGTGATCGAGGGCC AGCTCGGCG ACG AC AACG AGCTCCTC ATCTCG
31 ► GluHisAsnGlyHirGlyyalZleGluCilyGliłLeuGllyAspAspAsnGluLeuLeuIleSer
1954 CGCGACCTCATCGAGCCCTGCACCGGCAACC ACCGGCGCTACTTTAAGCTGGGGAGCGGGTAC
5 2 ► ArgAspIżauIleGluPrOCysTtirGlyAsnHlsAręArgTyrPhaLysLeiJGlySerGlyTYr
2017 GTGTACTACGAGGACTACAACTACGTGCGCATGGTGGAGGTGCCCGAGACGATCAGCACGCGG
7 3 ► ValTyrTyii31xiAspTyxAsniyEValArgMatVaJ.GluValI>roGluIłirIleSerlłirArg·
Xhol
2080 GTTACCCTG AACCTG ACGCTGCTGG AGGACCGCGAGTTCCTGCCCCTCG AGGTGTACACGCGC
4 ► ValTŁrLeuA£aaLeu3±aiD«xijeuGluAspAi^luPbeLeuPEoLexiGluValTyETSixArg
2143 GAGGAGCTCGCCGACACGGGCCTCCTGGACTACAGCGAGATCCAGCGCCGCAACCAGCTGCAC
715 ► GluGluleuAlaAsplhzGlyŁeuIjeuAspiTycSecGluIleGlDAEgAr^AsnGinLieuHls
2206 GCGCTCAAGTTCTACGACATCGACCGCGTGGTCAAGGTGGACCACAACGTGGTGCTGCTGCGC
3 6 ► AlaLeuZys£*heTyxAspIleAspAcOValValIyśValAspHisAsaVaJLValI<euLeuArg
2269 GGCATCGCCAACTTCTTCC AGGGCCTCGGCGACGTGGGCGCCGCCGTCGGCAAGGTGGTCCTG
757 > GlyIleAlaAsnPhePheGlxiGlyLeuQlyAspValGlyAlaA±aValGlyŁysValValLeii
2332 GGTGCCACGGGGCCCGTGATCTCGGCCGTCGGCGGCATGGTGTCCTTCCTGTCCAACCCCTTC
778 GlyAlaXhEGlyAlaValIleSezjQaValGlyGlyMetValSerPheŁetiSe£AsQPcoR)e
2395 GGGGCGCTCGCCATCGGGCTGCTGGTGCTGGCCGGCCTGGTCGCGGCCTTCCTGGCCTACCGG
799 ► GlyAlaleuAla3U.eGly1Jeul£uVaIljeuAlaGlyLeuValAlaAlaPbeLeuAlaTycAc7
2458 CACATCTCGCGCCTGCGCCGCAACCCCATGAAGGCCCTGTACCCCGTC ACGACGAAGACGCTC
820 ► HisIleSeiAEuLeuArgArgAsnPrciMatLysAlaLeiiTyrProyalTlirtSirLysThrLeu Sali
521 AAGGAGGACGGCGTCGACGAAGGCGACGTGGACGAGGCCAAGCTGG ACCAGGCCCGGGACATG
841 ► LysGluAspGlyValAspGluGlyAspValAspQluAlaLysLeuAspGlnAlaArgAspMet Xhol
2584 ATCCGGTAC ATGTCCATCGTGTCGGCCCTCGAGCAGCAGGAGCACAAGGCGCGCAAGAAGAAC
862 > IleAraTyrMetSerIleValSetAlaLetłGluGlnGlxiGluHisLysAlaAtgLysLysAsii
2647 AGCGCGCCCGCGCTGCTGGCCAGCCGCCTCGGGGCGATGGCCACCCCCCGCCGCCACTACCAG
5 3 ► SerGlyProAlal^uLeuAlaSeiArtfyalGlyAlaMetAlaThjcArgrAinjArgHisTyrGln Xhol
2710 CGCCTCGAG AGCGAGGACCCCGACGCCCTGTAG
904 ► ArgLeuGluSerGluAspPzroAspAlaljeu· · ®
Fig. 2 c.d. i koniec
190 615
ΑΒ168 + ΑΒ169 ρ ΡR 2.1 5.
ΑΒ166 + ΑΒ167
Fig. 3
190 615 i ATCCTGCTCCCACCCCTATTGGCGGCGCTGGTCGCCCGGACCACGCTCGGTGCGCACGTGGAC 1 ► htótXeuLeuAlaAlaJLeuL«euAlaAlaLeuValAlaArglłirTłirLeuGIyAlaAspValAsp
GCCGTGCCCGCCCCGACCTTCCCCCCGCCCGCGTACCCGTACACCGAGTCGTCGCAGCTGACG 22 ► AJ^VaŁPraAJ^LP3xi<EbrPhfiPxxjProPzaAlaTyrPix>TyETfarGluSerTEpGliiLeua3iE·
127 CTGACGACGGTCCCCTCGCCCTTCGTCGGCCCCGCGGACGTCTACCACACGCGCCCGCTGGAG 43 > Leua3arfŁ2AraJP>roSerProPheValGlyPraJUjAspVallV’^s73iEArgPraLeuGlu
190 GACCCGTGCGGGGTGGTGGCGCTGATCTCCGACCCGCAGGTGGACCGGCTGCTGAACGAGGCG 64 ► AspProCysGlyValValAlaT>ffiiT1 aSer AspProGlnValAgpArgr^i iT z^ŁAsnfiluAla
253 GTGGCCCACCGGCCGCCCACGTACCGCGCCCACGTGGCCTGGTACCGC ATCGCGG ACGGGTGC ► VadAlaHisAr^^rgProltirTyrArs^laHisValAlaTrpTyrArgIleAlaAspGlyCys
316 GCACACCTGCTCTACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCAGGCAGATCTTTGGGCG 106 ► Al gT/wiiT^nTyr-PhptTI p^rł^gAlaAgpgygAspPgoAggfrinAlaAspr/^tTrpAla
379 CTGCCGGCGCCGCACCACCCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGA 127 ► LeuProAlai>i?oHisHisAlaAspValValAsp?iX3'ValAxvGlyŁeuHisValProHiEGly
442 GGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGCCCCCCGGGCGGTTCAACGAGGGCC AGTACCGCCGCCT 148 ► GlyArgAlaGlyAlaAlaHisGIyQlyProArgAlaValGlnAraGlyPJ?oValPxQAlaPro
505 GGTGTCCGTCGACGGCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGA 169 ► GlyValAEgArgAir3Ax?gGlxiHisProHisArgIeuHisGlyGlyAlaPxQAi?oGlyAlaArsr
568 GTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCCTGCTGGACCGACGA 190 ► VaJProValAi^gPx?QAi?QGlyPraAlaPxoMsvąiGlnV!alAx?gAr2Vą-LL«euGltiAir5jAr^·
631 CAGCTTCAAGCGGGGCGTGGACGTGATGCGATTCCTGACGCCGTTCTACCAGCAGCCCCCGCA 211 > GlxiLei^lriAlaGlyArgGlyAr5AspAlKllePxxiAspAlAValLeuProAlaAlaPrQAla
694 CCGGGAGGTGGTG AACTACTGGTACCGCAAGAACGGCCGGACGCTCCCGCGGGCCCACGCCGC 232 ► ProGlyGlyGlyGlul^iiLeiiValProGlnGluArvPraAspAlaPraAlaGlyPraArgArv
757 CGCCACGCCGTACGCC ATCGACCCCGCGCGGCCCTCGGCGGGCTCGCCGAGGCCCCGGCCCCG 2 5 3 ► Aj^srHisAlaVaJArvaisArv^roAr5AlaAlaLeruGlyGlyLeuAlaGluAlaProAlaPro
820 GCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCGAAGCCCGAGCCCGCCCCGGCGACGCCCGCGCCCCCCGACCG 2 7 4 ► AlaProAlaProAlAProAlaGluAlaArgAlaAcgProGlyAspAlaAroAlaEroArgPro
883 CCTGCCCGAGCCGGCGACCCGGGACCACGCCGCCGGGGGCCGCCCCACGCCGCGACCCCCGAG 295 ► ProAlaArgAJLaGlyAjtpAlaGlyi^roArgAEgArgGlyProProHisAlaAlalSirPiroGlu
946 GCCCGAGACGCCCCACCGCCCCTTCGCCCCGCCGGCCGTCGTGCCCAGCGGGTGGCCGCAGCC 316 AlaArgAspAlaAlaProProLeuArgProAlaGlyArgArgAlaGlnAr^alAlaAlaAla
1009 CGCCGAGCCGTTCCAGCCGCGGACCCCCGCCGCGCCGGGCGTCTCGCGCCACCGCTCGGTGAT 3 37 ► AEyGlyAlaValProAlaAlaAspProArgAręAlaGlyAxvIjeuAlaProi>roLeuGlyAsp
Fig. 4
190 615
L 07 2 CGTCGGCACGGGCACCGCGATGGGCGCGCTCCTGGTGGGCGTGTGCGTCTACATCTTCTTCCG 3 5 8 > ArgArgHisGlyHisArgAspGlyArgAlaPixX31yGlyAi?gVa2JbrgL1euHisIjeuLeuPro
L13 5 CCTGAGGGGGGCGAAGGGGTATCGCCTCCTGGGCGGTCCCGCGGACGCCG ACGAGCTAAAAGC 3 7 9 ► PrryGluGlyGlyGluGl^alSei^roPrr^lyAjrgSerArgGlyArgAręArgAlaLysSer
1L98 GCAGCCCGGTCCGTAG 4 0 0 ► AlaAlaArgSexVal
Figura 4 c.d. i koniec
190 615 pPR29 pPR29 PB101 + PB102
I is· I
Fragmeni C
Fig. 5
190 615
ATGGAAGCAAAACTATTCGTATTATTCTGTACATTCACTGCGCTGAAAGCTGACACCATCTGT ► MetGlxiAlaLys£euPheValleuPheęyslfarPheIłłiAlaX<ettLysAlaAspTtirrieCys
GTAGGATACCATGCTAACAATTCCACAGATACTGTCGACACAATACTGGAGAAGAATGTGACT 22 ValGlyTyifiŁ«iAJ^AsnAsnSeirlhiAsp,lfaiValAspTti£‘IleLeruGluI.ysAso.'ValTłłr
127 GTGACTCATTCAGTTAATTTACTAGAAAACAGTCATAATGGAAAACTCTGCAGCCTGAATGGA 4 3 ► ValThrHisSerValAst»LeuLeuGliiAsaaSerHisAsnGlyŁysIjeuCysSerIjeuAsnGly
190 GTAGCCCCCTTGCAACTAGGGAAGTGCAACGTAGCAGGGTGGATCCTTGGCAACCCAGAATGT 64 ► ValJU^LPi?olieuGliiLeuGlyLyscysAsnValAlaGlyTxpIleLeuGlyAsnProGluCys
253 GACCTGTTGCTCACAGCGAATTCATGGTCTTACATAATAGAGACTTCAAATTCAGAAAATGGA 85 ► AgpT^uT^iiI^aiThrAl aA«m5^»rTrpSgrTyrTl f»T1 i ιΑ-<^πΓ;1 y
316 ACATGCTACCCCGGAGAATTCATTGATTATGAGGAATTAAGGGAGCAGCTGAGTTCAGTGTCT 10 6 ► TłizCysTyrProGlyGliiPheTLeAspTyrGlLiGliirjeuAraGliBGLnLeuSerSerYalSer
379 TCATTTGAAAGGTTTGAAATTTTCCC AAAAGCAAACTCATCGCCAAATCATGAGAC AACCAAA 127 ► SerPh^luAr^heGliiIlePhfiProLysAlaAsriSerTrpProAsriHisGltflłirThrLys
442 GGTATTACAGCTGCATGCTCTTACTCTGGAACCCCCAGTTTTTATCGGAATTTGCTATGGATA
505 GTAGAGAGGGAAAATTCCTATCCTAAACTCAGCAAATCATACACAAACAACAAAGGGAAAGAA 16 9 ► ValGluAroGluAsiiSexTyrPxx^ysLex^ierLysSerTyxTfaiAsnAsnLysGlyLy5Glu
568 GTGCTTATAATCTGGGGAGTGCACCACCCTCCAACTACCAATCACCAACAAAGCCTCTATCAG 190 ► ValLeuZleIleiEiTGlyValH£sHieProPEOTtcrthrAsnAsDGli^lnSerLeuiryxGln
631 AATGCTGATGCATATGTTTCAGTTGGGTCATCAAAATACAACCGAAGGTTC ACACC AGAAATA 211 > AsnAlaAspAlaTy3VaJJSerValGlySexSerLysTyrAsuArgArgPhfiltorProGluIle
694 GC AGCTAGACCTAAAGTCAAAGGAC AAGC AGGCAG AATG AATTATTATTGC ACATTGTTAG AT 2 3 2 ► AlaAlaArgProLysYaJLLysGlyGlnAlaGlyArgMe tAsiiTyriycTrpTSirLeuLeuAsp
757 C AAGG AG AC ACC ATAACGTTTG AAGCCACTGGGAACTTAATAGC ACC ATGGTACGCCTTCGCA 2 53 ► GloGlyAsplŁrIlea±KPheGluAlaThxGlyAsnLettIleAlaJPraTEpTycAlaPbeAla
820 TTGAATAAGGGCTCTGGTTCTGGAATTATAACGTCGGATACTCCGGTTCACAATTGTGATACA 27 4 ► LeuAsnLysGlySerGlySerGlyllelleinirSeEAspTłiEProyaUŁŁsAsnCysAsplłie
333 AAGTGCCAAACCCCTCATGGGGCCTTGAACAGTAGTCTTCCTTTTCAG AACGTAC ATCCCATC 295 ► LysCysGli±EhxProHisGlyAlaLeuAsnSerSerLeuProPheGlnAsriValHisProIle
946 ACTATTGGAGAATGCCCCAAATATGTTAAAAGC ACC AAACTG AGAATGGC AAC AGG ACTAAGG 316 ► ThrIleGlyGluCysProLysTyiValLysSexThrLysIjeuAEgtfetAlaThEGlyLeuArg
1009 AACGTCCCCTCTATTCAATCCAGAGGACTTTTCGGAGCAATTGCTGGATTCATTGAAGGAGGA 337»· AsnValProSerIleGlnSeiArgGlyLeuPheGlyAlaIleAlaGlyPheIleGluGlyGly
Fig. 6
190 615
LO72 7GCACAGGAATGATAGATGGGTGGTATGGGTATCACCATCACAATGACCAGGCATCTGGTTAC 358 > TrpotirGlyMetlleAspGlyTi^/ryrGlyryrHisHisGliiAsnGluGlriGlySerGlyTyr·
1135 GC AGCTGATC AGAAAAGCAC ACAAATTGCAATTG ACGGG ATCAGCAACAAAGTC AACTCAGTA 379 ► AlaAlaAspGlxLLysSerT±tcGlnIleAlaIleAspGiyIleSexAsiiLysValAsiiSexVal
1198 ATTGAGAAAATGAAC ACTCAATTC ACTGC AGTGGGC AAGG AATTC AATGATCTAGAAAAAAGG 400 ► IleGlxiLystfetAsiil3iiX3lnPhfiiIłu^laValGlyLysGluPhaAsnAspLeuGluLysAEęr
1261 ATTG AGAATTTGAATAAGAAAGTCGATGATGGGTTTTTGGATGTTTGGACATATAATGCTGAG 421 > IleGluAsnLeuAsnLysLy^aJAspAspGlyPfaeLeuAspVa2TiTTbrTyrAsnAlaGlu
1324 TTGCTCGTTTTGCTCGAGAACGAAAGGACTCTAGATTTCCATCACTTTAACGTAAGAAATTTA 442 ► LeuleuVaJJ-ieul«e«GluAsnGluAj^Tłxrl(euAspPhfiHisAspPheksnV&lArgAsnLeu
1387 TATGAAAAGGTC AAGTCACAATTGAGAAACAATGCC AAAGAAATCGGGAATGGTTGTTTTG AG 463 ► TyiGluLy^alLysSerGlriLeuAroAsiiAsnAlaLysGluZleGlyAsnGlyCyHPheGlu
1450 TTCTATCACAAATGTGATGACGAATGCATGAAGAGCGTAAAGAATGGCACATATAACTACCCC 484 ► PheTyxHisbysCysAspAspGlt£ysMetiysSeiValLysAsnGly<lSirTyiAs333?yrPxo
1513 AAATATTC AGAAG AATCC AAATTGAATAGAGAGG AAATAGACGGTGTGAAACTAG AATCAATC 505 ► LysTyrSerGluGluSer-LysLeuAsnAroGluGlulleAspGlyYaiLysLeuGluSerMet:
1576 GGAGTTTACCAGATTTTGGCGATCTACTCCACAGTCGCCAGTTCCCTGGTCTTGTTAGTCTCC 52 6 ► GlyValiyxGlnIleIieuAlaJleTVxSerTfaEValAlaSerSerLeu.ValLeuLeu.ValSer
1639 CTGCGGGCAATCAGCTTCTGGATGTGTTCTAATGCGTCATTGCAATGC AG AATATGCATTTAA 547 ► LeuGlyAlalleSerPheTrpMetCysSecAsnGlySerLeuGLnCysArglleCysZle· · ·
Figura 6 c.d. i koniec
190 615
Fig. 7
190 615
ATGGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCTTATGAGCAGATGGAAACCGGTCGAGAACGCCAGAAT 1 ► KatLAiaSerGlnGlylfarLysArgSerTyxGluGlnMetGluiIłirGli<3ly<31iiArgGLnAsa
GCTACTGAAATCAGAGCATCTGTTGGGGGAATGGTTGGTGGAATTCCAAGATTCTACATACAG
AlaThxGluZleArgAlaSeCValGlyGlyMetValGlyGlyIleGlyAirgPhfiTyrIleGln
127 ATGTGCACTGAACTCAAACTCAGTGACTATGAAGGGAGGCTGATCCAGAACAGCATAACAATA 4 3 ► MatCysThrGlxiLeuLysLeuSexAspTyxGluGlyArgLeuIleGlnAsiiSerIlelłirIle
190 GAGAGAATGGTTCTCTCTGCATTTGATGAGAGGAGGAACAAATACCTGGAAGAACATCCCACT 64 ► GluLArgMetValLeuSeiAlaPheAspGluAroAEgAsnLysTyrLeuGluGluHisProSer
253 GCGGGGAAGGACCCAAAGAAAACTGGAGGTCCAATCTACAGAAAGAGAGACGGAAAATGGATG 85 ► AlaGlyLysAspProLysLysThrGlyGlyProIleTyiAtyLysArgAspGlyŁysTiTiMae
316 AGAGAGCTGATTCTATATGACAAAGAGGAGATCAGGAGGATTTGGCGTCAAGCAAACAATGGT IG 6 ► Ai^GlłiLeuIleLeuTyrAspIłysGluSluIleAEgAcglleTcpAruGliłAlaAsnAsoGly
379 G AAG ATGCTACTGCTGGTCTCACTCATCTGATGATTTGGCATTCC AACCTGAATGATGCCACA 127 ► GluAspAlaT32xAlaGlytiex£QirSisLeuMetIleirrpHisSerAsnLeuAsnAspAlaThr
442 TATC AGAG AAC AAGAGCTCTCGTGCGTACTGGGATGG ACCCC AG AATGTGCTCTCTG ATGC AA 148 ► TyrGliiAirgOłirArgAlaljeuYalArgTłLrGlyMatAspProAiTgMetCysSerLeuMatGln
5G5 GGATCAACTCTCCCGAGGAGATCTGGAGCTGCTGGTGCGGCAGTAAAGGGAGTTGGGACGATG 169 ► GlySerThrleuProArgArsrSerGlyAlaAlaGlyAlaAlayalLysGlyYalGlyTłulteC
563 GTAATGGAACTG ATTCGGATGATAAAAGCGGGGATCAATGATCGGAACTTCTGGAGAGGCGAA
190 ► ValMetGluLeuIleAiT3tJetIleLysAlaGlyIleAsnAspArgAsaPhfiTrpArgGlyGlu
631 AATGGACGAAGAACAAGAATTGCATATGAGAGAATGTGCAACATCCTC AAAGGGAAATTTCAG 211 ► AsnGlyAi^AiraTbiAralleAlaTyrGliłAroMetCysAsiiIleLeuLysGlyljysPheGln
694 ACAGC AGCGC AACAAGC AATGATGGACCAGGTGCGAG AAATGAC AKATCCTGGGAATGCTG AG 232 ► ThrAlaAlaOlnGl nAl aMeaMetAspginyalAggGliiMatTtirAsnProGlyAsnAlaGlu
757 ACTGAAGACCTTATCTTTCTGGCACG ATCTGCACTC ATTCTGAG AGG ATC ACTGGCTC ATAAA 253 ► TtuxajiAspLeuZlePheLeuAlaArgSeiAlaLeuIleLeuArg<3lySexValAlaHisLys
2 G TCCTGCCTGCCTGCTTGTGTATATGGACTTGTTGTGGC AAGTGGATATG ACTTTGAAAGAG AA 274 ► 3^τΟγΗΐ42ΐϊΡττιΑΐΑ(2γ3νΗΐΤγχΰ1γ11ιεανΑΐν3ί1_ΑΐΗ3βτΰ1νΤνχΑ5ρΡΐιε01χιΑτ^σΐη
353 GGCTACTCTCTAGTCGGAATAGATCCTTTCCGTCTGCTCCAAAACACCCACGTGTTCAGCCTC 295 ► GlyTyr5exLexiVa±GlyIleAspProPheArgLeuLeuGliiAsriSerGlriVa±PheSerL<eu
946 ATT AGACC AAATGAC AATCCAGCACATAAGAGTCAGCTGCTATGGATGCCATGCCATTCTGC A 316*1 IleArgProAsnGluAsnProAlćiHisLiyBSecGlnljeuYalTrpMeCAlaCysHisSerAla
1GG9 GCATTTGAAGATCTCACAGTGTCAAGTTTCATCAGAGGGACAAGAGTGGTCCCAAGAGGACAA 3 3 7 ► AlaPheGluAspIjetiAEgVa2.SecSex^heZleArgGlyllicAxgValValProAi?gGlyGln.
Fig. 8
190 615
1972 CTGTCCACCAGAGGAGTTCAAATTGCTTCAAATGAAAACATGGAAACAATGGAGTCCAGTACT 358^ LexiSerOłiiArgGlyValGl3aIleAlaSeiAsnGliiAsa3MetGlu3łiiM2tGluSerSexTłLc·
1135 CTTGAACTGAGAAGCAAATACTGGGCTATAAGAACCAGGAGCGGAGGAAACACCAACCAACAG
1198 AG AGCATCTGC AGGGCAAATC AGTGTACAACTTACTTTCTCGGTAC AG AGAAATCTTCCTTTC 4 0 0 ► AxgA2juSexAlaGlyGlnIleSexValGlnLeuTłicPheSetValGlnArstAsnLeuPxoPhe
1261 GAGAGAGCGACCATC ATGGCAGC ATTTACAGGGAACACTGAAGGCAGAACATCTGAC ATGAGG 421 ► GluArgAlaThrlleMetJ^laAlaPheThiiSlyAsnalirGluGlyAr^jTfarSeiLAspMetArg
1324 ACTG AAATTATAAGAATG ATGGAAAGTGCCAGACCAGAAGATGTGTCCTTCC AGGGGCGGGG A 4 4 2 ► T±irGlxiXleIleAr3MetMetGluSeiAlaAxgProGliJAspV!aQSeEPhfiGlcGlyArgGly
1387 GTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCTTCCTTTGAC ATGAGTAAT 4 63 ► Va3LPbeGluLeiiSerAspGluLLysA3^1łirAsnProIleValProSerPheAspMetSerAsn
1450 GAGGGATCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTATGACAATTAA 4 84 ► GluGlySexTyrPbePheGlyAspAsnAlaiQluGlvi3ycAspAsn· · ·
Figura 8 c.d. i koniec
190 615
Fig. 9
190 615
ATGAAGACTGTCATTGCCTTGAGCTACATTTTCTGTCTGGTTCTTGGCCAAGACCTTCCAGAA 1 ► MetJLyslłixValIleAlal>eiiSerTyrIlePfaeCysL<euVal£<euGlyGlxiAspL«euPi?oGlu
AATGGCAGCAGCACAGCAAAGCCTGGTCTGGGACATCATGCGGTGCCAAACGGAACGTTAGTG 22 ► AsnGlySerSerT±rcAlaiysPrc<llyLeuGlySisHisAla.Va2_E>i?aAsnGlyTtirLeŁiVal
127 AAAACAATCACGAATGATCAGATCGAAGTGACTAATGCTACTGAGCTGGTCCAGAGTTTCTCA 43 ► Lyrrt^Tle^T-AmA<;pCł1 nTl <=C1uVa1 Th-r-RonM aTh-rGl nT/ai-iVa1 Gln.^T-Phf»5^»r190 ATGGGTAAAATATGCAACAATCCTCATCGAGTTCTTGATGGAGCAAACTGTACACTGATAGAT 64 ► MetGlyLysIleCysAsnAsiiPix>HisAraValLfflAAspGlyAlaAsc)CysTlirLeuJleAsp
253 GCTCTATTGGGGGACCCTC ATTGTGATGGCTTTCAAAATG AGAAATGGG ACCTTTTCGTTGAA 85 ► AlaJOeuLeuGlyAspProHisCysAspGlyPhfiGLaAsnGlilLysTrpAspLeuPbeValGlu
316 CGCAGCAAATGCTTCAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCAGATTATGCCTCCCTTAGGTCA 106 ► Ar5jSerLyBCysPheSerAsnCysTyrProTyrAspValProAspTyrAlaSerLeuArgSer
379 CTAATTGCCTCTTCGGGC ACTTTGGAGTTTATC AATG AAGGTTTCAATTGGACTGGGGTCACT 127 ► LeuZleAlaSerSerGlylhrIjeuGluPheIleAsnGluGlyPheAsnIrpOirGlyValltir
42 CAGAACGGAGGAAGCAATGCTTGCAAGAGGGGGCCTGATAGCGGTTTCTTCAGTAGGCTGAAC 148 ► GlnAsnGlyGlySecAsnAlaęysLysArBGlyPxoAspSexGlyPhaPheSeEArarLeuAsn
505 TGGTTGTACAAATCAGGAAACACATACCCGATGCTG AACGTGACTATGCCAAACAGTGATAAT 169 ► TtpLeuOyrLysSerGlyAsrilhrTyrPiroMatLeuAsaaYalTliEMatProAsDSeEAspAsn
568 TTTGAC AAATTATACATTTGGGGGGTTCACCATCCGAGCACAGAC AGGGAAC AAACC AACCTA 19 0 ► PheAspLysLeuayrIle®qpGlyValja±sHisPEoSex3łuAspAxsN*luGliJlłrEAsnleu
631 TATGTTCAAGTATCAGGGAAAGCAACGGTTTTCACCAAGAGAAGCCAGCAGACCATAATCCCG 211 ► TyrValGlnValSexGlylĄrsAlaTbxValPheTfarLysAroSecGlx3Glrfl3irIleIlePro
694 AACAGTCGGTCTAGACCCTGGGTAAGGGGTCTGTCTAGTAGAATAAGCATCCATTGGACAATA 2 32 ► AsnSezdtogSeiArgProTEpYalAEgGlyteuSetSeiArgrlleSerlleHisliEplłirlle
757 GTTAAACCGGGGGAC ATTCTG AT AATTAATAGTAATGGG AACCT AATTGCTC CTCGGGGTT AC 2 5 3 ► ValiysP2?oGlyAspIleLeuI lelleAsnSerAsnGlyAsULeuIleAlaProAEgGlyTyr
320 TTCAAAATGCACAATGGGAGAAGCTCAATAATGAGGTCAGATGCACCTATTGGCACCTGCAGT 274 ► PheLysMeCHisAsnGlyArgSerSerIleMetAroSexAspAlaProIleGiyflixCysSer
383 TCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATCCCAAATGACAAACCCTTTCAAAACGTAAACAAG 295 ► SerGluCysIleTfarProAsrłGlySerlleProAsriAspLysProPheGliiAsiiyalAszaLys
946 ATC AC AT ATGGGGC ATGTC CTAAGTATGTTAAAC AAAAC ACTCTG AAGTTGGC AACAGGG ATG 316 > IleThrTyi^lyAlaęy'sProLysTyiAralLysGlriAsn®irL<euIjysLeuAlaTfarGlyMet
1009 CGGAATATACCGGAAAAACAAACTACAGCCATATTCCGCGCAATAGCAGGTTTCATAGAGAAT 3 37 ► ArgAsnlleProGluLysGlnThrArgGlyllePheGlyAlalleAlaGlyPhelleGluAsn.
Fig. 10
190 615
1072 GGTTGGGAAGGAATGGTAGACGGCTGGTACGGTTTCAGACATCAAAATTCTGAGGGCACAGGA
353 ► GlyTxpGlxiGlyMetValAspGlyTtpTyrGlyPhaAi?ofiisGlnAsnSerGluGlySirGly
1135 CAAGCAGCAGACCTTAAAAGCACCCAAGCAGCCATCGACCAAATCAACGGGAAACTGAATAGA 379 ► GlnAlaAlaAspLeuLysSerllizGlnAlaAlalleAspGlnlleAsnGlyLysIjeuAsnAr?
1193 CTAATCGAGAAGACGAACGGGAAATTCCATCAAATCGAAAAGGAATTCTCAATAGTAGAAGGG 400 ► LeuIleGltiLyslłirAsnGlyLysPheHisGlnlleGluIiysGluPheSerlleyalGluGly
1261 AGAATTCAGGACCTCGAGAAATACGTTGAAGACACTAAAATAGATCTCTGGTCTTAC AATGCG 421 ► ArgIleGliiAspLeuGluLysTyrValGluAspTłirLysIleAspIjeulEpSeETyxAsnA±a
1324 GAACTTCTTGTCGCTCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTGACTGACTCGGAAATGAGC AAA 442><
1387 CTGTTTCAAAAAACAAGGAGGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGAC ATGGGAAACGGTTGCCTT 463 ► LeuPheGluLysTfarArgAryGlnl^uArgGluAsnAlAGluAspMetGlyAsriGl.yCysLeu.
1450 CAAATATACCACAAATGTGACAATGCTTGCATAGAGTCAATCAGAAATGGGACTTATGACC AT 484 > GlalleTyrHisLysCyaAspAsnAlaCysIleGluSerlleArgAsnGlyiłiETyrAspHis
1513 AATGAATACAGAGACCAAGC ATTĄAACAACCGATTTCAGATCAAAGGTGTTGAGCTGAAGTCG 505 ► AsxaGluTyTArgAspGluAlaLeuAsnAsnAxgPheGlnlleiysGiyvalGluLeuI«ysSer
1576 GG ATACAAAG ACTGGATCCTGTGG ATTTC CTCTGCC ATATC ATGCTTTTTCCTTTGTGTTGTT 5 2 6 ► GlyTyrLysAspTiplleLeuTrpIlftSerSerAlAlleSerCysPhftLeuIjeuCysValVal
1639 TTGCTAGGATTTATCATGTGGGCCTGCCAGAAAGGCAACATTAGGTGC AACATTTGCATCTG A 547 ► LeiiLeuGly5?t>eIle?43tTrpAlaCysGl2iLysGlyAsnIleArgCysAsnIleCysIle· · ·
Figura 10 c.d. i koniec
190 615
Fig. 11
190 615
ATGCCGTCTCAACCCACTAAACCATCTTATCACCAGATCGAAACCGGTGGAGAACGCCGGAAT 1 ► MetAlaSerGlxiGlyl±LrLysArvSerTyrGlu.GlxiMetGluTfarGlyGlyGluArgArgAsii
GCTACTGAAATCAGAGCATCTGTIGGGGGAATGGTTGGTGGAATTGGAAGATTCTACATACAG 22 ► Ala.TŁrGliirieAi?gAlaSerVaJ.GlyGlyMetValGlyGlyIleGlyArgPhfiTyrIleGLn
127 ATGTGC ACTAAACTC AAACTCAGTG ACTATGAAGGG AGGCTG ATCC AG AAC AGC AT AAC AATA 43 ► MetCysTłirLysIjeaLysLeuSerAspTyrGluGłyArgLeulleGIjlAsnSerlleThrIle
190 G AGAGAATGGTTCTCTCTGC ATTTGATGAGAGGAGGAACAAATACCTGGAAG AACATCCC AGT 64 ► GluArgMetValLeuSej^A3.aPheAspGluAr5ArgAsnLysTyrTjeuGluGluHi_sProSer
253 GCGGGGAAGG ACCC AAAGAAAACTGG AGGTCC AATATACAGAAAG AG AG ACGG AAAATGGATG 85 f* AlaGlytysAspJProLysLyslto3li<3lyProIleTyEJtaD&ysArgAspGlyŁysTEi)Met
316 AGAGAGCTGATTATGTATGACAAAGAGGAGATCAGGAGGATTTGGCGTCAAGC AAACAATGGT 106 ► Arg<S.uZ£uZleMetiyzAspI<ysGXxxaliiZleAzgA£gIleI±pArgGXiiAlaAsnAsi3Gly
379 GAAGATGCTACTGCTGGTCTCACTCATCTGATGATTTGGCATTCCAACCTGAATG ATGCC AC A
442 TATCAGAGAACAAGAGCTCTCGTGCGTACTGGGATGGACCCCAGAATGTGCTCTCTGATGCAA 148 ► TyrGOjnAi^aTłicArgAJ^aLLeuYalAr^ThrGlyMetAspProAirgMatCysSerLeuMetGlji
505 GGATCAACTCTCCCGAGGAGATCTGGAGCTGCTGGTGCAGCAGTAAAGGGAGTTGGGACGATG 169 ► GlySerThzŁeuPEoArgtogSesGlyJOaKlA&yAlaAlay&dLItfsGlyYalGlyEhzlfet
568 GTAATGGAACTGATTCGGATGATAAAGCGGGGGATCAATGATCGGAACTTCTGGAGAGGCGAA 190 ► ValMatQluIjeiilleAt?gMetIleI<ysArgGlyIleAsDAspA]?5jAsnPheTrpAcuaiy<3lu
631 AATGGACGAAGAAC AAGAATTGCATATGAGAGAATGTGC AACATCCTCAAAGGGAAATTTC AG 211 ► AsoGlyAraAz?aiEhrAcgIleAla3^zGluAi^rMatCysAsnZleŁeuŁysGlyŁysPbeGln
694 ACAGCAGCGCAACGAGCAACGATGGACCAGGTGCGAGAAAGCAGAAATCCTGGGAATGCTGAG 232 ► ThzdGAA3^G3aiAxrę^3^Tlir«atAspGliiVklArgGluSexArgAsnPrOGlyAsnAlaGlu
757 ATTGAAGACCTTATCTTTCTAGCACGATCTGCACTCATTCTGAGAGGATCAGTGGCTCATAAA 253 ► IleGluAspl^ŁTI ePheT/aiAlaArgSerAT a T/»nTl<»r/*uArgqiySerVa 1 Al aHi sŁys
820 TCCTGTCTGCCTGCTTGTGTATATGG ACTTGTTGTGGC AAGTGG ATATG ACTTTG AAAG AG AA 274 ► SerCysLeuJ<rciAlaCyWalTyrGlyLeuValValAlaSexGlyTyrAspPhfiGluArgGlu
833 GGGTACTCTCTAGTCGG AATAGATCCTTTCCGTCTGCTCCAGAAC AGCCAGGTGTTCAGCCTC 29 5 > GlyTyrSerLeuValGlyIleAspPrnPheAi^LeuLeuGlxiAsnSerOliiValPheSerLeii
6 ATTAGACCAAATGAGAATCCAGCACATAAGAGTCAGTTCGTATGGATGCCATGCCATTCTGCA 316 ► IleArgProAsnGluAsaProAlaHisLysSexG3jaLeu.ValTxpMetAlaCysHisSeiAla
1009 GCATTTGAAGATCTGAGAGTGTCAACTTTCATCAGACGGACAAAAGTGGTCCCAAGAGGACAA 3 37 ► AlaPheGXviAspLieuArqValSerSerFtteIleArgGlyTłłrLySValValProAxgGlyGlii
Fig. 12
190 615
1072 CTGTCCACTAGACGAGTTCAAATTGCTTCAAATGAAAACATGGAAACAATGGACTCCATTACT 358 > LeuSeriI±iiAirgGlyValGlJiIleAlaSeiAsnGluAsnMetGluiIłirMatAspSerIleTfar
1135 CTTGAACTGAGAAGCAAATACTGGGCTATAAGAACCAGGAGCGGAGGAAACACCAACCAACAG 379 ► LeuGlulJ3iiAi?gSerLysTyi/rrpAlaIleArgTłiEAxrgSerGlyGlyAsnItmAsnGlnGlji
1198 AGGGC ATCTGCAGGGC AAATCAGTGTACAACCTACTTTCTCGGTACAGAGAAATCTTCCTTTC 400 ► AttjM aOprll ad yfU nTl Π1 ηΡτΊ-νΡΚτ-ΡΉι^^τ-ν^Ι GI nAr<jAfinI^»łiPraPhf>
1261 GAGAGAGCGACCATCATGGCAGCATTTACAGGGAACACTGAAGGCAGAACATCTGACATGAGG 421 ► GIiiŁttjM a«rhT-Tl a&3 aPEu^rh-rGIyAtp-YTłri-CłlA^GlyArgTłirSeiAspMatArg·
1324 ACTGAAATTATAAGAATG ATGGAAAGTGCC AGACCAGAAGATGTGTCCTTCC AGGGGCGGGGA 442 ► TłixGluIleXleAr5MatMatGlxiSeiAlaArgP3?oGluAspValSerPheGlnGlyArgGly
1387 GTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAAGCAACGAACCCGATCGTGCCTTCCTTTGACGTGAGTAAT 4 6 3 ► ValPhfiGluIfiuSeiAspGluLysAlaałirAsnProIleVialProSerPheAspValSerAsii
1450 G AGGGATCTTATTTCTTCGG AG AC AATGC AGAGGAGTATAAC AATTAA 484 ► GluGlySerTyrPhePheGlyAspAsriAlaGluGluTyEAsnAjsn.· · ·
Figura 12 c.d. i koniec
190 615
Fig. 13
190 615
Fig. 14
Fig. 15
190 615
Fig. 16
Fig. 17
190 615
Fig. 18
Fig. 19
190 615
Fig. 20
Fig. 21
190 615
Fig. 22
Fig. 23
190 615
Fig. 25
190 615
Fig. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (35)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja szczepionki dla świń, w szczególności przeciwko chorobom układu rozrodczego i/lub oddechowego świń, znamienna tym, że obejmuje przynajmniej trzy wartościowości szczepionki polinukleotydowej, z których każda obejmuje integrujący plazmid, obejmujący gen z jednej wartościowości patogenu świń, który wyraża go in vivo w komórce gospodarza, przy czym wartościowości te wybrane są z dwóch grup składających się z wirusa choroby Aujeszky'ego, wirusa grypy świń, wirusa tajemniczej choroby świń, wirusa parwowirozy, wirusa klasycznego pomoru świń i bakterii odpowiedzialnych za aktinobacillozę, a plazmidy obejmują dla każdej wartościowości, jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z gB i gD dla wirusa choroby Aujeszky'ego, genów HA, NP i N dla wirusa grypy świń, genów E, ORF3, M dla wirusa tajemniczej choroby świń, VP2 dla wirusa parwowirozy, i genów apxl, apxll i apxIII dla aktinobacillozy.
  2. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje przynajmniej wartościowości dla choroby Aujeszky'ego i grypy świń.
  3. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że obejmuje dodatkowo przynajmniej jedną wartościowość z grupy obejmującej tajemniczą chorobę świń i aktinobacillozę.
  4. 4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że obejmuje wartościowość dla klasycznego pomoru świń.
  5. 5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje przynajmniej jedną wartościowość wybraną z grupy obejmującej wartościowości tajemniczej choroby świń, parwowirozy i klasycznego pomoru świń.
  6. 6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje gen HA i/lub NP wirusa grypy świń.
  7. 7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje gen E i/lub ORP3 wirusa tajemniczej choroby świń.
  8. 8. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że obejmuje gB i gD wirusa choroby Aujeszky'ego.
  9. 9. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że jest formułowana w postaci dawki o objętości od 0,1 do 10 ml, korzystnie od 1 do 5 ml.
  10. 10. Kompozycja szczepionki określona w zastrz. 1 do podawania śródskórnego w strudze płynu, korzystnie wieloma strugami, w dawce o objętości od 0,1 do 0,9 ml, w szczególności od 0,2 do 0,6 ml, korzystnie od 0,4 do 0,5 ml.
  11. 11. Kompozycja szczepionki według zastrz. 10, znamienna tym, że dawka jest w zakresie od 10 ng do 1 mg, korzystnie od 100 ng do 500 ng, jeszcze korzystniej od 1 |ig do 250 (ig na dany rodzaj plazmidu.
  12. 12. Zastosowanie kompozycji szczepionki określonej zastrz. 1, do wytwarzania szczepionki przeznaczonej do szczepienia świń, uprzednio szczepionych pierwszą szczepionką wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szczepionkę polinukleotydową albo antygen zapewniający odporność krzyżową.
  13. 13. Zestaw do szczepienia, znamienny tym, że obejmuje kompozycję szczepionki określoną w zastrz. 1 i przeznaczoną do pierwszego szczepienia, szczepionkę wybraną z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta pierwsza szczepionka posiada antygen kodowany przez szczepionkę polinukleotydową albo antygen zapewniający odporność krzy190 615 żową, przy czym zestaw jest przeznaczony do podawania pierwszej szczepionki podczas pierwszego szczepienia lub kompozycji szczepionki podczas szczepienia przypominającego.
  14. 14. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że ma dołączoną instrukcją obsługi wskazującą, że tę kompozycję można zastosować jako szczepionkę przypominającą dla pierwszej szczepionki wybranej z grupy obejmującej żywą pełną szczepionkę, inaktywowaną pełną szczepionkę, szczepionkę podjednostkową, szczepionkę rekombinowaną, przy czym ta szczepionka posiada antygen kodowany przez plazmid albo antygen zapewniający odporność krzyżową.
  15. 15. Szczepionka dla świń, znamienna tym, że zawiera plazmid obejmujący gen wirusa choroby Aujeszky'ego, wybrany z grupy składającej się z gB i gD.
  16. 16. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że plazmid zawiera oba geny, gB i gD.
  17. 17. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że plazmid zawiera gen gB.
  18. 18. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że plazmid zawiera gen gD.
  19. 19. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że zawiera plazmid zawierający gen gB i plazmid zawierający gen gD.
  20. 20. Szczepionlka dla świń, znamienna tym, że zawiera plazmid obejmujący gen wirusa PRRS, wybrany z grupy składającej się z E, ORF3 i M.
  21. 21. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że plazmid zawiera gen E.
  22. 22. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że plazmid zawiera gen ORF3.
  23. 23. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że plazmid zawiera gen M.
  24. 24. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że zawiera plazmid zawierający gen PRRS i drugi plazmid z innym genem PRRS, przy czym geny PRRS są wybrane z grupy składającej się z E, ORF3 i M.
  25. 25. Szczepionlka dla świń, znamienna tym, że zawiera plazmid obejmujący gen wirusa klasycznego pomoru świń, wybrany z grupy składającej się z El i E2.
  26. 26. Szczepionka według zastrz. 25, znamienna tym, że plazmid zawiera gen El.
  27. 27. Szczepionka według zastrz. 25, znamienna tym, że plazmid zawiera gen E2.
  28. 28. Szczepionka według zastrz. 25, znamienna tym, że plazmid zawiera oba geny El i E2.
  29. 29. Szczepionka według zastrz. 25, znamienna tym, że zawiera plazmid zawierający gen El i plazmid zawierający gen E2.
  30. 30. Zastosowanie plazmidu zawierającego VP2 z parwowirusa do wytwarzania szczepionki dla świń skutecznej przeciwko świńskiej parwowirozie.
  31. 31. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera plazmid zawierający gen z A.pleuropneumoniae wybrany z grupy składającej się z apxl, apxll i apxIII.
  32. 32. Szczepionka według zastrz. 31, znamienna tym, że plazmid zawiera dwa lub trzy wymienione geny.
  33. 33. Szczepionka według zastrz. 31, znamienna tym, że zawiera dwa lub trzy różne plazmidy, z których każdy zawiera gen z A.pleuropneumoniae.
  34. 34. Szczepionka według któregokolwiek z zastrz. 15 do 29 i 31 do 33, znamienna tym, że plazmid zawiera wczesny promotor CMV-IE cytomegalowirusa.
  35. 35. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że plazmid zawiera wczesny promotor CMY-IE cytomegalowirusa.
PL97331249A 1996-07-19 1997-07-15 Kompozycja szczepionki dla świń, zastosowanie kompozycji szczepionki, zestaw do szczepienia, szczepionka dla świń i zastosowanie plazmidu PL190615B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9609338A FR2751224B1 (fr) 1996-07-19 1996-07-19 Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
PCT/FR1997/001313 WO1998003658A1 (fr) 1996-07-19 1997-07-15 Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL331249A1 PL331249A1 (en) 1999-07-05
PL190615B1 true PL190615B1 (pl) 2005-12-30

Family

ID=9494450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97331249A PL190615B1 (pl) 1996-07-19 1997-07-15 Kompozycja szczepionki dla świń, zastosowanie kompozycji szczepionki, zestaw do szczepienia, szczepionka dla świń i zastosowanie plazmidu

Country Status (20)

Country Link
US (2) US6207165B1 (pl)
EP (1) EP0912743B1 (pl)
JP (1) JP2001500111A (pl)
KR (1) KR100496249B1 (pl)
CN (2) CN1329513C (pl)
AR (1) AR007864A1 (pl)
AU (1) AU735291B2 (pl)
BR (1) BR9710740A (pl)
CA (1) CA2261346C (pl)
CO (1) CO4750676A1 (pl)
DE (1) DE69734284T2 (pl)
DK (1) DK0912743T3 (pl)
ES (1) ES2251030T3 (pl)
FR (1) FR2751224B1 (pl)
HU (1) HUP9903822A3 (pl)
PL (1) PL190615B1 (pl)
RU (1) RU2305559C2 (pl)
TW (1) TW589190B (pl)
UA (2) UA91675C2 (pl)
WO (1) WO1998003658A1 (pl)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU762901B2 (en) * 1996-07-19 2003-07-10 Merial Polynucleotide vaccine formula for treating porcine respiratory and reproductive diseases
EP0863151A1 (en) * 1997-02-12 1998-09-09 Akzo Nobel N.V. "Canine parvovirus dna vaccines"
CA2223029A1 (en) 1997-02-12 1998-08-12 Akzo Nobel Nv Canine parvovirus dna vaccines
FR2776294B1 (fr) * 1998-03-20 2001-06-22 Merial Sas Nouveaux circovirus porcins ; vaccins et reactifs de diagnostic
US7192594B2 (en) * 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
DE07008633T1 (de) * 1997-12-11 2008-12-18 Merial Virus des multisystemischen Kümmersyndroms bei Absatzferkeln
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
FR2804028B1 (fr) * 2000-01-21 2004-06-04 Merial Sas Vaccins adn ameliores pour animaux de rente
KR20030054139A (ko) * 2001-12-24 2003-07-02 학교법인 건국대학교 돼지 오제스키병 바이러스의 ｇＤ 유전자를 포함하는재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 ＤＮＡ 백신
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
US20060160759A1 (en) * 2002-09-28 2006-07-20 Jianzhu Chen Influenza therapeutic
EP2390352A1 (en) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
US7468273B2 (en) 2003-05-01 2008-12-23 Meial Limited Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use
US20050214316A1 (en) 2003-11-13 2005-09-29 Brown Thomas P Methods of characterizing infectious bursal disease virus
US7527967B2 (en) * 2003-11-25 2009-05-05 Academia Sinica Recombinant baculovirus and virus-like particle
US20050202484A1 (en) 2004-02-19 2005-09-15 The Governors Of The University Of Alberta Leptin promoter polymorphisms and uses thereof
HRP20100314T1 (hr) 2005-04-25 2010-08-31 Merial Ltd. Cjepivo protiv nipah virusa
US20080241184A1 (en) 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
US7771995B2 (en) 2005-11-14 2010-08-10 Merial Limited Plasmid encoding human BMP-7
JP2009515529A (ja) 2005-11-14 2009-04-16 メリアル リミテッド 腎不全のための遺伝子療法
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
US20080274137A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-06 Jean Christophe Francis Audonnet DNA plasmids having improved expression and stability
MX2009011851A (es) 2007-05-02 2010-03-04 Merial Ltd Plasmidos de dna que tienen expresion y estabilidad mejoradas.
RU2559527C2 (ru) 2008-11-28 2015-08-10 Мериал Лимитед Рекомбинантная вакцина от птичьего гриппа и её применение
MX2011010406A (es) 2009-04-03 2012-01-20 Merial Ltd Vacunas aviares vectorizadas con el virus de la emfermedad de newcastle.
WO2011090708A2 (en) 2009-12-28 2011-07-28 Merial Limited Recombinant ndv antigen and uses thereof
US20130197612A1 (en) 2010-02-26 2013-08-01 Jack W. Lasersohn Electromagnetic Radiation Therapy
RU2575599C2 (ru) 2010-03-12 2016-02-20 Мериал Лимитед Рекомбинантные вакцины против вируса "синего языка", их применение
CN102373181B (zh) * 2010-08-09 2014-06-11 中山大学 猪流感病毒和猪蓝耳病病毒混合病毒样颗粒、制备方法和应用
CN102370976B (zh) * 2010-08-09 2014-06-11 中山大学 猪流感病毒和猪口蹄疫病毒的混合病毒样颗粒、制备方法和应用
EP3156070A3 (en) 2010-08-31 2017-06-14 Merial Inc. Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
AU2012240240A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
WO2012138789A2 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
WO2012145577A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Merial Limited Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile
EP2701736A1 (en) 2011-04-25 2014-03-05 Advanced Bioscience Laboratories, Inc. Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto
PH12013502265A1 (en) 2011-05-07 2014-01-06 Laboratorio Avi Mex S A De C V Recombinant vaccine against prrs in a viral vector
ES2764079T3 (es) 2011-05-27 2020-06-02 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Vacunas genéticas contra el virus Hendra y el virus Nipah
JP6096176B2 (ja) * 2011-05-27 2017-03-15 シノヴェット （ベイジン） バイオテクノロジー カンパニー，リミテッド ブタウイルス感染の予防のための混合ワクチン
CA2837375C (en) 2011-06-01 2019-07-16 Merial Limited Needle-free administration of prrsv vaccines
HUE035774T2 (en) 2011-08-12 2018-05-28 Merial Inc Biological substances, in particular vaccines, preserved by vacuum
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
CA2864106C (en) 2012-02-14 2017-10-17 Merial Limited Rotavirus subunit vaccines and methods of making and use thereof
CA2864119C (en) 2012-02-14 2022-05-24 Merial Limited Recombinant poxviral vectors expressing both rabies and ox40 proteins, and vaccines made therefrom
WO2013138776A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merial Limited Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g
BR112014031133B1 (pt) 2012-06-13 2023-02-07 The University Court Of The University Of Glasgow Vacinas reordenadas de btv e ahsv
CN102807989B (zh) * 2012-08-01 2014-04-23 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法
WO2014164697A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Merial Limited Reverse genetics schmallenberg virus vaccine compositions, and methods of use thereof
EP2985288B1 (en) * 2013-05-31 2019-11-13 Pulike Biological Engineering, Inc. Porcine pseudorabies virus, vaccine composition and preparation method and use thereof
KR102319843B1 (ko) 2013-09-25 2021-10-29 조에티스 서비시즈 엘엘씨 Pcv2b 분지형 백신 조성물 및 사용 방법
CN105251000B (zh) * 2014-09-30 2018-12-14 普莱柯生物工程股份有限公司 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用
US10010499B2 (en) 2014-11-03 2018-07-03 Merial Inc. Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
CA2990643C (en) 2015-06-23 2023-10-17 Merial, Inc. Prrsv minor protein-containing recombinant viral vectors and methods of making and use thereof
CN105693827B (zh) * 2015-06-29 2020-05-15 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN104998256A (zh) * 2015-07-14 2015-10-28 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种猪用三联灭活疫苗的制备方法
EP3337503A1 (en) 2015-08-20 2018-06-27 Merial, Inc. Fcv recombinant vaccines and uses thereof
HUE065661T2 (hu) 2015-09-29 2024-06-28 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Kutya parvovírus (CPV) vírusszerû részecske (VLP) vakcinák és alkalmazásuk
EP3380119B1 (en) 2015-11-23 2021-08-25 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Fmdv and e2 fusion proteins and uses thereof
TWI760322B (zh) 2016-01-29 2022-04-11 美商百靈佳殷格翰動物保健美國有限公司 重組腺病毒載體裝載之fmdv疫苗及其用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8901651A (nl) * 1989-06-29 1991-01-16 Centraal Diergeneeskundig Inst Vaccin tegen pestivirusinfecties, zoals varkenspest; daarvoor bruikbare nucleotidesequenties en polypeptiden.
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
PL178609B1 (pl) * 1993-02-08 2000-05-31 Bayer Ag Izolat wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń zwanego PRRSV, sposób namnażania izolatu PRRSV, klon linii komórkowej, hodowla tkankowa zawierająca izolat PRRSV, szczepionka efektywna w ochronie świń przeciw PRRSV oraz sposób wytwarzania szczepionki efektywnej w ochronie świń przeciw PRRSV
DE69536091D1 (de) * 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
US5516905A (en) * 1994-08-30 1996-05-14 University Of Massachusetts Medical Center Antibiotic compounds and methods to treat gram-positive bacterial and mycoplasmal infections
AU711915B2 (en) * 1995-12-21 1999-10-21 Dimminaco Ag Plasmid vaccine against pseudorabies virus

Also Published As

Publication number Publication date
CN101121023A (zh) 2008-02-13
HUP9903822A2 (hu) 2000-03-28
UA77935C2 (uk) 2007-02-15
FR2751224A1 (fr) 1998-01-23
TW589190B (en) 2004-06-01
CA2261346A1 (en) 1998-01-29
CO4750676A1 (es) 1999-03-31
US6207165B1 (en) 2001-03-27
KR100496249B1 (ko) 2006-01-27
JP2001500111A (ja) 2001-01-09
HUP9903822A3 (en) 2010-01-28
ES2251030T3 (es) 2006-04-16
AU735291B2 (en) 2001-07-05
CN1329513C (zh) 2007-08-01
EP0912743B1 (fr) 2005-09-28
RU2002133052A (ru) 2005-01-20
AR007864A1 (es) 1999-11-24
DE69734284T2 (de) 2006-07-13
PL331249A1 (en) 1999-07-05
UA91675C2 (ru) 2010-08-25
DK0912743T3 (da) 2006-01-30
RU2305559C2 (ru) 2007-09-10
FR2751224B1 (fr) 1998-11-20
US6576243B1 (en) 2003-06-10
WO1998003658A1 (fr) 1998-01-29
DE69734284D1 (de) 2006-02-09
CA2261346C (en) 2012-01-03
AU3699197A (en) 1998-02-10
BR9710740A (pt) 1999-08-17
CN1225684A (zh) 1999-08-11
KR20000065256A (ko) 2000-11-06
EP0912743A1 (fr) 1999-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL190615B1 (pl) Kompozycja szczepionki dla świń, zastosowanie kompozycji szczepionki, zestaw do szczepienia, szczepionka dla świń i zastosowanie plazmidu
US6228846B1 (en) Polynucleotide vaccine formula against canine pathologies
US6376473B1 (en) Polynucleotide vaccine formula in particular against bovine respiratory pathology
PL188409B1 (pl) Szczepionki do leczenia koni, zastosowanie plazmidu do wytwarzania szczepionki i zestaw do szczepienia koni
HU224833B1 (en) Intradermal bovine polynucleotide vaccine
JP2004313196A (ja) コロナウイルスに対するワクチン接種用組成物および方法
PL194348B1 (pl) Szczepionki DNA i zastosowanie polimerów kwasu akrylowego albo metakrylowego oraz kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej oraz zastosowanie karbopolu
AU762901B2 (en) Polynucleotide vaccine formula for treating porcine respiratory and reproductive diseases
TWI912376B (zh) 減毒之豬流行性下痢病毒
US7294338B2 (en) Polynucleotide vaccine formula against canine pathologies, in particular respiratory and digestive pathologies
AU776827B2 (en) Polynucleotide vaccine formula, particularly for treating bovine respiratory disease
JP2023543033A (ja) 弱毒化ブタ流行性下痢ウイルス
NZ506427A (en) A canidae vaccine comprising the rabies G gene under the control of the CMV-IE promoter