PL191624B1 - Wyizolowany polipeptyd kodowany przez gen białka podobnego do lipazy, jego fragment antygenowy, wyizolowany kwas nukleinowy kodujący ten polipeptyd i wektor go zawierający, zrekombinowana komórka zawierająca ten wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, przeciwciało zdolne do wiązania polipeptydu i komórka hybrydomy je wytwarzająca, kompozycja farmaceutyczna, sposób wyszukiwania agonistów lub antagonistów aktywności polipeptydu, sposób enzymatycznej hydrolizy in vitro estru fosfatydylocholiny, zastosowanie polipeptydu oraz transgeniczna mysz - Google Patents

Abstract

1. Wyizolowany polipeptyd kodowany przez gen bialka podobnego do lipazy (LLG), znamienny tym, ze (a) wiaze heparyne, (b) posiada homologie do ludzkiej lipazy lipoproteinowej i lipazy watrobowej, (c) zawiera domene katalityczna rodziny lipaz triacyloglicerolowych o masie 39000, przy czym i) polipeptyd zawiera sekwencje aminokwasowa o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie czasteczkowej okolo 55000 w 10% zelu SDS-PAGE, sekwencje aminokwasowa o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie czasteczkowej okolo 68000 w 10% zelu SDS-PAGE lub sekwencje aminokwasowa o numerze identyfikacyjnym 6 i o pozornej masie czasteczkowej okolo 40000 w 10% zelu SDS-PAGE, lub ii) domena katalityczna o masie 39000 zawiera sekwencje aminokwasowa o numerze iden- tyfikacyjnym 10, lub iii) wyizolowany polipeptyd jest pochodzenia króliczego i zawiera sekwencje aminokwasowa o numerze identyfikacyjnym 12. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd kodowany przez gen białka podobnego do lipazy, jego fragment antygenowy, wyizolowany kwas nukleinowy kodujący ten polipeptyd i wektor go zawierający, zrekombinowana komórka zawierająca ten wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, przeciwciało zdolne do wiązania polipeptydu i komórka hybrydomy je wytwarzająca, kompozycja farmaceutyczna zawierająca polipeptyd, wektor lub przeciwciało, sposób wyszukiwania agonistów lub antagonistów aktywności polipeptydu, sposób enzymatycznej hydrolizy in vitro estru fosfatydylocholiny przy pomocy tego polipeptydu, zastosowanie polipeptydu oraz transgeniczna mysz, w której organizmie zachodzi ekspresja polipeptydu.

A) Lipidy

Lipidy są nierozpuszczalnymi w wodzie cząsteczkami biologicznymi, które są zasadniczymi składnikami zaangażowanymi w rozmaitych funkcjach biologicznych, włącznie z przechowywaniem, magazynowaniem i metabolizmem energii oraz strukturą i płynnością błon. U człowieka i innych zwierząt lipidy pochodzą z dwóch źródeł: niektóre lipidy spożywane są jako tłuszcze i oleje w diecie, a inne lipidy są biosyntetyzowane przez człowieka lub zwierzę. U ssaków co najmniej 10% wagi ciała stanowią lipidy, z których większość ma postać triacylogliceroli.

Triacyloglicerole, znane również jako triglicerydy lub triacyloglicerydy, zbudowane są z do trzech kwasów tłuszczowych estryfikujących glicerol. Spożywane w diecie triacyloglicerole magazynowane są w tkankach tłuszczowych jako źródło energii lub hydrolizowane w przewodzie pokarmowym przez lipazy triacyloglicerolowe, z których najważniejsza jest lipaza trzustkowa. Triacyloglicerole transportowane są pomiędzy tkankami w postaci lipoprotein.

Lipoproteiny są występującymi w osoczu zgrupowaniami podobnymi do micelli, które zawierają różne proporcje różnych lipidów i białek (nazywanych apoproteinami). Istnieje pięć głównych klas lipoprotein osocza, których główną funkcją jest transport lipidów. Klasami tymi są, w kolejności wzrastającej gęstości, chylomikrony, lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL), lipoproteiny o pośredniej gęstości (IDL), lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) oraz lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL). Chociaż stwierdza się wiele rodzajów lipidów związanych z każdą z klas lipoprotein, każda klasa transportuje głównie jeden rodzaj lipidów: opisane powyżej triacyloglicerole transportowane są w chylomikronach, VLDL i IDL, podczas gdy fosfolipidy i estry cholesterolu transportowane są odpowiednio wHDL i LDL.

Fosfolipidy są estrami fosforanu glicerolu i dwóch kwasów tłuszczowych, zawierającymi również polarną grupę przyłączoną do grupy fosforanowej. Fosfolipidy są ważnymi składnikami strukturalnymi błon komórkowych. Fosfolipidy hydrolizowane są przez enzymy nazwane fosfolipazami. Przykładowy fosfolipid, fosfatydylocholina, jest głównym składnikiem większości błon komórek eukariotycznych.

Cholesterol jest metabolicznym prekursorem hormonów steroidowych i kwasów żółciowych, jak również zasadniczym składnikiem błon komórkowych. U człowieka i innych zwierząt cholesterol spożywany w pokarmie, a także syntetyzowany przez wątrobę i inne tkanki. Cholesterol transportowany jest pomiędzy tkankami w postaci estrów cholesterylowych w LDL i innych lipoproteinach.

Błony otaczają każdą żyjącą komórkę i służą jako bariera pomiędzy przedziałami wewnątrzkomórkowym i zewnątrzkomórkowym. Błony otaczają również eukariotyczne jądro komórkowe, tworzą retikulum endoplazmatyczne i odpowiadają za wyspecjalizowane funkcje, takie jak w otoczce mielinowej, która otacza aksony. Typowa błona zawiera około 50% lipidów i 60% białek, ale występuje znaczne zróżnicowanie. Głównymi składnikami lipidowymi są fosfolipidy, szczególnie fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina, oraz cholesterol. Właściwości fizykochemiczne błon, takie jak płynność, można zmieniać przez modyfikację albo profili kwasów tłuszczowych fosfolipidów, albo zawartości cholesterolu.

Modulowanie składu i organizacji lipidów błon moduluje również zależne od błon funkcje komórkowe, takie jak aktywność receptorów, endocytoza i przepływ cholesterolu.

B) Enzymy

Lipazy triacyloglicerolowe są rodziną enzymów, które odgrywają kilka podstawowych ról w metabolizmie lipidów w organizmie. Opisano trzech przedstawicieli rodziny ludzkich lipaz triacyloglicerolowych: lipazę trzustkową, lipazę lipoproteinową i lipazę wątrobową (Goldberg, I.J., Le, N.-A., Ginsberg, H.N., Krauss, R.M. i Lingren, F.T. (1988) J. Clin. Invest. 81, 561-568; Goldberg, I.J., Le, N., Paterniti, J.R., Ginsberg, H.N., Lindgren, F.T. i Brown, W.V. (1982) J. Clin. Invest. 70, 1184-1192; Hide, W.A., Chan, L. i Li, W.-H. (1992) J. Lipid Res. 33, 167-178). Lipaza trzustkowa jest przede wszystkim odpowiedzialna za hydrolizę lipidów pochodzących z pokarmu. Opisano warianty lipazy

PL 191 624 B1 trzustkowej, ale nie określono ich roli fizjologicznej (Giller, T., Buchwald, P., Blum-Kaelin, D. i Hunziker, W. (1992) J. Biol. Chem. 267, 16509-16516). Lipaza lipoproteinowa hydrolizuje triglicerydy zarówno w chylomikronach, jak i VLDL. Lipaza wątrobowa hydrolizuje triglicerydy w IDL i HDL i odpowiedzialna jest za przebudowywanie lipoprotein. Lipaza wątrobowa działa również jako fosfolipaza i hydrolizuje fosfolipidy w HDL.

Fosfolipazy odgrywają ważne role w katabolizmie i przebudowywaniu fosfolipidowej składowej lipoprotein i fosfolipidów błon. Fosfolipazy mogą również odgrywać rolę w uwalnianiu kwasu arachidonowego, a następnie w tworzeniu prostaglandyn, leukotrienów i innych lipidów, które zaangażowane są w różnych procesach zapalnych.

Polipeptydy lipaz kodowane przez te geny lipaz mają długość około 450 aminokwasów z liderowymi peptydami sygnałowymi dla ułatwiania sekrecji. Białka lipaz składają się z dwóch głównych domen (Winkler, K., D'Arcy, A. i Hunziker, W. (1990) Nature 343, 771-774). Domena aminokońcowa zawiera miejsce katalityczne, podczas gdy domenę karboksylową uważa się za odpowiedzialną za wiązanie substratu, łączenie z kofaktorem i oddziaływanie z receptorami komórkowymi (Wong, H., Davis, R.C., Nikazy, J., Seebart, K.E. i Schotz, M.C. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1129011294; van Tilbeurgh, H., Roussel, A., Lalouel, J.-M. i Cambillau, C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 46264633; Wong, H., Davis, R.C., Thuren, T., Goers, J.W., Nikazy, J., Waite, M. i Schotz, M.C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 10319-10323; Chappell, D.A., Inoue, I., Fry, G.L., Pladet, M.W., Bowen, S.L., Iverius, P.-H., Lalouel, J.M. i Strickland, D.K. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18001-18006). Całkowity poziom homologii aminokwasowej pomiędzy przedstawicielami rodziny wynosi 22-65%, z miejscowymi regionami wysokiej homologii odpowiadającymi homologiom strukturalnym związanym z funkcją enzymatyczną.

Naturalnie występujące białko lipazy lipoproteinowej jest glizkozylowane i glikolizacja jest konieczna do aktywności enzymatycznej LPL (Semenkovich, C.F., Luo, C.C., Nakanishi, M.K., Chen, S.H., Smith, L.C. i Chan, L. (1990) J. Biol. Chem. 265, 5429-5433). W lipazie wątrobowej i lipoproteinowej występują dwa miejsca N-glikozylacji, a jedno w lipazie trzustkowej. Ponadto, cztery pary cystein tworzą mostki dwusiarczkowe, które mają zasadnicze znaczenie dla utrzymywania integralności strukturalnej do aktywności enzymatycznej (Lo, J.-Y., Smith, L.C. i Chan, L. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 266-271; Brady, L., Brzozowski, A.M., Derewenda, Z.S., Dodson, E., Dodson, G., Tolley, S., Turkenburg, J.P., Christiansen, L., Huge-Jensen, B., Norskov, L., Thim, L. i Menge, U. (1990) Nature 343, 767-770).

Przedstawiciele rodziny lipaz triacyloglicerolowych posiadają liczne konserwatywne cechy wspólne. Jedną taką cechą jest motyw „GXSXG”, w którym środkowa reszta seryny jest jedną z trzech reszt stanowiących „triadę katalityczną” (Winkler, K., D'Arcy, A. i Hunziker, W. (1990) Nature 343, 771774; Faustinella, F., Smith, L.C. i Chan, L. (1992) Biochemistry 31, 7219-7223). Konserwatywne reszty asparaginianowa i histydynowa równoważą triadę katalityczną. Krótki odcinek o długości 19-23 aminokwasów („region wieka”) tworzy strukturę amfipatycznej helisy i przykrywa kieszeń katalityczną enzymu (Winkler, K., D'Arcy, A. i Hunziker, W. (1990) Nature 343, 771-774). Region ten jest różny u różnych przedstawicieli rodziny i ostatnio stwierdzono, że odcinek ten nadaje specyficzność substratową enzymom (Dugi, K.A., Dichek, H.L. i Santamarina-Fojo, S. (1995) J. Biol. Chem. 270, 2539625401) . Porównania pomiędzy lipazami wątrobową i lipoproteinową wykazały, że za różnice w aktywnościach lipazy triacyloglicerolowej i fosfolipazy częściowo odpowiedzialny jest ten region wieka (Dugi, K.A., Dichek, H.L. i Santamarina-Fojo, S. (1995) J. Biol. Chem. 270, 25396-25401).

Lipazy triacyloglicerolowe posiadają w różnym stopniu aktywność wiązania heparyny. Lipaza lipoproteinowa posiada najwyższe powinowactwo do heparyny i tę aktywność wiązania zmapowano do odcinków dodatnio naładowanych reszt w domenie aminokońcowej (Ma, Y., Henderson, H.E., Liu, M.S., Zhang, H., Forsythe, I.J., Clarke-Lewis, I., Hayden, M.R. i Brunzell, J. D. J. Lipid Res. 35, 20492059). Lokalizacja lipazy lipoproteinowej na powierzchni śródbłonkowej (Cheng, C. F., Oosta, G.M., Bensadoun, A. i Rosenberg, R.D. (1981) J. Biol. Chem. 256, 12893-12896) zachodzi przede wszystkim dzięki wiązaniu z proteoglikanami powierzchniowymi (Shimada, K., Gill, P.J., Silbert, J.E., Douglas, W.H.J. i Fanburg, B.L. (1981) J. Clin. Invest. 68, 995-1002; Saxena, U., Klein, M.G. i Goldberg,

I.J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 17516-17521; Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. i Vlodavsky, I (1992) J. Clin. Invest. 90, 2013-2021). Jest to aktywność, która umożliwia enzymowi przyspieszanie pobierania LDL poprzez działanie jako mostek pomiędzy LDL i powierzchnią komórki (Mulder, M., Lombardi, P., Jansen, H., van Berkel, T. J., Frants, R.R. i Havekes, L.M. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185, 582-587; Rutledge, J.C. i Goldberg, I.J. (1994) J. Lipid Res. 35, 1152-1160; Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, T., Kobayashi, Y., Konno, T. i Tada, K. (1980) Int. J. Cancer 26, 171-176).

PL 191 624 B1

O zarówno lipazie lipoproteinowej, jak i lipazie wątrobowej wiadomo, że działają w połączeniu z białkami koaktywatorów: apolipoproteiną CII dla lipazy lipoproteinowej i kolipazą dla ligazy trzustkowej.

Podano sekwencje genetyczne kodujące ludzkie lipazę trzustkową, lipazę wątrobową i lipazę lipoproteinową (numery dostępu Genbank odpowiednio M93285, J03540 i M15856). Długości matrycowych RNA ludzkiej lipazy wątrobowej i lipazy trzustkowej wynoszą odpowiednio 1,7 i 1,8 tysięcy par zasad. Z genu ludzkiej lipazy lipoproteinowej wytwarzane są dwa transkrypty o długości 3,6 i3,2 tysięcy par zasad. Te dwa transkrypty wykorzystują naprzemianległe sygnały poliadenylacji i różnią się pod względem wydajności ich translacji (Ranganathan, G., Ong, J.M., Yukht, A., Saghizadeh, M., Simsolo, R.B., Pauer, A.i Kern, P.A. (1995) J. Biol. Chem. 270, 7149-7155).

C) Procesy fizjologiczne

Metabolizm lipidów obejmuje oddziaływania lipidów, apoprotein, lipoprotein i enzymów.

Lipaza wątrobowa i lipaza lipoproteinowa są wielofunkcyjnymi białkami, które pośredniczą w wiązaniu, pobieraniu, katabolizmie i przebudowywaniu lipoprotein i fosfolipidów. Lipaza lipoproteinowa i lipaza wątrobowa działają, gdy są związane z luminalną powierzchnią komórek śródbłonkowych odpowiednio w tkankach obwodowych i wątrobie. Oba enzymy uczestniczą w transporcie powrotnym cholesterolu, który jest przemieszczaniem cholesterolu z tkanek obwodowych do wątroby albo w celu wydalenia z organizmu, albo w celu ponownego wykorzystania. O defektach genetycznych zarówno lipazy wątrobowej, jak i lipazy lipoproteinowej wiadomo, że są przyczyną rodzinnych zaburzeń metabolizmu lipoprotein. Wynikiem defektów metabolizmu lipoprotein są poważne zaburzenia metaboliczne, obejmujące hipercholesterolemię, hiperlipemia i aterosklerozę.

Ateroskleroza jest złożoną, zależną od wielu genów chorobą, którą pod względem histologicznym definiuje odkładanie się złogów (lipidowych lub fibrolipidowych blaszek) lipidów i innych składników krwi w ścianach naczyń krwionośnych, szczególnie dużych tętnic (aorty, tętnic wieńcowych, tętnicy szyjnej). Blaszkom tym, które są mniej lub bardziej zwapniałe w zależności od stopnia zaawansowania procesu aterosklerotycznego, mogą towarzyszyć uszkodzenia i są one związane z akumulacją w naczyniach złogów tłuszczowych, składających się zasadniczo z estrów cholesterolu. Blaszkom tym towarzyszy zwiększanie grubości ściany naczynia, hipertrofia mięśni gładkich, pojawianie się komórek piankowatych (zniszczonych lipidami komórek powstających w wyniku niekontrolowanego pobierania cholesterolu przez przyciągane makrofagi) i akumulacja tkanki włóknistej. Blaszka miażdżycowa wystaje znacznie ze ściany, nadając jej zwężony charakter odpowiedzialny za zamykanie naczyń przez ognisko miażdżycowe, zakrzepicę lub zator, które występują u najbardziej dotkniętych pacjentów. Te uszkodzenia mogą prowadzić do poważnych patologii sercowo-naczyniowych, takich jak zawał, nagły zgon, niewydolność serca i udar.

Rola lipaz triacyloglicerolowych w patologiach naczyń stała się przedmiotem intensywnych badań (przeglądu dokonano w Olivecrona, G.i Olivecrona, T. (1995) Curr. Opin. Lipid. 6, 291-305). Generalnie, działanie lipaz triacyloglicerolowych uważa się za przeciwaterogenne, ponieważ enzymy te obniżają poziomy triacylogliceroli w surowicy i pobudzają tworzenie HDL. Zwierzęta transgeniczne, w których zachodzi ekspresja ludzkiej lipazy lipoproteinowej lub lipazy wątrobowej, posiadają obniżone poziomy triglicerydów osocza i podwyższony poziom lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) (Shimada, M., Shimano, H., Gotoda, T., Yamamoto, K., Kawamura, M., Inaba, T., Yazaki, T. i Yamada, N. (1993) J. Biol. Chem. 268, 17924-17929; Liu, M.-S., Jirik, F.R., LeBoeuf, R.C., Henderson, H., Castellani, L.W., Lusis, A.J., Ma, Y., Forsythe, I.J., Zhang, H., Kirk, E., Brunzell, J.D. i Hayden, M.R. (1994)

J. Biol. Chem. 269, 11417-11424).

Stwierdzono, że ludzie z defektami genetycznymi, których wynikiem są obniżone poziomy aktywności lipazy lipoproteinowej, posiadają nadmiar triglicerydów we krwi, ale nie występuje u nich podwyższone ryzyko choroby wieńcowej. Donoszono, że jest to spowodowane brakiem wytwarzania aterogennych lipoprotein o pośredniej wielkości, które mogłyby ulegać akumulacji w przestrzeni podśródbłonkowej (Zilversmit, D.B. (1973) Circ. Res. 33, 633-638).

Jednakże przypuszcza się, że w ograniczonym obszarze uszkodzenia aterosklerotycznego zwiększony poziom aktywności lipazy przyspiesza proces aterogenny (Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. 41, 153-158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C., Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden, M.R. i Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341, 1119-1121). Może to być spowodowane następującym za pośrednictwem lipazy wzrostem wiązania i pobierania lipoprotein przez tkankę naczyniową (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T., Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90, 2013-2021; Tabas, I., Li, I., Brocia, R.W., Xu, S.W., Swenson, T.L., Williams, K.S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 20419-20432; Nordestgaard, B.G. i Nielsen, A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5, 252-257; Williams, K.J. i Tabas, I.

PL 191 624 B1 (1995) Art. Thromb. and Vasc. Biol. 15, 551-561). Dodatkowo, wynikiem wysokich miejscowych poziomów aktywności lipazy mogą być cytotoksyczne poziomy kwasów tłuszczowych i lizofosfatydylocholiny wytwarzanych w prekursorach uszkodzeń aterosklerotycznych.

Pomimo pojawiającego się zrozumienia dotyczącego roli aktywności lipaz w homeostazie lipidowej, zachodzi potrzeba w tej dziedzinie identyfikacji dodatkowych genów kodujących białka regulujące metabolizm lipidów.

Niniejszy wynalazek dotyczy odkrycia genu białka podobnego do lipazy (LLG), ulegającego z niego ekspresji produktów polipeptydowych oraz kompozycji i sposobów ich stosowania.

Wyizolowany polipeptyd według wynalazku kodowany przez gen białka podobnego do lipazy (LLG) (a) wiąże heparynę, (b) posiada homologię do ludzkiej lipazy lipoproteinowej i lipazy wątrobowej, (c) zawiera domenę katalityczną rodziny lipaz triacyloglicerolowych o masie 39000, przy czym

i) polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 55000 w 10% żelu SDS-PAGE, sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 68000 w 10% żelu SDS-PAGE lub sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 6 i o pozornej masie cząsteczkowej około 40000 w 10% żelu SDS-PAGE, lub ii) domena katalityczna o masie 39000 zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 10, lub iii) wyizolowany polipeptyd jest pochodzenia króliczego i zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 12.

Korzystnie, wyizolowany polipeptyd według wynalazku, zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8i o pozornej masie cząsteczkowej około 55000 w 10% żelu SDS-PAGE, sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 68000 w 10% żelu SDS-PAGE lub sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 6 i opozornej masie cząsteczkowej około 40000 w 10% żelu SDS-PAGE.

Korzystnie, domena katalityczna rodziny lipaz triacyloglicerolowych o masie 39000 zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 10.

Korzystnie, wyizolowany polipeptyd jest pochodzenia króliczego i zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 12.

Korzystnie, wyizolowany polipeptyd wykazuje aktywność fosfolipazy A.

Przedmiotem wynalazku jest także fragment antygenowy wyizolowanego polipeptydu według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to kwas korzystnie stanowi cDNA, korzystnie posiadający sekwencję nukleotydową wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 5, 7 i 9. Korzystnie, kwas nukleinowy zawiera nukleotydy 252-1754 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7.

W innym korzystnym wykonaniu wyizolowany kwas nukleinowy koduje polipeptyd pochodzenia króliczego, zawierający sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 12.

W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wyizolowany kwas nukleinowy posiada sekwencję o numerze indentyfikacyjnym 11.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wyizolowany kwas nukleinowy hybrydyzujący w warunkach 0,1X SSC, 0,5% SDS w temperaturze 68°C z celem wybranym z grupy składającej się z nukleotydów od 44 do 79 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3 i nukleotydów od 1036-1065 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd według wynalazku, połączony w sposób umożliwiający działanie z regionem regulującym, przy czym korzystnie region regulujący pochodzi ze źródła heterologicznego. Korzystnie, wektor jest wektorem wirusowym, korzystnie adenowirusowym.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zrekombinowana komórka zawierająca wektor z wbudowanym kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowana komórka, zawierającą ten wektor, korzystnie jest to komórka eukariotyczna, korzystnie komórka COS-7.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania polipeptydu według wynalazku, w którym hoduje się zrekombinowaną komórkę zawierającą wektor z wbudowanym kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd według wynalazku w warunkach umożliwiających ekspresję polipeptydu.

PL 191 624 B1

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało zdolne do specyficznego wiązania polipeptydu według wynalazku. Korzystnie przeciwciało to jest zdolne do neutralizowania aktywności fosfolipazowej polipeptydu. W jednym wariancie przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, w innym jest przeciwciałem poliklonalnym.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka hybrydomy wytwarzająca przeciwciało monoklonalne zdolne do specyficznego wiązania polipeptydu według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca a) wymieniony polipeptyd, albo b) wymieniony wektor, albo c) wymienione przeciwciało, oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

W jednym z wariantów kompozycja zawiera polipeptyd i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, w innym zawiera wektor i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, a w jeszcze innym zawiera przeciwciało i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. Korzystnie, dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem jest roztwór zgodny biologicznie.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wyszukiwania agonistów lub antagonistów aktywności polipeptydu kodowanego przez gen podobny do lipazy LLG, w którym (a) zapewnia się kontakt potencjalnych agonistów lub antagonistów z polipeptydem i substratem polipeptydu, oraz (b) mierzy się zdolność potencjalnych agonistów lub antagonistów do wzmacniania lub hamowania aktywności polipeptydu, przy czym polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 io pozornej masie cząsteczkowej około 55000 w 10% żelu SDS-PAGE, sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 68000 w 10% żelu SDS-PAGE lub sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 6 i o pozornej masie cząsteczkowej około 40000 w 10% żelu SDS-PAGE.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób enzymatycznej hydrolizy in vitro estru fosfatydylocholiny, w którym zapewnia się kontakt estru fosfatydylocholiny z polipeptydem zawierającym sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 55000 w10% żelu SDS-PAGE, sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 68000 w 10% żelu SDS-PAGE lub sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 6 i o pozornej masie cząsteczkowej około 40000 w 10% żelu SDS-PAGE, albo z polipeptydem, którego domena katalityczna o masie 39000 zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 10.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu według wynalazku do wytwarzania leku do poprawiania profilu lipidów w surowicy człowieka lub innego zwierzęcia posiadającego niepożądany profil lipidów.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku do poprawiania profilu lipidów w surowicy człowieka lub innego zwierzęcia posiadającego niepożądany profil lipidów.

Przedmiotem wynalazku jest także transgeniczna mysz, w której organizmie zachodzi ekspresja polipeptydu według wynalazku.

Wynalazek w przykładach wykonania został przedstawiony na rysunku, na którym

Figura 1 przedstawia sekwencje (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 17-31) starterów stosowanych w przykładowych amplifikacjach PCR.

Figura 2 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) i przewidywaną sekwencję aminokwasową (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2) produktu RTPCR z zastosowaniem zestawu Differential Display stanowiącego cDNA genu białka podobnego do lipazy. Sekwencje odpowiadające dwóm starterom zastosowanym w amplifikacji podkreślono. Kodon terminacji i sygnał poliadenylacji otoczono ramką. Motywy GAATTC i sekwencje flankujące pochodzą z wektora pCRII, w którym sklonowano produkt.

Figura 3 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3) i przewidywaną sekwencję aminokwasową (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4) przedłużenia cDNA LLG uzyskanego w wyniku reakcji 5'RACE. Sekwencje odpowiadające dwóm starterom zastosowanym w amplifikacji podkreślono. Motywy GAATTC i sekwencje flankujące pochodzą z wektora pCRII, w którym sklonowano produkt.

Figura 4 przedstawia sekwencję (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7) cDNA zawierającego pełną otwartą ramkę odczytu genu białka podobnego do lipazy, LLGXL. Kodon start (ATG) i kodon terminacji otoczono ramką. Miejsce Dral (TTTAAA) i miejsce Srfl (GCCCGGGC) zastosowane w konstruowaniu wektorów ekspresyjnych podkreślono.

PL 191 624 B1

Figura 5 przedstawia przewidywaną sekwencję aminokwasową (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8) białka LLGXL. Przewidywaną sekwencję sygnałową podkreślono.

Figura 6 przedstawia przyporządkowanie sekwencji białek rodziny genowej lipaz triacyloglicerolowych (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 13-15). Zacieniowane reszty są identyczne z resztami białka LLGXL (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8). Do sekwencji wprowadzono przerwy dla maksymalizacji wartości przyporządkowania przy zastosowaniu programu CLUSTAL.

Figura 7 przedstawia analizę przez blotting typu northern mRNA LLG w komórkach THP-1. Komórki stymulowano albo PMA, albo PMA i utlenionymi LDL (PMA + utlenione LDL). Liczby po lewej stronie wskazują położenia standardów RNA (w tysiącach par zasad).

Figura 8 przedstawia analizę przez blotting typu northern mRNA z wielu tkanek ludzkich badanych sondą cDNA LLG, lipazy lipoproteinowej i ludzkiej aktyny beta. Położenie standardu RNA o wielkości 4,4 tysięcy par zasad wskazano po lewej stronie żeli z LLGi LPL.

Figura 9 przedstawia analizę przez blotting typu northern ekspresji LLG i LPL w hodowanych ludzkich komórkach śródbłonkowych i komórkach THP-1. Komórki były albo niestymulowane (nie eksponowane na PMA), albo stymulowane PMA.

Figura 10 przedstawia sekwencję peptydu immunizującego (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16) i jej związek z sekwencją białka LLGXL. Peptyd przedstawiono w zacieniowanej ramce. Terminalną cysteinę wprowadzono w celu ułatwienia sprzęgania peptydu z białkiem nośnikowym.

Figura 11 przedstawia analizę przez blotting typu western białka zatężonego na heparynieSepharose z kodycjonowanego podłoża z hodowanych komórek śródbłonkowych. Blot analizowano stosując antysurowicę skierowaną przeciw LLG. Liczby po lewej stronie wskazują położenia standardów białkowych w kilodaltonach.

Figura 12 przedstawia analizę przez blotting typu western białek związanych z heparynąSepharose w kondycjonowanym podłożu z komórek COS-7 krótkotrwale stransfekowanych wektorem ekspresyjnym zawierającym cDNA LLGN lub LLGXL lub niezawierającym DNA (ślepa próba). Białka ze stymulowanych PMA komórek śródbłonkowych (HCAEC + PMA) włączono dla porównania wielkości. Liczby po lewej stronie wskazują pozorne masy cząsteczkowe głównych immunoreaktywnych białek, określone przez porównanie ze standardami białkowymi.

Figura 13 przedstawia sekwencję produktu PCR króliczego LLG (RLLG.SEQ, sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12) i przyporządkowanie sekwencji produktu PCR króliczego LLG i odpowiadającej sekwencji w cDNA ludzkim (LLG7742A). Identyczne nukleotydy zacieniowano.

Figura 14 przedstawia aktywność fosfolipazy A ludzkich LPL, LLGN i LLGXL przy zastosowaniu substratu fosfatydylocholiny.

Figura 15 przedstawia aktywność lipazy triacyloglicerydowej ludzkich LPL, LLGN i LLGXL przy zastosowaniu oleiny jako substratu.

Figura 16 przedstawia hybrydyzację sond LLG i LPL z genomowymi DNA z różnych gatunków.

Wynalazek dotyczy odkrycia genu białka podobnego do lipazy (LLG) i ulegających z niego ekspresji produktów polipeptydowych. Produkty polipetydowe, przedstawiciele rodziny lipaz triacyloglicerolowych, zawierają domenę katalityczną o masie cząsteczkowej około 39 kD rodziny lipaz triacyloglicerolowych, np. posiadającą sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 10. Jednym rozwiązaniem niniejszego wynalazku jest polipeptyd LLGN, który posiada 354 aminokwasy. Drugim rozwiązaniem niniejszego wynalazku jest polipeptyd LLGXL, który posiada 500 aminokwasów i wykazuje 43% podobieństwa do ludzkiej lipazy lipoproteinowej i 37% podobieństwa do ludzkiej lipazy wątrobowej. Polipeptyd LLGXL posiada aktywność fosfolipazy A.

Autorzy wynalazku wyizolowali częściowy cDNA z mRNA komórek THP-1, które eksponowano na ester forbolu i utlenione LDL. Po przedłużeniu uzyskanym w wyniku reakcji 5'RACE tego częściowego cDNA, wyizolowano mniejszy cDNA powstający w wyniku alternatywnego cięcia i składania mRNA. Drugi, większy cDNA wyizolowano z biblioteki cDNA łożyska ludzkiego.

Analiza przez blotting typu northern wykazała, że gen LLG ulega ekspresji w komórkach śródbłonkowych. Antysurowice otrzymane przez immunizację peptydem przewidzianym na podstawie otwartej ramki odczytu cDNA wykrywały białka o przewidywanej wielkości LLGN i LLGXL w kondycjonowanym podłożu z hodowanych komórek śródbłonkowych. Wynikiem traktowania komórek śródbłonkowych estrami forbolu było zwiększone wytwarzanie LLG na zarówno poziomie mRNA, jak i białka. Jest to pierwszy przedstawiciel rodziny lipaz triacyloglicerolowych, którego ekspresję stwierdzono w komórkach śródbłonkowych.

PL 191 624 B1

A) Definicje

Poniżej zdefiniowane terminy stosuje się w niniejszym opisie i powinny być pomocne w zrozumieniu zakresu i zastosowania w praktyce niniejszego wynalazku.

„Polipeptyd” jest polimerycznym związkiem złożonym z kowalencyjnie połączonych reszt aminokwasowych. Aminokwasy posiadają następującą strukturę ogólną.

Η

I

R-C-COOH

I νη₂

Aminokwasy klasyfikuje się w siedmiu grupach na podstawie łańcucha bocznego R: (1) alifatyczne łańcuchy boczne, (2) łańcuchy boczne zawierające grupę hydroksylową (OH), (3) łańcuchy boczne zawierające atomy siarki, (4) łańcuchy boczne zawierające grupę kwasową lub amidową, (5) łańcuchy boczne zawierające grupę zasadową, (6) łańcuchy boczne zawierające pierścień aromatyczny i (7) prolinę, iminokwas, w którym łańcuch boczny jest połączony z grupą aminową.

„Białko” jest polipeptydem, który odgrywa strukturalną lub funkcjonalną rolę w żywej komórce.

Polipeptydy i białka według wynalazku mogą być zglikozylowane lub niezglikozylowane.

„Homologia” oznacza podobieństwo sekwencji odzwierciedlające wspólne pochodzenie ewolucyjne. O polipeptydach lub białkach mówi się, że wykazują homologię, lub podobieństwo, jeśli znaczna liczba ich aminokwasów jest albo (1) identyczna, albo (2) posiada chemicznie podobny łańcuch boczny R. O kwasach nukleinowych mówi się, że wykazują homologię, jeśli znaczna liczba ich nukleotydów jest identyczna.

„Wyizolowany polipeptyd” lub „wyizolowane białko” jest polipeptydem lub białkiem, które są zasadniczo wolne od tych związków, które normalnie towarzyszą im w ich stanie naturalnym (np. innych białek lub polipeptydów, kwasów nukleinowych, węglowodanów, lipidów). „Wyizolowany” nie oznacza wykluczenia sztucznej lub syntetycznej mieszaniny z innymi związkami lub obecności zanieczyszczeń, które nie zakłócają aktywności biologicznej, a które mogą być obecne, na przykład, w wyniku niepełnego oczyszczenia, dodawania czynników stabilizujących lub włączenia w farmaceutycznie dopuszczalny preparat.

Cząsteczka jest „antygenowa, jeśli jest zdolna do specyficznego oddziaływania z rozpoznającą antygeny cząsteczką układu immunologicznego, taką jak immunoglobulina (przeciwciało) lub receptor komórki T. Polipeptyd antygenowy zawiera co najmniej około 5, a korzystnie co namniej około 10 aminokwasów. Antygenową częścią cząsteczki może być ta część, która jest immunodoninująca dla rozpoznawania przeciwciała lub receptora komórek T, lub może być nią część stosowana do utworzenia przeciwciała skierowanego przeciw cząsteczce przez koniugowanie części antygenowej z cząsteczką nośnika do immunizacji. Cząsteczka, która jest antygenowa nie musi sama być immunogenna, tj. zdolna do wywoływania odpowiedzi immunologicznej bez nośnika.

„Polipeptyd LLGN” i „białko LLGN” oznaczają polipeptyd obejmujący sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 6, przy czym rzeczony polipeptyd jest zglikozylowany lub niezglikozylowany.

„Polipeptyd LLGXL” i „białko LLGXL” oznaczają polipeptyd obejmujący sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 8, przy czym rzeczony polipeptyd jest zglikozylowany lub niezglikozylowany.

„Polipeptyd LLG” generalnie opisuje zarówno polipeptyd LLGN, jak i polipeptyd LLGXL.

Polipeptyd lub białko LLG według wynalazku obejmuje każdy analog, fragment, pochodną lub mutanta, które pochodzą od polipeptydu LLG i które zachowują co najmniej jedną właściwość biologiczną polipeptydu LLG. W przyrodzie występują różne warianty polipeptydu LLG. Warianty te mogą być wariantami allelicznymi, charakteryzującymi się różnicami w sekwencjach nukleotydowych genu struktury kodującego białko, lub mogą obejmować różnicowe wycinanie intronów bądź modyfikacje potranslacyjne. Specjalista w tej dziedzinie może tworzyć warianty posiadające pojedyncze lub wielokrotne podstawienia, delecje, addycje lub zastąpienia aminokwasowe. Warianty te mogą obejmować, między innymi, (a) warianty, w których jedną lub więcej reszt aminokwasowych podstawiono aminokwasami konserwatywnymi lub niekonserwatywnymi, (b) warianty, w których do polipeptydu LLG dodano jeden lub więcej aminokwasów, (c) warianty, w których jeden lub więcej aminokwasów zawiera grupę podstawnika oraz (d) warianty, w których polipeptyd LLG został poddany fuzji z innym polipepPL 191 624 B1 tydem, takim jak albumina surowicy. Inne polipeptydy według wynalazku obejmują warianty, w których reszty aminokwasowe pochodzące z jednego gatunku podstawiono w miejsce odpowiadającej reszty w innym gatunku, albo w pozycjach konserwatywnych, albo niekonserwatywnych. W innym rozwiązaniu, reszty aminokwasowe w pozycjach niekonserwatywnych podstawia się resztami konserwatywnymi lub niekonserwatywnymi. Techniki otrzymywania tych wariantów, obejmujące techniki genetyczne (supresje, delecje, mutacje itp.), chemiczne i enzymatyczne, są znane specjalistom w tej dziedzinie.

Jeśli wynikiem takich wariantów allelicznych, analogów, fragmentów, pochodnych, mutantów i produktów modyfikacji, włącznie z postaciami otrzymanymi w wyniku alternatywnego cięcia i składania mRNA i postaciami otrzymanymi w wyniku modyfikacji potranslacyjnej, są pochodne polipeptydu LLG, które zachowują jakiekolwiek właściwości biologiczne polipeptydu LLG, objęte są one zakresem tego wynalazku.

„Kwas nukleinowy” jest polimerycznym związkiem złożonym z kowalencyjnie połączonych podjednostek nazywanych nukleotydami. Kwas nukleinowy obejmuje kwas polirybonukleinowy (RNA) i kwas polideoksyrybonukleinowy (DNA), które mogą być jednoniciowe lub dwuniciowe. DNA obejmuje cDNA, genomowy DNA, syntetyczny DNA i półsyntetyczny DNA. Sekwencję nukleotydów, która koduje białko, nazywa się sekwencją sensowną.

„Antysensowny kwas nukleinowy” jest sekwencją nukleotydów, która jest komplementarna do sekwencji sensownej. Antysensowne kwasy nukleinowe można stosować do obniżania lub blokowania ekspresji polipeptydu kodowanego przez nić sensowną.

„Wyizolowany kwas nukleinowy” oznacza kwas nukleinowy, który jest zasadniczo wolny od tych związków, które normalnie towarzyszą mu w jego stanie naturalnym. „Wyizolowany” nie oznacza wykluczenia sztucznych lub syntetycznych mieszanin z innymi związkami lub obecności zanieczyszczeń, które nie zakłócają jego aktywności biologicznej, a które mogą być obecne, na przykład, w wyniku niepełnego oczyszczenia, dodawania czynników stabilizujących lub włączenia w farmaceutycznie dopuszczalny preparat.

Zwrot „kwas nukleinowy, który hybrydyzuje w warunach o wysokiej surowości” oznacza, że zhybrydyzowane kwasy nukleinowe są zdolne do wytrzymania przemywania w warunkach o wysokiej surowości. Przykładem warunków o wysokiej surowości przemywania dla hybryd DNA-RNA są 0,1X SSC, 0,5% SDS w temperaturze 68°C. Specjalistom w tej dziedzinie znane są inne warunki przemywania o wysokiej surowości.

„Region regulujący” oznacza sekwencję kwasu nukleinowego, która reguluje ekspresję kwasu nukleinowego. Region regulujący może obejmować sekwencje, które są naturalnie odpowiedzialne za ekspresję określonego kwasu nukleinowego (region homologiczny), lub może obejmować sekwencje innego pochodzenia (odpowiedzialne za ekspresję odrębnych białek lub nawet białek syntetycznych). W szczególności, sekwencjami mogą być sekwencje genów eukariotycznych lub wirusowych, bądź pochodzące od nich sekwencje, które stymulują lub hamują transkrypcję genu w sposób specyficzny lub niespecyficzny i w sposób indukowalny lub nieindukowalny. Regiony regulujące obejmują miejsca początku replikacji, miejsca cięcia i składania RNA, sekwencje wzmacniające, sekwencje terminacji transkrypcji, sekwencje sygnałowe, które kierują polipeptyd na szlak sekrecyjny komórki docelowej, oraz promotory.

Region regulujący ze „źródła heterologicznego” jest regionem regulującym, który nie towarzyszy ulegającemu naturalnie ekspresji kwasowi nukleinowemu. Do heterologicznych regionów regulujących należą regiony regulujące z innego gatunku, regiony regulujące z innego genu, hybrydowe sekwencje regulujące i sekwencje regulujące, które nie występują w przyrodzie, a które zostały zaprojektowane przez specjalistę w tej dziedzinie.

„Wektor” jest jakimkolwiek środkiem do przenoszenia kwasu nukleinowego według wynalazku do komórki gospodarza. Termin „wektor” obejmuje zarówno wirusowe, jak i niewirusowe środki do wprowadzania kwasu nukleinowego do komórki prokariotycznej lub eukariotycznej in vitro, ex vivo lub in vivo. Wektory niewirusowe obejmują plazmidy, liposomy, lipidy obdarzone ładunkiem (cytofektyny), kompleksy DNA-białko i biopolimery. Wektory wirusowe obejmują wektory będące retrowirusem, wirusem związanym z adenowirusem, wirusem ospy, bakulowirusem, wirusem krowianki, wirusem opryszczki, wirusem Epsteina-Barra i adenowirusem. Poza kwasem nukleinowym według wynalazku, wektor może zawierać także jeden lub więcej regionów regulujących i/lub markery selekcyjne użyteczne w selekcji, pomiarach i monitorowaniu wyników przenoszenia kwasu nukleinowego (przenoszenie do jakich tkanek, czasu trwania ekspresji itp.).

PL 191 624 B1 „Komórką zrekombinowaną” jest komórka, która zawiera kwas nukleinowy, który normalnie nie występuje w komórce. „Komórka zrekombinowana” obejmuje komórki wyższych organizmów eukariotycznych, takie jak komórki ssaków, komórki niższych organizmów eukariotycznych, takie jak komórki drożdży, komórki prokariotyczne i komórki archebakterii.

„Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” obejmuje rozcieńczalniki i wypełniacze, które są farmaceutycznie dopuszczalne biorąc pod uwagę sposób podawania, są jałowe, i mogą być wodnymi lub oleistymi zawiesinami utworzonymi z zastosowaniem odpowiednich czynników rozpraszających lub zwilżających oraz czynników zawieszających. Konkretny farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i stosunek związku aktywnego do nośnika determinuje rozpuszczalność i właściwości chemiczne kompozycji, konkretny sposób podawania i standardowa praktyka farmaceutyczna.

„Lipaza” jest białkiem, które może enzymatycznie rozszczepiać substrat lipidowy.

„Fosfolipaza” jest białkiem, które może enzymatycznie rozszczepiać substrat fosfolipidowy.

„Lipaza triacyloglicerolowa” jest białkiem, które może enzymatycznie rozszczepiać substrat triacyloglicerydowy.

„Fosfatydylocholina” jest fosfolipidem glicerolowym posiadającym następującą strukturę:

ο

Ο H₂C—Ο—Ρ—Ο—CH₂—CHz—-Ν (CH₃) 3

I

0’

R i R' są węglowodorowymi łańcuchami bocznymi kwasów tłuszczowych. Fosfatydylocholina jest również znana jako lecytyna.

„Profil lipidów” oznacza zestaw stężeń cholesterolu, triglicerydów, cholesterolu lipoprotein i innych lipidów w organizmie człowieka lub innego zwierzęcia.

„Niepożądany profil lipidów” jest stanem, w którym stężenia cholesterolu, triglicerydów lub cholesterolu lipoprotein znajdują się poza zakresami ustalonymi w zależności od wieku i płci. Generalnie, stężenie cholesterolu całkowitego > 200 mg/dl, triglicerydów osocza > 200 mg/dl, cholesterolu LDL >130 mg/dl, cholesterolu HDL < 39 mg/dl lub stosunek cholesterolu całkowitego do cholesterolu HDL > 4,0 uważa się za niepożądany profil lipidów. Niepożądany profil lipidów jest związany z szeregiem stanów patologicznych, obejmujących hiperlipemie, hipercholesterolemię cukrzycową, aterosklerozę i inne postacie choroby wieńcowej.

B) Polipeptydy

Niniejszy wynalazek ujawnia polipeptydy, które są członkami rodziny lipaz triacyloglicerolowych i które zawierają domenę katalityczną o masie cząsteczkowej 39 kD rodziny lipaz triacyloglicerolowych, np. posiadającą sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 10. Jednym rozwiązaniem niniejszego wynalazku jest wyizolowany polipeptyd LLG obejmujący sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 6 i posiadający pozorną masę cząsteczkową około 40 kD w 10% żelu do SDS-PAGE. Innym rozwiązaniem niniejszego wynalazku jest wyizolowany polipeptyd LLG obejmujący sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 8 i posiadający pozorną masę cząsteczkową około 55 kD lub 68 kD w 10% żelu do SDS-PAGE.

Polipeptydy i białka według niniejszego wynalazku mogą być zrekombinowanymi polipeptydami, naturalnymi polipeptydami lub syntetycznymi polipeptydami i mogą pochodzić od człowieka, królika lub innego zwierzęcia. Polipeptydy charakteryzują się powtarzalną pojedynczą masą cząsteczkową i/lub wielokrotnym zestawem mas cząsteczkowych, odpowiedzią chromatograficzną i profilami elucji, składem aminokwasowym i sekwencją oraz odpowiedzią biologiczną.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku można izolować ze źródeł naturalnych, takich jak ekstrakty z łożyska, osocze ludzkie lub podłoża kondycjonowane z hodowanych komórek, takich jak makrofagi lub komórki śródbłonkowe, przy zastosowaniu procedur oczyszczania znanych specjalistom w tej dziedzinie.

PL 191 624 B1

Alternatywnie, polipeptydy według niniejszego wynalazku można przygotowywać wykorzystując technologię rekombinacji DNA, która obejmuje włączenie kwasu nukleinowego kodującego ten polipeptyd do odpowiedniego wektora, wstawienie otrzymanego wektora do odpowiedniej komórki gospodarza, odzyskiwanie polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza i oczyszczanie odzyskanego polipeptydu.

C) Kwasy nukleinowe

Niniejszy wynalazek zapewnia wyizolowane kwasy nukleinowe, które kodują polipeptydy LLG.

Niniejszy wynalazek zapewnia również antysensowne kwasy nukleinowe, które można stosować do obniżania lub blokowania ekspresji polipeptydów LLG in vitro, ex vivo lub in vivo.

Techniki technlogii rekombinacji DNA znane są specjalistom w tej dziedzinie. Ogólne metody klonowania i ekspresji zrekombinowanych cząsteczek opisano w Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) oraz w Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1987), które włączono poprzez odnośniki literaturowe.

Kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku można łączyć z jednym lub więcej regionami regulującymi. Wybór odpowiedniego regionu lub regionów regulujących jest czynnością rutynową, pozostającą w zakresie umiejętności specjalisty w tej dziedzinie. Regiony regulujące obejmują promotory, a mogą obejmować sekwencje wzmacniające, supresorowe itp.

Promotory, które można stosować w niniejszym wynalazku obejmują zarówno promotory konstytutywne, jak i promotory regulowane (indukowalne). Promotory mogą być prokariotyczne lub eukariotyczne, zależnie od gospodarza. Wśród promotorów prokariotycznych (włącznie z bakteriofagowymi) użytecznych do praktycznego stosowania zgodnie z tym wynalazkiem znajdują się promotory lacI, lacZ, T3, T7, lambda Pr, P1 oraz trp. Wśród promotorów eukariotycznych (włącznie z wirusowymi) użytecznych do praktycznego stosowania zgodnie z tym wynalazkiem znajdują się promotory powszechnie występujących białek (np. HPRT, wimentyny, aktyny, tubuliny), promotory filamentów pośrednich (np. desminy, neurofilamentów, keratyny, GFAP), promotory genów terapeutycznych (np. typu MDR, CFTR, czynnika VIII), promotory specyficzne tkankowo (np. promotor aktyny w komórkach mięśni gładkich lub promotory Flt i Flk aktywne w komórkach śródbłonkowych), promotory, które są preferencyjnie aktywowane w komórkach ulegających podziałom, promotory, które odpowiadają na bodziec (np. receptora hormonów steroidowych, receptora kwasu retinowy), regulowane tetracykliną modulatory transkrypcji, natychmiastowe-wczesne promotory cytomegalowirusa, retrowirusowe LTR, metalotioneiny, SV-40, E1a i MLP. Regulowane tetracykliną modulatory transkrypcji i promotory CMV opisano w światowym opisie patentowym numer WO 96/01213, opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 168 062 i 5 385 839, zawartość których włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Korzystnie, wektory wirusowe stosowane w terapii genowej są defektywne pod względem replikacji, to jest są niezdolne do autonomicznej replikacji w komórce docelowej.

Ogólnie rzecz biorąc, genom defektywnych pod względem replikacji wektorów wirusowych, które stosuje się w zakresie niniejszego wynalazku, pozbawione są co najmniej jednego regionu, który jest konieczny do replikacji wirusa w zainfekowanej komórce. Regiony te mogą być albo usunięte (w całości lub w części), uczynione niefunkcjonalnymi jakąkolwiek techniką znaną specjaliście w tej dziedzinie. Techniki te obejmują całkowite usunięcie, podstawienie (innymi sekwencjami, w szczególności wstawianym kwasem nukleinowym), częściową delecję lub addycję jednej lub więcej zasad do zasadniczego (dla replikacji) regionu. Takie techniki można stosować in vitro (wobec wyizolowanego DNA) lub in situ, stosując techniki manipulacji genetycznych lub przez traktowanie czynnikami mutagennymi.

Korzystnie, wirus defektywny pod względem replikacji zachowuje sekwencje swojego genomu, które są konieczne do tworzenia kapsydów cząstek wirusowych.

Retrowirusy są ulegającymi integracji wirusami infekującymi komórki dzielące się. Genom retrowirusowy obejmuje dwa LTR, sekwencję tworzenia kapsydu itrzy regiony kodujące (gag, pol i env). Konstruowanie zrekombinowanych wektorów retrowirusowych zostało opisane: patrz, w szczególności, europejskie opisy patentowe o numerach 453242 i 178220, Bernstein i in., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 itp. W zrekombinowanych wektorach retrowirusowych geny gag, poli env są na ogół wydeletowane, w całości lub częściowo, i zastąpione będącą przedmiotem zainteresowania sekwencją heterologicznego kwasu nukleinowego. Wektory te można konstruować z różnych typów retrowirusów, takich jak MoMuLV („mysi wirus leukemii Moloneya”), MSV (mysi wirus mięsaka Moloneya”), HaSV („wirus mięsaka Harleya”), SNV („wirus nekrozy śledziony”), RSV („wirus mięsaka Rousa”) i wirus Frienda.

PL 191 624 B1

Generalnie, w celu konstruowania zrekombinowanych retrowirusów zawierających sekwencję kodującą LLG według wynalazku, konstruuje się plazmid, który zawiera LTRy, sekwencję tworzenia kapsydu i sekwencję kodującą. Konstrukcję tę stosuje się do transfekowania upakowującej linii komórkowej, która to linia komórkowa jest zdolna do zapewniania w pozycji trans retrowirusowych funkcji, których brak jest w plazmidzie. Ogólnie, upakowujące linie komórkowe są zatem zdolne do ekspresji genów gag, poli env. Takie upakowujące linie komórkowe opisano we wcześniejszych pracach, w szczególności linię komórkową PA317 (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 861 719), linię komórkową PsiCRIP (światowy opis patentowy numer WO 90/02806) i linię komórkową GP+envAm-12 (światowy opis patentowy numer WO 89/07150). Ponadto, zrekombinowane wektory retrowirusowe mogą zawierać modyfikacje w LTRach do supresji aktywności transkrypcyjnej, jak również rozległe sekwencje tworzenia kapsydu, które mogą obejmować część genu gag (Bender iin., J. Virol. 61 (1987) 1639). Zrekombinowane wektory retrowirusowe oczyszcza się standardowymi technikami znanymi specjalistom w tej dziedzinie.

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są wirusami DNA o stosunkowo małej wielkości, które mogą ulegać integracji, w stabilny i specyficzny wobec miejsca sposób, z genomem komórki, którą infekują. Są one zdolne do infekowania szerokiego spektrum komórek bez wywoływania jakiegokolwiek wpływu na wzrost komórkowy, morfologię lub różnicowanie i wydaje się, że nie są odpowiedzialne za stany patalogiczne u człowieka. Genom AAV sklonowano, zsekwencjonowano i scharakteryzowano. Obejmuje on około 4700 zasad i na każdym końcu zawiera region odwróconych powtórzeń terminalnych (ITR) o długości około 145 zasad, który służy jako miejsce początku replikacji wirusa. Pozostała część genomu jest podzielona na dwa zasadnicze regiony, które niosą informację dotyczące funkcji tworzenia kapsydu: część genomu po lewej stronie, która zawiera gen rep, biorący udział w replikacji wirusowej i ekspresji genów wirusowych, oraz część genomu po prawej stronie, która zawiera gen cap, kodujący białka kapsydu wirusa.

Stosowanie wektorów pochodzących z AAV do przenoszenia genów in vitro i in vivo zostało opisane (patrz światowy opis patentowy numer WO 91/18088; światowy opis patentowy numer WO 93/09239; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 797 369; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 139 941, europejski opis patentowy numer 488 528). Publikacje te opisują różne konstrukcje pochodzące od AAV, w których geny rep i/lub cap wydeletowano i zastąpiono genem będącym przedmiotem zainteresowania, oraz stosowanie tych konstrukcji do przenoszenia rzeczonego genu będącego przedmiotem zainteresowania in vitro (do komórek w hodowli) lub in vivo (bezpośrednio do organizmu). Defektywne pod względem replikacji, zrekombinowane AAV według wynalazku można przygotować przez kotransfekowanie linii komórkowej, która została zainfekowana ludzkim wirusem wspomagającym (na przykład adenowirusem) plazmidem zawierającym sekwencję kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania flankowanego przez dwa regiony odwróconych powtórzeń terminalnych (ITR) AAV oraz plazmidem niosącym geny tworzenia kapsydu (geny rep i cap) AAV. Rekombinanty AAV, które wytworzono, oczyszcza się następnie standardowymi technikami. Dlatego też, wynalazek dotyczy również pochodzących od AAV zrekombinowanych wirusów, których genom obejmuje sekwencję kodującą polipeptyd LLG flankowaną przez ITRy AAV. Wynalazek dotyczy również plazmidu obejmującego sekwencję kodującą polipeptyd LLG flankowaną przez dwa ITRy z AAV. Taki plazmid można stosować jako taki do przenoszenia sekwencji LLG, z plazmidem, jeśli jest to właściwe, włączonym do wektora liposomalnego (pseudowirusa).

W korzystnym rozwiązaniu wektorem jest wektor adenowirusowy.

Adenowirusy są wirusami DNA organizmów eukariotycznych, które można modyfikować w celu efektywnego dostarczania kwasu nukleinowego według wynalazku do szeregu rodzajów komórek.

Istnieją różne serotypy adenowirusa. Spośród tych serotypów wymienia się, w zakresie niniejszego wynalazku, stosowanie ludzkich adenowirusów typu 2 lub typu 5 (Ad 2 lub Ad 5) lub adenowirusów pochodzenia zwierzęcego (patrz światowy opis patentowy WO 94/26914). Te adenowirusy pochodzenia zwierzęcego, które można stosować zgodnie z zakresem niniejszego wynalazku, obejmują adenowirusy pochodzące od psów, bydła, myszy (przykład: Mavl, Beard i in., Virology 75 (1990) 81), owiec, świń, ptaków i małp (przykład: SAV). Korzystnie, adenowirusem pochodzenia zwierzęcego jest adenowirus psa, korzystniej adenowirus CAV2 (np. szczep Manhattan lub A26/61 (ATCC VR-800)).

Korzystnie, defektywne pod względem replikacji wektory adenowirusowe według wynalazku zawierają ITRy, sekwencję tworzenia kapsydu i kwas nukleinowy będący przedmiotem zainteresowania. Jeszcze korzystniej, przynajmniej region E1 wektora adenowirusowego jest niefunkcjonalny. Delecja w regionie E1 korzystnie ciągnie się od nukleotydu 455 do nukleotydu 3329 w sekwencji adenoPL 191 624 B1 wirusa Ad5. Inne regiony mogą również być zmodyfikowane, w szczególności region E3 (światowy opis patentowy numer WO 95/02697), region E2 (światowy opis patentowy numer WO 94/28938), region E4 (światowy opis patentowy numer WO 94/28152, światowy opis patentowy numer WO 94/12649 i światowy opis patentowy numer WO 95/02697) lub którykolwiek z późnych genów L1-L5. Defektywne wektory retrowirusowe ujawniono w światowym opisie patentowym numer WO 95/02697.

W korzystnym rozwiązaniu, wektor adenowirusowy posiada delecję w regionach E1i E4. W innym korzystnym rozwiązaniu, wektor adenowirusowy posiada delecję w regionie E1, do którego wstawiono region E4 i sekwencję kodującą LLG (patrz francuski opis patentowy numer FR 94 13355).

Defektywne pod względem replikacji zrekombinowane adenowirusy według wynalazku można przygotować jakąkolwiek techniką znaną specjaliście w tej dziedzinie (Levrero iin., Gene 101 (1991) 195, europejski opis patentowy numer 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). W szczególności, można je przygotowywać przez homologiczną rekombinację pomiędzy adenowirusem i plazmidem, który zawiera, między innymi, będącą przedmiotem zainteresowania sekwencję DNA. Rekombinację homologiczną uzyskuje się w wyniku kotransfekcji rzeczonymi adenowirusem i plazmidem odpowiedniej linii komórkowej. Linia komórkowa, którą się wykorzystuje, powinna korzystnie (i) być zdolna do ulegania transformacji rzeczonymi elementami oraz (ii) zawierać sekwencje, które są zdolne do komplementacji części genomu adenowirusa defektywnego pod względem replikacji, korzystnie w postaci zintegrowanej, w celu uniknięcia ryzyka rekombinacji. Przykładami linii komórkowych, które można stosować, są linia 293 komórek ludzkiej nerki zarodkowej (Graham i in., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), które zawierają zintegrowaną z ich genomem znajdującą się po lewej stronie część genomu adenowirusa Ad5 (12%), oraz linie komórek, które są zdolne do komplementacji funkcji E1i E4, jak opisano w światowych zgłoszeniach patentowych o numerach WO 94/26914 i WO 95/02697. Zrekombionowane adenowirusy odzyskuje się i oczyszcza stosując standardowe techniki biologii molekularnej, które są dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie.

Obniżenie ekspresji genów z zastosowaniem antysensownych kwasów nukleinowych można uzyskać na poziomie translacji lub transkrypcji. Antysensownymi kwasami nukleinowymi według wynalazku są korzystnie fragmenty kwasów nukleinowych zdolne do specyficznej hybrydyzacji z całością lub częścią kwasu nukleinowego kodującego LLG lub odpowiadającego matrycowego RNA. Tymi antysensownymi kwasami nukleinowymi mogą być syntetyczne oligonukleotydy, ewentualnie zmodyfikowane w celu poprawienia ich stabilności i selektywności. Mogą nimi być również sekwencje DNA, których ekspresja w komórce powoduje powstanie RNA komplementarnego do całości lub części mRNA LLG. Antysensowne kwasy nukleinowe można przygotowywać przez ekspresję całości lub części sekwencji wybranej z grupy składającej się z sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3, sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 7 lub sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11, w przeciwnej orientacji, jak opisano w europejskim opisie patentowym numer 140308. Dla praktycznego stosowania wynalazku odpowiednia jest jakakolwiek długość sekwencji antysensownej, tak długo jak jest ona zdolna do obniżania lub blokowania ekspresji LLG. Korzystnie, sekwencja antysensowna ma długość co najmniej 20 nukleotydów. Przygotowywanie i stosowanie antysensownych kwasów nukleinowych, DNA kodujących antysensowne mRNA i stosowanie oligonukleotydów antysensownych i genetycznych sekwencji antysensownych ujawniono w światowym opisie patentowym, zawartość którego włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

D) Przeciwciała

Niniejszy wynalazek zapewnia przeciwciała skierowane przeciw polipeptydowi LLG. Przeciwciała te mogą być przeciwciałami monoklonalnymi lub przeciwciałami poliklonalnymi. Niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciała chimeryczne, jednołańcuchowe i humanizowane, jak również fragmenty Fab i produkty biblioteki ekspresyjnej Fab.

Przeciwciała poliklonalne można przygotowywać jako skierowane przeciw antygenowym fragmentom polipeptydu LLG, jak opisano w Przykładzie 4A. Można również tworzyć przeciwciała skierowane przeciw nienaruszonemu białku lub polipeptydowi LLG, bądź przeciw fragmentowi, pochodnej, lub epitopowi białka lub polipeptydu. Przeciwciała można otrzymywać po podaniu białka, polipeptydu, fragmentu, pochodnej lub epitopu zwierzęciu, stosując techniki i procedury znane w tej dziedzinie.

Przeciwciała monoklonalne można przygotowywać stosując metodę Mishella, B.B. i in., Selected Methods In Cellular Immunology (W.H. Freeman, red.) San Francisco (1980). Krótko, polipeptyd według niniejszego wynalazku stosuje się do immunizacji komórek śledziony myszy Balb/C. Immunizowane komórki śledziony poddaje się fuzji z komórkami szpiczaka. Uzyskane w wyniku fuzji komórki posiadające właściwości komórek śledziony i szpiczaka izoluje się przez wzrost w podłożu HAT, które

PL 191 624 B1 to podłoże powoduje śmierć komórek macierzystych obu rodzajów, ale umożliwia przeżycie i wzrost produktów fuzji.

Przeciwciała monoklonalne według niniejszego wynalazku mogą być „humanizowane” dla zapobiegnięcia zwiększania odpowiedzi immunologicznej gospodarza na przeciwciała. „Przeciwciałem humanizowanym” jest przeciwciało, w którym regiony determinujące komplementarność (CDRy) i/lub inne części zrębu domeny zmiennej lekkiego i/lub ciężkiego łańcucha pochodzą z immunoglobuliny nieludzkiej, ale pozostałe części cząsteczki pochodzą z jednej lub więcej immunoglobulin ludzkich. Przeciwciała humanizowane obejmują również przeciwciała charakteryzujące się humanizowanym łańcuchem ciężkim związanym z donorowym lub akceptorowym niezmodyfikowanym łańcuchem lekkim lub chimerycznym łańcuchem lekkim, lub odwrotnie. Humanizację przeciwciał można prowadzić metodami znanymi w tej dziedzinie (patrz, np. G.E. Mark i E.H. Padlan, „Chapter 4. Humanization of Monoclonal Antibodies”, The Handbook of Experimental Pharmacology, tom 113, Springer-Verlag, Nowy Jork, 1994). Do ekspresji humanizowanych przeciwciał można stosować zwierzęta transgeniczne.

Znane w nauce techniki wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych można przystosować do wytwarzania jednołańcuchowych przeciwciał skierowanych przeciw polipeptydom i białkom według niniejszego wynalazku.

Przeciwciała anty-LLG użyteczne są w oznaczeniach do wykrywania lub ilościowego określania poziomów LLG. W jednym rozwiązaniu, oznaczenia te zapewniają kliniczną diagnozę i oszacowanie LLG w różnych stanach chorobowych i sposób monitorowania skuteczności leczenia.

E) Sposoby wyszukiwania agonistów i anatagonistów

Niniejszy wynalazek zapewnia sposoby przeszukiwania bibliotek małych cząsteczek lub źródeł produktów naturalnych pod względem agonistów (substancji wzmacniających lub koaktywatorów, włącznie z koaktywatorami białkowymi) lub antagonistów (inhibitorów) aktywności LLGXL. Potencjalnemu ągoniście lub antagoniście zapewnia się kontakt z białkiem LLGXL i substratem LLGXL i mierzy się zdolność potencjalnego agonisty lub antagonisty do wzmacniania lub hamowania aktywności LLGXL.

Stosowane w sposobie białko LLGXL można wytwarzać na drodze rekombinacyjnej w szeregu różnych komórek gospodarza, włącznie z komórkami ssaków (jak przedstawiono w Przykładzie 7), zainfekowanymi bakulowirusem komórkami owadów, drożdżami i bakteriami. Ekspresję LLG w stabilnie stransfekowanych komórkach CHO można optymalizować przez selekcjonowanie komórek metotreksatem. Białko LLGXL można również oczyszczać ze źródeł naturalnych, takich jak osocze ludzkie, ekstrakty z łożyska lub podłoża kondycjonowane z hodowanych komórek śródbłonkowych, komórek THP-1 lub makrofagów.

Optymalizację parametrów oznaczenia, obejmujących pH, stężenia jonów, temperaturę, stężenie substratu i warunki emulgowania określa doświadczalnie specjalista w tej dziedzinie.

Kwasy tłuszczowe będące podstawnikami substratów mogą różnić się długością łańcucha, jak również stopniem nienasycenia i pozycją wiązania nienasyconego. Substraty mogą być znakowane promieniotwórczo w którejkolwiek z kilku pozycji. Substraty fosfolipidowe, takie jak fosfatydylocholinę, można znakować promieniotwórczo na przykład w pozycji Sn-1 lub Sn-2 kwasu tłuszczowego lub w reszcie glicerolu, fosforanu lub w grupie polarnej (cholinowej w przypadku fosfatydylocholiny).

Jako alternatywę dla substratów znakowanych promieniotwórczo, w sposobach wyszukiwania można również stosować inne klasy znakowanych substratów, takie jak substraty fluorescencyjne lub substraty zawierające grupy tiolowe.

Substraty fluorescencyjne są szczególnie użyteczne w oznaczeniach wyszukiwania, ponieważ katalizę enzymatyczną można mierzyć w sposób ciągły przez pomiar intensywności fluorescencji, bez fizycznego oddzielania (ekstrakcji) produktów od substratów. Przykładem fluorescencyjnego substratu fosfatydylocholinowego jest C6NBD-PC{1-acylo-2-[6-(nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-ilo)amino]kaproilofosfatydylocholina.

Substraty zawierające grupy tiolowe obejmują 1,2-bis(heksanoilotio)-1,2-dideoksy-sn-glicero-3fosforylocholinę L.J. Reynolds, W.N. Washburn, R.A. Deems i E.A. Dennis, 1991, Methods in Enzymology 197: 3-23; L. Yu i E.A. Dennis, 1991, Methods in Enzymology 197: 65-75; L.A. Wittenauer, K. Shirai, R.L. Jackson i J.D. Johnson, 1984, Biochem. Biophys. Res. Commun. 118: 894-901.

F) Hydroliza estrów fosfatydylocholinowych

Niniejszy wynalazek zapewnia sposób enzymatycznej hydrolizy estrów fosfatydylocholinowych, np. do przetwórstwa przemysłowego lub przetwórstwa żywności, bądź w detergentach do prania. Polipeptydy według niniejszego wynalazku można stosować do hydrolizy estrów fosfatydylocholinowych

PL 191 624 B1 w roztworze, lub enzym może być związany ze stałym nośnikiem, który następnie kontaktuje się z substratem. Sposób ten można stosować do wytwarzania lizofosfolipidów i wolnych kwasów tłuszczowych.

G) Kompozycje

Niniejszy wynalazek zapewnia kompozycje w biologicznie kompatybilnym (biokompatybilnym) roztworze, zawierającym polipeptydy, kwasy nukleinowe, wektory i przeciwciała według wynalazku. Biologicznie kompatybilnym roztworem jest roztwór, w którym polipeptyd, kwas nukleinowy, wektor lub przeciwciało według wynalazku utrzymywane są w postaci aktywnej, np. w postaci zdolnej do wywierania aktywności biologicznej. Na przykład, polipeptyd według wynalazku powinien posiadać aktywność fosfolipazy, kwas nukleinowy powinien być zdolny do replikacji, translacji matrycy lub hybrydyzacji z komplementarnym kwasem nukleinowym; wektor powinien być zdolny do transfekowania komórki docelowej; przeciwciało powinno wiązać się z polipeptydem według wynalazku. Generalnie, takim biologicznie kompatybilnym roztworem będzie bufor wodny, np. bufor Tris, fosforanowy lub HEPES, zawierający jony soli. Zazwyczaj stężenie jonów soli będzie podobne do poziomów fizjologicznych. W szczególnym rozwiązaniu, biokompatybilny roztwór jest kompozycją dopuszczalną farmaceutycznie. Biologicznie kompatybilne roztwory mogą zawierać czynniki stabilizujące i konserwujące.

Kompozycjom takim można nadawać postać do podawania drogami miejscową, doustną, pozajelitową, donosową i wewnątrzgałkową. Podawanie pozajelitowe obejmuje techniki iniekcji dożylnej, iniekcji domięśniowej, iniekcji dotętniczej lub infuzji. Kompozycję można podawać pozajelitowo w postaciach do jednostkowego dawkowania zawierających standardowe, dobrze znane nietoksyczne, wskazane, fizjologicznie dopuszczalne nośniki, adiuwanty i podłoża.

Korzystnymi jałowymi preparatami iniekcyjnymi mogą być roztwory lub zawiesiny w nietoksycznym, dopuszczalnym do podawania pozajelitowego rozpuszczalniku lub rozcieńczalniku. Przykładami farmaceutycznie dopuszczalnych nośników są sól fizjologiczna, zbuforowana sól fizjologiczna, izotoniczna sól fizjologiczna (np. fosforan jednosodowy lub dwusodowy, chlorek sodowy, potasowy, wapniowy lub magnezowy, bądź mieszaniny takich soli), roztwór Ringera, dekstroza, woda, jałowa woda, glicerol, etanol lub ich kombinacje. Jako rozpuszczalniki lub podłoża zawieszające dogodne jest wykorzystanie 1,3-butanodiolu i jałowych olei roślinnych. Wykorzystywać można jakikolwiek odpowiedni olej roślinny, włącznie z zsyntetycznymi mono- i diglicerydami. W przygotowywaniu preparatów iniekcyjnych znajdują również zastosowanie kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy.

Podłożem kompozycji może być także hydrożel, który przygotowuje się z jakiegokolwiek biokompatybilnego i niecytotoksycznego (homo lub hetero) polimeru, takiego jak hydrofilowy polimer kwasu poliakrylowego, który może działać jako gąbka adsorbująca lek. Takie polimery opisano, na przykład, w światowym zgłoszeniu patentowym numer WO 93/08845, który w całości włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy. Niektóre z nich, takie jak, w szczególności, te otrzymywane z tlenku etylenu i/lub propylenu, są komercjalnie dostępne. Hydrożel można nakładać bezpośrednio na powierzchnię leczonej tkanki, na przykład podczas zabiegu chirurgicznego.

Inne korzystne rozwiązanie niniejszego wynalazku dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej defektywnego pod względem replikacji zrekombinowanego wirusa oraz poloxamer. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej defektywnego pod względem replikacji zrekombinowanego wirusa obejmującego kwas nukleinowy kodujący polipeptyd LLG oraz poloxamer. Korzystnym poloxamerem jest Poloxamer 407, który jest dostępny komercjalnie (BASF, Parsippany, NJ) i jest nietoksycznym, biokompatybilnym poliolem i jest najkorzystniejszy. Poloxamer nasycony zrekombinowanymi wirusami można nakładać bezpośrednio na powierzchnię leczonej tkanki, na przykład podczas zabiegu chirurgicznego. Poloxamer posiada zasadniczo te same zalety, co hydrożel, jednocześnie posiadając niższą lepkość.

H) Sposoby leczenia

Niniejszy wynalazek zapewnia sposoby leczenia, które obejmują podawanie człowiekowi lub innemu zwierzęciu skutecznej ilości kompozycji według wynalazku.

Skuteczne ilości mogą być zróżnicowane w zależności od wieku, rodzaju i ciężkości leczonego stanu, wagi ciała, pożądanego czasu trwania leczenia, sposobu podawania i innych parametrów. Skuteczne ilości określa lekarz lub inny wykwalifikowany pracownik medyczny.

Polipeptydy według wynalazku na ogół podaje się w dawkach od około 0,01 mg/kg do około 100 mg/kg, korzystnie od około 0,1 mg/kg do około 50 mg/kg, a najkorzystniej od około 1 mg/kg do około 10 mg/kg wagi ciała dziennie.

Zrekombinowanym wirusom według wynalazku na ogół nadaje się postać i podaje się w postaci dawek pomiędzy około 10⁴ a około 10¹⁴ pfu. W przypadku AAV i adenowirusów, korzystnie stosuje się

PL 191 624 B1 dawki od około 10⁶ do około 10¹⁴ pfu. Termin pfu („jednostka łysinkotwórcza”) odpowiada sile infekcyjnej zawiesiny wirionów; określa się ją przez infekowanie odpowiedniej hodowli komórkowej i pomiar liczby tworzonych łysinek. Techniki określania miana pfu roztworu wirusów są dobrze udokumentowane we wcześniejszych pracach.

Niniejszy wynalazek zapewnia sposoby leczenia aterosklerozy, w przypadkach kiedy rzeczona ateroskleroza jest wynikiem nadmiernej, nienormalnej lub nieodpowiedniej ekspresji aktywności polipeptydu LLG.

Niniejszy wynalazek zapewnia ponadto sposoby leczenia człowieka lub zwierzęcia posiadającego niepożądany profil lipidów, w przypadkach kiedy rzeczony niepożądany profil lipidów jest wynikiem nienormalnie wysokiej lub nieodpowiedniej ekspresji aktywności polipeptydu LLG.

Niniejszy wynalazek zapewnia ponadto sposoby leczenia cukrzycy, hiperlipemii, cholestazy śródwątrobowej lub innych zaburzeń metabolicznych, w przypadkach kiedy rzeczona cukrzyca, hiperlipemia, cholestaza śródwątrobowa lub inne zaburzenie metaboliczne jest wynikiem nienormalnie wysokiej lub nieodpowiedniej ekspresji aktywności polipeptydu LLG.

1) Leczenie niepożądanych profili lipidów związanych ze zwiększoną ekspresją polipeptydu LLG

Sposoby obniżania ekspresji polipeptydu LLG w celu poprawienia tych stanów, w których aktywność polipeptydu LLG przyczynia się do choroby lub zaburzenia związanego z niepożądanym profilem lipidów, obejmują, ale nie ograniczają się do podawania kompozycji zawierającej antysensowny kwas nukleinowy, podawania kompozycji zawierającej wewnątrzkomórkowe białko wiążące, takie jak przeciwciało, podawania kompozycji zawierającej polipeptyd LLGN lub inny fragment LLG oraz podawania kompozycji zawierającej kwas nukleinowy, który koduje polipeptyd LLGN lub inny fragment LLG.

W jednym rozwiązaniu, kompozycję zawierającą antysensowny kwas nukleinowy stosuje się do obniżania lub blokowania ekspresji LLG. W korzystnym rozwiązaniu, kwas nukleinowy koduje antysensowne cząsteczki RNA. W rozwiązaniu tym kwas nukleinowy jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sygnałami umożliwiającymi ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego i wprowadza się go do komórki wykorzystując, korzystnie, konstrukcje zrekombinowanych wektorów, które będą eksprymować antysensowny kwas nukleinowy po wprowadzeniu wektora do komórki. Przykłady odpowiednich wektorów obejmują plazmidy, adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami, retrowirusy i wirusy opryszczki. Korzystnie, wektorem jest adenowirus. Korzystniej, wektor jest defektywnym pod względem replikacji adenowirusem zawierającym delecję w regionie E1 i/lub E3 wirusa.

W innym rozwiązaniu, ekspresja LLG obniżana lub blokowana przez ekspresje sekwencji kwasu nukleinowego kodującej wewnątrzkomórkowe białko wiążące, które jest zdolne do specyficznych oddziaływań z LLG. Światowy opis patentowy numer WO 94/29446 i światowy opis patentowy numer WO 94/02610, których zawartość w całości włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe, ujawniają transfekcję komórek genami kodującymi wewnątrzkomórkowe białko wiążące. Wewnątrzkomórkowe białko wiążące obejmuje jakiekolwiek białko zdolne do selektywnego oddziaływania lub wiązania LLG w komórce, w której ulega ekspresji i do neutralizowania działania związanego LLG. Korzystnie, wewnątrzkomórkowym białkiem wiążącym jest przeciwciało lub fragment przeciwciała. Korzystniej, wewnątrzkomórkowym białkiem wiążącym jest przeciwciało jednołańcuchowe.

Światowy opis patentowy numer WO 94/02610 ujawnia przygotowywanie przeciwciał i identyfikację kwasu nukleinowego kodującego konkretne przeciwciało. Stosując LLG lub jego fragment, technikami znanymi specjalistom w tej dziedzinie przygotowuje się specyficzne przeciwciało monoklonalne. Następnie przygotowuje się do stosowania w sposobie według tego wynalazku wektor zawierający kwas nukleinowy kodujący wewnątrzkomórkowe białko wiążące lub jego część, i zdolny do ekspresji w komórce gospodarza.

Alternatywnie, aktywność LLG można blokować przez podawanie neutralizującego przeciwciała do krążenia. Takie neutralizujące przeciwciało można podawać bezpośrednio w postaci białka lub może ono ulegać ekspresji z wektora (z sygnałem sekrecji).

W innym rozwiązaniu, aktywność LLGXL hamuje się przez podawanie kompozycji zawierającej polipeptyd LLGN lub inny fragment LLG. Kompozycję tę można podawać w dogodny sposób, taki jak drogami doustną, miejscową, dożylną, dootrzewnową, domięśniową, podskórną, donosową lub śródskórną. Kompozycję można podawać bezpośrednio lub można ją zamknąć (np. w układ lipidowy, mikrokuleczki aminokwasowe lub w globularne dendrymery). Polipeptyd może, w niektórych przypadkach, być połączony z innym polimerem, takim jak albumina surowicy lub poliwinylopirolidon.

PL 191 624 B1

W innym rozwiązaniu, aktywność LLGXL hamuje się przez stosowanie związków o niskiej masie cząsteczkowej, które zakłócają jego właściwości enzymatyczne lub zapobiegają właściwemu rozpoznawaniu przez komórkowe miejsca wiążące.

W innym rozwiązaniu, aktywność LLGXL hamuje się poprzez stosowanie terapii genowej, to jest poprzez podawanie kompozycji zawierającej kwas nukleinowy, który koduje i kieruje ekspresją polipeptydu LLGN lub innego fragmentu LLG.

W szczególnym rozwiązaniu, produkt genu LLG według niniejszego wynalazku posiada również powinowactwo wobec heparyny. Wiązanie polipeptydu LLG według wynalazku z zewnątrzkomórkową heparyną w świetle naczyń krwionośnych mogłoby umożliwiać wiązanie LLG i przyspieszanie pobierania LDL poprzez działanie jako mostek pomiędzy LDL i zewnątrzkomórkową heparyną. Przypuszcza się, że w zlokalizowanym obszarze zmiany aterosklerotycznej zwiększony poziom aktywności przyspiesza proces aterosklerotyczny (Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. 41, 153-158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C., Moojani, S., Lupien, P. J., Hayden, M.R. i Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341, 1119-1121). Może to być powodowane zwiększaniem wiązania i pobierania lipoprotein przez tkankę naczyniową za pośrednictwem lipaz (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T., Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90, 2013-2021; Tabas, I., Li, I., Brocia, R.W., Xu, S.W., Swenson, T.L., Williams, K.J. (1993) J. Biol. Chem. 268, 20419-20432; Nordestgaard, B.G. i Nielsen, A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5, 252-257; Williams, K.J. i Tabas, I. (1995) Art. Thromb. and Vasc. Biol. 15, 551-561). Ponadto, wynikiem wysokiego miejscowego poziomu aktywności lipazy mogą być cytotoksyczne poziomy kwasów tłuszczowych i lizofosfatydylocholiny wytwarzanych w prekursorach zmian aterosklero-tycznych. Ta szczególna aktywność LLG może przyczyniać się do rozwoju lub postępu aterosklerozy, szczególnie w kontekście nadmiernych poziomów lipidów u osobnika z powodu czynników dietetycznych lub genetycznych. A zatem, niniejszy wynalazek umożliwia hamowanie akumulacji lipoprotein przez hamowanie ekspresji lub wiązania z lipoproteiną (np. LDL) polipeptydu LLG.

2) Leczenie niepożądanych profili lipidów związanych z niedostateczną aktywnością polipeptydu LLG.

Sposoby zwiększania ekspresji LLG w celu poprawy tych stanów, w których aktywność polipeptydu LLG przyczynia się do choroby lub stanu związanego z niepożądanym profilem lipidów obejmują, ale nie ograniczają się do podowania kompozycji zawierającej polipeptyd LLGXL oraz podawania kompozycji zawierającej kwas nukleinowy, który koduje polipeptyd LLGXL.

W jednym rozwiązaniu, poziom aktywności LLGXL zwiększa się poprzez podawanie kompozycji zawierającej polipeptyd LLGXL. Kompozycję tę można podawać w dogodny sposób, taki jak drogami doustną, miejscową, dożylną, dootrzewnową, domięśniową, podskórną, donosową lub śródskórną. Kompozycję można podawać bezpośrednio lub można ją zamknąć (np. w układ lipidowy, mikrokuleczki aminokwasowe lub w globularne dendrymery). Polipeptyd może, w niektórych przypadkach, być połączony z innym polimerem, takim jak albumina surowicy lub poliwinylopirolidon.

W innym rozwiązaniu, poziom LLGXL zwiększa się przez stosowanie związków o niskiej masie cząsteczkowej, które mogą zwiększać ekspresję LLGXL na poziomie transkrypcji, translacji lub po translacji.

W innym rozwiązaniu, poziom LLGXL zwiększa się poprzez stosowanie terapii genowej, to jest poprzez podawanie kompozycji zawierającej kwas nukleinowy, który koduje i kieruje ekspresją polipeptydu LLGXL.

Cholestazę śródwątrobową mogą charakteryzować zwiększone poziomy cholesterolu i fosfolipidów w surowicy. Opisany ostatnio model indukowanej farmakologicznie cholestazy śródwątrobowej u szczurów wykazał znaczące wzrosty poziomów cholesterolu i fosfolipidów (Ishizaki, K., Kinbara, S., Miyazawa, N., Takeuchi, Y., Hirabayashi, N., Kasai, H. i Araki, T. (1997) Toxicol Letters 90, 29-34). Produkty według tego wynalazku można stosować do leczenia cholestazy śródwątrobowej u pacjentów, którzy posiadają podwyższony poziom cholesterolu i/lub fosfolipidów w surowicy. Ponadto, na tym szczurzym modelu wykazano poważne obniżenie szybkości wydalania cholesterolu w żółci. Produkty, polipeptyd LLG i kwas nukleinowy według tego wynalazku można stosować do leczenia pacjentów z upośledzonym układem wydalania żółciowego.

Cholestaza śródwątrobowa charakteryzuje się również upośledzonym przepływem żółci w wątrobie. Ostatnio loci postępującej rodzinnej cholestazy śródwątrobowej (PFIC lub choroby Bylera) iłagodnej nawracającej cholestazy śródwątrobowej (BRIC) zmapowano w 18q21-q22 (odpowiednio Carlton, V.E.H., Knisely, A.S. i Freimer, N.B. (1995) Hum. Mol. Genet. 4, 1049-1053 oraz Houwen, R.H., Baharloo, S., Blankenship, K., Raeymaekers, P., Juyn, J., Sandkuijl, L.A. i Freimer, N.B. (1994) Nature

PL 191 624 B1

Genet. 8, 380-386). Ponieważ gen LLG mapuje się w tym regionie chromosomalnym w 18q21, gen LLG lub produkty według niniejszego wynalazku można stosować do leczenia pacjentów z cholestazą śródwątrobową, która jest powodowana przez mutację lub defektywną ekspresję genu(ów) choroby PFIC/BRIC.

W innym rozwiązaniu, gen LLG lub produkty polipeptydowe według tego wynalazku można stosować do leczenia pacjentów z cholestazą śródwątrobową, która nie jest spowodowana defektem genów choroby w 18q-21-q22. Ostatnie badania sugerowały, że inne locus, położone poza regionem 18q21-q22, również może powodować powstanie fenotypu PFIC (Strautnieks, S.S., Kagalwalla, A.F., Tanner, M. S., Gardiner, R.M. i Thompson, R.J. (1996) J. Med. Genet. 33, 833-836). Nie mniej jednak, podawanie LLG, albo bezpośrednio, albo poprzez terapię genową, może łagodzić tę postać choroby.

W terapii genowej jeden lub więcej kwasów nukleinowych kodujących polipeptyd, jak również regiony regulujące kontrolujące ich ekspresję, przenosi się do komórki docelowej człowieka lub innego zwierzęcia. Przeniesienie to przeprowadza się albo ex vivo, w procedurze, w której kwas nukleinowy przenosi się do komórkek w laboratorium, a następnie zmodyfikowane komórki podaje się człowiekowi lub innemu zwierzęciu, albo in vivo, w procedurze, w której kwas nukleinowy przenosi się bezpośrednio do komórek w organizmie człowieka lub innego zwierzęcia. Przeniesienie kwasu nukleinowego można uzyskać stosując opisane powyżej wektory wirusowe lub niewirusowe.

Wektory niewirusowe można przenosić do komórek stosując którąkolwiek z metod znanych wtej dziedzinie, obejmujących koprecypitrację z fosforanem wapniowym, lipofekcję (syntetycznymi liposomami anionowymi lub kationowymi), dostarczania genu za pośrednictwem receptorów, iniekcję obnażonego DNA, elektroporację i technikę biobalistyczną lub przyspieszania cząstek.

PRZYKŁADY

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady. Przykłady te są tylko ilustrujące i nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykład 1

Identyfikacja cDNA ulegającego różnicowej ekspresji

A) Przygotowywanie RNA

Ludzkie monocytarne komórki THP-1 (Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J.i Klenk, D.C. (1985) Anal. Biochem. 150, 76-85) hodowano w podłożu RPMI-1640 (GIBCO) z 25 mM HEPES, 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostkami/ml sodowej penicyliny G i 100 jednostkami/ml siarczanu streptomycyny. Komórki wysiewano na płytki do hodowli tkankowych o średnicy 15 cm w ilości 1,5 x 10⁷ komórek/płytkę i traktowano 40 ng/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (Sigma) w ciągu 48 godzin wcelu indukcji różnicowania komórek. Ludzkie lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) zakupiono w Calbiochem i dializowano gruntownie wobec PBS w temperaturze 4°C. Następnie LDL rozcieńczano do stężenia 500 μg/ml i dializowano wobec 50 μΜ CuSO₄ w PBS w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin. W celu zatrzymania utleniania, LDL dializowano gruntownie wobec 150 mM NaCl, 0,3 mM EDTA, następnie wyjaławiano przez sączenie. Stężenie białka określano metodą BCA (Schuh, J., Fairclough, G.F. i Haschemeyer, R.H. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3173-3177) (Pierce). Stopień utlenienia określano przez TBARS (Chomczynski, P. (1993) Biotechniques 15, 532-537) iwynosił on pomiędzy 25 a 30 równoważników MDA/mg białka. Zróżnicowane komórki THP-1 eksponowano w ciągu 24 godzin na albo 50 μg/ml utlenionych LDL, albo bufor NaCl-EDTA w podłożu RPMI z 10% pozbawioną lipoprotein płodową surowicą bydlęcą (Sigma). W celu zebrania RNA, płytki przemywano 10 ml PBS, następnie do każdej płytki dodawano 14 ml TRIZOL (Liang, P. i Pardee, A.B. (1992) Science 257, 967-971) (GIBCO). Roztwór pipetowano kilka razy dla zamieszania, następnie podobne próbki łączono w probówkach wirówkowych, dodawano 3 ml chloroformu na płytkę i mieszano. Probówki wirowano w ciągu 15 minutprzy 12000 x g. Po odwirowaniu górną warstwę przenoszono do nowej probówki, dodawano 7,5 ml izopropanolu na płytkę i mieszano. Probówki wirowano przy 12000 x g w ciągu 20 minut. Osad przemywano schłodzonym lodem 70% etanolem i suszono w temperaturze pokojowej. Osady zawieszano w 500 μl TE (Tris-EDTA) i traktowano 200 jednostkami wolnej od RNazy DNazy I i200 jednostkami łożyskowego inhibitora RNazy, RNasin (Promega) w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. RNA oczyszczano przez kolejne ekstrakcje fenolem, fenolem/chloroformem/alkoholem izoamylowym (25:24:1) i chloroformem/alkoholem izoamylowym (24:1), a następnie wytrącanie etanolem.

PL 191 624 B1

B) Synteza cDNA

Syntezę cDNA i amplifikację PCR prowadzono stosując protokoły z Differental Display Kit, wersja 1,0 (Display Systems Biotechnology, Inc.). Układ ten oparty jest na technice opartej na technice pierwotnie opisanej przez Lianga i Pardee (Mead, D.A., Pey, N.K., Herrnstadt, C., Marcil, R.A. i Shmith,

L.M. (1991) Bio/Techology 9, 657-663). Parami starterów, które pozwoliły otrzymać fragment cDNA zawierający po raz pierwszy informację genetyczną genu białka podobnego do lipazy, były starter 7, położony w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji, i starter 15, położony w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji. cDNA do amplifikacji syntetyzowano w następujący sposób, stosując RNA pochodzący z komórek THP-1 eksponowanych albo na bufor, albo na utlenione LDL: 3 μΐ 25 μΜ startera 7, położonego w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji, i 7,5 μl wody traktowanej dietylopirowęglanem (DEPC) dodawano do 300 ng (3,0 μΓ) RNA z każdej z próbek RNA THP-1. Mieszaninę tą ogrzewano w temperaturze 70°C w ciągu 10 minut, a następnie schładzano na lodzie. Do tej probówki dodawano 3 μί 5 x buforu do PCR (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl) (GIBCO), 3 μί 25 mM MgCl₂, 3 μl 0,1 M DTT, 1,2 μl 500 μM dNTP, 0,7 μl RNasin i 5,6 μl wody traktowanej DEPC. Probówki inkubowano w ciągu 2 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodawano 1,5 μl (300 jednostek) RNazy H-odwrotnej transkryptazy Superscript II (GIBCO). Probówki inkubowano kolejno wtemperaturze pokojowej w ciągu 2 minut, w temperaturze 37°C w ciągu 60 minut i w temperaturze 95°C wciągu 5 minut, a następnie schładzano na lodzie. Amplifikację PCR prowadzono stosując mieszaninę główną zawierającą 117 μl 10x bufor do PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl₂ i 0,01% (w/v) żelatyna), 70,2 μl 25 mM MgCl₂, 5,9 μl alfa-³³P dATP (10 mCi/ml, DuPont NEN), 4,7 μl mieszaniny 500 μl dNTP, 11 μl polimerazy DNA AmpliTaq (5 jednostek^l, Perkin-Elmer) i 493,3 μl wody traktowanej DEPC. Dla każdej z reakcji, 12 μl mieszaniny głównej dodawano do 2 μl położonego w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji startera 7, 1 μl cDNA i 5 μl położonego w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji startera 15. Mieszaniny reakcyjne ogrzewano w temperaturze 94°C w ciągu 1 minuty, następnie poddawano cyklom temperaturowym 40 razy z etapem denaturacji wtemperaturze 94°C w ciągu 15 sekund, etapem hybrydyzacji w temperaturze 40°C w ciągu 1minuty i etapem wydłużania w temperaturze 72°C w ciągu 30 sekund. Po 40 cyklach, mieszaniny reakcyjne inkubowano w temperaturze 72°C w ciągu 5 minut i przechowywano w temperaturze 10°C. Reakcje PCR prowadzono w termocyklerze Perkin Elmer GeneAmp System 9600.

Cztery mikrolitry produktu reakcji amplifikacji mieszano z równą objętością buforu do nakładania (0,2% błękit bromofenolowy, 0,2% cyjanol ksylenu, 10 mM EDTA, pH 8,0, i 20% glicerol). Cztery mikrolitry tej mieszaniny rozdzielano w 6% niedenaturującym żelu akryloamidowym formatu do sekwencjonowania w ciągu 3 godzin przy napięciu 1200 wolt (stałe napięcie). Żel suszono w temperaturze 80°C w ciągu 1,5 godziny i eksponowano na błonę Kodak XAR. Zidentyfikowano produkt amplifikacji stwierdzany tylko w mieszaninie reakcyjnej zawierającej cDNA z komórek THP-1 eksponowanych na utlenione LDL i wycięto go z żelu. Do probówki mikrowirówkowej zawierającej wycięty fragment żelu dodano 100 μl wody traktowanej DEPC i inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie w ciągu 15 minut w temperaturze 95°C.

W celu reamplifikacji produktu PCR, 26,5 mikrolitrów wyeluowanego DNA zastosowano w reakcji amplifikacji, która wymagała również 5 μl 10x buforu do PCR, 3 μl 25 mM MgCl₂, 5 μl 500 μM dNTP, 5 μl 2 μM położonego w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji startera 7, 7,5 μl położonego w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji startera 15 i 0,5 μl polimerazy Amplitaq. Parametry cykli PCR i aparat były takie same, jak opisano powyżej. Po amplifikacji 20 μl mieszaniny reamplifikacyjnej analizowano w żelu agarozowym i 4 μl zastosowano do zsubklonowania produktów PCR w wektorze pCRII stosując układ klonowania TA (Frohman, M.A., Dush, M.K. i Martin, G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002) (Invitrogen). Po ligacji przez noc w temperaturze 14°C, produkty ligacji zastosowano do transformacji E. coli. Pobrano uzyskane w wyniku transformanty i 3 ml całonocnej hodowli użyto do minipreparatyk plazmidów. Wielkości wstawek określono stosując trawienia plazmidów EcoRI i klony zawierające wstawki o przybliżonej wielkości początkowego produktu PCR zsekwencjonowano stosując odczynniki do terminacji barwnikiem fluorescencyjnym (Prism, Applied Biosystems) i sekwenator DNA Applied Biosystems 373. Sekwencję produktu PCR przedstawiono na Figurze 2. Sekwencję starterów do amplifikacji podkreślono.

C) Reakcja 5'RACE

Wydłużanie cDNA zidentyfikowanego poprzez RT-PCR przeprowadzono stosując układ 5'RACE (Loh, E.Y., Eliot, J.F., Cwirla, S., Lanier, L.L. i Davis, M.M. (1989) Science 243, 217-219; Simms, D., Guan, N. i Sitaraman, K. (1991) Focus 13, 99) (GIBCO). W procedurze 5'RACE wykorzy20

PL 191 624 B1 stano jeden mikrogram RNA THP-1 (traktowanych utlenionymi LDL), zastosowanego początkowo w reakcjach różnicowego występowania:

μΐ (1 μg) RNA połączono z 3 μΐ (3 pmolami) startera 2a i 11 μΐ wody traktowanej DEPC i ogrzewano w temperaturze 70°C w ciągu 10 minut, a następnie schłodzono na lodzie. Dodano 2,5 μl 10x buforu do reakcji (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl), 3 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl mieszaniny 10mM dNTP i 2,5 μΐ 0,1 M DTT. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 42°C w ciągu 2 minut, anastępnie dodano 1 μΐ odwrotnej transkryptazy Superscript II. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w ciągu dodatkowych 30 minut w temperaturze 42°C, 15 minut w temperaturze 70°C i na lodzie w ciągu minuty. Dodano jeden mikrolitr RNazy H (2 jednostki) i mieszaninę inkubowano w temperaturze 55°C w ciągu 10 minut. cDNA oczyszczano stosując zawarte w zestawie kolumny GlassMax (Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). cDNA eluowano z kolumny w 50 μl dH₂O, liofilizowano i ponownie zawieszano w 21 μl dH₂O. Dołączanie końców do cDNA prowadzono w następującej reakcji: 7,5 μl dH₂O, 2,5 μl buforu do reakcji (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl), 1,5 μl 25 mM MgCl₂, 2,5 μl 2 mM dCTP i 10 μl cDNA inkubowano w temperaturze 94°C w ciągu 3 minut, a następnie 1 minutę na lodzie. Dodano 1 μl (10 jednostek) terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej i mieszaninę inkubowano w ciągu 10 minut w temperaturze 37°C. Enzym inaktywowano termicznie przez inkubację w temperaturze 70°C w ciągu 10 minut i mieszaninę umieszczano na lodzie. Amplifikację PCR cDNA prowadzono w następujących etapach: 5 μl cDNA z dołączonym końcem wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej, która zawierała także 5 μΐ 10x bufor do PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl₂ i 0,01% (w/v) żelatynę, 1 μl mieszaniny 10 mM dNTP, 2 μΐ (10 pmoli) startera zakotwiczającego 1 μl (20 pmoli) startera 3a i 35 μl dH₂O. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 1 minuty, następnie dodano 0,9 μl (4,5 jednostek) polimerazy Amplitaq. Reakcję prowadzono w cyklach 40 razy w następujących warunkach: temperatura 94°C w ciągu 5 sekund, temperatura 50°C w ciągu 20 sekund i temperatura 72°C w ciągu 30 sekund. Jeden mikrolitr tej mieszaniny reakcyjnej zastosowano w zagnieżdżonej ponownej amplifikacji w celu zwiększenia poziomu specyficznego produktu do dalszego izolowania. Mieszanina reamplifikacyjna obejmowała: 1 μl produktu pierwotnej amplifikacji, 5 μΐ 10x buforu do PCR, 1 μl mieszaniny 10 mM dNTP, μl (20 pmoli) uniwersalnego startera amplifikacji, 2 μl (20 pmoli) startera 4a i 38 μl dH₂O. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 1 minuty, następnie dodano 0,7 μl (3,5 jednostek) polimerazy Amplitaq. Reakcję prowadzono w cyklach 40 razy w następujących warunkach: temperatura 94°C w ciągu 5 sekund, temperatura 50°C w ciągu 20 sekund i temperatura 72°C w ciągu 30 sekund. Produkty amplifikacji analizowano przez elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym. Wykryto główny produkt o przybliżonej długości 1,2 tysięcy par zasad. Dwa mikrolitry produktów reakcji sklonowano w wektorze pCRII z zestawu do klonowania TA (Invitrogen) i inkubowano przez noc w temperaturze 14°C. Produkty ligacji zastosowano do transformacji E. coli. Wielkości wstawek w uzyskanych w wyniku transformantach określono w następstwie trawienia EcoRI. Klony zawierające wstawki o przybliżonej wielkości produktu zsekwencjonowano stosując odczynniki do terminacji barwnikiem fluorescencyjnym (Prism, Applied Biosystems) i sekwenator DNA Applied Biosystems 373. Sekwencje produktu RACE obejmującego miejsca EcoRI z wektora TA przedstawiono na Figurze 3. Podkreślono sekwencje starterów amplifikacji (uniwersalnego startera amplifikacji i sekwencji komplementarnej do startera 4a 5'RACE).

P r z y k ł a d 2

Klonowanie i lokalizacjachromosomalna genu LLGXL

A) Przeszukiwanie biblioteki cDNA

Bibliotekę ludzkiego cDNA łożyskowego (oligo dT i po zastosowaniu losowych starterów, nr katalogowy 5014b, nr serii 52033) otrzymano z Clontech (Palo Alto, CA). Znakowaną radioaktywnie sondę utworzono przez wycięcie wstawki z opisanego powyżej plazmidu zawierającego produkt reakcji PCR 5'RACE. Sondę wyznakowano radioaktywnie stosując technikę z zastosowaniem losowych starterów: fragment DNA (50-100 ng) inkubowano z 1 μl losowych heksamerów (Gibco) w temperaturze 95°C w ciągu 10 minut, a następnie w ciągu 1 minuty na lodzie. W temperaturze pokojowej dodano następujące składniki: 3 μΐ 10x buforu do Klenowa (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM MgCl₂, 57 mM ditiotreitol; New England Biolabs), 3 μΐ 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP, 100 pCi α-³²PdCTP (3000 Ci/mmol, New England Nuclear) i 1 μg fragmentu Klenowa polimerazy DNA I (5 jednostek, Gibco). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w ciągu 2-3 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie reakcję zatrzymano przez zwiększenie objętości do 100 μΐ z zastosowaniem TE, pH 8,0, i dodanie EGTA do

PL 191 624 B1

1mM stężenia końcowego. Niewbudowane nukleotydy usunięto przez zwiększenie objętości mieszaniny reakcyjnej do 100 μΐ i przepuszczenie przez kolumnę do wirowania G-50 (Boehringer Mannheim). Otrzymane w wyniku sondy posiadały aktywność właściwą wyższą niż 5 x 10⁸ cpm/ μg DNA.

Sondy wykorzystano do przeszukania biblioteki stosując ustalone metody (Walter, P., Gilmore, R. i Blobel, G. (1984) Cell, 38, 5-8). Krótko, sączki poddawano hybrydyzacji w ciągu 24 godzin wtemperaturze 65°C w 4,8X SSPE (20X SSPE = 3,6 M NaCl, 0,2M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7,7), 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1X roztwór Denhardta (100X = 2% Ficoll 400, 2% poliwinylopirolidon, 2% BSA), 10% siarczan dekstranu, 0,1% SDS, 100 μg/ml DNA spermy łososia i 1 x 10⁶ cmp/ml sondy znakowanej radioaktywnie. Następniesączki przemywano trzy razy w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej w 2X SSC (1X SSC = 150 mM NaCl, 15 mM cytrynian sodowy, pH 7,0), 0,1% sodowy siarczan dodecylu (SDS)), po których następowały trzy przemywania po 15 minut każde w temperaturze pokojowej w 0,5X SSC, 0,1% SDS. Wyizolowano izamplifikowano faga, który hybrydyzował z sondą. DNA ze zamplifikowanego faga oczyszczono stosując odczynnik LambdaSorb (Promega), zgodnie z instrukcjami producenta. Wstawki wycięto z fagowego DNA przez trawienie EcoRI. Wstawki zsubklonowano w miejscu EcoRI wektora plazmidowego (Bluescript II SK, Stratagene). Sekwencję otwartej ramki odczytu zawartej we fragmencie EcoRI o długości 2,6 kb cDNA określono przez automatyczne sekwencjonowanie, jak opisano powyżej. Sekwencję przedstawiono na Figurze 4. Sekwencję aminokwasową przewidywanego białka kodowanego przez otwartą ramkę odczytu przedstawiono na Figurze 5 i nazwano LLGXL. Przewiduje się, że pierwszą resztę metioniny kodują pary nukleotydów 252-254. Długość przewidywanego białka wynosi 500 aminokwasów. Pierwszych 18 aminokwasów tworzy sekwencję charakterystyczną dla peptydu sygnałowego sekrecji (Higgins, D.G. i Sharp, P.M. (1988) Gene 73, 237-244). Przewidywana masa cząsteczkowa propeptydu wynosi 56 800 daltonów. Zakładając odszczepianie peptydu sygnałowego w pozycji 18, niezmodyfikowane dojrzałe białko posiada masę cząsteczkową 54 724 daltonów.

Ogólne podobieństwa pomiędzy białkiem i innymi znanymi przedstawicielami rodziny lipaz triacyloglicerolowych zilustrowano na Figurze 6 i w Tabeli 1. W przyporządkowaniu przedstawionym na Figurze 6, LLG jest polipeptydem (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6) kodowanym przez cDNA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5) opisanym w Przykładzie 1, a dalej w niniejszym opisie określanym jako LLGN. 345 reszt aminokońcowych tego białka to jest identycznych z białkiem LLGXL. Po dziewięciu unikalnych resztach następuje kodon terminacji, co powoduje powstawanie polipeptydu o masie cząsteczkowej 39,3 kD i dojrzałego białka o masie cząsteczkowej 37,3 kD. Sekwencjami, które są wspólne dla LLGN i LLGXL są sekwencja kwasu nukleinowego przedstawiona w sekwencji onumerze identyfikacyjnym: 9 i sekwencja aminokwasowa przedstawiona w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10.

Co interesujące, pozycja, w której białka LLGN i LLGXL różnią się, jest regionem, o którym wiadomo ze struktury innej lipazy, że jest położony pomiędzy domenami aminokońcową i karboksylokońcową białek. Dlatego też, białko LLGN wydaje się składać tylko z jednej z dwóch domen lipaz triacyloglicerolowych. Sekwencja ta zawiera charakterystyczny motyw „GXSXG lipaz w pozycjach 167-171, jak również zachowane reszty triady katalitycznej w pozycjach Ser 169, Asp 193 i His 274. Konserwatywność reszt cysteiny (pozycje 64, 77, 252, 272, 297, 308, 311, 316, 463 i 483), które biorą udział wtworzeniu wiązań dwusiarczkowych w innych lipazach sugeruje, że białko LLGXL wykazuje podobieństwa strukturalne do innych enzymów. Występuje pięć przewidywanych miejsc N-glikozylacji w pozycjach aminokwasowych 80, 136, 393, 469 i 491. Sekwencjami białek zastosowanymi w porównaniach są sekwencje ludzkiej lipazy lipoproteinowej (LPL; numer dostępu Genbank M15856, sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13), ludzkiej lipazy wątrobowej (HL; numer dostępu Genbank J03540, sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14), ludzkiej lipazy trzustkowej (PL; numer dostępu Genbank M93285, sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15), ludzkiego białka 1 podobnego do lipazy trzustkowej (PLRP-1; numer dostępu Genbank M93283) i ludzkiego białka 2 podobnego do lipazy trzustkowej (PLRP-2; numer dostępu Genbank M93284).

PL 191 624 B1

T ab el a 1

Podobieństwa w rodzinie genów lipaz triacyloglicerolowych

	LLGXL	LPL	HL	PL	PLRP1	PLRP2
LLGXL	-	42,7	36,5	24,5	22,5	22,6
LPL	42,7	-	40,0	22,8	22,7	20,9
HL	36,5	40,0	-	22,8	24,0	22,0
PL	24,5	22,8	22,8	-	65,2	62,2
PLRP1	22,5	22,7	24,0	65,2	-	61,7
PRLP2	22,6	20,9	22,0	62,2	61,7	-

Procent podobieństwa oparty był na przyporządkowaniu parami z zastosowaniem algorytmu Clustal (Camps, L., Reina, M., Llobera, M., Vilaro, S. i Olivecrona, T. (1990) Am. J. Physiol. 258, C673-C681) w programie Megalign, Lasergene Biocomputing Software Suite (Dnastar).

B) Lokalizacja chromosomalna

DNA z klonu P1 (Sternberg, N., Ruether, J. i DeRiel, K. The New Biologist 2: 151-62, 1990), zawierający genomowy DNA LLG, wyznakowano UTP digoksygeniny techniką przemieszczania pęknięć. Wyznakowaną sondę połączono z pofragmentownym DNA i hybrydyzowano ze stymulowanymi PHA limfocytami krwi obwodowej męskiego dawcy w roztworze zawierającym 50% formamid, 10% siarczan dekstranu i 2X SSC. Sygnały specyficznej hybrydyzacji wykrywano przez inkubowanie hybrydyzujących komórek w znakowanych fluoresceiną przeciwciałach skierowanych przeciw digoksygeninie, a następnie przeciwbarwienie DAPI. Wynikiem tego wstępnego doświadczenia było specyficzne wyznakowanie chromosomu z grupy E, który na podstawie barwienia DAPI uważano za chromosom 18.

Przeprowadzono drugie doświadczenie, w którym wyznakowaną biotyną sondę specyficzną wobec centromeru chromosomu 18 współhybrydyzowano z sondą LLG. Wynikiem tego doświadczenia było specyficzne wyznakowanie centromeru chromosomu 18 na czerwono i długiego ramienia chromosomu 18 na zielono. Pomiary 11 specyficznie wyznakowanych hybrydyzujących chromosomów wykazały, że LLG posiada Flter 0,67 (pomiar Franke 0,38), co odpowiada prążkowi 18q21. Uważa się, że kilka chorób genetycznych, włącznie z cholestazą śródwątrobową, dystrofią siatkówki i rodzinnym postępującym zanikaniem rozpływnym kości, wiąże się z defektami w tym regionie chromosomalnym.

P r z y k ł a d 3

Analiza RNA LLG

A) Ekspresja RNA LLG w komórkach THP-1

Analizę mRNA, z którego otrzymano cDNA, przeprowadzono przez blotting typu northern RNA THP-1. RNA z tych komórek przygotowano w sposób opisany powyżej. mRNA oczyszczono z całkowitego RNA poprzez zastosowanie układu perełek magnetycznych poli-dT (Polyattract system, Promega). Trzy mikrogramy mRNA zawierającego poli(A) poddano elektroforezie w 1% żelu agarozwowym z formaldehydem. Żel przemywano w ciągu 30 minut w dH2O. RNA przeniesiono próżniowo na membranę nylonową stosując zasadowy bufor do przenoszenia (3 M NaCl, 8 mM NaOH, 2 mM sarkozyl). Po przeniesieniu, blot zobojętniono przez inkubację w ciągu 5 minut w 200 mM buforze fosforanowym, pH 6,8. RNA usieciowano z membraną stosując aparat do sieciowania światłem ultrafioletowym (Stratagene).

Sondę wykonano przez wycięcie wstawki z plazmidu zawierającego opisany powyżej produkt reakcji PCR 5'RACE. Sondę wyznakowano radioaktywnie stosując opisaną w Przykładzie 2 technikę stosowania losowych starterów.

Sączki poddawano prehybrydyzacji w roztworze do szybkiej hybrydyzacji QuickHyb (Stratagene) w ciągu 30 minut w temperaturze 65°C. Wyznakowaną radioaktywnie sondę (1-2 x 10⁶ cpm/ml) i zsonikowany DNA spermy łososia (stężenie końcowe 100 μg/ml) zdenaturowano przez ogrzewanie w temperaturze 95°C w ciągu 10 minut i szybkie schłodzenie na lodzie przed dodaniem do sączka wQuickHyb. Hybrydyzację prowadzono w ciągu 3 godzin w temperaturze 65°C. Niezhybrydyzowaną sondę usunięto przez dwukrotne przemywanie sączków 2X SSC, 0,1% sodowym siarczanem dodecylu w ciągu 15 minut w temperaturze 62°C. Po przemywaniach umożliwiono krótkie wysychanie sączków, a następnie eksponowano na błonę Kodak XAR-2 zekranem wzmacniającym w temperaturze -80°C.

PL 191 624 B1

Wyniki przedstawiono na Figurze 7, która przedstawia główną postać o długości około 4,5 tysięcy par zasad. Obecne są również występujące w mniejszych ilościach postacie o długościach 4,3 i 1,6 tysięcy par zasad. Oczekiwana wielkość cDNA LLGN wynosi 1,6 kb. Sekwencję LLGXL prawdopodobnie koduje główna wykryta postać mRNA.

B) Ekspresja RNA LLG w różnych tkankach człowieka.

Komercjalnie przygotowany sączek zawierający po 3 μg mRNA z różnych tkanek ludzkich (serca, mózgu, łożyska, płuc, wątroby, mięśni szkieletowych, nerki i trzustki) otrzymano z Clontech (numer katalogowy 7760-1). Sączek ten poddawano analizie z zastosowaniem sondy i postępowano z nim jak opisano powyżej. Po zastosowaniu jako sondy wyznakowanego radioaktywnie fragmentu LLG i autoradiografii, sondę usunięto przez przemycie we wrzącym 0,1X SSC, 0,1% SDS w ciągu 2 x 15 minut w inkubatorze nastawionym na temperaturę 65°C. Następnie stosowano jako sondę fragment DNA o długości 1,4 tysiąca par zasad kodujący ludzką lipazę lipoproteinową. Fragment ten otrzymano przez RT-PCR RNA THP-1 (traktowanych PMA i utlenionymi LDL) stosując opisane na Figurze 1startery 5'LPL i 3'LPL i opisane powyżej warunki PCR. Po autoradiografii ponownie usunięto sondę i jako następną sondę stosowano znakowany radioaktywnie fragment cDNA ludzkiej aktyny beta, w celu normalizacji pod względem zawartości RNA. Wyniki tych analiz przedstawiono na Figurze 8. Najwyższy poziom matrycy LLG wykryto w RNA łożyska, z niższymi poziomami stwierdzonymi w RNA pochodzących z tkanek płuc, wątroby i nerki. Zgodnie z uprzednimi badaniami innych (Verhoeven, A.J.M., Jansen, H. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211, 121-124), matrycę lipazy lipoproteinowej stwierdzono w wielu tkankach, z najwyższymi poziomami stwierdzonymi w tkankach serca i mięśni szkieletowych. Wyniki tych analiz wskazują, że tkankowy rozkład ekspresji LLG jest bardzo odmienny od tego LPL. Wzór ekspresji LLG jest także różny od wzorów ekspresji lipazy wątrobowej lub lipazy trzustkowej, podanych przez innych (Wang, C.-S. i Hartsuck, J.A. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1166, 1-19; Semenkovich, C.F., Chen, S.-W., Wims, M., Luo, C.-C., Li, W.-H. i Chan,L.(1989)J.Lipid Res. 30, 423-431; Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Fields, C.i Venter, C. (1993) Nature Genet. 4, 256-265).

W celu określenia wzoru ekspresji w dodatkowych tkankach ludzkich, sondę cDNA LLGXL stosowano wobec innej komercjalnie dostępnej membrany. Tenblot plamkowy (Human RNA Master Blot, numer katalogowy Clontech 7770-1) zawiera 100-500 ng mRNA z 50 różnych tkanek i został znormalizowany wobec równoważnej ekspresji genu odniesienia (Chen, L. i Morin, R. (1971) Biochim. Biophys Acta 231, 194-197). Fragment Dral-Srfl o długości 1,6 kb cDNA LLGXL wyznakowano ³²PdCTP stosując układ wykorzystujący losowe startery oligonukleotydowe (Prime It II, Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta. Po 30 minutach prehybrydyzacji w temperaturze 65°C, do roztworu do hybrydyzacji dodano sondę w ilości 1,3 x 10⁶ cpm/ml. Hybrydyzację prowadzono w ciągu 2 godzin w temperaturze 65°C. Niezhybrydyzowaną sondę usunięto przez dwukrotne przemywanie sączków 2X SSC, 0,1% sodowym siarczanem dodecylu w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej, anastępnie dwukrotne przemywanie 0,1X SSC, 0,1% SDS w ciągu 15 minut w temperaturze 62°C. Po przemywaniach umożliwiono krótkie wysychanie sączków, a następnie eksponowano na błonę Kodak XAR-2 z ekranem wzmacniającym w temperaturze -80°C w ciągu różnych czasów. Otrzymane w wyniku obrazy poddano ocenie ilościowej przez densytometrię. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2. Względne poziomy ekspresji w tkankach reprezentowanych zarówno blocie typu northern wielu tkanek, jak i w blocie plamkowym wielu tkanek są podobne, z najwyższymi poziomami w łożysku i niższymi poziomami w płucach, wątrobie i nerkach. W płodowej wątrobie, nerkach i płucach również zachodzi ekspresja w przybliżeniu na takich samych poziomach, jak w dojrzałych tkankach. Nieoczekiwanie, poziomy ekspresji w tkance tarczycy były najwyższe spośród wszystkich reprezentowanych tkanek, z ekspresją wynoszącą 122% ekspresji w tkance łożyska. O ile istnieje doniesienie o ekspresji lipazy w łożysku (Rotwell, J.E., Elphick, M.C. (1982) J. Dev. Physiol. 4, 153-159; Verhoeven, A.J.M., Carling, D. i Jansen, H. (1994) J. Lipid Res. 35, 966-975; Burton, B.K., Mueller, H.W. (1980) Biochim. Biophys. Acta 618, 449-460), o tarczycy nie było wcześniej wiadomo, że zachodzi w niej ekspresja jakiejkolwiek lipazy. Wyniki te sugerują, że ekspresja LLG może być zaangażowana w utrzymywaniu łożyska, gdzie LLG może służyć do uwalniania wolnych kwasów tłuszczowych jako źródła energii ztakich substratów, jak fosfolipidy. LLG ulegający ekspresji w tarczycy może zapewniać prekursory do syntezy przez gruczoł cząsteczek aktywnych biologicznie.

PL 191 624 B1

Tabel a 2

Ekspresja mRNA LLG w różnych tkankach człowieka

cały mózg	N.W.	istota szara	N.W.	macica	N.W.	gruczoł sutkowy	N.W.	płuca	29
jądro migdałowate	N.W.	płat skroniowy	N.W.	gruczoł krokowy	5	nerka	44	tchawica	12
jądro ogoniaste	N.W.	wzgórze wzrokowe	N.W.	żołądek	N.W.	wątroba	61	łożysko	100
móżdżek	4	jądro podwzgórzowe	N.W.	jądra	9	jelito cienkie	6	mózg płodowy	5
kora móżdżku	N.W.	Rdzeń kręgowy	N.W.	jajnik	N.W.	śledziona	N.W.	serce płodowe	N.W.
płat czołowy	N.W.	serce	N.W.	trzustka	N.W.	grasica	N.W.	nerka płodowa	56
hipokamp	N.W.	aorta	N.W.	przysadka mózgowa	N.W.	leukocyty obwodowe	N.W.	wątroba płodowa	14
rdzeń przedłu-żony	N.W.	Mięśnie szkieletowe	N.W.	gruczoł nadner- czowy	N.W.	węzły chłonne	N.W.	śledziona płodowa	N.W.
płat potyliczny	N.W.	okrężnica	8	tarczyca	122	szpik kostny	N.W.	grasica płodowa	N.W.
skorupa	N.W.	pęcherz moczowy	N.W.	ślinianka	N.W.	wyrostek robaczkowy	7	płuca płodowe	8

Podane wartości są procentami ekspresji, z poziomem w tkance łożyska arbitralnie przyjętym za 100%. Wartości są średnimi z pomiarów densytometrycznych po dwóch ekspozycjach autoradiograficznych. N.W. = niewykrywalny.

C) Ekspresja RNA LLG w hodowanych komórkach śródbłonkowych

Ludzkie komórki śródbłonkowe żyły pępkowej (HUVEC) i ludzkie komórki śródbłonkowe tętnicy wieńcowej (HCAEC) otrzymano z Clonetics. HUVEC namnażano w komercjalnie przygotowanym podłożu do wzrostu komórek śródbłonkowych (EGM, Clonetics) wzbogaconym o 3 mg/ml ekstraktu mózgu bydlęcego (Maciag, T., Cerundolo, J., Ilsley, S., Kelley, P. R. i Forand, R. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5674-5678), Clonetics), podczas gdy HCAEC namnażano w EGM wzbogaconym o 3 mg/ml ekstraktu mózgu bydlęcego i 3% płodową surowicę bydlęcą (5% stężenie końcowe). Komórki namnażano do uzyskania spójnej warstwy, następnie podłoże wymieniano na EGM bez ekstraktu mózgu bydlęcego. Hodowle stymulowano przez dodanie 100 ng/ml mirystynianu forbolu (Sigma). Po inkubacji w ciągu 24 godzin, RNA ekstrahowano z komórek opisaną powyżej metodą z zastosowaniem Trizol. Dwadzieścia mikrogramów całkowitego RNA poddawano elektroforezie i przenoszono na membranę do analizy. Membrany przeszukiwano sondami LLG i LPL, jak opisano powyżej. Wyniki przedstawiono na Figurze 9. Dla porównania, na błocie stosowano dwadzieścia mikrogramów całkowitego RNA z komórek THP-1 stymulowanych PMA. RNA hybrydyzujący z sondą LLG wykryto w niestymulowanych i stymulowanych PMA komórkach HUVEC. W przeciwieństwie, wykrywalne poziomy mRNA LLG stwierdzono w hodowlach HCAEC tylko po stymulacji PMA. Zgodnie z uprzednimi badaniami innych autorów, w żadnym z RNA z komórek śródbłonkowych nie stwierdzono wykrywalnego mRNA lipazy lipoproteinowej (Verhoeven, A.J.M., Jansen, H. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211, 121-124).

P r z y k ł a d 4

Analiza białka LLG

A) Przygotowywanie przeciwciał

Utworzono antysurowice skierowane przeciw peptydom o sekwencjach odpowiadających regionowi przewidywanego białka kodowanego przez otwartą ramkę odczytu cDNA LLG. Peptyd ten wyPL 191 624 B1 brano z powodu jego wysokiego przewidywanego wskaźnika antygenowości (Jameson, B.A. i Wolf, H. (1988) Comput. Applic. in the Biosciences 4, 181-186). Sekwencji immunizującego peptydu nie stwierdzono w jakiejkolwiek sekwencji białka lub ulegającego translacji DNA w bazie danych Genbank. Odpowiadającą mu pozycję w białku LLG przedstawiono na Figurze 10. Karboksylokońcowa cysteina peptydu nie odpowiada reszcie w przypuszczalnym białku LLG, ale wprowadzono ją dla ułatwienia sprzęgania z białkiem nośnikowym. Peptyd zsyntetyzowano w syntezatorze peptydów Applied Biosystems Model 433A. Dwa miligramy peptydu sprzęgnięto z dwoma miligramami aktywowanej maleimidem hemocyjaniny skrzypłocza zgodnie z protokołami zawartymi w Imject Activated Immunogen Conjugation Kit (Pierce Chemical). Po odsoleniu, połowę koniugatu zemulgowano równą objętością kompletnego adiuwanta Freunda (Pierce). Emulsję tą wstrzyknięto królikowi rasy New Zealand White. Cztery tygodnie po pierwszej inokulacji, dokonano inokulacji przypominającej, emulsjąprzygotowaną dokładnie jak opisano powyżej, z wyjątkiem zastosowania niekompletnego adiuwanta Freunda (Pierce). Dwa tygodnie po dawce przypominającej,dokonano testowego pobrania krwi i miana specyficznych przeciwciał określono poprzez test ELISA stosując immobilizowany peptyd. Kolejną dawkę przypominającą podano jeden miesiąc popierwszej dawceprzypominającej.

B)Analiza przez blotting typu Western podłoża z hodowli komórekśródbłonkowych

Komórki HUVEC i HCAEC hodowano i stymulowano PMA jak opisano w Przykładzie 3C,z wyjątkiem stymulowania komórek PMA w ciągu 48 godzin. Próbki kondycjonowanego podłoża (9 ml) inkubowano z 500 μl 50% zawiesiny heparyno-Sepharose CL-6B w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem(PBS, 150 mM chloreksodowy, 100 mM fosforansodowy,pH 7,2). Heparyno-Sepharose wybrano do częściowego oczyszczania i zatężania białek LLG z powodu konserwatywności w sekwencji LLGXL reszt, które zidentyfikowano jako posiadające krytyczne znaczenie dla aktywności wiązania heparyny przez LPL (Ma, Y., Henderson, H.E.,Liu, M.-S.,Zhang, H.,Forsythe, I.J.,ClarkeLewis,I.,Hayden,M. R.i Brunzell,J. D.J. Lipid Res. 35, 2049-2059 i fig.6.).Po wytrząsaniu obrotowym w temperaturze 4°C w ciągu 1godziny, próbki wirowano wciągu5minutprzy150xg. Podłoże usunięto przez odessanie, a Sepharose przemyto 14ml PBS. Po odwirowaniu i odessaniu, osadzoną heparyno-Sepharose zawieszono w 200 μl buforu do nakładania 2x SDS (4% SDS, 20% glicerol, 2% β-merkaptoetanol, 0,002% błękit bromofenolowy i 120 mM Tris, pH 6,8). Próbki ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 5 minut i 40 μl nakładano na 10% żel z SDS w układzie buforowym Tris-Glycine. Poelektroforezieprzynapięciu 140 V w ciągu około 90 minut,białka przeniesiono na membrany nitrocelulozowe stosując aparat do elektroblottingu Novex (210 V, 1 godzina). Membrany blokowano wciągu 30 minut wbuforze blokującym (5% odtłuszczone mleko w proszku, 0,1% Tween20, 150 mM chlorek sodowy, 25 mM Tris, pH 7,2). Antysurowice skierowane przeciw peptydowi i normalną surowicę królika rozcieńczono 1:5000 w buforze blokującym iinkubowano, delikatnie mieszając, zmembranami przez noc w temperaturze 4°C. Następnie membrany przemywano 4 razy w ciągu 15 minut TBST (0,1% Tween 20, 150 mM chlorek sodowy, 25 mM Tris, pH 7,2). Sprzęgnięte z perosydazą kozie antysurowice skierowane przeciw immunoglobulinom królika (Boehringer Mannheim) rozcieńczono 1:5000 w buforze blokującym i inkubowano, mieszając, z membraną w ciągu 1 godziny. Membrany przemywano jak powyżej, poddawano reakcji z odczynnikiem chemiluminescencyjnym Renaissance (DuPont NEN) i eksponowano na błonę Kodak XAR-2. Wyniki przedstawiono na fig. 11. Wpróbkach z niestymulowanych komórek HUVEC i HCAEC obecne są dwie postacie białek reaktywnych immunologicznie. Poziomy białka reaktywnego immunologicznie w próbkach niestymulowanych HCAEC są znacznie niższe, niż w odpowiadających próbkach HUVEC. Po stymulacji PMA hodowle komórek śródbłonkowych wydzielają trzy białka reaktywne immunologicznie. Ekspozycja na PMA znacznie zwiększa poziom białek LLG wytwarzanych przez hodowle HCAEC. Indukcja białek LLG przez PMA nie była tak znacząca w hodowlach HUVEC.

Pr z y k ł a d 5

WytwarzaniezrekombinowanegobiałkaLLG

A) KonstrukcjeekspresyjneLLG cDNA kodujące białka LLGN i LLGXL sklonowano w ssaczym wektorze ekspresyjnym pCDN3 (Invitrogen). Wektor ten umożliwia ekspresję obcych genów w wielu komórkach ssaczych przez zastosowanie głównego późnego promotora cytomegalowirusa. Produkt 5'RACE LLGN sklonowano wmiejscu EcoRI pCDNA3. cDNA LLGXL strawiono Dral i Srfl uzyskując cDNA o długości 1,55 kb (patrz Figura 4). Wektor strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRV i wektor i wstawkę zligowano stosując ligazę DNA T4 i odczynniki z Rapid Ligation Kit (Boehringer Mannheim) zgodnie z instrukcjami producenta. Produkty ligacji zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli.Uzyskane

PL 191 624 B1 w wyniku kolonie przeszukiwano przez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie pod kątem obecności i orientacji wstawki w wektorze ekspresyjnym.

B) Krótkotrwała transfekcja LLG w komórkach COS-7

Wektory ekspresyjne LLG wprowadzono do komórek COS-7 poprzez zastosowanie kationowego odczynnika lipidowego Lipofectamine (GIBCO). Dwadzieścia cztery godziny przed transfekcją komórki COS-7 wysiano na szalki do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm z gęstością 2 x 10⁵ komórek/płytkę. Komórki namnażano w podłożu Eagle zmodyfikowanym przez Dulbecco (DMEM; GIBCO) wzbogaconym o 10% płodową surowicę cielęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny. Jeden mikrogram plazmidowego DNA dodano do 300 μl wolnego od surowicy podłoża Optimem I (Gibco). Dziesięć mikrolitrów odczynnika Lipofectamine rozcieńczono w 300 μl podłoża Optimem I i połączono z roztworem DNA, a następnie pozostawiono w temperaturze pokojowej na 30 minut. Podłoże usunięto z płytek i komórki przemyto 2 ml podłoża Optimem. Roztwór DNA-Lipofectamine dodano do płytek wraz z 2,7 ml podłoża Optimem i płytki inkubowano w ciągu 5 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji usunięto podłoże wolne od surowicy i zastąpiono DMEM wzbogaconym o 2% FBS i antybiotyki. Dwanaście godzin po transfekcji niektóre z hodowli traktowano albo 0,25 mM Pefabloc SC (Boehringer Mannheim), inhibitorem proteaz, albo 10 U/ml heparyny. Trzydzieści godzin przed zbieraniem, próbki traktowane heparyną traktowano dodatkowymi 40 U/ml heparyny. Podłoże usunięto z komórek 60 godzin po transfekcji. Do 1 ml podłoża dodawano heparyno-Sepharose CL-4B (200 μl 50% zawiesiny w PBS, pH 7,2) i mieszano w temperaturze 4°C w ciągu 1 godziny. Sepharose osadzano przez wirowanie z niską szybkością i trzy razy przemywano 1 ml zimnego PBS. Sepharose osadzano i zawieszano w 100 μl 2x buforu do nakładania. Próbki ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 5 minut. 40 μl każdej z próbek nałożono na 10% żel SDS-PAGE. Elektroforezę i analizę przez blotting typu western przeprowadzono stosując antysurowicę skierowaną przeciw LLG, jak opisano powyżej. Wyniki przedstawiono na Figurze 12. Jako odnośniki wielkości włączono białka z kondycjonowanego podłoża HCAEC. LLGN migruje przy około 40 kDa, odpowiadając najniższemu prążkowi w HCAEC. Podłoże z komórek COS-7 stransfekowanych cDNA LLGXL zawiera zarówno postać o masie cząsteczkowej 68 kD, jak i 40 kD. Jeśli komórki te traktowano heparyną, ilość obu białek o masach cząsteczkowych 68 kD i 40 kD odzyskiwanych z podłoża bardzo znacznie zwiększała się, wskazując albo na uwalnianie białka związanego z proteoglikanami z powierzchni komórek, albo na stabilizację białek przez heparynę. Jeśli komórki traktowano inhibitorem proteaz Pefabloc, wzrastała względna ilość białka o masie cząsteczkowej 68 kD w stosunku do tego o masie cząsteczkowej 40 kD. Sugeruje to, że wytwarzane przez te komórki białko o niższej masie cząsteczkowej jest produktem proteolizy większej postaci o masie cząsteczkowej 68 kD. Rola zidentyfikowanego przez różnicowe występowanie mRNA, który koduje krótszą postać o masie cząsteczkowej 40 kD, jest nieznana. Donoszono jednakże o powstającej w wyniku alternatywnego wycinania intronów postaci lipazy wątrobowej, która wydaje się ulegać ekspresji w specyficzny tkankowo sposób i powinna tworzyć skrócone białko.

Pr z y k ł a d 6

LLGwgatunkachzwierząt

A) KlonowaniekróliczegohomologuLLG

Komercjalnie dostępną bibliotekę lambda cDNA pochodzącego z tkanki płuc królika (Clontech, numer katalogowy TL1010b) zastosowano do wyizolowania fragmentu króliczego homologu genu LLG. Pięć mikrolitrów roztworu podstawowego biblioteki dodano do 45 μl wody i ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 10 minut. Następujące składniki dodano w objętości końcowej 100 pl: 200 μM dNTP, 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCh 100 pM każdy ze starterów DLIP774 iLLGgen2a oraz 2,5 U polimerazy Taq (GIBCO). Reakcję prowadzono w cyklach temperaturowych 35 razy przy parametrach: 15 sekund w temperaturze 94°C, 20 sekund w temperaturze 50°C i 30 sekund w temperaturze 72°C. Dziesięć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej analizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym. Wykryto produkt o długości około 300 par zasad. Część (4 pl) mieszaniny reakcyjnej zastosowano do sklonowania produktu wykorzystując układ klonowania TA. Wstawkę otrzymanego w wyniku klonu zsekwencjonowano (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11). Przyporządkowanie przewidywanej króliczej sekwencji aminokwasowej (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12) i odpowiadającej sekwencji cDNA ludzkiego przedstawiono również na Figurze 14. Dla nukleotydów niewchodzących w skład żadnego ze starterów amplifikacji występuje 85,8% identyczności pomiędzy króliczą i ludzką sekwencją LLG. Przewidywane białko kodowane przez ten cDNA królika wykazuje 94,6% identyczności z białkiem ludzkim, z większością podstawień nukleotydowych w trzeciej, lub „niedecydującej, pozycji kodonów. W szczególności, region ten obejmuje sekwencję „wieka

PL 191 624 B1 przewidywanego białka LLG i jest zmienną domeną w rodzinie lipaz genów. Jest to dowodem, że występuje wysoki stopień konserwatywności tego genu pomiędzy gatunkami.

B) LLG u innych gatunków

W celu wykazania obecności genów LLG u innych gatunków, genomowe DNA z różnych gatunków poddano trawieniu restrykcyjnemu EcoRI, rozdzielono przez elektroforezę w żelach agarozowych i blotowano na membrany nitrocelulozowe.

Membrany hybrydyzowano przez noc w temperaturze 65°C z 2,5 x 10⁶ cpm/ml wyznakowanej przez stosowanie losowych starterów sondy ³²P-LLG lub ³²P-LPL (lipazy lipoproteinowej) w roztworze do hybrydyzacji składającego się z 6X SSC, 10% siarczanu dextranu, 5 X roztworu Dendardta, 1% SDS i 5 μg/ml DNA spermy łososia. Membrany przemywano 0,1X SSC, 0,5% SDS w ciągu dziesięciu minut w temperaturze pokojowej, a następnie kolejno w ciągu 10 minut w temperaturze 40°C, 50°C i 55°C. Autoradiogramy blotów przedstawiono na fig. 16.

Figura 16 przedstawia występowanie genów LLG i LPL u wszystkich badanych gatunków, z wyjątkiem braku obserwowania hybrydyzacji sondy LLG z DNA szczura. Wyjątkowe dane dla szczura mogą stanowić artefakt spowodowany przez utworzenie fragmentów restrykcyjnych zawierających sekwencje LLG o nienornalnej wielkości. Takie fragmenty mogą pozostawać poza zakresem frakcjonowania żelu agarozowego lub mogą nie ulegać wydajnemu blotowaniu. Różne prążki wykryte przez dwie sondy wskazują, że geny LPL i LLG są oddzielnymi, konserwatywnymi ewolucyjnie genami.

P r z y k ł a d 7

A ktywnośćenzymatycznaLLGXL

A) Aktywność fosfolipazy

Kondycjonowane podłoża z komórek COS-7, w których zachodziła krótkotrwała ekspresja ludzkiej lipazy lipoproteinowej (LPL), LLGN lub LLGXL, oznaczano pod kątem aktywności fosfolipazy. MEM zawierający 10% FBS (MEM) stosowano jako próbę ślepą, a kondycjonowane podłoża z komórek COS-7 stransfekowanych plazmidem kodującym antysensowny LLGXL (AS) zastosowano jako kontrolę negatywną.

Emulsję fosfatydylocholiny (PC) przygotowano stosując 10 μl fosfatydylocholiny (10 mM), 40 μl

C-fosfatydylocholiny, dipalmitoilu (2 μ^), wyznakowanej w pozycjach sn 1 i sn 2, oraz 100 μl TrisTCNB (100 mM Tris, 1% Triton, 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl, 0,1% BSA). Emulsję odparowywano wciągu 10 minut, a następnie doprowadzono do objętości końcowej 1ml w Tris-TCNB.

Reakcje prowadzono w dwóch powtórzeniach; w skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło 50 μl emulsji PC i 950 μl podłoża. Próbki inkubowano w łaźni wodnej z wytrząsaniem w ciągu 2-4 godzin w temperaturze 37°C. Reakcje kończono przez dodanie 1 ml 1 N HCl, następnie ekstrahowano 4 ml

2-propanolu:heksanu (1:1). Górną warstwę 1,8 ml heksanu przepuszczano przez kolumnę z żelem krzemionkowym i uwolnione C-wolne kwasy tłuszczowe zawarte we frakcji nieulegającej zatrzymaniu na kolumnie określano ilościowo w liczniku scyntylacyjnym. Wyniki tych oznaczeń przedstawiono na fig.14.

B) Aktywność lipazy triacyloglicerolowej

Kondycjonowane podłoża z komórek COS-7, w których zachodziła krótkotrwała ekspresja ludzkiej lipazy lipoproteinowej (LPL), LLGN lub LLGXL, oznaczano pod kątem aktywności lipazy triglicerolowej. MEM zawierający 10% FBS stosowano jako próbę ślepą, a kondycjonowane podłoża z komórek COS-7 stransfekowanych plazmidem kodującym antysensowny LLGXL (AS) stosowano jako kontrolę negatywną.

₃

Stężony substrat przygotowano w postaci bezwodnej emulsji znakowanej oleiną, [9,10-^{i * 3 4}H(N)] i nieznakowanej oleiną (końcowa ilość całkowitej oleiny = 150 mg o 6,25 x 10⁸ cpm), który stabilizo₃ wano przez dodanie 9 mg lecytyny w 100% glicerolu. 0,56 ml ³H-oleiny (0,28 mCi) zmieszano z 0,17 ml nieznakowanej oleiny i 90 μl lecytyny (9 mg). Mieszaninę odparowano w strumieniu azotu. Wysuszoną mieszaninę lipidową zemulgowano w 2,5 ml 100% glicerolu przez sonikację (cykle 30 sekund impulsów na poziomie 2, po których następowały 2 sekundy schładzania, w ciągu 5 minut).

Substrat do oznaczenia przygotowywano przez rozcieńczenie 1 objętości stężonego substratu objętościami 0,2 M buforu Tris-HCl (pH 8,0) zawierającego 3% w/v albuminę surowicy bydlęcej wolnąod kwasów tłuszczowych. Rozcieńczony substrat wytrząsano intensywnie w ciągu 5 sekund stosującVortex.

Reakcje prowadzono w dwóch powtórzeniach w objętości całkowitej 0,2 ml, zawierającej 0,1 ml substratu do oznaczania i 0,1 ml wskazanego podłoża kondycjonowanego. Mieszaniny reakcyjne inkubowano w ciągu 90 minut w temperaturze 37°C. Reakcje zatrzymywano przez dodanie 3,25 ml metanolu-chloroformu-heptanu w stosunku 1,41:1,25:1 (v/v/v), a następnie 1,05 ml buforu 0,1 M węglan potasowy-boran (pH 10,5). Po intensywnym mieszaniu w ciągu 15 sekund, próbki wirowano w ciągu

PL 191 624 B1

5minut przy 1000 obrotach na minutę. Próbki o objętości 1,0 ml górnej fazy wodnej zliczano w liczniku scyntylacyjnym. Wyniki tych oznaczeń przedstawiono na fig. 15.

P r z y k ł a d 8

Stosowanie polipeptydu LLD do poszukiwania agonistówi antagonistów

Zrekombinowany LLG wytwarza się w zainfekownych bakulowirusem komórkach owadzich. Zrekombinowany LLG oczyszcza się z zawierającego surowicę lub wolnego od surowicy kondycjonowanego podłoża na heparyno-Sepharose, a następnie chromatografię na żywicy kationowymiennej. Jeśli zachodzi taka potrzeba, w oczyszczaniu LLG stosuje się trzeci etap chromatograficzny, taki jak sączenie molekularne. Podczas oczyszczania do monitorowania białka LLG stosuje się przeciwciała skierowane przeciw peptydowi, a oznaczenie aktywności fosfolipazy stosuje się do śledzenia aktywności LLG.

W oznaczeniu fluorescencyjnym, końcowymi warunkami oznaczenia są w przybliżeniu 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 5 pM C6NBD-PC{1-acylo-2- [6-(nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4ilo]kaproilofosfatydylocholina i białko LLG (około 1-100 ng). Mieszaninę reakcyjną poddaje się wzbudzaniu fluorescencji przy długości fali 470 nm i w sposób ciągły monitoruje się aktywność enzymu, mierzoną przez emisję fluorescencji przy długości fali 540 nm. Związki i/lub substancje przeznaczone do testowania pod kątem stymulacji i/lub hamowania aktywności LLG dodaje się jako 10-200 mM roztwory w dimetylosulfotlenku. Związki, które stymulują lub hamują aktywność LLG identyfikuje się jako powodujące zwiększenie lub zmniejszenie emisji fluorescencji przy długości fali 540 nm.

W oznaczeniu tiolowym, końcowymi warunkami oznaczenia są w przybliżeniu 25 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM KCl, 10 mM CaCl2, 4,24 mM Triton X-100, 0,5 mM 4,4'-ditiobispirydyna (z 50 mM roztworu podstawowego w etanolu) i 1-100 ng zrekombinowanego LLG. Aktywność fosfolipazy określa się mierząc wzrost absorpcji przy długości fali 342 nm. Związki i/lub substancje przeznaczone do testowania pod kątem stymulacji i/lub hamowania aktywności LLG dodaje się jako 10-200 mM roztwory w dimetylosulfotlenku. Związki, które stymulują lub hamują aktywność LLG identyfikuje się jako powodujące zwiększenie lub zmniejszenie absorpcji przy długości fali 342 nm.

P r z y k ł a d 9

Myszy transgeniczne przeprowadzające ekspresję LLG człowieka

Do dalszych badań fizjologicznej roli LLG tworzy się transgeniczne myszy zdolne do ekspresji LLG człowieka.

Fragment restrykcyjny Dral/Srfl o długości 1,53 kb, który koduje LLGXL (patrz Figura 4), sklonowano w wektorze plazmidowym (pHMG) za promotorem ulegającego ekspresji we wszystkich tkankach genu reduktazy hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A (HMG CoA). Transgeniczne myszy eksprymujące różne poziomy LLGXL człowieka utworzono stosując standardowe metody (patrz np. G.L. Tromp i in., Gene 1565: 199-205, 1995). Myszy transgeniczne stosuje się do określania wpływu nadekspresji LLGXL na profil lipidów, patologię naczyniową, szybkość rozwoju i stopień zaawansowania aterosklerozy i inne parametry fizjologiczne.

P r z y k ł a d 10

Ekspresja LLG w tkankach aterosklerotycznych

Ekspresję LLGXL w aterosklerozie badano przeprowadzając odwrotną transkrypcję-reakcję łańcuchową polimerazy (RT-PCR) z zastosowaniem mRNA izolowanego z materiału pobranego podczas biopsji naczyniowych od czterech pacjentów z aterosklerozą. Próbki tkanek pochodziły ze ściany aorty (jedna próbka), tętnicy biodrowej (dwie próbki) i tętnicy szyjnej (jedna próbka).

Aterosklerotyczny materiał biopsyjny otrzymano z Gloucestershire Royal Hospital, Anglia, przygotowano poliA+ mRNA i ponownie zawieszono w wodzie traktowanej dietylopirowęglanem (DEPC) w stężeniu mRNA 0,5 μg/μl. Reakcje odwrotnej transkryptazy prowadzono zgodnie z protokołem GibcoBRL dla Superscript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis. Krótko, cDNA syntetyzowano w następujący sposób: po 2 μΐ każdego z mRNA dodawano do 1 μΐ startera oligo (dT)₁₂.₁₈ i 9 μΐ wody DEPC. Probówki inkubowano w temperaturze 70°C w ciągu 10 minut i umieszczono na lodzie w ciągu 1 minuty. Do każdej probówki dodawano następujące składniki: 2 μΐ 10X buforu do PCR, 2 μΐ 25 mM MgCl₂, 1 μΐ mieszaniny 10 mM dNTP i 2 μΐ 0,1 M DTT. Po 5 minutach w temperaturze 42°C dodawano 1 μΐ (200 jednostek) odwrotnej transkryptazy Super Script II. Mieszaniny reakcyjne delikatnie mieszano, a następnie inkubowano w temperaturze 42°C w ciągu 50 minut. Reakcje kończono przez inkubację w temperaturze 70°C w ciągu 15 minut, a następnie umieszczono na lodzie. Pozostały mRNA niszczono przez dodanie do każdej probówki 1 μΐ RNazy H i inkubowano w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C.

PL 191 624 B1

Stosując 2 μl mieszanin reakcyjnych zawierających cDNA przeprowadzono amplifikacje PCR. Do każdej probówki dodawano następujące składniki: 5 μl 10X buforu do PCR, 5 μl 2 mM dNTP, 1 μl startera hllg-gsp1 (20 pmoli/ml, patrz fig. 1), 1 μl startera hllg-gsp2a (20 pmoli/ml, patrz fig. 1), 1,5 μl 50 mM MgCl₂, 0,5 μl polimerazy Taq (5 U/ml) i 34 μl wody. Po utrzymywaniu mieszanin reakcyjnych w temperaturze 95°C w ciągu 2 minut, przeprowadzano trzydzieści następujących cykli PCR: 15 sekund w temperaturze 94°C, 20 sekund w temperaturze 52°C i 30 sekund w temperaturze 72°C. Po zakończeniu reakcji mieszaniny reakcyjne utrzymywano w ciągu 10 minut w temperaturze 72°C przed analizą przez elektroforezę w żelu agarozowym. Startery hllg-gsp są specyficzne wobec LLG i pozwoliły uzyskać oczekiwany produkt o wielkości 300 bp. W celu wykazania, że reakcje syntezy cDNA zakończyły się powodzeniem, w równoległej PCR zastosowano startery specyficzne wobec genu odniesienia, G3PDH (ludzkiej dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego (po 1 μl każdego w stężeniu 20 pmoli/ml).

Startery G3PDH (patrz fig. 1) pozwoliły uzyskać oczekiwany produkt o długości 983 bp dla wszystkich próbek biopsji naczyniowej. EkspresjąLLG wykryto w trzech z czterech próbek, nie wykrywając żadnej ekspresji w próbce tętnicy szyjnej.

Wszystkie omawiane w niniejszym opisie pozycje literaturowe włączono do niego poprzez odnośniki literaturowe.

Specjalista w tej dziedzinie z łatwością zrozumie, że niniejszy wynalazek jest dobrze dostosowany do realizacji wyznaczonych zadań i uzyskania wymienionych celów i korzyści, jak również tych właściwych dla wynalazku. Opisane w niniejszym opisie peptydy, polinukleotydy, sposoby, procedury itechniki przedstawiono jako reprezentatywne dla korzystnych rozwiązań i jest zamiarem, aby stanowiły one przyład, a nie ograniczały zakres niniejszego wynalazku. Dla specjalistów w tej dziedzinie będą oczywiste pozostające w duchu wynalazku lub określone przez zakres dołączonych zastrzeżeń zmiany niniejszego wynalazku i inne jego zastosowania.

PL 191 624 B1

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Jaye, Michael C.

Doan, Kim-Anh T.

Krawiec, John A.

Lynch, Kevin J.

Amin, Dilip V.

South, Victoria J.

Cii} TYTUŁ WYNALAZKU: POLIPEPTYDY LLG Z RODZINY LIPAZ

TRIACYLOGLICEROLOWYCH ORAZ KOMPOZYCJE I

SPOSOBY ICH STOSOWANIA W HYDROLIZIE

ENZYMATYCZNEJ I TERAPIACH BIAŁKOWYCH I

GENOWYCH (iii) LICZBA SEKWENCJI: 31 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Rhone-Poulenc Rorer Inc.

(B) ULICA: 500 Arcola Rd. 3C43 (C) MIASTO: Collegeville (D) STAN: PA (E) KRAJ: STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD POCZTOWY: 19426 (V) ZAPIS KOMPUTEROWY:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja # 1.30 (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US (B) DATA ZŁOŻENIA:

PL 191 624 B1 (C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJA 0 FEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:

(A) NAZWISKO: dr Fehlner, Paul F.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 35 135 (C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ/NUMER W REJESTRZE: A2582-WO (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (610)454-3839 (B) TELEFAX: (610)454-3803 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ: 3	67 par 2asad
(B)	TYP: kwas	nukleinowy
(C)	ILOŚĆ NICI	: dwie
(D)	TOPOLOGIA:	liniowa
RODZAJ	CZĄSTECZKI:	cDNA

(ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 22..180 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI

KACYJNYM:!:

GAATTCGGCT TGATCAATCG C TTC Phe	AAA AAG GGG	ATC TGT CTG AGC TGC CGC	51
Lys	Lys	Gly	ile 5	Cys	Leu Ser	Cys Arg 10
	1
AAG AAC CGT TGT	AAT AGC ATT	GGC	TAC	AAT	GCC	AAG	AAA ATG	AGG AAC	99
Lys Asn Arg Cys	Asn Ser Ile 15	Gly	Tyr	Asn 20	Ala	Lys	Lys Met	Arg Asn 25
AAG AGG AAC AGC	AAA ATG TAC	CTA	AAA	ACC	CGG	GCA	GGC ATG	CCT TTC	147
Lys Arg Asn Ser 30	Lys Het Tyr	Leu	Lys 35	Thr	Arg	Ala	Gly Met 40	Pro Phe

PL 191 624 B1

AGA GGT AAC CTT CAG TCC CTG GAG TGT CCC TGA GGAAGGCCCT TAATACCTCC 200

Arg Gly Asn Leu Gin Ser Leu Glu Cys Pro *

50

TTCTTAATAC	CATGCTGCAG	AGCAGGGCAC	ATCCTAGCCC	AGGAGAAGTG	GCCAGCACAA	260
TCCAATCAAA	TCGTTGCAAA	TCAGATTACA	CTGTGCATGT	CCTAGGAAAG	GGAATCTTTA	320
CAAAATAAAC	AGTGTGGACC	CCTCAAAAAA	AAAAAAAAGC	CGAATTC		357

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 53 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 2:

Phe 1

Lys

Lys

Gly

Ile 5

Cys

Leu

Ser Cys

Arg 10

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn Ser 15

Ile

Gly

Tyr

Asn 20

Ala

Lys

Lys

Met Arg 25

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser 30

Lys Met

Tyr Leu Lys Thr Arg Ala Gly Mec Pro Phe Arg Gly Asn Leu Gin Ser 35 40 45

Leu Glu Cys Pro * (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:3: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1382 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 191 624 B1 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 312..1370 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI

KACYJNYM:3:

GAATTCGGCT	TCTACTACTA	CTAGGCCACG	CGTCGCCTAG	TACGGGGGGG	GGGGGGGGGG	60
TCAGCGAGTC	CTTGCCTCCC	GGCGGCTCAG	GACGAGGGCA	GATCTCGTTC	TGGGGCAAGC	120
CGTTGACACT	CGCTCCCTGC	CACCGCCCGG	GCTCCGTGCC	GCCAAGTTTT	CATTTTCCAC	iao
CTTCTCTGCC	TCCAGTCCCC	CAGCCCCTGG	CCGAGAGAAG	GGTCTTACCG	GCCGGGATTG	240
CTGGAAACAC	CAAGAGGTGG	TTTTTGTTTT	TTAAAACTTC	TGTTTCTTGG	GAGGGGGTGT	300

GGCGGGGCAG G ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC 350

Mec Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu

60 65

TGC TAT

TGC Cys

TTT Phe 70

GCT GCG GGG

AGC CCC GTA CCT TTT GGT CCA GAG GGA

398

Cys

Tyr

Ala Ala

Gly

Ser Pro 75

Val

Pro

Phe Gly

Pro 30

Glu

Gly

CGG

CTG

GAA

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

446

Arg

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

65

90

95

AAA

CCA

TCT

GTG

AGG

TTT

AAC

CTC

CGC

ACC

TCC

AAG

GAC

CCA

GAG

CAT

494

Lys

Pro

Ser

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

100

105

110

GAA

GGA

TGC

TAC

CTC

TCC

GTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

TTA

GAA

GAC

TGC

542

Glu

Gly

Cys

Tyr

Leu

Ser

Val

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys

115

120

125

130

AGT

TTC

AAC

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT

CAC

GGA

TGG

ACG

590

Ser

Phe

Asn

Met

Thr

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe

Ile

Ile

His

Gly

Trp

Thr

135

140

145

ATG

AGC

GGT

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC

GTG

TCA

GCC

CTG

638

Met

Ser

Gly

Ile

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu

His

Lys

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

150

155

160

CAC

ACA

AGA

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT

GAC

TGG

CTC

CCC

686

His

Thr

Arg

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn

Val

Val

Val

Val

Asp

Trp

Leu

Pro

165

170

175

PL 191 624 B1

CTG GCC CAC CAG CTT TAC ACG GAT GCG GTC AAT AAT ACC AGG GTG GTG

734

Leu

Ala 180

His

Gin

Leu Tyr

Thr Asp Ala Val Asn Asn

Thr

Arg

Val

Val

185

190

GGA

CAC

AGC

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG

GAG

AAG

GAC

GAT

782

Gly

His

Ser

Ile

Ala

Arg

Met

Leu

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp

195

200

205

210

TTT

TCT

CTC

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC

CTC

GGA

GCG

CAC

830

Phe

Ser

Leu

Gly

Asn

Val

His

Leu

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

215

220

225

GTG

GCC

GGG

TAT

GCA

GGC

AAC

TTC

GTG

AAA

GGA

ACG

GTG

GGC

CGA

ATC

878

Val

Ala

Gly

Tyr

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

Lys

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Ile

230

235

240

ACA

GGT

TTG

GAT

CCT

GCC

GGG

CCC

ATG

TTT

GAA

GGG

GCC

GAC

ATC

CAC

926

Thr

Gly

Leu

Asp

.Pro

Ala

Gly

Pro

Met

Phe

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile

His

245

250

255

AAG

AGG

CTC

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT

GTC

CTC

CAC

ACC

974

Lys

Arg

Leu

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

260

265

270

TAC

ACG

CGT

TCC

TTC

GGC

TTG

AGC

ATT

GGT

ATT

CAG

ATG

CCT

GTG

GGC

1022

Tyr

Thr

Arg

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile

Gin

Met

Pro

Val

Gly

275

280

285

290

CAC

ATT

GAC

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG

CCA

GGC

TGT

GGA

1070

His

Ile

Asp

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Gly

295

300

305

CTC

AAC

GAT

GTC

TTG

GGA

TCA

ATT

GCA

TAT

GGA

ACA

ATC

ACA

GAG

GTG

1118

Leu

Asn

Asp

Val

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

310

315

320

GTA

AAA

TGT

GAG

CAT

GAG

CGA

GCC

GTC

CAC

CTC

TTT

GTT

GAC

TCT

CTG

1166

Val

Lys

Cys

Glu

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

325

330

335

GTG

AAT

CAG

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

1214

Val

Asn

Gin

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

340

345

350

CGC

TTC

AAA

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

1262

Arg

Phe

Lys

Lys

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

355

360

365

370

AGC

ATT

GGC

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

1310

Ser

Ile

Gly

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

375

380

385

PL 191 624 B1

ATG	TAC	CTA	AAA	ACC CGG GCA GGC	ATG	CCT	TTC	AGA GGT AAC	CTT	CAG	1358
Met	Tyr	Leu	Lys	Thr Arg Ala Gly	Met	Pro	Phe	Arg Gly Asn	Leu	Gin
			390		395			400
TCC	CTG	GAG	TGT	CAAGCCGAAT TC							1382
Ser	Leu	Glu	Cys
		405

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 353 aminokwasy iB) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko <xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI-

	KACYJNYM	1:4:
Mec Ser Asn 1	Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp 5 10	Ser Leu Cys Tyr Cys 15
Phe Ala Ala	Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro 20 25	Glu Gly Arg Leu Glu 30
Asp Lys Leu 35	His Lys Pro Lys Ala Thr Gin Thr 40	Glu Val Lys Pro Ser 45
Val Arg Phe . 50	Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro 55	Glu His Glu Gly Cys 60
Tyr Leu Ser 55	Val Gly His Ser Gin Pro Leu Glu 70 75	Asp Cys Ser Phe Asn 80
Met Thr Ala	Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly 85 go	Trp Thr Met Ser Gly 95
Ile Phe Glu	Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser 100 105	Ala Leu His Thr Arg 110
Glu Lys Asp 115	Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp 120	Leu Pro Leu Ala His 125
Gin Leu Tyr 130	Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg 135	Val Val Gly His Ser 140
Ile Ala Arg 145	Mec Leu Asp Trp Leu Gin Glu Lys 150 155	Asp Asp Phe Ser Leu 160

PL 191 624 B1

Gly Asn Val

His

Leu 165

Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala 170

His

Val

Ala 175

Gly

Tyr

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

Lys

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

180

185

190

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Mec

Phe

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile

His

Lys

Arg

Leu

195

200

205

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

Tyr

Thr

Arg

210

215

220

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile

Gin

Met

Pro

Val

Gly

His

Ile

ASp

225

230

235

240

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Gly

Leu

Asn

Asp

24S

250

255

Val

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

Val

Lys

Cys

250

265

270

Glu

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

275

280

285

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

290

295

300

Lys

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly

305

310

315

320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

325

330

335

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Gly

Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Glu

340 345 350

Cys (2} INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1065 pac zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: CDNA

PL 191 624 B1 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 1..106S (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI KACYJNYM:5:

ATG Met

AGC AAC TCC GTT Ser Asn Ser Val 355

CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC TGC

TAT Tyr

TGC Cys

48

Pro

Leu 360

Leu

Cys

Phe Trp

Ser 365

Leu

Cys

TTT

GCT

GCG

GGG

AGC

CCC

GTA

CCT

TTT

GGT

CCA

GAG

GGA

CGG

CTG

GAA

96

Phe

Ala

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Pro

Phe

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg

Leu

Glu

370

375

380

385

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

AAA

CCA

TCT

144

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

Lys

Pro

Ser

390

395

400

GTG

AGG

TTT

AAC

CTC

CGC

ACC

TCC

AAG

GAC

CCA

GAG

CAT

GAA

GGA

TGC

192

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

Glu

Gly

Cys

405

410

415

TAC

CTC

TCC

GTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

TTA

GAA

GAC

TGC

AGT

TTC

AAC

240

Tyr

Leu

Ser

Val

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys

Ser

Phe

Asn

420

425

430

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT

CAC

GGA

TGG

ACG

ATG

AGC

GGT

288

Met

Thr

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe

Ile

Ile

His

Gly

Trp

Thr

Met'

Ser

Gly

435

440

445

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC

GTG

TCA

GCC

CTG

CAC

ACA

AGA

336

Ile

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu

His

Lys

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

His

Thr

Arg

450

455

460

465

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT

GAC

TGG

CTC

CCC

CTG

GCC

CAC

394

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn

Val

Val

Val

Val

Asp

Trp

Leu

Pro

Leu

Ala

His

470

475

480

CAG

CTT

TAC

ACG

GAT

GCG

GTC

AAT

AAT

ACC

AGG

GTG

GTG

GGA

CAC

AGC

432

Gin

Leu

Tyr

Thr

Asp

Ala

val

Asn

Asn

Thr

Arg

Val

Val

Gly

His

Ser

485

490

495

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG

GAG

AAG

GAC

GAT

TTT

TCT

CTC

490

Ile

Ala

Arg

Met

Leu

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp

Phe

Ser

Leu

500

505

510

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC

CTC

GGA

GCG

CAC

GTG

CCC

GGG

528

Gly

Asn

Val

His

Leu

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

val

Ala

Gly

515

520

525

TAT i

GCA

GGC

AAC

TTC

GTG

AAA

GGA

ACG

GTG

GGC

CGA

ATC

ACA

GGT

TTG

576

Tyr Ala

Gly

Asn

Phe

Val

Lys

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

He

Thr

Gly

Leu

530 535 540 545

PL 191 624 B1

GAT CCT GCC

GGG CCC ATG TTT GAA

GGG GCC

GAC Asp

ATC CAC AAG AGG CTC

624

Asp

Pro

Alą

Gly

Pro Met Phe 550

Glu

Gly

Ala 555

Ile

His

Lys

Arg 560

Leu

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT

GTC

CTC

CAC

ACC

TAC

ACG

CGT

S72

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

Tyr

Thr

Arg

565

570

575

TCC

TTC

GGC

TTG

AGC

ATT

GGT

ATT

CAG

ATG

CCT

GTG

GGC

CAC

ATT

GAC

720

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile

Gin

Mec

Pro

Val

Gly

His

Ile

Asp

580

585

590

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG

CCA

GGC

TGT

GGA

CTC

AAC

GAT

768

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Gly

Leu

Asn

Asp

S9S

600

605

GTC

TTG

GGA

TCA

ATT

GCA

TAT

GGA

ACA

ATC

ACA

GAG

GTG

GTA

AAA

TGT

816

Val

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

Val

Lys

Cys

610

615

620

625

GAG

CAT

GAG

CGA

GCC

GTC

CAC

CTC

TTT

GTT

GAC

TCT

CTG

GTG

AAT

CAG

864

Glu

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

630

635

640

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

CGC

TTC

AAA

912

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

645

650

655

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

AGC

ATT

GGC

960

Lys

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly

660

665

670

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

ATG

TAC

CTA

1008

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Mec

Tyr

Leu

675

680

685

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

GGT

AAC

CTT

CAG

TCC

CTG

GAG

1056

Lys

-Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Gly

Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Glu

690 695 700 705

TGT CCC TGA 1055

Cys Pro · (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:6 ii) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 355 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 191 624 B1 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

	(xi(	( OPIS	SEKWENCJI:	: SEKWENCJA 0 NUMERZE KACYJNYM:6:	IDENTYFI-
Met Ser 1	Asn	Ser Val 5	Pro Leu Leu	Cys Phe Trp Ser Leu Cys 10	Tyr Cys 15
Phe Ala	Ala	Gly Ser 20	Pro Val Pro	Phe Gly Pro Glu Gly Arg 25 30	Leu Glu
Asp Lys	Leu 35	His Lys	Pro Lys Ala 40	Thr Gin Thr Glu Val Lys 45	Pro Ser
Val Arg 50	Phe	Asn Leu	Arg Thr Ser 55	Lys Asp Pro Glu His Glu 60	Gly Cys
Tyr Leu 65	Ser	Vał Gly	His Ser Gin 70	Pro Leu Glu Asp Cys Ser 75	Phe Asn 80
Met Thr	Ala	Lys Thr 35	Phe Phe Ile	Ile His Gly Trp Thr Met 90	Ser Gly 95
Ile Phe	Glu	Asn Trp 100	Leu His Lys	Leu Val Ser Ala Leu His 105 110	Thr Arg
Glu Lys	Asp 115	Ala Asn	Val Val Val 120	Val Asp Trp Leu Pro Leu 125	Ala His
Gin Leu 130	Tyr	Thr Asp	Ala Val Asn 135	Asn Thr Arg Val Val Gly 140	His Ser
Ile Ala 145	Arg	Met Leu	Asp Trp Leu 150	Gin Glu Lys Asp Asp Phe 155	Ser Leu 160
Gly Asn	Val	His Leu 165	Ile Gly Tyr	Ser Leu Gly Ala His Val 170	Ala Gly 175
Tyr Ala	Gly	Asn Phe 130	Val Lys Gly	Thr Val Gly Arg Ile Thr 185 190	Gly Leu
Asp Pro	Ala 195	Gly Pro	Met Phe Glu 200	Gly Ala Asp Ile His Lys 205	Arg Leu
ser Pro 210	Asp	Asp Ala	Asp Phe Val 215	Asp Val Leu His Thr Tyr 220	Thr Arg
Ser Phe 225	Gly	Leu Ser	Ile Gly Ile 230	Gin Met Pro Val Gly His 235	ile Asp 240
Ile Tyr	Pro	Asn Gly 245	Gly Asp Phe	Gin Pro Gly Cys Gly Leu 250	Asn Asp 255

PL 191 624 B1

Val	Leu Gly	Ser 260	Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Vał Val	Lys Cys
265	270
Glu	His Glu	Arg	Ala Val His Leu Phe Val	Asp Ser Leu Val	Asn Gin
	275		280	285
Asp	Lys Pro	Ser	Phe Ala Phe Gin Cys Thr	Asp Ser Asn Arg	Phe Lys
	290		295	300
Lys	Gly Ile	Cys	Leu Ser Cys Arg Lys Asn	Arg Cys Asn Ser	Ile Gly
305			310	315	320
Tyr	Asn Ala	Lys	Lys Met Arg Asn Lys Arg	Asn Ser Lys Met	Tyr Leu
			325 330		335
Lys	Thr Arg	Ala	Gly Met Pro Phe Arg Gly	Asn Leu Gin Ser	Leu Glu
		340	345	350
Cys	Pro *
	355
	(2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 7

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2565 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 252..1754 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI

			KACYJNYM:'	7:
GAATTCGCGG	CCGCGTCGAC	GGCGGCTCAG	GACGAGGGCA	GATCTCGTTC	TGGGGCAAGC	60
CGTTGACACT	CGCTCCCTGC	CACCGCCCGG	GCTCCGTGCC	GCCAAGTTTT	CATTTTCCAC	120
CTTCTCTGCC	TCCAGTCCCC	CAGCCCCTGG	CCGAGAGAAG	GGTCTTACCG	GCCGGGATTG	180
CTGGAAACAC	CAAGAGGTGG	TTTTTGTTTT	TTAAAACTTC	TGTTTCTTGG	GAGGGGGTGT	240

PL 191 624 B1

GGCGGGGCAG G ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC 290

Mec Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu

360 36S

TGC TAT

TGC Cys

TTT GCT

GCG Ala

GGG AGC

CCC Pro

GTA CCT TTT GGT CCA GAG GGA

338

Cys

Tyr 370

Phe

Ala

Gly 375

Ser

Val

Pro

Phe 380

Gly

Pro

Glu

Gly

CGG

CTG

GAA

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

386

Arg

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

385

390

395

400

AAA

CCA

TCT

GTG

AGG

TTT

AAC

CTC

CGC

ACC

TCC

AAG

GAC

CCA

GAG

CAT

434

Lys

Pro

Ser

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

405

410

415

GAA

GGA

TGC

TAC

CTC

TCC

GTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

TTA

GAA

GAC

TGC

482

Glu

Gly

Cys

Tyr

Leu

Ser

Val

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys

420

425

430

AGT

TTC

AAC

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT

CAC

GGA

TGG

ACG

530

Ser

Phe

Asn

Mec

Thr

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe

Ile

Ile

His

Gly

Trp

Thr

435

440

445

ATG

AGC

GGT

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC

GTG

TCA

GCC

CTG

578

Met

Ser

Gly

Ile

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu

His

Lys

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

450

455

460

CAC

ĄCA

AGA

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT

GAC

TGG

CTC

CCC

626

His

Thr

Arg

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn

Val

Val

Val

Val

Asp

Trp

Leu

Pro

465

470

475

480

CTG

GCC

CAC

CAG

CTT

TAC

ACG

GAT

GCG

GTC

AAT

AAT

ACC

AGG

GTG

GTG

674

Leu

Ala

His

Gin

Leu

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val

Asn

Asn

Thr

Arg

Val

Val

485

490

495

GGA

CAC

AGC

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG

GAG

AAG

GAC

GAT

722

Gly

His

Ser

Ile

Ala

Arg

Met

Leu

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp

500

505

510

TTT

TCT

CTC

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC

CTC

GGA

GCG

CAC

770

Phe

Ser

Leu

Gly

Asn

Val

His

Leu

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

515

520

525

GTG Val

GCC Ala 530

GGG Gly

TAT GCA GGC

AAC TTC GTG AAA GGA ACG GTG GGC

CGA ATC

818

Tyr Ala

Gly

Asn 535

Phe Val

Lys

Gly

Thr Val 540

Gly

Arg

Ile

ACA

GGT

TTG

GAT

CCT

GCC

GGG

CCC

ATG

TTT

GAA

GGG

GCC

GAC

ATC

CAC

866

Thr

Gly

Leu

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Met

Phe

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile

His

545

550

S55

560

AAG

AGG

CTC

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT

GTC

CTC

CAC

ACC

914

Lys

Arg

Leu

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

565

570

575

PL 191 624 B1

TAC ACG CGT

TCC TTC GGC

TTG AGC ATT Leu Ser Ile 585

GGT ATT CAG ATG

CCT GTG GGC

962

Tyr

Thr Arg

Ser 580

Phe

Gly

Gly

Ile

Gin

Met

Pro 590

Val

Gly

CAC

ATT

GAC

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG

CCA

GGC

TGT

GGA

1010

His

Ile

Asp

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Gly

595

600

605

CTC

AAC

GAT

GTC

TTG

GGA

TCA

ATT

GCA

TAT

GGA

ACA

ATC

ACA

GAG

GTG

1058

Leu

Asn

Asp

Val

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

610

615

620

GTA

AAA

TGT

GAG

CAT

GAG

CGA

GCC

GTC

CAC

CTC

TTT

GTT

GAC

TCT

CTG

1106

Val

Lys

Cys

Glu

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

625

630

635

640

GTG

AAT

CAG

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

1154

Val

Asn

Gin

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

645

650

655

CGC

TTC

AAA

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

1202

Arg

Phe

Lys

Lys

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

660

665

670

AGC

ATT

GGC

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

1250

Ser

Ile

Gly

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

675

680

685

ATG

TAC

CTA

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

GTT

TAC

CAT

TAT

1298

Met

Tyr

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Val

Tyr

His

Tyr

690

695

700

CAG

ATG

AAA

ATC

CAT

GTC

TTC

AGT

TAC

AAG

AAC

ATG

GGA

GAA

ATT

GAG

1346

Gin

Met

Lys

Ile

His

val

Phe

Ser

Tyr

Lys

Asn

Met

Gly

Glu

Ile

Glu

705

710

715

720

CCC

ACC

TTT

TAC

GTC

ACC

CTT

TAT

GGC

ACT

AAT

GCA

GAT

TCC

CAG

ACT

1394

Pro

Thr

Phe

Tyr

Val

Thr

Leu

Tyr

Gly

Thr

Asn

Ala

Asp

Ser

Gin

Thr

725

730

735

CTG

CCA

CTG

GAA

ATA

GTG

GAG

CGG

ATC

GAG

CAG

AAT

GCC

ACC

AAC

ACC

1442

Leu

Pro

Leu

Glu

Ile

Val

Glu

Arg

Ile

Glu

Gin

Asn

Ala

Thr

Asn

Thr

740

745

750

TTC

CTG

GTC

TAC

ACC

GAG

GAG

GAC

TTG

GGA

GAC

CTC

TTG

AAG

ATC

CAG

1490

Phe

Leu

Val

Tyr

Thr

Glu

Glu

Asp

Leu

Gly

Asp

Leu

Leu

Lys

Ile

Gin

755

760

765

CTC

ACC

TGG

GAG

GGG

GCC

TCT

CAG

TCT

TGG

TAC

AAC

CTG

TGG

AAG

GAG

1538

Leu

Thr

Trp

Glu

Gly

Ala

Ser

Gin

Ser

Trp

Tyr

Asn

Leu

Trp

Lys

Glu

770

775

780

TTT

CGC

AGC

TAC

CTG

TCT

CAA

CCC

CGC

AAC

CCC

GGA

CGG

GAG

CTG

AAT

1586

Phe

Arg

Ser

Tyr

Leu

Ser

Gin

Pro

Arg

Asn

Pro

Gly

Arg

Glu

Leu

Asn

785

790

795

800

ATC

AGG

CGC

ATC

CGG

GTG

AAG

TCT

GGG

GAA

ACC

CAG

CGG

AAA

CTG

ACA

1634

Ile

Arg

Arg

Ile

Arg

Val

Lys

Ser

Gly

Glu

Thr

Gin

Arg

Lys

Leu

Thr

805

810

815

PL 191 624 B1

TTT TGT ACA GAA GAC	CCT Pro	GAG AAC ACC AGC ATA TCC CCA GGC CGG GAG	1682
Phe Cys Thr	Glu S20	Asp	Glu	Asn	Thr Ser 825	Ile Ser	Pro	Gly Arg Glu 830
CTC TGG TTT	CGC	AAG	TGT	CGG	GAT	GGC TGG	AGG ATG	AAA	AAC GAA ACC	1730
Leu Trp Phe	Arg	Lys	Cys	Arg	Asp	Gly Trp	Arg Met	Lys	Asn Glu Thr
835					840			845
AGT CCC ACT	GTG	GAG	CTT	CCC	TGA	GGGTGCCCGG GCAAGTCTTG CCAGCAAGGC	1784
Ser Pro Thr	VaX	Glu	Leu	Pro	*
850				855

AGCAAGACTT	CCTGCTATCC	AAGCCCATGG	AGGAAAGTTA	CTGCTGAGGA	CCCACCCAAT	1844
GGAAGGATTC	TTCTCAGCCT	TGACCCTGGA	GCACTGGGAA	CAACTGGTCT	CCTGTGATGG	1904
CTGGGACTCC	TCGCGGGAGG	GGACTGCGCT	GCTATAGCTC	TTGCTGCCTC	TCTTGAATAG	1964
CTCTAACTCC	AAACCTCTGT	CCACACCTCC	AGAGCACCAA	GTCCAGATTT	GTGTGTAAGC	2024
AGCTGGGTGC	CTGGGGCCTC	TCGTGCACAC	TGGATTGGTT	TCTCAGTTGC	TGGGCGAGCC	2084
TGTACTCTGC	CTGACGAGGA	ACGCTGGCTC	CGAAGAGGCC	CTGTGTAGAA	GGCTGTCAGC	2144
TGCTCAGCCT	GCTTTGAGCC	TCAGTGAGAA	GTCCTTCCGA	CAGGAGCTGA	CTCATGTCAG	2204
GATGGCAGGC	CTGGTATCTT	GCTCGGGCCC	TGGCTGTTGG	GGTTCTCATG	GGTTGCACTG	2264
ACCATACTGC	TTACGTCTTA	GCCATTCCGT	CCTGCTCCCC	AGCTCACTCT	CTGAAGCACA	2324
CATCATTGGC	TTTCCTATTT	TTCTGTTCAT	TTTTTAATTG	AGCAAATGTC	TATTGAACAC	2384
TTAAAATTAA	TTAGAATGTG	GTAATGGACA	TATTACTGAG	CCTCTCCATT	TGGAACCCAG	2444
TGGAGTTGGG	ATTTCTAGAC	CCTCTTTCTG	TTTGGATGGT	GTATGTGTAT	ATGCATGGGG	2504
AAAGGCACCT	GGGGCCTGGG	GGAGGCTATA	GGATATAAGC	AGTCGACGCG	GCCGCGAATT	2564

2565 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI ii) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 501 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa <D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYMI :

PL 191 624 B1

Met 1

Ser

Asn

Ser

Val 5

Pro

Leu

Leu

Cys

Phe 10

Trp

Ser

Leu

Cys

Tyr 15

Cys

Phe

Ala

Ala

Gly 20

Ser

Pro

Val

Pro

Phe 25

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg 30

Leu

Glu

ASp

Lys

Leu 35

His

Lys

Pro

Lys

Ala 40

Thr

Gin

Thr

Glu

Val 45

Lys

Pro

Ser

Val

Arg 50

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr 55

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu 60

His

Glu

Gly

Cys

Tyr 65

Leu

Ser

Val

Gly

His 70

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu 75

Asp

Cys

Ser

Phe

Asn 80

Met

Thr

Ala

Lys

Thr 85

Phe

Phe

Ile

Ile

His 90

Gly

Trp

Thr

Met

Ser 95

Gly

Ile

Phe

Glu

Asn 10 0

Trp

Leu

His

Lys

Leu 105

Val

Ser

Ala

Leu

His 110

Thr

Arg

Glu

Lys

Asp 115

Ala

Asn

Val

Val

Val 120

Val

Asp

Trp

Leu

Pro 125

Leu

Ala

His

Gin

Leu 130

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val 135

Asn

Asn

Thr

Arg

Val 140

Val

Gly

His

Ser

Ile 145

Ala

Arg

Met

Leu

Asp 150

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys 155

Asp

Asp

Phe

Ser

Leu 160

Gly

Asn

Val

His

Leu 165

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu 170

Gly

Ala

His

Val

Ala 175

Gly

Tyr

Ala

Gly

Asn 180

Phe

Val

Lys

Gly

Thr 185

Val

Gly

Arg

Ile

Thr 190

Gly

Leu

Asp

Pro

Ala 195

Gly

Pro

Met

Phe

Glu 200

Gly

Ala

Asp

Ile

His 205

Lys

Arg

Leu

Ser

Pro 210

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe 215

Val

Asp

Val

Leu

His 220

Thr

Tyr

Thr

Arg

Ser 225

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile 230

Gly

Ile

Gin

Met

Pro 235

Val

Gly

His

Ile

Asp 240

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin.

Pro

Gly

Cys

Gly

Leu

Asn

Asp

245 250 255

Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys 260 265 270

Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gin 275 280 285

Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gin Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys 290 295 300

PL 191 624 B1

Lys

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly

305

310

315

320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Mec

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

325

330

335

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Val

Tyr

His

Tyr

Gin

Met

Lys

340

345

350

Ile

His

Val

Phe

Ser

Tyr

Lys

Asn

Met

Gly

Glu

Ile

Glu

Pro

Thr

Phe

355

360

365

Tyr

Val

Thr

Leu

Tyr

Gly

Thr

Asn

Ala

Asp

Ser

Gin

Thr

Leu

Pro

Leu

370

375

380

Glu

Ile

Val

Glu

Arg

Ile

Glu

Gin

Asn

Ala

Thr

Asn

Thr

Phe

Leu

Val

335

390

395

400

Tyr

Thr

Glu

Glu

Asp

Leu

Gly

Asp

Leu

Leu

Lys

Ile

Gin

Leu

Thr

Trp

405

410

415

Glu

Gly

Ala

Ser

Gin

Ser

Trp

Tyr

Asn

Leu

Trp

Lys

Glu

Phe

Arg

Ser

420

425

430

Tyr

Leu

Ser

Gin

Pro

Arg

Asn

Pro

Gly

Arg

Glu

Leu

Asn

Ile

Arg

Arg

435

440

445

^Ι1θ 45! ^{Ser 617} 455 ^{THr Gln Ar}® ^{LyS LeU Thr Phe Cys Thr}

Glu 465

Asp

Pro

Glu

Asn

Thr 470

Ser

Ile

Ser

Pro

Gly 475

Arg

Glu

Leu

Trp

Phe 480

Arg

Lys

Cys

Arg

Asp

Gly

Trp

Arg

Met

Lys

Asn

Glu

Thr

Ser

Pro

Thr

Val Glu Leu Pro *

500 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:?

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1035 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xx) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS

PL 191 624 B1 (B) LOKALIZACJA: 1..1035 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:9:

ATG AGC AAC TCC GTT CCT
Met	Ser	Asn	Ser 505	Val	Pro
TTT	GCT	GCG	GGG	AGC	CCC
Phe	Ala	Ala 520	Gly	Ser	Pro
GAT	AAG	CTC	CAC	AAA	ccc
Asp	Lys 535	Leu	His	Lys	Pro
GTG	AGG	TTT	AAC	CTC	CGC
Val 550	Arg	Phe	Asn	Leu	Arg 555
TAC	CTC	TCC	GTC	GGC	CAC
Tyr	Leu	Ser	Val	Giy 570	His
ATG	ACA	GCT	AAA	ACC	TTT
Met	Thr	Ala	Lys 585	Thr	Phe
ATC	TTT	GAA	AAC	TGG	CTG
Ile	Phe	Glu 600	Asn	Trp	Leu
GAG	AAA	GAC	GCC	AAT	GTA
Glu	Lys 615	Asp	Ala	Asn	Val
CAG	CTT	TAC	ACG	GAT	GCG
Gin 630	Leu	Tyr	Thr	Asp	Ala 635
ATT	GCC	AGG	ATG	CTC	GAC
Ile	Ala	Arg	Met	Leu 650	Asp

CTG	CTC	TGT	TTC	TGG	AGC
Leu	Leu	Cys 510	Phe	Trp	Ser
GTA	CCT	TTT	GGT	CCA	GAG
Val	Pro 525	Phe	Gly	Pro	Glu
AAA	GCT	ACA	CAG	ACT	GAG
Lys 540	Ala	Thr	Gin	Thr	Glu 545
ACC	TCC	AAG	GAC	CCA	GAG
Thr	Ser	Lys	Asp	Pro 560	Glu
AGC	CAG	ccc	TTA	GAA	GAC
Ser	Gin	Pro	Leu 575	Glu	Asp
TTC	ATC	ATT	CAC	GGA	TGG
Phe	Ile	Ile 590	His	Gly	Trp
CAC	AAA	CTC	GTG	TCA	GCC
His	Lys 605	Leu	Val	Ser	Ala
GTT	GTG	GTT	GAC	TGG	CTC
Val 620	Val	Val	Asp	Trp	Leu 625
GTC	AAT	AAT	ACC	AGG	GTG
Val	Asn	Asn	Thr	Arg 640	Val
TGG	CTG	CAG	GAG	AAG	GAC
Trp	Leu	Gin	Glu 655	Lys	Asp

CTC	TGC	TAT	TGC	48
Leu	Cys 515	Tyr	Cys
GGA	CGG	CTG	GAA	96
Gly 530	Arg	Leu	Glu
GTC	AAA	CCA	TCT'	144
Val	Lys	Pro	Ser
CAT	GAA	GGA	TGC	192
His	Glu	Gly	Cys 565
TGC	AGT	TTC	AAC	240
Cys	Ser	Phe 590	Asn
ACG	ATG	AGC	GGT	288
Thr	Met 595	Ser	Gly
CTG	CAC	ACA	AGA	336
Leu 610	His	Thr	Arg
CCC	CTG	GCC	CAC	384
Pro	Leu	Ala	His
GTG	GGA	CAC	AGC	432
Val	Gly	His	Ser 645
GAT	TTT	TCT	CTC	480
Asp	Phe	Ser 660	Leu

GGG AAT GTC CAC TTG ATC Gly Asn Val His Leu Ile

665

TAT GCA GGC AAC TTC GTG Tyr Ala Gly Asn Phe Val

680

GAT CCT GCC GGG CCC ATG Asp Pro Ala Gly Pro Met

695

GGC TAC AGC CTC GGA GCG Gly Tyr Ser Leu Gly Ala

570

AAA GGA ACG GTG GGC CGA Lys Gly Thr Val Gly Arg

685

TTT GAA GGG GCC GAC ATC Phe Glu Gly Ala Asp Ile 700 705

CAC GTG GCC GGG 528

His Val Ala Gly

675

ATC ACA GGT TTG 576

Ile Thr Gly Leu

690

CAC AAG AGG CTC 624

His Lys Arg Leu

PL 191 624 B1

TCT CCG GAC GAT GCA	GAT TTT GTG GAT GTC CTC CAC ACC TAC ACG CGT	672
Ser 710	Pro Asp	Asp Ala	Asp 715	Phe Val Asp	Val	Leu 720	His	Thr	Tyr Thr Arg 725
TCC	TTC GGC	TTG AGC	ATT	GGT ATT CAG	ATG	CCT	GTG	GGC	CAC ATT GAC	720
Ser	Phe Gly	Leu Ser	Ile	Gly Ile Gin	MeC	Pro	Val	Gly	His Ile Asp
		730			735				740
ATC	TAC CCC	AAT GGG	GGT	GAC TTC CAG	CCA	GGC	TGT	GGA	CTC AAC GAT	768
Ile	Tyr Pro	Asn Gly	Gly	Asp Phe Gin	Pro	Gly	Cys	Gly	Leu Asn Asp
		745		750					755
GTC	TTG GGA	TCA ATT	GCA	TAT GGA ACA	ATC	ACA	GAG	GTG	GTA AAA TGT	816
Val	Leu Gly	Ser Ile	Ala	Tyr Gly Thr	Ile	Thr	Glu	Val	Val Lys Cys
	760			765				770
GAG	CAT GAG	CGA GCC	GTC	CAC CTC TTT	GTT	GAC	TCT	CTG	GTG AAT CAG	864
Glu	His Glu	Arg Ala	Val	His Leu Phe	Val	Asp	Ser	Leu	Val Asn Gin
	775			780			785
GAC	AAG CCG	AGT TTT	GCC	TTC CAG TGC	ACT	GAC	TCC	AAT	CGC TTC AAA	912
Asp	Lys Pro	Ser Phe	Ala	Phe Gin Cys	Thr	Asp	Ser	Asn	Arg Phe Lys
790			795			800			805
AAG	GGG ATC	TGT CTG	AGC	TGC CGC AAG	AAC	CGT	TGT	AAT	AGC ATT GGC	960
Lys	Gly Ile	Cys Leu	Ser	Cys Arg Lys	Asn	Arg	Cys	Asn	Ser Ile Gly
		810			815				820
TAC	AAT GCC	AAG AAA	ATG	AGG AAC AAG	AGG	AAC	AGC	AAA	ATG TAC CTA	1008
Tyr	Asn Ala	Lys Lys	Mec	Arg Asn Lys	Arg	Asn	Ser	Lys	Met Tyr Leu
		825		830					835
AAA	ACC CGG	GCA GGC	ATG	CCT TTC AGA						1035
Lys	Thr Arg	Ala Gly	Mec	Pro Phe Arg
	840			845
	(2) INFORMACJA 0	SEKWENCJI	O NUMERZE	IDENTYFIKACYJNYM:	10:
	(i	) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
			(A)	DŁUGOŚĆ:	345	aminokwasów
			(B)	TYP: aminokwasowa
			(D)	TOPOLOGIA: liniowa
	(ii) RODZAJ	CZĄSTECZKI: biał	ko
	(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI	-

KACYJNYM:10

PL 191 624 B1

Met 1	Ser	Asn	Ser	Val 5	Pro	Leu	Leu
Phe	Ala	Ala	Gly 20	Ser	Pro	Val	Pro
Asp	Lys	Leu 35	His	Lys	Pro	Lys	Ala 40
Val	Arg 50	Phe	Asn	Leu	Arg	Thr 55	Ser
Tyr 65	Leu	Ser	Val	Gly	His 70	Ser	Gin
Met	Thr	Ala	Lys	Thr 85	Phe	Phe	Ile
Ile	Phe	Glu	Asn 100	Trp	Leu	His	Lys
Glu	Lys	Asp 115	Ala	Asn	Val	Val	Val 120
Gin	Leu 130	Tyr	Thr	Asp	Ala	Val 135	Asn
Ile 145	Ala	Arg	Met	Leu	Asp 150	Trp	Leu
Gly	Asn	Val	His	Leu 165	Ile	Gly	Tyr
Tyr	Ala	Gly	Asn 180	Phe	Val	Lys	Gly

Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu 195 200

Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val 210 215

Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile 225 230

Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe 245

Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly 260

Glu His Glu Arg Ala Val His Leu 275 230

Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gin 290 295

Cys	Phe 10	Trp	Ser	Leu	Cys	Tyr 15	Cys
Phe 25	Gly	Pro	Glu	Gly	Arg 30	Leu	Glu
Thr	Gin	Thr	Glu	Val 45	Lys	Pro	Ser
Lys	Asp	Pro	Glu 60	His	Glu	ciy	Cys
Pro	Leu	Glu 75	Asp	Cys	Ser	Phe	Asn 80
Ile	His 90	Gly	Trp	Thr	Met	Ser 95	Gly
Leu 105	Val	Ser	Ala	Leu	His 110	Thr	Arg
Val	Asp	Trp	Leu	Pro 125	Leu	Ala	His
Asn	Thr	Arg	Val 140	Val	Gly	HiS	Ser
Gin	Glu	Lys 155	Asp	Asp	Phe	Ser	Leu 160
Ser	Leu 170	Gly	Ala	His	Val	Ala 175	Gly
Thr 185	Val	Gly	Arg	Ile	Thr 190	Gly	Leu
Gly	Ala	Asp	Ile	His	Lys	Arg	Leu

205

Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg 220

Gin Met Pro Vąl Gly His Ile Asp 235 240

Gin Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp 250 255

Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys 265 270

Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gin 285

Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys 300

PL 191 624 B1

Lys 305

Gly

Ile

Cys

Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly

310

315

320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

325

330

335

Lys Thr Arg Ala Gly Mec Pro Phe Arg 340 345 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ: 255 pary zasad
(B)	TYP: kwas	nukleinowy
(C)	ILOŚĆ NICI	: dwie
(D)	TOPOLOGIA:	liniowa
RODZAJ	CZĄSTECZKI:	cDNA

(ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 1..225 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFI KACYJNYM:!!:

CTG GGA TCC ATC

GCC Ala 350

TAT GGC

ACG Thr

ATC GCG GAG GTG GTG AAG

TGC Cys 360

GAG Glu

48

Leu Gly Ser

Ile

Tyr

Gly

Ile

Ala 355

Glu

Val

Val

Lys

CAT

GAG

CGG

GCC

GTG

CAT

CTC

TTT

GTG

GAC

TCC

CTG

GTG

AAC

CAG

GAC

96

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

Asp

365

370

375

AAG

CCG

AGC

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACA

GAC

TCC

AAC

CGC

TTC

AAA

AAA

144

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

Lys

330

385

390

GGG

ATC

TGT

CTC

AGC

TGC

CGG

AAG

AAC

CGC

TGT

AAC

GGC

ATC

GGC

TAC

192

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Gly

Ile

Gly

Tyr

395

400

405

AAT

GCT

AAG

AAG

ACG

AGG

AAT

AAG

AGG

AAC

ACC

225

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

410

415

420

PL 191 624 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 75 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 12:

Leu 1

Gly

Ser

Ile

Ala 5

Tyr

Gly

Thr

Ile

Ala 10

Glu

Val

Val

Lys

Cys 15

Glu

His

Glu

Arg

Ala 20

V&1

His

Leu

Phe

Val 25

Asp

Ser

Leu

Val

Asn 30

Gin

Asp

Lys

Pro

Ser 35

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys 40

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg 45

Phe

Lys

Lys

Gly

Ile 50

cys

Leu

Ser

Cys

Arg 55

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn 60

Gly

Ile

Gly

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 472 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 13:

Met

Glu Ser Lys Ala Leu Leu Val 5

Leu Thr Leu Ala Val Trp 10

Leu Gin 15

Leu Thr Ala Ser Arg Gly Gly Val Ala Ala Ala Asp Gin Arg Arg ²⁰ 25 30

PL 191 624 B1

Asp Phe Ile Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu Arg Thr Pro Glu Asp 35 40 45

Thr Ala Glu Asp Thr Cys His Leu Ile Pro Gly Val Ala Glu Ser Val 50 55 60

Ala Thr Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr Phe Met Val Ile His

70 75 80

Gly Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val

90 95

Ala Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn Val Ile Val Val Asp 100 105 ' 110

Trp Leu Ser Arg Ala Gin Glu His Tyr Pro Val Ser Ala Gly Tyr Thr 115 120 125

Lys Val Gly Gin Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu Glu 130 135 140

Phe Asn Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly

145 150 155 160

Ala His Ala Ala Gly Ile Ala Gly Ser Leu Thr Asn Lys Lys Val Asn

165 170 175

Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Asn Phe Glu Tyr Ala Glu 180 185 190

Ala Pro Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His 195 200 205

Thr

Phe 210

Thr

Arg

Gly

Ser

Pro 215

Gly

Arg

Ser

Ile

Gly 220

Ile

Gin

Lys

Pro

Val 225

Gly

His

Val

Asp

Ile 230

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly 235

Thr

Phe

Gin

Pro

Gly 240

Cys

Asn

Ile

Gly

Glu 245

Ala

Ile

Arg

val

Ile 250

Ala

Glu

Arg

Gly

Leu 255

Gly

Asp

Val

Asp

Gin 2 60

Leu

Lys

cys

Ser

His 265

Glu

Arg

Ser

Ile

His 270

Leu

Phe

Ile

Asp

Ser 275

Leu

Leu

Asn

Glu

Glu 280

Asn

Pro

Ser

Lys

Ala 285

Tyr

Arg

Cys

Ser

Ser 290

Lys

Glu

Ala

Phe

Glu 295

Lys

Gly

Leu

Cys

Leu 300

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn 305

Arg

Cys

Asn

Asn

Leu 310

Gly

Tyr

Glu

Ile

Asn 315

Lys

Val

Arg

Ala

Lys 320

Arg

Ser

Ser

Lys

Met 325

Tyr

Leu

Lys

Thr

Arg 330

Ser

Gin

Met

Pro

Tyr 335

Lys

Val

Phe

His

Tyr

Gin

Val

Lys

Ile

His

Phe

Ser ·

Gly

Thr

Glu

Ser

Glu

PL 191 624 B1

Thr His Thr Asn Gin Ala Phe Glu Ile ser Leu Tyr Gly Thr Val Ala
	355	360	365
Glu Ser 370	Glu Asn Ile	Pro Phe Thr 375	Leu Pro Glu Val Ser Thr Asn Lys 380
Thr Tyr 385	Ser Phe Leu	Ile Tyr Thr 390	Glu Val Asp Ile Gly Glu Leu Leu 395 400
Met Leu	Lys Leu Lys 405	Trp Lys Ser	Asp Ser Tyr Phe Ser Trp Ser Asp 410 415
Trp Trp	Ser Ser Pro 420	Gly Phe Ala	Ile Gin Lys Ile Arg Val Lys Ala 425 430
Gly Glu	Thr Gin Lys 435	Lys Val Ile 440	Phe Cys Ser Arg Glu Lys Val Ser 445
His Leu 450 Lys Ser 465	Gin Lys Gly Leu Asn Lys	Lys Ala Pro 455 Łys Ser Gly 470	Ala Val Phe Val Lys Cys His Asp 460
(2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 499 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii! RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFI· KACYJNYM:14:
Met Asp 1	Thr Ser Pro 5	Leu Cys Phe	Ser Ile Leu Leu Val Leu Cys Ile 10 15 .
Phe Ile	Gin Ser Ser 20	Ala Leu Gly	Gin Ser Leu Lys Pro Glu Pro Phe 25 30
Gly Arg	Arg Ala Gin 35	Ala Val Glu 40	Thr Asn Lys Thr Leu His Glu Met 45
Lys Thr 50	Arg Phe Leu	Leu Phe Gly 55	Glu Thr Asn Gin Gly Cys Gin Ile 60
Arg Ile 65	Asn His Pro	Asp Thr Leu 70	Gin Glu Cys Gly Phe Asn Ser Ser 75 80

PL 191 624 B1

Leu

Pro

Leu

Val

Met 85

Ile

11®

His

Gly

Trp 90

Ser

Val

Asp

Gly

Val 95

Leu

Glu

Asn

Trp

Ile 100

Trp

Gin

Met

Val

Ala 105

Ala

Leu

Lys

Ser

Gin 110

Pro

Ala

Gin

Pro

Val 115

Asn

Val

Gly

Łeu

Val 120

Asp

Trp

Ile

Thr

Leu 125

Ala

His

Asp

His

Tyr 130

Thr

Ile

Ala

Val

Arg 135

Asn

Thr

Arg

Leu

Val 140

Gly

Lys

Glu

Val

Ala 145

Ala

Leu

Leu

Arg

Trp 150

Leu

Glu

Glu

Ser

Val 155

Gin

Leu

Ser

Arg

Ser 160

His

Val

His

Leu

Ile 165

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly 170

Ala

His

Vał

Ser

Gly 175

Phe

Ala

Cly

Ser

Ser 180

Ile

Gly Gly

Thr

His 185

Lys

Ile

Gly

Arg

Ile 190

Thr

Gly

Leu

Asp

Ala' 195

Ala

Gly

Pro

Leu

Phe 200

Glu

Gly

Ser

Ala

Pro 205

Ser

Asn

Arg

Leu

Ser 210

Pro

Asp

Asp

Ala

Asn 215

Phe

Val

Asp

Ala

Ile 220

His

Thr

Phe

Thr

Arg 225

Glu

His

Met

Gly

Leu 230

Ser

Val

Gly

Ile

Lys 235

Gin

Pro

Ile

Gly

His 240

Tyr

Asp

Phe

Tyr

Pro .245

Asn

Gly

Gly

Ser

Phe 250

Gin

Pro

Gly

Cys

His 255

Phe

Leu

Glu

Leu

Tyr 260

Arg

His

Ile

Ala

Gin 265

His

Gly

Phe

Asn

Ala 270

Ile

Thr

Gin

Thr

Ile 275

Lys

Cys

Ser

His

Glu 280

Arg

Ser

Val

His

Leu 285

Phe

Ile

Asp

Ser

Leu 290

Leu

His

Ala

Gly

Thr 295

Gin

Ser

Met

Ala

Tyr 300

Pro

Cys

Gly

Asp

Met 305

Asn

Ser

Phe

Ser

Gin 310

Gly

Leu

Cys

Leu

Ser 315

Cys

Lys

Lys

Gly

Arg 320

Cys

Asn

Thr

Leu

Gly 325

Tyr

His

Val

Arg

Gin 330

Glu

Pro

Arg

Ser

Lys 335

Ser

Lys

Arg

Leu

Phe 340

Leu

Val

Thr

Arg

Ala 345

Gin

Ser

Pro

Phe

Lys 350

Val

Tyr

His

Tyr

Gin 355

Leu

Lys

Ile

Gin

Phe 360

Ile

Asn

Gin

Thr

Glu 365

Thr

Pro

Ile

Gin

Thr 370

Thr

Phe

Thr

Met

Ser 375

Łeu

Leu

Gly

Thr

Lys 390

Glu

Lys

Met

Gin

Lys

Ile

Pro

Ile

Thr

Leu

Gly

Lys

Gly

Ile

Ala

Ser

Asn

Lys

Thr

Tyr

385 390 395 400

PL 191 624 B1

Ser

Phe

Leu

Ile

Thr

Leu Asp

wal

Asp

Ile

Gly

Glu

Leu

Ile

Met

Ile

405

410

415

Lys

Phe

Lys

Trp 420

Glu

Asn

Ser

Ala

Val 425

Trp

Ala

Asn

Val

Trp 430

Asp

Thr

Val

Gin

Thr 435

Ile

Ile

Pro

Trp

Ser 440

Thr

Gly

Pro

Arg

His 44S

Ser

Gly

Leu

Val

Leu 450

Lys

Thr

Ile

Arg

Val 455

Lys

Ala

Gly

Glu

Thr 460

Gin

Gin

Ar y

Met

Thr 465

Phe

Cys

Ser

Glu

Asn 470

Thr Asp

Asp

Leu

Leu 475

Leu

Arg

Pro

Thr

Gin 480

Glu

Lys

Ile

Phe

Val 485

Lys

Cys Glu

Ile

Lys 490

Ser

Lys

Thr

Ser

Lys 495

Arg

Lys

Ile

Arg

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:15 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A)	DŁUGOŚĆ: 465 aminokwasów
	(8)	TYP: aminokwasowa
	(C)	ILOŚĆ NICI:
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
iii)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: białko
(xi)	OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA 0 NUMERZE IDENTYFI-

KACYJNYM:15

Met 1

Leu

Pro

Leu

Trp 5

Thr

Leu

Ser

Leu

Leu 10

Leu

Gly

Ala

Val

Ala 15

Gly

Lys

Glu

Val

Cys 20

Tyr

Glu

Arg

Leu

Gly 25

Cys

Phe

Ser

Asp

Asp 30

Ser

Pro

Trp

Ser

Gly 35

Ile

Thr

Glu

Arg

Pro 40

Leu

His

Ile

Leu

Pro 45

Trp

Ser

Pro

Lys

Asp 50

Val

Asn

Thr

Arg

Phe 55

Leu

Leu

Tyr

Thr

Asn 60

Glu

Asn

Pro

Asn

Asn 65

Phe

Gin

Glu

Val

Ala 70

Ala

Asp

Ser

Ser

Ser 75

Ile

Ser

Gly

Ser

Asn 80

Phe

Lys

Thr

Asn

Arg

Lys

Thr

Arg

Phe

Ile

Ile

His

Gly

Phe

Ile

Asjo

go _9S

PL 191 624 B1

Lys

Gly

Glu

Glu 100

Asn

Trp

Leu

Ala Asn Val 105

Cys

Lys

Asn

Leu 110

Phe

Lys

Val

Glu

Ser 115

Val

Asn

Cys

Ile

Cys Val Asp 120

Trp

Lys

Gly 125

Gly

Ser

Arg

Thr

Gly 130

Tyr

Thr

Gin

Ala

Ser 135

Gin Asn ile

Arg

Ile 140

Val

Gly

Ala

Glu

vał 145

Ala

Tyr

Phe

Val

Glu 150

Phe

Leu Gin Ser

Ala 155

Phe

Gly

Tyr

Ser

Pro 160

Ser

Asn

Val

His

Val 165

Ile

Gly

His Ser Leu 170

Gly

Ala

His

Ala

Ala 175

Gly

Glu

Ala

Gly

Arg 180

Arg

Thr

Asn

Gly Thr Ile 185

Gly

Arg

Ile

Thr 190

Gly

Leu

Asp

Pro

Ala 195

Glu

Pro

Cys

Phe

Gin Gly Thr 200

Pro

Glu

Leu 205

Vał

Arg

Leu

Asp

Pro 210

Ser

Asp

Ala

Łys

Phe 215

Val

Asp

Val

Ile

His 220

Thr

Asp

Gly

Ala

Pro

Ile

Val

Pro

Asn

Łeu

Gly

Phe

Gly

Met

Ser

Gin

Val

Val

Gly

His

225 230 235 240

Leu Asp Phe Phe Pro Asn Gly Gly Val Glu Mec Pro Gly Cys Lys Lys 245 250 255

Asn Ile Leu Ser Gin Ile Val Asp Ile Asp Gly Ile Trp Glu Gly Thr 260 2S5 270

Arg

Asp

Phe 275

Ala

Ala

Cys

Asn

His 280

Leu

Arg

Ser

Tyr

Lys 285

Tyr

Tyr

Thr

Asp

Ser 290

Ile

Val

Asn

Pro

Asp 295

Gly

Phe

Ala

Gly

Phe 300

Pro

Cys

Ala

Ser

Tyr 305

Asn

Val

Phe

Thr

Ala 310

Asn

Lys

Cys

Phe

Pro 315

Cys

Pro

Ser

Gly

Gly 320

Cys

Pro

Gin

Mec

Gly 325

His

Tyr

Ala

Asp

Arg 330

Tyr

Pro

Gly

Lys

Thr 335

Asn

Asp

Val

Gly

Gin 340

Lys

Phe

Tyr

Leu

Asp 345

Thr

Gly

Asp

Ala

Ser 350

Asn

Phe

Ala

Arg

Trp 355

Arg

Tyr

Lys

Val

Ser 360

Val

Thr

Leu

Ser

Gly 365

Lys

Lys

val

Thr

Gly 370

His

Ile

Leu

Val

Ser 375

Leu

Phe' Gly

Asn

Lys 380

Gly

Asn

Ser

Lys

Gin

Tyr

Glu

Ile

Phe

Lys

Gly

Thr

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Thr

His

Ser

235 390 395 ₄₀₀

PL 191 624 B1

Asn

Glu

Phe

Asp

Ser 405

Asp

Val

Asp

Vał

Gly 410

Asp

Leu

Gin

Met

Val 415

Lys

Fhe

Ile

Trp

Tyr 420

Asn

Asn

Val

He

Asn 425

Pro

Thr

Leu

Pro

Arg 430

Val

Gly

Ala

Ser

Lys 435

Ile

Ile

Val

Glu

Thr 440

Asn

Val

Gly

Lys

Gin 445

Phe

Asn

Phe

Cys

Ser

Pro

Glu

Thr

Val

Arg

Glu

Glu

Val

Leu

Leu

Thr

Leu

Thr

Pro

450 455 460

Cys

465 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:16: Ci) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (ES) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 16:

Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr 15 10 15

Cys (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:17 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 13 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna CD) TOPOLOGIA: liniowa

PL 191 624 B1 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /op. = „Oligonukleotyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 17:

ττττττττττ tga :

(2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (Ά) OPIS: /op. = „Oligonukleotyd (xiS OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 18:

GATCAATCGC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:19 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ C2P_lSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /op. = „Oligonukleotyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM: 19:

TAGGACATGC ACAGTGTAAT CTG

PL 191 624 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM:20 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

Claims (36)

1. Wyizolowany polipeptyd kodowany przez gen białka podobnego do lipazy (LLG), znamienny tym, że (a) wiąże heparynę, (b) posiada homologię do ludzkiej lipazy lipoproteinowej i lipazy wątrobowej, (c) zawiera domenę katalityczną rodziny lipaz triacyloglicerolowych o masie 39000, przy czym

i) polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 55000 w 10% żelu SDS-PAGE, sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 68000 w 10% żelu SDS-PAGE lub sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 6 i o pozornej masie cząsteczkowej około 40000 w 10% żelu SDS-PAGE, lub ii) domena katalityczna o masie 39000 zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 10, lub iii) wyizolowany polipeptyd jest pochodzenia króliczego i zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 12.

2. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 55000 w 10% żelu SDS-PAGE, sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 8 i o pozornej masie cząsteczkowej około 68000 w 10% żelu SDS-PAGE lub sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 6 i o pozornej masie cząsteczkowej około 40000 w 10% żelu SDS-PAGE.

3. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że domena katalityczna o masie 39000 zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 10.

4. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest pochodzenia króliczego i zawiera sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym 12.

5. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że wykazuje aktywność fosfolipazy A.

6. Fragment antygenowy wyizolowanego polipeptydu z zastrz. 1.

7. Wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd z zastrz. 1.

8. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 7, znamienny tym, że stanowi cDNA.

9. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 8, znamienny tym, że posiada sekwencję nukleotydową wybraną spośród grupy obejmującej sekwencje o numerze identyfikacyjnym 5, 7 i 9.

10. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera nukleotydy 252-1754 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7.

11. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 7, znamienny tym, że koduje polipeptyd z zastrz. 4.

12. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 11, znamienny tym, że posiada sekwencję o numerze identyfikacyjnym 11.

13. Wyizolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że hybrydyzuje w warunkach 0,1X SSC, 0,5% SDS w temperaturze 68°C z celem wybranym z grupy składającej się z nukleotydów od 44 do 79 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3 i nukleotydów od 1036-1065 sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5.

14. Wektor, znamienny tym, że zawiera wyizolowany kwas nukleinowy z zastrz. 7 albo 13 połączony w sposób umożliwiający działanie z regionem regulującym.

15. Wektor według zastrz. 14, znamienny tym, że region regulujący pochodzi ze źródła heterologicznego.

16. Wektor według zastrz. 14 albo 15, znamienny tym, że jest wektorem wirusowym.

17. Wektor według zastrz. 16, znamienny tym, że jest wektorem adenowirusowym.

18. Zrekombinowana komórka, znamienna tym, że zawiera wektor z zastrz. 14.

19. Zrekombinowana komórka według zastrz. 18, znamienna tym, że jest komórką eukariotyczną.

20. Zrekombinowana komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że jest komórką COS-7.

21. Sposób wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się zrekombinowaną komórkę z zastrz. 18w warunkach umożliwiających ekspresję polipeptydu.

22. Przeciwciało, znamienne tym, że jest zdolne do specyficznego wiązania polipeptydu z zastrz. 1.

23. Przeciwciało według zastrz. 22, znamienne tym, że jest zdolne do neutralizowania aktywności fosfolipazowej polipeptydu.

PL 191 624 B1

24. Przeciwciało według zastrz. 22 albo23, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.

25. Przeciwciałowedług zastrz. 22 albo23, znamienne tym, że jest przeciwciałem poliklonalnym.

26. Komórka hybrydomy,znamienna tym, że wytwarza przeciwciało z zastrz. 24.

27. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera

a) polipeptydz zastrz. 1, albo

b) wektor z zastrz 14, albo

c) przeciwciało z zastrz. 22 oraz dopuszczalnyfarmaceutycznie nośnik.

28. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że zawiera polipeptyd i dopuszczalny farmaceutycznienośnik.

29. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że zawiera wektor i dopuszczalny farmaceutycznienośnik.

30. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że zawiera przeciwciało i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

31. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że dopuszczalnymfarmaceutycznie nośnikiemjest zgodny biologicznieroztwór.

32. Sposób wyszukiwania agonistów lub antagonistów aktywności polipeptydu kodowanego przez genpodobnydolipazyLLG, znamienny tym, że (a) zapewnia siękontaktpotencjalnychagonistówlub antagonistówz polipeptydemi substratem polipeptydu, oraz (b) mierzy się zdolność potencjalnych agonistów lub antagonistów do wzmacniania lub hamowania aktywności polipeptydu, przy czym polipeptyd jest polipeptydem z zastrz. 2.

33. Sposób enzymatycznej hydrolizy in vitro estru fosfatydylocholiny, znamienny tym, że zapewnia się kontakt estru fosfatydylocholiny z polipeptydem z zastrz. 2 albo3.

34. Zastosowanie polipeptydu z zastrz. 1 do wytwarzania leku do poprawiania profilu lipidów wsurowicyczłowieka lub innego zwierzęcia posiadającego niepożądany profil lipidów.

35. Zastosowanie przeciwciała z zastrz. 22 do wytwarzania leku do poprawiania profilu lipidów w surowicy człowieka lub innego zwierzęcia posiadającego niepożądany profil lipidów.

36. Transgeniczna mysz, znamienna tym, że w jej organizmie zachodzi ekspresja polipeptydu z zastrz. 1.