ES2224614T3 - Procedimiento de analisis de substrato y biosensor. - Google Patents
Procedimiento de analisis de substrato y biosensor.Info
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Abstract
Un método para cuantificar un sustrato en una muestra, que comprende llevar a cabo una reacción enzimática y una reacción redox entre un reactivo de reacción que comprende simultáneamente una o más deshidrogenasas, una coenzima, un mediador de electrones y una sal de tetrazolio, y la muestra, y detectar un formazán formado como el producto final de reacción usando un sistema de electrodos fabricado con materiales eléctricamente conductores, el mecanismo de reacción de dicho método se resume como se muestra en el siguiente esquema de reacción:
Description
Procedimiento de análisis de substrato y
biosensor.
Esta invención se refiere a un método para
cuantificar conveniente y rápidamente sustratos contenidos en varias
muestras, por ejemplo, muestras biológicas tales como sangre, orina,
saliva y sudor, alimentos y muestras medioambientales y a un
biosensor. Más particularmente, se refiere a un método para
cuantificar un sustrato mediante reacciones usando un sistema de
electrodos fabricados de materiales eléctricamente conductores y
diversos reactivos y a un biosensor con el uso de los mismos.
Se ha considerado que los métodos de cuantificar
sustratos usando deshidrogenasas y coenzimas son útiles en el campo
de la química analítica para investigación clínica, análisis de
alimentos, etc. Una enzima reacciona con el uso de una
deshidrogenasa y una coenzima como catalizadores por medio de una
reacción en la que un sustrato contenido en una muestra se oxida
específicamente y, al mismo tiempo, la coenzima se reduce. Se han
confirmado varios cientos de reacciones de deshidrogenasas que
tienen lugar in vivo. Estas reacciones enzimáticas son
sumamente importantes porque son aplicables a la cuantificación de
sustratos en las muestras, la medida de actividades enzimáticas,
etc. En estos métodos de medida, se detectan las coenzimas
reducidas formadas en las reacciones.
Estas coenzimas reducidas formadas como productos
de la reacción se cuantifican por cromatografía líquida (Analytical
Biochemistry, Vol. 146, p. 118 (1985)), espectroscopía de absorción
UV (Clinical Chemistry, Vol. 22, p. 151 (1976)) y similares.
También se hace uso de un método que comprende someter una coenzima
reducida a una reacción redox con un oxidante seleccionado entre
sales de tetrazolio (descripción pública de la patente japonesa
número 286.784/97, Analyst, Vol. 120, p. 113 (1995)),
ferricianuros, quinonas, citocromos, iones metálicos, etc., y
después cuantificar el producto reducido así formado por
espectroscopía de absorción en la región visible. Sin embargo,
ninguno de estos métodos permite la medida conveniente y rápida, ya
que en ellas se necesita realizar pre-tratamientos
tales como dilución o separación. Otro problema es que se necesitan
aparatos de medida costosos y de gran tamaño cuando se emplean
estos métodos.
En años recientes, se han empleado biosensores
del tipo de detección electroquímica como medio de cuantificar
conveniente y rápidamente las coenzimas reducidas formadas por
reacciones enzimáticas. En estos casos, se prevé que las coenzimas
reducidas se podrían directamente detectar electroquímicamente
(Analytica Chimica Acta, Vol. 336, p. 57 (1996)). Sin embargo, las
coenzimas reducidas difícilmente pueden sufrir reacciones redox por
medio de transferencia de electrones. Por lo tanto, es necesario
aplicar un alto potencial para oxidar directamente una coenzima
reducida en los electrodos. Sin embargo, la aplicación de un alto
potencial tal provoca contaminación y daño de los electrodos o
induce efectos de las materias coexistentes. Se han hecho intentos
para resolver estos problemas usando mediadores de electrones, como
se puede ver en varios informes y patentes que conciernen a
biosensores publicados hasta el momento (descripción pública de la
patente japonesa número 165.199/98). Ejemplos de mediadores de
electrones empleados en biosensores hasta el presente incluyen
derivados de la fenacina tales como metilsulfato de
1-metoxi-5-metilfenacina
(1-metoxi PMS) (Analyst, Vol. 119, p. 253 (1994)),
azul de Meldola (Analytica Chimica Acta, Vol. 329, p. 215 (1996)),
ferricianuros (Analytical Chemistry, Vol. 59, p. 2111 (1987)),
ferroceno (Analytical Chemistry, Vol. 70, p. 4320 (1998)) y
quinonas (Bioscience & Bioelectronics, Vol. 11, p. 1267
(1996)). Un mediador de electrones tal se reduce por una reacción
redox con una enzima reducida y el mediador de electrones reducido
así formado sufre fácilmente una reacción redox aplicando un
potencial en los electrodos. Por lo tanto, la detección se puede
hacer aplicando un potencial más bajo, comparado con el caso de
oxidar una coenzima reducida directamente en los electrodos.
El documento
WO-A-97/14.965 describe un biosensor
amperométrico para detectar fructosamina en una muestra de fluido
corporal. El ensayo implica la reducción electroenzimática de la
fructosamina catalizada por la fructosamina deshidrogenasa en
presencia de NADH (dinucleótido adenina nicotinamida) y una sal de
tetrazolio. La concentración de fructosamina es proporcional a la
medida de la corriente anódica producida por la oxidación del
formazán producido electroenzimáticamente en el electrodo de
trabajo. El documento US-A-4.816.394
describe un ensayo para detectar 3-hidroxiesteroide
en una muestra por reducción con una deshidrogenasa en presencia de
NADH, una sal de tetrazolio y metosulfato de fenacina. La cantidad
de analito se determina espectrofotométricamente por la cantidad de
formazán producido durante la reacción enzimática.
Los presentes inventores han ideado biosensores
de un tipo integrado compuestos por un reactivo de reacción, que
comprende varias deshidrogenasas, dinucleótido adenina nicotinamida
oxidada (NAD^{+}) como una coenzima y un mediador de electrones
1-metoxi PMS, con un sistema de electrodos
(solicitud de patente japonesa número 201.553/98; WO 00/04.378
(PCT/JP98/03.194)) y biosensores construidos, con los que se pueden
cuantificar conveniente y rápidamente diversos sustratos. En estos
biosensores está localizado un soporte absorbente que lleva todos
los reactivos de la reacción entre un electrodo de trabajo y un
contra-electrodo, que esta fabricado de materiales
eléctricamente conductores y conformado por el método de impresión.
Se confirma que se puede obtener con él una corriente de respuesta
linear sumamente favorable dependiente de la concentración de cada
sustrato. Sin embargo, estudios posteriores han revelado que estos
biosensores todavía padecen el problema. Es decir, la corriente de
respuesta en la región de concentración baja de sustrato está sujeta
a verse afectada por materias coexistentes. Aparentemente, esto es
debido a que los mediadores de electrones son químicamente
inestables debido a su potencial redox estándar muy bajo y, por lo
tanto, son propensos a sufrir reacciones redox con materiales redox
coexistentes en las muestras, lo cual da lugar a fluctuaciones y
disminución de la corriente de respuesta en la región de
concentración baja de sustrato. Para llevar a cabo la
cuantificación sumamente exacta con una corriente de respuesta
estable, es por lo tanto necesario mejorar adicionalmente el
sistema.
Para resolver los problemas descritos
anteriormente, la presente invención proporciona un método para
cuantificar un sustrato usando un sistema de electrodos fabricado
de materiales eléctricamente conductores y un reactivo de reacción
que comprende al menos una deshidrogenasa, una coenzima, un mediador
de electrones y una sal de tetrazolio y un biosensor.
Comparado con los métodos convencionales de
oxidación directa de coenzimas reducidas o del uso de diversos
mediadores de electrones, el método según la presente invención
hace posible reducir la fluctuación en la corriente de respuesta ya
que se forma un formazán químicamente estable como producto final.
Además, en el método de la presente invención se incrementa en gran
medida la corriente de respuesta y se eleva la sensibilidad de
detección, lo que hace posible cuantificar un sustrato en la región
de concentración más baja. Por consiguiente, se puede cuantificar
un sustrato en una muestra con gran exactitud.
La presente invención proporciona un método para
cuantificar un sustrato usando un sistema de electrodos compuesto
de al menos un electrodo de trabajo y un
contra-electrodo fabricados de materiales
eléctricamente conductores y un reactivo de reacción compuesto de
al menos una deshidrogenasa, una coenzima, un mediador de
electrones y una sal de tetrazolio, y un biosensor en el que están
integrados el reactivo de reacción y el sistema de electrodos y que
permite la cuantificación conveniente y rápida.
En la presente invención, el sustrato en la
muestra sufre una reacción enzimática específica por la acción de
la deshidrogenasa y la coenzima incluidas en el reactivo de
reacción para formar una coenzima reducida. Después, transcurre
rápidamente una reacción redox entre esta coenzima reducida y el
mediador de electrones y la sal de tetrazolio, y se forma un
formazán químicamente estable como producto final. A continuación,
el formazán se transforma electroquímicamente aplicando un
potencial al sistema de electrodos y se detecta la corriente de
respuesta que surge de ese modo. Debido a que esta corriente de
respuesta depende de la concentración de sustrato, el sustrato se
puede así cuantificar. La Fig. 5 muestra aproximadamente el proceso
de una serie de reacciones como las descritas anteriormente. La
Fig. 6 muestra la fórmula estructural fundamental de la sal de
tetrazolio que reacciona finalmente y el formazán formado como
producto final.
El sustrato que se puede cuantificar en la
presente invención incluye cualquier sustrato en reacciones de
deshidrogenación en las que se forman coenzimas reducidas usando
deshidrogenasas como un catalizador. El uso de una reacción
enzimática tal hace posible no sólo cuantificar un sustrato sino
también medir la actividad enzimática, etc. Es decir, los sustratos
son utilizables en un intervalo extremadamente amplio en el método
según la presente invención, lo que lo hace aplicable a diversas
medidas. Ejemplos particulares de sustratos incluyen alcoholes,
galactosa, glucosa, colesterol, ácido láctico, fenilalanina y
leucina. Sin embargo, es obvio que otros diverso sustratos se pueden
cuantificar por el método de la presente invención.
Debido a que se forma un formazán químicamente
estable como producto final en el método de la presente invención,
se puede obtener una reducción en la fluctuación de la corriente de
respuesta. Ya se ha confirmado por el método espectroscópico
descrito anteriormente que la reacción de formación de un formazán
a partir de un sustrato transcurre suave y cuantitativamente
(descripción pública de la patente japonesa número 286.784/97,
Analyst, Vol. 120, p. 113 (1995)). Según la presente invención, se
ha clarificado además que la detección se puede llevar a cabo
usando un sistema de electrodos y, de ese modo, se ha establecido
un método de cuantificación más útil. Como resultado, se establece
una densidad de corriente de aproximadamente 120 \muA/cm^{2}
para el biosensor de la presente invención y de ese modo se aumenta
en gran medida la corriente de respuesta y se mejora la
sensibilidad de detección, ya que la densidad de corriente de los
biosensores convencionales abarca intervalos de aproximadamente 4 a
12 \muA/cm^{2} por mM de un sustrato y las densidades de
corriente de los biosensores actuales usando como mediadores de
electrones ferricianuros (Analytical Chemistry, Vol. 59, p. 2111
(1987)), ferroceno (Analytical Chemistry, Vol. 70, p. 4320 (1998))
y quinonas (Bioscience & Bioelectronics, Vol. 11, p. 1267
(1996)) son aproximadamente 2 \muA/cm^{2} (calculado de la Fig.
6, p. 2114), aproximadamente 6 \muA/cm^{2} (calculado de la
Fig. 4, p. 4323) y aproximadamente 10 \muA/cm^{2} (Fig. 10, p.
1273) respectivamente. Además, la presente invención permite la
cuantificación de un sustrato en una región de concentración más
baja. Así, un sustrato se puede cuantificar con gran exactitud
usando el método de cuantificación y el biosensor según la presente
invención.
La Fig. 1 es un diagrama que muestra
esquemáticamente la constitución del biosensor en un ejemplo de la
presente invención.
La Fig. 2 es una gráfica que muestra las
respuestas fundamentales del biosensor del Ejemplo 2.
La Fig. 3 es una gráfica que muestra el resultado
de la respuesta a dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) en el
Ejemplo 3.
La Fig. 4 es una gráfica que muestra el resultado
de la respuesta a L-fenilalanina en el Ejemplo
4.
La Fig. 5 es una visión del modelo de reacción de
la presente invención.
La Fig. 6 muestra las fórmulas estructurales de
las sales de tetrazolio y formazanes.
Los símbolos que se dan en las figuras anteriores
tienen los siguientes significados: 1 representa un soporte
aislante; 2 representa un electrodo de trabajo; 3 representa un
contra-electrodo; 4 representa una capa aislante; 5
representa un soporte absorbente.
El sistema de electrodos que se ha de usar en la
presente invención puede ser uno arbitrariamente sin restricciones,
con tal de que esté fabricado con materiales eléctricamente
conductores y sea electroquímicamente estable. Por lo tanto,
ejemplos de materiales utilizables incluyen carbono oro, plata,
plata/cloruro de plata (Ag/AgCl), níquel, platino, negro de platino,
paladio y aleaciones de estos materiales. Como resultado de los
exámenes de diversos materiales, se descubrió que los materiales de
carbono son favorables como electrodo de trabajo en los sistemas de
electrodos de la presente invención, ya que son menos costosos y
químicamente estables.
La expresión "materiales de carbono" como
se usa en la presente memoria significa materiales que contienen
carbono. Cualquiera de los materiales de carbono empleados en los
electrodos de carbono convencionales son utilizables en la presente
memoria sin ninguna restricción particular. Por ejemplo, se puede
hacer uso de fibra de carbono, negro de carbono, pasta de carbón,
carbón vítreo, grafito y similares.
Usando un material de carbono tal, se forma un
electrodo en el soporte aislante por un método empleado comúnmente.
Normalmente, el material de carbono se transforma en una pasta
usando una resina ligante, etc., se imprime en láminas y después se
seca por calentamiento para, de ese modo, formar el electrodo.
El soporte aislante puede estar fabricado de
vidrio, vidrio epoxi, cerámicas, plásticos, etc., aunque su
material no se restringe a ellos con tal de que no se dañe en la
etapa de formar los electrodos por impresión o añadiendo una
muestra. Por ejemplo, es posible usar películas plásticas hechas de
poliéster, polietileno, poli(tereftalato de etileno),
poliestireno, polipropileno, etc. Se descubrió que las películas de
poliéster son preferidas en la presente memoria, ya que son menos
costosas y excelentes en la adhesividad a tintas conductoras y
propiedades de procesamiento.
El método de impresión no se restringe a la
impresión en láminas sino que se puede hacer uso de, por ejemplo,
impresión por huecograbado, impresión offset, o impresión por
chorro de tinta.
El sustrato que se puede cuantificar por el
método de la presente invención no está restringido
particularmente, con tal de que pueda formar una coenzima reducida
con el uso de una deshidrogenasa como catalizador. Es decir, se
puede cuantificar cualquier sustrato. Por ejemplo, se puede hacer
uso de alanina, alcoholes, aldehídos, ácido isocítrico,
uridina-5'-difosfoglucosa,
galactosa, ácido fórmico,
gliceraldehído-3-fosfato, glicerol,
glicerol-3-fosfato, glucosa,
glucosa-6-fosfato, ácido glutámico,
colesterol, sarcosina, sorbitol, ácido carbónico, ácido láctico,
ácido 3-hidroxibutírico, ácido pirúvico,
fenilalanina, fructosa, ácido 6-fosfoglucónico,
formaldehído, manitol, ácido málico, leucina, etc.
La deshidrogenasa que se ha de usar en la
presente invención no está restringida particularmente, con tal de
que sea una enzima capaz de formar una coenzima reducida. El origen
de la deshidrogenasa tampoco está restringido. Por ejemplo, se
puede hacer uso de alanina deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa,
aldehído deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa,
uridina-5-difosfo-glucosa
deshidrogenasa, galactosa deshidrogenasa, formiato deshidrogenasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, glicerol deshidrogenasa,
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa,
glucosa deshidrogenasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
glutamato deshidrogenasa, colesterol deshidrogenasa, sarcosina
deshidrogenasa, sorbitol deshidrogenasa, carbonato deshidrogenasa,
lactato deshidrogenasa, 3-hidroxibutirato
deshidrogenasa, piruvato deshidrogenasa, fenilalanina
deshidrogenasa, fructosa deshidrogenasa,
6-fosfogluconato deshidrogenasa, formaldehído
deshidrogenasa, manitol deshidrogenasa, malato deshidrogenasa,
leucina deshidrogenasa, etc.
El mediador de electrones no está restringido
particularmente, con tal de que pueda sufrir rápidamente una
reacción redox con una coenzima reducida y una sal de tetrazolio.
Por ejemplo, se puede hacer uso de quinonas, diaforasa, citocromos,
biologén, fenacinas, fenoxacinas, fenotiacinas, ferricianuros,
ferredoxinas, ferroceno y sus derivados, etc. Entre todos, las
fenacinas muestran una elevada estabilidad en la respuesta. En
particular, se ha encontrado que 1-metoxi PMS es
preferible como mediador de electrones en la presente invención
debido a su estabilidad de almacenaje mejorada y reactividad con
las coenzimas reducidas y sales de tetrazolio.
La sal de tetrazolio no está restringida
particularmente, con tal de que pueda formar formazán. Entre todas,
se ha encontrado que se prefiere la sal monosódica de
2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio
(WST-1) como la sal de tetrazolio que se ha de usar
en la presente invención, ya que proporciona un formazán soluble en
agua y químicamente estable por reducción y el formazán así
formado muestra una respuesta específica en el sistema de
electrodos.
Ahora, la invención se ilustrará en mayor detalle
por referencia a los siguientes ejemplos.
La Fig. 1 es un diagrama que muestra
esquemáticamente la constitución del biosensor en un ejemplo de la
presente invención.
Sobre un soporte aislante 1 hecho de una película
de poliéster (fabricado por Diafoil Hoechst Co.), se formaron por
impresión en láminas un electrodo de trabajo 2 y un
contra-electrodo 3 respectivamente usando una tinta
conductora de grafito (fabricada por Acheson Japan Ltd.) y una
tinta conductora de Ag/AgCl (fabricada por Acheson Japan Ltd.)
seguido por secado por calentamiento (60ºC, 1 hora), formando de
ese modo un sistema de electrodos.
Se absorbió un componente tampón, que se empleó
para regular el valor de pH de la reacción enzimática al nivel
óptimo, en el electrodo de trabajo 2 y se fijó por secado (40ºC, 15
minutos).
Se absorbió 1-metoxi PMS
(fabricado por Dojindo Laboratories Co., Ltd.), que servía como
mediador de electrones, en el contra-electrodo 3 y
se fijó por secado (40ºC, 15 minutos).
Se disolvieron WST-1 (fabricado
por Dojindo Laboratories Co., Ltd.) empleado como la sal de
tetrazolio, una deshidrogenasa y una coenzima en un tampón de
fosfato (pH 8,0, 20 mM), después se adsorbieron en un soporte
adsorbente 5 hecho de fibra de celulosa (fabricada por Advantec
Toyo) y se fijaron por secado (40ºC, 15 minutos).
El electrodo de trabajo 2 que tenía el componente
tampón fijado en él y el contra-electrodo 3 que
tenía 1-metoxi PMS fijado en el se enfrentaron entre
sí, y el soporte absorbente que contenía WST-1, la
deshidrogenasa y la coenzima se colocaron entre estos electrodos
del sistema de electrodos, formando de ese modo un biosensor.
La Fig. 2 muestra los resultados de la medida de
las respuestas fundamentales del biosensor construido en el Ejemplo
1.
En este ejemplo, se añadieron porciones de 5
\mul de una disolución patrón que contenía NADH y de otra
disolución patrón exenta de NADH al sensor anteriormente descrito.
Después, se formó una formazán por reacción redox entre el NADH
añadido y 1-metoxi PMS y WST-1. Los
resultados obtenidos muestran el voltamograma cíclico del formazán
(velocidad de barrido: 50 mV/segundo; Modelo
HZ-3000 fabricado por Hokuto Denko Corporation). La
línea continua muestra el resultado obtenido usando la disolución
patrón que contenía NADH (1,5 mM) mientras que la línea discontinua
muestra el resultado obtenido usando la disolución patrón exenta de
NADH.
Como muestran estos resultados, apareció un pico
de oxidación a aproximadamente +500 mV frente a Ag/AgCl y de ese
modo se pudo obtener una corriente de respuesta característica al
formazán.
La Figura 3 muestra el resultado de la medida de
NADH, que es una coenzima reducida formada haciendo reaccionar una
muestra con una deshidrogenasa y una coenzima, usando el biosensor
construido en el Ejemplo 1.
Sesenta segundos después de añadir 5 \mul de
una muestra que contenía NADH, se aplicó un potencial de +700 mV
frente a Ag/AgCl (modelo HZ-3000 fabricado por
Hokuto Denko Corporation) usando el contra-electrodo
como estándar y se midió la corriente de respuesta (modelo
HZ-3000 fabricado por Hokuto Denko Corporation).
Como resultado, se consiguió una respuesta de una
linealidad muy buena en un intervalo de concentración de NADH de 0 a
1,5 mM.
Así, se espera que el método de cuantificación y
el biosensor según la presente invención sean aplicables a las
reacciones enzimáticas con el uso de cualquiera de las
deshidrogenasas y coenzimas que forman coenzimas reducidas.
La Fig. 4 muestra el resultado de la medida de
una disolución patrón que contenía L-fenilalanina
usando el biosensor construido en el Ejemplo 1 por referencia al
Ejemplo 3.
En este ejemplo, se añadieron 5 \mul de
disolución patrón que contenía L-fenilalanina a un
biosensor construido usando L-fenilalanina
deshidrogenasa (EC 1.4.1.20, fabricado por Unitika Ltd.). Después
de 60 segundos, se aplicó un potencial de +700 mV frente a Ag/AgCl
usando el contra-electrodo como el estándar y se
midió la corriente de respuesta.
La Figura 4 también muestra el resultado de la
medida usando un biosensor convencional por comparación.
En el caso del biosensor convencional, se
añadieron 5 \mul de una disolución patrón que contenía
L-fenilalanina y, después de 60 segundos, se aplicó
un potencial de -220 mV frente a Ag/AgCl usando un
contra-electrodo como el estándar y se midió la
corriente de respuesta.
Cuando se añade una muestra al reactivo de
reacción, el sustrato en la muestra sufre una reacción enzimática
específica por la acción de la deshidrogenasa, y la coenzima
incluida en el reactivo de reacción para formar de ese modo una
coenzima reducida. Después, transcurre rápidamente una reacción
redox entre esta coenzima reducida y el mediador de electrones y la
sal de tetrazolio y se forma un formazán químicamente estable como
producto final. Posteriormente, se aplica un potencial al sistema
de electrodos y de ese modo se transforma electroquímicamente el
formazán. Después, se detecta la corriente de respuesta que surge
de ese modo. Debido a que esta corriente de respuesta depende de la
concentración de sustrato, se puede cuantificar de ese modo el
sustrato. La Fig. 5 muestra una vista del modelo de reacción de la
presente invención como se describió anteriormente. La Fig. 6
muestra las fórmulas estructurales fundamentales de las sales de
tetrazolio y formazanes.
Como resultado, se consiguió una respuesta de una
linealidad muy buena en un intervalo de concentración de
L-fenilalanina de 0 a 1 mM. Se obtuvo una corriente
de respuesta muy grande que mostró una densidad de corriente de
aproximadamente 120 \muA/cm^{2} por mM de
L-fenilalanina.
Aunque en los ejemplos anteriores se hizo uso de
un biosensor que implicaba un sistema de dos electrodos que tenían
un electrodo de trabajo y un contra-electrodo, se
puede también hacer la cuantificación con mayor exactitud usando un
sistema de tres electrodos con un electrodo de referencia.
Claims (5)
1. Un método para cuantificar un sustrato en una
muestra, que comprende llevar a cabo una reacción enzimática y una
reacción redox entre un reactivo de reacción que comprende
simultáneamente una o más deshidrogenasas, una coenzima, un
mediador de electrones y una sal de tetrazolio, y la muestra, y
detectar un formazán formado como el producto final de reacción
usando un sistema de electrodos fabricado con materiales
eléctricamente conductores, el mecanismo de reacción de dicho
método se resume como se muestra en el siguiente esquema de
reacción:
2. El método según la reivindicación 1, en el que
dicho sustrato es alanina, un alcohol, un aldehído, ácido
isocítrico,
uridina-5'-difosfoglucosa,
galactosa, ácido fórmico,
gliceraldehído-3-fostato, glicerol,
glicerol-3-fosfato, glucosa,
glucosa-6-fosfato, ácido glutámico,
colesterol, sarcosina, sorbitol, ácido carbónico, ácido láctico,
ácido 3-hidroxibutírico, ácido pirúvico,
fenilalanina, fructosa, ácido 6-fosfoglucónico,
formaldehído, manitol, ácido málico o leucina.
3. El método según la reivindicación 1, en el que
dicho formazán se transforma electroquímicamente aplicando un
cierto potencial a dicho sistema de electrodos y se detecta la
corriente de respuesta que surge de ese modo.
4. Un biosensor para detectar formazán usando el
método de la reivindicación 1, en el que están integrados un
reactivo de reacción que comprende al menos una deshidrogenasa, una
coenzima, un mediador de electrones y una sal de tetrazolio, y un
sistema de electrodos compuesto por al menos un electrodo de trabajo
y un contra-electrodo hechos de materiales
eléctricamente conductores.
5. El biosensor según la reivindicación 4, en el
que dicho formazán se transforma electroquímicamente aplicando un
cierto potencial a dicho sistema de electrodos y se detecta la
corriente de respuesta que surge de ese modo.
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