PL191389B1

PL191389B1 - Kompozycja dla zmniejszania absorpcji cholesterolu, sposób przygotowywania produktów spożywczych o zmniejszonej przyswajalności cholesterolu, kompozycja spożywcza obejmująca produkt spożywczy zawierający cholesterol i dodatek do żywności oraz sposób wytwarzania wodnej, jednorodnej mieszaniny micelarnej sterolu roślinnego i lecytyny

Info

Publication number: PL191389B1
Application number: PL345163A
Authority: PL
Inventors: Richard E. Ostlund Jr
Original assignee: Univ Washington
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1999-03-25
Publication date: 2006-05-31
Also published as: CA2332983C; BR9910719A; EP1082029A1; ES2310034T3; CZ299194B6; JP2002516260A; ATE404076T1; EP1082029B1; DE69939315D1; PL345163A1; AU3360999A; WO1999060869A1; AU762738B2; HUP0302902A2; WO1999060869A8; HUP0302902A3; US5932562A; CA2332983A1; JP3755064B2; CZ20004400A3

Abstract

1. Kompozycja dla zmniejszania absorpcji cholesterolu, znamienna tym, ze stanowi wodna homo- geniczna mieszanine micelarna sterolu roslinnego i lecytyny wysuszona na bardzo drobny proszek roz- puszczalny w wodzie, przy czym stosunek molowy sterolu roslinnego do lecytyny miesci sie w zakresie 1:1 do 1:10. 7. Sposób przygotowywania produktów spozywczych o zmniejszonej przyswajalnosci cholesterolu, znamienny tym, ze do produktów spozywczych zawierajacych cholesterol dodaje sie silnie rozdrobnio- nego, rozpuszczalnego w wodzie proszku wytworzonego z wysuszonej wodnej, jednorodnej mieszaniny micelarnej sterolu roslinnego i lecytyny, przy czym stosunek molowy sterolu roslinnego do lecytyny mie- sci sie w zakresie 1:1 do 1:10; a ilosc wymienionej mieszaniny dodanej do produktu spozywczego jest taka, aby uzyskac dawke od okolo 100 mg do okolo 1000 mg sitostanolu. 8. Kompozycja spozywcza obejmujaca produkt spozywczy zawierajacy cholesterol i dodatek do zyw- nosci, znamienna tym, ze dodatek do zywnosci jest rozpuszczalna w wodzie, jednorodna mieszanina micelarna sitostanolu i lecytyny o stosunku molowym sitostanolu do lecytyny mieszczacym sie w zakresie 1:1 do 1:10. 11. Sposób wytwarzania wodnej, jednorodnej mieszaniny micelarnej sterolu roslinnego i lecytyny, zna- mienny tym, ze sterol roslinny, lecytyne i wode miesza sie przy uzyciu duzych sil scinajacych do uzyskania jednorodnosci, przy czym stosunek molowy sterolu roslinnego do lecytyny miesci sie w zakresie 1:1 do 1:10. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Fitosterole są sterolami roślinnymi o budowie podobnej do cholesterolu, są znane od wielu lat jako środki zmniejszające absorpcję cholesterolu i poziom zawartości cholesterolu w osoczu, same nie będąc absorbowanymi. Obniżenie poziomu zawartości cholesterolu w układzie krążenia i cholesterolu zawartego w liproproteinach o małej gęstości jest ważną częścią strategii zapobiegania i leczenia choroby układu krwionośnego, a szczególnie choroby wień cowej serca. Absorpcja cholesterolu stanowi krytyczny składnik metabolizmu cholesterolu w całym ciele. Cholesterol pochodzący z poż ywienia, a także z endogennego wydzielania żółci, trafia do jelit i około 50% ilości tych wymieszanych składników docierającej do jelit ulega absorpcji (Bosner, M.S., Ostlund, R.E., Jr., Osofisan, O., Grosklos, J., Fritschle, C., Lange, L.G., 1993). Niezdolność do ilościowej absorpcji cholesterolu stanowi więc kluczowy mechanizm eliminacji cholesterolu z ciała.

Leki stosowane zwykle do leczenia przypadków występowania wysokiego poziomu cholesterolu mają niewielki lub żaden wpływ na absorpcję cholesterolu. Na przykład, silne nowe inhibitory reduktazy koenzymu A, w postaci hydroksymetyloglutarylu odznaczają się głównie działaniem zmierzającym raczej do ograniczenia syntezy cholesterolu niż do zwiększenia jego eliminacji. Środki izolujące kwas żółciowy, takie jak żywica jonowymienna, cholestyramina, działają w jelitach, ale nie wiążą cholesterolu i mogą w istocie zwiększyć absorpcję cholesterolu przy przedłużonym podawaniu (McNamara, D.J., N.O.Davidson, P. Samuel i E. H. Ahrens, Jr. 1980, „Cholesterol absorption in man: effect of administration of clofibrate and/or cholestyramine”, J. Lipid Res. 21:1058-1064). Chociaż podawana doustnie neomycyna zmniejsza skutecznie absorpcję cholesterolu, to jest toksyczna i ma tę wadę, ż e wymaga przedłużonego podawania silnego antybiotyku (Samuel, P., 1979, „Treatment of hypercholesterolemia with neomycin - A time for reappraisal”, N.Engl. J.Med. 301:595-597). Lek Cytellin^®, wodną zawiesinę mieszaniny fitosteroli, wytworzyła firma Eli Lilly Co. dla leczenia podwyższonego poziomu cholesterolu, lecz nie był on sprzedawany od 1985r. Jak widać, jest oczywiste, że nowe inhibitory absorpcji cholesterolu uzupełniłyby stosowane obecnie sposoby leczenia przypadków występowania wysokiego poziomu zawartości cholesterolu w osoczu.

Skoro fitosterole są produktami naturalnymi, stanowiącymi nietoksyczne i niedrogie produkty uboczne przetwórstwa żywności, to mogą one być ważnymi środkami do leczenia osobników o nieznacznie podwyższonym poziomie zawartości cholesterolu w osoczu lub środkami dla całej ludności w produktach żywnoś ciowych lub dodatkach do ż ywności. Zastosowanie fitosteroli może zmniejszyć potrzebę stosowania leków wchłanianych ogólnoustrojowo.

Pomimo ich potencjalnej atrakcyjności, użyteczność fitosteroli była ograniczona przez małą i zmienną skuteczność oraz konieczność stosowania duż ych dawek. Na przykład, dawki 5-18 g sitosterolu/dzień zmniejszały ilość cholesterolu surowiczego o 16-20% (Farqhar, J.W. i M. Sokolow, 1958). Badanie reakcji na dawkę wykazało, że 3-9 g/dzień sproszkowanego sitosterolu było wymagane do obniżenia poziomu cholesterolu surowiczego o 12% (Lees, A.M., H. Y.I. Mok, R.S. Lees, M.A.McCluskey i S.M.Grundy. 1977, „Plant sterols as cholesterol-lowering agents:clinical trials in patients with hypercholesterolemia and studies of sterol balance”, Atherosclerosis 28:325-338). Dla zmniejszenia wymaganej ilości, w niedawnych doświadczeniach zastosowano sitostanol zamiast sitosterolu, gdyż wydaje się on silniejszy niż inne fitosterołe i nie ulega absorpcji (Sugano,

J., H.Morioka, and I.Ikeda., (1977), „A comparison of hypocholesterolemic activity of β-sitostanol in rats”, J.Nutr. 107:2011-2019). U osobników w stanie ciężkiej hipercholesterolemii, sitostanol w ilości

I, 5 g/dzień zmniejszył ilość cholesterolu surowiczego o 15% (Heinemann, T., O. Leiss i K. von Bergmann (1986) „Effect of low-dose sitostanol on serum cholesterol in patients with hypercholesterolemia”, Atherosclerosis 61:219-223). Jednakże, sitostanol w ilości 3 g/dzień nie wywarł żadnego wpływu na osobniki z umiarkowaną hipercholesterolemią (Denke, M.A. (1995), „Lack of efficacy of low-dose sitostanol therapy as an adjunct to a cholesterol-lowering diet in men with moderate hypercholesterolemia”, Am. J. Clin. Nutr. 61:392-396).

Liczni badacze proponowali sposoby zwiększenia rozpuszczalności lub biodostępności fitosteroli, w celu zwiększenia ich użyteczności. W oparciu o badania na szczurach i stwierdzenie, że estry fitosterolu są znacznie lepiej rozpuszczalne w oleju niż wolne sterole, zaproponowano zastosowanie estrów fitosteroli w oleju dla zmniejszenia absorpcji cholesterolu (Mattson, F.H., RA. Volpenhein i B.A: Erickon, (1977), „Effect of plant sterol esters on the absorption of dietary cholesterol”,

J. Nutr. 107:1139-1146). W opisie patentowym US 5502045 ujawniono zastosowanie estru sitostanolu w oleju dla leczenia hipercholesterolemii u ludzi. Stwierdzono, że 2,8 g sitostanolu/dzień,

PL 191 389 B1 podane w postaci estru sitostanolu w margarynie, zmniejszyło cholesterol LDL o 16% (Miettinen, T.A., P. Puska, H. Gylling, H. Vanhanen i E. Vartiainen, (1995), „Reduction of serum cholesterol with sitostanol-ester margarine in a mildly hypercholesterolemic population”, N. England J. Med. 333:1308-1312). Jednakże, zastosowanie estru sitostanolu rozpuszczonego w tłuszczu spożywczym ma tę wadę, że wymaga podawania 23-50 g/dzień tłuszczu spożywczego, co jest o 21% mniej skuteczne w zmniejszaniu absorpcji cholesterolu u ludzi w porównaniu ze sterolem nieestryfikowanym (Mattson, F.H., S.M. Grundy i J.R. Crouse, (1982), „Optimizing the effect of plant sterols on cholesterol absorption in man”, Am. J. Clin. Nutr. 35:697-700).

Inni badacze badali sposoby poprawy użyteczności nieestryfikowanych fitosteroli. Opisany w zgłoszeniu WO 95/00158 kompleks sitosterolu i niewchłanialnej spoż ywczej, włóknistej pektyny zmniejszał cholesterol surowiczy o 16,4% po podaniu ludziom cierpiącym na hipercholesterolemię w dawce 2,1 g/dzień. Jednakż e, nie wykonano żadnych pomiarów wpływu na absorpcję cholesterolu, a kompleks był rozpuszczalny tylko w około 50%, nawet przy silnie zasadowym pH, co sugerowało ograniczoną biodostępność składnika sitosterolowego.

W opisie patentowym US 5244887 ujawniono zastosowanie stanoli włą cznie z sitostanolem, w dodatkach do ż ywnoś ci, dla zmniejszenia absorpcji cholesterolu. Zgodnie z opisem patentowym US 5244887, przy wytwarzaniu dodatków, sitostanol rozpuszcza się z jadalnym środkiem ułatwiającym rozpuszczanie, takim, jak trigliceryd, przeciwutleniaczem, takim, jak tokoferol i środkiem dyspergującym, takim, jak lecytyna, Polisorbat 80 lub laurylosiarczan sodu. Jednakże nie podano żadnych danych pozwalających wybrać najskuteczniejsze składniki i ich ilości lub właściwe sposoby wytwarzania. Nie określono również skuteczności zmniejszania absorpcji cholesterolu. Korzystny wariant realizacji przewiduje zawartość 25% wagowych stanoli w oleju roślinnym, lecz rozpuszczalność steroli w oleju wynosi tylko 2%.

W opisie patentowym US 5118671 ujawniono wytwarzanie kompleksów sitosterol-lecytyna do użytku farmaceutycznego, lecz nie przewidziano zastosowania doustnego dla zmniejszenia ilości cholesterolu.

Cholesterol jest absorbowany z jelitowej fazy micelarnej zawierającej sole żółciowe i fosfolipidy, będącej w równowadze z fazą olejową wewnątrz jelita. Podawanie fitosterolu w postaci stałego proszku lub wodnej zawiesiny nie jest korzystne z uwagi na ograniczoną prędkość i zakres rozpuszczalności w ciekłych fazach jelitowych. Estryfikacja fitosterolu i podawanie poprzez fazę olejową żywności jest drogą alternatywną, lecz ma ona wadę użycia olejów jadalnych jako nośnika.

Zgodnie z powyższym, celem przedmiotowego wynalazku jest zapewnienie układu podawania steroli roślinnych, szczególnie sitostanolu, który omija fazę olejową i zapewnia biodostępny sitostanol na takim poziomie, przy którym następuje zmniejszenie absorpcji cholesterolu aż o 37%, stosując równocześnie emulgator o dobrym smaku, w możliwie jak najmniejszych ilościach.

Celem przedmiotowego wynalazku jest również zapewnienie sposobu wytwarzania suchego, silnie rozdrobnionego, rozpuszczalnego w wodzie proszku, który zawiera sterol roślinny, korzystnie sitostanol i lecytynę i który jest dobrze rozpuszczalny w wodzie, tak, aby w zetknięciu z układem wodnym tworzył wodny kompleks pęcherzykowy, który może wnikać bezpośrednio do jelitowej fazy micelarnej, aby hamować absorpcję cholesterolu.

Przedmiotem wynalazku jest zatem kompozycja dla zmniejszania absorpcji cholesterolu, znamienna tym, że stanowi wodną homogeniczną mieszaninę micelarną sterolu roślinnego i lecytyny wysuszoną na bardzo drobny proszek rozpuszczalny w wodzie, przy czym stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny mieści się w zakresie 1:1 do 1:10.

Korzystnie, w kompozycji według wynalazku stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny wynosi co najmniej 1:2

W innym korzystnym wariancie realizacji kompozycji według przedmiotowego wynalazku stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny mieści się w zakresie 1:2 do 1:4.

W dalszym korzystnym wariancie realizacji kompozycji według przedmiotowego wynalazku mieszanina micelarna jest mieszaniną pęcherzyków zawierających sterol roślinny i lecytynę.

W kolejnym korzystnym wariancie realizacji kompozycja według przedmiotowego wynalazku jako sterol roślinny zawiera sitostanol.

W nastę pnym korzystnym wariancie realizacji kompozycja według przedmiotowego wynalazku zawiera dodatkowo lizolecytynę w stosunku molowym do lecytyny wynoszącym co najmniej 0,2.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób przygotowywania produktów spożywczych o zmniejszonej przyswajalności cholesterolu, charakteryzują cy się tym, że do produktów spoż yw4

PL 191 389 B1 czych zawierających cholesterol dodaje się silnie rozdrobnionego, rozpuszczalnego w wodzie proszku wytworzonego z wysuszonej wodnej, jednorodnej mieszaniny micelarnej sterolu roślinnego i lecytyny, przy czym stosunek molowy sterolu roś linnego do lecytyny mieści się w zakresie 1:1 do 1:10; a ilość wymienionej mieszaniny dodanej do produktu spożywczego jest taka, aby uzyskać dawkę od około 100 mg do około 1000 mg sitostanolu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja spożywcza obejmująca produkt spożywczy zawierający cholesterol i dodatek do żywności, znamienna tym, że dodatek do żywności jest rozpuszczalną w wodzie, jednorodną mieszaniną micelarną sitostanolu i lecytyny o stosunku molowym sitostanolu do lecytyny mieszczącym się w zakresie 1:1 do 1:10.

Korzystnie w kompozycji według przedmiotowego wynalazku produkt spożywczy jest stałym produktem spożywczym.

W innym korzystnym wariancie realizacji kompozycji według wynalazku produkt spoż ywczy jest napojem.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wodnej, jednorodnej mieszaniny micelarnej sterolu roślinnego i lecytyny, znamienny tym, że sterol roślinny, lecytynę i wodę miesza się przy użyciu dużych sił ścinających do uzyskania jednorodności, przy czym stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny mieści się w zakresie 1:1 do 1:10.

Korzystnie w sposobie według przedmiotowego wynalazku mieszanie prowadzi się przy pomocy ultradźwięków.

W innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według przedmiotowego wynalazku jako sterol roślinny stosuje się sitostanol.

Kompleks fitosterolu (sterolu roślinnego) z lecytyną wytwarza się przez zmieszanie przy użyciu dużych sił ścinających, na przykład przez wirowanie, mieszanie, działanie ultradźwiękami lub przepuszczanie przez mały otwór mieszaniny fitosterolu i lecytyny w wodzie. Rozproszony materiał stosuje się następnie w otrzymanej postaci lub suszy się, na przykład stosując liofilizację lub suszenie rozpyłowe. Kompleks można stosować w postaci ciekłej, zanim zostanie wysuszony dowolnym sposobem lub można go suszyć, jak wskazano, a następnie po ponownym zetknięciu z cieczą tworzy on wodny kompleks pęcherzykowy, który może wnikać bezpośrednio do jelitowej fazy micelarnej. Nie stosuje się żadnego tłuszczu jako nośnika i nieoczekiwanie układ, nawet po wysuszeniu, nie zmienia swej budowy fizycznej w postaci miceli zawierających pęcherzyki, z których większość zawiera pewną ilość sterolu roślinnego i pewną ilość lecytyny.

Jak wspomniano uprzednio, niniejszy wynalazek różni się od dotychczasowych zastosowań steroli roślinnych i sitostanolu pod wieloma znaczącymi względami.

Po pierwsze, dawka wymagana dla zmniejszenia absorpcji cholesterolu jest mniejsza niż podano uprzednio, a mianowicie wynosi 25-300 mg sitostanolu. Po drugie, korzystny preparat nie zawiera triglicerydów lub olejów. Fitosterol nie jest rozpuszczony w tłuszczu, lecz połączony z fosfolipidem (lecytyną), tworząc wolny kompleks pęcherzykowy, który może wnikać bezpośrednio do jelitowej fazy micelarnej. Po trzecie, mieszaninę można wytworzyć w postaci stałej, susząc wodny preparat pęcherzykowy sitostanolu z lecytyną pełniącą rolę emulgatora, przy utrzymaniu rozpuszczalności w sztucznej żółci. Po czwarte, mieszanina jest skuteczna, gdy spożywa się ją osobno w stosunku do żywnoś ci zawierającej cholesterol. Po piąte, mieszaninę moż na dodawać do produktów żywnościowych i napojów niezawierających cholesterolu i tłuszczu. Po szóste, mieszaninę wytwarza się w sposób zapobiegający autoasocjacji sitostanolu, co ma miejsce, gdy suszy się ją z rozpuszczalników organicznych zawierają cych sitostanol i ś rodki ułatwiają ce rozpuszczanie. Opisywana tu mieszanina ma zaletę dużej biodostępności, zbadanej in vitro w połączeniu ze sztuczną żółcią. Jest to znacząca cecha, której nie można osiągnąć stosując układy nośnika tłuszczowego.

Kompozycja jest użyteczna dla zmniejszania absorpcji cholesterolu u ludzi, w dawkach pomiędzy 10 i 1000 mg, a korzystną jest dawka 100-300 mg. Dawka jest mniejsza niż wymagana zgodnie z obecnymi zaleceniami. Kompozycję można stosować jako lek w postaci kapsułek lub tabletek lub jako dodatek do żywności. Alternatywnie, można ją stosować w żywności, jako dodatek do żywności lub substancję ogólnie uznaną za bezpieczną przy spożyciu przez ludzi.

Przy wytwarzaniu kompozycji użytecznej dla zmniejszania ilości cholesterolu, w postaci o dobrej biodostępności, pierwszy etap polega na uzyskaniu wodnej, jednorodnej, micelarnej mieszaniny sterolu roślinnego z lecytyną.

Korzystny sposób przewiduje użycie sitostanolu, gdyż tylko małe ilości są absorbowane w jelicie cienkim, lecz z drugiej strony, ten sterol roślinny wykazuje duże działanie hamujące absorpcję

PL 191 389 B1 cholesterolu. Odpowiednie są także podobne związki, włącznie z sitosterolem, kampesterolem, kampestanolem, stigmasterolem. Ponadto użyteczne w tym celu są również lignany, takie, jak sezamina i saponiny, lecz korzystny jest sitostanol.

Fosfolipidem stosowanym w przedmiotowym wynalazku jest lecytyna, a najkorzystniejszym układem fosfolipidowym użytecznym dla zwiększenia biodostępności jest mieszanina lecytyny i lizolecytyny. Gdy stosuje się mieszaninę, to korzystny stosunek molowy lecytyny do lizolecytyny wynosi co najmniej 1:0,2, korzystnie 1:0,5.

W tym pierwszym etapie, wodną jednorodną mieszaninę sterolu roś linnego i lecytyny miesza się aż do uzyskania jednorodności otrzymując mieszaninę micelarną. Korzystnym rodzajem mieszania jest mieszanie z wykorzystaniem dużych sił ścinających. Przykładowo, można stosować wirowanie, działanie ultradźwiękami, przepuszczanie przez mały otwór, takie jak w prasie francuskiej lub inne rodzaje mieszania. Najkorzystniejszym mieszaniem jest działanie ultradźwiękami. Powoduje ono rozproszenie materiału i zwiększa tworzenie mieszaniny micelarnej zawierającej pęcherzyki, które w większości zawierają pewną ilość sterolu roślinnego i pewną ilość lecytyny.

Zwykle, w odniesieniu do działania ultradźwiękami, można stosować dowolny sposób stosowany do wytwarzania emulsji, aby wytworzyć jednorodne mieszaniny sterolu roślinnego i lecytyny, oddzielnie lub w kombinacji. Na przykład, mieszarki Waringa lub inne mieszalniki o dużych siłach ścinających mogą zapewnić akceptowalne wyniki. Można stosować mikrofluidyzator. W tym ostatniej fazie procesu sterol roślinny i lecytynę przeciska się przez ceramiczne kapilary pod wysokim ciśnieniem. Gdy stosuje się korzystną technikę działania ultradźwiękami, to wystarczający czas tego działania mieści się w zakresie 1,5 minuty do około 4 minut. W doświadczeniach w małej skali, działanie ultradźwiękami wykonuje się zwykle w ciągu około 1,5 minuty.

Proces suszenia nie jest krytyczny tak długo, jak długo nie powoduje zniszczenia kompleksu pęcherzykowego utworzonego pomiędzy sterolem roślinnym i lecytyną. Zwykle, korzystne są łagodne sposoby suszenia, takie jak suszenie próżniowe, suszenie z wymrażaniem lub niskotemperaturowe suszenie powietrzem w temperaturze otoczenia. Gdy stosuje się ciepło, to temperatura w warunkach atmosferycznych nie powinna przekraczać 0°C.

Jak wcześniej wyjaśniono, dawka suchego proszku może wynosić od 10 do 1000 mg dziennie, a korzystna dawka wynosi 25 do 300 mg dziennie. Najkorzystniejsze dawki, pozwalające osiągnąć znaczące zmniejszenie absorpcji cholesterolu, wynoszą od 100 do 300 mg, jeden raz do czterech razy w ciągu dnia.

Następujące przykłady objaśniają dalej sposób według niniejszego wynalazku, lecz bez jego ograniczenia.

P r z y k ł a d 1

Sitostanol, znacznikową ilość [³H] sitostanolu i inne związki znajdywane w jelicie lub takie, które stosuje się zwykle jako dodatki do żywności, zmieszano razem w roztworze chloroformu, w określonych stosunkach molowych. Podwielokrotność, zawierającą 1,2 μmola sitostanolu, przeniesiono do rurki próżniowej i usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (<50 mtorr, tj. <6,666 Pa). Doświadczenie rozpoczęto dodając 0,5 ml sztucznej żółci (8 mM taurocholanu sodu zawierające 0,5 mM lecytyny sojowej i 0,15 mM NaCl, pH = 7,4), a następnie wirując z prędkością 8 obr./min przez minut w 37°C. Następnie rurkę wirowano w ciągu 1 minuty przy 17000 x g, aby wytrącić wszystkie ciała stałe, a nadsącz usunięto i dodano do płynu scyntylacyjnego dla zmierzenia promieniotwórczości i obliczono procent promieniotwórczości w nadsączu sztucznej żółci. Tabela 1 poniżej, obejmuje zestawienie rozpuszczalności mieszanin sitostanolu w obecności soli sztucznej żółci.

T a b e l a 1

Skład mieszaniny sterolowej suszonej z chloroformu	Rozpuszczalny sterol %
1	2
sam sitostanol	2,3
sitostanol + Tween-20 1:1 wagowo	7,8
sitostanol + taurocholan 1:1 wagowo	57,7
sitostanol + monooleina + dioleina 1:1:1 wagowo	14,5

PL 191 389 B1 ciąg dalszy tabeli 1

1	2
sitostanol + lecytyna 1:1 wagowo	38,2
sitostanol + lizolecytyna 1:1 wagowo	8,0
sitostanol + lecytyna + lizolecytyna 1:1:0,5 wagowo	97,9

Jak podano tabeli 1, sam sitostanol jest słabo rozpuszczalny w soli sztucznej żółci (2,3%), a dodatek Tween-20, polisorbinianowego emulgatora stosowanego w produktach ż ywnoś ciowych, zwiększa nieco rozpuszczalność do 7,8%. Rozpuszczalność sitostanolu można powiększyć 25-ciokrotnie, od 2,3% do 57,7%, jeśli suszy się go w obecności detergentu jonowego, takiego jak taurocholan sodu (sól kwasu żółciowego). Skoro sól kwasu żółciowego jest składnikiem procesu trawienia, zbadano także inne związki znajdywane w układzie pokarmowym. Monooleina i dioleina są produktami trawienia tłuszczu spożywczego, lecz jak przedstawiono w tabeli 1, spowodowały one tylko umiarkowane zwiększenie rozpuszczalności 2,3% do 14,5%. Żółć zawiera lecytynę, a ten fosfolipid zwiększył rozpuszczalność sitostanolu z 2,3% do 38,2%. Jednakże, produkt reakcji hydrolizy lecytyny przy pomocy fosfolipazy A2, lizolecytyna, powoduje niewielki wzrost rozpuszczalności sitostanolu, 2,3% do 8,0%. Nieoczekiwanie, gdy lecytynę i lizolecytynę zmieszano razem z sitostanolem, powstała stała mieszanina spowodowała prawie całkowitą rozpuszczalność sterolu 97,9%. Rozpatrywane łącznie, dane te wskazują, że stały sitostanol nie rozpuszcza się łatwo w sztucznej żółci, lecz może stać się rozpuszczalnym w różnym stopniu przez wprowadzenie innych związków do stałej mieszaniny. Ponadto, związek (lizolecytyna), który sam miał mały wpływ na rozpuszczalność sitosterolu, może dać znaczący wynik, gdy zastosuje się go w kombinacji z innymi środkami (lecytyną).

P r z y k ł a d 2

Sitostanol, znacznikową ilość [³H] sitostanolu i lecytynę zmieszano razem w chloroformie.

Dwie podwielokrotności zawierające 1,2 μmola sitostanolu usunięto, a chloroformowy rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, według opisu w przykładzie 1. Jedną podwielokrotność użyto bez dalszego przygotowania, a do drugiej dodano 500 μl wody i próbkę mieszaniny poddano działaniu ultradźwięków przez 5 minut przy 40% mocy w urządzeniu Fisher Sonic Dismembrator Model 300 wyposażonym w mikrokońcówkę. Następnie próbkę zamrożono przy pomocy suchego lodu z acetonem i liofilizowano usuwając wodę. Istotne jest utrzymanie temperatury próbki poniżej temperatury zamrażania, aby zapobiec wytrącaniu się sitostanolu z mieszaniny. Następnie określono rozpuszczalność każdej z tych próbek w sztucznej żółci, według opisu w przykładzie 1, a wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 2.

T a b e l a 2

Sposób suszenia próbki	Rozpuszczalny sterol, %
sitostanol, suszenie z chloroformu	2,3
sitostanol/lecytyna (stos. molowy 1:1), suszenie z chloroformu	38,2
sitostanol/lecytyna (stos. molowy 1:1), działanie ultradźwiękami w wodzie, liofilizacja	89,7

Dane wskazują na znaczenie lecytyny dla ułatwiania rozpuszczalności sitostanolu. Jednakże, sposób suszenia mieszaniny sitostanol/lecytyna również wpływa na następujące potem rozpuszczanie się sterolu. Gdy mieszaninę suszy się z chloroformu, to 38,2% sterolu jest rozpuszczalne w sztucznej żółci. Natomiast, gdy mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków, a następnie liofilizuje, to rozpuszczalność wzrasta do 89,7%. Wskazuje to na fakt, że rozpraszanie sitostanolu/lecytyny w środowisku wodnym, a następnie usuwanie wody jest korzystnym sposobem wytwarzania mieszanin sitostanol/lecytyna.

P r z y k ł a d 3

Skuteczność zmiennych ilości lecytyny dla rozpuszczalności sitostanolu badano tak, jak w przykładzie 1, z tym wyjątkiem, że po wirowaniu w 37°C przez 30 minut pozostały osadzający się

PL 191 389 B1 sitostanol ekstrahowano powtórnie dwukrotnie wirując z 0,5 ml dodatkowej sztucznej żółci i odwirowując. Uzyskano następujące wyniki:

T a b e l a 3

Stosunek molowy sitostanol : lecytyna	Rozpuszczalny sterol, %
1:1	53,1
1:2	67,9
1:10	67,6

Te dane wskazują, że nawet przy powtórzonej ekstrakcji i dodaniu dziesięciokrotnego nadmiaru lecytyny, znacząca ilość sitostanolu (32%) pozostała nierozpuszczalna. Gdy dodano [³H] fosfatydylocholinę jako znacznik zamiast [³H] sitostanolu, to ilość rozpuszczalnej lecytyny wyniosła 93,3%. To wskazuje, że lecytyna była prawie ilościowo wyekstrahowana z suszonego kompleksu sitostanol/lecytyna, podczas gdy ograniczająca ilość sitostanolu pozostała. A więc, sposoby rozpuszczania sitostanolu w sztucznej żółci muszą brać pod uwagę obecność pozostającego nierozpuszczalnego sitostanolu. Suszenie mieszanin sitostanol/lecytyna z bardziej polarnego rozpuszczalnika, takiego jak etanol lub z mniej polarnego, takiego jak heksan dało podobne wyniki.

P r z y k ł a d 4

Wpływ pęcherzyków z sitostanolem/lecytyną, poddanych działaniu ultradźwięków, na absorpcję cholesterolu u ludzi porównano z wpływem stałego sitostanolu dawkowanego w obecności lecytyny poddanej działaniu ultradźwięków. Sitostanol odwodniono przez dwukrotne rozpuszczenie w chloroformie i odparowanie, a następnie rozdrobniono na proszek w moździerzu z tłuczkiem. Dla przygotowania pęcherzyków z sitostanolem/lecytyną o stosunku molowym 1:3, 2,00 g sterolu dodano do 11,3 g oczyszczonej lecytyny sojowej w zlewce szklanej 150 ml. Dodano chloroform, mieszając, aby rozpuścić oba składniki, a następnie usunięto rozpuszczalnik wygrzewając na łaźni piaskowej w 65°C. Lecytynę sojową (11,3 g) bez sitostanolu przygotowano w taki sam sposób. Po usunięciu całego rozpuszczalnika umieszczono zlewki w naczyniu do liofilizacji i usunięto pozostały chloroform pod próżnią w ciągu co najmniej 24 godzin. Ciało stałe w każdej zlewce pokruszono następnie łopatką, dodano 120 ml dejonizowanej wody i mieszano zawiesinę energicznie przez jedną godzinę. Pęcherzyki wytworzono działając ultradźwiękami na zawartość każdej zlewki przy pomocy aparatu Branson Sonifier (podziałka 7) wyposażonego w małą końcówkę. Podczas działania ultradźwiękami zlewkę zanurzono w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Pęcherzyki zawierające tylko lecytynę powstały w ciągu 15-30 minut, lecz te, które zawierały zarówno sterol jak i lecytynę wymagały 30-45 min. Następnie próbki odwirowano przy 10000 x g przez 10 minut i przesączono przez filtr 5 μm, średnia średnica pęcherzyków określona aparatem Zetasizer, kalibrowanym przy pomocy standardu 250 nm, wynosiła 204,7 nm dla pęcherzyków lecytyny i 247,2 nm dla pęcherzyków z sitostanolem/lecytyną. Stężenie sitostanolu zmierzono enzymatycznie. Po przygotowaniu i identyfikacji pęcherzyki przechowywano przez noc w lodówce w 4°C. Następnego dnia próbki rozcieńczono wodą do 60 ml i dodano 500 mg Crystal Light (Kraft Food, Inc.) aromatyzowanego cytryną. Trzy kapsułki żołądkowe U.S.P. napełniono całkowitą ilością 1 g sitostanolu lub 1 g glukozy placebo dla każdego osobnika.

Sześciu normalnych osobników poddano trzem testom absorpcji cholesterolu w przypadkowej kolejności w odstępie 2 tygodni. W każdym z testów spożywano dietę według National Cholesterol Education Program Step 1 w ciągu 8 dni począwszy od pierwszego dnia badania. W czwartym dniu spożyto standaryzowane testowe śniadanie, złożone z 240 ml soku pomarańczowego, 240 ml pełnego mleka, 21 g płatków kukurydzianych i 60 g rogalika nasyconego 40 mg znacznika cholestero₂ lowego [26, 26, 26, 27, 27, 27 - ²H6] rozpuszczonego w 2,5 ml oleju kukurydzianego. Każdy osobnik spożył także napój zawierający bądź pęcherzyki z sitostanolem/lecytyną bądź pęcherzyki z lecytyną i trzy kapsułki zawierające bądź proszek sitostanolu bądź glukozę (placebo). Stężenie deuterowanego znacznika cholesterolowego w cholesterolu osocza krwi w dniu siódmym, i ósmym zmierzono przy pomocy chromatografii gazowej negatywnego jonu metanu jonizacji chemicznej/spektrometrii masowej. Zmniejszenie absorpcji cholesterolu określono dzieląc średnie stężenie deuterowanego cholesterolu w dniu siódmym, i ósmym przez stężenie występujące podczas badania, które obej8

PL 191 389 B1 mowało tylko pęcherzyki lecytyny i kapsułki glukozy i wyrażając wynik w procentach. Uzyskano następujące wyniki:

T a b e l a 4

Zastosowane działanie	Zmniejszenie absorpcji cholesterolu
1000 mg proszku sitostanolu	11,3+7,4% (p = 0,2)
700 mg pęcherzyków sitostanol/lecytyna	36,7±4,2% (p = 0,003)

Wyniki te wskazują, że w porównaniu z placebo, 1000 mg proszku sitostanolu nie zmniejszyło znacząco absorpcji cholesterolu. Jest to zbieżne z poprzednimi doniesieniami wskazującymi, że tylko wielogramowa dawka sitostanolu zmniejsza absorpcję cholesterolu. Jednakże, 700 mg pęcherzyków z sitostanolem/lecytyną zmniejszyło absorpcję cholesterolu o 37%, wskazując, że prawidłowo spreparowany sitostanol jest czynny i biodostępny.

P r z y k ł a d 5

Dla wykazania, że sitostanol/lecytyna redukują absorpcję cholesterolu w postaci farmakologicznej reakcji na dawkę, podano je w zmniejszonej ilości pięciu z sześciu osobnikom z przykładu 4 podczas czterech dodatkowych badań absorpcji cholesterolu. Dawkę 300 mg sitostanolu w pęcherzykach sitostanol/lecytyna porównano z lecytynowym placebo oraz dawkę 150 mg sitostanolu w pęcherzykach sitostanol/lecytyna porównano z innym lecytynowym placebo. Podano ilość kapsułek stałego sitostanolu lub placebo. Uzyskano następujące wyniki:

T a b e l a 5

Zastosowanie działania	Zmniejszenie absorpcji cholesterolu
300 mg pęcherzyków sitostanol/lecytyna	34,4±5,8% (p = 0,01)
95 mg pęcherzyków sitostanol/lecytyna	5,6±7,2% (nie znaczący)

Absorpcję cholesterolu zmniejszono prawie tak znacznie przy pomocy dawki 300 mg jak przy pomocy dawki 700 mg, co wskazuje na fakt, że ta ostatnia dawka jest nasycająca. Jest to zbieżne z poprzednią pracą , wskazują cą , że fitosterole nie blokują całkowicie absorpcji cholesterolu. Nie ma żadnego znaczącego wpływu dawki 95 mg na absorpcję cholesterolu.

Z powyż szych przykładów widać , ż e kompozycja wytworzona zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku jest biodostępna in vitro w żółci, w znaczący sposób obniża absorpcję cholesterolu i pozwala osiągnąć cel wynalazku.

Zrozumiałe jest, że możliwe są liczne modyfikacje w stosunku do dokładnych procedur i konkretnych składów kompozycji, które są zgodne z ideą wynalazku i wchodzą tym samym w jego zakres, bądź dokładnie, bądź na zasadzie ekwiwalentów.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja dla zmniejszania absorpcji cholesterolu, znamienna tym, że stanowi wodną homogeniczną mieszaninę micelarną sterolu roślinnego i lecytyny wysuszoną na bardzo drobny proszek rozpuszczalny w wodzie, przy czym stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny mieści się w zakresie 1:1 do 1:10.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny wynosi 1:2.
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny mieści się w zakresie 1:2 do 1:4.
4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszanina micelarna jest mieszaniną pęcherzyków zawierających sterol roślinny i lecytynę.
5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako sterol roślinny zawiera sitostanol.
6. Kompozycja według zastrz. 1, która zawiera dodatkowo lizolecytynę w stosunku molowym do lecytyny wynoszącym co najmniej 0,2.

PL 191 389 B1
7. Sposób przygotowywania produktów spożywczych o zmniejszonej przyswajalności cholesterolu, znamienny tym, że do produktów spożywczych zawierających cholesterol dodaje się silnie rozdrobnionego, rozpuszczalnego w wodzie proszku wytworzonego z wysuszonej wodnej, jednorodnej mieszaniny micelarnej sterolu roślinnego i lecytyny, przy czym stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny mieści się w zakresie 1:1 do 1:10; a ilość wymienionej mieszaniny dodanej do produktu spożywczego jest taka, aby uzyskać dawkę od około 100 mg do około 1000 mg sitostanolu.
8. Kompozycja spożywcza obejmująca produkt spoż ywczy zawierający cholesterol i dodatek do żywności, znamienna tym, że dodatek do żywności jest rozpuszczalną w wodzie, jednorodną mieszaniną micelarną sitostanolu i lecytyny o stosunku molowym sitostanolu do lecytyny mieszczącym się w zakresie 1:1 do 1:10.
9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, ż e produkt spożywczy jest stałym produktem spożywczym.
10. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że produkt spożywczy jest napojem.
11. Sposób wytwarzania wodnej, jednorodnej mieszaniny micelarnej sterolu roślinnego i lecytyny, znamienny tym, że sterol roślinny, lecytynę i wodę miesza się przy użyciu dużych sił ścinających do uzyskania jednorodności, przy czym stosunek molowy sterolu roślinnego do lecytyny mieści się w zakresie 1:1 do 1:10.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że mieszanie prowadzi się przy pomocy ultradźwięków.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako sterol roślinny stosuje się sitostanol.