PL191504B1

PL191504B1 - Sposób ilościowej oceny substratu biologicznego lub środowiskowego i czujnik biologiczny

Info

Publication number: PL191504B1
Application number: PL350333A
Authority: PL
Inventors: Naoki Shinozuka; Toru Yokoyama; Kenji Nakamura
Original assignee: Sapporo Immuno Diagnostic Lab
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2006-05-31
Also published as: EP1164370A4; WO2000057166A1; DE69919224T2; CA2366565A1; JP3403390B2; AU2853899A; KR20020011368A; ATE272836T1; ES2224614T3; AU758153B2; US6720164B1; DE69919224D1; EP1164370A1; EP1164370B1; PT1164370E; KR100490762B1; PL350333A1

Abstract

1. Sposób ilo sciowej oceny substratu biologicznego lub srodowiskowego w próbce, polegaj acy na elektrochemicznym wykrywaniu substancji wytworzonej w reakcji pomi edzy substratem a re- agentem zawieraj acym dehydrogenaz e, koenzym i przeno snik elektronów, znamienny tym, ze dodatkowo do reagentów wprowadza si e sól tetrazoliow a dla wytworzenia stabilizowanego forma- zonu wykrywanego przez zastosowanie uk ladu elektrod z materia lów elektrycznie przewodz acych, która to reakcja jest zdefiniowana przebiegiem nast epuj acych etapów reakcji: PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ilościowej oceny substratu biologicznego lub środowiskowego i czynnik biologiczny. Sposób ten jest metodą dogodnej i szybkiej oceny ilościowej substratów zawartych w różnych próbkach, na przykład w próbkach biologicznych, takich jak krew, mocz, ślina i pot, żywność i próbki pochodzenia środowiskowego, sposób ten można zrealizować za pomocą czujnika biologicznego. Dokładniej przedmiotem wynalazku jest sposób ilościowej oceny substratu drogą reakcji z zastosowaniem układu elektrod wykonanych z elektrycznie przewodzących materiałów i różnych odczynników oraz czujnik biologiczny z zastosowaniem tego układu.

Uważa się, że sposoby ilościowej oceny substratów z zastosowaniem dehydrogenaz i koenzymów są użyteczne w dziedzinie chemii analitycznej do badań klinicznych, analizy żywności, itp. Reakcja enzymatyczna z zastosowaniem dehydrogenazy i koenzymu jako katalizatorów oznacza reakcję, za pomocą której substrat zawarty w próbce utlenia się w sposób specyficzny i jednocześnie redukuje koenzym. Potwierdzono już kilkaset reakcji dehydrogenaz, które biegną in vivo. Te reakcje enzymatyczne są bardzo ważne, ponieważ można je wykorzystać do ilościowej oceny substratów w próbkach, pomiaru aktywności enzymatycznej, itp. W tych sposobach pomiaru wykrywa się zredukowane koenzymy utworzone w tych reakcjach.

Te zredukowane koenzymy utworzone jako produkty reakcji ocenia się ilościowo drogą chromatografii cieczowej (Analytical Biochemistry, tom 46, str. 118 (1985)), spektroskopii absorpcyjnej w nadfiolecie (Clinical Chemistry, tom 22, str. 151 (1976), itp. Wykorzystuje się także sposób, który polega na poddawaniu zredukowanego koenzymu reakcji redoks z utleniaczem wybranym spośród soli tetrazoliowych (japoński opis patentowy nr 286784/97, Analyst, tom 120, str. 113 (1995)), żelazicjanków, chinonów, cytochromów, jonów metali, itp., a następnie ilościowej ocenie tak utworzonego zredukowanego produktu drogą spektroskopii absorpcyjnej w obszarze widzialnym.

Jednak żaden z tych sposobów nie pozwala na dogodny i szybki pomiar, ponieważ konieczne jest tu przeprowadzenie obróbek wstępnych, takich jak rozcieńczanie albo rozdzielanie. Inny problem polega na konieczności stosowania kosztownej i na wielką skalę aparatury pomiarowej, gdy korzysta się z tych sposobów.

W ostatnich latach opracowano biologiczne czujniki oparte na wykrywaniu elektrochemicznym jako środku do dogodnej i szybkiej oceny ilościowej zredukowanych koenzymów utworzonych w reakcjach enzymatycznych. W takich przypadkach przewiduje się, że zredukowane koenzymy byłyby wykrywane bezpośrednio elektrochemicznie (Analytica Chimica Acta, tom 336, str. 57 (1996))). Jednak zredukowane koenzymy trudno poddają się reakcjom redoks z przenoszeniem elektronów i stąd konieczne jest stosowanie wysokiego potencjału w celu bezpośredniego utlenienia zredukowanego koenzymu na elektrodach. Jednak zastosowanie takiego wysokiego potencjału powoduje zanieczyszczenie i uszkodzenie elektrod albo powoduje skutki w postaci współistniejących substancji. Wysiłki w kierunku rozwiązania tych problemów poczyniono stosując przenośniki elektronów, jak widać z szeregu opublikowanych dotychczas sprawozdań i opisów patentowych dotyczących czujników biologicznych (japoński opis patentowy nr 165199/98). Przykłady przenośników elektronów stosowanych w czujnikach biologicznych obejmują aktualnie pochodne fenazyny, takie jak metylosiarczan 1-metoksy-5-metylofenazyniowy (1-metoksy-PMS) (Analyst, tom 119, str. 253 (1994)), błękit Meldola (Analytica Chimica Acta, tom 329, str. 215 (1996)), żelazicjanki (Analytical Chemistry, tom 59, str. 2111 (1987)), ferrocen (Analytical Chemistry, tom 70, str. 4320 (1988)) i chinony (Bioscience & Bioelectronics, tom 11, str. 1267 (1966)). Taki przenośnik elektronów redukuje się drogą reakcji redoks za pomocą zredukowanego enzymu, a tak utworzony zredukowany przenośnik elektronów łatwo ulega reakcji redoks przez przyłożenie potencjału do elektrod. Zatem wykrywanie można przeprowadzić drogą przykładania niższego potencjału w porównaniu z przypadkiem utleniania zredukowanego koenzymu bezpośrednio na elektrodach.

Twórcy niniejszego wynalazku sporządzili czujniki biologiczne zintegrowanego typu, składające się z odczynnika reakcyjnego, który zawiera różne dehydrogenazy, utleniony dwunukleotyd nikotynoamidoadeniny (NAD⁺) jako koenzym i przenośnik elektronów, 1-metoksy-PMS, z układem elektrod (japoński opis patentowy nr 201553/98, PCT/JP98/03194) i skonstruowanymi czujnikami biologicznymi, przez co można dokonać dogodnie i szybko oceny ilościowej różnych substratów. W tych czujnikach biologicznych nośnik absorpcyjny zawierający wszystkie odczynniki reakcyjne jest umieszczony pomiędzy elektrodą roboczą i elektrodą licznikową, które są wykonane z elektrycznie przewodzących materiałów techniką drukowania. Potwierdzono, że w ten sposób, w zależności od stężenia każdego substratu, można otrzymać prąd o bardzo korzystnej reakcji liniowej.

PL 191 504 B1

Jednak dalsze badania ujawniły, że w tych czujnikach biologicznych wciąż pojawiają się problemy polegające na tym, że prąd reakcji w obszarze niskiego stężenia substratu podlega wpływowi współistniejących substancji. Wydaje się, że przyczyną tego jest chemiczna nietrwałość przenośników elektronów na skutek ich bardzo niskiego standardowego potencjału redoks, a zatem mogą one ulegać reakcjom redoks z materiałami redoks współistniejącymi w próbkach, co daje w wyniku fluktuacje i zmniejszenie prądu reakcji w obszarze o bardzo niskim stężeniu substratu. Aby dokonać bardzo dokładnej oceny ilościowej za pomocą stabilnego prądu reakcji konieczne jest dalsze polepszenie układu.

W celu rozwią zania wyżej opisanych problemów opracowano zgodnie z wynalazkiem sposób ilościowej oceny substratu biologicznego lub środowiskowego, stosując układ elektrod wykonanych z elektrycznie przewodzących materiałów i odczynnik reakcyjny, zawierający co najmniej dehydrogenazę, koenzym, przenośnik elektronów i sól tetrazoliową, oraz czujnik biologiczny.

W porównaniu z konwencjonalnymi sposobami z bezpoś rednim utlenianiem zredukowanych koenzymów albo z zastosowaniem różnych przenośników elektronów sposób według wynalazku umożliwia zmniejszenie fluktuacji prądu reakcji, ponieważ jako produkt końcowy tworzy się chemicznie trwały formazan. Co więcej, w sposobie według niniejszego wynalazku zwiększa się bardzo prąd reakcji oraz czułość wykrywania, co umożliwia ilościową ocenę substratu w obszarze niższego stężenia. Dzięki temu substrat w próbce można oceniać ilościowo z wysoką dokładnością.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób ilościowej oceny biologicznego lub środowiskowego substratu w próbce, z wykorzystaniem metod elektrochemicznego wykrywania substancji wytworzonej w reakcji pomiędzy substratem a reagentem zawierającym dehydrogenazę, koenzym i przenośnik elektronów, polegający na tym, że dodatkowo do reagentów wprowadza się sól tetrazoliową dla wytworzenia stabilizowanego formazonu wykrywanego przez zastosowanie układu elektrod z materiałów elektrycznie przewodzących, która to reakcja jest zdefiniowana przebiegiem następujących etapów reakcji:

Subslral

Produkl

Korzystnie w sposobie według wynalazku substrat wybiera się z grupy obejmującej alaninę, alkohol, aldehyd, kwas izocytrynowy, urydyno-5'-dwufosfoglukozę, galaktozę, kwas mrówkowy, fosforan 3-gliceryloaldehydu, glicerynę, fosforan 3-glicerylu, glukozę, fosforanem 6-glukozy, kwas glutaminowy, cholesterol, sarkozynę, sorbit, kwas węglowy, kwas mlekowy, kwas 3-hydroksymasłowy, kwas pirogronowy, fenyloalaninę, fruktozę, kwas 6-fosfoglukonowy, formaldehyd, mannit, kwas jabłkowy albo leucynę.

Również korzystnie w sposobie według wynalazku formazan zmienia się elektrochemicznie drogą przykładania pewnego potencjału do układu elektrod i wykrywa się zwiększający się w ten sposób prąd reakcji.

Przedmiotem wynalazku jest również czujnik biologiczny do wykrywania formazanu, zbudowany z nośnika absorpcyjnego oraz elektrody roboczej i licznikowej, charakteryzują cy się tym, ż e skł ada się z noś nika absorpcyjnego do unieruchamiania dehydrogenazy, koenzymu i soli tetrazoliowej, ukł adu elektrod złożonego z elektrody licznikowej z unieruchomionym nośnikiem elektronów oraz z elektrody roboczej z unieruchomionym składnikiem buforującym, przy czym nośnik absorpcyjny umieszczony jest pomiędzy elektrodą licznikową a elektrodą roboczą.

W bardziej korzystnym wykonaniu czujnik charakteryzuje się tym, że do układu elektrod przykłada się pewien potencjał.

Układ elektrod składaj, się z co najmniej elektrody roboczej i elektrody licznikowej, wykonanych z elektrycznie przewodzących materiałów. Układ elektrod stanowi jedną całość i umożliwia dogodną i szybką ocenę ilościową.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem substrat w próbce ulega specyficznej reakcji enzymatycznej pod działaniem dehydrogenazy i koenzymu zawartego w odczynniku reakcyjnym z utworzeniem zredukowanego koenzymu. Następnie szybko postępuje reakcja pomiędzy zredukowanym koenzymem

PL 191 504 B1 i przenośnikiem elektronów i solą tetrazoliową, a jako produkt koń cowy tworzy się chemicznie trwały formazan. Następnie formazan zmienia się elektrochemicznie drogą przykładania potencjału do układu elektrod, a zatem wykrywa się zwiększający się prąd reakcji. Ponieważ ten prąd reakcji zależy od stężenia substratu, to substrat można zatem oceniać ilościowo. Jak opisano wyżej, na fig. 5 przedstawiono z grubsza proces szeregu reakcji. Na fig. 6 przedstawiono podstawowe wzory strukturalne reagującej na koniec soli tetrazoliowej oraz formazanu utworzonego jako produkt końcowy.

Substrat, który można oceniać ilościowo w reakcjach odwodornienia w niniejszym wynalazku, obejmuje każdy substrat, przez co tworzą się zredukowane koenzymy przy zastosowaniu dehydrogenaz jako katalizatora. Wykorzystanie takiej reakcji enzymatycznej umożliwia nie tylko ilościową ocenę substratu, lecz także pomiar aktywności enzymatycznej, itp. W sposobie według niniejszego wynalazku można mianowicie stosować substraty o nadzwyczaj szerokim wachlarzu, co umożliwia jego zastosowanie w wielu pomiarach. Szczególne przykłady substratu obejmują alkohole, galaktozę, glukozę, cholesterol, kwas mlekowy, fenyloalaninę i leucynę. Oczywiście sposobem według niniejszego wynalazku można oceniać ilościowo także i inne substraty.

Ponieważ w sposobie według niniejszego wynalazku jako produkt końcowy tworzy się trwały chemicznie formazan, to można uzyskać zmniejszenie fluktuacji prądu reakcji. Wyżej opisaną metodą spektroskopową zostało już potwierdzone, że reakcja tworzenia formazanu z substratu biegnie gładko i ilościowo (japoński opis patentowy nr 286784/97, Analyst, tom 120, str. 113 (1995)). Zgodnie z niniejszym wynalazkiem ustalono ponadto, że wykrywanie można prowadzić stosując układ elektrod, a zatem ustalono bardziej użyteczny sposób oceny ilościowej. W wyniku tego za pomocą czujnika biologicznego według niniejszego wynalazku ustalono gęstość prądu około 120 μΑ/cm², a zatem bardziej wzrasta prąd reakcji i polepsza się czułość wykrywania, ponieważ gęstość prądu konwencjonalnych czujników biologicznych wynosi od około 4 do 12 μΑ/cm² na mM substratu, a gęstości prądu istniejących czujników biologicznych z zastosowaniem, jako przenośnika elektronów, żelazicjanków (Analytical Chemistry, tom 59, str. 2111 (1987), ferrocenu (Analytical Chemistry, tom 70, str. 4320 (1998) i chinonów (Bioscience & Bioelectronics, tom 11, str. 1267 (1996) wynoszą odpowiednio około 2 μΑ/cm² (obliczone z fig. 6, str. 2114), około 6 μΑ/cm² (obliczone z fig. 4, str. 4323) i około 10 μΑ/cm² (fig. 10, str. 1273). Co więcej, niniejszy wynalazek umożliwia ilościową ocenę substratu w obszarze niskiego stężenia. Zatem substrat można oceniać ilościowo z wysoką dokładnością stosując metodę oceny ilościowej i czujnik biologiczny według niniejszego wynalazku.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia schematycznie budowę czujnika biologicznego w przykładzie według niniejszego wynalazku,

Figura 2 - wykres pokazujący podstawowe reakcje czujnika biologicznego w przykładzie 2,

Figura 3 - wykres pokazujący wynik reakcji na zredukowany dwunukleotyd nikotynoamidoadeniny (NADH) w przykładzie 3,

Figura 4 - wykres pokazujący wyniki reakcji na L-fenyloalaninę w przykładzie 4,

Figura 5 - model reakcji według niniejszego wynalazku,

Figura 6 - wzory strukturalne soli tetrazoliowych i formazanów.

Symbole podane na powyższych figurach mają następujące znaczenia: 1 - podłoże izolujące, 2 - elektroda robocza, 3 - elektroda licznikowa, 4 - warstwa izolująca, 5 - nośnik absorpcyjny.

Układ elektrod stosowany w niniejszym wynalazku może być dowolnym układem bez ograniczeń tak długo, dopóki jest wykonany z elektrycznie przewodzących materiałów i jest elektrochemicznie trwały. Przykłady materiałów użytecznych do tego celu obejmują węgiel, złoto, srebro, srebro/chlorek srebra (Ag/AgCl), nikiel, platynę, czerń platynową, pallad i stopy tych metali. W wyniku badań prowadzonych na różnych materiałach ustalono, że jako elektroda robocza w układzie elektrod według niniejszego wynalazku korzystne są materiały węglowe, ponieważ są one mniej kosztowne i chemicznie trwałe.

Stosowane tu określenie „materiały węglowe” oznacza materiały zawierające węgiel, przy czym użyteczne są tu wszelkie materiały węglowe stosowane w konwencjonalnych elektrodach węglowych. Stosować można włókna węglowe, sadzę, pastę węglową, węgiel szklisty, grafit, itp.

Stosując taki materiał węglowy elektrodę formuje się na podłożu izolującym powszechnie stosowanym sposobem. Materiał węglowy przetwarza się zwykle w pastę stosując spoiwo żywicowe, itp., drukuje techniką sitową, a następnie suszy drogą ogrzewania tworząc w ten sposób elektrodę.

Podłoże izolacyjne może być wykonane ze szkła, epoksydu szklanego, ceramiki, tworzyw sztucznych, itp., chociaż jego materiał nie jest ograniczony tak długo, dopóki nie jest on uszkodzony w etapie formowania elektrod drogą drukowania albo dodawania próbki. Możliwe jest na przykład stoPL 191 504 B1 sowanie folii z tworzyw sztucznych wykonanych z poliestru, polietylenu, polietylenotereftalanu, polistyrenu, polipropylenu, itp. Ustalono, że korzystne są tu folie poliestrowe, ponieważ są one mniej kosztowne i mają nadzwyczajną przyczepność do przewodzących farb oraz właściwości przetwórcze.

Sposób drukowania nie ogranicza się do drukowania sitowego, lecz stosować można także druk wklęsły, druk offsetowy i drukowanie strumieniowe.

Substrat, który można oceniać ilościowo sposobem według niniejszego wynalazku, nie jest ograniczony tak długo, dopóki może on tworzyć zredukowany koenzym z zastosowaniem dehydrogenazy jako katalizatora, przy czym ocenie ilościowej można poddawać każdy substrat. Stosować można na przykład alaninę, alkohole, aldehydy, kwas izocytrynowy, urydyno-5'-dwufosfoglukozę, galaktozę, kwas mrówkowy, fosforan 3-gliceryloaldehydu, glicerynę, fosforan 3-glicerylu, glukozę, fosforan 6-glukozy, kwas glutaminowy, cholesterol, sarkozynę, sorbit, kwas węglowy, kwas mlekowy, kwas 3-hydroksymasłowy, kwas pirogronowy, fenyloalaninę, fruktozę, kwas 6-fosfoglukonowy, formaldehyd, mannit, kwas jabłkowy, leucynę, itp.

Dehydrogenaza stosowana w niniejszym wynalazku nie jest ograniczona tak długo, dopóki jest ona enzymem zdolnym do tworzenia zredukowanego koenzymu, przy czym nie jest także ograniczone jej pochodzenie. Stosować można na przykład dehydrogenazę alaniny, dehydrogenazę alkoholu, dehydrogenazę aldehydu, dehydrogenazę izocytrynianiu, dehydrogenazę urydyno-5'-dwufosfoglukozy, dehydrogenazę galaktozy, dehydrogenazę mrówczanu, dehydrogenazę fosforanu 3-gliceryloaldehydu, dehydrogenazę gliceryny, dehydrogenazę fosforanu 3-glicerylu, dehydrogenazę glukozy, dehydrogenazę fosforanu 6-glukozy, dehydrogenazę glutaminianu, dehydrogenazę cholesterolu, dehydrogenazę sarkozyny, dehydrogenazę sorbitu, dehydrogenazę węglanu, dehydrogenazę mleczanu, dehydrogenazę 3-hydroksymaślanu, dehydrogenazę fruktozy, dehydrogenazę 6-fosfoglukonianu, dehydrogenazę formaldehydu, dehydrogenazę mannitu, dehydrogenazę jabłczanu, dehydrogenazę leucyny, itp.

Przenośnik elektronów nie jest szczególnie ograniczony tak długo, dopóki ulega on szybko reakcji redoks ze zredukowanym koenzymem i solą tetrazoliową. Stosować można na przykład chinony, diaforazę, cytochromy, biologen, fenazyny, fenoksazyny, fenotiazyny, żelazicjanki, ferredoksyny, ferrocen i ich pochodne, itp., przy czym spośród wszystkich tych związków fenazyny wykazują wysoką trwałość reakcyjną. Ustalono w szczególności, że jako przenośnik elektronów korzystny jest w niniejszym wynalazku 1-metoksy-PMS dzięki swojej lepszej trwałości przy przechowywaniu i reaktywności ze zredukowanymi koenzymami i solami tetrazoliowymi.

Sól tetrazoliową nie jest ograniczona tak długo, dopóki może ona tworzyć formazan. Ustalono, że spośród wszystkich soli tetrazoliowych jako sól tetrazoliową można w niniejszym wynalazku stosować korzystnie jednosodową sól 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-dwusulfofenylo)-2H-tetrazoliową (WST-1), ponieważ drogą redukcji daje ona rozpuszczalny w wodzie i chemicznie trwały formazan, a tak utworzony formazan wykazuje w układzie elektrod specyficzną reakcję.

P r z y k ł a d y

Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami wykonania.

P r z y k ł a d 1: Konstrukcja czujnika biologicznego

Na fig. 1 przedstawiono schematycznie budowę czujnika biologicznego w przykładzie według niniejszego wynalazku.

Na podłożu izolacyjnym 1 wykonanym z folii poliestrowej (produkcji Diafoil Hoechst Co.) utworzono drogą druku sitowego elektrodę roboczą 2 i elektrodę licznikową 3, stosując odpowiednio przewodzącą farbę grafitową (produkcji Acheson Japan Ltd.) i przewodzącą farbę Ag/AgCl (produkcji Acheson Japan Ltd.), a następnie suszono je drogą ogrzewania (60°C, 1 godzina) wytwarzając w ten sposób układ elektrod.

Składnik buforujący, który stosowano do regulowania wartości pH reakcji enzymatycznej do optymalnego poziomu, adsorbowano na elektrodzie roboczej 2 i utrwalano drogą suszenia (40°C, 15 minut).

1-Metoksy-PMS (produkcji Dojindo Laboratories Co., Ltd.), służący jako przenośnik elektronów, adsorbowano na elektrodzie licznikowej 3 i utrwalano drogą suszenia (40°C, 15 minut).

WST-1 (produkcji Dojindo Laboratories Co., Ltd.), stosowany jako sól tetrazoliowa, dehydrogenazę i koenzym rozpuszczano w buforze fosforanowym (pH 8,0, 10 mM), a następnie adsorbowano na nośniku absorpcyjnym 5 wykonanym z włókien celulozowych (produkcji Advantec Toyo) i utrwalano drogą suszenia (40°C, 15 minut).

Elektrodę roboczą 2, która ma utrwalony na sobie składnik buforowy, i elektrodę licznikową 3, która ma utrwalony na sobie 1-metoksy-PMS, ustawiano czołowo względem siebie i pomiędzy elektrodami układu elektrod umieszczano nośnik absorpcyjny zawierający WST-1, dehydrogenazę i koenzym, tworząc w ten sposób czujnik biologiczny.

PL 191 504 B1

P r z y k ł a d 2: Pomiar podstawowej reakcji czujnika biologicznego

Na fig. 2 przedstawiono wyniki pomiaru podstawowych reakcji czujnika biologicznego skonstruowanego w przykładzie 1.

W tym przykładzie do wyżej opisanego czujnika dodawano 5 μΐ porcje standardowego roztworu zawierającego NADH i innego standardowego roztworu wolnego od NADH, a następnie tworzono formazan drogą reakcji redoks pomiędzy dodanym NADH i 1-metoksy-PMS i WST-1. Uzyskane wyniki pokazują cykliczny woltamogram formazanu (szybkość przemiatania: 50 mV/sek, model HZ-3000 produkcji Hokuto Denko Corporation). Linia ciągła pokazuje wynik uzyskany z zastosowaniem roztworu standardowego zawierającego NADH (1,5 mM), natomiast linia przerywana pokazuje wynik uzyskany z zastosowaniem standardowego roztworu bez NADH.

Jak pokazują te wyniki, maksimum oksydacyjne pojawiało się przy około +500 mV względem Ag/AgCl, a zatem można było uzyskać prąd reakcji charakterystyczny dla formazanu.

P r z y k ł a d 3: Ocena ilościowa NADH

Na fig. 3 przedstawiono wynik pomiaru NADH, który jest zredukowanym enzymem utworzonym drogą reakcji próbki z dehydrogenazą i koenzymem z zastosowaniem czujnika biologicznego skonstruowanego w przykładzie 1.

Sześćdziesiąt sekund po dodaniu 5 μΐ próbki zawierającej NADH przykładano potencjał +700 mV względem Ag/AgCl (model HZ-3000 produkcji Hokuto Denko Corporation) z zastosowaniem elektrody licznikowej jako wzorca i mierzono prąd reakcji (model HZ-3000 produkcji Hokuto Denko Corporation).

W wyniku tego uzyskano reakcję o bardzo dobrej liniowości przy stężeniu NADH od 0 do 1,5 mM.

Zatem przewiduje się, że sposób ilościowej oceny i czujnik biologiczny według niniejszego wynalazku można stosować do reakcji enzymatycznych z zastosowaniem wszelkich dehydrogenaz i koenzymów tworzących zredukowane koenzymy.

P r z y k ł a d 4: Ocena ilościowa L-fenyloalaniny

Na fig. 4 przedstawiono wynik pomiaru standardowego 20 roztworu zawierającego L-fenyloalaninę z zastosowaniem czujnika biologicznego skonstruowanego w przykładzie 1 w odniesieniu do przykładu 3.

W tym przykładzie 5 μΐ standardowego roztworu zawierającego L-fenyloalaninę dodano do czujnika biologicznego z zastosowaniem dehydrogenazy L-fenyloalaniny (EC 1.4.1.20 produkcji Unitika Ltd.). Po 60 sekundach przykładano potencjał +700 względem Ag/AgCl stosując elektrodę licznikową jako wzorzec i mierzono prąd reakcji.

Na fig. 4 przedstawiono także dla porównania wynik pomiaru z zastosowaniem konwencjonalnego czujnika biologicznego.

W przypadku konwencjonalnego czujnika biologicznego dodano 5 μl standardowego roztworu zawierającego L-fenyloalaninę, a po 60 sekundach przykładano potencjał -220 mV względem Ag/AgCl, stosując elektrodę licznikową jako wzorzec, i mierzono prąd reakcji.

Gdy dodaje się próbkę do odczynnika reakcyjnego, to substrat w próbce ulega specyficznej reakcji enzymatycznej pod działaniem dehydrogenazy i koenzymu zawartego w odczynniku reakcyjnym tworząc przez to zredukowany koenzym. Wtedy biegnie szybko reakcja redoks pomiędzy tym zredukowanym koenzymem i przenośnikiem elektronów i solą tetrazoliową, a jako produkt końcowy tworzy się chemicznie trwały formazan. Następnie do układu elektrod przykłada się potencjał, a zatem formazan zmienia się elektro-chemicznie, i wykrywa się tak rosnący prąd reakcji. Ponieważ ten prąd reakcji zależy od stężenia substratu, to można w ten sposób substrat oceniać ilościowo. Na fig. 5 przedstawiono, jak opisano wyżej, w widoku model reakcji według niniejszego wynalazku. Na fig. 6 przedstawiono podstawowe wzory strukturalne soli tetrazoliowych i formazanów.

W wyniku tego uzyskano reakcję o bardzo dobrej liniowości w zakresie stężeń L-fenyloalaniny od 0 do 1 mM. Uzyskano bardzo duży prąd reakcji o gęstości około 120 μΑ/cm² na mM L-fenyloalaniny.

Chociaż stosowano czujnik biologiczny zawierający układ elektrod, który ma w powyższych przykładach elektrodę roboczą i elektrodę licznikową, to oceny ilościowej z wyższą dokładnością można dokonać także stosując układ trzech elektrod w odniesieniu do elektrody wzorcowej.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób ilościowej oceny substratu biologicznego lub środowiskowego w próbce, polegający na elektrochemicznym wykrywaniu substancji wytworzonej w reakcji pomiędzy substratem a reagentem zawierającym dehydrogenazę, koenzym i przenośnik elektronów, znamienny tym, że dodatkowo do reagentów wprowadza się sól tetrazoliową dla wytworzenia stabilizowanego formazonu wykrywanego przez zastosowanie układu elektrod z materiałów elektrycznie przewodzących, która to reakcja jest zdefiniowana przebiegiem następujących etapów reakcji:
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że substrat wybiera się z grupy obejmującej alaninę, alkohol, aldehyd, kwas izocytrynowy, urydyno-5'-dwufosfoglukozę, galaktozę, kwas mrówkowy, fosforan 3-gliceryloaldehydu, glicerynę, fosforan 3-glicerylu, glukozę, fosforanem 6-glukozy, kwas glutaminowy, cholesterol, sarkozynę, sorbit, kwas węglowy, kwas mlekowy, kwas 3-hydroksymasłowy, kwas pirogronowy, fenyloalaninę, fruktozę, kwas 6-fosfoglukonowy, formaldehyd, mannit, kwas jabłkowy albo leucynę.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że formazan zmienia się elektrochemicznie drogą przykładania pewnego potencjału do układu elektrod i wykrywa się zwiększający się w ten sposób prąd reakcji.
4. Czujnik biologiczny do wykrywania formazanu, zbudowany z nośnika absorpcyjnego oraz elektrody roboczej i licznikowej, znamienny tym, że składa się z nośnika absorpcyjnego (5) do unieruchamiania dehydrogenazy, koenzymu i soli tetrazoliowej, układu elektrod złożonego z elektrody licznikowej (3) z unieruchomionym nośnikiem elektronów oraz z elektrody roboczej (2) z unieruchomionym składnikiem buforującym, przy czym nośnik absorpcyjny (5) umieszczony jest pomiędzy elektrodą licznikową (3) a elektrodą roboczą (2).
5. Czujnik według zastrz. 4, znamienny tym, że do układu elektrod (2) i (3) przykłada się pewien potencjał.